WO2015053398A1 - 高力価レトロウイルスベクター - Google Patents

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WO2015053398A1
WO2015053398A1 PCT/JP2014/077233 JP2014077233W WO2015053398A1 WO 2015053398 A1 WO2015053398 A1 WO 2015053398A1 JP 2014077233 W JP2014077233 W JP 2014077233W WO 2015053398 A1 WO2015053398 A1 WO 2015053398A1
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WO
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sequence
vector
gene
cell
virus
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PCT/JP2014/077233
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峰野　純一
泰典 天石
幸子 岡本
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タカラバイオ株式会社
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
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    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Definitions

  • the present invention relates to a retroviral vector used for gene transfer into a cell for transformation in the fields of medicine, pharmacy, agriculture, forestry and fisheries, and food science, a cell into which the vector is introduced, and a gene-transferred cell using the vector It relates to the manufacturing method.
  • Viral vectors are technologies widely used in the field of gene therapy from basic to clinical.
  • adenoviral vectors are suitable for transiently expressing large amounts of target genes in target cells
  • retroviral vectors are It is a vector that is expected in the field of gene therapy for genetic diseases, and is a technique that is also expected in the field of transgenic animal production. .
  • Retroviruses have a viral particle structural protein, a gag / pol gene that encodes a precursor protein such as protease, reverse transcriptase, and integrase, and an env gene that encodes an envelope glycoprotein. Both ends of these genes are 5′LTR (Long Terminal Repeat) and 3′LTR involved in the integration of double-stranded DNA synthesized through viral gene transcription, reverse transcription from the viral genome, and reverse transcription. It is sandwiched between.
  • a gene transfer system using retroviral particles makes one or two packaging constructs expressing gag / pol and env genes and retrovirus in order to make self-replication impossible while maintaining the infectivity of viral particles. It is divided into vectors.
  • a retroviral vector is also called a transfer vector and has a packaging signal sequence for LTR and viral particles, and most of the gag / pol gene and the env gene are deleted, and a desired gene is inserted instead.
  • the RNA genome is transcribed by the promoter sequence of the 5 'LTR of the transfer vector and packaged into a viral particle by the packaging signal sequence.
  • Non-patent Document 1 The functions of retrovirus genes and elements are being clarified, and many improvements have been made to transfer vectors (Non-patent Document 1).
  • RRE Rev Responsive Element
  • cPPT central polypurine tract
  • a final double-stranded cDNA forms a triple-stranded structure of about 100 base pairs called a DNA flap in the center.
  • This triple-stranded structure is thought to be involved in the passage of the nuclear membrane pore of the pre-integration complex (Patent Document 1).
  • Wild-type virus cPPT is known to be located several bases from the center of the DNA genome, and it is considered that cPPT is located in the center of the virus vector (Patent Document 1).
  • PRE posttranslational regulatory element
  • WPRE Woodchuck hepatitis virus
  • An object of the present invention is to provide a retroviral vector for introducing a desired gene into a cell and expressing it more efficiently.
  • a retroviral vector characterized in that it is arranged, [2] The retroviral vector according to [1], further comprising a post-transcriptional regulatory sequence (PRE) on the 3 ′ side of the base sequence of the desired gene, [3] The retroviral vector according to [1], wherein the base sequence of a desired gene is a base sequence that is translated to produce a polypeptide, [4] The retroviral vector according to [1], wherein the retrovirus is a lentivirus, [5] The retroviral vector according to [1], further comprising a packaging signal sequence on the 5 ′ side of cPPT, wherein the SA sequence and / or SA-like sequence between RREs has been removed from the packaging signal sequence, [6] A retrovirus comprising a base sequence of a desired gene, PRE and RRE, wherein the
  • the present invention provides a retroviral vector that efficiently expresses a desired gene, a method for producing a gene-transferred cell using the vector, and a cell into which the vector has been introduced.
  • retroviral vectors, gene-transfected cell production methods and gene-introduced cells are extremely useful for protein production, disease treatment by cell therapy, and research and testing therefor.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the structure of the retrovirus vector of an Example.
  • PBS is a primer binding site
  • pMSCV is a mouse stem cell virus (Murine Stem Cell Virus) -U3 promoter
  • ZsGreen is a fluorescent protein ZsGreen1
  • ⁇ 3′LTR is a SIN-type 3′LTR sequence having a mutation in the U3 region.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the structure of the retrovirus vector of an Example. It is a figure which shows the virus titer of each retrovirus vector. It is a figure which shows the virus titer of each retrovirus vector. It is a figure which shows the structure of the retrovirus vector of an Example.
  • PBS is a primer binding site
  • pMSCV is a mouse stem cell virus (Murine Stem Cell Virus) -U3 promoter
  • ZsGreen is a fluorescent protein ZsGreen1
  • ⁇ 3′LTR is a SIN type 3′LTR having a mutation in the U3 region
  • ⁇ env is env
  • Each sequence of a portion of the gene is shown. It is a figure which shows the virus titer of each retrovirus vector.
  • the “Rev response element (RRE)” is a sequence to which a Rev polypeptide that is an RNA binding protein binds.
  • RRE is a sequence of about 240 bases present in the env gene of lentivirus.
  • RNA containing RRE has a complex secondary structure in the region of this sequence, and Rev binds. The gene carried in the construct containing the RRE sequence is efficiently expressed depending on the Rev polypeptide.
  • central polypurine sequence means a sequence of about 15 bases present in the approximate center of the lentiviral genome, which is a double-stranded DNA from the lentiviral genomic RNA. It is a sequence that acts as a primer binding site for synthesizing plus-strand DNA during the synthesis process.
  • CTS central termination sequence
  • post-transcriptional regulatory element means the promotion of polyadenylation of mRNA transcribed from a gene in a cell, promotion of nuclear export of mRNA, or activation of translation of mRNA. The sequence that contributes to is shown. It is known that the expression of a desired gene is improved by inserting it into the untranslated region of the desired gene of a retroviral vector.
  • gene of interest is artificially inserted into a cell (for example, the cell's nuclear genome or cytoplasm) either temporarily or permanently (by artificial manipulation). It refers to an exogenous gene that is desired to be performed. Such genes include genes that are completely or partially derived from the introduced cell, and also include genes having any mutation. Further, it may be the same gene as the endogenous gene that the cell naturally has. Here, “naturally” means a state in which no artificial manipulation is applied.
  • Retroviral vector of the present invention comprises cPPT, RRE and the base sequence of the desired gene, and the base sequence of cPPT, RRE and the desired gene is in the 5 ′ to 3 ′ direction. They are arranged in the order of arrangement.
  • the retroviral vector of the present invention comprises a nucleotide sequence of a desired gene, PRE and RRE, and the sequence is in the 5 ′ to 3 ′ direction, and the nucleotide sequence of the desired gene, PRE and RRE. It is arranged in the order of.
  • the vector of the present invention has a high expression efficiency of a desired gene in the introduced cell.
  • the vector of the present invention can be used for protein production, treatment of diseases by cell therapy, research and testing therefor.
  • a retrovirus is a single-stranded RNA virus, and the 5 ′ LTR sequence, SD (Splicing Donor) sequence, packaging signal sequence, gag gene sequence, pol gene sequence from the 5 ′ end are the main elements in the viral genome. , SA (Splicing Acceptor) sequence, env gene sequence and 3 ′ LTR sequence.
  • SA Splicing Acceptor sequence
  • env gene sequence a plurality of accessory genes are included in addition to these elements.
  • the 5 'LTR sequence, the packaging signal sequence, and the 3' LTR sequence are essential for the transfer vector in a gene introduction system using a retrovirus vector.
  • the vector of the present invention may further comprise RRE, cPPT, PRE, SD sequence or SA sequence.
  • the products of genes such as gag, pol, env, rev, and tat necessary for the formation of retroviral particles can be supplied from the packaging cells carrying these genes.
  • the RRE contained in the vector of the present invention can use a partial sequence of the env gene to which the lentiviral Rev binds.
  • the RRE of human immunodeficiency virus (HIV) -1 is 243 bases of the env gene [base number 7362 to base number 7595: Muesing et al., Nature, 313, 450 (1985), US Patent No. No. 6294165 publication].
  • HIV-2 belonging to lentivirus simian immunodeficiency virus (SIV), feline immunodeficiency virus (FIV), bovine immunodeficiency virus (BIV), equine infectious anemia virus (EIAV), goat arthritis encephalitis virus (CAEV) Derived sequences and their mutated sequences can be used.
  • the length of the sequence derived from the env gene containing RRE of the vector of the present invention is less than 1000 bases, preferably less than 600 bases, more preferably less than 300 bases, and even more preferably less than 250 bases.
  • the base sequence of base numbers 1942 to 2175 of SEQ ID NO: 13 can be used as the RRE sequence.
  • the cPPT contained in the vector of the present invention can serve as a primer binding site for plus-strand DNA synthesis, and a part of the lentiviral pol gene sequence forming a triple-stranded structure called a DNA flap can be used.
  • the cPPT included in the present invention can use a virus-derived sequence belonging to the lentivirus from which the RRE is derived and a mutant sequence thereof.
  • the length of the sequence derived from the pol gene containing cPPT of the vector of the present invention is less than 500 bases together with CTS, preferably less than 200 bases, more preferably less than 125 bases.
  • the base sequence of base numbers 1794 to 1917 of SEQ ID NO: 13 can be used as the cPPT sequence.
