CN1203183C - 包含功能性剪接供体位点和功能性剪接受体位点的反转录病毒载体 - Google Patents

包含功能性剪接供体位点和功能性剪接受体位点的反转录病毒载体 Download PDF

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Abstract

描述了一种反转录病毒载体。所述反转录病毒载体包含一个功能性剪接供体位点和一个功能性剪接受体位点的反转录病毒载体；其中所述功能性剪接供体位点和所述功能性剪接受体位点邻接一个第一目的核苷酸序列(“NOI”)；其中所述功能性剪接供体位点位于所述功能性剪接受体位点上游；其中所述反转录病毒载体衍生自反转录病毒原载体；其中所述反转录病毒原载体包含一个能够产生所述功能性剪接供体位点的第一核苷酸序列(“NS”)和一个能够产生所述功能性剪接受体位点的第二NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游；使得所述反转录病毒载体因所述反转录病毒原载体的反转录而形成。

Description

包含功能性剪接供体位点和功能性 剪接受体位点的反转录病毒载体
本发明涉及载体。
具体地说，本发明涉及用于包装并表达反转录病毒颗粒中的遗传物质的新系统。
更具体地讲，本发明涉及能够表达反转录病毒颗粒的新系统，它能够将目的核苷酸序列(下文缩写为“NOI”)或甚至多种NOI传递至一个或多个靶位点。
另外，本发明特别涉及可用于基因治疗的新型反转录病毒载体。
基因治疗可以包括以下的任何一种或多种形式：例如在一个或多个靶位点诸如靶细胞中对一种或多种核苷酸序列进行加入、取代、缺失、补充、操作等。如果所述靶位点为靶细胞，则所述细胞可以为组织或器官的部分。在Molecular Biology(编辑Robert Meyers，Pub VCH，诸如第556-558页)中可以找到关于基因治疗的的一般内容。
作为再一实例，基因治疗也可以提供用于以下任何一种或多种目的的方法：可以应用诸如基因的核苷酸序列以取代或补充缺陷基因；可以消除致病核苷酸序列，诸如基因或其表达产物；可以加入或引入核苷酸序列，诸如基因或其表达产物，以便例如产生更合适的表型；可以加入或引入核苷酸序列，诸如基因或其表达产物，例如用于选择目的(即在非转化细胞上选择转化细胞等)；可以在分子水平上操作细胞，以治疗、治愈或预防疾病病症-诸如癌症(Schmidt-Wolf和Schmidt-Wolf，1994，Annals of Hematology 69，273-279)或其它疾病病症，诸如免疫疾病、心血管疾病、神经病、炎症疾病或传染病；可以操作抗原和/或将其引入以诱发免疫应答，诸如基因疫苗接种。
在最近数年中，已经提出将反转录病毒用于基因治疗。本质上说，反转录病毒是生活周期不同于裂解病毒的RNA病毒。在该方面，反转录病毒是通过DNA中间体复制的感染性实体。当反转录病毒感染细胞时，其基因组由反转录酶转变为DNA形式。所述DNA拷贝用作模板，以产生新的RNA基因组和感染性病毒颗粒装配所必需的病毒编码的蛋白。
有许多反转录病毒，实例包括：鼠类白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、弗吉纳米肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠类白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠类骨肉瘤病毒(FRB MSV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾贝尔逊鼠类白血病病毒(A-MLV)、鸟类髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和鸟类成红细胞增生病毒(AEV)。
在Coffin等(“Retroviruses”1997 Cold Spring Harbour LaboratoryPress编辑：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第758-763页)中，可以找到详细的反转录病毒一览表。
在本领域中可以找到关于某些反转录病毒基因组结构的细节。作为实例，可以从NCBI Genbank中可以找到关于HIV的细节(即基因组登记号AF033819)。
所有野生型反转录病毒基本上均含有三种主要的编码域-gag、pol、env，它们编码必需的病毒体蛋白。然而，反转录病毒可以大致分为两类：即“简单的”和“复杂的”。这些类别的区别在于其基因组结构。简单的反转录病毒通常仅携带基本信息。相比之下反，复杂的反转录病毒也编码得自多重剪接信息的另外的调节蛋白。
反转录病毒甚至可以进一步分为7组。其中5组代表具有致癌潜力的反转录病毒。其余2组是慢病毒和泡沫病毒。这些反转录病毒的综述出现于“Retroviruses”(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press编辑：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第1-25页)。
除人T细胞白血病病毒-牛白血病病毒群(TLV-BLV)外的所有致癌成员均为简单的反转录病毒。HTLV、BLV和慢病毒以及泡沫病毒是复杂的反转录病毒。研究得最清楚的一些致癌反转录病毒是劳斯肉瘤病毒(RSV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)和鼠类白血病病毒(MLV)和人T细胞白血病病毒(HTLV)。
慢病毒群甚至再分为“灵长类”和“非灵长类”慢病毒。灵长类慢病毒的实例包括人免疫缺陷病毒(HIV)(即人自身免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒群包括原型“慢病毒”维斯那/梅迪病毒(VMV)以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和新近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒。
慢病毒科和其它类型反转录病毒之间的不同之处在于，慢病毒具有感染分裂细胞和非分裂细胞的能力(Lewis等1992 EMBO.J11：3053-3058；Lewis和Emerman 1994 J.Virol.68：510-516)。相比之下，诸如MLV的其它反转录病毒不能感染非分裂细胞，诸如构成例如肌肉、脑、肺和肝脏组织的细胞。
在感染过程中，反转录病毒最初附着于特定的细胞表面受体。在进入敏感性宿主细胞时，反转录病毒RNA基因组则由亲代病毒内携带的病毒编码的反转录酶拷贝为DNA。该DNA被转运到宿主细胞核，随后在核内整合入宿主基因组。在此阶段，它通常被称为原病毒。在细胞分裂期间，原病毒稳定地存在宿主染色体上，并同其它细胞蛋白一样被转录。原病毒编码制造更多病毒所需的蛋白和包装机器，病毒可以通过有时称为“芽生”的过程离开细胞。
正如已经表明的，每个反转录病毒基因组均包含称为gag、pol和env的基因，它们编码病毒体蛋白和酶。在原病毒中，这些基因两端的侧翼为称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR负责原病毒的整合和转录。它们也作为增强子-启动子序列而起作用。换句话说，LTR可以控制病毒基因的表达。反转录病毒RNA的包衣壳借助于位于病毒基因组5’端的psi序列而发生。
LTR本身是相同的序列，它们可以分为三种元件，这些元件称为U3、R和U5。U3得自所述RNA 3’端特有的序列。R得自于所述RNA两端重复的序列，而U5得自所述RNA 5’端特有的序列。在不同反转录病毒中，这三种元件的大小可以显著变化。
为了易于理解，以下显示RNA和DNA形式的所述反转录病毒的简单的一般结构(未按比例制图)，其中显示了LTR的基本特征和gag、pol和env的相对定位。
病毒体DNA
Figure C9881142400101
如上图所示，传染性反转录病毒RNA基因组的基本分子结构是(5’)R-U5-gag，pol，env-U3-R(3’)。在缺陷型反转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可能不存在或没有功能。该RNA两端的R区是重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组5’和3’端特有的序列。
病毒体RNA反转录为双链DNA发生于细胞质中，涉及反转录酶从模板分子的5’末端至3’末端的两次跳跃。这些跳跃的结果是位于病毒体RNA 5’和3’端的序列复制。然后这些序列在病毒DNA两端发生串联融合，形成包含R U5和U3区的长末端重复序列(LTR)。反转录完成时，病毒DNA易位到细胞核中，在此称为前整合复合物(PIC)的反转录病毒基因组的线性拷贝，借助病毒体整合酶随机插入染色体DNA中，形成稳定的原病毒。整合入宿主细胞基因组中的可能位点的数目非常大并且分布非常广。
原病毒转录的控制主要归于病毒LTR的非编码序列。转录起始位点位于左手边LTR(未显示)中U3和R之间的边界，poly(A)添加(终止)位点位于右手边LTR(未显示)中R和U5之间的边界。U3含有所述原病毒的大多数转录控制元件，它们包括对细胞转录激活蛋白和在某些情况下对病毒的转录激活蛋白应答的启动子和多个增强子序列。某些反转录病毒具有任何一种或多种的以下基因：诸如tat、rev、tax和rex，它们编码参与基因表达调节的蛋白。
原病毒DNA的转录再产生全长病毒RNA基因组大小的RNA分子和通过RNA加工产生的亚基因组大小的RNA分子。通常，所有的RNA产物均用作产生病毒蛋白的模板。通过RNA转录物剪接和翻译期间核糖体移码的组合，完成RNA产物的表达。
RNA剪接是去除间插或“内含子”RNA序列且将剩余的“外显子”序列连接以提供用于翻译的连续读框的过程。反转录病毒DNA的最初转录物以几种方式修饰，其方式非常类似于细胞mRNA。然而，与其中所有内含子被有效剪接的大多数细胞mRNA不同，新合成的反转录病毒RNA必须转变为两个群体。一个群体保持未剪接，以用作基因组RNA，而另一群体进行剪接，以提供亚基因组RNA。
全长未剪接的反转录病毒RNA转录物有两个功能：(i)它们编码gag和pol基因产物，和(ii)它们作为基因组RNA被包装入子代病毒体颗粒中。亚基因组大小的RNA分子为其余的病毒基因产物提供mRNA。所有剪接的反转录病毒转录物均带有第一外显子，它跨越5’LTR的U5区。最后一个外显子总是保留3’LTR编码的U3和R区，尽管其大小不同。其余RNA结构的组成取决于剪接事件数和可变剪接位点的选择。
在简单反转录病毒中，一个群体的新合成的反转录病毒RNA保持未剪接，以用作基因组RNA并作为gag和pol的mRNA。另一群体进行剪接，将基因组RNA的5’部分融合至下游基因，最常见为env。用位于gag上游的剪接供体和pol 3’末端附近的剪接受体完成剪接。在剪接供体和剪接受体之间、通过剪接去除的内含子含有gag和pol基因。这一剪接事件产生包膜(Env)蛋白的mRNA。所述剪接供体通常位于gag上游，但在诸如ASLV的某些病毒中，剪接供体位于gag基因中的少数密码子，产生第一Env翻译产物，包括与Gag共同的少数氨基末端氨基酸残基。Env蛋白在膜结合多核糖体上合成，并通过细胞的囊泡输运转运至质膜，在此它被加入病毒颗粒中。
复杂的反转录病毒既产生单剪接转录物，也产生多剪接转录物，它们不仅编码env基因产物，而且编码数组这些病毒独特的调节蛋白和辅助蛋白。复杂的反转录病毒诸如慢病毒，尤其是HIV，提供了在反转录病毒感染期间可能发生的可变剪接复杂性的突出实例。例如，现在已知，HIV-1能够通过亚适剪接，由最初的基因组转录物产生30种以上的不同mRNA。由于破坏竞争性剪接受体的突变可以引起剪接模式的变化，并且可以影响病毒的感染性，因此看来这种选择过程受到调节(Purcell和Martin 1993 J Virol 67：6365-6378)。
