CN117642420A - 含有截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的脂质颗粒及相关方法和用途 - Google Patents
含有截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的脂质颗粒及相关方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本文提供了脂质颗粒,诸如慢病毒颗粒,其掺入截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白或用截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化,所述截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白含有具有部分抑制性R肽的胞质尾部,所述部分抑制性R肽小于全长野生型BaEV抑制性R肽。本文还提供了编码所述截短的BaEV包膜糖蛋白的多核苷酸和用于制备含有所述截短的BaEV包膜糖蛋白的所述脂质颗粒诸如慢病毒颗粒的生产细胞,以及用于制备和使用所述脂质颗粒诸如慢病毒颗粒的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年5月28日提交的标题为“含有截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的脂质颗粒及相关方法和用途(LIPID PARTICLES CONTAINING ATRUNCATED BABOON ENDOGENOUS RETROVIRUS(BaEV)ENVELOPE GLYCOPROTEIN AND RELATEDMETHODS AND USES)”的美国临时申请号63/194,880的优先权,该临时申请的内容据此以引用方式全文并入以用于所有目的。
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技术领域
本公开涉及脂质颗粒,诸如慢病毒颗粒,其掺入截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白或用截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化,该截短的狒狒内源性逆转录病毒包膜糖蛋白含有具有部分抑制性R肽的胞质尾部,该部分抑制性R肽小于全长野生型BaEV抑制性R肽。本公开还提供了编码截短的BaEV包膜糖蛋白的多核苷酸和用于制备含有截短的BaEV包膜糖蛋白的脂质颗粒诸如慢病毒颗粒的生产细胞,以及用于制备和使用脂质颗粒诸如慢病毒颗粒的方法。
发明内容
脂质颗粒(包括病毒样颗粒和病毒载体,诸如慢病毒颗粒)通常用于将外源药剂递送至细胞。对于各种颗粒,诸如慢病毒载体颗粒,可以通过用异源包膜蛋白假型化来改变宿主范围。具有某些异源假型包膜蛋白的颗粒的有效制备和产生可能并不总是有效的,例如由于包膜蛋白对产生的慢病毒载体颗粒的低滴度的影响。需要改进的脂质颗粒,包括病毒样颗粒和病毒载体,其能够以较高滴度和所需细胞的高效转导效率产生。所提供的公开内容解决了这种需要。
本文提供了一种狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型慢病毒颗粒,其包含截短的BaEV包膜糖蛋白,该截短的BaEV包膜糖蛋白包含相对于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中该部分融合抑制性R肽包含至少一个氨基末端氨基酸,但小于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的全长。
本文还提供了一种狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型慢病毒颗粒,其包含截短的BaEV包膜糖蛋白,该截短的BaEV包膜糖蛋白相对于野生型BaEV包膜糖蛋白包含具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中该胞质尾部的长度为25个氨基酸,并且含有野生型BaEV包膜糖蛋白的全长抑制性R肽的抑制性R肽(R+8)的8个连续的氨基末端酸。
在任何所提供的实施方案中的一些中,慢病毒颗粒是复制缺陷型的。在任何所提供的实施方案中的一些中,所提供的慢病毒颗粒通过包括用编码Gag-pol、Rev、Tat和截短的BaEV包膜糖蛋白的包装质粒转导生产细胞的方法制备。
在任何所提供的实施方案中的一些中,慢病毒颗粒还包含病毒核酸。在任何实施方案中的一些中,病毒核酸包含以下核酸序列中的一种或多种(例如,全部):5'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3结构域)、Psi包装元件(Psi)、中央多嘌呤区(cPPT)/中央终止序列(CTS)(例如DNA瓣)、聚A尾序列、转录后调控元件(例如WPRE)、Rev反应元件(RRE)和3'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3)。在任何实施方案中的一些中,慢病毒颗粒不含病毒基因组DNA。
本文提供了一种包含截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的脂质颗粒,其包含:(a)包围内腔的脂质双层,以及(b)截短的BaEV包膜糖蛋白,其包含相对于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中该部分融合抑制性R肽包含至少一个连续的氨基末端氨基酸,但小于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的抑制性R肽的全长,其中包膜糖蛋白包埋在脂质双层中。
本文提供了一种包含截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的脂质颗粒,其包含:(a)包围内腔的脂质双层,以及(b)截短的BaEV包膜糖蛋白,其包含相对于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中该胞质尾部的长度为25个氨基酸,并且含有野生型BaEV包膜糖蛋白的全长抑制性R肽的抑制性R肽的8个连续氨基末端酸(R+8),其中包膜糖蛋白包埋在脂质双层中。
在任何所提供的实施方案中的一些中,脂质双层源自用于产生逆转录病毒或逆转录病毒样颗粒的宿主细胞的膜。在任何实施方案中的一些中,宿主细胞选自由以下组成的组:CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。
在任何所提供的实施方案中的一些中,脂质双层是或包含除BaEV包膜糖蛋白以外的一种或多种其他病毒组分。在任何所提供的实施方案中的一些中,一种或多种病毒组分来自逆转录病毒。在任何所提供的实施方案中的一些中,逆转录病毒是慢病毒或慢病毒样颗粒。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV糖蛋白包含:(i)糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分,以及(ii)糖蛋白p20E(p20E)亚基的一部分,其包含具有部分抑制性R肽的胞质尾部。在任何实施方案中的一些中,糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分和糖蛋白p20E(p20E)亚基的该部分通过亚基间二硫键缔合。在任何实施方案中的一些中,BaEV糖蛋白结合ASCT-2或ASCT-1受体。
在任何所提供的实施方案中的一些中,糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列,或表现出与SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列至少至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中,糖蛋白p20E(p20E)亚基的该部分包含SEQ ID NO:26,或表现出与SEQ ID NO:26至少至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列,并且包含部分抑制性R肽。
在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白相对于SEQ ID NO:24是截短的,并且缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的多达16个连续氨基酸。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白相对于SEQ ID NO:24是截短的,并且缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的8至14个连续氨基酸,任选地缺乏来自SEQ IDNO:24的C末端胞质尾部的8至13个连续氨基酸。
在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至9所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:14(R+9)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:37中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至8所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:13(R+8)中所示。
在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:36中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至7所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:12(R+7)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:35中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至6所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:11(R+6)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:34中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQID NO:22的氨基酸1至5所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:10(R+5)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:33中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至4所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:9(R+4)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:32中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至3所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:8(R+3)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:31中所示。
在任何所提供的实施方案中的一些中,颗粒还包含外源药剂。在任何实施方案中的一些中,外源药剂存在于内腔中。在任何所提供的实施方案中的一些中,外源药剂是蛋白质或核酸,任选地其中该核酸是DNA或RNA。在任何所提供的实施方案中的一些中,颗粒被产生为与参考颗粒配制物相比滴度增加的配制物,该参考颗粒配制物类似地产生但掺入了具有胞质尾部的BaEV包膜糖蛋白,该胞质尾部具有全长R肽或长度为10个或更多个氨基酸的R肽的一部分。
在任何所提供的实施方案中的一些中,滴度增加等于或大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多,任选地等于或约或大于5倍或更多。在任何所提供的实施方案中的一些中,转导后靶细胞、任选地HEK293细胞中的滴度为等于或大于3×106TU/mL、等于或大于4×106TU/mL、等于或大于5×106TU/mL、等于或大于6×106TU/mL、等于或大于7×106TU/mL、等于或大于8×106TU/mL、等于或大于9×106TU/mL、等于或大于1×107TU/mL或等于或大于1.2×107TU/mL。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白以至少约(0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2或0.5)个截短的BaEV包膜糖蛋白/nm2的密度存在于颗粒的表面上。
本文提供了一种截短的BaEV包膜糖蛋白,相对于野生型BaEV包膜糖蛋白包含具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中该部分融合抑制性R肽包含野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的至少一个连续氨基末端氨基酸,但小于全长。
在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV糖蛋白包含:(i)糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分,以及(ii)糖蛋白p20E(p20E)亚基的一部分,其包含具有部分抑制性R肽的胞质尾部。在任何实施方案中的一些中,糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分和糖蛋白p20E(p20E)亚基的该部分通过亚基间二硫键缔合。
在任何所提供的实施方案中的一些中,BaEV糖蛋白结合ASCT-2或ASCT-1受体。
在任何所提供的实施方案中的一些中,糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列,或表现出与SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列至少至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中,糖蛋白p20E(p20E)亚基的该部分包含SEQ ID NO:26,或表现出与SEQ ID NO:26至少至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列,并且包含部分抑制性R肽。
在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白相对于SEQ ID NO:24是截短的,并且缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的多达16个连续氨基酸。在任何实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白相对于SEQ ID NO:24是截短的,并且缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的8至14个连续氨基酸,任选地缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的8至13个连续氨基酸。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至9所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:14(R+9)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:37中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至8所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:13(R+8)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:36中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至7所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:12(R+7)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:35中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQID NO:22的氨基酸1至6所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:11(R+6)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:34中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至5所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:10(R+5)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:33中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至4所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:9(R+4)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:32中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至3所示,任选地其中胞质尾部如SEQ ID NO:8(R+3)中所示。在任何所提供的实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:31中所示。
本文提供了一种多核苷酸,其包含编码任何所提供的实施方案的截短的BaEV包膜糖蛋白的核酸。在任何所提供的实施方案中的一些中,多核苷酸是密码子优化的。
在任何所提供的实施方案中的一些中,多核苷酸还包含可操作地连接以控制核酸表达的至少一个启动子。在任何实施方案中的一些中,启动子是组成型启动子。在任何所提供的实施方案中的一些中,启动子是诱导型启动子。
本文提供了一种包含任何所提供的多核苷酸的载体。本文提供了一种包含任何所提供的多核苷酸的质粒。在任何所提供的实施方案中的一些中,质粒还包含编码用于慢病毒产生的蛋白质的一种或多种核酸。
本文提供了一种包含任何所提供的多核苷酸、载体或质粒的细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中,细胞是用于产生慢病毒颗粒的生产细胞。
本文提供了一种生产细胞,其包含(i)病毒核酸和(ii)编码如权利要求43-64中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白的核酸,任选地其中病毒核酸是慢病毒核酸。在任何所提供的实施方案中的一些中,生产细胞选自由以下组成的组:CHO细胞BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中,生产细胞包括293T细胞。
在任何所提供的实施方案中的一些中,病毒核酸缺乏参与病毒复制的一个或多个基因。在任何所提供的实施方案中的一些中,病毒核酸包含编码选自Gag、Pol、Rev和Tat中的一种或多种的病毒包装蛋白的核酸。在任何所提供的实施方案中的一些中,病毒核酸包含以下核酸序列中的一种或多种(例如,全部):5'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3结构域)、Psi包装元件(Psi)、中央多嘌呤区(cPPT)/中央终止序列(CTS)(例如DNA瓣)、聚A尾序列、转录后调控元件(例如WPRE)、Rev反应元件(RRE)和3'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3)。
本文提供了一种制备包含截短的BaEV糖蛋白的脂质颗粒的方法,该方法包括:a)将任何所提供的多核苷酸、任何所提供的载体或任何所提供的质粒引入源细胞中;b)在允许产生脂质颗粒的条件下培养细胞,以及c)从细胞中分离、富集或纯化脂质颗粒,从而制备脂质颗粒。
在任何所提供的实施方案中的一些中,源细胞是哺乳动物细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中,源细胞是生产细胞,并且脂质颗粒是病毒颗粒或病毒样颗粒,任选地逆转录病毒颗粒或逆转录病毒样颗粒,任选地慢病毒颗粒或慢病毒样颗粒。
本文提供了一种制备假型慢病毒颗粒的方法,该方法包括:a)提供包含慢病毒核酸和任何所提供的编码截短的BaEV包膜糖蛋白或任何所提供的多核苷酸的核酸的生产细胞;b)在允许产生慢病毒颗粒的条件下培养细胞,以及c)从生产细胞中分离、富集或纯化慢病毒颗粒,从而制备假型慢病毒颗粒。
在任何所提供的实施方案中的一些中,生产细胞选自由以下组成的组:CHO细胞BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中,生产细胞包括293T细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中,该方法产生与参考慢病毒颗粒配制物相比具有增加的滴度的慢病毒配制物,该参考慢病毒颗粒配制物类似地产生但用具有胞质尾部的BaEV包膜糖蛋白假型化,该胞质尾部具有全长R肽或长度为10个或更多个氨基酸的R肽的一部分。
在任何所提供的实施方案中的一些中,滴度增加等于或大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多,任选地等于或约或大于5倍或更多。在任何所提供的实施方案中的一些中,该方法产生慢病毒配制物,该慢病毒配制物在转导后在靶细胞、任选地HEK293细胞中的滴度为等于或大于3×106TU/mL、等于或大于4×106TU/mL、等于或大于5×106TU/mL、等于或大于6×106TU/mL、等于或大于7×106TU/mL、等于或大于8×106TU/mL、等于或大于9×106TU/mL、等于或大于1×107TU/mL或等于或大于1.2×107TU/mL。在任何所提供的实施方案中的一些中,与类似的方法相比,该方法导致生产细胞的合胞体形成减少,但该方法用于产生用BaEV包膜糖蛋白假型化的参考慢病毒颗粒配制物,该BaEV包膜糖蛋白具有不含R肽(Rless)或相对于野生型BaEV包膜糖蛋白R肽长度为3个连续氨基末端氨基酸或更少的R肽的胞质尾部。在任何所提供的实施方案中的一些中,该方法产生具有高滴度(例如大于4×106TU/mL、大于5×106TU/mL、大于6×106TU/mL、大于7×106TU/mL、大于8×106TU/mL、大于9×106TU/mL、大于1×107TU/mL或大于1.2×107TU/mL)并且在产生方法期间生产细胞的合胞体形成最少的慢病毒配制物。
本文提供了一种通过任何所提供的方法产生的脂质颗粒。本文还提供了一种通过任何所提供的方法产生的慢病毒颗粒。
本文提供了一种包含任何所提供的截短的BaEV包膜糖蛋白的脂质颗粒。本文提供了一种包含多个任何所提供的慢病毒颗粒的组合物。本文提供了一种包含多个任何所提供的脂质颗粒的组合物。
在任何所提供的实施方案中的一些中,组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
本文提供了一种转导细胞的方法,该方法包括使细胞与任何所提供的慢病毒颗粒或任何所提供的组合物接触。在任何所提供的实施方案中的一些中,脂质颗粒或慢病毒载体包含外源药剂并且转导将外源药剂引入细胞中。
本文提供了一种将外源药剂递送至细胞中的方法,该方法包括使任何所提供的慢病毒颗粒或任何所提供的脂质颗粒或任何所提供的组合物与细胞接触。
在任何所提供的实施方案中的一些中,接触是体外或离体的。在任何所提供的实施方案中的一些中,接触是在受试者体内。
本文提供了一种向受试者的细胞递送外源药剂的方法,该方法包括向受试者施用任何所提供的慢病毒颗粒、脂质颗粒或组合物。
在任何所提供的实施方案中的一些中,细胞是造血谱系细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中,细胞选自由以下组成的组:骨髓-淋巴平衡的造血谱系细胞、骨髓偏向性造血谱系细胞、淋巴偏向性造血谱系细胞、血小板偏向性造血谱系细胞、血小板-骨髓偏向性造血谱系细胞、长期再增殖的造血谱系细胞、中期再增殖的造血谱系细胞或短期再增殖的造血谱系细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中,细胞选自单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞和血小板。在任何所提供的实施方案中的一些中,细胞选自T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和先天淋巴样细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中,细胞是造血干细胞(HSC)。在任何所提供的实施方案中的一些中,受试者已接受造血干细胞移植。
在任何所提供的实施方案中的一些中,外源药剂是蛋白质或核酸,任选地其中该核酸是DNA或RNA。在任何所提供的实施方案中的一些中,外源药剂是或编码用于治疗受试者的疾病或病症的治疗剂。在任何所提供的实施方案中的一些中,外源药剂是或编码膜蛋白,任选地嵌合抗原受体,用于靶向与受试者的疾病或病症相关的抗原。在任何所提供的实施方案中的一些中,外源药剂在基因治疗中使用以纠正受试者中的遗传缺陷或替换缺陷或缺失的基因。在任何所提供的实施方案中的一些中,受试者是人类受试者。
附图说明
图1描绘了用包装质粒和含有不同长度的抑制性R肽的各种截短的BaEV包膜糖蛋白转染的生产细胞产生的慢病毒载体颗粒的病毒滴度。
图2描绘了通过用包装质粒和含有不同长度的抑制性R肽的各种截短的BaEV包膜糖蛋白转染生产细胞来生产慢病毒载体颗粒期间生产细胞的合胞体形成。
图3描绘了在从用包装质粒和不同浓度的编码R+8截短的BaEV包膜糖蛋白的质粒转染的生产细胞产生后,用截短的BaEV包膜糖蛋白假型化的示例性慢病毒载体配制物的病毒滴度,该截短的BaEV包膜糖蛋白含有部分抑制性R肽,该部分抑制性R肽具有野生型BaEV包膜蛋白的R肽(R+8)的8个连续氨基末端氨基酸。
图4描绘了用BaEV+8、BaEVTR、BaEVRless或VSV-G假型载体转导八天后GFP+细胞的百分比。
具体实施方式
本文提供了用截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的脂质颗粒,诸如慢病毒颗粒,该截短的狒狒内源性逆转录病毒包膜糖蛋白相对于全长野生型BaEV包膜糖蛋白含有具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部。本文还提供了用截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的脂质颗粒,诸如慢病毒颗粒,该截短的狒狒内源性逆转录病毒包膜糖蛋白包含(i)糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分,以及(ii)包含部分融合抑制性R肽的糖蛋白p20E(p20E)亚基。在具体实施方案中,R肽含有抑制性R肽的至少三个连续氨基末端氨基酸。在具体实施方案中,部分融合抑制性R肽能够介导截短的BaEV包膜糖蛋白与所需靶细胞的融合。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白包埋在脂质颗粒中。脂质颗粒可以是非病毒颗粒、病毒颗粒或病毒样颗粒(VLP)。
所提供的实施方案基于BaEV包膜糖蛋白,其表现出特别适合于将基因转移至造血细胞(包括造血干细胞(HSC)以及静息T和B细胞)中的转导特性。这提供了用于将治疗性基因递送至能够分化为所有造血谱系的HSC的递送载体,以替换或校正与基因治疗方法相关的基因。此外,将基因有效转移到静止或静息的T和B淋巴细胞中用于基因治疗或免疫治疗也具有与病毒颗粒递送的离体和体内方法相关的许多优点。
BaEV包膜糖蛋白具有与其他逆转录病毒包膜糖蛋白相同的结构和功能特征,包括胞外结构域、跨膜结构域和胞质尾部结构域。BaEV包膜糖蛋白被合成为无活性前体,其被N-糖基化并被高尔基体中的宿主细胞弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶加工成两个亚基,即表面单位蛋白或gp70和跨膜蛋白p20E。gp70与p20E之间的切割位点需要最小序列[KR]-X-[KR]-R(其中X是任何氨基酸),并且gp70和p20E保持以可以包括二硫键的不稳定相互作用缔合。gp70通过结合受体将病毒附着于宿主细胞,该受体触发p20E的重折叠,这被认为会促进与宿主细胞膜的融合。p20E充当I类病毒融合蛋白,其与许多家族的融合蛋白(例如,HIV-1gp41或流感病毒血凝素[HA])共有共同的结构和功能特征。在天然条件下,BaEV包膜糖蛋白还在p20E的胞质结构域或胞质尾部中经历第二次切割。胞质尾部的C末端17个氨基酸(融合抑制性R肽)含有酪氨酸内吞信号YXXL,其因病毒蛋白酶的蛋白水解切割而被去除。R肽的去除与包膜糖蛋白融合性的促进有关(Beneviste等人(1974)Nature 248:17-20;Todaro等人(1974)Cell2:55-61;Aguilar等人(2003)Journal of Virology 77(2):1281-1291)。
虽然R肽切割增强融合性的机制尚不清楚,但可以通过在不存在病毒蛋白酶的情况下工程切割R肽来提高BaEV包膜糖蛋白的融合效率。已经鉴定出BaEV中完全切割17个氨基酸R肽的突变(US9249426,Bernardin等人(2019)Blood.3(3):461-475)。此外,尽管R肽之间的同源性较低,包括鼠白血病病毒(MuLV)与长臂猿白血病病毒(GaLV)之间的同源性仅为33%,但R肽是可互换的(Christodoulopoulos等人(2001)J.Viral 75(4):4129-4138)。已经确定了几种这样的研究,其中变体BaEV包膜糖蛋白的胞质尾部已被MuLV取代(US9249426,Bernardin等人(2019)Blood.3(3):461-475)。
然而,从胞质尾部截短完整的R肽使得包膜糖蛋白高度融合,导致大量合胞体形成(Olsen等人(1999)Journal of Virology 8975-8981;Ragheb等人(1994)J Virol.68:3220-3231;Rein等人(1994)J Virol1773-1781)。与全长R肽相比,包括形成MuLV和BaEV的各种包膜糖蛋白在缺乏R肽的细胞-细胞融合测定中表现出更强的诱导合胞体的能力(Aguilar(2003)J.Virol.77(2):1281-1291)。此外,慢病毒载体生产过程中的合胞体形成已被证明会导致低滴度,即使在尝试优化较高滴度方案的条件下(Bauler等人(2019)Molecular Therapy第17卷;Noguchi等人(2020)ASGCT 23rd Annual Meeting.Poster#988)。
虽然已经产生了掺入缺乏野生型R肽的BaEV的颗粒,但是在本文中发现具有低合胞体形成的超融合突变体是由BaEV包膜糖蛋白的特定尾部截短产生的。此外,本文发现,当表达R肽的特定氨基酸截短时,突变型BaEV包膜糖蛋白导致慢病毒配制物的滴度提高。例如,发现含有R肽的8个氨基酸的BaEV包膜糖蛋白的滴度是表达R肽的10个氨基酸的BaEV包膜糖蛋白的5倍。
所提供的脂质颗粒,诸如慢病毒颗粒,掺入了截短的BaEV包膜糖蛋白,该截短的BaEV包膜糖蛋白含有相对于全长野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部。部分融合抑制肽可以包含抑制性R肽的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个连续氨基末端氨基酸。在一些实施方案中,所提供的脂质颗粒,诸如慢病毒载体,在它们由生产细胞产生后表现出高滴度,特别是与含有完全抑制性R肽的全长BaEV包膜糖蛋白相比。此外,所提供的脂质颗粒,诸如慢病毒载体,表现出较低的融合活性,导致生产细胞的合胞体形成较少或最少,特别是与缺乏完整R肽(R-less)的突变BaEV包膜糖蛋白相比。
还提供了包含截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的颗粒,该截短的狒狒内源性逆转录病毒包膜糖蛋白相对于野生型BaEV包膜糖蛋白含有具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部。颗粒可以包括脂质颗粒、病毒颗粒、病毒样颗粒(VLP)、非病毒颗粒或合成颗粒、或本文所述的任何颗粒。
还提供了另外含有一种或多种外源药剂的颗粒,诸如用于将诊断剂或治疗剂递送至细胞,包括在体内施用于受试者之后。在一些实施方案中,外源药剂可以是转基因,诸如编码所需蛋白质的核酸,或者可以是异源蛋白质。在一些方面,转基因可以与基因治疗结合使用,诸如替换细胞中基因缺陷或缺损的基因。在一些实施方案中,外源药剂可以编码或是需要递送至靶细胞的蛋白质。在一些实施方案中,外源药剂编码或是嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中,外源药剂是或编码与基因编辑相关的因子。在一些实施方案中,外源药剂是或编码与碱基编辑和/或引导编辑(即,靶标引导逆转录(TPRT))相关的因子。在一些实施方案中,外源药剂编码或是核酸酶,诸如在基因编辑方法中使用。在一些实施方案中,核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR相关蛋白核酸酶(Cas)。在一些实施方案中,外源药剂是或编码转座酶和/或重组酶。在一些实施方案中,外源药剂是或编码DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶。
本文还提供了截短的BaEV包膜糖蛋白和颗粒的方法和用途,诸如在诊断和治疗方法中。还提供了多核苷酸、用于工程化、制备和产生糖蛋白和颗粒的方法,以及含有和用于使用、产生和施用颗粒的试剂盒和装置。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用整体并入,其程度如同每篇单独的出版物单独地通过引用并入一样。如果本文阐述的定义与以引用方式并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中阐述的定义相反或在其他方面不一致,则本文阐述的定义优先于以引用方式并入本文的定义。
本文所使用的章节标题仅用于组织目的,而不应被解释为限制所描述的主题。
I.定义
除非另外定义,否则本文所使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或术语学旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在一些情况下,为了清楚和/或为了便于参考,本文定义了具有通常理解的含义的术语,并且本文包括此类定义不应解释为表示与本领域通常理解的含义的显著差异。
如本文所用,冠词“一个/一种(a/an)”是指所述冠词的语法对象中的一个/一种或多于一个/多于一种(即,至少一个/至少一种)。例如,“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
如本文所用,术语“约”将为本领域普通技术人员所理解,并且将在其使用的上下文中在一定程度上变化。如本文所用,“约”当指可测量的值诸如量、短暂的持续时间等时,意指涵盖与指定值相差±20%或±10%、更优选±5%、甚至更优选±1%、以及还更优选±0.1%的变化,因为此类变化适于执行所公开的方法。
如本文所用,“脂质颗粒”是指包含围绕内腔或空腔的两亲性脂质双层的任何生物或合成颗粒。通常,颗粒不包含核。脂质颗粒的实例包括固体颗粒诸如纳米颗粒、病毒衍生的颗粒或细胞衍生的颗粒。此类脂质颗粒包括但不限于基于病毒的颗粒,诸如病毒样颗粒或病毒载体(例如,慢病毒载体)、外来体、去核细胞、各种囊泡(诸如微泡、膜囊泡、细胞外膜囊泡、质膜囊泡、巨质膜囊泡、凋亡小体)、有丝分裂颗粒、核红细胞(pyrenocyte)或溶酶体。在一些实施方案中,脂质颗粒可以是融合体(fusosome)。在一些实施方案中,脂质颗粒不是血小板。
术语“基于病毒的颗粒”可以是源自病毒或病毒蛋白的任何类型的脂质颗粒,例如病毒载体颗粒和病毒样颗粒。
术语“病毒载体颗粒”和“病毒载体”在本文中可互换使用。病毒载体颗粒可以是任何类型的脂质颗粒,其除了至少一种非结构病毒基因组组分或其功能片段(即,聚合酶、整合酶、蛋白酶或其他非结构组分)以外还包含一种或多种病毒结构蛋白。
术语“病毒样颗粒”或VLP可以是以至少一种病毒结构蛋白为特征并且不含病毒遗传物质的任何类型的颗粒。
如本文所用,“融合体”是指含有围绕内腔或空腔的两亲性脂质双层和与两亲性脂质双层相互作用的融合剂的颗粒。在一些实施方案中,融合体包含外源药剂。在一些实施方案中,外源药剂是核酸(例如DNA或RNA)、肽或蛋白质。在一些实施方案中,融合体是膜包围的配制物。在一些实施方案中,融合体来源于源细胞。
如本文所用,“融合体组合物”是指包含一种或多种融合体的组合物。
如本文所用,“融合剂”是指在两个膜(包括膜封闭的内腔)之间产生相互作用的试剂或分子。在实施方案中,融合剂促进膜的融合。在其他实施方案中,融合剂在两个膜或内腔(例如,逆转录病毒载体的内腔和靶细胞的细胞质)之间产生连接,例如小孔。
如本文所用,“逆转录病毒核酸”是指含有单独或与辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒组合包装到逆转录病毒或逆转录病毒载体中的至少最小序列要求的核酸。在一些实施方案中,逆转录病毒核酸包含5'LTR(例如,以促进整合)、U3(例如,以激活病毒基因组RNA转录)、R(例如,Tat结合区)、U5、3'LTR(例如,以促进整合)、包装位点(例如,psi(Ψ))、RRE(例如,以结合Rev并促进核输出)中的一个或多个(例如,全部)。逆转录病毒核酸可包含RNA(例如,当为病毒体的一部分时)或DNA(例如,当被引入源细胞中时或在受体细胞中逆转录之后)。在一些实施方案中,使用包含gag、pol和env中的一种或多种(例如,全部)的辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒来包装逆转录病毒核酸。
如本文所用,关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”和“同源性”被定义为在比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后,候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术内的各种方式(例如使用公众可获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件)来实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数,包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸取代可包括但不限于多肽中的一个氨基酸用另一种氨基酸替换。示例性取代示于表1中。可以将氨基酸取代引入感兴趣的抗体中,并筛选产物的所需活性,例如保留/改善的结合。
表1
可以根据共同的侧链特性对氨基酸进行分组:
(1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性亲水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)碱性:His、Lys、Arg;
(5)影响链取向的残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换成另一类别。
关于蛋白质的位置的术语“对应于”,诸如叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开的序列(诸如序列表中所示的)中的核苷酸或氨基酸位置,是指基于结构序列比对或使用标准比对算法(诸如GAP算法)与所公开的序列比对后鉴定的核苷酸或氨基酸位置。例如,相似序列(例如片段或物种变体)的对应残基可以通过结构比对方法与参考序列比对来确定。通过比对序列,本领域技术人员可以鉴定对应的残基,例如,使用保守的和同一的氨基酸残基作为指导。