  • the PRE contained in the vector of the present invention can use a sequence that contributes to stabilization of transcribed mRNA, promotion of mRNA extranuclear transport or activation of mRNA translation.
  • a constitutive RNA transport factor (CTE) a hepadnavirus post-transcriptional regulatory sequence (HPRE) such as hepatitis B, and a woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory sequence (WPRE) can be used.
  • WPRE is the base sequence of base numbers 3312 to 3904 of SEQ ID NO: 13.
  • Retroviruses include subclasses of oncoretrovirus and lentivirus, and sequences from any class of virus can be used in the present invention. These sequences may be the same virus-derived sequences, but they can be combined with sequences from different viruses as long as they can be combined with appropriate packaging cells to form virus particles and integrate into the introduced cell genome. May be used.
  • LTR sequence and packaging signal sequence used in the present invention examples include Moloney murine leukemia virus (MMLV), mouse embryonic stem cell virus (MESV), mouse stem cell virus (MSCV), myeloproliferative virus belonging to oncoretrovirus. Sequences derived from sarcoma virus (MPSV), splenic focal foci forming virus (SFFV) can be used. Oncoretrovirus-derived viral vectors are capable of high-efficiency gene transfer, but the cells must be actively dividing when the vector is introduced. These oncorretroviral vectors have been described in numerous references [eg, US Pat. No. 5,219,740, Bulletin of the American Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 90, 8033]. -8037 (1993)].
  • Lentiviral vectors can introduce genes into the genome in the nucleus regardless of the mitosis of the cells into which the genes are introduced. Lentiviral vectors have also been described in a number of literature [eg, Journal of Virology, Vol. 72, 8463-8471 (1998)]. Other groups of retroviruses such as the spumavirus (eg, foamy virus) can also efficiently transduce non-dividing cells.
  • the spumavirus eg, foamy virus
  • an LTR sequence having a mutated sequence can also be used.
  • the LTR is functionally divided into three regions U3, R and U5 from the 5 'end.
  • the U3 region has enhancer / promoter activity, and the RNA genome II of the host cell transcribes the viral genome from the R region of the 5 'LTR sequence to the R region of the 3' LTR sequence.
  • a 3'LTR in which a mutation has been introduced into the U3 region and the enhancer / promoter activity has been deleted can be used.
  • a retroviral vector in which the U3 region of the 3'LTR sequence is mutated in this way is called a self-inactive (SIN) type vector.
  • SI self-inactive
  • An LTR sequence in which the U3 region of the 5 'LTR sequence is replaced with an exogenous promoter derived from other than the virus from which the LTR sequence is derived can also be used in the present invention.
  • a virus or mammal-derived sequence can be used, and a constitutive, inducible or tissue-specific promoter can be used.
  • HCMV human cytomegalovirus
  • MMSV Moloney murine sarcoma virus
  • RSV rous sarcoma virus
  • SV40 early promoter region [Nature, 290, 304-310 (1981)]
  • promoters derived from viruses such as spleen focus-forming virus (SFFV), and polypeptide chain elongation factors (EF) derived from a gene selected from 1 ⁇ gene, phosphoglycerate kinase (PGK) gene, ⁇ actin gene, globin gene, elastase gene, albumin gene, ⁇ -fetoprotein gene and insulin gene Mammal-derived promoter can be used.
  • SFFV spleen focus-forming virus
  • EF polypeptide chain elongation factors
  • a promoter sequence for expressing a desired gene is arranged.
  • a promoter sequence existing between the 5 'LTR and the 3' LTR may be referred to as an internal promoter sequence.
  • an internal promoter sequence a promoter sequence derived from a virus or a mammalian gene can be used.
  • a viral promoter sequence the same virus-derived sequence as the virus from which the 5 'LTR, 3' LTR or packaging signal sequence is derived or a sequence derived from a different virus can be used.
  • a promoter sequence derived from the U3 region of a retrovirus LTR for example, a promoter sequence derived from the U3 region of the LTR of a mouse stem cell virus (MSCV) can be used.
  • a sequence exemplified as an exogenous promoter for substituting the U3 region of the 5 'LTR sequence in the previous paragraph can be used.
  • the vector of the present invention may contain an SD sequence and / or an SA sequence.
  • an SD sequence and / or an SA sequence derived from a gene different from the LTR and packaging signal mounted on the vector can be used. “Derived from different genes” means that each element described above is derived from a different gene of the same type of virus or mammal, or derived from a different virus or mammal.
  • the SD sequence and the SA sequence may be sequences derived from different genes.
  • 16S RNA of simian virus (SV) 40, immediate early RNA of HCMV, SD sequence and SA sequence derived from human hEF1 ⁇ gene can be used [American Academy of Sciences, Vol. 95, No. 1, 219-223. Page (1998)].
  • SD sequences or SA sequences in which mutations are introduced into the consensus sequence and the splicing activity is enhanced or suppressed can also be used in the vector of the present invention.
  • the SD sequence and / or the SA sequence may be removed from the vector of the present invention. Removal of the SD sequence and / or SA sequence can be performed by substituting or deleting these sequences.
  • SA2 In the wild-type lentivirus, there is a major SA sequence SA2 on the 3 'side of cPPT.
  • SA7a, SA7b, and SA7 exist on the 3 'side of the RRE.
  • Each SA sequence corresponds to SEQ ID NO: 13, SA2 is 1925, SA7a is 1645, SA7b is 1651, and SA7 is 1679.
  • sequences that may function as SA sequences may be removed.
  • the present invention includes a vector in which the SA sequence and / or SA-like sequence between RREs is removed from the packaging signal sequence.
  • the nucleotide sequence of a desired gene contained in the vector of the present invention is a gene sequence that is desired to be expressed in cells into which the vector is introduced.
  • the gene sequence includes, for example, a sequence encoding a polypeptide, a ribozyme, an antisense RNA, a siRNA (short interfering RNA), a sequence encoding an RNA that functions in a cell, such as tRNA and miRNA.
  • a vector in which the base sequence of a desired gene in the vector of the present invention is replaced with a sequence (multicloning site) in which a plurality of restriction enzyme recognition sequences are arranged can be easily inserted using the multicloning site. Can do.
  • a vector having a multiple cloning site instead of the base sequence of the desired gene is also included in the vector of the present invention.
  • the vector of the present invention is characterized in that a packaging signal sequence, cPPT, RRE and a desired gene base sequence are arranged in the 5 'to 3' direction in this order.
  • This sequence is exemplified by the sequence of base numbers 685 to 2175 of SEQ ID NO: 13 or the sequence of base numbers 685 to 1720 of SEQ ID NO: 16.
  • Examples of the vector of the present invention in this aspect include the vector E and the vector E3 prepared in the examples.
  • the vector E is arranged in the order of 5 'LTR, packaging signal sequence, cPPT, RRE, internal promoter sequence, desired gene base sequence, PRE and 3' LTR in the 5 'to 3' direction.
  • the vector E3 is a vector in which the env gene sequence existing between the packaging signal sequence of vector E and cPPT is removed, and the SA and SA-like sequences existing between the packaging signal sequence and RRE are removed.
  • the vector of the present invention is characterized by being arranged in the 5 'to 3' direction in the order of the base sequence of the desired gene, WPRE and RRE.
  • the sequence of WPRE and RRE is exemplified by the sequence of base numbers 3081 to 3921 of SEQ ID NO: 14.
  • the vector of the present invention in this embodiment is exemplified by vector H prepared in the examples.
  • the vector H is arranged in the order of 5 'LTR, packaging signal sequence, cPPT, internal promoter sequence, desired gene base sequence, PRE, RRE and 3' LTR in the 5 'to 3' direction.
  • examples of the base sequence of a desired gene mounted on the vector of the present invention include the base sequence of a polypeptide gene.
  • the polypeptide is not particularly limited, and examples thereof include structural proteins, enzymes, transcription factors, receptors, and antibodies.
  • the polypeptide may be, for example, an oligomeric protein.
  • the oligomer protein may be a receptor that is a cell surface protein (membrane protein), and a gene encoding an antigen recognition receptor exemplified in the examples, for example, a sequence encoding a T cell receptor (T cell receptor: TCR) is desired. It is suitable as a base sequence.
  • TCRs There are two types of TCRs: heterodimers consisting of ⁇ and ⁇ chains (heterodimers) and heterodimers consisting of ⁇ and ⁇ chains.
  • Each chain of TCR consists of a variable (V) region, a binding (J) region, and a constant (C) region.
  • V variable
  • J binding
  • C constant
  • the diversity of the TCR V region is caused by the combination of the gene segments encoding the V region and rearrangement of the rearranged binding site by DNA rearrangement, and the insertion of an N sequence into the binding site.
  • Hypervariable regions (CDRs) with particularly high amino acid sequence variations are observed in the V regions of the ⁇ and ⁇ chains.
  • a desired gene can be a sequence obtained by polycistronicly linking genes encoding two polypeptides constituting a TCR heterodimer.
  • the two genes can be connected to each other via a sequence selected from a sequence encoding a self-cleaving peptide and an IRES (internal ribosomal entry site) sequence.
  • the order of the two genes may be either, for example, a polycistronic sequence from the 5 'end to the order of TCR ⁇ chain-TCR ⁇ chain or TCR ⁇ chain-TCR ⁇ chain.
  • the self-cleaving peptide can be obtained from a viral 2A peptide or a 2A-like peptide having a function equivalent to that of the virus.