在受感染细胞中，全长RNA和亚基因组大小RNA的相对比例是变化的，在反转录病毒基因表达期间，这些转录物水平的调节是潜在的控制步骤。对于反转录病毒基因的表达，未剪接RNA和剪接的RNA均必须转运到胞质，并且必须维持剪接的和未剪接的RNA的合适比例，以有效地进行反转录病毒的基因表达。不同类别的反转录病毒已经进化出对该问题的不同解决方法。仅使用全长和单剪接RNA的简单反转录病毒，或者利用不定的有效剪接位点，或者通过在其基因组中加入几种仅部分限定的顺式作用元件，来调节这些种类的胞质比率。既指导单剪接RNA的合成、也指导多剪接RNA的合成的复杂反转录病毒，通过RNA上的序列与辅助基因之一(诸如HIV-1中的rev和HTLV-1中的rex)的蛋白产物相互作用，来调节不同基因组和亚基因组大小的RNA种类的转运和可能的剪接。
关于结构基因gag、pol和env本身以及略微更详细的细节，gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag被蛋白水解加工为成熟蛋白MA(基质)、CA(壳体)和NC(核壳)。pol基因编码反转录酶(RT)，RT含有DNA聚合酶和相关的RNA酶H两者的活性，pol基因还编码整合酶(IN)，IN介导基因组的复制。env基因编码病毒体的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，它们形成与细胞受体蛋白特异性相互作用的复合物。这种相互作用最终导致病毒膜与细胞膜的融合。
Env蛋白是覆盖病毒颗粒并在允许病毒进入靶细胞中起主要作用的病毒蛋白。反转录病毒的包膜糖蛋白复合物包括两种多肽：一种外部的糖基化亲水多肽(SU)和一种跨膜蛋白(TM)。这些蛋白一起形成病毒体表面上的寡聚“隆起(knob)”或“隆起的刺突”。两种多肽均由env基因编码，并以多肽前体形式合成，多肽前体在其转运至细胞表面期间被蛋白水解切割。尽管未切割的Env蛋白能够结合于所述受体，但切割事件本身对激活该蛋白的融合潜力是必需的，这对于病毒进入宿主细胞是必需的。通常，SU和TM蛋白均于多个位点糖基化。然而，在某些病毒中，例如MLV，TM不被糖基化。
尽管SU和TM蛋白本身不总是有包膜病毒体颗粒装配所需的，但它们在进入过程中起重要作用。在该方面，SU域结合于靶细胞上的受体分子，通常是特定的受体分子。据信这一结合事件激活TM蛋白的膜融合诱导潜力，此后病毒膜和细胞膜融合。在某些病毒中，特别是MLV，人们认为导致TM胞质尾的短部分去除的切割事件在暴露该蛋白全部融合活性中起关键作用(Brody等1994 J Virol 68：4620-4627；Rein等1994 J Virol 68：1773-1781)。TM跨膜区段远侧的该胞质“尾”仍在病毒膜内侧上，在不同的反转录病毒中其长度显著不同。
因此，SU/受体相互作用的特异性可以限定反转录病毒的宿主范围和组织嗜性。在某些情况下，这种特异性可能限制重组反转录病毒载体的转导潜力。这里，转导包括用病毒载体将非病毒基因传递至靶细胞的过程。因此，许多基因治疗试验使用MLV。具有称为4070A的包膜蛋白的特定MLV被称为兼嗜性病毒，它也可以感染人细胞，因为其包膜蛋白与人和小鼠之间保守的磷酸转运蛋白“对接”。这种转运蛋白是普遍存在的，因此这些病毒能够感染许多细胞类型。然而，在某些情况下，尤其从安全的角度来看，它可能对特异性导向限定的细胞有益。为此，几个研究小组已经工程改造了一种小鼠亲嗜性反转录病毒，这种反转录病毒不同于相对正常地仅感染小鼠细胞的其兼嗜性病毒，而是特异性地感染特定的人细胞。用红细胞生成素区段取代Env蛋白的片段，产生重组反转录病毒，该反转录病毒则特异性地结合至在其表面表达红细胞生成素受体的人细胞，诸如红细胞前体(Maulik和Patel1 997“Molecular Biotechnology：Therapeutic Applicationsand Strategies”1997 Wiley-Liss Inc.第45页)。
除gag、pol和env外，复杂的反转录病毒也含有“辅助”基因，它们编码辅助蛋白。辅助蛋白定义为由通常的复制基因或结构基因gag、pol和env编码的蛋白以外的、由辅助基因编码的蛋白。这些辅助蛋白不同于参与基因表达调节的蛋白，如由tat、rev、tax和rex编码的蛋白。辅助基因的实例包括vif、vpr、vpx、vpu和nef中的一个或多个。这些辅助基因可以发现于例如HIV中(参见例如“Retroviruses”Coffin等编辑，Pub.CSHL 1997的第802和803页)。非必需辅助蛋白可以在特化的细胞类型中起作用，提供与由细胞蛋白提供的功能至少部分重复的功能。通常，辅助基因位于pol和env之间，恰好在env下游，包括LTR的U3区或env和每种其它基因的重叠部分。
复杂的反转录病毒已经进化出调节机制，所述调节机制使用病毒编码的转录激活蛋白以及细胞转录因子。这些反式作用的病毒蛋白用作由LTR指导的RNA转录的激活蛋白。慢病毒的转录反式激活蛋白由病毒tat基因编码。Tat结合于稳定的称为TAR的茎-环RNA二级结构，其一种功能是使Tat明显最佳定位，以反式激活转录。
如早前所述，已经提议将反转录病毒作为传递系统(要不然作为传递载体进行表达)，特别是将NOI或多个NOI传递至一个或多个目的位点。这种转移可以在体外、活体外或体内发生，或是它们的组合。当以该方式使用时，反转录病毒通常称为反转录病毒载体或重组反转录病毒载体。反转录病毒载体已经被用来研究反转录病毒生活周期的各个方面，包括受体使用、反转录和RNA包装(由Miller综述，1992 CurrTop Microbiol Immunol 158：1-24)。
在用于基因治疗的典型的重组反转录病毒载体中，可以从病毒除去gag、pol和env蛋白编码区中的一种或多种的至少一部分。这使得反转录病毒载体为复制缺陷型。除去的部分甚至可以用一种NOI取代，以便产生能够将其基因组整合入宿主基因组的病毒，但其中修饰的病毒基因组由于缺乏结构蛋白而本身不能繁殖。当整合入宿主基因组中时，发生所述NOI的表达，产生例如治疗和/或诊断效应。因此，通常通过：将NOI整合入重组病毒载体中；将修饰的病毒载体包装入病毒体外壳中；并允许转导目的位点，诸如靶细胞或靶细胞群体，而达到将所述NOI转移至目的位点。
繁殖并分离大量的反转录病毒载体(例如制备合适滴度的反转录病毒载体)，通过采用包装细胞系或辅助细胞系和重组载体的组合，用于后续的例如目的位点的转导，这是可能的。
在某些情况下，繁殖和分离可能需要将反转录病毒的gag、pol和env基因分离，并将其分别引入宿主细胞中，以产生“包装细胞系”。所述包装细胞系产生包装反转录病毒DNA所需的蛋白，但由于缺乏psi区而导致不能包衣壳。然而，当将携带NOI和psi区的重组载体引入包装细胞系时，所述辅助蛋白可以包装psi阳性重组载体，产生重组病毒原种。这可以用来转导细胞，以将所述NOI引入细胞基因组中。其基因组缺乏制造病毒蛋白所需的所有基因的重组病毒，仅可以转导一次，并且不能繁殖。这些仅能转导一轮靶细胞的病毒载体被称为复制缺陷型载体。因此，将所述NOI引入宿主/靶细胞基因组，而不产生潜在有害的反转录病毒。在“Retroviruses”(1997 Cold Spring HarbourLaboratory Press编辑：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第449页)中概述了可用的包装系。
已经发展了反转录病毒包装细胞系的设计，以解决特别是早先设计所通常遇到的自发产生辅助病毒的问题。因为同源性大大促进重组，所以降低或消除该载体和辅助病毒基因组之间的同源性已经减少了辅助病毒产生的问题。新近，已经研制出包装细胞，其中在独立转染入包装细胞系的分离的表达质粒中携带gag、pol和env病毒编码区，使得野生型病毒的产生需要三次重组事件。这降低了可复制病毒产生的潜力。该策略有时称为三质粒转染法(Soneoka等1995 Nucl.Acids Res.23：628-633)。
当研制载体时，瞬时转染也可以用来测量载体的产生。在该方面，瞬时转染避免了产生稳定的载体生产细胞系所需的较长时间，如果该载体或反转录病毒包装组分对细胞有毒性，则使用瞬时转染。通常用来产生反转录病毒载体的组分包括编码Gag/Pol蛋白的质粒、编码Env蛋白的质粒和含有NOI的质粒。载体的产生包括将这些组分中的一种或多种瞬时转染入含其它所需组分的细胞中。如果该载体编码有毒基因或编码干扰宿主细胞复制的基因，诸如细胞周期抑制剂或诱导细胞凋亡的基因，则可能难以产生稳定的载体生产细胞系，但瞬时转染可以用来在细胞死亡之前产生所述载体。此外，利用瞬时转染，已经开发出产生的载体滴度水平与得自稳定的载体生产细胞系的水平相当的细胞系(Pear等1993，Proc Natl Acad Sci 90：8392-8396)。
某些HIV蛋白的毒性，可能使得难以产生稳定的基于HIV的包装细胞，由于这种毒性，通常通过载体和辅助病毒的瞬时转染制备HIV载体。某些工作者甚至已经用水泡性口膜炎病毒(VSV)的Env蛋白取代HIV的Env蛋白。VSV Env蛋白的插入促进载体的浓缩，因为通过瞬时转染，已经产生滴度为5×105(浓缩后为108)的HIV/VSV-G载体(Naldini等1996 Science 272：263-267)。因此，HIV载体的瞬时转染可以提供有用的策略，以产生高滴度的载体(Yee等1994 PNAS.91：9564-9568)。
关于载体的滴度，反转录病毒载体的实际使用主要受以下因素的限制：在体外培养物中可以获得的转导颗粒滴度(通过不超过108颗粒/ml)和许多有包膜病毒对用于浓缩和纯化病毒的常规生化和物化技术的敏感性。
作为实例，已经开发了几种浓缩反转录病毒载体的方法，包括使用离心(Fekete和Cepko 1993 Mol Cell Biol 13：2604-2613)、中空纤维过滤(Paul等1993 Hum Gene Ther 4：609-615)和切向流过滤(Kotani等1994Hun Gene Ther 5：19-28)。尽管可以达到将病毒滴度提高20倍，但反转录病毒的Env蛋白的相对脆性限制了浓缩反转录病毒载体的能力，且浓缩该病毒通常导致感染性病毒体的回收差。尽管如上所述，通过用更稳定的VSV-G蛋白取代反转录病毒的Env蛋白可以克服该问题，这允许以更好的得率更有效地浓缩载体，但其缺点是VSV-G蛋白对细胞的毒性相当大。
尽管用目前可利用的载体可获得107cfu/ml的无辅助病毒载体的滴度，但通常可以用滴度低得多的载体贮液进行试验。然而，由于实用原因，需要高滴度的病毒，尤其是当必须感染大量的细胞时。另外，转导大百分率的某些细胞类型需要高滴度。例如，人造血祖细胞感染的频率主要取决于载体的滴度，仅用滴度非常高的贮液才能发生有用频率的感染(Hock和Miller 1986 Nature 320：275-277；Hogge和Humphries 1987 Blood 69：611-617)。在这些情况下，仅仅将所述细胞暴露于大体积的病毒以补偿低病毒滴度是不够的。相反，在某些情况下，感染性载体病毒体的浓度对于促进有效的转导可能是关键性的。
研究人员正在尝试产生高滴度的载体以用于基因传递。作为实例，已经证明不同载体设计的比较，可用来帮助限定高滴度病毒产生所需的必需元件。关于不同反转录病毒载体设计的早期工作表明，几乎所有的MLV内部蛋白编码区均可以缺失，而不消除该载体的感染性(Miller等1983 Proc Natl Acad Sci 80：4709-4713)。这些早期载体仅保留env编码区3’端的小部分。后续的工作已经表明，所有的env基因编码序列均可以去除，而不会进一步降低载体的滴度(Miller和Rosman1989 Biotechnique 7：980-990；Morgenstern和Land 1990 Nucleic AcidsRes 18：3587-3596)。仅病毒LTR和连接所述LTR、包括正链和负链DNA引发所需区段和将病毒RNA选择性包装入病毒体所需的区(psi位点；Mann等1983 Cell 33：153-159)在内的短区域，被认为是载体传递必需的。尽管如此，用这些早期载体获得的病毒滴度仍低于亲代辅助病毒滴度的约10倍。