如本文所用,术语“分离的”是指已与通常在自然界中发现或产生的至少一些组分分离的分子。例如,当多肽与产生它的细胞的至少一些组分分离时,所述多肽被称为“分离的”。当多肽在表达后由细胞分泌的情况下,从产生所述多肽的细胞中物理地分离含有所述多肽的上清液被认为是“分离”所述多肽。类似地,当多核苷酸不是其通常在自然界中发现的较大多核苷酸(例如在DNA多核苷酸的情况下为基因组DNA或线粒体DNA)的一部分时或与产生所述多核苷酸的细胞的至少一些组分分离(例如在RNA多核苷酸的情况下)时,将所述多核苷酸称为“分离的”。因此,在宿主细胞内的载体中包含的DNA多核苷酸可以被称为“分离的”。
如本文所用,术语“有效量”意指足以显著且正面地改变待治疗的症状和/或疾患(例如,提供正面临床反应)的药物组合物的量。用于药物组合物的活性成分的有效量将随所治疗的具体病症、病症的严重程度、治疗的持续时间、并行疗法的性质、所使用的具体活性成分、所使用的具体药学上可接受的赋形剂和/或载体和主治医师知识和专业知识内的类似因素而变化。
如本文所用,关于颗粒的“外源药剂”是指既不被相应的野生型病毒或由相应的野生型源细胞制备的融合剂包含也不被编码的试剂。在一些实施方案中,外源性剂不是天然存在的,诸如具有相对于天然存在的蛋白质改变(例如,通过插入、缺失或取代)的序列的蛋白质或核酸。在一些实施方案中,外源性剂不天然存在于源细胞中。在一些实施方案中,外源性剂天然存在于源细胞中,但对于病毒而言是外源的。在一些实施方案中,外源性剂不天然存在于受体细胞中。在一些实施方案中,外源性剂天然存在于受体细胞中,但不以期望的水平或在期望时间存在。在一些实施方案中,外源药剂包含RNA或蛋白质。
如本文所用,“启动子”是指当与基因编码序列可操作地连接时驱动基因转录的顺式调节DNA序列。启动子可包含转录因子结合位点。在一些实施方案中,启动子与基因远端的一个或多个增强子协同工作。
如本文所用,组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、混悬液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或它们的任何组合。
如本文所用,术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物活性或特性并且相对无毒的材料(诸如载体或稀释剂|),即,所述材料可以施用于个体而不引起不期望的生物效应或以有害方式与包含其的组合物的任何组分相互作用。
如本文所用,术语“药物组合物”是指本发明的至少一种化合物与其他化学组分(诸如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂和/或赋形剂)的混合物。药物组合物有助于将化合物施用于生物体。本领域中存在多种施用化合物的技术,包括但不限于静脉内、口服、气雾剂、肠胃外、眼部、肺部和局部施用。
如本文所用的“疾病”或“病症”是指需要和/或期望治疗的疾患。
如本文所用,术语“治疗(treat、treating或treatment)”是指改善疾病或病症,例如减缓或阻止或减少疾病或病症的发展或减少其至少一种临床症状。出于本公开的目的,改善疾病或病症可包括获得有益或期望的临床结果,所述有益或期望的临床结果包括但不限于以下中的任何一项或多项:减轻一种或多种症状、减小疾病程度、预防或延迟疾病的扩散(例如,转移,例如,转移至肺部或淋巴结)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减慢疾病进展、改善疾病状态、抑制疾病或疾病进展、抑制或减慢疾病或其进展、阻止其发展、和缓解(无论是部分还是全部)。
术语“个体”和“受试者”在本文中可互换使用,是指动物;例如哺乳动物。术语患者包括人和兽医受试者。在一些实施方案中,提供了治疗哺乳动物的方法,所述哺乳动物包括但不限于人、啮齿动物、猿、猫科动物、犬类、马科动物、牛、猪、绵羊、山羊、哺乳动物实验室动物、哺乳动物农场动物、哺乳动物运动动物和哺乳动物宠物。受试者可以是雄性或雌性,并且可以是任何合适的年龄,包括婴儿、少年、青少年、成年和老年受试者。在一些实例中,“个体”或“受试者”是指需要治疗疾病或病症的个体或受试者。在一些实施方案中,接受治疗的受试者可以是患者,表明所述受试者已经被鉴定为患有与治疗有关的病症或有足够风险患上所述病症的事实。在特定实施方案中,受试者是人,诸如人患者。
II.截短的BAEV融合剂
本文提供了截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白,其是脂质颗粒或者可以掺入脂质颗粒中,该脂质颗粒诸如病毒颗粒,包括慢病毒颗粒或慢病毒样颗粒。例如,本文提供了用任何所提供的截短的BaEV包膜糖蛋白假型化的慢病毒颗粒。本文还提供了编码截短的BaEV包膜糖蛋白的多核苷酸。
野生型BaEV包膜糖蛋白是含有C末端胞质尾部(例如对应于SEQ ID NO:4,或SEQID NO 24的氨基酸512-545)、跨膜结构域(例如对应于SEQ ID NO:3,或SEQ ID NO:24的氨基酸489-511)和胞外结构域(例如对应于SEQ ID NO:2,或SEQ ID NO:24的氨基酸1-488)的逆转录病毒包膜蛋白。需要最小序列[KR]-X-[KR]-R(其中X是任何氨基酸)的前体蛋白在高尔基体中的成熟产生两个亚基,即表面单位蛋白或gp70和跨膜蛋白p20E。表面单位蛋白或gp70(例如对应于SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:24的氨基酸1-358)和跨膜蛋白p20E(例如对应于SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:24的氨基酸359-545)保持以可以包括二硫键的不稳定相互作用缔合。在野生型BaEV包膜糖蛋白中,融合性由称为融合抑制性R肽(例如SEQ IDNO:22中所示)的17个短的氨基酸序列控制,该序列位于胞质尾部结构域的C末端。融合抑制性R肽带有酪氨酸内吞信号YXXL,并且其被病毒蛋白酶切割被认为通过包膜糖蛋白的跨膜结构域和胞外区中的分子重排来增强融合激活(Salamango等人(2015)Journalof virology 89(24):12492-12500)。
在野生型BaEV包膜糖蛋白中,gp70介导受体与宿主细胞上的ASCT-2和ASCT-1受体的结合。在一些实施方案中,糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分结合ASCT-2和ASCT-1受体。在野生型BaEV包膜糖蛋白中,p20E充当I类病毒融合蛋白。gp70亚基与宿主细胞膜的相互作用触发了p20E的重折叠,并被认为通过暴露融合肽来激活融合潜能。
在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白相对于野生型BaEV包膜糖蛋白包含具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中R肽含有抑制性R肽的连续部分,但缺乏野生型BaEV包膜糖蛋白的全长R肽。在一些实施方案中,相对于野生型BaEV包膜糖蛋白,截短的BaEV包膜糖蛋白具有由部分抑制性R肽组成的胞质尾部,该部分抑制性R肽具有抑制性R肽的至少一个、至少两个或至少三个连续氨基末端氨基酸,但小于全长R肽。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有胞质尾部,该胞质尾部具有由野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的1至16个连续氨基末端氨基酸组成的部分抑制性R肽,诸如由野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、12、14、15或16个氨基末端氨基酸组成。
在具体实施方案中,部分融合抑制性R肽包含1至9个连续氨基末端氨基酸,但小于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的全长。在具体实施方案中,部分融合抑制性R肽包含2至9个连续氨基末端氨基酸,但小于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的全长。在具体实施方案中,部分融合抑制性R肽包含3至9个连续氨基末端氨基酸,但小于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的全长。在具体实施方案中,部分融合抑制性R肽包含4至9个连续氨基末端氨基酸,但小于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的全长。在具体实施方案中,部分融合抑制性R肽包含5至9个连续氨基末端氨基酸,但小于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的全长。在具体实施方案中,部分融合抑制性R肽包含6至9个连续氨基末端氨基酸,但小于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的全长。在具体实施方案中,部分融合抑制性R肽包含7至9个连续氨基末端氨基酸,但小于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的全长。在具体实施方案中,部分融合抑制性R肽包含8至9个连续氨基末端氨基酸,但小于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的全长。在具体实施方案中,部分融合抑制性R肽包含9个连续氨基末端氨基酸,但小于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽的全长。
在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白由于含有部分抑制性R肽而含有比截短的BaEV包膜糖蛋白的全长胞质尾部小的胞质尾部。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有SEQ ID NO:4中所示的全长胞质尾部的一部分。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有胞质尾部,该胞质尾部含有SEQ ID NO:4的18至33个连续氨基末端氨基酸,诸如SEQ ID NO:4的18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个连续氨基末端氨基酸。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜的胞质尾部的长度为18至33个氨基酸,诸如长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个氨基酸。
在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白包含SEQ ID NO:23或24中任一个中所示的序列的一部分,其是保留融合活性的功能活性变体或其生物活性部分。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白缺乏来自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的多达16个连续氨基酸。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白缺乏SEQ ID NO:23或SEQID NO:24的C末端胞质尾部的1至16个连续氨基酸,诸如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续氨基酸。在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白缺乏SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的8至14个连续氨基酸。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白缺乏SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:24的C末端胞质尾部的8至13个连续氨基酸。
在一些实施方案中,所提供的截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白,诸如当掺入到脂质颗粒(例如慢病毒颗粒)中时,由两条链组成,所述两条链包含(i)糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分,以及(ii)糖蛋白p20E(p20E)亚基的一部分,其含有具有所描述的部分融合抑制性R肽的胞质结构域。
在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白gp70亚基具有SEQ ID NO:25中所示的序列,或者是其功能或生物学活性变体,其表现出与SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性。
在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白p20E亚基的部分具有SEQ ID NO:26中所示的序列,或者是其保留融合活性的功能或生物学活性变体,并且包含部分抑制性R肽。在一些实施方案中,p20E亚基的功能或生物活性变体包含表现出与SEQ ID NO:26至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列,并且包含部分抑制性R肽。在一些实施方案中,p20E亚基的部分具有SEQ ID NO:44-60中任一个中所示的序列。
在具体实施方案中,所提供的截短的BaEV包膜糖蛋白,诸如当掺入脂质颗粒(例如慢病毒颗粒)中时,表现出由部分融合抑制性R肽介导的融合活性。在一些实施方案中,所提供的含有部分融合抑制性R肽的截短的BaEV包膜糖蛋白保留了野生型BaEV包膜糖蛋白的融合活性。融合活性包括截短的BaEV包膜糖蛋白促进或推动两个膜腔和靶细胞(例如含有被截短的BaEV包膜蛋白识别或结合的表面受体或分子的细胞)的细胞质融合的能力。在一些实施方案中,本文提供的截短的BaEV包膜糖蛋白结合中性氨基酸转运蛋白受体ASCT-2或ASCT-1。ASCT-2和ASCT-1受体共有约57%的序列同一性,在细胞(例如T和B细胞)中差异表达,并且是一组重叠但不同一的中性氨基酸的转运蛋白(Colmartino等人(2019)Frontiersin Immunology 10(2873):1-7;Girard-Gagnepain等人(2014)Blood124:1221-1231;Levy等人(2016)Journal of Thrombosis and Haemostasis 14:2478-2492)。
关于保留融合活性,包括相应野生型BaEV包膜糖蛋白(诸如SEQ ID NO:24中所示)的结合水平或程度的10%至等于或约150%或更高的活性。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白的融合活性是相应野生型BaEV包膜糖蛋白(诸如SEQ ID NO:24中所示)的结合水平或程度的50%至125%。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白的融合活性是相应野生型BaEV包膜糖蛋白(诸如SEQ ID NO:24中所示)的结合水平或程度的80%至120%。
在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白的融合活性低于缺乏完全抑制性R肽(R-Less)的BaEV包膜糖蛋白的融合活性。例如,在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白的融合活性小于在野生型BaEV包膜糖蛋白的远端C末端部分具有17个氨基酸截短的R-LessBaEV包膜糖蛋白的融合活性,对应于SEQ ID NO:24的氨基酸529-545。在一些实施方案中,R-Less BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所提供的截短的BaEV包膜糖蛋白表现出R-Less BaEV包膜糖蛋白的融合活性的10%至90%,诸如小于R-Less BaEV包膜糖蛋白的融合活性的等于或约90%、等于或约85%、等于或约80%、等于或约75%、等于或约70%、等于或约60%、等于或约50%、等于或约40%、等于或约30%、等于或约20%或等于或约10%或更小,例如如SEQ ID NO:28中所示。在一些实施方案中,降低的融合活性避免了在产生所提供的脂质颗粒(例如慢病毒颗粒)期间高水平的细胞融合。例如,在产生脂质颗粒例如慢病毒颗粒的方法期间掺入截短的BaEV包膜糖蛋白避免或减少了在颗粒产生期间生产细胞的高水平合胞体形成。
在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有部分融合抑制性R肽,其含有野生型抑制性R肽的九个连续氨基末端氨基酸(例如R+9)。在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有如SEQ ID NO:22的氨基酸1至9中所示的部分融合抑制性R肽。在一些实施方案中,BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:14中所示的胞质尾部。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有这样的序列,其表现出与SEQ ID NO:37中所示的序列至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性,并且含有具有九个氨基酸的部分抑制剂肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1至9中所示。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有SEQID NO:37中所示的序列。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有gp70或其生物活性部分(例如SEQ ID NO:25中所示)和含有具有部分抑制性多肽的胞质结构域的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有SEQ ID NO:25中所示的gp70亚基和SEQ ID NO:53中所示的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,gp70亚基是s并且p20E部分通过亚基间二硫键缔合。
在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有部分融合抑制性R肽,其含有野生型抑制性R肽的八个连续氨基末端氨基酸(例如R+8)。在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有如SEQ ID NO:22的氨基酸1至8中所示的部分融合抑制性R肽。在一些实施方案中,BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:13中所示的胞质尾部。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有这样的序列,其表现出与SEQ ID NO:36中所示的序列至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性,并且含有具有八个氨基酸的部分抑制剂肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1至8中所示。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有SEQID NO:36中所示的序列。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有gp70或其生物活性部分(例如SEQ ID NO:25中所示)和含有具有部分抑制性多肽的胞质结构域的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有SEQ ID NO:25中所示的gp70亚基和SEQ ID NO:52中所示的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,gp70亚基是s并且p20E部分通过亚基间二硫键缔合。
在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有部分融合抑制性R肽,其含有野生型抑制性R肽的七个连续氨基末端氨基酸(例如R+7)。在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有如SEQ ID NO:22的氨基酸1至7中所示的部分融合抑制性R肽。在一些实施方案中,BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:12中所示的胞质尾部。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有这样的序列,其表现出与SEQ ID NO:35中所示的序列至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性,并且含有具有七个氨基酸的部分抑制剂肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1至7中所示。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有SEQID NO:35中所示的序列。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有gp70或其生物活性部分(例如SEQ ID NO:25中所示)和含有具有部分抑制性多肽的胞质结构域的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有SEQ ID NO:25中所示的gp70亚基和SEQ ID NO:51中所示的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,gp70亚基是s并且p20E部分通过亚基间二硫键缔合。
在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有部分融合抑制性R肽,其含有野生型抑制性R肽的六个连续的氨基末端氨基酸(例如R+6)。在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有如SEQ ID NO:22的氨基酸1至6中所示的部分融合抑制性R肽。在一些实施方案中,BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:11中所示的胞质尾部。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有这样的序列,其表现出与SEQ ID NO:34中所示的序列至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性,并且含有具有六个氨基酸的部分抑制剂肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1至6中所示。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:34中所示的序列。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有gp70或其生物活性部分(例如SEQ ID NO:25中所示)和含有具有部分抑制性多肽的胞质结构域的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有SEQ ID NO:25中所示的gp70亚基和SEQ ID NO:50中所示的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,gp70亚基是s并且p20E部分通过亚基间二硫键缔合。
在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有部分融合抑制性R肽,其含有野生型抑制性R肽的五个连续的氨基末端氨基酸(例如R+5)。在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有如SEQ ID NO:22的氨基酸1至5中所示的部分融合抑制性R肽。在一些实施方案中,BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:10中所示的胞质尾部。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有这样的序列,其表现出与SEQ ID NO:33中所示的序列至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性,并且含有具有五个氨基酸的部分抑制剂肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1至5中所示。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:33中所示的序列。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有gp70或其生物活性部分(例如SEQ ID NO:25中所示)和含有具有部分抑制性多肽的胞质结构域的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有SEQ ID NO:25中所示的gp70亚基和SEQ ID NO:49中所示的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,gp70亚基是s并且p20E部分通过亚基间二硫键缔合。
在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有部分融合抑制性R肽,其含有野生型抑制性R肽的四个连续的氨基末端氨基酸(例如R+4)。在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有如SEQ ID NO:22的氨基酸1至4中所示的部分融合抑制性R肽。在一些实施方案中,BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:9中所示的胞质尾部。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有这样的序列,其表现出与SEQ ID NO:32中所示的序列至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性,并且含有具有四个氨基酸的部分抑制剂肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1至4中所示。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:32中所示的序列。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有gp70或其生物活性部分(例如SEQ ID NO:25中所示)和含有具有部分抑制性多肽的胞质结构域的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有SEQ ID NO:25中所示的gp70亚基和SEQ ID NO:48中所示的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,gp70亚基是s并且p20E部分通过亚基间二硫键缔合。
在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有部分融合抑制性R肽,其含有野生型抑制性R肽的三个连续的氨基末端氨基酸(例如R+3)。在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有如SEQ ID NO:22的氨基酸1至3中所示的部分融合抑制性R肽。在一些实施方案中,BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:8中所示的胞质尾部。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有这样的序列,其表现出与SEQ ID NO:31中所示的序列至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性,并且含有具有三个氨基酸的部分抑制剂肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1至3中所示。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:31中所示的序列。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有gp70或其生物活性部分(例如SEQ ID NO:25中所示)和含有具有部分抑制性多肽的胞质结构域的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有SEQ ID NO:25中所示的gp70亚基和SEQ ID NO:47中所示的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,gp70亚基是s并且p20E部分通过亚基间二硫键缔合。
在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有部分融合抑制性R肽,其含有野生型抑制性R肽的两个连续的氨基末端氨基酸(例如R+2)。在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有如SEQ ID NO:22的氨基酸1至2中所示的部分融合抑制性R肽。在一些实施方案中,BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:7中所示的胞质尾部。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有这样的序列,其表现出与SEQ ID NO:30中所示的序列至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性,并且含有具有两个氨基酸的部分抑制剂肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1至1中所示。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:30中所示的序列。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有gp70或其生物活性部分(例如SEQ ID NO:25中所示)和含有具有部分抑制性多肽的胞质结构域的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有SEQ ID NO:25中所示的gp70亚基和SEQ ID NO:46中所示的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,gp70亚基是s并且p20E部分通过亚基间二硫键缔合。
在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有部分融合抑制性R肽,其含有野生型抑制性R肽的一个连续的氨基末端氨基酸(例如R+1)。在具体实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白含有如SEQ IDNO:22的氨基酸1中所示的部分融合抑制性R肽。在一些实施方案中,BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:6中所示的胞质尾部。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有这样的序列,其表现出与SEQ ID NO:29中所示的序列至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性,并且含有具有一个氨基酸的部分抑制性肽的胞质结构域,例如如SEQID NO:22的氨基酸中所示。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白具有SEQ ID NO:29中所示的序列。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有gp70或其生物活性部分(例如SEQ ID NO:25中所示)和含有具有部分抑制性多肽的胞质结构域的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白是含有SEQ ID NO:25中所示的gp70亚基和SEQ ID NO:45中所示的p20E亚基部分的双链形式。在一些实施方案中,gp70亚基和p20E部分通过亚基间二硫键缔合。
A.多核苷酸
本文提供了包含编码截短的BaEV包膜糖蛋白的核酸序列的多核苷酸,该截短的BaEV包膜糖蛋白含有相对于本文所述的野生型BaEV包膜糖蛋白具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部。多核苷酸可以包含编码上述任何截短的BaEV包膜糖蛋白的核苷酸序列。
在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其含有具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,该部分融合抑制性R肽含有野生型抑制性R肽的九个连续氨基末端氨基酸(例如R+9)。在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其具有这样的氨基酸序列,表现出与SEQ ID NO:37至少85%、至少90%或至少95%序列同一性,并且含有具有九个氨基酸的部分抑制性肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1-9中所示。在一些实施方案中,多核苷酸编码SEQ ID NO:37中所示的截短的BaEV包膜糖蛋白。
在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其含有具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,该部分融合抑制性R肽含有野生型抑制性R肽的八个连续氨基末端氨基酸(例如R+8)。在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其具有这样的氨基酸序列,表现出与SEQ ID NO:36至少85%、至少90%或至少95%序列同一性,并且含有具有八个氨基酸的部分抑制性肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1-8中所示。在一些实施方案中,多核苷酸编码SEQ ID NO:36中所示的截短的BaEV包膜糖蛋白。
在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其含有具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,该部分融合抑制性R肽含有野生型抑制性R肽的七个连续氨基末端氨基酸(例如R+7)。在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其具有这样的氨基酸序列,表现出与SEQ ID NO:35至少85%、至少90%或至少95%序列同一性,并且含有具有七个氨基酸的部分抑制性肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1-7中所示。在一些实施方案中,多核苷酸编码SEQ ID NO:35中所示的截短的BaEV包膜糖蛋白。
在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其含有具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,该部分融合抑制性R肽含有野生型抑制性R肽的六个连续氨基末端氨基酸(例如R+6)。在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其具有这样的氨基酸序列,表现出与SEQ ID NO:34至少85%、至少90%或至少95%序列同一性,并且含有具有六个氨基酸的部分抑制性肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1-6中所示。在一些实施方案中,多核苷酸编码SEQ ID NO:34中所示的截短的BaEV包膜糖蛋白。
在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其含有具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,该部分融合抑制性R肽含有野生型抑制性R肽的五个连续氨基末端氨基酸(例如R+5)。在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其具有这样的氨基酸序列,表现出与SEQ ID NO:33至少85%、至少90%或至少95%序列同一性,并且含有具有五个氨基酸的部分抑制性肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1-5中所示。在一些实施方案中,多核苷酸编码SEQ ID NO:33中所示的截短的BaEV包膜糖蛋白。
在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其含有具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,该部分融合抑制性R肽含有野生型抑制性R肽的四个连续氨基末端氨基酸(例如R+4)。在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其具有这样的氨基酸序列,表现出与SEQ ID NO:32至少85%、至少90%或至少95%序列同一性,并且含有具有四个氨基酸的部分抑制性肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1-4中所示。在一些实施方案中,多核苷酸编码SEQ ID NO:32中所示的截短的BaEV包膜糖蛋白。
在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其含有具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,该部分融合抑制性R肽含有野生型抑制性R肽的三个连续氨基末端氨基酸(例如R+3)。在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其具有这样的氨基酸序列,表现出与SEQ ID NO:31至少85%、至少90%或至少95%序列同一性,并且含有具有三个氨基酸的部分抑制性肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1-3中所示。在一些实施方案中,多核苷酸编码SEQ ID NO:31中所示的截短的BaEV包膜糖蛋白。
在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其含有具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,该部分融合抑制性R肽含有野生型抑制性R肽的两个连续氨基末端氨基酸(例如R+2)。在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其具有这样的氨基酸序列,表现出与SEQ ID NO:30至少85%、至少90%或至少95%序列同一性,并且含有具有两个氨基酸的部分抑制性肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸1-2中所示。在一些实施方案中,多核苷酸编码SEQ ID NO:30中所示的截短的BaEV包膜糖蛋白。
在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其含有具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,该部分融合抑制性R肽含有野生型抑制性R肽的一个连续氨基末端氨基酸(例如R+1)。在一些实施方案中,多核苷酸编码截短的BaEV包膜糖蛋白,其具有这样的氨基酸序列,表现出与SEQ ID NO:29至少85%、至少90%或至少95%序列同一性,并且含有具有一个氨基酸的部分抑制性肽的胞质结构域,例如如SEQ ID NO:22的氨基酸一中所示。在一些实施方案中,多核苷酸编码SEQ ID NO:29中所示的截短的BaEV包膜糖蛋白。