  • 2A peptide (F2A) derived from foot-and-mouth disease virus (FMDV)
  • 2A peptide (E2A) derived from equine rhinitis A virus (ERAV)
  • E2A equine rhinitis A virus
  • P2A 2A peptide derived from Porcine teschovirus (PTV-1)
  • T2A having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 can be used.
  • 2A peptides are reviewed in Expert Opinion On Biological Therapy, Volume 5, pages 627-638 (2005).
  • the IRES sequence refers to an element that promotes the direct entry of a ribosome into the initiation codon of a cistron (protein coding region), eg, AUG, thereby initiating cap-independent translation of the gene [Trens in Bio Chemical Science (Trends Biochem Sci), Vol. 15, No. 12, pp. 477-83 (1990)]. Multiple polypeptides are translated from a single mRNA having multiple cistrons linked by an IRES sequence.
  • Method for producing gene-introduced cell of the present invention comprises a step of introducing the retroviral vector of the present invention described in (1) above into a cell. This process is performed outside the body.
  • mammals such as cells derived from humans or cells derived from non-human mammals such as monkeys, mice, rats, pigs, cows and dogs can be used.
  • non-human mammals such as monkeys, mice, rats, pigs, cows and dogs
  • Arbitrary cells can be used.
  • cells or cell populations eg, peripheral blood mononuclear cells (PBMC), blood cell lineage cells
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • body fluids such as bone marrow, tissues or organs, Hematopoietic stem cells, cord blood mononuclear cells, fibroblasts, preadipocytes, hepatocytes, blood cells, skin keratinocytes, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, adipose stem cells, various cancer cell lines, periodontal ligament fibroblasts
  • neural stem cells can be used.
  • the cells may be either collected from a living body or established as a cell line. When it is desired to transplant the produced gene-transduced cell or a cell differentiated from the cell into a living body, it is preferable to produce the transgenic cell from a cell collected from the living body itself or the same kind of living body.
  • the step of introducing the vector of the present invention into a cell comprises selecting an appropriate packaging cell based on the LTR sequence and the packaging signal sequence possessed by the vector, and using this, a retrovirus.
  • This can be done by preparing the particles and infecting the cells.
  • PG13 ATCC CRL-10686
  • PA317 ATCC CRL-9078
  • GP + E-86 and GP + envAm-12 US Pat. No. 5,278,056
  • Psi-Crip [American Academy of Sciences, Vol. 85, No. 6460-6464 (1988)] is exemplified.
  • Retroviral particles can also be produced using 293 cells or 293T cells with high transfection efficiency.
  • Retrovirus vectors produced based on many types of retroviruses and packaging cells that can be used for packaging the vectors are widely available from various companies. From these retroviral vectors, it is possible to prepare a DNA fragment having the sequence used in the vector of the present invention. These packaging cells can also be used in the method of the present invention.
  • a retrovirus produced by pseudotype packaging having an envelope derived from a virus different from that of the genome of the retrovirus vector can also be used.
  • pseudotyped retroviruses having proteins that can function as envelopes or envelopes derived from MMLV, gibbon leukemia virus (GaLV), vesicular stomatitis virus (VSV), or feline endogenous virus (feline endogenous virus) can be used.
  • retroviral vector particles having a sugar chain-modified protein on its surface can be prepared.
  • a functional substance that improves the introduction efficiency can also be used (for example, International Publication No. 95/26200, International Publication No. 00/01836).
  • substances that improve the introduction efficiency include substances having an activity of binding to a viral vector, such as fibronectin or fibronectin fragments.
  • a fibronectin fragment having a heparin binding site for example, a fragment commercially available as RetroNectin (registered trademark, CH-296, manufactured by Takara Bio Inc.) can be used.
  • RetroNectin registered trademark, CH-296, manufactured by Takara Bio Inc.
  • polybrene, fibroblast growth factor, type V collagen, polylysine, or DEAE-dextran which is a synthetic polycation having an effect of improving the infection efficiency of retrovirus cells, can be used.
  • the functional substance is immobilized on a suitable solid phase, for example, a container (plate, petri dish, flask, bag, etc.) used for cell culture or a carrier (microbeads, etc.).
  • a suitable solid phase for example, a container (plate, petri dish, flask, bag, etc.) used for cell culture or a carrier (microbeads, etc.).
  • a container plate, petri dish, flask, bag, etc.
  • a carrier microbeads, etc.
  • Gene-transferred cell of the present invention is a cell into which the retroviral vector of (1) has been introduced by the production method of (2).
  • the gene-transferred cell of the present invention expresses an exogenous desired gene with high efficiency.
  • the gene-transferred cell of the present invention can be used for treatment of a drug containing the cell or a disease using the drug.
  • An embodiment of the present invention includes a gene-transferred cell into which an exogenous TCR that recognizes a specific antigen is introduced.
  • the disease to which a T cell into which an exogenous TCR is introduced is administered is not particularly limited as long as it is a disease sensitive to the T cell.
  • cancer leukemia, solid tumor, etc.
  • hepatitis Infectious diseases caused by viruses such as influenza and HIV, bacteria, and fungi, such as tuberculosis, MRSA, VRE, and deep mycosis are exemplified.
  • the cell of the present invention can also be used for donor lymphocyte infusion for the purpose of bone marrow transplantation, prevention of infection after irradiation, and remission of relapsed leukemia.
  • Example 1 Production of Fluorescent Protein-Expressing Lentiviral Vector Plasmid An artificially synthesized gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 was produced. This artificially synthesized gene has an MSCV-U3 promoter, a multicloning site, and an ORF encoding the fluorescent protein ZsGreen1. This artificially synthesized gene was cloned using the In-fusion HD Cloning Kit (Clontech) between ClaI and MluI of pLVSIN-CMV-NEO (Takara Bio), which is a lentiviral vector plasmid, and internal MSCV- A vector A (SEQ ID NO: 2) in which ZsGreen1 is expressed from the U3 promoter was prepared.
  • PCR was performed using the vector A as a template and the BF primer shown in SEQ ID NO: 3 and the BR primer shown in SEQ ID NO: 4 to prepare a vector B from which the RRE sequence was removed.
  • PCR was performed using vector A as a template and the CF primer shown in SEQ ID NO: 5 and the CR primer shown in SEQ ID NO: 6 to prepare vector C from which the WPRE sequence was removed.
  • PCR was carried out using the vector A as a template and the DE-F primer shown in SEQ ID NO: 7 and the DE-R primer shown in SEQ ID NO: 8 to obtain an amplified DNA fragment DE.
  • the amplified DNA fragment DE was connected to the amplification product obtained by PCR using the vector B as a template and the DF primer shown in SEQ ID NO: 9 and the DR primer shown in SEQ ID NO: 10 to prepare the vector D .
  • the amplified DNA fragment DE was connected to an amplification product obtained by PCR using the vector B as a template and the EF primer shown in SEQ ID NO: 11 and the ER primer shown in SEQ ID NO: 12, and the vector E ( SEQ ID NO: 13) was prepared.
  • Vector EC and vector HC were prepared.
  • the plasmid construct prepared as described above is shown in FIG.
  • Example 2 Preparation of Lentivirus Solution Escherichia coli JM109 was transformed with each of the 10 plasmid vectors prepared in Example 1 to obtain transformants. Plasmid DNAs retained by these transformants were purified using NucleoBond Xtra Midi Kit (manufactured by Mach Liner Gel) and subjected to the following operations as transfection DNA.
  • TransIT-293 Transfection Reagent manufactured by Miras
  • transfection was performed according to the product protocol.
  • a supernatant liquid containing a lentivirus having a VSVG envelope was obtained from each of the obtained transduced cells, and filtered through a 0.45 ⁇ m filter (Milex HV, manufactured by Millipore).
  • Example 3 Infection with a fluorescent protein-expressing lentiviral vector
  • the virus solution prepared in Example 2 was appropriately diluted, and human fibrosarcoma-derived cell line HT1080, human T-lymphocytic leukemia-derived cell line SupT1, and human acute myeloid leukemia-derived cells
  • the experiment of infecting strain KG1a once was carried out in duplicate.
  • Infection with HT1080 and KG1a was performed in the presence of 8 ⁇ g / mL polybrene.
  • the ratio of ZsGreen1-positive cells and the average fluorescence intensity of positive cells in the cells 3 and 4 days after virus infection were measured. Based on the ratio of positive cells obtained (positive rate), virus titer was calculated according to the following formula.
  • Virus titer number of infected cells ⁇ (positive rate% / 100) ⁇ liquid volume at infection (mL)
  • FIG. 2 shows a comparison of virus titers when vector A is 100%
  • FIG. 3 shows a comparison of average fluorescence intensities.
  • FIG. 2 it was confirmed that the three vectors E, G, and H had a significant increase in virus titer compared to the control A and other vectors.
  • the E and H vectors did not show a decrease in the expression level of the introduced gene.
  • Example 4 Infection with a WT1-TCR Expression Lentiviral Vector
  • This synthetic gene T is an ORF encoding a TCR that specifically recognizes the cancer antigen WT1 (hereinafter referred to as WT1-TCR), a restriction enzyme NotI on the 5 ′ end side, and a restriction enzyme XhoI site on the 3 ′ end side.
  • WT1-TCR cancer antigen WT1
  • NotI the cancer antigen WT1
  • XhoI site on the 3 ′ end side.
  • Have A fragment obtained by cleaving the synthetic gene T with restriction enzymes NotI and XhoI was inserted between NotI-XhoI of vectors A, E, H, C, EC, and HC prepared in Example 1, and vectors AT, ET, HT CT, ECT, HCT were prepared.