其它试验表明，gag基因5’端序列的保留显著提高病毒载体的滴度，这是因为将病毒RNA包装入病毒体中的包装效率提高(Armentano等1987 J Virol 61：1647-1650；Bender等1987 J Virol 61：1639-1646；Adam和Miller 1988 J Virol 62：3802-3806)。这种效应不是因为由该载体的gag区合成病毒蛋白，而是因为gag读框破坏或gag的密码子突变为终止密码子已经对载体的滴度无影响(Bender等1987出处同上)。这些试验证明，将基因组RNA有效包装入MLV所需的序列比先前通过缺失分析限定的psi信号大(Mann等1983出处同上)。为了获得高滴度(106至＞107)，已表明在反转录病毒载体中包括这种称为psi+(psiplus)的较大的信号是重要的。现在已经证明，该信号从所述剪接供体上游跨越至gag起始密码子下游(Bender等1987出处同上)。因为该信号的位置而使得在剪接的env表达转录物中该信号缺失。这确保仅含有病毒生活周期的所有三种必需基因的全长转录物被包装。
除在提高载体滴度方面操作所述反转录病毒载体外，也已经设计了反转录病毒载体，以诱导在转导的细胞中产生特定的NOI(通常为标记蛋白)。正如已经提及的，最常用的反转录病毒载体设计包括用一种或多种NOI取代反转录病毒序列，以产生复制缺陷型载体。这种最简单的方法是使用所述反转录病毒5’LTR中的启动子，来控制编码NOI的cDNA的表达，或改变所述LTR的增强子/启动子，以提供组织特异性表达或诱导性。或者，已经通过用在启动子选择中提供更大灵活性的内部启动子表达了单一的编码区。
当所述NOI为选择标记时，如在次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)的情况下，最容易实现表达目的基因的这些策略(Miller等1983Proc Natl Acad Sci 80：4709-4713)，这便于载体转导的细胞的选择。如果该载体含有不是选择标记的NOI，则可以通过与存在于分离的质粒上的选择标记共转染，将该载体引入包装细胞。该策略对于基因治疗有吸引力的优点是：在最终的靶细胞中表达单一的蛋白，并且避免了选择标记的可能毒性和抗原性。然而，当所插入的基因不可选择时，该方法的缺点是：更难以产生生产高滴度载体贮液的细胞。另外，通常更难以测定该载体的滴度。
目前用来设计表达两种或两种以上蛋白的反转录病毒载体的方法，依赖于三种通用的策略。这些策略包括：(i)由一种启动子转录的可变剪接的mRNA表达不同的蛋白；(ii)使用5’LTR中的启动子和内部启动子，驱动不同cDNA的转录，和(iii)使用内部核糖体进入位点(IRES)元件，以允许由或者单一mRNA或者由可以从一个可读框表达的融合蛋白翻译多个编码区。
含内部启动子的载体已经广泛用来表达多个基因。一种内部启动子使得利用非病毒LTR的启动子/增强子组合来驱动基因表达成为可能。多个内部启动子可以包括在反转录病毒载体中，且已经证明可以分别由来自其自身的启动子表达至少三种不同的cDNA(Overell等1988 Mol Cell Biol 8：1803-1808)。
尽管现在有许多这类修饰的反转录病毒载体可以用于在多种哺乳动物细胞中表达NOI，但大多数这些反转录病毒载体衍生自不能转导非分裂细胞的简单的反转录病毒，诸如鼠类致癌反转录病毒。
作为实例，广泛使用的利用可变剪接以由病毒LTR SV(X)(Cepko等1984 Cell 37：1053-1062)表达基因的载体，含有新霉素磷酸转移酶基因作为选择标记。这类类型载体的模型是亲代病毒MO-MLV，在该病毒中Gag和Gag-Pol蛋白由全长病毒mRNA翻译，而Env蛋白由剪接的mRNA产生。由该载体编码的其中一种蛋白由全长RNA翻译，而将5’LTR附近的剪接供体恰好连接于第二基因上游的剪接受体的剪接作用产生一种RNA，由该RNA可以翻译第二基因产物。该策略的一个缺点是将外源序列插入剪接的基因的内含子中。这可以影响剪接RNA与未剪接RNA之比，或提供干扰编码第二基因产物的剪接RNA产生的可变剪接受体(Korman等1987 Proc Natl Acad Sci 84：2150-2154)。因为这些效应是不可预测的，所以它们可能影响所编码基因的生产。
其它修饰的反转录病毒载体可以根据剪接能力分为两类。
第一类修饰的反转录病毒载体含有剪接供体内的、抑制病毒转录物剪接的突变(GT至GC)，其典型为pBABE载体(Morgenstern等1990Nucleic Acid Reseasrch 1 8：3587-3596)。这种剪接抑制是有益的，原因有两个：首先，它确保所有的病毒转录物均含有包装信号，并因此所有的病毒转录物均可以包装入所述生产细胞。其次，它防止病毒剪接供体和所插入基因的可能的隐蔽剪接受体之间的潜在的异常剪接。
第二类修饰的反转录病毒载体含有功能性内含子，其典型为N2(Miller等1989 Biotechniques 7：980-990)和新近的MFG(Dranoff等1993Proc Natl Acad Sci 19：3979-3986)。这两种载体均使用在包装信号内发现的正常的剪接供体。然而，它们各自的剪接受体(SA)不同。对于N2，SA发现于“延伸的”包装信号内(Bender等1987出处同上)。对于MFG，使用天然的SA(发现于pol内，参见图1)。对于这两种载体，已经表明，剪接大大增强转导细胞中的基因表达(Miller等1989出处同上；Krall等1996 Gene Therapy 3：37-48)。这类观察支持先前的发现：一般而言，剪接可以增强mRNA的翻译(Lee等1981 Nature 294：228-232；Lewis等1986 Mol Cell Biol 6：1998-2010；Chapman等1991 NucleicAcids Res 19：3979-3986)。对此，一个可能的原因是：参与转录物剪接的相同机器可能也有助于将转录物输出细胞核。
与上述修饰的反转录病毒载体不同，对能够感染非分裂细胞的反转录病毒慢病毒系统中可变剪接的研究工作非常少(Naldini等1996Science 272：263-267)。迄今为止，仅有的公开的慢病毒载体为衍生自HIV-1(Kim等1997 J Virol 72：811-816)和FIV(Poeschla等1998 NatMed 4：354-357)的慢病毒载体。这些载体仍含有病毒衍生的剪接供体和受体序列(Naldini等1996出处同上)。
一些研制用于基因传递的高滴度载体的替代方法包括使用：(i)缺陷型病毒载体，诸如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒和痘病毒和(ii)修饰的反转录病毒载体设计。
腺病毒是一种双链线性DNA病毒，它不经过RNA中间体。根据基因序列的同源性，将超过50种不同的人血清型腺病毒分为6个亚群。腺病毒的天然靶是呼吸道上皮和胃肠道上皮，一般仅产生轻度症状。血清型2和5(具有95％序列同源性)最常用于腺病毒载体系统中，通常与年轻人的上呼吸道感染相关。
腺病毒是无包膜的规则二十面体。典型的腺病毒包括140nm壳内DNA病毒。二十面体对称的该病毒由152个壳粒组成：240个六邻体和12个五邻体。所述颗粒的核心含有36kb线性双链体DNA，它于5’端与用作DNA复制引物的末端蛋白(TP)共价连接。所述DNA具有反向末端重复序列(ITR)，且其长度随血清型而变化。
腺病毒进入细胞涉及一系列不同的事件。病毒通过病毒纤丝(37nm)和细胞上的纤丝受体的相互作用而附着于细胞。Ad2/5血清型的该受体最近已经鉴定出，命名为CAR(Coxsackie和Adeno受体，Tomko等(1997 Proc Natl Acad Sci 94：3352-3358)。所述病毒通过细胞αvβ3和αvβ5整联蛋白内化入内体，是由五邻体-基质壳体蛋白(base capsidprotein)中的病毒GRD序列介导的(Wickham等，1993 Cell 73：309-319)。内化后，内体通过称为内体裂解(endosomolysis)的过程破裂，据信这是由细胞αvβ5整联蛋白优先促进的事件(Wickham等1994 J CellBiol 127：257-264)。另外，最近有证据表明，Ad5的纤丝隆起以高亲和性结合于某些细胞类型表面上的1类MHCα2结构域，所述细胞类型包括上皮细胞和B原淋巴细胞(Hong等1997 EMBO 16：2294-2306)。
随后，病毒易位至细胞核，在此发生早期区的激活，并且不久后进行DNA复制和晚期区的激活。腺病毒DNA的转录、复制和包装需要宿主和病毒两者的功能性蛋白机器。
病毒基因的表达可以分为早期(E)和晚期(L)。晚期定义为病毒DNA复制的开始。腺病毒结构蛋白一般在晚期合成。在腺病毒感染后，在大多数血清型病毒感染的细胞中，宿主细胞mRNA和蛋白的合成被抑制。腺病毒2和腺病毒5的腺病毒裂解循环非常有效，每个受感染细胞产生约10,000病毒体，并且合成过量的病毒蛋白和不加入病毒体中的DNA。腺病毒早期转录是一连串复杂的相关互连的生化事件，但它主要需要在DNA复制开始之前合成病毒RNA。
以下示意图是腺病毒基因组的示意图，显示早期和晚期基因转录的相对方向和位置。
晚期mRNA
Figure C9881142400231
腺病毒基因组的结构在所有腺病毒群中是相似的，特定的功能一般位于所研究的每种血清型的相同位置。早期胞质信使RNA与病毒DNA上的四个限定的非相连区互补。这些区命名为E1-E4。早期转录物已经分类为一系列的立即早期区(E1a)、延迟早期区(E1b、E2a、E2b、E3和E4)以及中间区(intermediate region)。
早期基因在感染后约6-8小时表达，由基因区段E1-4中的7个启动子驱动。
E1a区参与病毒基因和细胞基因的转录反式激活以及其它序列的转录阻抑。E1a基因对所有其它早期腺病毒信使RNA发挥重要的控制功能。在正常组织中，为了有效地转录E1b、E2a、E2b、E3或E4区，需要活性E1a产物。然而，可以绕过E1a功能。可以操作细胞，以提供E1a样功能，或可以天然含有这类功能。也可以操作病毒以绕过E1a功能。病毒包装信号与E1a增强子(194-358nt)重叠。
E1b区影响病毒和细胞的代谢和宿主蛋白的关闭。也包括编码pIX蛋白的基因(3525-4088nt)，包装全长病毒DNA需要此蛋白，它对于病毒的热稳定性是重要的。感染晚期病毒事件的正常进程需要病毒E1b区。E1b产物在宿主细胞核中起作用。在E1b序列中产生突变的突变体表现出晚期病毒mRNA积累减少以及对腺病毒感染晚期正常观察到的宿主细胞转运的抑制的削弱。改变宿主细胞功能需要E1b，以使得加工和转运的改变有利于病毒晚期基因产物。这些产物则导致病毒包装并释放病毒体。E1b产生防止细胞凋亡的19kD蛋白。E1b也产生结合于p53的55kD蛋白。关于腺病毒及其复制的综述，参见WO96/17053。
E2区是必需的，因为它编码72kDa DNA结合蛋白、DNA聚合酶和55kDa末端蛋白(TP)的80kDa前体，TP是蛋白引发以起始DNA合成所需的。
19kDa蛋白(gp 19K)在E3区中编码，它与调节宿主对病毒的免疫应答有关。在感染的第一阶段该蛋白的表达对TNFα应答而向上调节，该蛋白然后结合I类MHC抗原并防止该抗原迁移至上皮细胞表面，由此减少细胞毒T淋巴细胞对腺病毒感染的细胞的识别。在体外研究中E3区是不必要的，并且可以通过缺失1.9kb XbaI片段而被去除。