在一些实施方案中,多核苷酸可以是合成核酸。还提供了含有任何所提供的多核苷酸的表达载体。
在任何实施方案中的一些中,天然或合成核酸的表达通常通过将编码感兴趣的基因的核酸可操作地连接到启动子并将构建体整合到表达载体中来实现。在一些实施方案中,载体可以适合于在真核生物中复制和整合。在一些实施方案中,克隆载体含有可用于表达期望的核酸序列的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。在任何实施方案中的一些中,质粒包含适合于在细胞中表达的启动子。
在一些实施方案中,多核苷酸含有至少一个可操作地连接以控制截短的BaEV包膜糖蛋白的表达的启动子。为了表达截短的BaEV包膜糖蛋白,每个启动子中的至少一个模块起定位RNA合成的起始位点的作用。其最著名的实例是TATA盒,但在一些启动子中缺乏TATA盒,诸如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40基因的启动子,覆盖起始位点本身的离散元件有助于固定起始位置。
在一些实施方案中,另外的启动子元件例如增强子调节转录起始的频率。在一些实施方案中,另外的启动子元件位于起始位点上游30-110bp的区域,但是最近已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。在一些实施方案中,启动子元件之间的间隔通常是柔性的,使得当元件相对于彼此反转或移动时保持启动子功能。在一些实施方案中,胸苷激酶(tk)启动子,启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到相隔50bp。在一些实施方案中,取决于启动子,单个元件可以协同地或独立地起作用以激活转录。
启动子可以是与基因或多核苷酸序列天然相关的启动子,这可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5′非编码序列来获得。这种启动子可以被称为“内源的”。类似地,增强子可以是与多核苷酸序列天然相关的增强子,其位于该序列的下游或上游。可替代地,通过将编码多核苷酸区段置于重组或异源启动子的控制下将获得某些优点,所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与多核苷酸序列相关的启动子。重组或异源增强子也指在其天然环境中通常不与多核苷酸序列相关的增强子。此类启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子,和从任何其他原核、病毒或真核细胞分离的启动子或增强子,以及非“天然存在的”启动子或增强子,即含有不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列以外,还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCR)结合本文公开的组合物来产生序列(美国专利号4,683,202和5,928,906)。
在一些实施方案中,合适的启动子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。在一些实施方案中,启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。在一些实施方案中,合适的启动子是延伸生长因子-la(EF-l a)。在一些实施方案中,也可以使用其他组成型启动子序列,包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子、以及人基因启动子(诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子)。
在一些实施方案中,启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中,诱导型启动子提供了分子开关,当需要表达时,所述分子开关能够开启其可操作地连接的多核苷酸序列的表达,或者当不需要表达时,关闭所述表达。在一些实施方案中,诱导型启动子包含金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在一些实施方案中,外源控制的诱导型启动子可用于调节截短的BaEV包膜糖蛋白的表达。例如,辐射诱导型启动子、热诱导型启动子和/或药物诱导型启动子可以用于在例如靶向区域中选择性地驱动转基因表达。在此类实施方案中,转基因表达的位置、持续时间和水平可以通过施用外源诱导源来调节。
在一些实施方案中,使用药物诱导型启动子调节截短的BaEV包膜糖蛋白的表达。例如,在一些情况下,启动子、增强子或反式激活因子包含Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列、多西环素操纵子序列、雷帕霉素操纵子序列、他莫昔芬操纵子序列或激素反应性操纵子序列或其类似物。在一些情况下,诱导型启动子包含四环素反应元件(TRE)。在一些实施方案中,诱导型启动子包含雌激素反应元件(ERE),其可以在他莫昔芬的存在下激活基因表达。在一些情况下,药物诱导型元件诸如TRE可以与所选启动子组合以在药物诸如多西环素的存在下增强转录。在一些实施方案中,药物诱导型启动子是小分子诱导型启动子。
可以修饰任何所提供的多核苷酸以去除CpG基序和/或优化特定物种(诸如人、犬、猫科动物、马科动物、绵羊、牛等物种)中用于翻译的密码子。在一些实施方案中,多核苷酸针对人类密码子使用进行优化(即,人类密码子优化的)。在一些实施方案中,修饰多核苷酸以去除CpG基序。在其他实施方案中,修饰所提供的多核苷酸以去除CpG基序并进行密码子优化,诸如人密码子优化。密码子优化和CpG基序检测和修饰的方法是熟知的。通常,多核苷酸优化增强转基因表达,增加转基因稳定性并保留所编码多肽的氨基酸序列。
为了评估截短的BaEV包膜糖蛋白的表达,待引入细胞的表达载体还可以含有选择标记基因或报告基因或二者,以促进表达颗粒例如病毒颗粒的鉴定和选择。在其他实施方案中,选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序中。选择标记和报告基因两者都可以与适当的调节序列侧接,以便能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记是本领域已知的,并且包括例如抗生素抗性基因,诸如neo等。
将报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评价调节序列的功能性。编码容易测定的蛋白质的报告基因是本领域熟知的。通常,报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达并且编码其表达由一些容易检测的特性例如酶活性证明的蛋白质的基因。在将DNA引入受体细胞之后的合适时间测定报告基因的表达。
合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(参见例如Ui-Tei等人,2000,FEBS Lett.479:79-82)。合适的表达系统是熟知的,并且可以使用熟知的技术来制备或商购获得。可以使用独特的内部限制性位点或通过部分消化非独特的限制性位点来产生内部缺失构建体。然后可以将构建体转染到显示高水平的期望的多核苷酸和/或多肽表达的细胞中。通常,具有显示最高水平的报告基因表达的最小5′侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
III.脂质颗粒和产生脂质颗粒的方法
本文提供了一种颗粒,其包含脂质双层、被脂质双层包围的内腔和截短的BaEV包膜蛋白,诸如任何如所述的,其中截短的BaEV包膜蛋白包埋在脂质双层中。在一些实施方案中,所提供的脂质颗粒优先靶向造血细胞(例如T细胞),其由截短的BaEV包膜蛋白的向性介导。在一些实施方案中,脂质颗粒可以另外含有用于递送至细胞的外源药剂(例如治疗剂)。在一些实施方案中,将脂质颗粒引入受试者的细胞。还提供了将任何所提供的脂质颗粒递送至细胞的方法。
在一些实施方案中,所提供的脂质颗粒表现出融合活性,其由截短的BaEV包膜蛋白介导,该截短的BaEV包膜蛋白促进脂质颗粒的两个内腔与靶细胞膜的吸收或融合。因此,所提供的脂质颗粒中有融合体。在一些实施方案中,融合体包含天然来源的两亲性脂质双层,其中截短的BaEV包膜蛋白作为融合体。在一些实施方案中,融合体包含(a)脂质双层;(b)被脂质双层包围的内腔(例如,包含胞质溶胶);以及(c)融合剂,其相对于源细胞是外源的或过表达的。在一些实施方案中,截短的BaEV包膜蛋白位于脂质双层中。在一些实施方案中,融合体包含几种不同类型的脂质,例如,两亲性脂质,诸如磷脂。在一些实施方案中,融合体包含脂质双层作为最外表面。
在一些实施方案中,脂质颗粒包含围绕内腔或空腔的天然来源的两亲性脂质双层。在一些实施方案中,脂质颗粒包含脂质双层作为最外表面。在一些实施方案中,脂质双层围绕内腔。在一些实施方案中,内腔是水性的。在一些实施方案中,内腔与脂质双层内部的亲水性头部基团接触。在一些实施方案中,内腔是胞质。在一些实施方案中,胞质含有存在于源细胞中的细胞组分。在一些实施方案中,胞质不含有存在于源细胞中的组分。在一些实施方案中,内腔是空腔。在一些实施方案中,空腔含有水性环境。在一些实施方案中,空腔不含有水性环境。
在一些实施方案中,脂质颗粒可以是病毒颗粒、病毒样颗粒、纳米颗粒、囊泡、外来体、树状聚体、慢病毒、病毒载体、去核细胞、微泡、膜囊泡、细胞外膜囊泡、质膜囊泡、巨质膜囊泡、凋亡小体、有丝分裂颗粒、核红细胞、溶酶体、另一种膜包围的囊泡、或慢病毒载体、基于病毒的颗粒、病毒样颗粒(VLP)或基于细胞的颗粒。
在一些方面,脂质双层在产生含脂质颗粒的过程中来源于源细胞。本文描述了用于产生含脂质颗粒的示例性方法。在一些实施方案中,脂质双层包括衍生脂质双层的宿主细胞的膜组分,例如磷脂、膜蛋白等。在一些实施方案中,脂质双层包括胞质溶胶,该胞质溶胶包括在衍生媒介物的细胞中发现的组分,例如溶质、蛋白质、核酸等,但不是细胞的所有组分,例如缺乏细胞核。在一些实施方案中,脂质双层被认为是外来体样的。脂质双层的大小可以变化,并且在一些情况下具有从30至300nm(诸如从30至150nm以及包括从40至100nm)范围内的直径。
在具体实施方案中,脂质颗粒是病毒来源的。在一些实施方案中,脂质颗粒可以是基于病毒的颗粒,诸如病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)或病毒样颗粒(例如慢病毒样颗粒)。在一些实施方案中,脂质双层是病毒包膜。在一些实施方案中,病毒包膜获自宿主细胞。在一些实施方案中,病毒包膜由来自源细胞质膜的病毒衣壳获得。在一些实施方案中,脂质双层获自除宿主细胞的质膜以外的膜。在一些实施方案中,病毒包膜脂质双层包埋有病毒蛋白,包括病毒糖蛋白。
在具体实施方案中,脂质颗粒不是病毒来源的。在一些实施方案中,脂质颗粒可以是纳米颗粒、囊泡、外来体、树状聚体、去核细胞、微泡、膜囊泡、细胞外膜囊泡、质膜囊泡、巨质膜囊泡、凋亡小体、有丝分裂颗粒、核红细胞、溶酶体、另一种膜包围的囊泡、或细胞来源的颗粒。
在一些实施方案中,脂质双层包括衍生脂质双层的宿主细胞的膜组分,例如磷脂、膜蛋白等。在一些实施方案中,脂质双层包括胞质溶胶,所述胞质溶胶包括在衍生媒介物的细胞中发现的组分,例如溶质、蛋白质、核酸等,但不是细胞的所有组分,例如缺少细胞核。在一些实施方案中,脂质双层被认为是外来体样的。脂质双层的大小可以变化,并且在一些情况下具有从30至300nm(诸如从30至150nm以及包括从40至100nm)范围内的直径。
在其他方面,所述脂质双层包括合成脂质复合物。在一些实施方案中,合成脂质复合物是脂质体。在一些实施方案中,脂质双层是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊状结构。在一些实施方案中,脂质双层具有由水性介质分开的多个脂质层。在一些实施方案中,当磷脂悬浮于过量的水溶液中时,脂质双层自发形成。在一些实例中,脂质组分在形成封闭结构之前经历自身重排,并且在脂质双层之间截留水和溶解的溶质。
在一些实施方案中,脂质颗粒包含几种不同类型的脂质。在一些实施方案中,脂质是两亲性脂质。在一些实施方案中,两亲性脂质是磷脂。在一些实施方案中,磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中,脂质包括磷脂诸如磷酸胆碱和磷酸肌醇。在一些实施方案中,所述脂质包括DMPC、DOPC和DSPC。
在具体实施方案中,外源药剂诸如多核苷酸或多肽被包封在脂质颗粒的内腔中。所提供的脂质颗粒的实施方案可具有促进有效负载(例如所需转基因或外源药剂)递送至靶细胞的多种性质。外源药剂可以是多核苷酸或多肽。在一些实施方案中,本文提供的脂质颗粒施用于受试者,例如哺乳动物,例如人。在此类实施方案中,受试者可能有风险患上特定疾病或病症,可能具有特定疾病或病症的症状,或可能被诊断或鉴定为患有特定疾病或病症。在一个实施方案中,受试者患有癌症。在一个实施方案中,受试者患有感染性疾病。在一些实施方案中,脂质颗粒含有编码用于治疗疾病或病症的外源药剂或多肽外源药剂的核酸序列(多核苷酸)。
脂质颗粒可以包括球形颗粒或者可以包括细长或不规则形状的颗粒。
在一些实施方案中,可以评估颗粒组合物的与其尺寸相关的一个或多个特征,包括直径、其在直径的平均值(均值)或中值以上和以下的变化范围、变化系数、多分散指数或组合物中颗粒尺寸的其他量度。可以使用用于颗粒表征的各种方法,包括但不限于激光衍射、动态光散射(DLS;也称为光子相关光谱)或图像分析,诸如显微镜检查或自动图像分析。
在一些实施方案中,所提供的脂质颗粒的直径或组合物中颗粒的平均(均值)直径小于约3μm、小于约2μm、小于约1μm、小于约900nm、小于约800nm、小于约700nm、小于约600nm、小于约500m、小于约400nm、小于约300、小于约200nm、小于约150nm、小于约100nm、小于约50nm或小于约20nm。在一些实施方案中,脂质颗粒的直径或组合物中颗粒的平均(均值)直径小于约400nm。在另一个实施方案中,脂质颗粒的直径或组合物中颗粒的平均(均值)直径小于约150nm。在一些实施方案中,脂质颗粒的直径或组合物中颗粒的平均(均值)直径介于等于或约2μm和等于或约1μm之间、介于等于或约1μm和等于或约900nm之间、介于等于或约900nm和等于或约800nm之间、介于等于或约800和等于或约700nm之间、介于等于或约700nm和等于或约600nm之间、介于等于或约600nm和等于或约500nm之间、介于等于或约500nm和等于或约400nm之间、介于等于或约400nm和等于或约300nm之间、介于等于或约300nm和等于或约200nm之间、介于等于或约200和等于或约100nm之间、介于等于或约100和等于或约50nm、或介于等于或约20nm和等于或约50nm之间。
在一些实施方案中,颗粒组合物中的中值颗粒直径介于等于或约10nm和等于或约1000nM之间、介于等于或约25nm和等于或约500nm之间、介于等于或约40nm和等于或约300nm之间、介于等于或约50nm和等于或约250nm之间、介于等于或约60nm和等于或约225nm之间、介于等于或约70nm和等于或约200nm之间、介于等于或约80nm和等于或约175nm之间、或介于等于或约90nm和等于或约150nm之间。
在一些实施方案中,组合物中90%的脂质颗粒落在脂质颗粒的中值直径的50%内。在一些实施方案中,组合物中90%的脂质颗粒落在脂质颗粒的中值直径的25%内。在一些实施方案中,组合物中90%的脂质颗粒落在中值直径的20%内。在一些实施方案中,组合物中90%的脂质颗粒落在脂质颗粒的中值直径的15%内。在一些实施方案中,组合物中90%的脂质颗粒落在脂质颗粒的中值直径的10%内。
在一些实施方案中,组合物中75%的脂质颗粒落在脂质颗粒的平均直径的+/-2或+/-1St Dev标准偏差(St Dev)内。在一些实施方案中,组合物中80%的脂质颗粒落在脂质颗粒的平均直径的+/-2St Dev或+/-1St Dev内。在一些实施方案中,组合物中85%的脂质颗粒落在脂质颗粒的平均直径的+/-2St Dev或+/-1St Dev内。在一些实施方案中,组合物中90%的脂质颗粒落在脂质颗粒的平均直径的+/-2St Dev或+/-1St Dev内。在一些实施方案中,组合物中95%的脂质颗粒落在脂质颗粒的平均直径的+/-2St Dev或+/-1St Dev内。
在一些实施方案中,脂质颗粒具有例如通过DLS测定的约100nm至约两微米的平均流体动力学半径。在一些实施方案中,脂质颗粒具有介于等于或约2μm和等于或约1μm之间、介于等于或约1μm和等于或约900nm之间、介于等于或约900nm和等于或约800nm之间、介于等于或约800和等于或约700nm之间、介于等于或约700nm和等于或约600nm之间、介于等于或约600nm和等于或约500nm之间、介于等于或约500nm和等于或约400nm之间、介于等于或约400nm和等于或约300nm之间、介于等于或约300nm和等于或约200nm之间、介于等于或约200和等于或约100nm之间、介于等于或约100和等于或约50nm、或介于等于或约20nm和等于或约50nm之间的平均流体动力学半径。
在一些实施方案中,脂质颗粒具有例如通过多角度光散射测定的约100nm至约两微米的平均几何半径。在一些实施方案中,脂质颗粒具有介于等于或约2μm和等于或约1μm之间、介于等于或约1μm和等于或约900nm之间、介于等于或约900nm和等于或约800nm之间、介于等于或约800和等于或约700nm之间、介于等于或约700nm和等于或约600nm之间、介于等于或约600nm和等于或约500nm之间、介于等于或约500nm和等于或约400nm之间、介于等于或约400nm和等于或约300nm之间、介于等于或约300nm和等于或约200nm之间、介于等于或约200和等于或约100nm之间、介于等于或约100和等于或约50nm、或介于等于或约20nm和等于或约50nm之间的平均几何半径。
在一些实施方案中,脂质颗粒组合物的变异系数(COV)(即标准偏差除以平均值)小于30%或小于约30%、小于25%或小于约25%、小于20%或小于约20%、小于15%或小于约15%、小于10%或小于约10%或小于5%或小于约5%。
在一些实施方案中,所提供的脂质颗粒组合物的特征在于其多分散指数,其是颗粒的尺寸分布的量度,其中1(最大分散)与0(所有颗粒的相同尺寸)之间的值是可能的。在一些实施方案中,本文提供的脂质颗粒的组合物的多分散指数为介于等于或约0.05和等于或约0.7之间、介于等于或约0.05和等于或约0.6之间、介于等于或约0.05和等于或约0.5之间、介于等于或约0.05和等于或约0.4之间、介于等于或约0.05和等于或约0.3之间、介于等于或约0.05和等于或约0.2之间、介于等于或约0.05和等于或约0.1之间、介于等于或约0.1和等于或约0.7之间、介于等于或约0.1和等于或约0.6之间、介于等于或约0.1和等于或约0.5之间、介于等于或约0.1和等于或约0.4之间、介于等于或约0.1和等于或约0.3之间、介于等于或约0.1和等于或约0.2之间、介于等于或约0.2和等于或约0.7之间、介于等于或约0.2和等于或约0.6之间、介于等于或约0.2和等于或约0.5之间、介于等于或约0.2和等于或约0.4之间、介于等于或约0.2和等于或约0.3之间、介于等于或约0.3和等于或约0.7之间、介于等于或约0.3和等于或约0.6之间、介于等于或约0.3和等于或约0.5之间、介于等于或约0.3和等于或约0.4之间、介于等于或约0.4和等于或约0.7之间、介于等于或约0.4和等于或约0.6之间、介于等于或约0.4和等于或约0.5之间、介于等于或约0.5和等于或约0.7之间、介于等于或约0.5和等于或约0.6、或介于等于或约0.6和等于或约0.7之间。在一些实施方案中,多分散指数小于0.05或小于约0.05、小于0.1或小于约0.1、小于0.15或小于约0.15、小于0.2或小于约0.2、小于0.25或小于约0.25、小于0.3或小于约0.3、小于0.4或小于约0.4、小于0.5或小于约0.5、小于0.6或小于约0.6或小于0.7或小于约0.7。各种脂质颗粒是已知的,它们中的任一种可以根据所提供的实施方案产生。脂质颗粒的非限制性实例包括如国际公布的PCT申请号WO 2017/095946、WO 2017/095944、WO 2017/095940、WO 2019/157319、WO 2018/208728、WO 2019/113512、WO 2019/161281、WO 2020/102578、WO 2019/222403、WO 2020/014209、WO 2020/102485、WO 2020/102499、WO 2020/102503、WO 2013/148327、WO 2017/182585、WO 2011/058052或WO 2017/068077中描述的任一种、或其中描述的特征,这些申请中的每一个以引用方式全文并入。
所提供的示例性脂质颗粒的特征在以下小节中描述。
A.基于病毒的颗粒
本文提供了源自病毒的基于病毒的颗粒,包括源自逆转录病毒或慢病毒的那些,含有截短的BaEV包膜蛋白,诸如第I节中所述。在一些实施方案中,两亲性脂质的脂质颗粒双层是或包含病毒包膜。在一些实施方案中,两亲性脂质的脂质颗粒双层是或包含源自生产细胞的脂质。在一些实施方案中,病毒包膜可包含融合剂,例如对病毒内源的融合剂或假型融合剂。在一些实施方案中,脂质颗粒的内腔或空腔包含病毒核酸,例如逆转录病毒核酸,例如慢病毒核酸。在一些实施方案中,病毒核酸可以是病毒基因组。在一些实施方案中,脂质颗粒还包含一种或多种病毒非结构蛋白,例如在其空腔或内腔中。在一些实施方案中,基于病毒的颗粒是或包含病毒样颗粒(VLP)。在一些实施方案中,VLP不包含任何病毒遗传物质。在一些实施方案中,基于病毒的颗粒不包含任何病毒衍生的核酸或病毒蛋白,诸如病毒结构蛋白。
将外源性剂导入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。DNA和RNA载体也可用于容纳和递送多核苷酸和多肽。病毒载体和病毒样颗粒,并且特别是逆转录病毒载体,已经成为将基因插入哺乳动物例如人细胞的最广泛使用的方法。其他病毒载体和病毒样颗粒可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。用于产生包含载体和/或外源酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见例如,Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York。
在一些实施方案中,两亲性脂质的病毒颗粒或病毒样颗粒双层是或包含源自受感染的宿主细胞的脂质。在一些实施方案中,脂质双层是病毒包膜。在一些实施方案中,病毒颗粒或病毒样颗粒包膜获自宿主细胞。在一些实施方案中,病毒颗粒或病毒样颗粒包膜由来自源细胞质膜的病毒衣壳获得。在一些实施方案中,脂质双层获自除宿主细胞的质膜以外的膜。在一些实施方案中,病毒颗粒或病毒样颗粒包膜脂质双层包埋有病毒蛋白,包括病毒糖蛋白。
在一些实施方案中,将病毒颗粒或病毒样颗粒,例如逆转录病毒颗粒或逆转录病毒样颗粒的一个或多个转导单位施用于受试者。在一些实施方案中,向受试者施用至少1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个转导单位/kg。在一些实施方案中,向受试者施用至少1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个转导单位/靶细胞/ml血液。
1.病毒载体颗粒
在一些实施方案中,脂质颗粒是或包含病毒或病毒载体,例如逆转录病毒或逆转录病毒载体,例如慢病毒或慢病毒载体。在一些实施方案中,病毒或病毒载体是重组的。例如,病毒颗粒可以称为重组病毒或重组病毒载体,它们可互换使用。在一些实施方案中,脂质颗粒是重组慢病毒载体颗粒。
在一些实施方案中,脂质颗粒包含脂质双层,该脂质双层包含含有包膜的逆转录病毒载体。例如,在一些实施方案中,两亲性脂质双层是或包含病毒包膜。病毒包膜可以包含融合剂,例如截短的BaEV融合剂,其是病毒内源的或是假型融合剂。在一些实施方案中,病毒载体的内腔或空腔包含病毒核酸,例如逆转录病毒核酸,例如慢病毒核酸。病毒核酸可以是病毒基因组。在一些实施方案中,病毒载体还可以包含一种或多种病毒非结构蛋白,例如在其空腔或内腔中。在一些实施方案中,基于病毒的载体颗粒是慢病毒。在一些实施方案中,慢病毒载体颗粒是人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)。
在一些方面,病毒载体颗粒在可包装的多核苷酸的数量方面受到限制。在一些实施方案中,可以修饰编码待包装的多肽的核苷酸,使得它们在编码区中的核苷酸比编码野生型肽的核苷酸更少的情况下保留功能活性。此类修饰可以包括截短或其他缺失。在一些实施方案中,多于一种的多肽可以从相同的启动子表达,使得它们是融合多肽。在一些实施方案中,待包装的插入片段大小(即,病毒基因组或其部分;或如所描述的异源多核苷酸)的长度可以在500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-7000或7000-8000个核苷酸之间。在一些实施方案中,插入片段的长度可以超过8000个核苷酸,诸如9000、10,000或11,000个核苷酸。
在一些实施方案中,病毒载体颗粒诸如逆转录病毒载体颗粒包含gag多蛋白、聚合酶(例如,pol)、整合酶(例如,功能性或非功能性变体)、蛋白酶和融合剂中的一种或多种。在一些实施方案中,脂质颗粒还包含rev。在一些实施方案中,一种或多种上述蛋白质在逆转录病毒基因组(即,如上所述的插入片段)中编码,并且在一些实施方案中,一种或多种上述蛋白质以反式例如由辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒提供。在一些实施方案中,脂质颗粒核酸(例如,逆转录病毒核酸)包含一种或多种以下核酸序列:5'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3结构域)、Psi包装元件(Psi)、可操作地连接至有效负载基因的中央多嘌呤区(cPPT)启动子、有效负载基因(任选地包含在开放阅读框之前的内含子)、聚A尾序列、WPRE和3'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3)。在一些实施方案中,脂质颗粒核酸还包含逆转录病毒顺式作用RNA包装元件和cPPT/CTS元件。在一些实施方案中,脂质颗粒核酸还包含一种或多种绝缘子元件。在一些实施方案中,识别位点位于聚A尾序列与WPRE之间。
在一些实施方案中,脂质颗粒包含由自组装成衣壳的病毒蛋白形成的超分子复合物。在一些实施方案中,脂质颗粒是源自病毒衣壳的病毒颗粒。在一些实施方案中,脂质颗粒是源自病毒核衣壳的病毒颗粒。在一些实施方案中,脂质颗粒包含保留包装核酸的性质的核衣壳衍生的。
在一些实施方案中,脂质颗粒在表达过程中包装来自携带一种或多种病毒核酸(例如逆转录病毒核酸)的宿主细胞的核酸。在一些实施方案中,所述核酸不编码参与病毒复制的任何基因。在具体实施方案中,脂质颗粒是基于病毒的颗粒,例如逆转录病毒颗粒诸如慢病毒颗粒,其是复制缺陷型的。
在一些情况下,脂质颗粒是在形态上与野生型感染性病毒无法区分的病毒颗粒。在一些实施方案中,所述病毒颗粒将整个病毒蛋白质组作为抗原呈递。在一些实施方案中,所述病毒颗粒仅将蛋白质组的一部分作为抗原呈递。
在一些实施方案中,逆转录病毒核酸包含以下中的一种或多种(例如,全部):5'启动子(例如,用于控制整个包装的RNA的表达)、5'LTR(例如,其包括R(聚腺苷酸化尾信号)和/或包括引物激活信号的U5)、引物结合位点、psi包装信号、用于核输出的RRE元件、直接位于转基因上游以控制转基因表达的启动子、转基因(或其他外源药剂元件)、多嘌呤区和3'LTR(例如,其包括突变的U3、R和U5)。在一些实施方案中,逆转录病毒核酸还包含cPPT、WPRE和/或绝缘子元件中的一种或多种。
逆转录病毒通常通过将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝并随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中来复制。适用于具体实施方案的说明性逆转录病毒包括但不限于:莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒(spumavirus)、弗瑞德鼠(Friend murine)白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))和慢病毒。
在一些实施方案中,逆转录病毒是γ逆转录病毒。在一些实施方案中,所述逆转录病毒是ε逆转录病毒。在一些实施方案中,逆转录病毒是α逆转录病毒。在一些实施方案中,逆转录病毒是β逆转录病毒。在一些实施方案中,逆转录病毒是δ逆转录病毒。在一些实施方案中,逆转录病毒是慢病毒。在一些实施方案中,逆转录病毒是泡沫逆转录病毒。在一些实施方案中,逆转录病毒是内源性逆转录病毒。
例示性的慢病毒包括但不限于:HIV(人免疫缺陷病毒;包括HIV 1型和HIV 2型);维士那-梅地病毒(VMV)病毒;山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV);马传染性贫血病毒(EIAV);猫免疫缺陷病毒(FIV);牛免疫缺陷病毒(BIV);和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一些实施方案中,使用基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)。
病毒载体可以包含包括病毒来源的核酸元件的核酸分子(例如,转移质粒),该病毒来源的核酸元件通常促进核酸分子(例如包括编码外源药剂的核酸)转移或整合到细胞基因组中或整合到介导核酸转移的病毒颗粒中。病毒载体颗粒通常包括各种病毒组分,有时除核酸以外还包括宿主细胞组分。病毒载体可以包含能够将核酸转移到细胞中(例如编码外源药剂的核酸)或转移到转移的核酸中(例如作为裸DNA)的病毒或病毒颗粒。病毒载体和转移质粒可以包含主要来源于病毒的结构和/或功能遗传元件。逆转录病毒载体可包含病毒载体或质粒,其含有主要来源于逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分。慢病毒载体可包含含有结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒,包括主要源自慢病毒的LTR。
在实施方案中,慢病毒载体(例如慢病毒表达载体)可包含慢病毒转移质粒(例如作为裸DNA)或感染性慢病毒颗粒。关于诸如克隆位点、启动子、调控元件、异源核酸等元件,应理解这些元件的序列可以在慢病毒颗粒中以RNA形式存在,并且可以在DNA质粒中以DNA形式存在。
在本文所述的一些载体中,与对应的野生型病毒相比,可能不存在有助于复制或为复制所必需的一个或多个蛋白质编码区的至少一部分。这使得病毒载体复制有缺陷。在一些实施方案中,载体能够转导靶非分裂宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。
野生型逆转录病毒基因组的结构通常包含5’长末端重复序列(LTR)和3’LTR,在它们之间或之内有一个能使基因组被包装的包装信号、一个引物结合位点、实现整合到宿主细胞基因组中的整合位点以及编码促进病毒颗粒组装的包装组分的gag、pol和env基因。更复杂的逆转录病毒具有附加的特征,诸如HIV中的rev和RRE序列,其使得整合的原病毒的RNA转录物能够从感染靶细胞的细胞核有效输出到细胞质。在原病毒中,病毒基因在两个末端侧接称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR参与原病毒整合和转录。LTR也充当增强子-启动子序列,并且可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的衣壳化是通过位于病毒基因组的5’端的psi序列发生的。
LTR本身通常是相似的(例如同一的)序列,可以分成三个元件,称为U3、R和U5。U3源自对RNA的3'末端独特的序列。R源自在RNA两端重复的序列,并且U5源自RNA的5'端特有的序列。这三种元件的尺寸在不同的逆转录病毒中可以有相当大的变化。
对于病毒基因组,转录起始位点通常在一个LTR中的U3与R之间的边界处,而聚(A)添加(终止)位点在另一个LTR中的R与U5之间的边界处。U3含有原病毒的大部分转录控制元件,其包括对细胞和在一些情况下病毒转录激活因子蛋白作出应答的启动子和多个增强子序列。一些逆转录病毒包含编码参与调节基因表达的蛋白质的以下基因中的任何一种或多种:tot、rev、tax和rex。关于结构基因gag、pol和env本身,gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag蛋白被蛋白水解加工为成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(RT),它含有介导基因组复制的DNA聚合酶、相关RNA酶H和整合酶(IN)。env基因编码病毒体的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白,它们形成与细胞受体蛋白特异性相互作用的复合物。这种相互作用例如通过使过病毒膜与细胞膜融合来促进感染。
在复制缺陷逆转录病毒载体基因组中,gag、pol和env可以不存在或没有功能。RNA两个末端的R区通常是重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组的5'和3'末端的独特序列。
逆转录病毒还可以含有编码除gag、pol和env以外的蛋白质的附加基因。额外基因的实例包括(在HIV中)vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef中的一种或多种。EIAV具有(尤其)额外基因S2。由额外基因编码的蛋白质具有多种功能,其中一些可能与细胞蛋白质提供的功能相同。例如,在EIAV中,tat充当病毒LTR的转录激活因子(Derse和Newbold1993Virology 194:530-6;Maury等人1994Virology200:632-42)。其与称为TAR的稳定的茎环RNA二级结构结合。Rev通过rev反应元件(RRE)调节和协调病毒基因的表达(Martarano等人1994J.Virol.68:3102-11)。这两种蛋白质的作用机制被认为与灵长类动物病毒中的类似机制大致相似。此外,已鉴定了一种EIAV蛋白Ttm,其由剪接到env编码序列的跨膜蛋白起始处的tat的第一外显子编码。
除了蛋白酶、逆转录酶和整合酶以外,非灵长类动物慢病毒还含有编码dUTP酶的第四种pol基因产物。这可能在这些慢病毒感染某些不分裂或缓慢分裂细胞类型的能力中起作用。
在实施方案中,重组慢病毒载体(RLV)是具有足够的逆转录病毒遗传信息以允许在包装组分的存在下将RNA基因组包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中的载体。靶细胞的感染可以包括逆转录和整合到靶细胞基因组中。RLV通常携带待由载体递送至靶细胞的非病毒编码序列,诸如编码本文所述的外源药剂的核酸。在实施方案中,RLV不能在靶细胞内独立复制产生感染性逆转录病毒颗粒。通常,RLV缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或参与复制的其他基因。载体可以被配置为分裂内含子载体,例如,如PCT专利申请WO 99/15683中所述,所述申请通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中,慢病毒载体包含最小的病毒基因组,例如,病毒载体已被操纵以除去非必需元件并保留必需元件,从而提供感染、转导和递送所关注的核苷酸序列至靶宿主细胞所需的功能,例如,如WO 98/17815中所述,所述专利通过引用整体并入本文。
最小慢病毒基因组可包含例如(5')R-U5-一个或多个第一核苷酸序列-U3-R(3')。然而,用于在源细胞内产生慢病毒基因组的质粒载体还可包括可操作地连接到慢病毒基因组以指导基因组在源细胞中转录的转录调节控制序列。这些调控序列可以包含与转录的逆转录病毒序列缔合的天然序列,例如5’U3区,或者它们可以包含异源启动子,例如另一种病毒启动子,例如CMV启动子。一些慢病毒基因组包含促进有效病毒产生的额外序列。例如,在HIV的情况下,可以包含rev和RRE序列。可替代地或组合地,可以使用密码子优化,例如,编码外源剂的基因可以是密码子优化的,例如,如WO 01/79518中所述,所述专利通过引用整体并入本文。也可以使用执行与rev/RRE系统相似或相同的功能的替代性序列。例如,在梅森-菲舍猴病毒(Mason Pfizer monkey virus)中发现了rev/RRE系统的功能类似物。这被称为CTE,并且包含基因组中被认为与受感染细胞中的因子相互作用的RRE型序列。细胞因子可以被认为是rev类似物。因此,CTE可以用作rev/RRE系统的替代物。此外,HTLV-I的Rex蛋白可以在功能上替代HIV-I的Rev蛋白。Rev和Rex具有对IRE-BP相似的效应。
在一些实施方案中,逆转录病毒核酸(例如慢病毒核酸,例如灵长类或非灵长类慢病毒核酸)(1)包含缺失的gag基因,其中gag中的缺失除去了gag编码序列的约核苷酸350或354下游的一个或多个核苷酸;(2)在所述逆转录病毒核酸中不存在一个或多个辅助基因;(3)缺乏tat基因但包含位于5'LTR的末端与gag的ATG之间的前导序列;和(4)(1)、(2)和(3)的组合。在一个实施方案中,慢病毒载体包含所有特征(1)和(2)和(3)。在WO 99/32646中更详细地描述了这种策略,所述专利通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中,灵长类慢病毒最小系统不需要HIV/SIV附加基因vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef用于载体产生或用于转导分裂和非分裂细胞。在一些实施方案中,EIAV最小载体系统不需要S2用于载体产生或用于转导分裂和非分裂细胞。
额外基因的缺失可以允许产生没有与慢病毒(例如HIV)感染性疾病相关的基因的载体。特别地,tat与疾病相关。其次,额外基因的缺失允许载体包装更多的异源DNA。第三,功能未知的基因诸如S2可以省略,从而降低引起不良影响的风险。最小慢病毒载体的实例公开于WO 99/32646和WO 98/17815中。
在一些实施方案中,逆转录病毒核酸至少缺乏tat和S2(如果其是EIAV载体系统),也可能缺乏vif、vpr、vpx、vpu和nef。在一些实施方案中,逆转录病毒核酸还缺乏rev、RRE或两者。
在一些实施方案中,逆转录病毒核酸包含vpx。Vpx多肽与SAMHD1限制因子结合并诱导其降解,所述SAMHD1限制因子降解细胞质中的游离dNTP。因此,随着Vpx降解SAMHD1和逆转录活性增加,细胞质中游离dNTP的浓度增加,从而促进逆转录病毒基因组的逆转录和整合到靶细胞基因组中。
不同的细胞在特定密码子的使用上有所不同。这种密码子偏好对应于细胞类型中特定tRNA相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子,使它们与相应tRNA的相对丰度相匹配,有可能增加表达。出于同样的原因,有可能通过故意选择已知相应tRNA在特定的细胞类型中十分罕见的密码子来降低表达。因此,额外程度的翻译控制是可用的。密码子优化的另外描述见于例如WO 99/41397中,其通过引用整体并入本文。
许多病毒,包括HIV和其他慢病毒,使用大量稀有密码子,通过改变这些密码子使其对应于常用的哺乳动物密码子,可以提高包装组分在哺乳动物生产细胞中的表达。
在一些实施方案中,密码子优化具有许多其他优点。在一些实施方案中,由于它们序列的改变,编码包装组分的核苷酸序列可以从它们中减少或清除RNA不稳定性序列(INS)。同时,保留包装组分的氨基酸序列编码序列,使得由所述序列编码的病毒组分保留相同或至少足够相似,使得包装组分的功能不受损害。在一些实施方案中,密码子优化还克服了输出的Rev/RRE要求,使得优化的序列为Rev非依赖性的。在一些实施方案中,密码子优化还减少了载体系统内不同构建体之间的同源重组(例如在gag-pol和env开放阅读框中重叠的区域之间)。在一些实施方案中,密码子优化导致病毒滴度增加和/或安全性提高。
在一些实施方案中,只有与INS有关的密码子被密码子优化。在其他实施方案中,除了包含gag-pol移码位点的序列外,所述序列全部是密码子优化的。
gag-pol基因包含编码gag-pol蛋白的两个重叠阅读框。两种蛋白质的表达取决于翻译期间的移码。由于翻译期间核糖体“滑动”而发生这种移码。这种滑动被认为至少部分是由核糖体-停滞RNA二级结构引起的。这种二级结构存在于gag-pol基因中的移码位点的下游。对于HIV,重叠区从gag起点(其中核苷酸1是gag ATG的A)下游的核苷酸1222延伸到gag的末尾(nt 1503)。因此,跨越移码位点的281bp片段和两个阅读框的重叠区优选不是密码子优化的。在一些实施方案中,保留此片段将能够更有效地表达gag-pol蛋白。对于EIAV,重叠的起点位于nt 1262(其中核苷酸1是gag ATG的A)。重叠的末尾位于nt 1461。为了确保移码位点和gag-pol重叠被保留,可以保留从nt1156到1465的野生型序列。
在一些实施方案中,例如为了适应方便的限制性位点,可以从最佳密码子使用中进行衍生,并且可以将保守氨基酸改变引入gag-pol蛋白中。