  • WT1- ⁇ represents a gene encoding the ⁇ chain of WT1-TCR
  • WT1- ⁇ represents a gene encoding the ⁇ chain of WT1-TCR
  • 2A represents a sequence encoding the 2A peptide.
  • Example 6 kinds of lentivirus solutions were prepared in the same manner as in Example 2 and infected once with SupT1.
  • Cells were stained with PE-labeled anti-V ⁇ 5.1-PE antibody (manufactured by Beckman Coulter) or PE-labeled anti-TCR ⁇ antibody (manufactured by Becton Dickinson), and the TCR positive rate was measured with a flow cytometer.
  • the virus titers measured and calculated in the same manner as in Example 3 were compared (FIG. 7). As shown in FIG. 7, even when WT1-TCR was expressed, an increase in virus titer was confirmed in ET, HT, ECT, and HCT.
  • PBMC Donor A, Donor B
  • PBMC peripheral blood collected from two donors with informed consent by a standard method using protamine. Infected once. Cells 3 days after virus infection were stained with HLA-A2402 WT1 tetramer-PE (MBL) and APCcy7-labeled anti-human CD8 antibody (Becton Dickinson). Using a flow cytometer, virus titers calculated by measuring the proportion of cells that were CD8 positive and tetramer positive were compared for the cells after staining (FIG. 8). As shown in FIG.
  • virus titers equivalent to or higher than those in AT and CT were confirmed in ET, HT, ECT, and HCT. From the above, by changing the RRE mounting position, an increase in virus titer was observed regardless of the gene mounted on the virus vector and the cells to be infected.
  • Example 5 Infection with an SA-removed lentiviral vector PCR was performed using the vector E as a template and the E2-F primer shown in SEQ ID NO: 17 and the E2-R primer shown in SEQ ID NO: 18 to introduce mutations into the SA2 sequence
  • Vector E2 was produced.
  • a vector E3 (SEQ ID NO: 16) from which a region containing the SA7 sequence was removed by performing PCR using the E3-F primer shown in SEQ ID NO: 19 and the E3-R primer shown in SEQ ID NO: 20 using the vector E2 as a template. was made.
  • Example 2 In the same manner as in Example 2, four types of lentivirus solutions of vector A, vector E, vector E2, and vector E3 were prepared and infected once with SupT1. Using a flow cytometer, the ZsGreen1 positive rate of cells 3 days after virus infection was measured, and the virus titers calculated in the same manner as in Example 3 were compared (FIG. 10). As shown in FIG. 10, a further increase in virus titer was confirmed by removing SA2 and SA7.
  • the present invention provides a retroviral vector that efficiently expresses a desired gene, a method for producing a gene-transferred cell using the vector, and a cell into which the vector has been introduced.
  • retroviral vectors, gene-transfected cell production methods and gene-introduced cells are extremely useful for protein production, disease treatment by cell therapy, and research and testing therefor.
  • SEQ ID NO: 1 Synthetic gene sequence
  • SEQ ID NO: 2 Vector A sequence SEQ ID NO: 3: BF primer sequence SEQ ID NO: 4: BR primer sequence SEQ ID NO: 5: CF primer sequence SEQ ID NO: 6: CR primer sequence SEQ ID NO: 7: DE-F primer sequence SEQ ID NO: 8: DE-R primer sequence SEQ ID NO: 9: DF primer sequence SEQ ID NO: 10: DR primer sequence SEQ ID NO: 11: EF primer sequence SEQ ID NO: 12: ER primer sequence SEQ ID NO: 13: Vector E sequence SEQ ID NO: 14: Vector H sequence SEQ ID NO: 15: Synthetic gene T sequence SEQ ID NO: 16: Vector E3 sequence SEQ ID NO: 17: E2-F primer sequence SEQ ID NO: 18: E2-R primer sequence SEQ ID NO: 19: E3-F primer sequence SEQ ID NO: 20: E3-R primer sequence

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Abstract

　本発明は、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）及び所望の遺伝子の塩基配列を含み、前記配列が５'から３'方向に、ｃＰＰＴ、ＲＲＥ及び所望の遺伝子の塩基配列の順に配置されていることを特徴とするレトロウイルスベクター、又は所望の遺伝子の塩基配列、ＰＲＥ及びＲＲＥを含み、前記配列が５'から３'方向に、所望の遺伝子の塩基配列、ＰＲＥ及びＲＲＥの順に配置されていることを特徴とするレトロウイルスベクター、前記レトロウイルスベクターを細胞に導入する工程を含む遺伝子導入細胞の製造方法、前記レトロウイルスベクターが導入された遺伝子導入細胞を提供する。

Description

高力価レトロウイルスベクター
　本発明は医学、薬学、農林水産学、食品学の分野において、細胞に遺伝子導入して形質転換するために用いるレトロウイルスベクター、前記ベクターが導入された細胞、ならびに前記ベクターを使用する遺伝子導入細胞の製造方法に関する。
　真核生物への遺伝子導入法としては、ウイルスベクターを用いる方法、裸のＤＮＡをエンドサイトーシスや電気穿孔法、遺伝子銃によって導入する技術などが知られている。ウイルスベクターは、遺伝子治療の分野で基礎から臨床まで幅広く利用されている技術であり、例えばアデノウイルスベクターは標的細胞で目的遺伝子を一過性に大量発現させるのに適しており、レトロウイルスベクターは、宿主染色体への安定な組み込み機能により長期安定発現が可能であり、遺伝子疾患の遺伝子治療の分野で期待されているベクターであり、また、トランスジェニック動物作製の分野でも期待されている技術である。
　レトロウイルスは、ウイルス粒子の構造タンパク質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼなどの前駆体タンパク質をコードするｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子、エンベロープ糖タンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を有する。これらの遺伝子の両端は、ウイルス遺伝子の転写、ウイルスゲノムからの逆転写、逆転写を経て合成された二本鎖ＤＮＡの宿主ＤＮＡへの組み込みに関わる５’ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ）及び３’ＬＴＲで挟まれている。レトロウイルス粒子を使用する遺伝子導入システムは、ウイルス粒子の感染力を保ちつつ自己複製を不可能にするため、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子とｅｎｖ遺伝子を発現する１つ又は２つのパッケージングコンストラクトと、レトロウイルスベクターに分割されている。レトロウイルスベクターはトランスファーベクターとも呼ばれ、ＬＴＲ及びウイルス粒子へのパッケージングシグナル配列を有し、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の大部分とｅｎｖ遺伝子が削除され、その代わりに所望の遺伝子が挿入されている。トランスファーベクターの５’ＬＴＲのプロモーター配列によりＲＮＡゲノムが転写され、パッケージングシグナル配列によりウイルス粒子にパッケージングされる。