E4区涉及减少宿主蛋白的合成并增加病毒的DNA复制。
有5个家族的晚期基因，所有这些晚期基因均从主要晚期启动子起始。晚期基因的表达包括涉及RNA剪接的非常复杂的转录后控制机制。纤丝蛋白在L5区中编码。腺病毒基因组邻接反向末端重复序列，所述序列在Ad5中为103bp，并且是DNA复制所必需的。感染后30-40小时，完成病毒的生产。
通过缺失对E2、E3和E4启动子的诱导重要的E1基因，可以转变腺病毒，以用作基因转移的载体。E1复制缺陷型病毒可以在反式提供E1多肽的细胞系中繁殖，所述细胞系诸如人胚肾细胞系293。可以通过重组，插入一种或多种治疗基因来取代E1基因。由或者E1启动子或者异源启动子驱动该基因的表达。
通过缺失某些或所有E4可读框(ORF)，已经研制出甚至更加减毒的腺病毒载体。然而，某些第二代载体看来不产生长期的基因表达，即使所述DNA似乎被保持。因此，看来一种或多种E4 ORF的功能可以增强来自病毒携带的至少某些病毒启动子的基因表达。
制造缺陷更多的病毒的替代方法已经将所述病毒完全“去内脏”，仅保留病毒复制所需的末端重复。可以用第一代辅助病毒，在293细胞系中使“去内脏的”或“无内脏的”病毒生长至高滴度，但难以从辅助病毒中分离出“去内脏的”载体。
有复制能力的腺病毒也可以用于基因治疗。例如，可以将E1A基因插入第一代病毒中，使其处于肿瘤特异性启动子的调节之下。理论上，在将病毒注射入肿瘤后，病毒可以在肿瘤中特异性地复制，但在周围正常细胞中不复制。该类型的载体可以或者用来通过裂解直接杀伤肿瘤细胞，或者用来传递“自杀基因”，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV tk)，它可以在用丙氧鸟苷处理后杀伤受感染细胞和旁观者细胞。或者，仅E1b缺陷的腺病毒已经特别在1期临床试验中用于抗肿瘤治疗。由E1b编码的多肽能够阻断p53介导的细胞凋亡，防止细胞对病毒感染应答而自杀。因此，在正常的非肿瘤细胞中，在缺乏E1b时，病毒不能阻断细胞凋亡，并因此不能产生感染性病毒并传播。在p53缺陷型肿瘤细胞中，E1b缺陷型病毒可以生长并传播至相邻的p53缺陷型肿瘤细胞，而不传播至正常的细胞。再者，该类型的载体也可以用来传递诸如HSV tk的治疗基因。
作为用于基因传递的载体，腺病毒提供优于其它基因治疗载体系统的优点，原因如下：
它是双链DNA无包膜病毒，能够在体内和体外转导范围广泛的人类和非人类起源的细胞类型。这些细胞包括呼吸道上皮细胞、肝细胞、肌细胞、心肌细胞、滑膜细胞、初级乳房上皮细胞和有丝分裂后终末分化的细胞，诸如神经元(也许重要的例外为某些淋巴样细胞，包括单核细胞)。
腺病毒载体也能转导非分裂细胞。对于诸如囊性纤维化、其中肺上皮中的受侵袭细胞更新率慢的疾病而言，这是非常重要的。事实上，正在进行的几个试验利用腺病毒介导的将囊性纤维化转运蛋白(CFTR)转移入受影响的囊性纤维化成年患者的肺脏中。
腺病毒已经用作基因治疗的载体，并用于表达异源基因。大(36千碱基)基因组可以容纳至多8kb的外源插入DNA，并且能够在互补细胞系中有效复制，产生至多1012的非常高的滴度。因此，腺病毒是研究基因在初级非复制型细胞中表达的最佳系统之一。
由腺病毒基因组表达病毒基因或外源基因，不需要复制型细胞。腺病毒载体通过受体介导的内吞作用进入细胞。一旦在细胞内，腺病毒载体极少整合入宿主染色体中，而是在染色体外(独立于宿主基因组)作为线性基因组在宿主细胞核中发挥作用。因此，使用重组腺病毒缓解了与随机整合入宿主基因组中有关的问题。
人类恶性肿瘤与腺病毒感染无关。已经研制出减毒的腺病毒株，并已经作为活疫苗用于人类。
然而，目前的腺病毒载体在体内治疗应用方面有一些主要的限制。这些限制包括：(i)瞬时基因表达-腺病毒载体一般保持为附加体并且不复制，使得它不能传递到随后的子代，(ii)因为它不能复制，所以靶细胞的增殖可能导致稀释该载体，(iii)产生针对腺病毒蛋白的免疫应答，使得甚至低水平表达腺病毒蛋白的细胞被破坏，以及(iv)不能得到有效的治疗指数，因为体内的传递导致仅在一部分靶细胞中摄入该载体并表达所传递的基因。
如果将腺病毒的特征与反转录病毒/慢病毒的遗传稳定性结合，则所述腺病毒基本上可以用来转导靶细胞，以成为可以稳定感染相邻细胞的瞬时反转录病毒生产细胞。
本发明设法提供新型反转录病毒载体。
具体地说，本发明设法提供能够在一个或多个所需靶位点提供一种NOI或甚至多种NOI有效表达的新型反转录病毒载体。
本发明也设法提供一种用于制备高滴度载体病毒体的新系统，所述系统加入了体内使用安全的特征，并能够提供于一个或多个所需靶位点提供一种NOI或甚至多种NOI的有效表达。
按照本发明的第一方面，提供包含一个功能性剪接供体位点和一个功能性剪接受体位点的反转录病毒载体；其中所述功能性剪接供体位点和所述功能性剪接受体位点邻接一个第一目的核苷酸序列(“NOI”)；其中所述功能性剪接供体位点位于所述功能性剪接受体位点上游；其中所述反转录病毒载体衍生自反转录病毒原载体；其中所述反转录病毒原载体包含一个能够产生所述功能性剪接供体位点的第一核苷酸序列(NS)和一个能够产生所述功能性剪接受体位点的第二NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游；使得所述反转录病毒载体因所述反转录病毒原载体的反转录而形成。
按照本发明的第二方面，提供一种反转录病毒载体，其中所述反转录病毒原载体包含一个反转录病毒包装信号；并且其中所述第二NS位于所述反转录病毒包装信号下游，使得可于
Figure C9881142400271
第一靶位点阻止剪接。
按照本发明的第三方面，提供一种反转录病毒载体，其中所述第二NS置于所述第一NOI下游，使得所述第一NOI能够于
Figure C9881142400272
第一靶位点表达。
按照本发明的第四方面，提供一种反转录病毒载体，其中所述第二NS位于多克隆位点上游，使得可以插入一种或多种另外的NOI。
按照本发明的第五方面，提供一种反转录病毒载体，其中所述第二NS为编码免疫分子或其部分的核苷酸序列。
按照本发明的第六方面，提供一种反转录病毒载体，其中所述免疫分子为免疫球蛋白。
按照本发明的第七方面，提供一种反转录病毒载体，其中所述第二NS为编码免疫球蛋白重链可变区的核苷酸序列。
按照本发明的第八方面，提供一种反转录病毒载体，其中所述载体还包含一种功能性内含子。
按照本发明的第九方面，提供一种反转录病毒载体，其中所述功能性内含子的定位使得它能够将至少一种所述NOI的表达限于所需靶
按照本发明的第十方面，提供一种反转录病毒载体，其中所述靶位点为一种细胞。
按照本发明的第十一方面，提供一种反转录病毒载体，其中所述载体或原载体衍生自鼠类致癌反转录病毒或慢病毒。
按照本发明的第十二方面，提供一种反转录病毒载体，其中所述载体衍生自MMLV、MSV、MMTV、HIV-1或EIAV。
按照本发明的第十三方面，提供一种反转录病毒载体，其中所述反转录病毒载体为整合的原病毒。
按照本发明的第十四方面，提供可得自反转录病毒载体的反转录病毒颗粒。
按照本发明的第十五方面，提供用反转录病毒载体转染或转导的细胞。
按照本发明的第十六方面，提供用于医学的反转录病毒载体或病毒颗粒或细胞。
按照本发明的第十七方面，提供一种反转录病毒载体或病毒颗粒或细胞，以用于生产将一种或多种NOI传递至有需要的靶位点的药用组合物。
按照本发明的第十八方面，提供包括用反转录病毒载体或病毒颗粒转染或转导细胞或使用细胞的方法。
按照本发明的第十九方面，提供反转录病毒载体或病毒颗粒或细胞的传递系统，其中所述传递系统包含一种或多种非反转录病毒表达载体、腺病毒或质粒或它们的组合，以将一种NOI或多种NOI传递至第一靶细胞，所述传递系统还包含一种反转录病毒载体，以将一种或多种NOI传递至第二靶细胞。
按照本发明的第二十方面，提供一种反转录病毒原载体。
按照本发明的第二十一方面，提供一种功能性内含子的用法，以将一种或多种NOI的表达限于所需靶细胞。
按照本发明的第二十二方面，提供应用反转录酶将第一NS从反转录病毒原载体的3’端传递至反转录病毒载体的5’端。
按照本发明的第二十三方面，提供用于体内基因传递的杂种病毒载体系统，所述系统包含一种或多种编码第二病毒载体的第一病毒载体，所述第一载体能够感染第一靶细胞并在其中表达所述第二病毒载体，所述第二载体能够转导第二靶细胞。
按照本发明的第二十四方面，提供一种杂种病毒载体系统，其中所述第一载体可得自或基于腺病毒载体和/或所述第二病毒载体可得自或基于反转录病毒载体，最好是慢病毒载体。
按照本发明的第二十五方面，提供一种杂种病毒载体系统，其中所述慢病毒载体包含或能够传递断裂内含子结构。
按照本发明的第二十六方面，提供一种慢病毒载体系统，其中所述慢病毒载体包含或能够传递断裂内含子结构。
按照本发明的第二十七方面，提供一种腺病毒载体系统，其中所述腺病毒载体包含或能够传递断裂内含子结构。
按照本发明的第二十八方面，提供基于或得自以下任何一种或多种实体的载体或质粒：pE1sp1A、pCI-Neo、pE1RevE、pE1HORSE3.1、pE1PEGASUS4、pCI-Rab、pE1Rab。
按照本发明的第二十九方面，提供能够在靶细胞中差异表达NOI的反转录病毒载体。
本发明的另一方面包括用于体内基因传递的杂种病毒载体系统，所述系统包含编码第二病毒载体的第一病毒载体，所述第一载体能够感染第一靶细胞并在其中表达所述第二病毒载体，所述第二载体能够转导第二靶细胞，其中所述第一载体可得自或基于腺病毒载体，而所述第二病毒载体可得自或基于反转录病毒载体，最好是慢病毒载体。
本发明的另一方面包括用于体内基因传递的杂种病毒载体系统，所述系统包含编码第二病毒载体的第一病毒载体，所述第一载体能够感染第一靶细胞并在其中表达所述第二病毒载体，所述第二载体能够转导第二靶细胞，其中所述第一载体可得自或基于腺病毒载体，而所述第二病毒载体可得自或基于反转录病毒载体，最好是慢病毒载体；其中所述病毒载体系统包含一个功能性剪接供体位点和一个功能性剪接受体位点；其中所述功能性剪接供体位点和所述功能性剪接受体位点邻接一个第一目的核苷酸序列(“NOI”)；其中所述功能性剪接供体位点位于所述功能性剪接受体位点上游；其中所述反转录病毒载体衍生自反转录病毒原载体；其中所述反转录病毒原载体包含一个能够产生所述功能性剪接供体位点的第一核苷酸序列(“NS”)和一个能够产生所述功能性剪接受体位点的第二NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游；使得所述反转录病毒载体因所述反转录病毒原载体的反转录而形成。
最好是，所述反转录病毒原载体包含一个位于所述第二核苷酸序列上游的第三NS；其中所述第三NS能够产生一个非功能性剪接供体位点。
所述反转录病毒载体最好还包含一个第二NOI；其中所述第二NOI位于所述功能性剪接受体位点下游。
所述反转录病毒原载体最好包含所述第二NOI；其中所述第二NOI位于所述第二核苷酸序列下游。
所述第二NOI或其表达产物最好是治疗剂或诊断剂，或包含治疗剂或诊断剂。
所述第一NOI或其表达产物最好是或包含一种或多种赋予可选择性的因子(例如标记元件)、病毒必需元件或其部分或其组合。
所述第一NS最好位于反转录病毒原载体3’端或其附近；最好是其中所述3’端包含一个U3区和一个R区；并且最好其中所述第一NS位于所述U3区和所述R区之间。
所述反转录病毒原载体的U3区和/或所述第一NS最好包含为第三NOI的NS；其中所述NOI为转录控制元件、编码序列或其部分的一种或多种。
所述第一NS最好可得自病毒。
所述第一NS最好为内含子或其部分。
所述内含子最好可得自SV40病毒的小t-内含子。
所述载体组分最好受调节。在本发明的一个优选方面，所述载体组分由低氧调节。
在本发明的另一优选方面，所述载体组分由四环素开/关系统调节。
因此，本发明提供利用反转录病毒载体的传递系统。