在一些实施方案中,密码子优化是基于哺乳动物系统中具有较差密码子使用的密码子。可以改变第三个碱基,有时也可以改变第二和第三个碱基。
在一些实施方案中,由于遗传密码的简并性,可以理解,技术人员可以获得许多gag-pol序列。此外,描述了许多逆转录病毒变体,它们可以用作产生密码子优化的gag-pol序列的起点。慢病毒基因组可以是相当可变的。例如,存在许多仍有功能的HIV-I的准种类。这也是EIAV的情况。这些变体可以用于增强转导过程的特定部分。HIV-I变体的示例可以在os Alamos国家实验室维护的HIV数据库中找到。EIAV克隆的细节可以在国家卫生研究院(National Institutes of Health)维护的NCBI数据库中找到。
凭经验确定病毒序列的适当密码子优化在本领域技术人员的水平之内。包括gag-pol序列的密码子优化序列的策略可用于任何逆转录病毒,例如EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-I和HIV-2。此外,此方法可以用于增加来自HTLV-I、HTLV-2、HFV、HSRV和人内源性逆转录病毒(HERV)、MLV和其他逆转录病毒的基因的表达。
在实施方案中,逆转录病毒载体包含包装信号,所述包装信号在仍保留env序列的载体中包含gag的255至360个核苷酸,或在剪接供体突变gag和env缺失的特定组合中包含gag的约40个核苷酸。在一些实施方案中,逆转录病毒载体包括包含一个或多个缺失的gag序列,例如所述gag序列包含可从N末端衍生的约360个核苷酸。
在一些实施方案中,逆转录病毒载体、辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒可包含逆转录病毒结构蛋白和辅助蛋白,例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef蛋白或其他逆转录病毒蛋白。在一些实施方案中,逆转录病毒蛋白源自相同的逆转录病毒。在一些实施方案中,逆转录病毒蛋白源自多于一种逆转录病毒,例如2种、3种、4种或更多种逆转录病毒。
在一些实施方案中,gag和pol编码序列通常在天然慢病毒中被组织为Gag-Pol前体。gag序列编码55-kD Gag前体蛋白,也称为p55。p55在成熟过程期间被病毒编码的蛋白酶(pol基因的产物)切割成四种较小的蛋白质,命名为MA(基质[p17])、CA(衣壳[p24])、NC(核衣壳[p9])和p6。pol前体蛋白被病毒编码的蛋白酶从Gag上切割开,并进一步消化以分离蛋白酶(p10)、RT(p50)、RNA酶H(p15)和整合酶(p31)活性。
在一些实施方案中,慢病毒载体是整合缺陷的。在一些实施方案中,pol是整合酶缺陷的,诸如由于整合酶基因中的突变而编码。例如,pol编码序列可以含有整合酶中的失活突变,诸如通过突变参与催化活性的一个或多个氨基酸,即突变天冬氨酸64、天冬氨酸116和/或谷氨酸152中的一个或多个。在一些实施方案中,整合酶突变是D64V突变。在一些实施方案中,整合酶中的突变允许将病毒RNA包装成慢病毒。在一些实施方案中,整合酶中的突变允许将病毒蛋白包装成慢病毒。在一些实施方案中,整合酶中的突变降低了插入诱变的可能性。在一些实施方案中,整合酶中的突变降低了产生具有复制能力的重组体(RCR)的可能性(Wanisch等人2009.Mol Ther.1798):1316-1332)。在一些实施方案中,天然Gag-Pol序列可以用于辅助载体(例如辅助质粒或辅助病毒),或者可以进行修饰。这些修饰包括嵌合Gag-Pol,其中Gag和Pol序列获自不同的病毒(例如不同的物种、亚种、病毒株、分化体等),和/或其中所述序列已被修饰以改善转录和/或翻译和/或减少重组。
在一些实施方案中,逆转录病毒核酸包括编码gag蛋白的150-250个(例如168个)核苷酸部分的多核苷酸,所述多核苷酸(i)包括相对于野生型INS1减少RNA核输出限制的突变INS1抑制序列,(ii)含有导致移码和提前终止的两个核苷酸插入,和/或(iii)不包括gag的INS2、INS3和INS4抑制序列。
在一些实施方案中,本文所述的载体是包含逆转录病毒(例如慢病毒)序列和非慢病毒病毒序列的杂合载体。在一些实施方案中,杂合载体包含用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒(例如慢病毒)序列。
根据某些具体实施方案,大部分或全部病毒载体主链序列源自慢病毒,例如HIV-1。然而,应当理解,可以使用许多不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列,或者组合使用,并且可以适应某些慢病毒序列中的许多取代和改变,而不损害转移载体执行本文所述的功能的能力。Naldini等人,(l996a、l996b和1998);Zufferey等人,(1997);Dull等人,1998,美国专利第6,013,516号和第5,994,136号中描述了多种慢病毒载体,其中许多可以适于产生逆转录病毒核酸。
在原病毒的每个末端,通常发现长末端重复序列(LTR)。LTR通常包含位于逆转录病毒核酸末端的结构域,在其天然序列背景下其是正向重复序列并且含有U3、R和U5区。LTR通常促进逆转录病毒基因的表达(例如,基因转录物的促进、起始和聚腺苷酸化)和病毒复制。LTR可包含许多调节信号,包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号和用于病毒基因组复制和整合的序列。病毒LTR通常分为三个区域,称为U3、R和U5。U3区通常含有增强子和启动子元件。U5区通常是在引物结合位点与R区之间的序列,并且可以含有聚腺苷酸化序列。R(重复)区可以侧接U3和U5区。LTR通常由U3、R和U5区构成并且可以出现在病毒基因组的5'和3'末端。在一些实施方案中,与5'LTR相邻的是用于逆转录基因组(tRNA引物结合位点)和用于将病毒RNA有效包装成颗粒(Psi位点)的序列。
在一些实施方案中,包装信号可包含位于逆转录病毒基因组内介导病毒RNA插入到病毒衣壳或颗粒中的序列,参见例如Clever等人,1995.J.of Virology,第69卷第4期;第2101-2109页。几种逆转录病毒载体使用最小包装信号(psi[Y]序列)用于病毒基因组的衣壳化。
在各种实施方案中,逆转录病毒核酸包含经修饰的5'LTR和/或3'LTR。LTR中的任一个或两个可包含一个或多个修饰,包括但不限于一个或多个缺失、插入或取代。通常对3'LTR进行修饰以通过使病毒成为复制缺陷的(例如不能完全、有效地复制从而不产生感染性病毒体的病毒(例如复制缺陷慢病毒子代))来改善慢病毒或逆转录病毒系统的安全性。
在一些实施方案中,载体是自我失活(SIN)载体,例如复制缺陷载体,例如逆转录病毒或慢病毒载体,其中右(3')LTR增强子-启动子区(称为U3区)已被修饰(例如通过缺失或取代)以防止病毒转录超过第一轮病毒复制。在一些方面,本文提供了无复制能力的(在本文中也称为复制缺陷型)载体颗粒,其在不存在包装细胞的情况下不能参与复制(即,病毒载体颗粒不是由转导细胞产生的)。在一些方面,这是因为在病毒复制期间右(3')LTR U3区可以用作左(5')LTR U3区的模板,并且因此不存在U3增强子-启动子会抑制病毒复制。在实施方案中,3'LTR被修饰使得U5区被除去、改变或例如被外源聚(A)序列替换。3'LTR、5'LTR或3'和5'LTR两者可以是经修饰的LTR。使所述载体不能复制的对病毒载体(即逆转录病毒或慢病毒载体)的其他修饰是本领域已知的。
在一些实施方案中,5'LTR的U3区被异源启动子替换以在病毒颗粒产生期间驱动病毒基因组的转录。可以使用的异源启动子的示例包括例如病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。在一些实施方案中,启动子能够以Tat非依赖性方式驱动高水平的转录。在某些实施方案中,异源启动子在控制病毒基因组转录的方式方面具有附加的优点。例如,异源启动子可以是诱导型的,使得只有当存在诱导因子时才发生全部或部分病毒基因组的转录。诱导因子包括但不限于一种或多种化学化合物或培养宿主细胞的生理条件诸如温度或pH。
在一些实施方案中,病毒载体包含TAR(反式激活反应)元件,例如位于慢病毒(例如HIV)LTR的R区中。此元件与慢病毒反式激活因子(tat)遗传元件相互作用以增强病毒复制。然而,例如在其中5'LTR的U3区被异源启动子替换的实施方案中,此元件不是必需的。
R区,例如逆转录病毒LTR内开始于加帽基团起点(即转录起点)并终止于聚A区起点之前的区域,可以侧接U3区和U5区。R区在将新生DNA从基因组的一端转移到另一端的逆转录期间起作用。
逆转录病毒核酸还可包含FLAP元件,例如其序列包括逆转录病毒(例如HIV-1或HIV-2)的中央多嘌呤区和中央终止序列(cPPT和CTS)的核酸。合适的FLAP元件在美国专利第6,682,907号中和在Zennou等人,2000,Cell,101:173中有所描述,所述文献通过引用整体并入本文。在HIV-1逆转录期间,正链DNA在中央多嘌呤区(cPPT)的中央起始和在中央终止序列(CTS)的中央终止可以导致三链DNA结构的形成:HIV-1中央DNA瓣。在一些实施方案中,逆转录病毒或慢病毒载体骨架包含在编码外源性剂的基因上游或下游的一个或多个FLAP元件。例如,在一些实施方案中,转移质粒包括FLAP元件,例如源自或分离自HIV-L的FLAP元件。
在实施方案中,逆转录病毒或慢病毒核酸包含一个或多个输出元件,例如调节将RNA转录物从细胞核转运到细胞质的顺式作用转录后调控元件。RNA输出元件的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)rev反应元件(RRE)(参见例如Cullen等人,1991.J.Virol.65:1053;以及Cullen等人,1991.Cell 58:423)和乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE),这些文献以引用方式整体并入本文。通常,将RNA输出元件置于基因的3'UTR内,并且可以作为一个或多个拷贝插入。
在一些实施方案中,通过将转录后调控元件、聚腺苷酸化位点和转录终止信号中的一个或多个(例如,全部)掺入载体中来增加异源序列(例如编码外源药剂的核酸)的表达。多种转录后调控元件可以增加异源核酸表达于蛋白质,例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE;Zufferey等人,1999,J.Virol.,73:2886);存在于乙型肝炎病毒(HPRE)中的转录后调控元件(Huang等人,Mol.Cell.Biol.,5:3864);等等(Liu等人,1995,Genes Dev.,9:1766),这些文献中的每一篇以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中,本文所述的逆转录病毒核酸包含转录后调控元件,例如WPRE或HPRE
在一些实施方案中,本文所述的逆转录病毒核酸缺乏或不包含转录后调控元件诸如WPRE或HPRE。
可以包括指导异源核酸转录物终止和聚腺苷酸化的元件,例如以增加外源剂的表达。可以在聚腺苷酸化信号的下游发现转录终止信号。在一些实施方案中,载体包含编码外源性剂的多核苷酸3'的聚腺苷酸化序列。多聚A位点可包含指导RNA聚合酶II终止和聚腺苷酸化新生RNA转录物的DNA序列。聚腺苷酸化序列可以通过向编码序列的3'末端添加多聚A尾来促进mRNA稳定性,并且因此有助于增加翻译效率。可以用于逆转录病毒核酸中的多聚A信号的例示性实例包括AATAAA、ATT AAA、AGTAAA、牛生长激素多聚A序列(BGHpA)、兔b珠蛋白多聚A序列(rPgpA)或另一种合适的异源或内源多聚A序列。
在一些实施方案中,逆转录病毒或慢病毒载体还包含一个或多个绝缘子元件,例如本文所述的绝缘子元件。
在各种实施方案中,载体包含与编码外源性剂的多核苷酸可操作地连接的启动子。载体可以具有一个或多个LTR,其中任一个LTR包含一个或多个修饰,诸如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。载体还可以包含一个或多个增加转导效率的辅助元件(例如cPPT/FLAP)、病毒包装(例如Psi(Y)包装信号,RRE)和/或增加外源基因表达的其他元件(例如聚(A)序列),并且可以任选地包含WPRE或HPRE。
在一些实施方案中,慢病毒核酸例如从5'至3'包含以下中的一种或多种(例如全部):启动子(例如CMV)、R序列(例如包含TAR)、U5序列(例如用于整合)、PBS序列(例如用于逆转录)、DIS序列(例如用于基因组二聚化)、psi包装信号、部分gag序列、RRE序列(例如用于核输出)、cPPT序列(例如用于核输入)、驱动外源性剂表达的启动子、编码外源性剂的基因、WPRE序列(例如,用于有效的转基因表达)、PPT序列(例如,用于逆转录)、R序列(例如,用于聚腺苷酸化和终止)和U5信号(例如,用于整合)。
2.病毒样载体颗粒
在一些实施方案中,基于病毒的颗粒是来源于病毒的病毒样脂质颗粒(VLP)。在一些实施方案中,病毒包膜可包含融合剂,例如对病毒内源的融合剂或假型融合剂。VLP包括来源于逆转录病毒或慢病毒的那些。虽然VLP模仿天然病毒体结构,但其缺乏在宿主细胞内独立复制所必需的病毒基因组信息。因此,在某些方面,VLP是非感染性的。在具体实施方案中,VLP不含有病毒基因组。在一些实施方案中,两亲性脂质的VLP双层是或包含病毒包膜。在一些实施方案中,两亲性脂质的靶向脂质颗粒双层是或包含源自细胞的脂质。在一些实施方案中,VLP含有至少一种类型的来自病毒的结构蛋白。在大多数情况下,这种蛋白质会形成蛋白质衣壳。在一些情况下,衣壳也将被包裹在脂质双层中,所述脂质双层来源于已释放出组装的VLP(例如,包含人免疫缺陷病毒结构蛋白诸如GAG的VLP)的细胞。在一些实施方案中,VLP还包含靶向部分作为脂质双层内的包膜蛋白。
在一些实施方案中,载体媒介物颗粒包含由自组装成衣壳的病毒蛋白形成的超分子复合物。在一些实施方案中,载体媒介物颗粒是源自病毒衣壳蛋白的病毒样颗粒。在一些实施方案中,载体媒介物颗粒是源自病毒核衣壳蛋白的病毒样颗粒。在一些实施方案中,载体媒介物颗粒包含保留包装核酸性质的核衣壳衍生的蛋白质。在一些实施方案中,基于病毒的颗粒,诸如病毒样颗粒在来自病毒基因组的蛋白质中仅包含病毒结构糖蛋白。在一些实施方案中,载体媒介物颗粒不含有病毒基因组。
在一些实施方案中,载体媒介物颗粒在表达过程中包装来自宿主细胞的核酸,诸如编码外源药剂的核酸。在一些实施方案中,核酸不编码参与病毒复制的任何基因。在具体实施方案中,载体媒介物颗粒是病毒样颗粒,例如逆转录病毒样颗粒,诸如慢病毒样颗粒,其是复制缺陷型的。
在一些实施方案中,载体媒介物颗粒是包含缺少或缺乏病毒RNA的序列(这可能是从该序列中除去或清除病毒RNA的结果)的病毒样颗粒。在一些实施方案中,这可以通过使用gag上的内源包装信号结合位点来实现。在一些实施方案中,内源包装信号结合位点在pol上。在一些实施方案中,待递送的RNA将含有同源包装信号。在一些实施方案中,位于待递送的RNA上的异源结合结构域(其与gag异源)和位于gag或pol上的同源结合位点可以用于确保待递送的RNA的包装。在一些实施方案中,异源序列可以是非病毒的或者其可以是病毒的,在这种情况下其可以源自不同的病毒。在一些实施方案中,载体颗粒可以用于递送治疗性RNA,在这种情况下不需要功能性整合酶和/或逆转录酶。在一些实施方案中,载体颗粒也可以用于递送感兴趣的治疗基因,在这种情况下通常包括pol。
在一些实施方案中,VLP包含由病毒蛋白自组装成衣壳形成的超分子复合物。在一些实施方案中,VLP源自病毒衣壳。在一些实施方案中,VLP源自病毒核衣壳。在一些实施方案中,VLP是核衣壳衍生的,并保留了包装核酸的特性。在一些实施方案中,VLP仅包含病毒结构糖蛋白。在一些实施方案中,VLP不含有病毒基因组。
3.产生基于病毒的颗粒的方法
大规模病毒颗粒产生通常可用于实现所需的病毒滴度。可以通过将转移载体转染到包装细胞系中来产生病毒颗粒,所述包装细胞系包含病毒结构和/或辅助基因,例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或其他逆转录病毒基因。
在一些实施方案中,病毒载体颗粒可以在包括细菌、哺乳动物细胞系、昆虫细胞系、酵母和植物细胞的多种细胞培养系统中产生。描述了用于产生病毒载体颗粒的示例性方法。
在一些实施方案中,用于产生病毒载体(即,重组病毒载体,诸如无复制能力的慢病毒载体)的元件包含在包装细胞系中或存在于包装载体上。在一些实施方案中,病毒载体可以包含经由一种或多种包装载体递送至包装细胞系的包装元件rev、gag和pol。
在实施方案中,包装载体是缺乏包装信号并且包含编码一种、两种、三种、四种或更多种病毒结构和/或辅助基因的多核苷酸的表达载体或病毒载体。通常,包装载体包含在包装细胞中,并通过转染、转导或感染引入细胞中。可以通过转染、转导或感染将逆转录病毒(例如慢病毒)转移载体引入到包装细胞系中,以产生源细胞或细胞系。通过标准方法将包装载体引入人细胞或细胞系,所述标准方法包括例如磷酸钙转染、脂质转染或电穿孔。在一些实施方案中,将包装载体与显性选择标记诸如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素(zeocin)、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA一起引入细胞中,随后在适当药物的存在下进行选择并分离克隆。选择标记基因可与包装载体编码的基因例如通过IRES或自切割病毒肽物理连接。在一些实施方案中,包装载体是包装质粒。
生产细胞系(也称为包装细胞系)包括不含有包装信号但稳定或瞬时表达可以包装病毒颗粒的病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)的细胞系。可以使用任何合适的细胞系,例如哺乳动物细胞,例如人细胞。可以使用的合适细胞系包括例如CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。在实施方案中,包装细胞是293细胞、293T细胞或A549细胞。
在一些实施方案中,生产细胞(即,源细胞系)包括能够产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系,该细胞系包含生产细胞系和包含包装信号的转移载体构建体。制备病毒原液的方法由例如Y.Soneoka等人(1995)Nucl.Acids Res.23:628-633和N.R.Landau等人(1992)J.Virol.66:5110-5113描绘,所述文献通过引用并入本文。例如通过细胞裂解或收集细胞培养物的上清液,感染性病毒颗粒可从包装细胞中收集。任选地,可以富集或纯化所收集的病毒颗粒。
在一些实施方案中,源细胞包含一种或多种质粒,所述质粒编码可包装病毒颗粒(即,包装质粒)的病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)。在一些实施方案中,编码gag、pol和env前体中的至少两种的序列在相同质粒上。在一些实施方案中,编码gag、pol和env前体的序列在不同的质粒上。在一些实施方案中,编码gag、pol和env前体的序列具有相同的表达信号,例如启动子。在一些实施方案中,编码gag、pol和env前体的序列具有不同的表达信号,例如不同的启动子。在一些实施方案中,gag、pol和env前体的表达是诱导型的。在一些实施方案中,在相同时间或在不同时间转染编码病毒结构蛋白和复制酶的质粒。在一些实施方案中,在与包装载体相同的时间或不同的时间转染编码病毒结构蛋白和复制酶的质粒。
在一些实施方案中,源细胞系包含一个或多个稳定整合的病毒结构基因。在一些实施方案中,稳定整合的病毒结构基因的表达是诱导型的。
在一些实施方案中,病毒结构基因的表达在转录水平上受到调节。在一些实施方案中,病毒结构基因的表达在翻译水平上受到调节。在一些实施方案中,病毒结构基因的表达在翻译后水平受到调节。
在一些实施方案中,病毒结构基因的表达受四环素(Tet)依赖性系统调节,其中Tet调节的转录阻遏物(Tet-R)与在启动子中包含的DNA序列结合并且通过空间位阻抑制转录(Yao等人,1998;Jones等人,2005)。在添加多西环素(dox)后,Tet-R被释放,从而允许转录。多种其他合适的转录调节启动子、转录因子和小分子诱导物适合用于调节病毒结构基因的转录。
在一些实施方案中,将在Tet调节的启动子的控制下并与抗生素抗性盒偶联的第三代慢病毒组分、人免疫缺陷病毒1型(HIV)、Rev、Gag/Pol和包膜分别整合到源细胞基因组中。在一些实施方案中,源细胞仅在基因组中整合了一个拷贝的Rev、Gag/Pol和包膜蛋白中的每一种。
在一些实施方案中,编码外源剂的核酸(例如,编码外源剂的逆转录病毒核酸)也被整合到源细胞基因组中。在一些实施方案中,编码外源剂的核酸保持游离状态。在一些实施方案中,编码外源剂的核酸被转染到在基因组中具有稳定整合的Rev、Gag/Pol和包膜蛋白的源细胞中。参见例如Milani等人EMBO Molecular Medicine,2017,其以引用方式全文并入本文。
在一些实施方案中,本文所述的逆转录病毒核酸不能进行逆转录。在实施方案中,这样的核酸能够瞬时表达外源性剂。逆转录病毒或VLP可能包含无效的逆转录酶蛋白,或者可能不包含逆转录酶蛋白。在实施方案中,逆转录病毒核酸包含无效的引物结合位点(PBS)和/或att位点。在实施方案中,一种或多种病毒辅助基因(包括rev、tat、vif、nef、vpr、vpu、vpx和S2或其功能等效物)在逆转录病毒核酸中是无效的或缺失的。在实施方案中,选自S2、rev和tat的一个或多个辅助基因在逆转录病毒核酸中是无效的或缺失的。
通常,现代逆转录病毒载体系统包含携带顺式作用载体序列的病毒基因组,该顺式作用载体序列用于将病毒RNA转录、逆转录、整合、翻译和包装到病毒颗粒中,以及(2)生产细胞系,其表达生产病毒颗粒所需的反式作用逆转录病毒基因序列(例如,gag、pol和env)。通过完全分离顺式作用载体序列和反式作用载体序列,病毒不能在超过一个感染周期内保持复制。可以通过许多策略来避免活病毒的产生,例如通过使顺式作用序列和反式作用序列之间的重叠最小化来避免重组。
包含如第III.A.2节中所描述的不含或缺乏病毒RNA的序列的病毒样颗粒(VLP)可以是从该序列中除去或消除病毒RNA的结果。与第III.A.1节中所公开的病毒载体颗粒类似,VLP含有由宿主细胞(即生产细胞或源细胞)脂质双层以及至少一种病毒结构蛋白制成的病毒外包膜。在一些实施方案中,病毒结构蛋白是指有助于病毒核心或衣壳结构的任何病毒蛋白或其片段。
通常,对于如第III.A.1节所描述的病毒载体颗粒,gag前体蛋白的表达单独介导载体组装和释放。在一些方面,gag蛋白或其片段已被证明组装成类似于病毒核心的结构。在一个实施方案中,这可以通过使用gag上的内源性包装信号结合位点来实现。或者,内源性包装信号结合位点是在pol上。在该实施方案中,待递送的RNA将含有同源包装信号。在另一个实施方案中,位于待递送RNA上的异源结合结构域(与gag异源)和位于gag或pol上的同源结合位点可用于确保待递送RNA的包装。异源序列可以是非病毒的,也可以是病毒的,在这种情况下,它可以来源于不同的病毒。VLP可用于递送治疗性RNA,在这种情况下不需要功能性整合酶和/或逆转录酶。这些VLP也可用于递送目标治疗性基因,在这种情况下通常包括pol。
在一个实施方案中,gag-pol被改变,并且包装信号被相应的包装信号置换。在这个实施方案中,颗粒可以包装具有新的包装信号的RNA。这种方法的优点是可以包装缺少病毒序列的RNA序列,例如RNAi。
另一种方法是依靠待包装的RNA的过量表达。在一个实施方案中,待包装的RNA在不存在任何含有包装信号的RNA的情况下过量表达。这可能导致大量的治疗性RNA被包装,并且该量足以转导细胞并具有生物学效应。
在一些实施方案中,多核苷酸包含编码病毒gag蛋白或逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列,其中gag蛋白或pol蛋白包含能够识别RNA序列中相应序列的异源RNA结合结构域,以便于将RNA序列包装到病毒载体颗粒中。在一些实施方案中,异源RNA结合结构域包含来源于噬菌体外壳蛋白、Rev蛋白、U 1小核核糖核蛋白颗粒蛋白、Nova蛋白、TF111 A蛋白、TIS11蛋白、trp RNA结合衰减蛋白(TRAP)或假尿苷合酶的RNA结合结构域。
在一些实施方案中,基于病毒的载体媒介物颗粒(即,VLP)的组装通过核心蛋白与病毒基因组内的独特衣壳化序列(例如具有茎环结构的UTR)的结合来启动。在一些实施方案中,核心与所述衣壳化序列的相互作用促进寡聚化。
在一些实施方案中,用于产生VLP的源细胞包含一种或多种编码病毒结构蛋白(例如gag、pol)的质粒,所述质粒可以包装病毒颗粒(即包装质粒)。在一些实施方案中,编码gag和pol前体中的至少两种的序列在同一质粒上。在一些实施方案中,编码gag和pol前体的序列在不同的质粒上。在一些实施方案中,编码gag和pol前体的序列具有相同的表达信号,例如启动子。在一些实施方案中,编码gag和pol前体的序列具有不同的表达信号,例如不同的启动子。在一些实施方案中,gag和pol前体的表达是可诱导的。
在一些实施方案中,可以通过本领域已知的任何合适的技术来检测如上文第III节中所描述的VLP或任何基于病毒的颗粒的形成。此类技术的实例包括例如电子显微镜、动态光散射、选择性色谱分离和/或密度梯度离心。
B.基于细胞的颗粒
在一些实施方案中,脂质颗粒是包含天然来源的膜的基于细胞的颗粒。在一些实施方案中,天然来源的膜包括由细胞或组织制备的膜囊泡。在一些实施方案中,基于细胞的颗粒包含可从细胞获得的囊泡。在一些实施方案中,基于细胞的颗粒包含微泡、外来体、膜包围体、凋亡小体(来自凋亡细胞)、颗粒(其可以来源于例如血小板)、核外粒(可来源于例如血清中的嗜中性粒细胞和单核细胞)、前列腺小体(prostatosome)(可获自前列腺癌细胞)或心小体(可来源于心脏细胞)。
在一些实施方案中,源细胞是内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如,巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如,间充质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞(例如,来源于受试者细胞的诱导多能干细胞)、胚胎干细胞(例如,来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、红细胞生成组织、造血组织的干细胞))、成肌细胞、实质细胞(例如,肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如,视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如,视网膜前体细胞、成髓细胞、骨髓前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、成巨核细胞、幼巨核细胞、成黑素细胞、成淋巴样细胞、骨髓前体细胞、正成红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如,心脏祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、母细胞)或无限增殖化细胞(例如,HeEa、HEK293、HFF-l、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。在一些实施方案中,源细胞不是293细胞、HEK细胞、人内皮细胞或人上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或干细胞。
在一些实施方案中,基于细胞的颗粒具有<1、1-1.1、1.05-1.15、1.1-1.2、1.15-1.25、1.2-1.3、1.25-1.35或>1.35g/ml的密度。在一些实施方案中,载体媒介物颗粒组合物包含按蛋白质质量计少于0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%或10%的源细胞或少于0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%或10%的具有功能细胞核的细胞。
在实施方案中,基于细胞的颗粒的大小或载体媒介物颗粒的群体的平均大小小于源细胞的大小的约0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。
在一些实施方案中,基于细胞的颗粒是细胞外囊泡,例如包含膜的基于细胞的囊泡,该膜包围内部空间并且具有比其来源的细胞更小的直径。在实施方案中,细胞外囊泡具有20nm至1000nm的直径。在实施方案中,基于细胞的颗粒是凋亡小体、细胞片段、通过直接或间接操作衍生自细胞的囊泡、囊泡化细胞器和由活细胞产生的囊泡(例如,通过直接质膜出芽或晚期内体与质膜融合)。在实施方案中,细胞外囊泡源自活的或死的生物体、移植的组织或器官或培养的细胞。
在实施方案中,基于细胞的颗粒是纳米囊泡,例如,细胞衍生的小(例如,直径在20-250nm之间或直径在30-150nm之间)囊泡,其包含包围内部空间的膜并且其通过直接或间接操作从所述细胞产生。在一些情况下,纳米囊泡的产生可以导致源细胞的破坏。纳米囊泡可以包含脂质或脂肪酸和多肽。
在实施方案中,基于细胞的颗粒是外来体。在实施方案中,外来体是细胞衍生的小(例如,直径在20-300nm之间或直径在40-200nm之间)的囊泡,其包含包围内部空间的膜并且其通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜的融合从所述细胞产生。在实施方案中,外来体的产生不导致源细胞的破坏。在实施方案中,外来体包含脂质或脂肪酸和多肽。示例性外来体和其他膜包围体在WO/2017/161010、WO/2016/077639、US20160168572、US20150290343和US20070298118中也有所描述,所述专利中的每一篇通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中,基于细胞的颗粒是微泡。在一些实施方案中,微泡具有约100nm至约2000nm的直径。
在一些实施方案中,基于细胞的颗粒是细胞空壳。在一些实施方案中,囊泡是质膜囊泡,例如巨质膜囊泡。
在一些实施方案中,基于细胞的颗粒源自具有遗传修饰的源细胞,该遗传修饰导致免疫调节剂诸如免疫抑制剂的表达增加。在一些实施方案中,免疫抑制剂在细胞的外表面上。在一些实施方案中,免疫抑制剂被掺入载体媒介物颗粒的外表面。在一些实施方案中,载体媒介物颗粒包含通过共价键或非共价键附着于固体颗粒表面的免疫调节剂。
在一些实施方案中,基于细胞的颗粒通过诱导外来体、微泡、膜囊泡、细胞外膜囊泡、质膜囊泡、巨质膜囊泡、凋亡小体、有丝分裂小体、核红细胞、溶酶体或其他膜包围囊泡的出芽而产生。
在一些实施方案中,通过诱导细胞去核来产生基于细胞的颗粒。去核可以使用如下测定来进行:所述测定诸如遗传、化学(例如,使用放线菌素D,参见Bayona-Bafaluy等人,“A chemical enucleation method for the transfer of mitochondrial DNA toρ°cells”Nucleic Acids Res.2003年8月15日;31(16):e98)、机械方法(例如,挤压或抽吸,参见Lee等人,“A comparative study on the efficiency of two enucleation methodsin pig somatic cell nuclear transfer:effects of the squeezing and theaspiration methods.”Anim Biotechnol.2008;19(2):71-9)或它们的组合。
在一些实施方案中,基于细胞的颗粒通过诱导细胞破碎产生。在一些实施方案中,细胞破碎可以使用以下方法来进行,所述方法包括但不限于:化学方法、机械方法(例如离心(例如超速离心或密度离心)、冷冻-解冻或超声处理)或它们的组合。
在一些实施方案中,用于制备基于细胞的颗粒的源细胞在制备载体媒介物颗粒后将不可用于测试。
在一些实施方案中,通过与参考细胞比较来描述基于细胞的颗粒的特征。在实施方案中,参考细胞是源细胞。在实施方案中,参考细胞是HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞。在一些实施方案中,载体媒介物颗粒群体的特征通过与参考细胞群体(例如源细胞群体或HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞群体)比较来描述。
C.外源药剂
在一些实施方案中,本文所述的脂质颗粒或包含其的药物组合物含有外源药剂。在一些实施方案中,本文所述的脂质颗粒或包含其的药物组合物含有编码外源药剂的核酸。在一些实施方案中,脂质颗粒含有外源药剂。在一些实施方案中,脂质颗粒含有编码外源药剂的核酸。编码外源药剂的核酸的编码序列在本文中也称为有效负载基因。在一些实施方案中,外源药剂或编码外源药剂的核酸存在于脂质颗粒的内腔中。
在一些实施方案中,所述外源剂是蛋白质或核酸(例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA(例如mRNA或miRNA))。在一些实施方案中,外源药剂是蛋白质。在一些实施方案中,外源药剂是核酸(例如,DNA、染色体(例如,人类人工染色体)、RNA,例如,mRNA或miRNA)。在一些实施方案中,外源药剂包含或编码膜蛋白。在一些实施方案中,外源药剂包含或编码治疗剂。在一些实施方案中,治疗剂选自以下中的一种或多种:蛋白质,例如酶、跨膜蛋白、受体或抗体;核酸,例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA或miRNA;或小分子。
在一些实施方案中,脂质颗粒或药物组合物将脂质颗粒所包含的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的外源药剂(例如,包含或编码治疗剂的外源药剂)递送至靶细胞。在一些实施方案中,与靶细胞接触(例如,融合)的脂质颗粒(例如,融合体)将与靶细胞接触(例如,融合)的脂质颗粒(例如,融合体)所包含的平均至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的外源药剂(例如,包含或编码治疗剂的外源药剂)递送至靶细胞。在一些实施方案中,脂质颗粒组合物将脂质颗粒组合物所包含的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的外源药剂(例如,包含或编码治疗剂的外源药剂)递送至靶组织。
在一些实施方案中,外源药剂不在衍生脂质颗粒的细胞中天然表达。在一些实施方案中,外源药剂在衍生脂质颗粒的细胞中天然表达。在一些实施方案中,通过在衍生脂质颗粒的细胞中的表达(例如通过转染、转导或电穿孔引入的DNA或mRNA的表达)将外源药剂加载到脂质颗粒中。在一些实施方案中,外源由整合到基因组中的DNA表达或保持游离状态。在一些实施方案中,外源药剂的表达是组成型的。在一些实施方案中,外源药剂的表达被诱导。在一些实施方案中,在产生脂质颗粒之前立即诱导外源药剂的表达。在一些实施方案中,外源药剂的表达与融合剂的表达同时被诱导。
在一些实施方案中,通过电穿孔到脂质颗粒本身中或到衍生脂质颗粒的细胞中将外源药剂加载到脂质颗粒中。在一些实施方案中,通过转染(例如,编码外源药剂的DNA或mRNA的转染)到脂质颗粒本身中或到衍生脂质颗粒的细胞中将外源药剂加载到脂质颗粒中。
在一些实施方案中,外源药剂可以包括一种或多种核酸序列、一种或多种多肽、核酸序列和/或多肽的组合、一种或多种细胞器以及它们的任何组合。在一些实施方案中,外源药剂可以包括一种或多种细胞组分。在一些实施方案中,外源药剂包括一种或多种胞质和/或核组分。
在一些实施方案中,脂质颗粒含有为核酸的外源药剂或含有编码外源药剂的核酸。在一些实施方案中,核酸可操作地连接至“阳性靶细胞特异性调节元件”(或阳性TCSRE)。在一些实施方案中,阳性TCSRE是功能性核酸序列。在一些实施方案中,阳性TCSRE包含启动子或增强子。在一些实施方案中,TCSRE是增加靶细胞中外源试剂水平的核酸序列。在一些实施方案中,阳性靶细胞特异性调节元件包含T细胞特异性启动子、T细胞特异性增强子、T细胞特异性剪接位点、延长RNA或蛋白质半衰期的T细胞特异性位点、T细胞特异性mRNA核输出促进位点、T细胞特异性翻译增强位点或T细胞特异性翻译后修饰位点。在一些实施方案中,T细胞特异性启动子是Immgen consortium中描述的启动子,其以引用方式全文并入本文,例如,T细胞特异性启动子是IL2RA(CD25)、LRRC32、FOXP3或IKZF2启动子。在一些实施方案中,T细胞特异性启动子或增强子是Schmidl等人,Blood.2014年4月24日;123(17):e68-78中描述的启动子或增强子,其以引用方式全文并入本文。在一些实施方案中,T细胞特异性启动子是前述任一种的转录活性片段。在一些实施方案中,T细胞特异性启动子是与前述任一种具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的变体。
在一些实施方案中,脂质颗粒含有为核酸的外源药剂或含有编码外源药剂的核酸。在一些实施方案中,核酸可操作地连接至“阴性靶细胞特异性调节元件”(或阴性TCSRE)。在一些实施方案中,阴性TCSRE是功能性核酸序列。在一些实施方案中,阴性TCSRE是导致非靶细胞中脂质颗粒的抑制降解的miRNA识别位点。在一些实施方案中,外源试剂可操作地连接至“非靶细胞特异性调节元件”(或NTCSRE)。在一些实施方案中,NTCSRE包含与非靶细胞中相比降低非靶细胞中的外源试剂的水平的核酸序列。在一些实施方案中,NTCSRE包含非靶细胞特异性miRNA识别序列、非靶细胞特异性蛋白酶识别位点、非靶细胞特异性泛素连接酶位点、非靶细胞特异性转录抑制位点或非靶细胞特异性表观遗传抑制位点。在一些实施方案中,NTCSRE包含组织特异性miRNA识别序列、组织特异性蛋白酶识别位点、组织特异性泛素连接酶位点、组织特异性转录抑制位点或组织特异性表观遗传抑制位点。在一些实施方案中,NTCSRE包含非靶细胞特异性miRNA识别序列、非靶细胞特异性蛋白酶识别位点、非靶细胞特异性泛素连接酶位点、非靶细胞特异性转录抑制位点或非靶细胞特异性表观遗传抑制位点。在一些实施方案中,NTCSRE包含非靶细胞特异性miRNA识别序列,并且该miRNA识别序列能够被miR3 1、miR363或miR29c中的一种或多种结合。在一些实施方案中,NTCSRE位于或编码在编码外源试剂的转录区内,任选地其中转录区产生的RNA包含UTR或编码区内的miRNA识别序列。
1.核酸
在一些实施方案中,外源药剂可以包括核酸。例如,外源药剂可以包含增强内源蛋白表达的RNA,或抑制内源蛋白表达的siRNA或miRNA。例如,内源蛋白可以调节在靶细胞中的结构或功能。在一些实施方案中,外源药剂可以包括编码调节靶细胞中的结构或功能的工程化蛋白质的核酸。在一些实施方案中,外源药剂是靶向调节靶细胞中的结构或功能的转录激活因子的核酸。
在一些实施方案中,本文所述的脂质颗粒包含核酸,例如RNA或DNA。在一些实施方案中,核酸是一个或多个天然核酸残基、包含一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中,核酸是一种或多种核酸类似物、包含一种或多种核酸类似物或由一种或多种核酸类似物组成。在一些实施方案中,核酸具有编码功能性基因产物诸如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中,核酸包含一个或多个内含子。在一些实施方案中,通过从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合的酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中复制和化学合成中的一种或多种来制备核酸。在一些实施方案中,核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1 10、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施方案中,核酸是部分或全部单链的;在一些实施方案中,核酸是部分或全部双链的。在一些实施方案中,核酸具有包含至少一个编码多肽的元件或者是编码多肽的序列的互补体的核苷酸序列。核酸可以包括变体,例如与参考核酸具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%的总体序列同一性。在一些实施方案中,变体核酸不与参考核酸共享至少一个特征序列元件。在一些实施方案中,变体核酸具有参考核酸的一种或多种生物活性。在一些实施方案中,核酸变体具有与参考核酸同一的核酸序列,但是在特定位置具有少量序列改变。在一些实施方案中,与参考相比,变体中少于约20%、约15%、约10%、约9%、约8%、约7%、约6%、约5%、约4%、约3%或约2%的残基被取代、插入或缺失。在一些实施方案中,与参考相比,变体核酸包含约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2或约1个取代残基。在一些实施方案中,相对于参考,变体核酸包含极少量(例如,少于约5、约4、约3、约2或约1个)的参与特定生物活性的取代、插入或缺失的功能残基。在一些实施方案中,与参考相比,变体核酸包含不超过约15、约12、约9、约3或约1个添加或缺失,并且在一些实施方案中,不包含添加或缺失。在一些实施方案中,与参考相比,变体核酸包含少于约27、约24、约21、约18、约15、约12、约9、约6、约3或少于约9、约6、约3或约2个添加或缺失。