　レトロウイルスの各遺伝子及びエレメントの機能が明らかにされつつあり、トランスファーベクターにも多数の改良が行われている（非特許文献１）。ＲＲＥ（Ｒｅｖ　Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）は、レンチウイルスのＲｅｖが結合しウイルスゲノムＲＮＡが効率よく核から細胞質へ輸送されるのに必要である。また、レトロウイルスは逆転写の際、３’ＬＴＲのすぐ上流にあるＰＰＴ（ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ　ｔｒａｃｔ）配列からプラス鎖の合成が始まるが、レンチウイルスにはゲノムの中央部分にｃＰＰＴ（ｃｅｎｔｒａｌ　ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ　ｔｒａｃｔ）と呼ばれる配列がもう１ヶ所あり、ここからも合成が行われるため、最終的な２本鎖ｃＤＮＡには中央にＤＮＡフラップと呼ばれる約１００塩基対の３本鎖構造が形成される。この３本鎖構造がプレインテグレーション複合体の核膜孔の通過に関与していると考えられている（特許文献１）。野生型のウイルスｃＰＰＴは、ＤＮＡゲノムの中央から数塩基に位置すること知られており、ｃＰＰＴが中央に位置することがウイルスベクターの力価に重要であることされている（特許文献１）。さらに、ＰＲＥ（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔ）はｍＲＮＡの安定性を高めると考えられており、ウッドチャック肝炎ウイルス由来のＰＲＥ（ＷＰＲＥ）がよく利用されている。
米国特許６６８２９０７号公報
モレキュラー　セラピー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１８巻、第３号、第４７７－４９０頁（２０１０）
　本発明の目的は、細胞に所望の遺伝子を導入してより効率よく発現させるためのレトロウイルスベクターを提供することにある。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、レトロウイルスベクターのエレメント（ドメイン）の配置を変更することにより、導入された遺伝子を効率よく発現するレトロウイルスベクターを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明を概説すれば、
［１］セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）及び所望の遺伝子の塩基配列を含み、前記配列が５’から３’方向に、ｃＰＰＴ、ＲＲＥ及び所望の遺伝子の塩基配列の順に配置されていることを特徴とするレトロウイルスベクター、
［２］所望の遺伝子の塩基配列の３’側に、さらに転写後調節配列（ＰＲＥ）を含む、［１］記載のレトロウイルスベクター、
［３］所望の遺伝子の塩基配列が、翻訳されてポリペプチドを産生する塩基配列である［１］記載のレトロウイルスベクター、
［４］レトロウイルスがレンチウイルスである［１］記載のレトロウイルスベクター、
［５］ｃＰＰＴの５’側に、さらにパッケージングシグナル配列を含み、パッケージングシグナル配列からＲＲＥの間のＳＡ配列及び／又はＳＡ様配列が除去されている、［１］記載のレトロウイルスベクター、
［６］所望の遺伝子の塩基配列、ＰＲＥ及びＲＲＥを含み、前記配列が５’から３’方向に、所望の遺伝子の塩基配列、ＰＲＥ及びＲＲＥの順に配置されていることを特徴とするレトロウイルスベクター、
［７］所望の遺伝子の塩基配列の５’側に、さらにｃＰＰＴを含む、［６］記載のレトロウイルスベクター、
［８］所望の遺伝子の塩基配列が、翻訳されてポリペプチドを産生する塩基配列である［６］記載のレトロウイルスベクター、
［９］レトロウイルスがレンチウイルスである［６］記載のレトロウイルスベクター、
［１０］［１］～［９］のいずれか１項記載のレトロウイルスベクターを細胞に導入する工程を含む遺伝子導入細胞の製造方法、
［１１］［１］～［９］のいずれか１項記載のレトロウイルスベクターが導入された遺伝子導入細胞、に関する。
　本発明により、効率よく所望の遺伝子が発現するレトロウイルスベクター、当該ベクターを使用する遺伝子導入細胞の製造方法、当該ベクターが導入された細胞が提供される。これらのレトロウイルスベクター、遺伝子導入細胞の製造方法及び遺伝子導入細胞は、タンパク質の製造、細胞医療による疾患の治療及びそのための研究、試験に極めて有用である。
実施例のレトロウイルスベクターの構造を示す図である。図中、ＰＢＳはプライマー結合サイト、ｐＭＳＣＶはマウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉｒｕｓ）－Ｕ３プロモーター、ＺｓＧｒｅｅｎは蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ１、Δ３’ＬＴＲはＵ３領域に変異を有するＳＩＮ型の３’ＬＴＲの各配列を示す。 各レトロウイルスベクターのウイルスタイターを示す図である。 遺伝子導入細胞の平均蛍光強度を示す図である。 各レトロウイルスベクターのウイルスタイターを示す図である。 遺伝子導入細胞の平均蛍光強度を示す図である。 実施例のレトロウイルスベクターの構造を示す図である。 各レトロウイルスベクターのウイルスタイターを示す図である。 各レトロウイルスベクターのウイルスタイターを示す図である。 実施例のレトロウイルスベクターの構造を示す図である。図中、ＰＢＳはプライマー結合サイト、ｐＭＳＣＶはマウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉｒｕｓ）－Ｕ３プロモーター、ＺｓＧｒｅｅｎは蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ１、Δ３’ＬＴＲはＵ３領域に変異を有するＳＩＮ型の３’ＬＴＲ、Δｅｎｖはｅｎｖ遺伝子の一部分の各配列を示す。 各レトロウイルスベクターのウイルスタイターを示す図である。
　本明細書において「Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ：Ｒｅｖ　Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、ＲＮＡ結合タンパク質であるＲｅｖポリペプチドが結合する配列である。ＲＲＥは、レンチウイルスのｅｎｖ遺伝子内に存在する約２４０塩基の配列である。ＲＲＥを含有するＲＮＡはこの配列の領域で複雑な２次構造をとりＲｅｖが結合する。ＲＲＥ配列を含有する構築物に搭載された遺伝子はＲｅｖポリペプチドに依存して効率的に発現する。
　本明細書において「セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ：ｃｅｎｔｒａｌ　ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ　ｔｒａｃｔ）」とは、レンチウイルスゲノムのほぼ中央に存在する約１５塩基の配列を意味し、これはレンチウイルスゲノムＲＮＡからの二本鎖ＤＮＡ合成の過程でプラス鎖ＤＮＡ合成のためのプライマー結合部位として働く配列である。レンチウイルスのＲＮＡゲノムが逆転写される際、セントラル終結配列（ＣＴＳ：ｃｅｎｔｒａｌ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と共に機能し、ＤＮＡフラップと呼ばれる３本鎖構造を形成する。
　本明細書において「転写後調節配列（ＰＲＥ：ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、細胞内で遺伝子から転写されたｍＲＮＡのポリアデニレーションの促進、ｍＲＮＡの核外輸送の促進又はｍＲＮＡの翻訳の活性化に寄与する配列のことを示す。レトロウイルスベクターの所望の遺伝子の非翻訳領域に挿入することにより、所望の遺伝子の発現が向上することが知られている。
　本明細書において「所望の遺伝子（ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」とは、細胞（例えば、細胞の核ゲノムや細胞質）中に一時的もしくは永続的のいずれかで人工的に（人為的な操作により）挿入されることが望まれる外来性の遺伝子を意味する。このような遺伝子には、導入する細胞に対して完全に異種由来又は部分的に異種由来である遺伝子が含まれ、また、任意の変異を有する遺伝子も含まれる。また、その細胞が天然に有している内在性遺伝子と同一の遺伝子でありうる。ここで「天然に」とは、人為的な操作が加えられていない状態であることを意味する。
　以下、本発明を具体的に説明する。
（１）本発明のレトロウイルスベクター
　本発明のレトロウイルスベクターは、ｃＰＰＴ、ＲＲＥ及び所望の遺伝子の塩基配列を含み、前記配列が５’から３’方向に、ｃＰＰＴ、ＲＲＥ及び所望の遺伝子の塩基配列の順に配置されていることを特徴とする。本発明の別の態様として、本発明のレトロウイルスベクターは、所望の遺伝子の塩基配列、ＰＲＥ及びＲＲＥを含み、前記配列が５’から３’方向に、所望の遺伝子の塩基配列、ＰＲＥ及びＲＲＥの順に配置されていることを特徴とする。本発明のベクターは、導入された細胞内における所望の遺伝子の発現効率が高い。本発明のベクターは、タンパク質の製造、細胞医療による疾患の治療及びそのための研究、試験に使用することができる。
　レトロウイルスは一本鎖ＲＮＡウイルスであり、そのウイルスゲノムには主要な要素として、その５’末端より５’ＬＴＲ配列、ＳＤ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ　Ｄｏｎｏｒ）配列、パッケージングシグナル配列、ｇａｇ遺伝子配列、ｐｏｌ遺伝子配列、ＳＡ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ　Ａｃｃｅｐｔｏｒ）配列、ｅｎｖ遺伝子配列及び３’ＬＴＲ配列が存在している。後述するレンチウイルスの場合にはこれらの要素に加えて複数のアクセサリー遺伝子が含まれている。このうち、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入システムにおいてトランスファーベクターに必須であるのは、５’ＬＴＲ配列、パッケージングシグナル配列、３’ＬＴＲ配列である。本発明のベクターは、さらにＲＲＥ、ｃＰＰＴ、ＰＲＥ、ＳＤ配列又はＳＡ配列を含みうる。レトロウイルス粒子の形成に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｒｅｖ、ｔａｔ等の遺伝子の産物は、これらの遺伝子を保持させたパッケージング細胞より供給され得る。