本发明传递系统的反转录病毒载体包含一个功能性剪接供体位点(“FSDS”)和一个功能性剪接受体位点(“FSAS”)，它们连接一个第一NOI。所述反转录病毒载体因反转录病毒原载体的反转录而形成，该反转录病毒原载体可以包含多个NOI。
当所述FSDS位于所述FSAS上游时，任何间插序列均能被剪接。通常，剪接去除间插或“内含子”RNA序列，连接剩余的“外显子”序列以提供连续的序列用于翻译。
剪接过程图可示于下：
未剪接形式
Figure C9881142400321
剪接形式
在该图示中，Y代表因剪接而被去除的间插序列。
反转录病毒载体的天然剪接结构示于图27a。已知载体的剪接结构示于图27b。按照本发明的剪接结构示于图27c。
按照本发明，如果所述FSDS位于所述FSAS下游，则剪接不能发生。
同样，如果所述FSDS为非功能性剪接供体位点(NFSDS)和/或所述FSAS为非功能性受体受体位点(NFAS)时，则剪接不能发生。
NFSDS的一个实例是突变的FSDS，使得所述FSDS不再能够被剪接机制识别。
按照本发明，每种NS均可以是任何合适的核苷酸序列。例如，每种序列可以是独立的DNA或RNA-它们可以合成制备或可以用重组DNA技术制备，或可以从天然来源分离，或可以是它们的组合。所述序列可以是有义序列或反义序列。可以有多种可以直接或间接地相互连接的序列或其组合。
按照本发明，每种NOI均可以是任何合适的核苷酸序列。例如，每种序列可以是独立的DNA或RNA-它们可以合成制备或可以用重组DNA技术制备，或可以从天然来源分离，或可以是它们的组合。所述序列可以是有义序列或反义序列。可以有多种可以直接或间接地相互连接的序列或其组合。
所述第一NOI可以包括任何一种或多种以下选择标记，所述选择标记已经成功地用于反转录病毒载体：细菌新霉素和潮霉素磷酸转移酶基因，它们分别赋予G418抗性和潮霉素抗性(Palmer等1987 ProcNatl Acid Sci 84：1055-1059；Yang等1987 Mol Cell Biol 7：3923-3928)；突变的小鼠二氢叶酸还原酶基因(dhfr)，它赋予对氨甲蝶呤抗性(Miller等1985 Mol Cell Biol 5：431-437)；细菌gpt基因，它允许细胞在含霉酚酸、黄嘌呤和氨基蝶呤的培养基中生长(Mann等1983 Cell 33：153-159)；细菌hisD基因，它允许细胞在无组氨酸但含组氨醇的培养基中生长(Danos和Mulligan 1988 Proc Natl Acad Sci 85：6460-6464)；多种抗药性基因(mdr)，赋予对多种药物的抗性(Guild等1988 Proc Natl AcadSci 85：1595-1599；Pastan等1988 Proc Natl Acad Sci 85：4486-4490)和细菌赋予对嘌呤霉素或腐草霉素抗性的基因(Morgenstern和Land 1990Nucleic Acid Res 18：3587-3596)。
所有这些标记均为显性选择标记，并允许化学选择表达这些基因的大多数细胞。β-半乳糖苷酶也可以认为是显性标记；表达β-半乳糖苷酶的细胞可以通过采用荧光激活细胞分类器而被选择。事实上，任何细胞表面蛋白均可以为已经不制造所述蛋白的细胞提供选择标记。通过采用抗所述蛋白的荧光抗体和细胞分类器，可以选择表达所述蛋白的细胞。已经包括在载体中的其它选择标记包括hprt和HSV胸苷激酶，后者允许细胞在含次黄嘌呤、氨甲蝶呤和胸苷的培养基中生长。
所述第一NOI可以含有非编码序列，例如反转录病毒包装位点或使得所述第二NOI在所述原载体中无功能性的无义序列，但当它们通过剪接所述载体而被去除时，所述第二NOI显露出，进行功能表达。
所述第一NOI也可以编码病毒必需元件，诸如编码Env蛋白的env，这可以降低生产系统的复杂度。作为实例，在腺病毒载体中，这允许所述反转录病毒载体基因组和包膜配置于单一的腺病毒载体中，并置于同一启动子控制之下，由此提供更简单的系统，并在所述腺病毒载体中留下更大的容纳额外序列的容量。一方面，那些额外的序列可以是gag-pol盒本身。因此，在一个腺病毒载体中，人们可以生产反转录病毒载体颗粒。先前的研究(Feng等1997 Nature Biotechnology 15：866)需要使用多个腺病毒载体。
如果所述反转录病毒组分包括一个env核苷酸序列，则全部或部分该序列可以任选地用另一env的全部或部分核苷酸序列取代，所述另一env核苷酸序列的实例诸如命名为4070A的兼嗜性Env蛋白或流感血细胞凝集素(HA)或水泡性口腔炎病毒G(VSV-G)蛋白。用异源env基因取代所述env基因，是称为假型化的技术或策略的一个实例。假型化不是一种新现象，在WO-A-98/05759、WO-A-98/05754、WO-A-97/17457、WO-A-96/09400、WO-A-91/00047和Mebatsion等1997Cell 90，841-847中可以找到实例。
在一个优选方面，已经将本发明的反转录病毒载体假型化。在该方面，假型化可以提供一个或多个优点。例如，用所述慢病毒载体，基于HIV的载体的env基因产物将限制这些载体，使其仅感染表达称为CD4的蛋白的细胞。但如果这些载体中的所述env基因已经用来自其它RNA病毒的env序列取代，则它们的感染范围可能更广(Verma和Somia 1997 Nature 389：239-242)。作为实例，研究人员已经用来自VSV的糖蛋白将基于HIV的载体假型化(Verma和Somia 1997出处同上)。
在另一替代方法中，所述Env蛋白可以是修饰的Env蛋白，诸如突变的或工程改造的Env蛋白。可以制造修饰或选择修饰，以引入寻靶能力或降低毒性或用于另一目的(Valsesia-Wittman等1996 J Virol 70：2056-64；Nilson等1996 Gene Therapy 3：280-6；Fielding等1998 Blood 9：1802和其中引用的参考文献)。
合适的第二NOI编码序列包括治疗和/或诊断应用的序列，诸如但不限于编码以下的序列：细胞因子、趋化因子、激素、抗体、工程免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、酶、免疫共同刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、靶蛋白的反式显性阴性突变体(transdominatnegative mutant)、毒素、条件毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白和生长因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶以及它们的衍生物(诸如具有结合的报道基团)。但包括这类编码序列时，这类编码序列通常可以操作性地连接于合适的启动子，所述启动子可以是驱动核酶表达的启动子、或是一种不同的启动子或多种启动子。
所述第二NOI编码序列可以编码融合蛋白或编码序列的区段。
本发明反转录病毒载体可以用来将诸如前体药物活化酶的第二NOI传递至肿瘤位点，以治疗癌症。在每种情况下，使用合适的前体药物联合合适的前体药物活化酶治疗所述个体(诸如患者)。合适的前体药物结合所述载体给予。前体药物的实例包括：磷酸鬼臼亚乙苷(与碱性磷酸酶一起使用，Senter等1988 Proc Natl Acad Sci 85：4842-4846)；5-氟胞嘧啶(与胞嘧啶脱氨酶一起使用，Mullen等1994 CancerRes.54：1503-1506)；阿霉素-N-对羟基苯氧基乙酰胺(与青霉素-V酰胺酶一起使用，Kerr等1990 Cancer Immunol Immunother 31：202-206)；对-N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸(与羧肽酶G2一起使用)；氨基甲酸头孢菌素氮芥(与β-内酰胺酶一起使用)；SR4233(与P450还原酶一起使用)；丙氧鸟苷(与HSV胸苷激酶一起使用，Borrelli等1988 ProcNatl Acad Sci 85：7572-7576)；与硝基还原酶一起使用的芥子前体药物(Friedlos等1997 J Med Chem 40：1270-1275)和环磷酰胺(与P450一起使用，Chen等1996 Cancer Res 56：1331-1340)。
本发明的载体可以通过病毒或非病毒载体传递至靶位点。
正如本领域众所周知的，载体是允许或促进一种实体从一种环境转移至另一种环境的工具。并且作为实例，用于重组DNA技术的某些载体允许诸如DNA区段(诸如异源DNA区段，诸如异源cDNA区段)的实体转移入靶细胞。可任选地，一旦处于靶细胞中，所述载体则可以用来将异源DNA维持在所述细胞中，或可以用作DNA复制单位。用于重组DNA技术的载体实例包括质粒、染色体、人工染色体或病毒。
非病毒传递系统包括但不限于DNA转染法。在此，转染包括使用非病毒载体将基因传递至靶哺乳动物细胞的过程。
典型的转染方法包括电穿孔、DNA生物发射(biolistics)、脂质介导的转染、紧密(compacted)DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂转染试剂、阳离子试剂介导的转染、阳离子表面两亲物(CFA)(NatureBiotechnology 1996 14；556)和它们的组合物。
病毒传递系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。其它的载体实例包括活体外传递系统，它们包括但不限于DNA转染法，诸如电穿孔、DNA生物发射、脂质介导的转染、紧密DNA介导的转染。
本发明的载体传递系统可以包括在体外制备的一个第一载体，它编码在体内产生第二载体所必需的基因。
一种或多种所述第一病毒载体可以是多种不同的病毒载体，诸如反转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或痘病毒载体，或在多个第一病毒载体的情况下，它们可以是不同病毒起源的载体的混合物。无论在何种情况下，所述第一病毒载体均最好是缺陷型的，因为缺陷型载体不能独立地复制。因此，它们能够进入靶细胞并传递所述第二载体序列，但并不能复制以继续进一步感染靶细胞。
在所述杂种病毒载体系统包含一种以上第一载体以编码所述第二载体的情况下，两种或所有三种第一载体将用来转染或转导第一靶细胞群体，通常是同时转染或转导。
最好有编码所述第二病毒载体所有组分的单一的第一病毒载体。
优选的单一或多个第一病毒载体是腺病毒载体。
用于本发明的腺病毒载体可以衍生自人腺病毒或通常不感染人类的腺病毒。所述载体最好衍生自2型腺病毒或5型腺病毒(Ad2或Ad5)、或小鼠腺病毒或鸟类腺病毒，诸如CELO病毒(Cotton等1993 JVirol 67：3777-3785)。所述载体可以是具有复制能力的腺病毒载体，但更优选是缺陷型腺病毒载体。可以通过缺失病毒复制必需的一种或多种组分，使腺病毒载体为缺陷型。通常，每个腺病毒载体含有至少一个E1区的缺失。为了产生感染性腺病毒载体颗粒，通过使病毒在诸如人293细胞系的人胚胎成纤维细胞细胞系中传代，可以互补这一缺失，其中293细胞系含有整合拷贝的Ad5的左边部分，包括E1基因。异源DNA插入这类载体的容量至多可以为约7kb。因此，这类载体可以用来构建按照本发明的包含三种分离重组载体的系统，每种载体含有其中一个必需的转录单位以构建所述反转录病毒第二载体。
替代的腺病毒载体是本领域已知的，它们在其它腺病毒基因中含有进一步的缺失，这些载体也适用于本发明。这些第二代腺病毒载体中的数种已经显示免疫原性降低(例如E1+E2缺失Gorziglia等1996 JVirol 70：4173-4178；E1+E4缺失Yeh等1996 J Virol 70：559-565)。延伸的缺失用来提供额外的克隆容量以将多个基因引入所述载体。例如已经描述了25kb的缺失(Lieber等1996 J Virol 70：8944-8960)，也报道了缺失所有病毒基因的克隆载体(Fisher等1996 Virology 217：11-22)，所述载体允许引入35kb以上的异源DNA。这类载体可以用来产生按照本发明的腺病毒第一载体，所述第一载体编码用于构建所述反转录病毒第二载体的两种或三种转录单位。