在一些实施方案中,外源药剂包括核酸,例如DNA、nDNA(核DNA)、mtDNA(线粒体DNA)、编码蛋白质的DNA、基因、操纵子、染色体、基因组、转座子、反转录转座子、病毒基因组、内含子、外显子、经修饰的DNA、mRNA(信使RNA)、tRNA(转移RNA)、经修饰的RNA、微RNA、siRNA(小干扰RNA)、tmRNA(转移信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mtRNA(线粒体RNA)、snRNA(小核RNA)、小核仁RNA(snoRNA)、SmY RNA(mRNA反式剪接RNA)、gRNA(向导RNA)、TERC(端粒酶RNA组分)、aRNA(反义RNA)、顺式-NAT(顺式-天然反义转录物)、CRISPR RNA(crRNA)、IncRNA(长非编码RNA)、piRNA(piwi相互作用RNA)、shRNA(短发夹RNA)、tasiRNA(反式作用siRNA)、eRNA(增强子RNA)、卫星RNA、pcRNA(编码蛋白质的RNA)、dsRNA(双链RNA)、RNAi(干扰RNA)、circRNA(环状RNA)、重编程RNA、适体以及它们的任何组合。在一些实施方案中,核酸是野生型核酸。在一些实施方案中,蛋白质是突变体核酸。在一些实施方案中,核酸是多个核酸序列的融合体或嵌合体。
在实施方案中,核酸编码针对一种或多种RNA靶标的一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子。抑制性RNA分子可以是例如miRNA或shRNA。在一些实施方案中,抑制性分子可以是miRNA的前体,例如Pri-miRNA或Pre-miRNA,或shRNA的前体。在一些实施方案中,抑制性分子可以是人工来源的miRNA或shRNA。在其他实施方案中,抑制性RNA分子可以是被加工成siRNA的dsRNA(转录的或人工引入的)或siRNA本身。在一些实施方案中,抑制性RNA分子可以是miRNA或shRNA,其具有天然未发现的序列,或具有天然未发现的至少一个功能片段,或具有天然未发现的功能片段的组合。在示例性实施方案中,至少一种或所有抑制性RNA分子是miR-l55。在一些实施方案中,本文所述的逆转录病毒载体编码针对一种或多种RNA靶标的两种或更多种抑制性RNA分子。在一些实施方案中,两种或更多种抑制性RNA分子可以针对不同的靶标。在其他实施方案中,两种或更多种抑制性RNA分子针对相同的靶标。在一些实施方案中,外源药剂包含shRNA。shRNA(短发夹RNA)可以包含由单条自身互补RNA链形成的双链结构。shRNA构建体可以包含与靶基因的编码或非编码序列的一部分同一的核苷酸序列。还可以使用相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列。可以使用抑制性RNA和靶基因部分之间大于90%的序列同一性,或甚至100%的序列同一性。在某些实施方案中,shRNA的双链体形成部分的长度是至少20、2 1或22个核苷酸的长度,例如,在大小上对应于由Dicer依赖性切割产生的RNA产物。在某些实施方案中,shRNA构建体的长度为至少25、50、100、200、300或400个碱基。在某些实施方案中,shRNA构建体的长度为400-800个碱基。shRNA构建体对环序列和环大小的变化具有高度耐受性。在实施方案中,编码siRNA、miRNA、shRNA或核酶的逆转录病毒载体包含一种或多种调节序列,例如强组成型polIII,例如人U6 snRNA启动子、小鼠U6 snRNA启动子、人和小鼠H l RNA启动子和人tRNA-val启动子或强组成型pol II启动子。
2.多肽
在一些实施方案中,脂质颗粒含有编码蛋白质外源药剂的核酸(也称为“编码外源药剂的有效负载基因”)。在一些实施方案中,本文所述的脂质颗粒包含外源药剂,该外源药剂是或包含蛋白质。
在一些实施方案中,蛋白质可以包括除氨基酸以外的部分(例如,可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以以其他方式加工或修饰。在一些实施方案中,蛋白质有时可以包括多于一条多肽链,例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式缔合。
在一些实施方案中,蛋白质可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者,并且可以含有多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。在一些实施方案中,蛋白质可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸以及它们的组合。在一些实施方案中,蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征部分。在一些实施方案中,多肽可以包括其变体,例如与参考多肽具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%的总序列同一性。在一些实施方案中,变体多肽不与参考多肽共享至少一个特征序列元件。在一些实施方案中,变体多肽具有参考多肽的一种或多种生物活性。在一些实施方案中,多肽变体具有与参考核酸同一的氨基酸序列,但是在特定位置具有少量序列改变。在一些实施方案中,与参考相比,变体中少于约20%、约15%、约10%、约9%、约8%、约7%、约6%、约5%、约4%、约3%或约2%的残基被取代、插入或缺失。在一些实施方案中,与参考相比,变体多肽包含约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2或约1个取代残基。在一些实施方案中,相对于参考,变体多肽包含极少量(例如,少于约5、约4、约3、约2或约1个)的参与特定生物活性的取代、插入或缺失的功能。在一些实施方案中,与参考相比,变体多肽包含不超过约5、约4、约3、约2或约1个添加或缺失,并且在一些实施方案中,不包含添加或缺失。在一些实施方案中,与参考相比,变体多肽包含少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6、并且通常少于约5、约4、约3或约2个添加或缺失。
在一些实施方案中,蛋白质包括多肽,例如酶、结构多肽、信号传导多肽、调节多肽、转运多肽、感觉多肽、运动多肽、防御多肽、贮存多肽、转录因子、抗体、细胞因子、激素、分解代谢多肽、合成代谢多肽、蛋白水解多肽、代谢多肽、激酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、酶调节多肽、蛋白结合多肽、脂质结合多肽、膜融合多肽、细胞分化多肽、表观遗传多肽、细胞死亡多肽、核转运多肽、核酸结合多肽、重编程多肽、DNA编辑多肽、DNA修复多肽、DNA重组多肽、转座酶多肽、DNA整合多肽、靶向核酸内切酶(例如锌指核酸酶、转录激活物样核酸酶(TALEN)、cas9及其同源物)、重组酶、转座酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶以及它们的任何组合。
在一些实施方案中,蛋白质靶向细胞中的蛋白质用于降解。在一些实施方案中,蛋白质靶向细胞中的蛋白质以通过将蛋白质定位到蛋白酶体而降解。在一些实施方案中,蛋白质是野生型蛋白质。在一些实施方案中,蛋白质是突变蛋白质。
示例性蛋白质外源药剂在以下小节中描述。在一些实施方案中,本文提供的脂质颗粒可以包括任何此类外源药剂。在具体实施方案中,脂质颗粒含有编码任何此类外源药剂的核酸。
a.胞质蛋白
在一些实施方案中,外源剂包含胞质蛋白,例如在受体细胞中产生并定位于受体细胞的细胞质的蛋白质。在一些实施方案中,外源剂包含分泌蛋白,例如由受体细胞产生和分泌的蛋白质。在一些实施方案中,外源剂包含核蛋白,例如在受体细胞中产生并被输入受体细胞的细胞核的蛋白质。在一些实施方案中,外源剂包含细胞器蛋白(例如线粒体蛋白),例如在受体细胞中产生并被输入受体细胞的细胞器(例如线粒体)中的蛋白质。在一些实施方案中,蛋白质是野生型蛋白质或突变蛋白质。在一些实施方案中,蛋白质是融合蛋白或嵌合蛋白。
b.膜蛋白
在一些实施方案中,外源药剂包含膜蛋白。在一些实施方案中,膜蛋白包含嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体、整联蛋白、离子通道、成孔蛋白、Toll样受体、白介素受体、细胞粘附蛋白或转运蛋白。
1)嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施方案中,本文所述的有效负载基因编码包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中,本文所述的外源药剂包含含有抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中,有效负载是或包含含有抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中,CAR是或包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域(例如,一个、两个或三个信号传导结构域)的第一代CAR。在一些实施方案中,CAR包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域的第三代CAR。在一些实施方案中,第四代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域和在CAR成功信号传导时诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中,抗原结合结构域是或包含scFv或Fab。
在一些实施方案中,抗原结合结构域靶向细胞类型特征性抗原。在一些实施方案中,抗原结合结构域靶向肿瘤细胞特征性抗原。在一些实施方案中,肿瘤细胞特征性抗原选自细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白偶联的受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰环化酶、组氨酸激酶相关受体、表皮生长因子受体(EGFR)(包括ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体和Eph受体家族(包括EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、Bestrophins、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC转运蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、鞘氨醇-1-磷酸受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多跨跨膜蛋白、T细胞受体基序、T细胞α链、T细胞β链、T细胞γ链、T细胞δ链、CCR7、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD34、CD35、CD40、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD62L、CD68、CD80、CD95、CD117、CD127、CD133、CD137(4-1BB)、CD163、F4/80、IL-4Ra、Sca-1、CTLA-4、GITR、GARP、LAP、粒酶B、LFA-1、转铁蛋白受体、NKp46、穿孔素、CD4+、Th1、Th2、Th17、Th40、Th22、Th9、Tfh、典型Treg、FoxP3+、Tr1、Th3、Treg17、TREG、CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如,CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ2、VEGF、VEGFR1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、肌腱蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、Smoothened、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR或ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板源生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、主要组织相容性复合物I类相关基因蛋白(MR1)、尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)、Fos-相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素、端粒酶、PCTA-1/Galectin8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A,B,C)CD49f、CD151 CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC或其抗原片段或抗原部分。
在一些实施方案中,抗原结合结构域靶向T细胞特征性抗原。在一些实施方案中,所述表征T细胞的抗原选自表征T细胞的细胞表面受体、膜转运蛋白(例如,主动或被动转运蛋白,例如离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或细胞粘附蛋白。在一些实施方案中,T细胞特征性抗原可以是G蛋白偶联的受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰环化酶、组氨酸激酶相关受体、AKT1、AKT2、AKT3、ATF2、BCL10、CALM1、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD4、CD8、CD28、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD247(CD3ζ)、CTLA4(CD152)、ELK1、ERK1(MAPK3)、ERK2、FOS、FYN、GRAP2(GADS)、GRB2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HRAS、IKBKA(CHUK)、IKBKB、IKBKE、IKBKG(NEMO)、IL2、ITPR1、ITK、JUN、KRAS2、LAT、LCK、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K6(MKK6)、MAP2K7(MKK7)、MAP3K1(MEKK1)、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K8、MAP3K14(NIK)、MAPK8(JNK1)、MAPK9(JNK2)、MAPK10(JNK3)、MAPK11(p38β)、MAPK12(p38γ)、MAPK13(p38δ)、MAPK14(p38α)、NCK、NFAT1、NFAT2、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PIK3C2B、PIK3C3(VPS34)、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PKCA、PKCB、PKCM、PKCQ、PLCY1、PRF1(穿孔素)、PTEN、RAC1、RAF1、RELA、SDF1、SHP2、SLP76、SOS、SRC、TBK1、TCRA、TEC、TRAF6、VAV1、VAV2或ZAP70。
在一些实施方案中,抗原结合结构域靶向疾病特征性抗原。在一些实施方案中,抗原结合结构域靶向自身免疫或炎性病症特征性抗原。在一些实施方案中,自身免疫或炎性病症选自慢性移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮、关节炎、免疫复合物肾小球肾炎、古德帕斯丘、葡萄膜炎、肝炎、系统性硬化症或硬皮病、I型糖尿病、多发性硬化、冷凝集素病、寻常型天疱疮、格雷夫氏病、自身免疫性溶血性贫血、A型血友病、原发性干燥综合征、血栓性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、埃文氏综合征、IGM介导的神经病、冷球蛋白血症、皮肌炎、特发性血小板减少症、强直性脊柱炎、大疱性类天疱疮、获得性血管性水肿、慢性荨麻疹、抗磷脂脱髓鞘性多发性神经病和自身免疫性血小板减少症或中性粒细胞减少症或纯红细胞再生障碍,虽然同种免疫疾病的示例性非限制性实例包括同种异体致敏(参见例如Blazar等人,2015,Am.J.Transplant,15(4):931-41)或来自造血或实体器官移植、输血、妊娠与胎儿的异种致敏、新生儿同种免疫血小板减少症、新生儿溶血性疾病、对外来抗原的致敏,诸如用酶或蛋白质替代疗法治疗的遗传性或获得性缺陷病症的替代、血液制品和基因疗法可发生。在一些实施方案中,自身免疫或炎性病症特征性抗原选自细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白偶联的受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶或组氨酸激酶相关受体。在一些实施方案中,CAR抗原结合结构域结合在B细胞、浆细胞、成浆细胞、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干扰素受体、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2上表达的配体。参见US2003/0077249、WO 2017/058753、WO 2017/058850,这些文献的内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中,抗原结合结构域靶向衰老细胞特征性抗原,例如尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)。在一些实施方案中,CAR可用于治疗或预防以衰老细胞的异常积累为特征的病症,例如肝和肺纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病和骨关节炎。
在一些实施方案中,抗原结合结构域靶向感染性疾病特征性抗原。在一些实施方案中,其中感染性疾病选自HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人疱疹病毒、人疱疹病毒8型(HHV-8、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV))、人T-淋巴样细胞病毒-1性(HTLV-1)、默克尔细胞多瘤病毒(MCV)、猿猴病毒40(SV40)、Eptstein-Barr病毒、CMV、人乳头瘤病毒。在一些实施方案中,感染性疾病特征性抗原选自细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白偶联的受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关受体、HIV Env、gpl20或HIV-1Env上的CD4诱导的表位。
在一些实施方案中,CAR跨膜结构域至少包含以下的跨膜区:T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体。在一些实施方案中,所述跨膜结构域至少包含以下的跨膜区:CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能变体。
在一些实施方案中,所述CAR包含选自以下中的一种或多种的至少一个信号传导结构域:B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6)、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α、TNF RII/TNFRSF1B)、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150)、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整联蛋白α4/CD49d、整联蛋白α4β1、整联蛋白α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、NKG2C、CD3ζ结构域、基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性地结合CD83的配体、或其功能片段。
在一些实施方案中,所述CAR包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体。在一些实施方案中,CAR包含(i)CD3ζ结构域,或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM),或其功能变体;以及(ii)CD28结构域,或4-1BB结构域,或其功能变体。在一些实施方案中,所述CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体;(ii)CD28结构域或其功能变体;和(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在一些实施方案中,所述CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体;(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体,和/或(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在一些实施方案中,所述CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体;(ii)CD28结构域或其功能变体;(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体;和(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中,所述CAR还包含一个或多个间隔子,例如,其中所述间隔子是抗原结合结构域与跨膜结构域之间的第一间隔子。在一些实施方案中,第一间隔区包括免疫球蛋白恒定区或其变体或修饰形式的至少一部分。在一些实施方案中,所述间隔子是跨膜结构域与信号传导结构域之间的第二间隔子。在一些实施方案中,所述第二间隔子是寡肽,例如,其中所述寡肽包含甘氨酸-丝氨酸双联体。
在一些实施方案中,外源药剂是或包含CAR,例如第一代CAR或编码第一代CAR的核酸。在一些实施方案中,第一代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和一个信号传导结构域。在一些实施方案中,信号传导结构域在T细胞激活期间介导下游信号传导。
在一些实施方案中,外源药剂是或包含第二代CAR或编码第二代CAR的核酸。在一些实施方案中,第二代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和两个信号传导结构域。在一些实施方案中,信号传导结构域在T细胞激活期间介导下游信号传导。在一些实施方案中,信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中,共刺激结构域增强T细胞激活期间的细胞因子产生、CAR T细胞增殖和/或CAR T细胞持久性。
在一些实施方案中,外源药剂是或包含第三代CAR或编码第三代CAR的核酸。在一些实施方案中,第三代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和至少三个信号传导结构域。在一些实施方案中,信号传导结构域在T细胞激活期间介导下游信号传导。在一些实施方案中,信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中,共刺激结构域增强T细胞激活期间的细胞因子产生、CAR T细胞增殖和/或CAR T细胞持久性。在一些实施方案中,第三代CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中,该至少两个共刺激结构域不同。
在一些实施方案中,外源药剂是或包含第四代CAR或编码第四代CAR的核酸。在一些实施方案中,第四代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个、三个或四个信号传导结构域。在一些实施方案中,信号传导结构域在T细胞激活期间介导下游信号传导。在一些实施方案中,信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中,共刺激结构域增强T细胞激活期间的细胞因子产生、CAR T细胞增殖和/或CAR T细胞持久性。
在一些实施方案中,第一、第二、第三或第四代CAR还包含在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中,细胞因子基因对于包含CAR的靶细胞是内源性或外源性的,该CAR包含在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中,细胞因子基因编码促炎细胞因子。在一些实施方案中,细胞因子基因编码IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF或IFN-γ或其功能片段。在一些实施方案中,在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中,在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中,转录因子或其功能结构域或片段是或包含活化T细胞的核因子(NFAT)、NF-kB或其功能结构域或片段。参见例如Zhang.C.等人,Engineering CAR-T cells.Biomarker Research.5:22(2017);WO 2016126608;Sha,H.等人Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumourimmunotherapy.Bioscience Reports,2017年1月27日,37(1)。
在一些实施方案中,CAR抗原结合结构域是或包含抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中,CAR抗原结合结构域是或包含scFv或Fab。在一些实施方案中,CAR抗原结合结构域包含以下的scFv或Fab片段:T细胞α链抗体;T细胞β链抗体;T细胞γ链抗体;T-细胞δ链抗体;CCR7抗体;CD3抗体;CD4抗体;CD5抗体;CD7抗体;CD8抗体;CD11b抗体;CD11c抗体;CD16抗体;CD19抗体;CD20抗体;CD21抗体;CD22抗体;CD25抗体;CD28抗体;CD34抗体;CD35抗体;CD40抗体;CD45RA抗体;CD45RO抗体;CD52抗体;CD56抗体;CD62L抗体;CD68抗体;CD80抗体;CD95抗体;CD117抗体;CD127抗体;CD133抗体;CD137(4-1BB)抗体;CD163抗体;F4/80抗体;IL-4Ra抗体;Sca-1抗体;CTLA-4抗体;GITR抗体GARP抗体;LAP抗体;粒酶B抗体;LFA-1抗体;MR1抗体;uPAR抗体;或运铁蛋白受体抗体。
在一些实施方案中,抗原结合结构域结合细胞的细胞表面抗原。在一些实施方案中,细胞表面抗原是一种类型的细胞的特征。在一些实施方案中,细胞表面抗原是多于一种类型的细胞的特征。
在一些实施方案中,CAR抗原结合结构域结合T细胞特征性细胞表面抗原。在一些实施方案中,T细胞特征性抗原可以是细胞表面受体、膜转运蛋白(例如,主动或被动转运蛋白,例如,离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或T细胞特征性细胞粘附蛋白。在一些实施方案中,T细胞特征性抗原可以是G蛋白偶联的受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶或组氨酸激酶相关受体。
在一些实施方案中,T细胞特征性抗原可以是T细胞受体。在一些实施方案中,T细胞受体可以是AKT1、AKT2、AKT3、ATF2、BCL10、CALM1、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD4、CD8、CD28、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD247(CD3ζ)、CTLA4(CD152)、ELK1、ERK1(MAPK3)、ERK2、FOS、FYN、GRAP2(GADS)、GRB2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HRAS、IKBKA(CHUK)、IKBKB、IKBKE、IKBKG(NEMO)、IL2、ITPR1、ITK、JUN、KRAS2、LAT、LCK、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K6(MKK6)、MAP2K7(MKK7)、MAP3K1(MEKK1)、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K8、MAP3K14(NIK)、MAPK8(JNK1)、MAPK9(JNK2)、MAPK10(JNK3)、MAPK11(p38β)、MAPK12(p38γ)、MAPK13(p38δ)、MAPK14(p38α)、NCK、NFAT1、NFAT2、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PIK3C2B、PIK3C3(VPS34)、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PKCA、PKCB、PKCM、PKCQ、PLCY1、PRF1(穿孔素)、PTEN、RAC1、RAF1、RELA、SDF1、SHP2、SLP76、SOS、SRC、TBK1、TCRA、TEC、TRAF6、VAV1、VAV2或ZAP70。
在一些实施方案中,CAR包含作为共刺激结构域的信号传导结构域。在一些实施方案中,CAR包含第二共刺激结构域。在一些实施方案中,CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中,CAR包含至少三个共刺激结构域。在一些实施方案中,CAR包含共刺激结构域,该共刺激结构域选自CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体中的一种或多种。
在一些实施方案中,所述CAR包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体。在一些实施方案中,CAR包含(i)CD3ζ结构域,或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM),或其功能变体;以及(ii)CD28结构域,或4-1BB结构域,或其功能变体。在一些实施方案中,所述CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体;(ii)CD28结构域或其功能变体;和(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在一些实施方案中,所述CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体;(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体,和/或(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在一些实施方案中,所述CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体;(ii)CD28结构域或其功能变体;(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体;和(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在某些实施方案中,所述细胞内信号传导结构域包含与CD3(例如CD3-ζ)细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中,胞内信号传导结构域包含与CD3ζ胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB、TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中,CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的胞内组分。
在一些实施方案中,胞内信号传导结构域包括4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域的胞内组分。在一些实施方案中,所述细胞内信号传导结构域包括CD28信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域的细胞内组分。
在一些实施方案中,所述CAR包含与抗原(例如肿瘤抗原)结合的细胞外抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段,诸如scFv)、间隔子(例如含有铰链结构域,诸如本文所述的任何一种)、跨膜结构域(例如本文所述的任何一种)和细胞内信号传导结构域(例如任何细胞内信号传导结构域,诸如本文所述的初级信号传导结构域或共刺激信号传导结构域)。在一些实施方案中,胞内信号传导结构域是或包括初级胞质信号传导结构域。在一些实施方案中,所述细胞内信号传导结构域另外包括共刺激分子的细胞内信号传导结构域(例如,共刺激结构域)。CAR的示例性组分的实例描述于表2中。在所提供的方面,CAR中的每个组分的序列可以包括表2中列出的任何组合。
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在一些实施方案中,所述CAR还包含一个或多个间隔子,例如,其中所述间隔子是抗原结合结构域与跨膜结构域之间的第一间隔子。在一些实施方案中,第一间隔区包括免疫球蛋白恒定区或其变体或修饰形式的至少一部分。在一些实施方案中,所述间隔子是跨膜结构域与信号传导结构域之间的第二间隔子。在一些实施方案中,所述第二间隔子是寡肽,例如,其中所述寡肽包含甘氨酸-丝氨酸双联体。
除了本文所述的CAR以外,多种嵌合抗原受体和编码其的核苷酸序列是本领域已知的,并且将适用于如本文所述的体内和体外的靶细胞的融合体递送和重编程。参见例如WO2013040557、WO2012079000、WO2016030414、Smith T等人,NatureNanotechnology.2017.DOI:10.1038/NNANO.2017.57,它们的公开内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中,将包含CAR或编码CAR的核酸(例如,DNA、gDNA、cDNA、RNA、pre-mRNA、mRNA、miRNA、siRNA等)的脂质颗粒递送至靶细胞。在一些实施方案中,所述靶细胞是效应细胞,例如表达一种或多种Fc受体并介导一种或多种效应子功能的免疫系统细胞。在一些实施方案中,所述靶细胞可以包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、自然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞(例如T细胞),γδT细胞、B淋巴细胞(例如B细胞)中的一种或多种,并且可以来自任何生物体,包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。
3.基因编辑剂(例如核酸酶)
在一些实施方案中,外源药剂与基因编辑技术相关。可以包括与基因编辑技术相关的多种药剂中的任一种作为外源药剂,诸如用于将基因编辑机器递送至细胞。在一些实施方案中,基因编辑技术可以包括涉及核酸酶、整合酶、转座酶、重组酶的系统。在一些实施方案中,基因编辑技术可用于基因的敲除或敲低。在一些实施方案中,基因编辑技术可用于将DNA敲入或整合到基因组的区域中。在一些实施方案中,外源药剂介导双链断裂(DSB),包括与非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)有关。在一些实施方案中,外源药剂不介导DSB。在一些实施方案中,外源药剂可用于基于DNA的编辑或引导编辑。在一些实施方案中,外源药剂可用于经由位点特异性靶向元件(PASTE)的可编程添加。
在一些实施方案中,外源药剂是用于基因编辑方法的核酸酶。在一些实施方案中,核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR相关蛋白核酸酶(Cas)。在一些实施方案中,Cas是来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9。在一些实施方案中,Cas是来自普雷沃菌属(Prevotella)或弗朗西斯菌属(Francisella)细菌的Cas12a(也称为cpf1)。在一些实施方案中,Cas是来自芽孢杆菌属(Bacillus)、任选的希氏芽孢杆菌(Bacillus hisashii)的Cas12b。
在一些实施方案中,核酸酶的递送是通过所提供的编码核酸酶的载体(例如Cas)进行的。
在一些实施方案中,所提供的病毒载体颗粒含有核酸酶蛋白,并且将该核酸酶蛋白直接递送至靶细胞。递送核酸酶蛋白的方法包括例如Cai等人Elife,2014,3:e01911和国际专利公开号WO2017068077中描述的方法。例如,所提供的病毒载体颗粒包含一种或多种Cas蛋白,诸如Cas9。在一些实施方案中,核酸酶蛋白(例如Cas,诸如Cas9)被工程化为与病毒结构蛋白(例如GAG)的嵌合核酸酶蛋白,用于包装到病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)中。例如,与结构GAG蛋白融合的嵌合Cas9蛋白可以包装在慢病毒载体颗粒内。在一些实施方案中,融合蛋白是(i)病毒结构蛋白(例如GAG)与(ii)核酸酶蛋白(例如Cas蛋白,诸如Cas 9)之间的可切割融合蛋白。
在一些实施方案中,Cas是野生型Cas9,其可以位点特异性地切割双链DNA,导致双链断裂(DSB)修复机制的激活。DSB可以通过细胞非同源末端连接(NHEJ)途径进行修复(Overballe-Petersen等人,2013,Proc Natl Acad Sci USA,第110卷:19860-19865),从而导致破坏靶基因座的插入和/或缺失(indel)。可替代地,如果提供了与靶基因座具有同源性的供体模板,则可以通过同源定向修复(HDR)途径来修复DSB,从而允许进行精确替换突变(Overballe-Petersen等人,2013,Proc Natl Acad Sci USA,Vol.110:19860-19865;Gong等人,2005,Nat.Struct Mol Biol,第12卷:304-312)。在一些实施方案中,Cas是突变形式,称为Cas9 D10A,仅具有切口酶活性。这意味着Cas9D10A仅切割一条DNA链,并且不激活NHEJ。相反,当提供同源修复模板时,DNA修复仅通过高保真HDR途径进行,从而导致indel突变减少(Cong等人,2013,Science,第339卷:819-823;Jinek等人,2012,Science,第337卷:816-821;Qi等人,2013Cell,第152卷:1173-1183)。当基因座被设计成生成相邻DNA切口的配对Cas9复合物靶向时,Cas9D10A在靶标特异性方面甚至更具吸引力(Ran等人,2013,Cell,第154卷:1380-1389)。在一些实施方案中,Cas是核酸酶缺陷型Cas9(Qi等人,2013Cell,第152卷:1173-1183)。例如,HNH结构域中的突变H840A和RuvC结构域中的突变D10A使切割活性失活,但不阻止DNA结合。因此,该变体可用于以序列特异性方式靶向基因组的任何区域而无需切割。相反,通过与各种效应结构域融合,dCas9可用作基因沉默或激活工具。此外,通过将向导RNA或Cas9蛋白与荧光团或荧光蛋白偶联,其可用作可视化工具。
在具体实施方案中,核酸酶是Cas核酸酶,诸如Cas9。在一些实施方案中,CRISPR/Cas的递送可用于经由单个gRNA在特定靶基因中引入单点突变(缺失或插入)。相反,使用一对gRNA引导的Cas9核酸酶,也有可能诱导大的缺失或基因组重排,诸如倒位或易位。在一些实施方案中,dCas9版本的CRISPR/Cas9系统可用于靶向蛋白质结构域以进行转录调节、表观遗传修饰和特定基因组基因座的显微镜可视化。