　本発明のベクターに含まれるＲＲＥには、レンチウイルスのＲｅｖが結合するｅｎｖ遺伝子の一部の配列が使用できる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）－１のＲＲＥはｅｎｖ遺伝子の２４３塩基［塩基番号７３６２～塩基番号７５９５：Ｍｕｅｓｉｎｇら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３１３巻、第４５０頁（１９８５）、米国特許第６２９４１６５号公報］を含む配列である。また、レンチウイルスに属するＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）由来の配列及びこれらの変異配列が使用できる。本発明のベクターのＲＲＥを含むｅｎｖ遺伝子由来の配列の長さは１０００塩基未満であり、好ましくは６００塩基未満、より好ましくは３００塩基未満、さらに好ましくは２５０塩基未満である。例えば、配列番号１３の塩基番号１９４２～２１７５の塩基配列がＲＲＥの配列として使用できる。
　本発明のベクターに含まれるｃＰＰＴは、プラス鎖ＤＮＡ合成のためのプライマー結合部位として働き、ＤＮＡフラップと呼ばれる３本鎖構造を形成するレンチウイルスのｐｏｌ遺伝子の一部の配列が使用できる。また、本発明に含まれるｃＰＰＴには、前記ＲＲＥの由来となるレンチウイルスに属するウイルス由来の配列及びこれらの変異配列が使用できる。本発明のベクターのｃＰＰＴを含むｐｏｌ遺伝子由来の配列の長さは、ＣＴＳと合わせて５００塩基未満であり、好ましくは２００塩基未満、より好ましくは１２５塩基未満である。例えば、配列番号１３の塩基番号１７９４～１９１７の塩基配列がｃＰＰＴの配列として使用できる。
　本発明のベクターに含まれるＰＲＥは、転写されたｍＲＮＡの安定化、ｍＲＮＡの核外輸送の促進又はｍＲＮＡの翻訳の活性化に寄与する配列が使用できる。例えば、構成的ＲＮＡ輸送因子（ＣＴＥ：ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ＲＮＡ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｅｌｅｍｅｎｔ）、Ｂ型肝炎などのヘパドナウイルスの転写後調節配列（ＨＰＲＥ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節配列（ＷＰＲＥ）が使用できる。ＷＰＲＥは、配列番号１３の塩基番号３３１２～３９０４の塩基配列である。
　本発明のベクターに含まれる５’ＬＴＲ配列、３’ＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列は、レトロウイルス由来の配列で哺乳動物細胞に遺伝子を導入することが可能な配列であればいずれも使用することができる。レトロウイルスは、オンコレトロウイルスとレンチウイルスのサブクラスを含み、いずれのクラスのウイルス由来の配列も本発明に使用できる。これらの配列は同一のウイルス由来の配列であってもよいが、適切なパッケージング細胞との組み合せによりウイルス粒子の形成や導入細胞ゲノムへの組み込みが可能な範囲で異なるウイルス由来の配列を組み合わせて使用してもよい。
　本発明に使用されるＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列には、例えば、オンコレトロウイルスに属するモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、脾限局巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）由来の配列が使用できる。オンコレトロウイルス由来のウイルスベクターは、高効率で遺伝子導入可能であるが、ベクターの導入の際に細胞が活発に細胞分裂を行っている必要がある。これらのオンコレトロウイルスベクターは多数の文献で説明されている［例えば米国特許第５，２１９，７４０号公報、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９０巻、第８０３３－８０３７頁（１９９３）］。
　また、本発明で使用するＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列には、前記ＲＲＥの由来となるレンチウイルスに属するウイルス由来の配列が使用できる。レンチウイルスベクターは、遺伝子を導入する細胞の有糸分裂に関係なく核内のゲノムに遺伝子を導入することができる。レンチウイルスベクターも多数の文献で説明されている［例えば、ジャーナル　オブ　ヴイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第７２巻、第８４６３－８４７１頁（１９９８）］。スプマウイルス属（例えば、泡沫状ウイルス）のような他のレトロウイルスのグループも、分裂していない細胞に効率的に形質導入することができる。
　本発明のベクターには、配列を変異させたＬＴＲ配列を使用することもできる。ＬＴＲは機能的に５’末端よりＵ３、Ｒ、Ｕ５の３つの領域に区分される。Ｕ３領域にはエンハンサー／プロモーター活性があり、宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩによって、ウイルスゲノムは５’ＬＴＲ配列のＲ領域から３’ＬＴＲ配列のＲ領域までが転写される。本発明のベクターには、Ｕ３領域に変異を導入してエンハンサー／プロモーター活性を欠失させた３’ＬＴＲを使用することができる。３’ＬＴＲ配列のＵ３領域に変異を導入してエンハンサー／プロモーター活性を欠失させることにより、ウイルスゲノムが染色体に組み込まれて形成されたプロウイルスでのＲ領域からの転写が抑制される。このように３’ＬＴＲ配列のＵ３領域を変異させたレトロウイルスベクターを自己不活性（ＳＩＮ）型ベクターと呼ぶ。３’ＬＴＲ配列への変異の導入は、塩基の置換又は欠失により実施される。
　また、５’ＬＴＲ配列のＵ３領域を、そのＬＴＲ配列が由来するウイルス以外に由来する外来性プロモーターに置換したＬＴＲ配列も本発明に使用できる。置換する外来性のプロモーターは、ウイルス又は哺乳動物由来の配列を使用することができ、構成的、誘導性又は組織特異的なプロモーターが使用できる。例えばヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（米国特許第５３８５８３９号公報）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ　Ｕ３領域［セル（Ｃｅｌｌ）、第２２巻、第７８７－７９７頁（１９８０）］、ＳＶ４０初期プロモーター領域［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２９０巻、第３０４－３１０頁（１９８１）］、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）等のウイルス由来プロモーターや、ポリペプチド鎖伸長因子（ＥＦ）１α遺伝子、ホスホグリセレート　キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子、βアクチン遺伝子、グロビン遺伝子、エラスターゼ遺伝子、アルブミン遺伝子、α－フェトプロテイン遺伝子及びインスリン遺伝子から選択される遺伝子に由来する哺乳動物由来プロモーターが使用できる。
　ＳＩＮ型ベクターはプロウイルスでのＬＴＲのＲ領域からの転写が抑制されているため、所望の遺伝子を発現させるためのプロモーター配列をＬＴＲとは別に配置する必要がある。さらに、複数の所望の遺伝子を発現させる場合にも、ＬＴＲとは別のプロモーター配列を配置する。このような、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲの間に存在するプロモーター配列を内部プロモーター配列と言うことがある。内部プロモーター配列は、ウイルス由来又は哺乳動物遺伝子由来のプロモーター配列が使用できる。ウイルス由来のプロモーター配列を使用する場合は、５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ又はパッケージングシグナル配列が由来するウイルスと同一のウイルス由来の配列又は異なるウイルス由来の配列を使用できる。例えば、レトロウイルスのＬＴＲのＵ３領域由来のプロモーター配列、例えば、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）のＬＴＲのＵ３領域由来のプロモーター配列等が使用できる。また、内部プロモーター配列は、前段落の５’ＬＴＲ配列のＵ３領域を置換する外来性プロモーターとして例示する配列が使用できる。
　本発明のベクターは、ＳＤ配列及び／又はＳＡ配列を含みうる。例えば、ベクターに搭載されたＬＴＲやパッケージングシグナルとは異なる遺伝子に由来するＳＤ配列及び／又はＳＡ配列が使用できる。「異なる遺伝子に由来する」とは、前記の各エレメントが同種のウイルス又は哺乳動物の異なる遺伝子に由来すること、もしくは異なるウイルス又は哺乳動物に由来することを意味する。また、ＳＤ配列及びＳＡ配列は、互いに異なる遺伝子に由来する配列であってもよい。例えば、ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ（ＳＶ）４０の１６Ｓ　ＲＮＡ、ＨＣＭＶのｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ＲＮＡ、ヒトのｈＥＦ１α遺伝子由来のＳＤ配列及びＳＡ配列が使用できる［米国科学アカデミー紀要、第９５巻、第１号、第２１９－２２３頁（１９９８）］。また、コンセンサス配列に変異を導入し、スプライシング活性を強化又は抑制されたＳＤ配列又はＳＡ配列も本発明のベクターに使用できる。
　逆に、本発明のベクターは、ＳＤ配列及び／又はＳＡ配列を除去しても良い。ＳＤ配列及び／又はＳＡ配列の除去は、これらの配列を置換又は欠失させることにより実施することができる。野生型レンチウイルスでは、ｃＰＰＴの３’側にｍａｊｏｒ　ＳＡ配列であるＳＡ２が存在する。ＲＲＥの３’側にＳＡ７ａ、ＳＡ７ｂ、ＳＡ７が存在する。各ＳＡ配列は、配列番号１３において、ＳＡ２は第１９２５番、ＳＡ７ａは第１６４５番、ＳＡ７ｂは１６５１番、ＳＡ７は１６７９番の塩基に相当する。さらに、ＳＡ配列として機能する可能性のある配列（ＳＡ様配列）を除去しても良い。本発明は、パッケージングシグナル配列からＲＲＥの間のＳＡ配列及び／又はＳＡ様配列を除去したベクターを含む。
　本発明のベクターに含まれる所望の遺伝子の塩基配列は、ベクターを導入する細胞で発現させたい遺伝子配列である。当該遺伝子配列には、例えばポリペプチドをコードする配列、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）、ｔＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ等の細胞内で機能するＲＮＡをコードする配列が含まれる。本発明のベクターにおける所望の遺伝子の塩基配列を、制限酵素認識配列を複数個並べた配列（マルチクローニングサイト）に置換したベクターは、マルチクローニングサイトを利用して所望の遺伝子を容易に挿入することができる。所望の遺伝子の塩基配列の代わりにマルチクローニングサイトを有するベクターも本発明のベクターに含まれる。