所述第二病毒载体最好是反转录病毒载体。通过在所述第一靶细胞中缺陷型病毒载体颗粒装配和包装的必需基因的表达，产生所述第二载体。因为该载体不能独立复制，因而为缺陷型的。因此，一旦所述第二反转录病毒载体已经转导了一个第二靶细胞，则它不能通过复制而传播至任何其它靶细胞。
术语“反转录病毒载体”通常包括能够感染但本身不能复制的反转录病毒核酸。因此，它是复制缺陷型。反转录病毒载体通常包含一种或多种NOI，最好是非反转录病毒起源的NOI，以将其传递至靶细胞。反转录病毒载体也可以包含一个功能性剪接供体位点(FSDS)和一个功能性剪接受体位点(FSAS)，使得当所述FSDS位于所述FSAS上游时，任何间插序列均能够被剪接。反转录病毒载体可以在U3区包含其它非反转录病毒序列，诸如非反转录病毒控制序列，一旦所述反转录病毒载体作为原病毒整合入靶细胞中时，所述U3区可以影响NOI的表达。所述反转录病毒载体不需要含有仅来自单一反转录病毒的元件。因此，按照本发明，可以具有可得自两种或两种以上不同反转录病毒或其它来源的元件。
术语“反转录病毒原载体”通常包括上述的反转录病毒载体基因组，但它包含一个能够产生一个功能性剪接供体位点(FSDS)的第一核苷酸序列(NS)和一个能够产生一个功能性剪接受体位点(FSAS)的第二NS，使得所述第一NS位于所述第二NS下游，以致不能发生与所述第一NS和所述第二NS有关的剪接。当所述反转录病毒原载体反转录时，形成反转录病毒载体。
术语“反转录病毒载体颗粒”是指包装的反转录病毒载体，它最好能够结合于靶细胞并进入靶细胞。如上讨论的所述载体颗粒的组分可以相对于野生型反转录病毒进行修饰。例如，可以将所述颗粒的蛋白性外壳中的Env蛋白进行遗传修饰，以便改变其寻靶特异性或完成某些其它所需功能。
本发明该方面的反转录病毒载体可以衍生自鼠类致癌反转录病毒，诸如MMLV、MSV或MMTV；或可以衍生自慢病毒，诸如HIV-1、EIAV；或可以衍生自另一反转录病毒。
可以将本发明的反转录病毒载体修饰，以使得所述反转录病毒的天然剪接供体位点无功能性。
术语“修饰”包括使所述天然剪接供体沉默或去除。所述剪接供体位点已去除的载体诸如基于MLV的载体，是本领域已知的。这种载体的一个实例是pBABE(Morgenstren等1990出处同上)。
可以由所述第一载体中DNA编码的反转录病毒载体生产的必需基因的表达，产生所述第二载体。这类基因可以包括反转录病毒的gag-pol基因、有包膜病毒的env基因和含一种或多种治疗或诊断NOI的缺陷型反转录病毒载体。所述缺陷型反转录病毒载体一般含有使得能进行反转录的序列、5’长末端重复序列(LTR)的至少一部分、3’LTR的至少一部分和包装信号。
如果期望使所述第二载体为复制缺陷型，则所述第二载体可以由多个转录单位编码，所述转录单位可以位于单一的或位于两种或两种以上的腺病毒载体或其它第一载体中。因此，可能有编码所述第二载体基因组的转录单位、编码gag-pol的转录单位和编码env的转录单位。或者，可以结合两种或多种这些转录单位。例如，编码gag-pol和env或env和基因组的核酸序列，可以结合在单一转录单位中。完成这一点的方法是本领域已知的。
本文所述的转录单位为含编码序列和完成这些编码序列表达的信号的核酸区，其独立于任何其它编码序列。因此，每个转录单位通常包含包含至少一个启动子、一个增强子和一个多腺苷酸化信号。
术语“启动子”以本领域的正常含义使用，例如Jacob-Monod基因表达理论中的RNA聚合酶结合位点。
术语“增强子”包括结合于转录起始复合物的其它蛋白组分并由此促进由其相关启动子指导的转录起始的DNA序列。
编码第二载体的转录单位的启动子和增强子最好在生产所述第二病毒载体的条件下，在所述第一靶细胞中有强活性，或能够被强烈诱导。所述启动子和/或增强子可以是组成型有效的，或其活性可以受组织限制或受时间限制。合适的组织限制启动子/增强子的实例是在肿瘤细胞中有高活性的启动子/增强子，诸如来自MUC1基因、CEA基因或5T4抗原基因的启动子/增强子。时间限制的启动子/增强子的实例是对局部缺血/或低氧应答的启动子/增强子，诸如低氧效应元件或grp78或grp94基因的启动子/增强子。一个优选的启动子-增强子组合是人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)启动子/增强子组合。
其它优选的额外组分包括能够有效表达NOI或多个NOI的实体。
在本发明的一个优选方面，有所述第二载体组分的低氧或局部缺血可调节表达。在该方面，低氧是在范围广泛的不同细胞类型中基因表达的有效的调节物，并通过诱导诸如低氧诱导型因子-1(HIF-1；Wang和Semenza 1993 Proc Natl Acad Sci 90：430)的低氧诱导型转录因子的活性而起作用，低氧诱导型转录因子结合于同类的DNA识别位点，即各种基因启动子上的低氧效应元件(HRE)。Dachs等(1997Nature Med 5：515)已经使用了多体形式的小鼠磷酸甘油激酶-1(PGK-1)基因的HRE(Firth等1994 Proc Natl Acad Sci 91：6496-6500)，来在体外控制对低氧应答的人纤维肉瘤细胞的标记基因和治疗基因的表达，以及在体内控制在实体瘤中的标记基因和治疗基因的表达(Dachs等出处同上)。或者，显著的葡萄糖缺乏也存在于肿瘤的局部缺血区的事实，能被用来在肿瘤中特异性地激活异源基因的表达。已知被葡萄糖缺乏特异性激活的grp78基因启动子的截短的632个碱基对的序列，也显示出能够在体内鼠类肿瘤中驱动高水平的报道基因的表达(Gazit等1995 Cancer Res.55：1660)。
调节这类组分表达的一个替代方法是如Yorshida等所述的使用Gossen和Bujard描述的四环素开/关系统(1992 Proc Natl Acad Sci 89：5547)来生产反转录病毒的gal、pol和VSV-G蛋白(1997 BiochemBiophys Res Comm 230：426)。不寻常的是，该调节系统也用于本发明来控制所述原载体基因组的生产。这确保在缺乏四环素时没有载体组分从所述腺病毒载体表达。
以下描述可以加入到所述杂种病毒载体系统的安全特征。可以存在一种或多种这类特征。
所述第二载体对于体内应用也是有利的，因为将消除产生能够独立复制的感染性病毒的重组的可能性的一种或多种特征加入其中。在先前公开的研究中不包括这类特征(Feng等1997出处同上)。特别是，Feng等没有描述由下述三种组分构建反转录病毒载体(出处同上)。
首先，通过缺失同源区，可以避免编码所述第二载体组分的序列之间的序列同源性。同源区允许发生基因重组。在一个特定的实施方案中，用三种转录单位构建第二反转录病毒载体。第一转录单位含有在非反转录病毒启动子和增强子控制下的反转录病毒的gag-pol基因。第二转录单位含有在非反转录病毒启动子和增强子控制下的反转录病毒的env基因。第三转录单位包含在非反转录病毒启动子和增强子控制下的缺陷型反转录病毒基因组。在天然的反转录病毒基因组中，包装信号的位置使得正确起作用需要部分gag序列。通常，当由其构建反转录病毒载体系统时，包括部分gag基因在内的包装信号仍在所述载体基因组中。然而，在本发明的情况下，所述缺陷型反转录病毒基因组含有基本包装信号，它不包含与所述第一转录单位中的gag序列同源的序列。同样外，在反转录病毒中，例如在莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)中，在pol编码序列3’端和env 5’端之间有重叠小区。通过改变或者pol编码序列3’端或者env 5’端的序列，以改变密码子用法，而不改变所编码蛋白的氨基酸序列，可以去除所述第一和第二转录单位之间的相应的同源性区域。
其次，通过用另一反转录病毒或另一有包膜病毒的Env蛋白将一种反转录病毒的基因组假型化，使得避免env组分和gag-pol组分之间的同源区，可以避免有复制能力的第二病毒载体的可能性。
在一个具体实施方案中，由以下三种组分构建所述反转录病毒载体：第一转录单位含有非反转录病毒启动子和增强子控制下的反转录病毒的gag-pol基因。第二转录单位含有在非反转录病毒启动子和增强子控制下的替代的有包膜病毒的env基因。第三转录单位包含在非反转录病毒启动子和增强子控制下的缺陷型反转录病毒基因组。所述缺陷型反转录病毒基因组含有基本包装信号，它不含有与所述第一转录单位中的gag序列同源的序列。
第三，通过采用以特定方式构建的两种转录单位，可以消除有复制能力的反转录病毒的可能性。第一转录单位含有在第一靶细胞中有活性的启动子-增强子(诸如hCMV启动子-增强子或组织限制启动子-增强子)控制下的gag-pol编码区。第二转录单位编码能够被包装入反转录病毒颗粒中的反转录病毒基因组RNA。第二转录单位含有包装、整合和反转录所必需的反转录病毒序列，也含有有包膜病毒的env蛋白编码序列和一种或多种治疗基因的编码序列。
在该实施例中，设计所述env和NOI编码序列的转录，使得所述Env蛋白优先在第一靶细胞中生产，而所述NOI的表达产物优先在第二靶细胞中生产。
一种合适的内含子剪接布置在后面实施例5中进行了描述，并在图17和图27c中图示。这里，在由所述第一载体传递至第一靶细胞的反转录病毒基因组序列中，剪接供体位点位于剪接受体位点下游。因此在第一靶细胞中不存在剪接，或很少发生剪接，所以所述Env将蛋白优先表达。然而，一旦所述载体基因组已经通过反转录过程并整合入第二靶细胞，则功能性剪接供体序列将位于5’LTR中，位于功能性剪接受体序列上游。发生剪接，将所述env序列剪接出，产生所述NOI的转录物。
在该实施例的第二布置中，所述NOI的表达限于第二靶细胞，并防止在第一靶细胞中表达，如下所述。该布置在后面的实施例6中描述，并图示于图18。在此，启动子-增强子和含所述编码序列5’端的NOI第一片段和天然或人工衍生或可衍生的剪接供体序列，被插入所述反转录病毒基因组构成物3’端R区的上游。含有完成所述编码区所需的所有序列的所述NOI的第二片段，置于所述反转录病毒基因组构成物中包装信号下游的天然或人工衍生或可衍生剪接受体序列的下游。反转录病毒基因组在第二靶细胞中反转录并整合时，所述NOI的启动子’5片段和所述功能性剪接供体序列位于所述功能性剪接受体和所述NOI 3’端上游。来自所述启动子和剪接的转录，允许在第二靶细胞中翻译所述NOI。
在一个优选实施方案中，按照本发明的杂种病毒载体系统包含编码反转录病毒第二载体的单一的或多个腺病毒第一载体。
描述的本发明的优选实施方案解决一个与腺病毒载体和其它病毒载体有关的一个主要问题，即来自这类载体的基因表达是瞬时的。由第一靶细胞产生的反转录病毒颗粒可以转导第二靶细胞，在所述第二靶细胞中的基因表达稳定地保持，因为所述反转录病毒载体基因组整合入宿主细胞基因组中。所述第二靶细胞不表达大量的病毒蛋白抗原，因此免疫原性低于用腺病毒载体转导的细胞。
用反转录病毒载体作为所述第二载体是有利的，因为它例如通过允许导向快速分裂细胞，而允许一定程度的细胞辨别。此外，反转录病毒的整合允许在靶组织中稳定表达治疗基因，包括在增殖性靶细胞中的稳定表达。
应用本发明的新型反转录病毒载体设计也是有利的，因为基因表达可以限于第一靶位点或第二靶位点。以该方式，单一的或多个NOI可以优先于第二靶位点表达，而在第一靶位点表达差或不以生物学显著水平表达。结果，可以避免NOI的可能毒性或抗原性。
优选的是，所述第一病毒载体优先转导某种或某些细胞类型。
所述第一载体更优选为定向载体，也就是说它与天然病毒相比组织嗜性改变，使得所述载体导向特定的细胞。
术语“定向载体”不必与术语“靶位点”或“靶细胞”关连。
“靶位点”是指天然或定向载体能够转染或转导的位点。