在一些实施方案中,所提供的含有Cas核酸酶(例如Cas9)的病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)还包含一种或多种CRISPR-cas系统向导RNA或进一步与其复合以靶向所需靶基因。在一些实施方案中,CRISPR向导RNA有效地包封在含有CAS的病毒颗粒中。在一些实施方案中,所提供的病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)还包含靶向核酸或进一步与靶向核酸复合。
在一些实施方案中,外源药剂是用于靶标引导逆转录(TPRT)或“引导编辑”的外源药剂。在一些实施方案中,引导编辑介导人细胞中的靶向插入、缺失、所有12种可能的碱基到碱基转化以及它们的组合,而不需要DSB或供体DNA模板。
引导编辑是一种基因组编辑方法,其使用与聚合酶联合工作的核酸可编程DNA结合蛋白(“napDNAbp”)(即,以融合蛋白的形式或以其他方式与napDNAbp反式提供)将新的遗传信息直接写入指定的DNA位点,其中引导编辑系统用引导编辑(PE)向导RNA(“PEgRNA”)编程,该引导编辑向导RNA既指定靶位点,又通过工程化到向导RNA上(例如,在向导RNA的5'或3'端处,或在向导RNA的内部部分处)的延伸(DNA或RNA)以替代DNA链的形式模板化所需编辑的合成。含有所需编辑(例如,单个核碱基取代)的替换链与待编辑的靶位点的内源链共享相同的序列(除了它包括所需编辑)。通过DNA修复和/或复制机制,靶位点的内源链被含有所需编辑的新合成的替换链替换。在一些情况下,引导编辑可被认为是一种“搜索和替换”基因组编辑技术,因为引导编辑器搜索并定位待编辑的所需靶位点,并编码含有所需编辑的替换链,该替换链被同时安装以替代相应的靶位点内源DNA链。例如,引导编辑可适用于进行基于CRISPR/Cas的精确基因组编辑以绕过双链断裂。在一些实施方案中,外源药剂是或编码Cas蛋白-逆转录酶融合体或相关系统,以用向导RNA靶向特定DNA序列,在靶位点处产生单链切口,并且使用切口DNA作为引物用于与向导RNA整合的工程化逆转录酶模板的逆转录。
在一些实施方案中,外源药剂是或编码引物编辑器,该引物编辑器是逆转录酶或本领域已知的任何DNA聚合酶。因此,在一个方面,引导编辑器可以包含Cas9(或等效的napDNAbp),其被编程为通过将DNA序列与含有与靶DNA中的互补原型间隔区退火的间隔区序列的特异性向导RNA(即,PEgRNA)相关联以靶向DNA序列。此类方法包括Anzalone等人(https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4),或PCT公开号WO2020191248、WO2021226558或WO2022067130中公开的那些,这些文献据此全文以引用方式并入。
在一些实施方案中,外源药剂用于经由位点特异性靶向元件的可编程添加(PASTE)。在一些方面,PASTE是其中通过与逆转录酶和丝氨酸整合酶两者融合的CRISPR-Cas9切口酶指导基因组插入的平台。如Ioannidi等人(doi:https://doi.org/10.1101/2021.11.01.466786)中所述,PASTE不产生双链断裂,但允许大至~36kb的序列整合。在一些实施方案中,丝氨酸整合酶可以是本领域已知的任一种。在一些实施方案中,丝氨酸整合酶具有足够的正交性,使得PASTE可用于多重基因整合,在至少两个基因组基因座处同时整合至少两种不同的基因。在一些实施方案中,PASTE具有与基于同源定向修复或非同源末端连接的整合相当或更好的编辑效率,在非分裂细胞中具有活性和较少的可检测的脱靶事件。在一些实施方案中,外源药剂与碱基编辑缔合。碱基编辑器(BE)通常是Cas(“CRISPR相关的”)结构域和核碱基修饰结构域(例如,天然或进化的脱氨酶,诸如包括APOBEC1(“载脂蛋白B mRNA编辑酶,催化多肽1”)、CDA(“胞苷脱氨酶”)和AID(“激活诱导的胞苷脱氨酶”)的胞苷脱氨酶)的融合体。在一些情况下,碱基编辑器还可以包括改变细胞DNA修复过程以提高所产生的单核苷酸变化的效率和/或稳定性的蛋白质或结构域。
在一些方面,目前可用的碱基编辑器包括转化靶标C的胞苷碱基编辑器(例如,BE4)。·G至T·A和转化靶标A的腺嘌呤碱基编辑(例如,ABE7.10)·T至G·C.在一些方面,Cas9靶向脱氨作用结合碱基编辑器(BE)系统首次得到证明,该碱基编辑器系统旨在诱导碱基变化而不引入双链DNA断裂。另外,与失活的Cas9(dCas9)融合的大鼠脱氨酶APOBEC1(rAPOBEC1)用于成功地将sgRNA的PAM上游的胞苷转化为胸苷。在一些方面,通过将dCas9改变为“切口酶”Cas9D10A来优化该第一BE系统,该切口酶在脱氨基胞苷相对的链上切口。在不受理论束缚的情况下,预期这引发长补丁碱基切除修复(BER),其中脱氨基链优先用于模板修复以产生U:A碱基对,然后在DNA复制期间将其转化为T:A。
在一些实施方案中,外源药剂是或编码碱基编辑器(例如,核碱基编辑器)。在一些实施方案中,外源药剂是核碱基编辑器,其含有催化失活的第一DNA结合蛋白结构域、具有碱基编辑活性的结构域和具有切口酶活性的第二DNA结合蛋白结构域,其中DNA结合蛋白结构域在单个融合蛋白上表达或单独表达(例如,在分开的表达载体上)。在一些实施方案中,碱基编辑器是融合蛋白,其包含具有碱基编辑活性的结构域(例如,胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶)和两个核酸可编程DNA结合蛋白结构域(napDNAbp),第一napDNAbp包含切口酶活性并且第二napDNAbp是催化失活的,其中至少两个napDNAbp通过接头连接。在一些实施方案中,碱基编辑器是融合蛋白,其包含具有切口酶活性(nCas;nCas9)的CRISPR-Cas(例如,Cas9)的DNA结构域、具有核酸可编程DNA结合活性(dCas;例如,dCas9)的CRISPR-Cas蛋白(例如,Cas9)的催化失活结构域以及脱氨酶结构域,其中dCas通过接头连接至nCas,并且dCas紧邻脱氨酶结构域。在一些实施方案中,碱基编辑器是腺嘌呤至胸腺嘧啶或“ATBE”(或胸腺嘧啶至腺嘌呤或“TABE”)颠换碱基编辑器。示例性碱基编辑器和碱基编辑器系统包括专利公开号US20220127622、US20210079366、US20200248169、US20210093667、US20210071163、WO2020181202、WO2021158921、WO2019126709、WO2020181178、WO2020181195、WO2020214842、WO2020181193中描述的任一种,这些专利据此全文以引用方式并入。
在一些实施方案中,外源药剂是或编码具有选自由以下组成的组的活性的一种或多种多肽:核酸酶活性(例如,可编程核酸酶活性);切口酶活性(例如,可编程切口酶活性);归巢活性(例如,可编程DNA结合活性);核酸聚合酶活性(例如,DNA聚合酶或RNA聚合酶活性);整合酶活性;重组酶活性;或碱基编辑活性(例如,胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶活性)。
4.小分子
在一些实施方案中,外源药剂包括小分子,例如离子(例如Ca2+、C1-、Fe2+)、碳水化合物、脂质、活性氧物质、活性氮物质、类异戊二烯、信号传导分子、血红素、多肽辅因子、电子接受化合物、电子供给化合物、代谢物、配体以及它们的任何组合。在一些实施方案中,所述小分子是与细胞中的靶标相互作用的药物。在一些实施方案中,所述小分子靶向细胞中的蛋白质用于降解。在一些实施方案中,所述小分子靶向细胞中的蛋白质以通过将蛋白质定位到蛋白酶体而降解。在一些实施方案中,所述小分子是蛋白水解靶向嵌合体分子(PROTAC)。
在一些实施方案中,所述外源剂包括蛋白质、核酸或代谢物的混合物,例如多种多肽、多种核酸、多种小分子;核酸、多肽和小分子的组合;核糖核蛋白复合物(例如Cas9-gRNA复合物);多种转录因子、多种表观遗传因子、重编程因子(例如Oct4、Sox2、cMyc和Klf4);多种调节RNA;以及它们的任何组合。
D.示例性特征
在一些实施方案中,与参考颗粒相比,截短的BaEV包膜糖蛋白在颗粒表面上具有增加或更高的表达,但含有缺乏R肽的所有氨基酸残基的BaEV(例如SEQ ID NO:24中所示的BaEV)。在一些实施方案中,与含有缺乏R肽的所有氨基酸残基的BaEV(例如SEQ ID NO:24中所示的BaEV)的参考颗粒相比,表达增加5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、200%、300%、400%、500%或更多。在一些实施方案中,与含有缺乏R肽的所有氨基酸残基的BaEV(例如SEQ ID NO:24中所示的BaEV)的参考颗粒相比,表达增加1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多,优选等于或约或大于10倍或更多。在一些实施方案中,可以使用流式细胞术(例如FAC)在体外测定表达。在一些实施方案中,表达可以描述为脂质颗粒表面上BaEV包膜糖蛋白(例如截短的BaEV包膜糖蛋白)的数量或密度。在一些实施方案中,表达可以描述为脂质颗粒表面上截短的BaEV包膜糖蛋白(例如截短的BaEV包膜糖蛋白)的表面表达的平均荧光强度(MFI)。在一些实施方案中,表达可以描述为在对BaEV包膜糖蛋白(例如截短的BaEV包膜糖蛋白)呈表面阳性的群体中脂质颗粒(例如慢病毒载体)的百分比。
在一些实施方案中,在脂质颗粒(例如慢病毒载体)群体中,大于50%或大于约50%的脂质颗粒对截短的BaEV包膜糖蛋白呈表面阳性。例如,在所提供的脂质颗粒(例如慢病毒载体)群体中,群体中大于55%或大于约55%、大于60%或大于约60%、大于65%或大于约65%、大于70%或大于约70%、大于75%或大于约75%的细胞对截短的BaEV包膜糖蛋白呈表面阳性。
在一些实施方案中,与引入缺乏R肽的所有氨基酸残基的BaEV(例如SEQ ID NO:24中所示的BaEV)的参考脂质颗粒(例如参考慢病毒载体)的相同靶细胞中的滴度相比,在诸如通过转导(例如转导细胞)引入靶细胞中后,脂质颗粒的滴度增加。在一些实例中,与参考脂质颗粒(例如参考慢病毒载体),例如含有缺乏R肽的所有氨基酸残基的BaEV的参考脂质颗粒(例如SEQ ID NO:24中所示的BaEV)的滴度相比,滴度增加等于或大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多。在一些任何实施方案中,转导后在靶细胞中的滴度等于或大于1×106个转导单位(TU)/mL、等于或大于2×106TU/mL、等于或大于3×106TU/mL、等于或大于4×106TU/mL、等于或大于5×106TU/mL、等于或大于6×106TU/mL、等于或大于7×106TU/mL、等于或大于8×106TU/mL、等于或大于9×106TU/mL、或等于或大于1×107TU/mL。
在具体实施方案中的一些中,截短的BaEV包膜糖蛋白以至少约(0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2或0.5)个截短的BaEV包膜糖蛋白/nm2的密度存在于颗粒的表面上。
在一些实施方案中,与非靶细胞相比,所提供的脂质颗粒优先靶向靶细胞。在一些实施方案中,所提供的脂质颗粒在内腔或空腔内含有外源药剂,并且与非靶细胞相比,此类脂质颗粒表现出外源药剂向靶细胞的优先递送。
如本文所用,“靶细胞”是指被含有BaEV包膜糖蛋白的脂质颗粒特异性靶向的类型的细胞。在实施方案中,靶细胞是造血细胞,诸如对于CD34呈表面阳性的细胞(CD34+细胞)。
如本文所用,“非靶细胞”是指不需要靶向脂质颗粒(例如用于递送外源药剂)的类型的细胞。在一些实施方案中,非靶细胞是非造血细胞。在一些实施方案中,非靶细胞是对于CD34呈表面阴性的细胞(CD34-细胞)。
在一些实施方案中,含有截短的BaEV包膜糖蛋白的脂质颗粒(诸如BaEV糖蛋白假型慢病毒颗粒)能够离体靶向细胞。在一些实施方案中,含有截短的BaEV包膜糖蛋白的脂质颗粒(诸如BaEV糖蛋白假型慢病毒颗粒)能够体内靶向细胞。在一些实施方案中,含有截短的BaEV包膜糖蛋白的脂质颗粒(诸如BaEV糖蛋白假型慢病毒颗粒)能够在动员后体内靶向细胞。
在一些实施方案中,截短的BaEV包膜糖蛋白表现出与VSV-G相似的向性和细胞靶向性。因此,在一些实施方案中,含有截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的脂质颗粒(诸如BaEV糖蛋白假型慢病毒颗粒)可用于代替VSV-G。
在一些实施方案中,靶细胞对ASCT1和/或ASCT2的细胞表面表达呈阳性。
在一些实施方案中,靶细胞是造血谱系细胞。提及的“造血细胞”包括来自骨髓和淋巴谱系的血细胞。具体地,术语“造血细胞”包括未分化或分化不良的细胞诸如造血干细胞和祖细胞,以及分化细胞诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞或树突细胞。在一些实施方案中,造血细胞是造血干细胞、CD34+祖细胞(特别是外周血CD34+细胞、极早期祖CD34+细胞)、B细胞CD19+祖细胞、骨髓祖CD13+细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞、癌症B细胞(特别是B细胞慢性淋巴细胞性白血病(BCLL)细胞和边缘区淋巴瘤(MZL)B细胞),以及胸腺细胞。
如本领域技术人员所知,许多造血细胞由骨髓造血干细胞产生。
在一些实施方案中,造血细胞是造血干细胞(HSC),其是能够补充所有血细胞类型并自我更新的细胞。造血干细胞可以具体定义为当注射到造血系统耗尽的受体小鼠的循环中时,将骨髓细胞、T细胞和B细胞的水平保持在稳定可检测的水平(通常多于1%的外周血细胞)达16周的细胞(Schroeder(2010)Cell Stem Cell 6:203-207)。
在一些实施方案中,造血细胞是“CD34+祖细胞”,其是异质细胞群体,包括HSC、多能干细胞和处于谱系定型早期的细胞的亚群。在正常成年动物中,CD34+祖细胞不断地迁移到骨髓和从骨髓中迁移出来。它们可以分化产生在循环中发现的所有造血细胞谱系。在一些实施方案中,造血细胞是极早期祖CD34+细胞,它是从HSC富集的CD34+祖细胞的亚群。
在一些实施方案中,造血细胞包括“外周血CD34+细胞”,其是血液中存在的CD34+细胞。
在一些实施方案中,造血细胞是B细胞CD19+祖细胞,其是表达细胞表面CD10、CD34和CD19的B谱系细胞群体。
在一些实施方案中,造血细胞是骨髓祖CD13+细胞,它是表达细胞表面CD34和CD34并且在一些情况下还表达CD33的骨髓谱系细胞群体。
在一些实施方案中,细胞选自由以下组成的组:骨髓-淋巴平衡的造血谱系细胞、骨髓偏向性造血谱系细胞、淋巴偏向性造血谱系细胞、血小板偏向性造血谱系细胞、血小板-骨髓偏向性造血谱系细胞、长期再增殖的造血谱系细胞、中期再增殖的造血谱系细胞或短期再增殖的造血谱系细胞。在一些实施方案中,细胞选自单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞和血小板。在一些实施方案中,细胞选自T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和先天淋巴样细胞。
在一些实施方案中,造血细胞是T细胞。在一些实施方案中,T细胞是幼稚T细胞。在一些实施方案中,T细胞是记忆T细胞。
在一些实施方案中,造血细胞是B细胞。在一些实施方案中,靶细胞是静息B细胞,诸如幼稚B细胞或记忆B细胞。在一些实施方案中,靶细胞是癌症B细胞,诸如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(BCLL)细胞或边缘区淋巴瘤(MZL)B细胞。
在一些实施方案中,靶细胞是胸腺细胞。在一些实施方案中,靶细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中,胸腺细胞表达CD4或CD8。在一些实施方案中,胸腺细胞不表达CD4或CD8。在一些实施方案中,自然杀伤(NK)细胞是表达CD56的细胞。
IV.药物组合物和制备方法
还提供了含有本文的脂质颗粒的组合物以及制剂,所述脂质颗粒含有截短的BaEV包膜糖蛋白或编码截短的BaEV包膜糖蛋白的多核苷酸,所述组合物包括药物组合物。药物组合物可以包括任何所描述的含有截短的BaEV的脂质颗粒。
在一些方面,本公开还提供了包含本文所述的组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
术语“药物制剂”是指以允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式的配制物,并且其不含有对将施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。
“药学上可接受的载体”是指对受试者无毒的药物制剂中活性成分以外的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面,载体的选择部分地由特定脂质颗粒和/或由施用方法决定。因此,存在多种合适的制剂。例如,药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵(benzalkonium chloride)。在一些方面,使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量计约0.0001%至约2%的量存在。载体例如由Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)描述。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒,并且包括但不限于:缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵;六甲双铵氯化物;苯扎氯铵;苄索氯铵;苯酚、丁醇或苯甲醇;对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;以及间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖,诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐抗衡离子,诸如钠;金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物);和/或非离子表面活性剂,诸如聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中,脂质颗粒符合药物或药品生产质量管理规范(GMP)标准。在一些实施方案中,脂质颗粒根据药品生产质量管理规范(GMP)制备。在一些实施方案中,脂质颗粒具有低于预定参考值的病原体水平,例如基本上不含病原体。在一些实施方案中,脂质颗粒具有低于预定参考值的污染物水平,例如基本上不含污染物。在一些实施方案中,脂质颗粒具有低免疫原性。
在一些实施方案中,本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知或此后开发的任何方法来制备。在一些实施方案中,制备方法包括以下步骤:使活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分缔合,然后如果有必要或需要,使产品成形或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
在一些实施方案中,“单位剂量”是包含预定量的活性成分的离散量的药物组合物。在一些实施方案中,活性成分的量通常等于将向受试者施用的活性成分的剂量或这种剂量的方便部分(例如这种剂量的二分之一或三分之一)。在一些实施方案中,单位剂型可以用于单个日剂量或多个日剂量之一(例如,每天约1至4次或更多次)。在一些实施方案中,当使用多个日剂量时,单位剂型对于每个剂量可以是相同的或不同的。
在一些实施方案中,含有截短的BaEV包膜糖蛋白的脂质颗粒是病毒载体或病毒样颗粒(例如,第II节)。在一些实施方案中,本文提供的组合物可以基因组拷贝(GC)的剂量单位调配。测定GC的合适方法已有描述,并且包括例如qPCR或数字液滴PCR(ddPCR),如例如M.Lock等人,Hu Gene Therapy Methods,Hum Gene Ther Methods25(2):115-25.2014所描述,其通过引用并入本文。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约104至约1010GC单位,包括端点值。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约109至约1015GC单位,包括端点值。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约105至约109GC单位,包括端点值。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约106至约109GC单位,包括端点值。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约1012至约1014GC单位,包括端点值。在一些实施方案中,施用剂量为1.0×109GC单位、5.0×109GC单位、1.0×1010GC单位、5.0×1010GC单位、1.0×1011GC单位、5.0×1011GC单位、1.0×1012GC单位、5.0×1012GC单位、1.0×1013GC单位、5.0×1013GC单位、1.0×1014GC单位、5.0×1014GC单位或1.0×1015GC单位。
在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约104至约1010感染单位,包括端点值。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约109至约1015感染单位,包括端点值。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约105至约109感染单位。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约106至约109感染单位。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约1012至约1014感染单位,包括端点值。在一些实施方案中,施用剂量为1.0×109感染单位、5.0×109感染单位、1.0×1010感染单位、5.0×1010感染单位、1.0×1011感染单位、5.0×1011感染单位、1.0×1012感染单位、5.0×1012感染单位,或1.0×1013感染单位、5.0×1013感染单位、1.0×1014感染单位、5.0×1014感染单位或1.0×1015感染单位。可用于量化感染单位的技术是本领域的常规技术,并且包括病毒颗粒数测定、荧光显微镜和噬斑滴度测定。例如,腺病毒颗粒的数量可以通过测量A260的吸光度来确定。类似地,感染单位也可以通过使用单克隆抗体的载体特异性蛋白质的定量免疫荧光或通过噬斑测定来确定。
在一些实施方案中,计算感染单位的方法包括噬斑测定,其中病毒的滴定在细胞单层上进行,并且在几天至几周后计数噬斑的数量。例如,确定感染滴度,诸如通过噬斑测定,例如评估细胞病变效应(CPE)的测定。在一些实施方案中,通过在覆盖有琼脂糖的单层细胞(诸如HFF细胞)上连续稀释病毒来进行CPE测定。在孵育一段时间以实现细胞病变效应,诸如约3至28天,通常7至10天后,可固定细胞,并且确定显现为噬斑的缺失细胞的病灶。在一些实施方案中,可以使用终点稀释(TCID50)方法确定感染单位,所述方法确定50%细胞培养物被感染时的病毒稀释度,并且因此,通常可以确定一定范围内的滴度,诸如一个对数。
在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约104至约1010噬斑形成单位(pfu),包括端点值。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约109至约1015pfu,包括端点值。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约105至约109pfu。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约106至约109pfu。在一些实施方案中,病毒载体或病毒样颗粒的施用剂量为约1012至约1014pfu,包括端点值。在一些实施方案中,施用剂量为1.0×109pfu、5.0×109pfu、1.0×1010pfu、5.0×1010pfu、1.0×1011pfu、5.0×1011pfu、1.0×1012pfu、5.0×1012pfu,或1.0×1013pfu、5.0×1013pfu、1.0×1014pfu、5.0×1014pfu或1.0×1015pfu。
在一些实施方案中,受试者将接受单次注射。在一些实施方案中,可以每天/每周/每月的间隔重复施用,持续不确定的时间和/或直到已经确定治疗的功效。如本文所述,治疗功效可以通过评估本文所述的症状和临床参数和/或通过检测所需反应来确定。
所需的载体提供的脂质颗粒的确切量将因受试者而异,取决于受试者的物种、年龄、体重和一般状况、所使用的具体多核酸、多肽或载体、其施用模式等。本领域普通技术人员仅使用本文给出的教导的常规实验就可确定适当的量。
在一些实施方案中,组合物以无菌液体配制物的形式提供,例如等渗水溶液、混悬液、乳液、分散体或粘性组合物,其在一些方面可以被缓冲至选定的pH。液体配制物通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外,液体组合物更便于施用,尤其是通过注射施用。另一方面,粘性组合物可以在合适的粘度范围内调配,以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体,其可以是含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)以及它们的合适混合物的溶剂或分散介质。
无菌注射溶液可以通过将脂质颗粒掺入溶剂中来制备,诸如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物也可以冻干。取决于施用途径和所需的配制物,组合物可以含有辅助物质,诸如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等。在一些方面,可以参考标准文本来制备合适的配制物。
可注射剂可以制备成常规形式(液体溶液或悬浮液),适于在注射前溶解在液体中的混悬液的固体形式,或乳剂。如本文所用,“肠胃外施用”包括皮内、鼻内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内和气管内途径,以及缓释或持续释放系统,使得维持恒定的剂量。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂,包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保防止微生物作用。可通过使用延迟吸收剂,例如单硬脂酸铝和明胶,使可注射药物形式的吸收延长。
可以制备缓释配制物。缓释配制物的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质,该基质是成形制品的形式,例如膜或微胶囊。
在一些实施方案中,媒介物制剂可以包含冷冻保护剂。如本文所用,术语“防冻剂”是指一种或多种剂,当与给定物质结合时,有助于减少或消除冷冻时对所述物质的损害。在一些实施方案中,冷冻保护剂与载体媒介物组合以在冷冻期间稳定它们。在一些方面,在-20℃和-80℃之间冷冻储存RNA可能有利于多核苷酸的长期(例如36个月)稳定性。在一些实施方案中,RNA种类是mRNA。在一些实施方案中,冷冻保护剂包含在载体制剂中以通过冷冻/解冻循环和在冷冻储存条件下稳定多核苷酸。所提供的实施方案的冷冻保护剂可以包括但不限于蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油、右旋糖、棉子糖和/或甘露醇。海藻糖被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration)列为一般认为安全的物质(GRAS)并常用于商业药物制剂中。
将用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以容易地实现,例如通过无菌过滤膜过滤。
V.使用方法和治疗应用
在一些实施方案中,本文提供的含有截短的BaEV包膜糖蛋白的脂质颗粒(例如慢病毒颗粒)用于将外源药剂递送至靶细胞。外源药剂可以是蛋白质、核酸(诸如DNA或RNA(例如mRNA))或小分子。描述了可以包含在本文的非细胞颗粒中用于递送的示例性外源药剂。本文提供的方法包括将外源药剂递送至靶细胞的方法。在一些实施方案中,外源试剂是完全异源的或不由靶细胞产生或正常表达的试剂。
在一些实施方案中,递送是通过将所提供的慢病毒载体颗粒转导至靶细胞中。因此,本文还提供了用所提供的用截短的BaEV包膜糖蛋白假型化的慢病毒载体颗粒转导靶细胞的方法。包括使造血细胞与如上定义的假型病毒载体颗粒在实现假型化病毒载体颗粒转导造血细胞的条件下接触。在一些实施方案中,用病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)转导最初在结合至靶细胞后将生物材料递送至靶细胞的膜或细胞质。递送后,生物材料可以转移到细胞的其他区室。在一些实施方案中,转导介导由颗粒表达的外源基因整合至细胞基因组中。实现靶向细胞转导的条件是本领域技术人员熟知的,并且通常包括温育待转导的细胞,诸如通过在烧瓶、板或培养皿中培养,并且在一些情况下在转导佐剂(例如重组人纤粘连蛋白)的存在下培养。在一些实施方案中,靶细胞可以被预刺激或活化,诸如用细胞因子混合物或用于刺激或活化靶细胞的其他刺激剂。在一些实施方案中,病毒载体颗粒与靶细胞以1、5、10或100或任何前述之间的任何值的MOI温育。在一些实施方案中,温育在无血清培养基中进行。
在一些实施方案中,靶细胞是造血细胞。在一些实施方案中,造血细胞是血细胞,诸如来自骨髓或淋巴谱系的血细胞。具体地,造血细胞可以是未分化或分化不良的细胞,诸如造血干细胞和祖细胞,或分化细胞诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞或树突细胞。在一些实施方案中,造血细胞选自由以下组成的组:造血干细胞、CD34+祖细胞(特别是外周血CD34+细胞、极早期祖CD34+细胞)、B细胞CD19+祖细胞、骨髓祖CD13+细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞、癌症B细胞(特别是B细胞慢性淋巴细胞性白血病(BCLL)细胞和边缘区淋巴瘤(MZL)B细胞),以及胸腺细胞。
在一些实施方案中,靶细胞是造血干细胞(HSC)。HSC是补充所有血细胞类型并自我更新的干细胞。造血干细胞可以具体定义为当注射到造血系统耗尽的受体小鼠的循环中时,将骨髓细胞、T细胞和B细胞的水平保持在稳定可检测的水平(通常多于1%的外周血细胞)达16周的细胞(Schroeder(2010)Cell Stem Cell 6:203-207)。
在一些实施方案中,靶细胞是CD34+祖细胞。在一些方面,CD34+祖细胞是异质细胞群体,其包括HSC、多能干细胞和处于谱系定型早期的细胞的亚群。在正常成年动物中,CD34+祖细胞不断地迁移到骨髓和从骨髓中迁移出来。它们可以分化产生在循环中发现的所有造血细胞谱系。
在一些实施方案中,所述靶细胞是T细胞。在一些实施方案中,T细胞是静息或静止T细胞。在一些实施方案中,T细胞是幼稚或记忆T细胞。在一些实施方案中,在递送脂质颗粒之前,包括在用所提供的慢病毒载体颗粒转导之前,T细胞未被活化。因此,在所提供的方法的方面,T细胞在用所提供的截短的BaEV包膜糖蛋白假型化、病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)转导之前,不被T细胞刺激剂(诸如抗CD3/抗CD28抗体试剂(例如Dynabead))活化。T细胞可以是CD4+T细胞或CD8+T细胞或其亚群。
在一些实施方案中,靶细胞是B细胞。在一些实施方案中,B细胞是静息B细胞,诸如幼稚记忆B细胞。在一些实施方案中,B细胞可以是癌症B细胞,诸如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(BCLL)细胞或边缘区淋巴瘤(MZL)B细胞。
在一些实施方案中,将外源试剂递送至靶细胞可以提供治疗受试者疾病或病症的治疗效果。治疗效果可以通过靶向、调节或改变存在的或由靶细胞表达的抗原或蛋白来实现,该靶细胞与疾病或病症相关或涉及疾病或病症。治疗效果可以通过提供外源试剂来实现,其中外源药剂是靶细胞中不存在的、突变的或比野生型水平低的蛋白质(或编码该蛋白质的核酸,例如,编码该蛋白质的mRNA)。在一些实施方案中,靶细胞来自患有遗传疾病,例如单基因疾病,例如单基因胞内蛋白质疾病的受试者。
在一些实施方案中,靶细胞来自患有造血疾病或病症的受试者。在一些实施方案中,造血障碍可能是由于血液疾病,特别是涉及造血细胞的疾病。在一些实施方案中,造血障碍是单基因造血疾病,诸如由于单个基因的突变。在一些实施方案中,造血障碍是脊髓发育不良、再生障碍性贫血、范可尼贫血、阵发性夜间血红蛋白尿、镰状细胞病、戴-布二氏贫血、沙赫曼戴蒙氏病、科斯特曼综合征、慢性肉芽肿病、肾上腺脑白质营养不良、白细胞粘附缺陷、血友病、地中海贫血、β-地中海贫血、白血病诸如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性(髓样)白血病(AML)、成人淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、幼年型慢性髓性白血病(CML)和幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、严重联合免疫缺陷病(SCID)、X连锁严重联合免疫缺陷病、Wiskott-Aldrich综合征(WAS)、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、慢性肉芽肿性疾病、Chediak-Higashi综合征、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或AIDS。
在一些实施方案中,靶细胞来自患有自身免疫性疾病的受试者。在一些实施方案中,自身免疫性疾病是急性播散性脑脊髓炎、急性出血性白质炎、阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、斑秃、肌萎缩侧索硬化症、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、特应性过敏、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴增殖综合征、自身免疫性周围神经病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌综合征、自身免疫性黄体酮皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、Balo病、Balo同心硬化症、Bechets综合症、伯杰病、比克斯塔夫脑炎、布劳综合征、大疱性类天疱疮、癌症、卡斯尔曼病、乳糜泻、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性复发性多灶性骨髓炎、Churg-Strauss综合征、疤痕性类天疱疮、Cogan综合征、冷凝集素病、补体成分2缺乏症、颅动脉炎、CREST综合征、克罗恩病、库欣综合征、皮肤白细胞破碎性血管炎、德戈病、德库姆病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化症、德雷斯勒综合征、盘状红斑狼疮、湿疹、附着点炎相关性关节炎、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性胃肠炎、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、原发性混合性冷球蛋白血症、埃文氏综合征、进行性骨化纤维发育不良、纤维化肺泡炎、胃炎、胃肠道类天疱疮、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征、格雷夫氏病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本脑炎、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性炎性脱髓鞘病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、包涵体肌炎、炎性脱髓鞘多发性神经病、间质性膀胱炎、幼年特发性关节炎、幼年类风湿性关节炎、川崎病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、线性IgA病(LAD)、卢伽雷氏病、狼疮性肝炎、红斑狼疮、马吉德综合征、梅尼埃病、显微镜下多血管炎、米勒-费雪综合征、混合结缔组织病、硬斑病、穆哈-哈伯曼病、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、视神经鞘炎、神经性肌强直、眼部瘢痕性类天疱疮、眼阵挛性肌阵挛综合征、甲状腺炎、回文性风湿病、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、ParryRomberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、扁平部炎、天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、静脉周围脑脊髓炎、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎性神经病、银屑病、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍性贫血、拉斯穆森脑炎、雷诺现象、复发性多软骨炎、赖特综合征、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、类风湿性关节炎、类风湿热、结节病、施密特综合征、施尼茨勒综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、脊椎关节病、斯提耳氏病、僵硬人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、苏萨克氏综合征、Sweet综合征、Sydenham舞蹈病、交感性眼炎、Takayasu动脉炎、颞动脉炎、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、未分化脊柱关节病、血管炎、白癜风或韦格纳肉芽肿病。
在一些实施方案中,靶细胞来自患有癌症的受试者。在一些实施方案中,癌症是白血病。在一些实施方案中,白血病是B-CLL、CML或基于T细胞的白血病诸如ALT。在一些实施方案中,癌症是黑素瘤。
在一些实施方案中,靶细胞来自患有中枢神经系统脱髓鞘疾病的受试者。
本文所述的脂质颗粒(例如慢病毒载体)或含有其的药物组合物可以施用于受试者,例如哺乳动物,例如人。在此类实施方案中,受试者可能有风险患上特定疾病或病症(例如,本文所述的疾病或病症),可能具有特定疾病或病症(例如,本文所述的疾病或病症)的症状,或可能被诊断或鉴定为患有特定疾病或病症(例如,本文所述的疾病或病症)。在一些实施方案中,疾病或病况可以是通过将包含在所施用的脂质颗粒中的外源试剂递送至受试者的靶细胞而治疗的疾病或病症。
在一些实施方案中,在某些方面,本公开提供了向受试者(例如,人类受试者)施用脂质颗粒组合物的方法,包括向受试者施用所提供的包含多个本文所述的脂质颗粒的脂质颗粒组合物,从而将脂质颗粒组合物施用于受试者。
在一些实施方案中,在某些方面,本公开提供了将脂质颗粒组合物递送至靶细胞的方法,包括使靶细胞与所提供的包含本文所述的多个脂质颗粒的脂质颗粒组合物接触,从而将脂质颗粒组合物递送至靶细胞。在一些实施方案中,通过向受试者施用所提供的脂质颗粒来进行接触,其中脂质颗粒被递送至受试者中存在的靶细胞。
在一些实施方案中,在某些方面,本公开提供了将外源药剂例如治疗剂(例如,多肽、核酸、代谢物、细胞器或亚细胞结构)递送至受试者或细胞的方法,包括向受试者施用本文所述的多个脂质颗粒或本文所述的药物组合物,其中脂质颗粒组合物以使得治疗剂被递送的量和/或时间施用。可以包含在本文的脂质颗粒中用于递送至受试者的示例性外源药剂描述于第III.D节中。
在一些实施方案中,在某些方面,本公开提供了将外源药剂例如治疗剂(例如,多肽、核酸、代谢物、细胞器或亚细胞结构)递送至靶细胞的方法,包括使靶细胞与本文所述的多个脂质颗粒或本文所述的药物组合物接触,其中脂质颗粒组合物在使得治疗剂被递送的条件下与靶细胞接触。可以包含在本文的脂质颗粒中用于递送至受试者的示例性外源药剂描述于第III.D节中。在一些实施方案中,通过向受试者施用所提供的脂质颗粒来进行接触,其中包含在脂质颗粒中的治疗剂(例如外源药剂)被递送至受试者中存在的靶细胞。