　本発明の別の態様において、本発明のベクターは５’から３’方向に、パッケージングシグナル配列、ｃＰＰＴ、ＲＲＥ及び所望の遺伝子の塩基配列の順に配置されていることを特徴とする。この配列は、配列番号１３の塩基番号６８５～２１７５の配列又は配列番号１６の塩基番号６８５～１７２０の配列が例示される。この態様の本発明のベクターは、実施例で作製したベクターＥ及びベクターＥ３が例示される。ベクターＥは５’から３’方向に、５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル配列、ｃＰＰＴ、ＲＲＥ、内部プロモーター配列、所望の遺伝子の塩基配列、ＰＲＥ及び３’ＬＴＲの順に配置されている。ベクターＥ３は、ベクターＥのパッケージングシグナル配列とｃＰＰＴの間に存在するｅｎｖ遺伝子の配列を除去し、パッケージングシグナル配列とＲＲＥの間に存在するＳＡ及びＳＡ様配列を除去したベクターである。
　本発明の別の態様において、本発明のベクターは５’から３’方向に、所望の遺伝子の塩基配列、ＷＰＲＥ及びＲＲＥの順に配置されていることを特徴とする。ＷＰＲＥ及びＲＲＥの配列は、配列番号１４の塩基番号３０８１～３９２１の配列が例示される。この態様の本発明のベクターは、実施例で作製したベクターＨが例示される。ベクターＨは５’から３’方向に、５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル配列、ｃＰＰＴ、内部プロモーター配列、所望の遺伝子の塩基配列、ＰＲＥ、ＲＲＥ及び３’ＬＴＲの順に配置されている。
　本発明の一態様として、本発明のベクターに搭載される所望の遺伝子の塩基配列は、ポリペプチドの遺伝子の塩基配列が挙げられる。ここで、前記のポリペプチドには特に限定はなく、構造タンパク質、酵素、転写因子、レセプター、抗体が例示される。前記のポリペプチドは、例えばオリゴマータンパク質であってもよい。オリゴマータンパク質としては細胞表面タンパク質（膜タンパク質）であるレセプターであってもよく、実施例に例示された抗原認識レセプター、例えばＴ細胞レセプター（Ｔ細胞受容体：ＴＣＲ）をコードする配列が所望の遺伝子の塩基配列として好適である。
　ＴＣＲは、α鎖とβ鎖からなるヘテロダイマー（ヘテロ二量体）、γ鎖とδ鎖からなるヘテロダイマーの２種類が存在する。ＴＣＲの各鎖とも可変（Ｖ）領域、結合（Ｊ）領域、定常（Ｃ）領域からなる。ＴＣＲのＶ領域の多様性は、ＤＮＡの再編成によるＶ領域をコードする遺伝子セグメントの組み合わせと再編成結合部位のずれ、及び結合部位へのＮ配列の挿入によって生じる。α鎖とβ鎖のＶ領域には、アミノ酸配列の変異が特に高い超可変領域（ＣＤＲ）が認められる。本発明のベクターの一態様として、ＴＣＲのヘテロダイマーを構成する２つのポリペプチドをコードする遺伝子をポリシストロニックに連結した配列を所望の遺伝子とすることができる。前記２つの遺伝子は、自己切断ペプチドをコードする配列及びＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ：内部リボソーム進入部位）配列から選択される配列を介して相互に接続させることが可能である。２つの遺伝子の順はどちらでもよく、例えば５’末端からＴＣＲα鎖－ＴＣＲβ鎖の順、又はＴＣＲβ鎖－ＴＣＲα鎖の順のポリシストロニックな配列が使用できる。
　自己切断ペプチドは、ウイルスの２Ａペプチド又はそれと同等の機能を有する２Ａ様ペプチドから得ることが可能である。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）由来の２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ（ＰＴＶ－１）由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）及びＴｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎａ　ｖｉｒｕｓ（ＴａＶ）由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）から成る群から選択することができる。例えば、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＴ２Ａを使用することができる。２Ａペプチドは、エキスパート　オピニオン　オン　バイオロジカル　セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｌ　Ｔｈｅｒ）、第５巻、６２７－６３８頁（２００５）に総説されている。
　ＩＲＥＳ配列は、リボソームがシストロン（タンパク質コード領域）の開始コドン、例えばＡＵＧへ直接的に進入することを促進し、それによって、遺伝子のキャップ非依存的な翻訳を開始させるエレメントをいう［トレンズ　イン　バイオケミカル　サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｓｃｉ）、第１５巻、第１２号、第４７７－８３頁（１９９０）］。ＩＲＥＳ配列により連結された複数のシストロンを有する単一のｍＲＮＡから、複数のポリペプチドが翻訳される。
（２）本発明の遺伝子導入細胞の製造方法
　本発明の遺伝子細胞の製造方法は、前記（１）に記載する本発明のレトロウイルスベクターを細胞に導入する工程を包含することを特徴とする。当該工程は体外で実施される。
　本発明の方法には、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来の細胞が使用できる。本発明の方法に使用される細胞に特に限定はなく、任意の細胞を使用することができる。例えば、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄などの体液、組織又は器官より採取、単離、精製、誘導された細胞又は細胞集団（例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、血球系細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、血球細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、各種癌細胞株、歯周靭帯線維芽細胞又は神経幹細胞）を使用することができる。前記の細胞は生体より採取されたもの、又は細胞株として樹立されたもののどちらでもよい。製造された遺伝子導入細胞もしくは当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞より遺伝子導入細胞を製造することが好ましい。
　本発明の方法において、本発明のベクターを細胞に導入する工程は、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製し、細胞に感染させることにより実施することができる。例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－９０７８）、ＧＰ＋Ｅ－８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２（米国特許第５，２７８，０５６号公報）、Ｐｓｉ－Ｃｒｉｐ［米国科学アカデミー紀要、第８５巻、第６４６０－６４６４頁（１９８８）］のパッケージング細胞が例示される。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス粒子を作製することもできる。多くの種類のレトロウイルスを基に製造されたレトロウイルスベクター及び当該ベクターのパッケージングに使用可能なパッケージング細胞は、各社より広く市販されている。これらのレトロウイルスベクターから、本発明のベクターに使用される配列を有するＤＮＡ断片を調製することが可能である。また、これらのパッケージング細胞を本発明の方法に使用することができる。
　本発明には、当該レトロウイルスベクターのゲノムが由来するものとは異種のウイルス由来のエンベロープを有する、シュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）パッケージングによって作製されたレトロウイルスも使用することができる。例えばＭＭＬＶ、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ネコ内在性ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｖｉｒｕｓ）由来のエンベロープやエンベロープとして機能しうるタンパク質を有するシュードタイプレトロウイルスを使用することができる。さらに、糖鎖合成に関与する酵素遺伝子などを導入したパッケージング細胞を使用し、糖鎖修飾を受けたタンパクをその表面に有するレトロウイルスベクター粒子を調製することができる。
　本発明のベクターを細胞に導入する工程で、導入効率を向上させる機能性物質を用いることもできる（例えば、国際公開第９５／２６２００号パンフレット、国際公開第００／０１８３６号パンフレット）。導入効率を向上させる物質としては、ウイルスベクターに結合する活性を有する物質、例えばフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントなどの物質が挙げられる。好適には、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメント、例えばレトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、登録商標、ＣＨ－２９６、タカラバイオ社製）として市販されているフラグメントを用いることができる。また、レトロウイルスの細胞への感染効率を向上させる作用を有する合成ポリカチオンであるポリブレン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジン又はＤＥＡＥ－デキストランを使用することができる。
　本発明の好適な態様において、前記の機能性物質は適切な固相、例えば細胞培養に使用される容器（プレート、シャーレ、フラスコもしくはバッグ等）又は担体（マイクロビーズ等）に固定化された状態で使用することができる。
（３）本発明の遺伝子導入細胞
　本発明の遺伝子導入細胞は、前記（２）の製造方法により、前記（１）のレトロウイルスベクターが導入された細胞である。本発明の遺伝子導入細胞は、外来性の所望の遺伝子を高効率で発現している。本発明の遺伝子導入細胞は、当該細胞を含有する医薬や、当該医薬を使用する疾患の治療に使用することができる。
　本発明の一態様として、特定の抗原を認識する外来性ＴＣＲを導入した遺伝子導入細胞が挙げられる。外来性ＴＣＲが導入されたＴ細胞が投与される疾患としては、当該Ｔ細胞に感受性を示す疾患であればよく特に限定はないが、例えば、がん（白血病、固形腫瘍など）、肝炎や、インフルエンザ、ＨＩＶなどのウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症が例示される。また、本発明の細胞は、骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注などにも利用できる。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
実施例１　蛍光タンパク質発現レンチウイルスベクタープラスミドの作製