“第一靶位点”是指天然或定向载体能够转染或转导的第一位点。
“第二靶位点”是指天然或定向载体能够转染或转导的第二位点。
“靶细胞”就是指是天然或定向载体能够转染或转导的细胞。
“第一靶细胞”是指天然或定向载体能够转染或转导的第一细胞。
“第二靶细胞”是指天然或定向载体能够转染或转导的第二细胞。
按照本发明的优选的腺病毒第一载体也最好是定向载体，其中所述载体的组织嗜性因改变而不同于野生型腺病毒。可以修饰腺病毒载体，以产生例如以下描述的定向腺病毒载体：Krasnykh等1996 J.Virol70：6839-6846；Wickham等1996 J.Virol 70：6831-6838；Stevenson等1997 J.Virol 71：4782-4790；Wickham等1995 Gene Therapy 2：750-756；Douglas等1997 Neuromuscul.Disord 7：284-298；Wickham等1996Nature Biotechnology 14：1570-1573。
用于按照本发明的载体系统的第一靶细胞包括：造血细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞或任何这些细胞的祖细胞)；内皮细胞；肿瘤细胞；基质细胞；星形胶质细胞或神经胶质细胞；肌细胞；和上皮细胞。
因此，能够产生所述第二病毒载体的按照本发明的第一靶细胞可以是上述细胞类型中的任何一种。
在一个优选的实施方案中，按照本发明的第一靶细胞是用一种缺陷型腺病毒载体转导的单核细胞或巨噬细胞，所述缺陷型腺病毒载体含有用于反转录病毒gag-pol的第一转录单位和能够产生可包装缺陷型反转录病毒基因组的第二转录单位。在这种情况下，所述第二转录单位最好处于在机体内患病位置中优先有活性的启动子-增强子的控制之下，其中所述患病位置诸如局部缺血位点或实体瘤的微环境。
在一个具体的优先实施方案中，构建所述第二转录单位，使得将所述基因组插入所述第二靶细胞中时，产生一个内含子，它用来降低病毒必需元件(诸如病毒env基因)的表达，并允许有效地表达一种或多种治疗和/或诊断NOI。
所述包装细胞可以是待治疗个体机体内的体内包装细胞，或它可以是在体外培养的细胞，诸如组织培养细胞系。合适的细胞系包括哺乳动物细胞，诸如鼠类成纤维细胞衍生的细胞系或人细胞系。所述包装细胞系最好是人细胞系，诸如HEK293、293T、TE671、HT1080。
或者，所述包装细胞可以是得自待治疗个体的细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、血细胞或成纤维细胞。所述细胞可以从个体分离，活体外给予所述包装组分和载体组分，然后再给予自身包装细胞。或者，可以将所述包装组分和载体组分体内给予所述包装细胞。将反转录病毒的包装组分和载体组分给予个体细胞的方法是本领域已知的。例如，一种方法是：通过瞬时三重转染(Landau和Littman 1992 J.Virol.66，5110；Soneoka等1995 Nucleic Acids Res 23：628-633)，将产生反转录病毒颗粒所需的不同的DNA序列(例如env编码序列、gag-pol编码序列和缺陷型反转录病毒基因组)同时引入所述细胞。
所述第二病毒载体也可以是定向载体。对于反转录病毒载体，这可以通过修饰所述Env蛋白来完成。所述反转录病毒第二载体的Env蛋白需要是无毒的包膜或可以以无毒量在所述第一靶细胞中生产的包膜，诸如MMLV兼嗜性包膜或修饰的兼嗜性包膜。在这种情况下，所述安全特征最好是缺失反转录病毒组分之间同源的区域或序列。
所述包膜最好是允许转导人细胞的包膜。合适的env基因的实例包括但不限于VSV-G、MLV兼嗜性env诸如4070A env、RD114猫白血病病毒env或流感病毒的血细胞凝集素(HA)。所述Env蛋白可以是能够结合于数目有限的人类细胞类型上的受体的Env蛋白，可以是含有导向部分的工程包膜。由在所选择的包装细胞系中有活性的启动子和任选增强子，转录所述env和gag-pol编码序列，所述转录单位由一个多腺苷酸化信号终止。例如，如果所述包装细胞是人类细胞，则合适的启动子-增强子组合是来自人巨细胞病毒主要立即早期(hCMV-MIE)基因的启动子-增强子，并可以使用来自SV40病毒的多腺苷酸化信号。其它合适的启动子和多腺苷酸化信号是本领域已知的。
所述第二靶细胞群体可以与所述第一靶细胞群体相同。例如，将本发明的第一载体传递至肿瘤细胞，导致可以转导其它肿瘤细胞的其它载体颗粒的复制和产生。
或者，所述第二靶细胞群体可以不同于所述第一靶细胞群体。在这种情况下，所述第一靶细胞用作被治疗个体机体内的内源工厂，产生可以转导所述第二靶细胞群体的另外的载体颗粒。例如，所述第一靶细胞群体可以是用所述第一载体体内或活体外转导的造血细胞。然后，将所述第一靶细胞传递至或迁移至机体内诸如肿瘤的位点，并产生能够转导例如实体瘤中有丝分裂活性的肿瘤细胞的所述第二载体颗粒。
按照本发明的反转录病毒载体颗粒也将能够转导缓慢分裂的细胞和诸如MLV的非慢病毒不能有效转导的细胞。缓慢分裂的细胞在约每3-4天内分裂一次，包括某些肿瘤细胞。尽管肿瘤含有快速分裂的细胞，但某些肿瘤细胞尤其是肿瘤中心的某些细胞很少分裂。或者，所述靶细胞可以是能够经历细胞分裂的生长停滞的细胞，诸如肿瘤块中心部分的细胞或干细胞，诸如造血干细胞或CD34阳性细胞。作为再一替代方法，所述靶细胞可以是分化细胞的前体，诸如单核细胞前体、CD33阳性细胞或骨髓前体。作为再一替代方法，所述靶细胞可以是分化细胞，诸如神经元、星形胶质细胞、神经胶质细胞、小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、精母细胞、精子细胞或精子。可以或者在从人类个体分离后在体外转导靶细胞，或者在体内直接转导靶细胞。
本发明允许在随后有效转导第二靶细胞所需的一种或多种治疗蛋白的作用位点或其附近，体内定位产生高滴度的缺陷型反转录病毒载体颗粒。这比或者采用缺陷型腺病毒载体或者采用单独的缺陷型反转录病毒载体更加有效。
本发明也允许体内在非分裂细胞或缓慢分裂的细胞中产生诸如基于MMLV的载体的反转录病毒载体。仅在诸如体外增殖的适应于组织培养的细胞的快速分裂的细胞中，或在体内的快速分裂的肿瘤细胞中，产生基于MMLV的反转录病毒载体，这在先前已经是可能的。对于将基因传递至实体瘤的细胞(其许多实体瘤细胞分裂缓慢)而言，以及对于应用非分裂细胞(诸如内皮细胞)和各种造血谱系细胞作为生产治疗蛋白产物的内源工厂而言，扩展能够产生反转录病毒载体的细胞类型的范围是有利的。
由按照本发明的载体系统传递一种或多种治疗基因的方法可以单独采用或结合其它治疗或所述治疗组分使用。
例如，本发明的反转录病毒载体可以用来传递可用于治疗WO-A-98/05635中所列疾病的一种或多种NOI。为了易于参考，现在提供部分该表：癌症、炎症和炎症疾病、皮肤病、发热、心血管效应、出血、血凝固和急性期反应、恶病质、厌食、急性感染、HIV感染、休克状态、移植物抗宿主反应、自身免疫病、再灌注损伤、脑膜炎、偏头痛和阿斯匹林依赖性抗血栓形成；肿瘤的生长、侵入和扩散、血管发生、转移、恶性腹水和恶性胸膜渗漏；脑局部缺血、局部缺血性心脏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨质疏松、哮喘、多发性硬化、神经变性、早老性痴呆、动脉粥样硬化、中风、脉管炎、节段性回肠炎和溃疡性结肠炎；牙周炎、龈炎；牛皮癣、特应性皮炎、慢性溃疡、大疱性表皮松解；角膜溃疡、视网膜病和手术伤口愈合；鼻炎、过敏性结膜炎、湿疹、过敏反应；再狭窄、充血性心力衰竭、子宫内膜异位、动脉粥样硬化或endosclerosis。
另外，或在替代方法中，本发明的反转录病毒载体可以用来传递可用于治疗WO-A-98/07859中所列疾病的一种或多种NOI。为了易于参考，现在提供部分该表：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如用于治疗免疫缺陷，包括感染人免疫缺陷病毒；调节淋巴细胞的生长；治疗癌症和许多自身免疫病，以及预防移植排斥或诱导肿瘤免疫)；调节血生成，例如治疗骨髓疾病或淋巴疾病；促进骨、软骨、腱、韧带和神经组织的生长，例如用于使伤口愈合、治疗烧伤、溃疡和牙周病及神经变性；抑制或激活促卵泡激素(调节生育力)；趋化活性(例如使特定的细胞类型移动至伤害位点或感染位点)；止血和溶解血栓活性(例如用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(用于治疗例如脓毒性休克或节段性回肠炎)；作为抗微生物药；例如代谢或行为的调节物；作为镇痛药；治疗特定的缺陷疾病；用于治疗例如牛皮癣，用于人类或兽医医学领域。
另外，或在替代方法中，本发明的反转录病毒载体可以用来传递可用于治疗WO-A-98/09985中所列疾病的一种或多种NOI。为了易于参考，现在提供部分该表：巨噬细胞抑制活性和/或T细胞抑制活性和由此的抗炎活性；抗免疫活性，即对细胞免疫应答和/或体液免疫应答的抑制效应，包括与炎症不相关的应答；抑制巨噬细胞和T细胞附着于细胞外基质组分和纤连蛋白的能力，以及向上调节T细胞中fas受体的表达；抑制不想要的免疫反应和炎症，包括关节炎，包括类风湿性关节炎、与过敏性相关的炎症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原疾病和其它自身免疫病、与动脉粥样硬化相关的炎症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心搏停止、心肌梗塞、血管炎症疾病、呼吸窘迫综合征或其它心肺疾病、与消化性溃疡、溃疡性结肠炎和其它胃肠道疾病相关的炎症、肝纤维变性、肝硬变或其它肝病、甲状腺炎、或其它腺病、肾小球性肾炎、或其它肾病和泌尿学疾病、耳炎或其它耳鼻咽疾病、皮炎或其它皮肤病、牙周病或其它牙病、睾丸炎或附睾炎(epididimo-orchitis)、不育症、睾丸创伤或其它与免疫相关的睾丸疾病、胎盘功能障碍、胎盘机能不全、习惯性流产、子痫、先兆子痫和其它与免疫和/或炎症相关的妇科疾病、后色素层炎、中色素层炎、前色素层炎、结膜炎、脉络膜视网膜炎、眼色素层视网膜炎(uveoretinitis)、视神经炎、眼内炎症例如视网膜炎或囊性斑状水肿(cystoid macular oedema)、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎、退行性fondus病的免疫和炎性组分、眼外伤的炎性组分、由感染引起的眼部炎症、增生性玻璃体-视网膜病(vitreo-retinopathies)、急性局部缺血性视神经病、例如在青光眼过滤手术后的过度瘢痕形成、针对眼植入物的免疫和/或炎性反应以及其它免疫和炎症相关的眼病、与自身免疫病相关的炎症或在中枢神经系统(CNS)或任何其它器官中免疫和/或炎症抑制将为有益的病症或障碍、Parkinson病、由治疗Parkinson病引起的并发症/或副作用、与AIDS相关的痴呆综合征、HIV相关的脑病、Devic病、Sydenham舞蹈病、早老性痴呆和CNS的其它退行性疾病、病症或障碍、中风的炎性组分、小儿麻痹后综合征、精神障碍的免疫和炎性组分、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、Guillaim-Barre综合征、Sydenham舞蹈病、重症肌无力、脑假肿瘤、Down综合征、Huntington病、肌萎缩性侧索硬化、CNS压迫或CNS外伤或CNS感染的炎性组分、肌肉萎缩和营养不良的炎性组分、以及中枢神经系统和外周神经系统的与免疫和炎症相关的疾病、病症或障碍、外伤后炎症、脓毒性休克、传染病、手术的炎症并发症或副作用、骨髓移植或其它移植并发症和/或副作用、例如由于感染病毒载体引起的基因治疗的炎症和/或免疫并发症和副作用、或与AIDS相关的炎症、为了抑制或阻止体液和/或细胞免疫应答、为了通过减少单核细胞或淋巴细胞的量来治疗或减轻单核细胞或白细胞增生性疾病例如白血病、在移植天然或人工细胞、组织或器官(诸如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人工皮肤组织)的情况下用于预防和/或治疗移植排斥。