在一些实施方案中,通过施用本文所述的脂质颗粒组合物来递送外源药剂可以改变细胞蛋白质表达水平。在某些实施方案中,施用的组合物指导一种或多种外源药剂货物(例如,多肽或mRNA)的上调(通过在细胞中表达、在细胞中递送或在细胞内诱导),该一种或多种外源药剂货物提供在递送多肽的细胞中基本上不存在或降低的功能活性。在一些实施方案中,缺失的功能活性本质上可以是酶活性、结构活性或调节活性。在一些实施方案中,所施用的组合物指导一种或多种多肽的上调,其(例如协同地)增加在多肽被上调的细胞中存在但基本上缺乏的功能活性。在任何实施方案中的一些中,所施用的组合物指导一种或多种运载物(例如多肽、siRNA或miRNA)的下调(通过在细胞中表达、在细胞中递送或在细胞内诱导),该一种或多种运载物抑制在递送多肽、siRNA或miRNA的细胞中存在或上调的功能活性。在任何实施方案中的一些中,上调的功能活性本质上可以是酶活性、结构活性或调节活性。在一些实施方案中,所施用的组合物指导一种或多种多肽的下调,其(例如协同地)降低在多肽被下调的细胞中存在或被上调的功能活性。在一些实施方案中,所施用的组合物指导某些功能活性的上调和其他功能活性的下调。
在任何实施方案中的一些中,脂质颗粒组合物(例如,包含线粒体或DNA的脂质颗粒组合物)介导对靶细胞的作用,并且该作用持续至少1、2、3、4、5、6或7天、2、3或4周或1、2、3、6或12个月。在一些实施方案中(例如,其中脂质颗粒组合物包含外源蛋白质),该作用持续少于1、2、3、4、5、6或7天、2、3或4周、或1、2、3、6或12个月。
在一些实施方案中,脂质颗粒还包含第二外源药剂,或者该方法还包括递送第二外源药剂,该第二外源药剂包含或编码结合细胞表面受体的第二细胞表面配体或抗体,并且任选地还包含或编码一种或多种结合细胞表面受体的另外的细胞表面配体或抗体(例如,1、2、3、4、5、10、20、50或更多种)。在一些实施方案中,第一外源药剂和第二外源药剂形成复合物,其中任选地,复合物还包含一种或多种另外的细胞表面配体。在一些实施方案中,外源药剂包含或编码细胞表面受体,例如外源细胞表面受体。在一些实施方案中,脂质颗粒还包含第二外源药剂,或者该方法还包括递送第二外源药剂,该第二外源药剂包含或编码第二细胞表面受体,并且任选地还包含或编码一种或多种另外的细胞表面受体(例如,1、2、3、4、5、10、20、50或更多种细胞表面受体)。
在一些实施方案中,脂质颗粒能够将一种或多种细胞表面受体递送(例如,递送)至靶细胞(例如,免疫细胞)。类似地,在一些实施方案中,本文的方法包括将一种或多种细胞表面受体递送至靶细胞。在一些实施方案中,第一外源药剂和第二外源药剂形成复合物,其中任选地,复合物还包含一种或多种另外的细胞表面受体。在一些实施方案中,外源药剂包含或编码抗原或抗原呈递蛋白。
在一些实施方案中,脂质颗粒能够引起(例如,引起)靶细胞分泌蛋白质,例如治疗性蛋白质。在一些实施方案中,脂质颗粒能够例如通过在允许靶细胞产生和分泌蛋白质的条件下将编码蛋白质的核酸(例如,mRNA)递送至靶细胞来将分泌的外源药剂(例如,分泌的蛋白质)递送(例如,递送)至靶位点(例如,胞外区)。类似地,在一些实施方案中,本文的方法包括递送如本文所述的分泌的外源药剂。在实施方案中,分泌的蛋白质包含蛋白质治疗剂,例如抗体分子、细胞因子或酶。在实施方案中,分泌的蛋白质包含自分泌信号传导分子或旁分泌信号传导分子。在实施方案中,分泌的外源药剂包含分泌颗粒。
在一些实施方案中,脂质颗粒能够分泌(例如,分泌)外源药剂,例如蛋白质。在一些实施方案中,将外源药剂(例如分泌的药剂)递送至受试者体内的靶位点。在一些实施方案中,外源药剂是不能重组制备或难以重组制备的蛋白质。在一些实施方案中,分泌的蛋白质的脂质颗粒来自选自MSC或软骨细胞的源细胞。
在一些实施方案中,脂质颗粒能够例如通过递送选自转录因子、编码转录因子的核酸、mRNA的一种外源药剂或多种所述外源药剂来重编程(例如,重编程)靶细胞(例如,免疫细胞)。类似地,在一些实施方案中,本文的方法包括重编程靶细胞。在实施方案中,重编程包括诱导耗尽的T细胞呈现未耗尽的T细胞例如杀伤T细胞的一种或多种特征。在一些实施方案中,外源药剂包含抗原。在一些实施方案中,脂质颗粒包含含有抗原的第一外源药剂和含有抗原呈递蛋白的第二外源药剂。
在一些实施方案中,脂质颗粒能够例如通过递送外源药剂(蛋白质或核酸)或编码外源药剂的核酸来修饰(例如,修饰)靶肿瘤细胞。类似地,在一些实施方案中,本文的方法包括修饰靶肿瘤细胞。在实施方案中,脂质颗粒递送编码免疫刺激配体、抗原呈递蛋白、肿瘤抑制蛋白或促凋亡蛋白的mRNA。在一些实施方案中,脂质颗粒递送能够降低靶细胞中免疫抑制配体、促有丝分裂信号或生长因子的水平的miRNA。
在一些实施方案中,脂质颗粒递送免疫调节性(例如,免疫刺激性)的外源药剂。
在一些实施方案中,脂质颗粒能够例如通过递送包含抗原或编码抗原的核酸的外源药剂而引起(例如,引起)靶细胞呈递抗原。类似地,在一些实施方案中,本文的方法包括在靶细胞上呈递抗原。在一些实施方案中,脂质颗粒促进靶组织中的再生。类似地,在一些实施方案中,本文的方法包括促进靶组织中的再生。
在一些实施方案中,脂质颗粒能够将核酸递送(例如,递送)至靶细胞,例如以稳定地修饰靶细胞的基因组,例如用于基因治疗。类似地,在一些实施方案中,本文的方法包括将核酸递送至靶细胞。在一些实施方案中,靶细胞具有酶缺陷,例如,包含导致酶活性降低(例如,无活性)的酶突变。
在一些实施方案中,脂质颗粒能够递送(例如,递送)介导对靶细胞中的DNA的序列特异性修饰的药剂(例如,Cas9、ZFN或TALEN)。类似地,在一些实施方案中,本文的方法包括将药剂递送至靶细胞。在实施方案中,靶细胞是CNS细胞。
在一些实施方案中,脂质颗粒能够将核酸递送(例如,递送)至靶细胞,例如以瞬时修饰靶细胞中的基因表达。
在一些实施方案中,脂质颗粒能够将蛋白质递送(例如,递送)至靶细胞,例如以瞬时挽救蛋白质缺陷。类似地,在一些实施方案中,本文的方法包括将蛋白质递送至靶细胞。在实施方案中,蛋白质是膜蛋白(例如,膜转运蛋白)、胞质蛋白(例如,酶)或分泌蛋白(例如,免疫抑制蛋白)。
在一些实施方案中,脂质颗粒能够进行细胞内分子递送,例如将蛋白质外源药剂递送至靶细胞。类似地,在一些实施方案中,本文的方法包括将分子递送至靶细胞的胞内区。在实施方案中,蛋白质外源药剂是抑制剂。在一些实施方案中,蛋白质外源药剂包括纳米抗体、scFv、骆驼抗体、肽、大环或小分子。
在一些实施方案中,脂质颗粒在其膜上包含一种或多种细胞表面配体(例如,1、2、3、4、5、10、20、50或更多种细胞表面配体),所述细胞表面配体将由脂质颗粒呈递至靶细胞。类似地,在一些实施方案中,本文的方法包括向靶细胞呈递一种或多种细胞表面配体。在一些实施方案中,具有细胞表面配体的脂质颗粒来自选自以下的源细胞:嗜中性粒细胞(例如,并且靶细胞是肿瘤浸润淋巴细胞)、树突细胞(例如,并且靶细胞是幼稚T细胞)或嗜中性粒细胞(例如,并且靶细胞是肿瘤细胞或病毒感染的细胞)。在一些实施方案中,脂质颗粒包含膜复合物,例如包含至少2、3、4或5种蛋白质的复合物,例如同二聚体、异二聚体、同三聚体、异三聚体、同四聚体或异四聚体。在一些实施方案中,脂质颗粒包含抗体,例如毒性抗体,例如脂质颗粒能够将抗体递送至靶位点,例如通过归巢至靶位点。在一些实施方案中,源细胞是NK细胞或嗜中性粒细胞。
在一些实施方案中,本文的方法包括通过将细胞表面配体呈递在脂质颗粒上来引起配体呈递在靶细胞表面上。在一些实施方案中,脂质颗粒能够引起靶细胞的细胞死亡。在一些实施方案中,脂质颗粒来自NK源细胞。在一些实施方案中,脂质颗粒或靶细胞能够吞噬(例如,病原体)。类似地,在一些实施方案中,本文的方法包括引起吞噬。在一些实施方案中,脂质颗粒感测并响应其局部环境。在一些实施方案中,脂质颗粒能够感测代谢物、白介素或抗原的水平。
在实施方案中,脂质颗粒能够进行趋化性、外渗或一种或多种代谢活性。在实施方案中,代谢活性选自犬尿氨酸(kyneurinine)、葡糖异生、前列腺素脂肪酸氧化、腺苷代谢、尿素循环和产热呼吸。在一些实施方案中,源细胞是嗜中性粒细胞并且脂质颗粒能够归巢至损伤部位。在一些实施方案中,源细胞是巨噬细胞并且脂质颗粒能够吞噬。在一些实施方案中,源细胞是棕色脂肪组织细胞并且脂质颗粒能够脂解。
在一些实施方案中,脂质颗粒包含(例如,能够递送至靶细胞)多种外源药剂(例如,至少2、3、4、5、10、20或50种外源药剂)或编码多种外源药剂的核酸。在实施方案中,脂质颗粒包含抑制性核酸(例如,siRNA或miRNA)和mRNA。
在一些实施方案中,脂质颗粒包含(例如,能够递送至靶细胞)膜蛋白或编码该膜蛋白的核酸。在实施方案中,脂质颗粒能够重编程或转分化靶细胞,例如,脂质颗粒包含一种或多种诱导靶细胞重编程或转分化的试剂。
VI.示例性实施方案
所提供的实施方案包括:
1.一种狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型慢病毒颗粒,其包含截短的BaEV包膜糖蛋白,所述截短的BaEV包膜糖蛋白包含相对于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中所述部分融合抑制性R肽包含至少一个氨基末端氨基酸,但小于所述野生型BaEV包膜糖蛋白的所述抑制性R肽的全长。
2.一种狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型慢病毒颗粒,其包含截短的BaEV包膜糖蛋白,所述截短的BaEV包膜糖蛋白相对于野生型BaEV包膜糖蛋白包含具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中所述胞质尾部的长度为25个氨基酸,并且含有野生型BaEV包膜糖蛋白的全长抑制性R肽的所述抑制性R肽(R+8)的8个连续的氨基末端酸。
3.如实施方案1或实施方案2所述的慢病毒颗粒,其是复制缺陷型的。
4.如实施方案1-3中任一项所述的慢病毒颗粒,其通过包括用编码Gag-pol、Rev、Tat和所述截短的BaEV包膜糖蛋白的包装质粒转导生产细胞的方法制备。
5.如实施方案1-4中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述慢病毒颗粒还包含病毒核酸。
6.如实施方案5所述的慢病毒颗粒,其中所述病毒核酸包含以下核酸序列中的一种或多种(例如,全部):5'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3结构域)、Psi包装元件(Psi)、中央多嘌呤区(cPPT)/中央终止序列(CTS)(例如DNA瓣)、聚A尾序列、转录后调控元件(例如WPRE)、Rev反应元件(RRE)和3'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3)。
7.如实施方案1-4中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述慢病毒颗粒不含病毒基因组DNA。
8.一种包含截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的脂质颗粒,其包含:
(a)包围内腔的脂质双层,以及
(b)截短的BaEV包膜糖蛋白,其包含相对于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中所述部分融合抑制性R肽包含至少一个连续的氨基末端氨基酸,但小于所述野生型BaEV包膜糖蛋白的所述抑制性R肽的抑制性R肽的全长,其中所述包膜糖蛋白包埋在所述脂质双层中。
9.一种包含截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的脂质颗粒,其包含:
(a)包围内腔的脂质双层,以及
(b)截短的BaEV包膜糖蛋白,其包含相对于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中所述胞质尾部的长度为25个氨基酸,并且含有野生型BaEV包膜糖蛋白的全长抑制性R肽的所述抑制性R肽的8个连续氨基末端酸(R+8),其中所述包膜糖蛋白包埋在所述脂质双层中。
10.如实施方案8或实施方案9所述的脂质颗粒,其中所述脂质双层衍生自用于产生逆转录病毒或逆转录病毒样颗粒的宿主细胞膜。
11.如实施方案10所述的脂质颗粒,其中所述宿主细胞选自由以下组成的组:CHO细胞BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。
12.如实施方案8-11中任一项所述的脂质颗粒,其中所述脂质双层是或包含除所述BaEV包膜糖蛋白以外的一种或多种其他病毒组分。
13.如实施方案12所述的脂质颗粒,其中所述一种或多种病毒组分来自逆转录病毒。
14.如10-13所述的脂质颗粒,其中所述逆转录病毒是慢病毒或慢病毒样颗粒。
15.如实施方案1-7中任一项所述的慢病毒颗粒或如实施方案8-14中任一项所述的脂质颗粒,其中所述截短的BaEV糖蛋白包含:(i)糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分,以及(ii)糖蛋白p20E(p20E)亚基的一部分,其包含具有所述部分抑制性R肽的所述胞质尾部。
16.如实施方案15所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分和所述糖蛋白p20E(p20E)亚基的所述部分通过亚基间二硫键缔合。
17.如实施方案1-16中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述BaEV糖蛋白结合ASCT-2或ASCT-1受体。
18.如实施方案15-17中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列,或表现出与SEQ IDNO:25中所示的氨基酸序列至少至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列。
19.如实施方案15-18中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述糖蛋白p20E(p20E)亚基的所述部分包含SEQ ID NO:26,或表现出与SEQ ID NO:26至少至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列,并且包含所述部分抑制性R肽。
20.如实施方案1-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白相对于SEQ ID NO:24是截短的,并且缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的多达16个连续氨基酸。
21.如实施方案1-20中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白相对于SEQ ID NO:24是截短的,并且缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的8至14个连续氨基酸,任选地缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的8至13个连续氨基酸。
22.如实施方案1、3-7、8和10-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至9所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQID NO:14(R+9)中所示。
23.如实施方案1、3-7、8和10-22中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:37中所示。
24.如实施方案1-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至8所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:13(R+8)中所示。
25.如实施方案1-19和24中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:36中所示。
26.如实施方案1、3-7、8和10-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至7所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQID NO:12(R+7)中所示。
27.如实施方案1、3-7、8、10-19和26中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:35中所示。
28.如实施方案1、3-7、8和10-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至6所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQID NO:11(R+6)中所示。
29.如实施方案1、3-7、8、10-19和28中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:34中所示。
30.如实施方案1、3-7、8和10-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至5所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQID NO:10(R+5)中所示。
31.如实施方案1、3-7、8、10-19和30中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:33中所示。
32.如实施方案1、3-7、8和10-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至4所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQID NO:9(R+4)中所示。
33.如实施方案1、3-7、8、10-19和32中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:32中所示。
34.如实施方案1、3-7、8和10-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至3所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQID NO:8(R+3)中所示。
35.如实施方案1、3-7、8、10-19和34中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:31中所示。
36.如实施方案1-35中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述颗粒还包含外源药剂。
37.如实施方案36所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述外源药剂存在于所述内腔中。
38.如实施方案36或实施方案37所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述外源药剂是蛋白质或核酸,任选地其中所述核酸是DNA或RNA。
39.如实施方案36-38中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述外源药剂是或编码与基因编辑相关的因子。
40.如实施方案36-39中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述外源药剂是或编码与碱基编辑和/或引导编辑(即,靶标引导逆转录(TPRT))相关的因子。
41.如实施方案36-40中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述外源药剂是或编码核酸酶,任选地其中所述核酸酶选自包含锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR相关蛋白核酸酶(Cas)的组。
42.如实施方案36-40中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述外源药剂是或编码转座酶和/或重组酶。
43.如实施方案36-40中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述外源药剂是或编码DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶。
44.如实施方案1-43中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述颗粒被产生为与参考颗粒配制物相比滴度增加的配制物,所述参考颗粒配制物类似地产生但掺入了具有胞质尾部的BaEV包膜糖蛋白,所述胞质尾部具有全长R肽或长度为10个或更多个氨基酸的所述R肽的一部分。
45.如实施方案44所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述滴度增加等于或大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多,任选地等于或约或大于5倍或更多。
46.如实施方案1-45中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质,其中转导后靶细胞、任选地HEK293细胞中的滴度为等于或大于3×106TU/mL、等于或大于4×106TU/mL、等于或大于5×106TU/mL、等于或大于6×106TU/mL、等于或大于7×106TU/mL、等于或大于8×106TU/mL、等于或大于9×106TU/mL、等于或大于1×107TU/mL或等于或大于1.2×107TU/mL。
47.如实施方案1-46中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白以至少约(0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2或0.5)个截短的BaEV包膜糖蛋白/nm2的密度存在于所述颗粒的表面上。
48.一种截短的BaEV包膜糖蛋白,相对于野生型BaEV包膜糖蛋白包含具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中所述部分融合抑制性R肽包含所述野生型BaEV包膜糖蛋白的所述抑制性R肽的至少一个连续氨基末端氨基酸,但小于全长。
49.如实施方案48所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV糖蛋白包含:(i)糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分,以及(ii)糖蛋白p20E(p20E)亚基的一部分,其包含具有所述部分抑制性R肽的所述胞质尾部。
50.如实施方案49所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分和所述糖蛋白p20E(p20E)亚基的所述部分通过亚基间二硫键缔合。
51.如实施方案48-50中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述BaEV糖蛋白结合ASCT-2或ASCT-1受体。
52.如实施方案48-51中任一项所述的截短的BaEV糖蛋白,其中所述糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列,或表现出与SEQ IDNO:25中所示的氨基酸序列至少至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列。
53.如实施方案48-52中任一项所述的截短的BaEV糖蛋白,其中所述糖蛋白p20E(p20E)亚基的所述部分包含SEQ ID NO:26,或表现出与SEQ ID NO:26至少至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列,并且包含所述部分抑制性R肽。
54.如实施方案48-53中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白相对于SEQ ID NO:24是截短的,并且缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的多达16个连续氨基酸。
55.如实施方案48-54中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白相对于SEQ ID NO:24是截短的,并且缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的8至14个连续氨基酸,任选地缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的8至13个连续氨基酸。
56.如实施方案48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至9所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:14(R+9)中所示。
57.如实施方案48-56中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:37中所示。
58.如实施方案48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至8所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:13(R+8)中所示。
59.如实施方案48-55和58中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:36中所示。
60.如实施方案48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至7所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:12(R+7)中所示。
61.如实施方案48-55和60中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:35中所示。
62.如实施方案48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至6所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:11(R+6)中所示。
63.如实施方案48-55和62中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:34中所示。
64.如实施方案48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至5所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:10(R+5)中所示。
65.如实施方案48-55和64中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:33中所示。
66.如实施方案48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至4所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:9(R+4)中所示。
67.如实施方案48-55和66中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:32中所示。
68.如实施方案48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至3所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:8(R+3)中所示。
69.如实施方案48-55和68中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:31中所示。
70.一种多核苷酸,其包含编码如实施方案48-69中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白的核酸。
71.如实施方案70所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸是密码子优化的。
72.如实施方案70或实施方案71所述的多核苷酸,还包含可操作地连接以控制所述核酸表达的至少一个启动子。
73.如实施方案72所述的多核苷酸,其中所述启动子是组成型启动子。
74.如实施方案72或实施方案73所述的多核苷酸,其中所述启动子是诱导型启动子。
75.一种载体,其包含如实施方案70-74中任一项所述的多核苷酸。
76.一种质粒,其包含如实施方案70-74中任一项所述的多核苷酸。
77.如实施方案76所述的质粒,还包含编码用于慢病毒产生的蛋白质的一种或多种核酸。
78.一种细胞,其包含如实施方案70-74中任一项所述的多核苷酸、如实施方案75所述的载体或如实施方案76或实施方案77所述的质粒。
79.如实施方案78所述的细胞,其用于产生慢病毒颗粒的生产细胞。
80.一种生产细胞,其包含(i)病毒核酸和(ii)编码如实施方案48-69中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白的核酸,任选地其中所述病毒核酸是慢病毒核酸。
81.如实施方案80所述的生产细胞,其中所述生产细胞选自由以下组成的组:CHO细胞BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。
82.如实施方案80或实施方案81所述的生产细胞,其中所述生产细胞包括293T细胞。
83.如实施方案80-82中任一项所述的生产细胞,其中所述病毒核酸缺乏参与病毒复制的一个或多个基因。
84.如实施方案80-83中任一项所述的生产细胞,其中所述病毒核酸包含编码选自Gag、Pol、Rev和Tat中的一种或多种的病毒包装蛋白的核酸。
85.如实施方案80-84中任一项所述的生产细胞,其中所述病毒核酸包含以下核酸序列中的一种或多种(例如,全部):5'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3结构域)、Psi包装元件(Psi)、中央多嘌呤区(cPPT)/中央终止序列(CTS)(例如DNA瓣)、聚A尾序列、转录后调控元件(例如WPRE)、Rev反应元件(RRE)和3'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3)。
86.一种制备包含截短的BaEV糖蛋白的脂质颗粒的方法,该方法包括:
a)将如实施方案70-74中任一项所述的多核苷酸、如实施方案75所述的载体或如实施方案76或实施方案77所述的质粒引入源细胞中;
b)在允许产生脂质颗粒的条件下培养所述细胞,以及
c)从所述细胞中分离、富集或纯化所述脂质颗粒,从而制备所述脂质颗粒。
87.如实施方案86所述的方法,其中所述源细胞是哺乳动物细胞。
88.如实施方案86或实施方案87所述的方法,其中所述源细胞是生产细胞,并且所述脂质颗粒是病毒颗粒或病毒样颗粒,任选地逆转录病毒颗粒或逆转录病毒样颗粒,任选地慢病毒颗粒或慢病毒样颗粒。
89.一种制备假型慢病毒颗粒的方法,所述方法包括:
a)提供包含慢病毒核酸和编码如实施方案48-69中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白或如实施方案70-74中任一项所述的多核苷酸的核酸的生产细胞;
b)在允许产生所述慢病毒颗粒的条件下培养所述细胞,以及
c)从所述生产细胞中分离、富集或纯化所述慢病毒颗粒,从而制备所述假型慢病毒颗粒。
90.如实施方案88或实施方案89所述的方法,其中所述生产细胞选自由以下组成的组:CHO细胞BHK细胞、MDCK细胞、C3H10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。
91.如实施方案88-90中任一项所述的方法,其中所述生产细胞包括293T细胞。
92.如实施方案88-91中任一项所述的方法,其中所述方法产生与参考慢病毒颗粒配制物相比具有增加的滴度的慢病毒配制物,所述参考慢病毒颗粒配制物类似地产生但用具有胞质尾部的BaEV包膜糖蛋白假型化,所述胞质尾部具有全长R肽或长度为10个或更多个氨基酸的所述R肽的一部分。
93.如实施方案92所述的方法,其中所述滴度增加等于或大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多,任选地等于或约或大于5倍或更多。
94.如实施方案88-93中任一项所述的方法,其中所述方法产生慢病毒配制物,所述慢病毒配制物在转导后在靶细胞、任选地HEK293细胞中的滴度为等于或大于3×106TU/mL、等于或大于4×106TU/mL、等于或大于5×106TU/mL、等于或大于6×106TU/mL、等于或大于7×106TU/mL、等于或大于8×106TU/mL、等于或大于9×106TU/mL、等于或大于1×107TU/mL或等于或大于1.2×107TU/mL。
95.如实施方案88-94中任一项所述的方法,其中与类似的方法相比,所述方法导致所述生产细胞的合胞体形成减少,但所述方法用于产生用BaEV包膜糖蛋白假型化的参考慢病毒颗粒配制物,所述BaEV包膜糖蛋白具有不含R肽(Rless)或相对于所述野生型BaEV包膜糖蛋白R肽长度为3个连续氨基末端氨基酸或更少的R肽的胞质尾部。
96.如实施方案88-95中任一项所述的方法,其中所述方法产生具有高滴度(例如大于4×106TU/mL、大于5×106TU/mL、大于6×106TU/mL、大于7×106TU/mL、大于8×106TU/mL、大于9×106TU/mL、大于1×107TU/mL或大于1.2×107TU/mL)并且在所述产生方法期间所述生产细胞的合胞体形成最少的慢病毒配制物。
97.一种脂质颗粒,通过如实施方案86-88和90-96中任一项所述的方法产生。
98.一种慢病毒颗粒,通过如实施方案89-96中任一项所述的方法产生。
99.一种脂质颗粒,其包含如实施方案48-69中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白。
100.一种慢病毒颗粒,用如实施方案48-69中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白假型化。
101.一种组合物,其包含多个如实施方案1-7、15-47、98和100中任一项所述的慢病毒颗粒。
102.一种组合物,其包含多个如实施方案8-47、97和99中任一项所述的脂质颗粒。
103.如实施方案101或实施方案102所述的组合物,还包含药学上可接受的赋形剂。
104.一种转导细胞的方法,所述方法包括使细胞与如实施方案1-7、15-47、98和100中任一项所述的慢病毒颗粒或如实施方案101或实施方案103所述的组合物接触。
105.如实施方案104所述的方法,其中所述脂质颗粒或慢病毒载体包含外源药剂并且所述转导将所述外源药剂引入所述细胞中。
106.一种将外源药剂递送至细胞中的方法,所述方法包括使如实施方案1-47和97-100中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒或如实施方案101-103中任一项所述的组合物与细胞接触。
107.如实施方案104-106中任一项所述的方法,其中所述接触是体外或离体的。
108.如实施方案104-106中任一项所述的方法,其中所述接触是在受试者体内。
109.一种向受试者的细胞递送外源药剂的方法,所述方法包括向所述受试者施用如实施方案1-47和97-100中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒或如实施方案101-103中任一项所述的组合物。
110.如实施方案104-109中任一项所述的方法,其中所述细胞是造血谱系细胞。
111.如实施方案104-110中任一项所述的方法,其中所述细胞选自由以下组成的组:骨髓-淋巴平衡的造血谱系细胞、骨髓偏向性造血谱系细胞、淋巴偏向性造血谱系细胞、血小板偏向性造血谱系细胞、血小板-骨髓偏向性造血谱系细胞、长期再增殖的造血谱系细胞、中期再增殖的造血谱系细胞或短期再增殖的造血谱系细胞。
112.如实施方案104-111中任一项所述的方法,其中所述细胞选自单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞和血小板。
113.如实施方案104-112中任一项所述的方法,其中所述细胞选自T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和先天淋巴样细胞。
114.如实施方案104-113中任一项所述的方法,其中所述细胞是造血干细胞(HSC)。
115.如实施方案114所述的方法,其中所述受试者已接受造血干细胞移植。
116.如实施方案105-115中任一项所述的方法,其中所述外源药剂是蛋白质或核酸,任选地其中所述核酸是DNA或RNA。
117.如实施方案105-116中任一项所述的方法,其中所述外源药剂是或编码用于治疗所述受试者的疾病或病症的治疗剂。
118.如实施方案105-116中任一项所述的方法,其中所述外源药剂是或编码膜蛋白,任选地嵌合抗原受体,用于靶向与所述受试者的疾病或病症相关的抗原。
119.如实施方案105-117中任一项所述的方法,其中所述外源药剂在基因治疗中使用以纠正所述受试者中的遗传缺陷或替换缺陷或缺失的基因。
120.如实施方案104-119中任一项所述的方法,其中所述受试者是人类受试者。
VII.实施例
包括以下实施例仅用于说明目的,并不旨在限制本发明的范围。
实施例1用截短的BaEV包膜糖蛋白假型化的慢病毒的产生和表征。
本实施例描述了用示例性截短的BaEV包膜糖蛋白进行假型化的慢病毒载体的产生和评估。
A.BaEV假型慢病毒的产生
通过用以下质粒瞬时转染在293T细胞中产生表达增强的绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒载体:LTR主链、受CMV启动子控制的eGFP(CMV-eGFP);rev、tat、gag-pol和含有编码表E1中总结的截短的BaEV包膜糖蛋白之一的核苷酸序列的质粒。在该实验中,每次转染使用约188ng编码BaEV包膜糖蛋白的质粒。编码的截短的BaEV包膜蛋白相对于SEQ ID NO:24中所示的全长BaEV包膜糖蛋白含有截短的序列,其中产生的截短的BaEV包膜糖蛋白具有截短的胞质尾部,该胞质尾部相对于含有SEQ ID NO:24的全长R肽的野生型胞质尾部(含有SEQ ID NO:4中所示的全长R肽的野生型胞质尾部)具有部分融合抑制性R肽。
2天后,收获病毒上清液并冷冻,并对生产细胞进行EGFP成像。随后,在存在5ug/mL聚凝胺的情况下,通过解冻上清液并将其应用于确定数量的HEK293细胞来测定上清液的滴度。再过24-48小时后,对这些细胞进行胰蛋白酶消化,并通过流式细胞术分析EGFP。通过GFP+细胞的%测定滴度。如图1所示,用含有BaEV包膜糖蛋白(含有抑制性R肽的1至9个连续氨基末端氨基酸(R+1至R+9))的构建体转染的细胞表现出比含有抑制性R肽的10至16个连续氨基末端氨基酸或全长序列的构建体增加的滴度。
如图2所示,用含有BaEV包膜糖蛋白(含有抑制性R肽的4至9个连续氨基末端氨基酸)的构建体基本上减少了合胞体形成,而R-less构建体表现出生产细胞融合成大合胞体。
实施例2用截短的BaEV包膜糖蛋白假型化的慢病毒的优化。
本实施例描述了用含有实施例1所述的R肽(SEQ ID NO:13)的8个连续氨基酸的R+8截短的BaEV包膜糖蛋白假型化的慢病毒载体的优化。
用类似于实施例1的质粒转染293T细胞,不同之处在于以不同浓度范围转染编码示例性BaEV包膜糖蛋白R+8的质粒,所述浓度范围包括0.009、0.038、0.094、0.188、0.376和0.752μg。滴度的结果显示在图3中,其证明了病毒滴度的质粒浓度的剂量依赖性影响。
实施例3 CD34+细胞上的假型慢病毒活性。
如上所述用BaEV+8、BaEVTR、BaEVRless或VSV-G假型化产生慢病毒载体。在人CD34+细胞上测试了粗生产上清液的转导效率。将来自两个供体的人CD34+细胞(Hemacare)在6孔板中在补充有人重组细胞因子cKIT、TPO、Flt3L(StemCell Tech)的无血清培养基中温育24小时。将2×104个预刺激的CD34+细胞转导到涂布有重组人纤粘连蛋白的96孔板中,并在无血清培养基中以各种稀释度稀释粗制LV。每3天向细胞补充细胞因子。转导后八天,通过流式细胞术测定GFP+细胞的百分比并估计粗滴度,如图4所示。BaEV+8的估计粗滴度大于VSV-G或BaEVRless。本实施例证明用BaEV+8假型化的慢病毒载体可以转导原代人CD34+细胞。
本发明的范围并不局限于具体公开的实施方案,这些实施方案是为了举例说明本发明的各个方面而提供的。根据本文的描述和教导,对所描述的组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实践此类变化,并且此类变化旨在落入本公开的范围内。
VIII.序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
序列表
<110> 萨那生物科技公司(Sana Biotechnology, Inc.)