　配列番号１に示す塩基配列の人工合成遺伝子を作製した。この人工合成遺伝子はＭＳＣＶ－Ｕ３プロモーターとマルチクローニングサイト、蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ１をコードするＯＲＦを有する。この人工合成遺伝子を、レンチウイルスベクタープラスミドであるｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ－ＮＥＯ（タカラバイオ社製）のＣｌａＩ－ＭｌｕＩ間にＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用してクローニングし、内部ＭＳＣＶ－Ｕ３プロモーターからＺｓＧｒｅｅｎ１が発現するベクターＡ（配列番号２）を作製した。
　ベクターＡを鋳型とし、配列番号３に示すＢ－Ｆプライマーと配列番号４に示すＢ－Ｒプライマーを用いたＰＣＲを行い、ＲＲＥ配列を除去したベクターＢを作製した。同様に、ベクターＡを鋳型とし配列番号５に示すＣ－Ｆプライマーと配列番号６に示すＣ－Ｒプライマーを用いたＰＣＲを行い、ＷＰＲＥ配列を除去したベクターＣを作製した。
　ベクターＡを鋳型とし、配列番号７に示すＤＥ－Ｆプライマーと配列番号８に示すＤＥ－Ｒプライマーを用いたＰＣＲを行い増幅ＤＮＡ断片ＤＥを得た。次いでベクターＢを鋳型とし、配列番号９に示すＤ－Ｆプライマーと配列番号１０に示すＤ－Ｒプライマーを用いたＰＣＲにより得られた増幅産物に増幅ＤＮＡ断片ＤＥを接続し、ベクターＤを作製した。同様に、ベクターＢを鋳型とし、配列番号１１に示すＥ－Ｆプライマーと配列番号１２に示すＥ－Ｒプライマーを用いたＰＣＲにより得られた増幅産物に増幅ＤＮＡ断片ＤＥを接続し、ベクターＥ（配列番号１３）を作製した。
　さらに、ベクターＤを制限酵素ＡｐａＩとＣｌａＩで切断して得た断片、制限酵素ＸｈｏＩとＭｌｕＩで切断して得た断片、制限酵素ＰｓｔＩとＫｐｎＩで切断して得た断片を、ベクターＢのＡｐａＩ－ＣｌａＩ間、ＸｈｏＩ－ＭｌｕＩ間、ＰｓｔＩ－ＫｐｎＩ間にそれぞれ挿入し、ベクターＦ、ベクターＧ、ベクターＨ（配列番号１４）を作製した。
　また、ベクターＣを制限酵素ＸｈｏＩとＮｈｅＩで切断して得た断片、制限酵素ＮｏｔＩとＰｓｔＩで切断して得た断片を、ベクターＥのＸｈｏＩ－ＮｈｅＩ間、ベクターＨのＮｏｔＩ－ＰｓｔＩ間にそれぞれ挿入しベクターＥＣ、ベクターＨＣを作製した。
　以上により作製したプラスミドコンストラクトを図１に示す。
実施例２　レンチウイルス溶液の作製
　実施例１で作製した１０種のプラスミドベクターにより大腸菌ＪＭ１０９をそれぞれ形質転換し、形質転換体を得た。これら形質転換体の保持するプラスミドＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ　Ｘｔｒａ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（マッハライナーゲル社製）を用いてそれぞれ精製し、トランスフェクション用ＤＮＡとして以下の操作に供した。
　調製したトランスフェクション用ＤＮＡのそれぞれとＬｅｎｔｉ－Ｘ　ＨＴＸ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の各ベクターを、２９３Ｔ／１７細胞にそれぞれトランスフェククトした。トランスフェクション試薬にはＴｒａｎｓＩＴ－２９３　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を使用し、同製品プロトコールに従ってトランスフェクトを行った。得られた形質導入細胞のそれぞれよりＶＳＶＧエンベロープを持つレンチウイルスを含有する上清液を獲得し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ　ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過した。
実施例３　蛍光タンパク質発現レンチウイルスベクターの感染
　実施例２で作製したウイルス液を適宜希釈し、ヒト繊維肉腫由来細胞株ＨＴ１０８０、ヒトＴリンパ球性白血病由来細胞株ＳｕｐＴ１およびヒト急性骨髄性白血病由来細胞株ＫＧ１ａに対し１回感染させる実験を２連で行った。ＨＴ１０８０およびＫＧ１ａへの感染は８μｇ／ｍＬのポリブレン存在下で実施した。フローサイトメーターを使用し、ウイルス感染３、４日後の細胞のＺｓＧｒｅｅｎ１陽性細胞の割合と陽性細胞の平均蛍光強度を測定した。得られた陽性細胞の割合（陽性率）に基づき、下式に従ってウイルスタイターを算出した。
ウイルスタイター（ＩＦＵ／ｍＬ）＝感染細胞数×（陽性率％／１００）×感染時液量（ｍＬ）
　ベクターＡを１００％とした時のウイルスタイターを比較したものを図２に、平均蛍光強度を比較したものを図３に示す。図２に示されるように、Ｅ、Ｇ、Ｈの３つのベクターは、対照としたＡや他のベクターに比べて大幅なウイルスタイターの上昇が確認された。また、図３より、Ｅ、Ｈのベクターでは導入された遺伝子の発現量の低下が認められなかった。
　さらに、ベクターＡ、Ｅ、Ｈと、それぞれからＷＰＲＥ配列を除去したＣ、ＥＣ、ＨＣに関し、３種の細胞株（ＨＴ１０８０細胞株、ＳｕｐＴ１細胞株、ＫＧ１ａ細胞株）について同条件で２回感染させた。ウイルスタイターの測定結果を図４に、平均蛍光強度の測定結果を図５に示す。図４に示す通り、ＷＰＲＥを除去したベクターＥＣ、ＨＣでもベクターＥ、Ｈ同様にウイルスタイターの上昇が確認された。また、図５に示す通り、感染させる細胞株によってＷＰＲＥを除去した際の平均蛍光強度に与える影響は異なるが、ＲＲＥ搭載位置を変更したものでもその変化は維持された。
実施例４　ＷＴ１－ＴＣＲ発現レンチウイルスベクターの感染
　配列番号１５に示す人工合成遺伝子（合成遺伝子Ｔ）を作製した。この合成遺伝子Ｔはがん抗原ＷＴ１を特異的に認識するＴＣＲ（以下、ＷＴ１－ＴＣＲと記載する）をコードするＯＲＦと、５’末端側に制限酵素ＮｏｔＩ、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩサイトを有する。合成遺伝子Ｔを制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩで切断して得た断片を実施例１で作製したベクターＡ、Ｅ、Ｈ、Ｃ、ＥＣ、ＨＣのＮｏｔＩ―ＸｈｏＩ間に挿入し、ベクターＡＴ、ＥＴ、ＨＴ、ＣＴ、ＥＣＴ、ＨＣＴを作製した。これらの構造を図６に示す。図６中、ＷＴ１－βはＷＴ１－ＴＣＲのβ鎖をコードする遺伝子を示し、ＷＴ１－αはＷＴ１－ＴＣＲのα鎖をコードする遺伝子を示し、２Ａは２Ａペプチドをコードする配列を示す。
　実施例２と同様に６種のレンチウイルス溶液を作製し、ＳｕｐＴ１に対し１回感染させた。ウイルス感染３、４日後の細胞をＰＥ標識抗Ｖβ５．１－ＰＥ抗体（ベックマンコールター社製）もしくはＰＥ標識抗ＴＣＲαβ抗体（ベクトンディッキンソン社製）で染色した後、フローサイトメーターにてＴＣＲ陽性率を測定し実施例３と同様に算出したウイルスタイターを比較した（図７）。図７に示す通り、ＷＴ１－ＴＣＲを発現させた場合でもＥＴ、ＨＴ、ＥＣＴ、ＨＣＴにてウイルスタイターの上昇が確認された。
　さらに、インフォームドコンセントの得られた２名のドナーより採取されたヒト末梢血より分離したＰＢＭＣ（ＤｏｎｏｒＡ、ＤｏｎｏｒＢ）に、プロタミンを用いた標準的な方法で前記の６種のレンチウイルス溶液をそれぞれ１回感染させた。ウイルス感染３日後の細胞をＨＬＡ－Ａ２４０２　ＷＴ１　テトラマー－ＰＥ（ＭＢＬ社製）及びＡＰＣｃｙ７標識抗ヒトＣＤ８抗体（ベクトンディッキンソン社製）により染色した。フローサイトメーターを使用し、染色後の細胞について、ＣＤ８陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定して算出したウイルスタイターを比較した（図８）。図８に示す通り、ＰＢＭＣでもＡＴ、ＣＴに対し、ＥＴ、ＨＴ、ＥＣＴ、ＨＣＴで同等以上のウイルスタイターが確認された。
　以上より、ＲＲＥ搭載位置を変更することにより、ウイルスベクターに搭載する遺伝子や感染させる細胞を問わずウイルスタイターの上昇が認められた。
実施例５　ＳＡ除去型レンチウイルスベクターの感染
　ベクターＥを鋳型とし、配列番号１７に示すＥ２－Ｆプライマーと配列番号１８に示すＥ２－Ｒプライマーを用いたＰＣＲを行い、ＳＡ２配列に変異を導入したベクターＥ２を作製した。同様に、ベクターＥ２を鋳型とし、配列番号１９に示すＥ３－Ｆプライマーと配列番号２０に示すＥ３－Ｒプライマーを用いたＰＣＲを行い、ＳＡ７配列を含む領域を除去したベクターＥ３（配列番号１６）を作製した。これらの構造を図９に示す。
　実施例２と同様に、ベクターＡ、ベクターＥ、ベクターＥ２、ベクターＥ３の４種のレンチウイルス溶液を作製し、ＳｕｐＴ１に対し１回感染させた。フローサイトメーターを使用し、ウイルス感染３日後の細胞のＺｓＧｒｅｅｎ１陽性率を測定し、実施例３と同様に算出したウイルスタイターを比較した（図１０）。図１０に示す通り、ＳＡ２およびＳＡ７を除去することによりさらなるウイルスタイターの上昇が確認された。
　本発明により、効率よく所望の遺伝子が発現するレトロウイルスベクター、当該ベクターを使用する遺伝子導入細胞の製造方法、当該ベクターが導入された細胞が提供される。これらのレトロウイルスベクター、遺伝子導入細胞の製造方法及び遺伝子導入細胞は、タンパク質の製造、細胞医療による疾患の治療及びそのための研究、試験に極めて有用である。
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Claims (11)

  1. 　セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）及び所望の遺伝子の塩基配列を含み、前記配列が５’から３’方向に、ｃＰＰＴ、ＲＲＥ及び所望の遺伝子の塩基配列の順に配置されていることを特徴とするレトロウイルスベクター。
  2. 　所望の遺伝子の塩基配列の３’側に、さらに転写後調節配列（ＰＲＥ）を含む、請求項１記載のレトロウイルスベクター。
  3. 　所望の遺伝子の塩基配列が、翻訳されてポリペプチドを産生する塩基配列である、請求項１記載のレトロウイルスベクター。
  4. 　レトロウイルスがレンチウイルスである請求項１記載のレトロウイルスベクター。
  5. 　ｃＰＰＴの５’側に、さらにパッケージングシグナル配列を含み、パッケージングシグナル配列からＲＲＥの間のＳＡ配列及び／又はＳＡ様配列が除去されている、請求項１記載のレトロウイルスベクター。
  6. 　所望の遺伝子の塩基配列、ＰＲＥ及びＲＲＥを含み、前記配列が５’から３’方向に、所望の遺伝子の塩基配列、ＰＲＥ及びＲＲＥの順に配置されていることを特徴とするレトロウイルスベクター。
  7. 　所望の遺伝子の塩基配列の５’側に、さらにｃＰＰＴを含む、請求項６記載のレトロウイルスベクター。
  8. 　所望の遺伝子の塩基配列が、翻訳されてポリペプチドを産生する塩基配列である、請求項６記載のレトロウイルスベクター。
  9. 　レトロウイルスがレンチウイルスである請求項６記載のレトロウイルスベクター。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項記載のレトロウイルスベクターを細胞に導入する工程を含む遺伝子導入細胞の製造方法。
  11. 　請求項１～９のいずれか１項記載のレトロウイルスベクターが導入された遺伝子導入細胞。
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