<120> 含有截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的脂质颗粒及相关方法和用途
<130> 18615-20044.40
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> 63/194,880
<151> 2021-05-28
<160> 72
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 信号序列
<400> 1
Met Gly Phe Thr Thr Lys Ile Ile Phe Leu Tyr Asn Leu Val Leu Val
1 5 10 15
Tyr Ala
<210> 2
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞外结构域
<400> 2
Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys Arg Tyr
1 5 10 15
Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro Pro Ser
20 25 30
Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr Leu Met
35 40 45
Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr Ser Pro
50 55 60
Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser Ser Val
65 70 75 80
His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly Asn Lys
85 90 95
Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly Thr Ser
100 105 110
Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser Pro Cys
115 120 125
Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala Pro Ile
130 135 140
His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile Lys Ser
145 150 155 160
Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro Glu Leu
165 170 175
Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu Met Val
180 185 190
Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu Leu Leu
195 200 205
Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu Lys Leu
210 215 220
Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser Tyr Val
225 230 235 240
Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro Leu Leu
245 250 255
Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser Pro Ser
260 265 270
Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe Ser Asn
275 280 285
Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val Asn Gly
290 295 300
Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu Pro Thr
305 310 315 320
Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp Ile Asp
325 330 335
Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp His Phe
340 345 350
Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly
355 360 365
Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val
370 375 380
Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val
385 390 395 400
Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser
405 410 415
Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr
420 425 430
Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe
435 440 445
Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln
450 455 460
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp
465 470 475 480
Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro
485
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜结构域
<400> 3
Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe
20
<210> 4
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 包括R肽的全胞质结构域
<400> 4
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu Ala
20 25 30
Gln Asp
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R-less)
<400> 5
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+1)
<400> 6
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+2)
<400> 7
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+3)
<400> 8
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr
20
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+4)
<400> 9
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln
20
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+5)
<400> 10
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln
20
<210> 11
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+6)
<400> 11
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
20
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+7)
<400> 12
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln
20
<210> 13
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+8)
<400> 13
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val
20 25
<210> 14
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+9)
<400> 14
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu
20 25
<210> 15
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+10)
<400> 15
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg
20 25
<210> 16
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+11)
<400> 16
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr
20 25
<210> 17
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+12)
<400> 17
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp
20 25
<210> 18
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+13)
<400> 18
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu
20 25 30
<210> 19
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+14)
<400> 19
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu
20 25 30
<210> 20
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+15)
<400> 20
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu Ala
20 25 30
<210> 21
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 胞质尾部(R+16)
<400> 21
Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala
1 5 10 15
Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu Ala
20 25 30
Gln
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 仅全R肽
<400> 22
Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu Ala Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 23
<211> 563
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有信号序列的全蛋白
<400> 23
Met Gly Phe Thr Thr Lys Ile Ile Phe Leu Tyr Asn Leu Val Leu Val
1 5 10 15
Tyr Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys
20 25 30
Arg Tyr Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro
35 40 45
Pro Ser Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr
50 55 60
Leu Met Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr
65 70 75 80
Ser Pro Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser
85 90 95
Ser Val His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly
100 105 110
Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly
115 120 125
Thr Ser Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser
130 135 140
Pro Cys Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala
145 150 155 160
Pro Ile His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile
165 170 175
Lys Ser Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro
180 185 190
Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu
195 200 205
Met Val Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu
210 215 220
Leu Leu Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu
225 230 235 240
Lys Leu Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser
245 250 255
Tyr Val Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro
260 265 270
Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser
275 280 285
Pro Ser Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe
290 295 300
Ser Asn Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val
305 310 315 320
Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu
325 330 335
Pro Thr Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp
340 345 350
Ile Asp Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp
355 360 365
His Phe Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu
370 375 380
Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu
385 390 395 400
Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser
405 410 415
Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val
420 425 430
Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu
435 440 445
Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys
450 455 460
Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr
465 470 475 480
Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro
485 490 495
Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu
500 505 510
Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile
515 520 525
Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His
530 535 540
Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu
545 550 555 560
Ala Gln Asp
<210> 24
<211> 545
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 无信号序列的全蛋白
<400> 24
Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys Arg Tyr
1 5 10 15
Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro Pro Ser
20 25 30
Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr Leu Met
35 40 45
Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr Ser Pro
50 55 60
Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser Ser Val
65 70 75 80
His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly Asn Lys
85 90 95
Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly Thr Ser
100 105 110
Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser Pro Cys
115 120 125
Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala Pro Ile
130 135 140
His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile Lys Ser
145 150 155 160
Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro Glu Leu
165 170 175
Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu Met Val
180 185 190
Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu Leu Leu
195 200 205
Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu Lys Leu
210 215 220
Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser Tyr Val
225 230 235 240
Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro Leu Leu
245 250 255
Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser Pro Ser
260 265 270
Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe Ser Asn
275 280 285
Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val Asn Gly
290 295 300
Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu Pro Thr
305 310 315 320
Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp Ile Asp
325 330 335
Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp His Phe
340 345 350
Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly
355 360 365
Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val
370 375 380
Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val
385 390 395 400
Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser
405 410 415
Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr
420 425 430
Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe
435 440 445
Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln
450 455 460
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp
465 470 475 480
Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro
485 490 495
Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn
500 505 510
Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met
515 520 525
Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu Ala Gln
530 535 540
Asp
545
<210> 25
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 表面蛋白亚基
<400> 25
Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys Arg Tyr
1 5 10 15
Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro Pro Ser
20 25 30
Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr Leu Met
35 40 45
Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr Ser Pro
50 55 60
Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser Ser Val
65 70 75 80
His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly Asn Lys
85 90 95
Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly Thr Ser
100 105 110
Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser Pro Cys
115 120 125
Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala Pro Ile
130 135 140
His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile Lys Ser
145 150 155 160
Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro Glu Leu
165 170 175
Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu Met Val
180 185 190
Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu Leu Leu
195 200 205
Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu Lys Leu
210 215 220
Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser Tyr Val
225 230 235 240
Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro Leu Leu
245 250 255
Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser Pro Ser
260 265 270
Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe Ser Asn
275 280 285
Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val Asn Gly
290 295 300
Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu Pro Thr
305 310 315 320
Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp Ile Asp
325 330 335
Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp His Phe
340 345 350
Ile Tyr Arg Pro Lys Arg
355
<210> 26
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基(无R肽)
<400> 26
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met
165 170
<210> 27
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基(包括R肽)
<400> 27
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
165 170 175
Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu Ala Gln Asp
180 185
<210> 28
<211> 528
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BaEv包膜糖蛋白R-less
<400> 28
Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys Arg Tyr
1 5 10 15
Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro Pro Ser
20 25 30
Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr Leu Met
35 40 45
Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr Ser Pro
50 55 60
Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser Ser Val
65 70 75 80
His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly Asn Lys
85 90 95
Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly Thr Ser
100 105 110
Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser Pro Cys
115 120 125
Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala Pro Ile
130 135 140
His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile Lys Ser
145 150 155 160
Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro Glu Leu
165 170 175
Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu Met Val
180 185 190
Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu Leu Leu
195 200 205
Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu Lys Leu
210 215 220
Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser Tyr Val
225 230 235 240
Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro Leu Leu
245 250 255
Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser Pro Ser
260 265 270
Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe Ser Asn
275 280 285
Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val Asn Gly
290 295 300
Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu Pro Thr
305 310 315 320
Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp Ile Asp
325 330 335
Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp His Phe
340 345 350
Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly
355 360 365
Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val
370 375 380
Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val
385 390 395 400
Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser
405 410 415
Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr
420 425 430
Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe
435 440 445
Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln
450 455 460
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp
465 470 475 480
Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro
485 490 495
Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn
500 505 510
Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met
515 520 525
<210> 29
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BAEV包膜糖蛋白R+1
<400> 29
Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys Arg Tyr
1 5 10 15
Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro Pro Ser
20 25 30
Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr Leu Met
35 40 45
Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr Ser Pro
50 55 60
Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser Ser Val
65 70 75 80
His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly Asn Lys
85 90 95
Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly Thr Ser
100 105 110
Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser Pro Cys
115 120 125
Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala Pro Ile
130 135 140
His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile Lys Ser
145 150 155 160
Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro Glu Leu
165 170 175
Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu Met Val
180 185 190
Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu Leu Leu
195 200 205
Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu Lys Leu
210 215 220
Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser Tyr Val
225 230 235 240
Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro Leu Leu
245 250 255
Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser Pro Ser
260 265 270
Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe Ser Asn
275 280 285
Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val Asn Gly
290 295 300
Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu Pro Thr
305 310 315 320
Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp Ile Asp
325 330 335
Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp His Phe
340 345 350
Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly
355 360 365
Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val
370 375 380
Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val
385 390 395 400
Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser
405 410 415
Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr
420 425 430
Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe
435 440 445
Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln
450 455 460
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp
465 470 475 480
Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro
485 490 495
Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn
500 505 510
Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met
515 520 525
Val
<210> 30
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BAEV包膜糖蛋白R+2
<400> 30
Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys Arg Tyr
1 5 10 15
Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro Pro Ser
20 25 30
Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr Leu Met
35 40 45
Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr Ser Pro
50 55 60
Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser Ser Val
65 70 75 80
His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly Asn Lys
85 90 95
Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly Thr Ser
100 105 110
Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser Pro Cys
115 120 125
Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala Pro Ile
130 135 140
His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile Lys Ser
145 150 155 160
Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro Glu Leu
165 170 175
Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu Met Val
180 185 190
Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu Leu Leu
195 200 205
Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu Lys Leu
210 215 220
Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser Tyr Val
225 230 235 240
Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro Leu Leu
245 250 255
Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser Pro Ser
260 265 270
Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe Ser Asn
275 280 285
Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val Asn Gly
290 295 300
Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu Pro Thr
305 310 315 320
Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp Ile Asp
325 330 335
Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp His Phe
340 345 350
Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly
355 360 365
Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val
370 375 380
Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val
385 390 395 400
Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser
405 410 415
Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr
420 425 430
Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe
435 440 445
Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln
450 455 460
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp
465 470 475 480
Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro
485 490 495
Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn
500 505 510
Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met
515 520 525
Val Leu
530
<210> 31
<211> 531
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BAEV包膜糖蛋白R+3
<400> 31
Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys Arg Tyr
1 5 10 15
Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro Pro Ser
20 25 30
Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr Leu Met
35 40 45
Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr Ser Pro
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 32
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro Leu Leu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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340 345 350
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<220>
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<400> 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BAEV包膜糖蛋白R+6
<400> 34
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530
<210> 35
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BAEV包膜糖蛋白R+7
<400> 35
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1 5 10 15
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435 440 445
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450 455 460
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<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BAEV包膜糖蛋白R+8
<400> 36
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<211> 537
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BAEV包膜糖蛋白R+9
<400> 37
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65 70 75 80
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Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly Thr Ser
100 105 110
Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser Pro Cys
115 120 125
Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala Pro Ile
130 135 140
His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile Lys Ser
145 150 155 160
Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro Glu Leu
165 170 175
Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu Met Val
180 185 190
Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu Leu Leu
195 200 205
Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu Lys Leu
210 215 220
Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser Tyr Val
225 230 235 240
Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro Leu Leu
245 250 255
Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser Pro Ser
260 265 270
Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe Ser Asn
275 280 285
Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val Asn Gly
290 295 300
Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu Pro Thr
305 310 315 320
Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp Ile Asp
325 330 335
Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp His Phe
340 345 350
Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly
355 360 365
Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val
370 375 380
Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val
385 390 395 400
Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser
405 410 415
Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr
420 425 430
Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe
435 440 445
Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln
450 455 460
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp
465 470 475 480
Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro
485 490 495
Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn
500 505 510
Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met
515 520 525
Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu
530 535
<210> 38
<211> 538
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BAEV包膜糖蛋白R+10
<400> 38
Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys Arg Tyr
1 5 10 15
Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro Pro Ser
20 25 30
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35 40 45
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Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala Pro Ile
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<220>
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<220>
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<400> 41
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515 520 525
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BAEV包膜糖蛋白R+14
<400> 42
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BAEV包膜糖蛋白R+15
<400> 43
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<210> 44
<211> 544
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BAEV包膜糖蛋白R+16
<400> 44
Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys Arg Tyr
1 5 10 15
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Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly Thr Ser
100 105 110
Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser Pro Cys
115 120 125
Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala Pro Ile
130 135 140
His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile Lys Ser
145 150 155 160
Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro Glu Leu
165 170 175
Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu Met Val
180 185 190
Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu Leu Leu
195 200 205
Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu Lys Leu
210 215 220
Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser Tyr Val
225 230 235 240
Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro Leu Leu
245 250 255
Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser Pro Ser
260 265 270
Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe Ser Asn
275 280 285
Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val Asn Gly
290 295 300
Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu Pro Thr
305 310 315 320
Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp Ile Asp
325 330 335
Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp His Phe
340 345 350
Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly
355 360 365
Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val
370 375 380
Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val
385 390 395 400
Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser
405 410 415
Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr
420 425 430
Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe
435 440 445
Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln
450 455 460
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp
465 470 475 480
Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro
485 490 495
Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn
500 505 510
Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met
515 520 525
Val Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu Ala Gln
530 535 540
<210> 45
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+1 肽)
<400> 45
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val
165 170
<210> 46
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+2 肽)
<400> 46
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu
165 170
<210> 47
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+3 肽)
<400> 47
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr
165 170
<210> 48
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+4 肽)
<400> 48
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln
165 170
<210> 49
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+5 肽)
<400> 49
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln
165 170 175
<210> 50
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+6 肽)
<400> 50
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
165 170 175
<210> 51
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+7 肽)
<400> 51
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
165 170 175
Gln
<210> 52
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+8 肽)
<400> 52
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
165 170 175
Gln Val
<210> 53
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+9 肽)
<400> 53
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
165 170 175
Gln Val Leu
<210> 54
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+10 肽)
<400> 54
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
165 170 175
Gln Val Leu Arg
180
<210> 55
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+11 肽)
<400> 55
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
165 170 175
Gln Val Leu Arg Thr
180
<210> 56
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+12 肽)
<400> 56
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
165 170 175
Gln Val Leu Arg Thr Asp
180
<210> 57
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+13 肽)
<400> 57
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
165 170 175
Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu
180
<210> 58
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+14 肽)
<400> 58
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
165 170 175
Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu
180
<210> 59
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+15 肽)
<400> 59
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
165 170 175
Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu Ala
180 185
<210> 60
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 跨膜蛋白亚基 (R+16 肽)
<400> 60
Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr
20 25 30
Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu
50 55 60
Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile
65 70 75 80
Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly
85 90 95
Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg
100 105 110
Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu
115 120 125
Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile
145 150 155 160
Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His Ala Met Val Leu Thr Gln Gln Tyr
165 170 175
Gln Val Leu Arg Thr Asp Glu Glu Ala Gln
180 185
<210> 61
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 scFv (FMC63)
<400> 61
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 62
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 scFv (FMC63)
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4铰链
<400> 63
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 64
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8铰链
<400> 64
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
20 25
<210> 65
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28
<400> 65
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 66
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8
<400> 66
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
1 5 10 15
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
20 25 30
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
35 40
<210> 67
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28
<400> 67
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 68
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28
<400> 68
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 69
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28
<400> 69
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 70
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 4-1BB
<400> 70
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 71
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 71
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 72
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 72
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
Claims (120)
1.一种狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型慢病毒颗粒,其包含截短的BaEV包膜糖蛋白,所述截短的BaEV包膜糖蛋白包含相对于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中所述部分融合抑制性R肽包含至少一个氨基末端氨基酸,但小于所述野生型BaEV包膜糖蛋白的所述抑制性R肽的全长。
2.一种狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型慢病毒颗粒,其包含截短的BaEV包膜糖蛋白,所述截短的BaEV包膜糖蛋白相对于野生型BaEV包膜糖蛋白包含具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中所述胞质尾部的长度为25个氨基酸,并且含有野生型BaEV包膜糖蛋白的全长抑制性R肽的所述抑制性R肽(R+8)的8个连续的氨基末端酸。
3.如权利要求1或权利要求2所述的慢病毒颗粒,其是复制缺陷型的。
4.如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒颗粒,通过包括用编码Gag-pol、Rev、Tat和所述截短的BaEV包膜糖蛋白的包装质粒转导生产细胞的方法制备。
5.如权利要求1-4中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述慢病毒颗粒还包含病毒核酸。
6.如权利要求5所述的慢病毒颗粒,其中所述病毒核酸包含以下核酸序列中的一种或多种(例如,全部):5'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3结构域)、Psi包装元件(Psi)、中央多嘌呤区(cPPT)/中央终止序列(CTS)(例如DNA瓣)、聚A尾序列、转录后调控元件(例如WPRE)、Rev反应元件(RRE)和3'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3)。
7.如权利要求1-4中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述慢病毒颗粒不含病毒基因组DNA。
8.一种包含截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的脂质颗粒,其包含:
(a)包围内腔的脂质双层,以及
(b)截短的BaEV包膜糖蛋白,其包含相对于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中所述部分融合抑制性R肽包含至少一个连续的氨基末端氨基酸,但小于所述野生型BaEV包膜糖蛋白的所述抑制性R肽的抑制性R肽的全长,其中所述包膜糖蛋白包埋在所述脂质双层中。
9.一种包含截短的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的脂质颗粒,其包含:
(a)包围内腔的脂质双层,以及
(b)截短的BaEV包膜糖蛋白,其包含相对于野生型BaEV包膜糖蛋白的抑制性R肽具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中所述胞质尾部的长度为25个氨基酸,并且含有野生型BaEV包膜糖蛋白的全长抑制性R肽的所述抑制性R肽的8个连续氨基末端酸(R+8),其中所述包膜糖蛋白包埋在所述脂质双层中。
10.如权利要求8或权利要求9所述的脂质颗粒,其中所述脂质双层衍生自用于产生逆转录病毒或逆转录病毒样颗粒的宿主细胞膜。
11.如权利要求10所述的脂质颗粒,其中所述宿主细胞选自由以下组成的组:CHO细胞BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。
12.如权利要求8-11中任一项所述的脂质颗粒,其中所述脂质双层是或包含除所述BaEV包膜糖蛋白以外的一种或多种其他病毒组分。
13.如权利要求12所述的脂质颗粒,其中所述一种或多种病毒组分来自逆转录病毒。
14.如10-13所述的脂质颗粒,其中所述逆转录病毒是慢病毒或慢病毒样颗粒。
15.如权利要求1-7中任一项所述的慢病毒颗粒或如权利要求8-14中任一项所述的脂质颗粒,其中所述截短的BaEV糖蛋白包含:(i)糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分,以及(ii)糖蛋白p20E(p20E)亚基的一部分,其包含具有所述部分抑制性R肽的所述胞质尾部。
16.如权利要求15所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分和所述糖蛋白p20E(p20E)亚基的所述部分通过亚基间二硫键缔合。
17.如权利要求1-16中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述BaEV糖蛋白结合ASCT-2或ASCT-1受体。
18.如权利要求15-17中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列,或表现出与SEQ IDNO:25中所示的氨基酸序列至少至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列。
19.如权利要求15-18中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述糖蛋白p20E(p20E)亚基的所述部分包含SEQ ID NO:26,或表现出与SEQ ID NO:26至少至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列,并且包含所述部分抑制性R肽。
20.如权利要求1-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白相对于SEQ ID NO:24是截短的,并且缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的多达16个连续氨基酸。
21.如权利要求1-20中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白相对于SEQ ID NO:24是截短的,并且缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的8至14个连续氨基酸,任选地缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的8至13个连续氨基酸。
22.如权利要求1、3-7、8和10-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至9所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ IDNO:14(R+9)中所示。
23.如权利要求1、3-7、8和10-22中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:37中所示。
24.如权利要求1-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至8所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:13(R+8)中所示。
25.如权利要求1-19和24中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:36中所示。
26.如权利要求1、3-7、8和10-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至7所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ IDNO:12(R+7)中所示。
27.如权利要求1、3-7、8、10-19和26中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:35中所示。
28.如权利要求1、3-7、8和10-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至6所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ IDNO:11(R+6)中所示。
29.如权利要求1、3-7、8、10-19和28中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:34中所示。
30.如权利要求1、3-7、8和10-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至5所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ IDNO:10(R+5)中所示。
31.如权利要求1、3-7、8、10-19和30中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:33中所示。
32.如权利要求1、3-7、8和10-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至4所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ IDNO:9(R+4)中所示。
33.如权利要求1、3-7、8、10-19和32中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:32中所示。
34.如权利要求1、3-7、8和10-19中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至3所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ IDNO:8(R+3)中所示。
35.如权利要求1、3-7、8、10-19和34中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:31中所示。
36.如权利要求1-35中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述颗粒还包含外源药剂。
37.如权利要求36所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述外源药剂存在于所述内腔中。
38.如权利要求36或权利要求37所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述外源药剂是蛋白质或核酸,任选地其中所述核酸是DNA或RNA。
39.如权利要求36-38中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述外源药剂是或编码与基因编辑相关的因子。
40.如权利要求36-39中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述外源药剂是或编码与碱基编辑和/或引导编辑(即,靶标引导逆转录(TPRT))相关的因子。
41.如权利要求36-40中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述外源药剂是或编码核酸酶,任选地其中所述核酸酶选自包含锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR相关蛋白核酸酶(Cas)的组。
42.如权利要求36-40中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述外源药剂是或编码转座酶和/或重组酶。
43.如权利要求36-40中任一项所述的慢病毒颗粒,其中所述外源药剂是或编码DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶。
44.如权利要求1-43中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述颗粒被产生为与参考颗粒配制物相比滴度增加的配制物,所述参考颗粒配制物类似地产生但掺入了具有胞质尾部的BaEV包膜糖蛋白,所述胞质尾部具有全长R肽或长度为10个或更多个氨基酸的所述R肽的一部分。
45.如权利要求44所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述滴度增加等于或大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多,任选地等于或约或大于5倍或更多。
46.如权利要求1-45中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质,其中转导后靶细胞、任选地HEK293细胞中的滴度为等于或大于3×106TU/mL、等于或大于4×106TU/mL、等于或大于5×106TU/mL、等于或大于6×106TU/mL、等于或大于7×106TU/mL、等于或大于8×106TU/mL、等于或大于9×106TU/mL、等于或大于1×107TU/mL或等于或大于1.2×107TU/mL。
47.如权利要求1-46中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白以至少约(0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2或0.5)个截短的BaEV包膜糖蛋白/nm2的密度存在于所述颗粒的表面上。
48.一种截短的BaEV包膜糖蛋白,相对于野生型BaEV包膜糖蛋白包含具有部分融合抑制性R肽的胞质尾部,其中所述部分融合抑制性R肽包含所述野生型BaEV包膜糖蛋白的所述抑制性R肽的至少一个连续氨基末端氨基酸,但小于全长。
49.如权利要求48所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV糖蛋白包含:(i)糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分,以及(ii)糖蛋白p20E(p20E)亚基的一部分,其包含具有所述部分抑制性R肽的所述胞质尾部。
50.如权利要求49所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分和所述糖蛋白p20E(p20E)亚基的所述部分通过亚基间二硫键缔合。
51.如权利要求48-50中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述BaEV糖蛋白结合ASCT-2或ASCT-1受体。
52.如权利要求48-51中任一项所述的截短的BaEV糖蛋白,其中所述糖蛋白70(g70)亚基或其生物活性部分包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列,或表现出与SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列至少至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列。
53.如权利要求48-52中任一项所述的截短的BaEV糖蛋白,其中所述糖蛋白p20E(p20E)亚基的所述部分包含SEQ ID NO:26,或表现出与SEQ ID NO:26至少至少等于或约80%、至少等于或约81%、至少等于或约82%、至少等于或约83%、至少等于或约84%、至少等于或约85%、至少等于或约86%、至少等于或约87%、至少等于或约88%、至少等于或约89%、至少等于或约90%、至少等于或约91%、至少等于或约92%、至少等于或约93%、至少等于或约94%、至少等于或约95%、至少等于或约96%、至少等于或约97%、至少等于或约98%或至少等于或约99%序列同一性的序列,并且包含所述部分抑制性R肽。
54.如权利要求48-53中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白相对于SEQ ID NO:24是截短的,并且缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的多达16个连续氨基酸。
55.如权利要求48-54中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白相对于SEQ ID NO:24是截短的,并且缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的8至14个连续氨基酸,任选地缺乏来自SEQ ID NO:24的C末端胞质尾部的8至13个连续氨基酸。
56.如权利要求48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至9所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:14(R+9)中所示。
57.如权利要求48-56中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:37中所示。
58.如权利要求48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至8所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:13(R+8)中所示。
59.如权利要求48-55和58中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:36中所示。
60.如权利要求48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至7所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:12(R+7)中所示。
61.如权利要求48-55和60中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:35中所示。
62.如权利要求48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至6所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:11(R+6)中所示。
63.如权利要求48-55和62中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:34中所示。
64.如权利要求48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至5所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:10(R+5)中所示。
65.如权利要求48-55和64中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:33中所示。
66.如权利要求48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至4所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:9(R+4)中所示。
67.如权利要求48-55和66中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:32中所示。
68.如权利要求48-55中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述部分融合抑制性R肽如SEQ ID NO:22的氨基酸1至3所示,任选地其中所述胞质尾部如SEQ ID NO:8(R+3)中所示。
69.如权利要求48-55和68中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白,其中所述截短的BaEV包膜糖蛋白如SEQ ID NO:31中所示。
70.一种多核苷酸,其包含编码如权利要求48-69中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白的核酸。
71.如权利要求70所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸是密码子优化的。
72.如权利要求70或权利要求71所述的多核苷酸,还包含可操作地连接以控制所述核酸表达的至少一个启动子。
73.如权利要求72所述的多核苷酸,其中所述启动子是组成型启动子。
74.如权利要求72或权利要求73所述的多核苷酸,其中所述启动子是诱导型启动子。
75.一种载体,其包含如权利要求70-74中任一项所述的多核苷酸。
76.一种质粒,其包含如权利要求70-74中任一项所述的多核苷酸。
77.如权利要求76所述的质粒,还包含编码用于慢病毒产生的蛋白质的一种或多种核酸。
78.一种细胞,其包含如权利要求70-74中任一项所述的多核苷酸、如权利要求75所述的载体或如权利要求76或权利要求77所述的质粒。
79.如权利要求78所述的细胞,其用于产生慢病毒颗粒的生产细胞。
80.一种生产细胞,其包含(i)病毒核酸和(ii)编码如权利要求48-69中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白的核酸,任选地其中所述病毒核酸是慢病毒核酸。
81.如权利要求80所述的生产细胞,其中所述生产细胞选自由以下组成的组:CHO细胞BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。
82.如权利要求80或权利要求81所述的生产细胞,其中所述生产细胞包括293T细胞。
83.如权利要求80-82中任一项所述的生产细胞,其中所述病毒核酸缺乏参与病毒复制的一个或多个基因。
84.如权利要求80-83中任一项所述的生产细胞,其中所述病毒核酸包含编码选自Gag、Pol、Rev和Tat中的一种或多种的病毒包装蛋白的核酸。
85.如权利要求80-84中任一项所述的生产细胞,其中所述病毒核酸包含以下核酸序列中的一种或多种(例如,全部):5'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3结构域)、Psi包装元件(Psi)、中央多嘌呤区(cPPT)/中央终止序列(CTS)(例如DNA瓣)、聚A尾序列、转录后调控元件(例如WPRE)、Rev反应元件(RRE)和3'LTR(例如,包含U5并且缺乏功能性U3)。
86.一种制备包含截短的BaEV糖蛋白的脂质颗粒的方法,所述方法包括:
a)将如权利要求70-74中任一项所述的多核苷酸、如权利要求75所述的载体或如权利要求76或权利要求77所述的质粒引入源细胞中;
b)在允许产生脂质颗粒的条件下培养所述细胞,以及
c)从所述细胞中分离、富集或纯化所述脂质颗粒,从而制备所述脂质颗粒。
87.如权利要求86所述的方法,其中所述源细胞是哺乳动物细胞。
88.如权利要求86或权利要求87所述的方法,其中所述源细胞是生产细胞,并且所述脂质颗粒是病毒颗粒或病毒样颗粒,任选地逆转录病毒颗粒或逆转录病毒样颗粒,任选地慢病毒颗粒或慢病毒样颗粒。
89.一种制备假型慢病毒颗粒的方法,所述方法包括:
a)提供包含慢病毒核酸和编码如权利要求48-69中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白或如权利要求70-74中任一项所述的多核苷酸的核酸的生产细胞;
b)在允许产生所述慢病毒颗粒的条件下培养所述细胞,以及
c)从所述生产细胞中分离、富集或纯化所述慢病毒颗粒,从而制备所述假型慢病毒颗粒。
90.如权利要求88或权利要求89所述的方法,其中所述生产细胞选自由以下组成的组:CHO细胞BHK细胞、MDCK细胞、C3H10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。
91.如权利要求88-90中任一项所述的方法,其中所述生产细胞包括293T细胞。
92.如权利要求88-91中任一项所述的方法,其中所述方法产生与参考慢病毒颗粒配制物相比具有增加的滴度的慢病毒配制物,所述参考慢病毒颗粒配制物类似地产生但用具有胞质尾部的BaEV包膜糖蛋白假型化,所述胞质尾部具有全长R肽或长度为10个或更多个氨基酸的所述R肽的一部分。
93.如权利要求92所述的方法,其中所述滴度增加等于或大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多,任选地等于或约或大于5倍或更多。
94.如权利要求88-93中任一项所述的方法,其中所述方法产生慢病毒配制物,所述慢病毒配制物在转导后在靶细胞、任选地HEK293细胞中的滴度为等于或大于3×106TU/mL、等于或大于4×106TU/mL、等于或大于5×106TU/mL、等于或大于6×106TU/mL、等于或大于7×106TU/mL、等于或大于8×106TU/mL、等于或大于9×106TU/mL、等于或大于1×107TU/mL或等于或大于1.2×107TU/mL。
95.如权利要求88-94中任一项所述的方法,其中与类似的方法相比,所述方法导致所述生产细胞的合胞体形成减少,但所述方法用于产生用BaEV包膜糖蛋白假型化的参考慢病毒颗粒配制物,所述BaEV包膜糖蛋白具有不含R肽(Rless)或相对于所述野生型BaEV包膜糖蛋白R肽长度为3个连续氨基末端氨基酸或更少的R肽的胞质尾部。
96.如权利要求88-95中任一项所述的方法,其中所述方法产生具有高滴度(例如大于4×106TU/mL、大于5×106TU/mL、大于6×106TU/mL、大于7×106TU/mL、大于8×106TU/mL、大于9×106TU/mL、大于1×107TU/mL或大于1.2×107TU/mL)并且在所述产生方法期间所述生产细胞的合胞体形成最少的慢病毒配制物。
97.一种脂质颗粒,通过如权利要求86-88和90-96中任一项所述的方法产生。
98.一种慢病毒颗粒,通过如权利要求89-96中任一项所述的方法产生。
99.一种脂质颗粒,其包含如权利要求48-69中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白。
100.一种慢病毒颗粒,用如权利要求48-69中任一项所述的截短的BaEV包膜糖蛋白假型化。
101.一种组合物,其包含多个如权利要求1-7、15-47、98和100中任一项所述的慢病毒颗粒。
102.一种组合物,其包含多个如权利要求8-47、97和99中任一项所述的脂质颗粒。
103.如权利要求101或权利要求102所述的组合物,还包含药学上可接受的赋形剂。
104.一种转导细胞的方法,所述方法包括使细胞与如权利要求1-7、15-47、98和100中任一项所述的慢病毒颗粒或如权利要求101或权利要求103所述的组合物接触。
105.如权利要求104所述的方法,其中所述脂质颗粒或慢病毒载体包含外源药剂并且所述转导将所述外源药剂引入所述细胞中。
106.一种将外源药剂递送至细胞中的方法,所述方法包括使如权利要求1-47和97-100中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒或如权利要求101-103中任一项所述的组合物与细胞接触。
107.如权利要求104-106中任一项所述的方法,其中所述接触是体外或离体的。
108.如权利要求104-106中任一项所述的方法,其中所述接触是在受试者体内。
109.一种向受试者的细胞递送外源药剂的方法,所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-47和97-100中任一项所述的慢病毒颗粒或脂质颗粒或如权利要求101-103中任一项所述的组合物。
110.如权利要求104-109中任一项所述的方法,其中所述细胞是造血谱系细胞。
111.如权利要求104-110中任一项所述的方法,其中所述细胞选自由以下组成的组:骨髓-淋巴平衡的造血谱系细胞、骨髓偏向性造血谱系细胞、淋巴偏向性造血谱系细胞、血小板偏向性造血谱系细胞、血小板-骨髓偏向性造血谱系细胞、长期再增殖的造血谱系细胞、中期再增殖的造血谱系细胞或短期再增殖的造血谱系细胞。
112.如权利要求104-111中任一项所述的方法,其中所述细胞选自单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞和血小板。
113.如权利要求104-112中任一项所述的方法,其中所述细胞选自T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和先天淋巴样细胞。
114.如权利要求104-113中任一项所述的方法,其中所述细胞是造血干细胞(HSC)。
115.如权利要求114所述的方法,其中所述受试者已接受造血干细胞移植。
116.如权利要求105-115中任一项所述的方法,其中所述外源药剂是蛋白质或核酸,任选地其中所述核酸是DNA或RNA。
117.如权利要求105-116中任一项所述的方法,其中所述外源药剂是或编码用于治疗所述受试者的疾病或病症的治疗剂。
118.如权利要求105-116中任一项所述的方法,其中所述外源药剂是或编码膜蛋白,任选地嵌合抗原受体,用于靶向与所述受试者的疾病或病症相关的抗原。
119.如权利要求105-117中任一项所述的方法,其中所述外源药剂在基因治疗中使用以纠正所述受试者中的遗传缺陷或替换缺陷或缺失的基因。
120.如权利要求104-119中任一项所述的方法,其中所述受试者是人类受试者。
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