按照本发明还提供控制一种或多种治疗NOI生产的方法，使得所述治疗NOI优先在第二靶细胞群体中表达，而在第一靶细胞中表达差或不以生物学显著水平表达。
本发明也提供用于通过基因疗法治疗个体的药用组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的本发明反转录病毒载体，所述反转录病毒载体包含一种或多种可传递治疗和/或诊断NOI或由所述反转录病毒载体产生或可得自所述反转录病毒载体的病毒颗粒。所述药用组合物可以用于人类或动物。通常，医师会确定最适于个体受治疗者的精确的剂量，所述剂量将随特定个体的年龄、体重和反应而变化。
所述组合物可以可任选地包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据计划的给药途径和标准的药物实践来选择。所述药用组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂的或除此之外的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂和可以辅助或增加病毒进入靶位点的其它载体剂(诸如脂质传递系统)。
合适时，所述药用组合物可以通过以下任何一种或多种方式给予：吸入；栓剂或子宫托形式；通常以洗剂、溶液剂、乳膏、软膏或撒布粉剂(dusting powder)形式；通过使用皮肤贴剂；口服，为含赋形剂(诸如淀粉或乳糖)的片剂形式、或单独的或结合赋形剂的胶囊或ovule形式、或含调味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或悬浮液形式；或它们可以胃肠外注射，例如经阴茎海绵体内、静脉内、肌内或皮下注射。对于胃肠外给药，所述组合物最好以无菌水溶液形式使用，所述水溶液可以含有其它物质，例如足够的盐或单糖，以使得溶液与血液等渗。对于颊或舌下给药，所述组合物可以以用常规方法配制的片剂或锭剂形式给予。
在本发明的再一方面，提供一般意义(即不必限于以上限定的本发明的上述第一方面)的用于体内基因传递的杂种病毒载体系统，所述系统系统包含一种或多种编码第二病毒载体的第一病毒载体，所述第一载体能感染第一靶细胞并在其中表达所述第二病毒载体，所述第二载体能够转导第二靶细胞。
关于该具体实施方案，本发明的基因载体因此为用于基因传递的杂种病毒载体系统，它能够从靶细胞内产生缺陷型感染性颗粒。因此，本发明的基因载体包括一种体外制造的第一载体，所述第一载体编码体内产生第二载体必需的基因。在应用中，所述第二载体携带一种或多种用于插入所述第二靶细胞的选定基因。所述选定基因可以是一种或多种标记基因和/或治疗基因。标记基因编码可选择和/或可检测蛋白。
以下是涉及本发明该特定方面的更多方面，所述内容也可应用于本发明的上述方面。
另一方面，本发明提供用一种或多种所述第一病毒载体感染、并能够产生感染性的第二病毒载体颗粒的靶细胞。
再一方面，本发明提供治疗人类和非人类哺乳动物的方法，所述方法包括如本文所述的给予杂种病毒载体系统或用一种或多种所述第一病毒载体感染的靶细胞。
一种或多种所述第一病毒载体可以是多种不同的病毒载体，诸如反转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或痘病毒载体，或在多个第一病毒载体的情况下，它们可以是不同病毒起源的载体的混合物。无论在何种情况下，所述第一病毒载体均最好是缺陷型的，因为缺陷型载体不能独立地复制。因此，它们能够进入靶细胞并传递所述第二载体序列，但并不能复制以继续感染其它靶细胞。
在所述杂种病毒载体系统包含一种以上编码所述第二载体的第一载体的情况下，两种或所有三种第一载体将用来感染第一靶细胞群体，通常是同时感染。最好有编码所述第二病毒载体所有组分的单一的第一病毒载体。
优选的单一或多种第一病毒载体是腺病毒载体。在可以从体外培养物获得的滴度方面，腺病毒载体具有优于其它病毒载体的显著优点。与有包膜病毒相比，所述腺病毒颗粒也比较稳定，因此更容易纯化和贮存。然而，目前的腺病毒载体用于体内治疗应用的主要限制，是由于来自缺陷型腺病毒载体的基因表达仅为瞬时的。因为所述载体基因组不复制，所述靶细胞的增殖导致稀释所述载体。此外，针对腺病毒蛋白产生的免疫应答，破坏甚至低水平表达所述腺病毒蛋白的细胞。
所述第二病毒载体最好是反转录病毒载体。通过在所述第一靶细胞中缺陷型病毒载体颗粒装配和包装的必需基因的表达，产生所述第二载体。因为该载体不能独立复制，因而为缺陷型的。因此，一旦所述第二反转录病毒载体已经转导了一个第二靶细胞，则它不能通过复制而传播至任何其它靶细胞。
可以由所述第一载体中DNA编码的反转录病毒载体生产的必需基因的表达，产生所述第二载体。这类基因可以包括反转录病毒的gag-pol基因、有包膜病毒的包膜基因和含一种或多种治疗基因的缺陷型反转录病毒基因组。所述缺陷型反转录病毒基因组一般含有使得能进行反转录的序列、5’长末端重复序列(LTR)的至少一部分、3’LTR的至少一部分和包装信号。
重要的是，所述第二载体对于体内使用也是安全的，因为它加入了消除重组产生能独立复制的感染性病毒的可能性的一种或多种安全特征。
为了确保所述第二载体为复制缺陷型的，可以用多个转录单位编码所述第二载体，所述转录单位可以位于单一的或位于两种或两种以上腺病毒或其它第一载体中。因此，可以有一个转录单位编码所述第二载体基因组、一个转录单位编码gag-pol，而一个转录单位编码env。或者，可以组合两种或多种这些转录单位。例如，编码gag-pol和env、或env和所述基因组的核酸序列可以组合在一个单一转录单位中。完成这一点的方法是本领域已知的。
本文所述的转录单位为含编码序列和完成那些编码序列表达的信号的核酸区，其独立于任何其它编码序列。因此，每个转录单位一般包含至少一个启动子、一个增强子和一个多腺苷酸化信号。编码所述第二载体的转录单位的启动子和增强子最好在生产所述第二病毒载体的条件下，在所述第一靶细胞中是强活性的，或能够被强烈诱导。所述启动子和/或增强子可以是组成型有效的，或其活性可以受组织限制或受时间限制。合适的组织限制启动子/增强子的实例是在肿瘤细胞中有高活性的启动子/增强子，诸如来自MUC1基因、CEA基因或5T4抗原基因的启动子/增强子。时间限制的启动子/增强子的实例是对局部缺血和/或低氧应答的启动子/增强子，诸如低氧效应元件或grp78或grp94基因的启动子/增强子。一个优选的启动子-增强子组合是人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)启动子/增强子组合。
在某些环境下，第二载体组分的低氧或局部缺血可调节表达可能特别有用。低氧是在范围广泛的不同细胞类型中基因表达的强效的调节物，并通过诱导诸如低氧诱导型因子-1(HIF-1；Wang和Semenza1993 Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：430)的低氧诱导型转录因子的活性而起作用，低氧诱导型转录因子结合于同类的DNA识别位点，即各种基因启动子上的低氧效应元件(HRE)。Dach等(1997 Nature Med 5：515)已经使用了多体形式的小鼠磷酸甘油激酶-1(PGK-1)基因的HRE(Firth等1994 Proc.Natl.Acad.Sci USA 91：6496-6500)，来在体外控制对低氧应答的人纤维肉瘤细胞的标记基因和治疗基因的表达，以及在体内控制在实体瘤中的标记基因和治疗基因的表达(Dachs等出处同上)。或者，显著的葡萄糖缺乏也存在于肿瘤的局部缺血区的事实，能被用来在肿瘤中特异性地激活异源基因的表达。已知被葡萄糖缺乏特异性激活的grp78基因启动子的截短的632个碱基对序列，也显示出能够在体内在鼠类肿瘤中驱动高水平的报道基因的表达(Gazit等1995 CancerRes.55：1660)。
以下描述可以加入到所述杂种病毒载体系统的安全特征。可以存在一种或多种这类特征。
首先，通过缺失同源区，可以避免编码所述第二载体组分的序列之间的序列同源性。同源区允许发生基因重组。在一个特定的实施方案中，用三种转录单位构建第二反转录病毒载体。第一转录单位含有在非反转录病毒启动子和增强子控制下的反转录病毒的gag-pol基因。第二转录单位含有在非反转录病毒启动子和增强子控制下的反转录病毒的env基因。第三转录单位包含在非反转录病毒启动子和增强子控制下的缺陷型反转录病毒基因组。在天然的反转录病毒基因组中，包装信号的位置使得正确起作用需要部分gag序列。通常，当由其构建反转录病毒载体系统时，包括部分gag基因在内的包装信号仍在所述载体基因组中。然而，在本发明的情况下，所述缺陷型反转录病毒基因组含有基本包装信号，它不含与所述第一转录单位中的gag序列同源的序列。此外，在反转录病毒中，例如在莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)中，在pol编码序列3’端和env 5’端之间有重叠小区。通过改变或者pol编码序列3’端的序列或者env 5’端的序列，以改变密码子用法，而不改变所编码蛋白的氨基酸序列，可以去除所述第一和所述第二转录单位之间的相应的同源性区域。
其次，通过用另一反转录病毒或另一有包膜病毒的包膜蛋白将一种反转录病毒的基因组假型化，使得避免env组分和gag-pol组分之间的同源区，可以避免有复制能力的第二病毒载体的可能性。在一个具体实施方案中，由以下三种组分构建所述反转录病毒载体。第一转录单位含有在非反转录病毒启动子和增强子控制下的反转录病毒的gag-pol基因。第二转录单位含有在非反转录病毒启动子和增强子控制下的替代有包膜病毒的env基因。第三转录单位包含在非反转录病毒启动子和增强子控制下的缺陷型反转录病毒基因组。所述缺陷型反转录病毒基因组含有基本包装信号，它不含有与所述第一转录单位中的gag序列同源的序列。
假型化可能涉及例如基于慢病毒(诸如HIV或马传染性贫血病毒(EIAV))的反转录病毒基因组，所述包膜蛋白可以例如是命名为4070A的兼嗜性包膜蛋白。或者，所述反转录病毒基因组可以基于MMLV，所述包膜蛋白可以是来自可以在所述第一靶细胞中以无毒量生产的另一病毒的蛋白，诸如流感血细胞凝集素或水泡性口腔炎病毒G蛋白。在另一替代方法中，所述包膜蛋白可以是修饰的包膜蛋白，诸如突变的或工程改造的包膜蛋白。可以制备修饰或选择修饰，以引入寻靶能力或降低毒性或用于另一目的。
第三，通过采用以特定方式构建的两种转录单位，可以消除有复制能力的反转录病毒的可能性。第一转录单位含有在第一靶细胞中有活性的启动子-增强子(诸如hCMV启动子-增强子或组织限制性启动子-增强子)控制下的gag-pol编码区。第二转录单位编码能够包装入反转录病毒颗粒中的反转录病毒基因组RNA。第二转录单位含有包装、整合和反转录所必需的反转录病毒序列，也含有有包膜病毒的env蛋白编码序列和一种或多种治疗基因的编码序列。
在一个优选实施方案中，按照本发明的杂种病毒载体系统包含单一或多种编码反转录病毒第二载体的腺病毒第一载体。用于本发明的腺病毒载体可以衍生自人腺病毒或通常不感染人类的腺病毒。所述载体最好衍生自2型腺病毒或5型腺病毒(Ad2或Ad5)、或小鼠腺病毒或鸟类腺病毒，诸如CELO病毒(Cotton等1993 J.Virol 67：3777-3785)。所述载体可以是具有复制能力的腺病毒载体，但更优选缺陷型腺病毒载体。可以通过缺失病毒复制必需的一种或多种组分，使腺病毒载体为缺陷型。通常，每个腺病毒载体含有至少一个E1区的缺失。为了产生感染性腺病毒载体颗粒，通过使病毒在诸如人293细胞系的人胚胎成纤维细胞细胞系中传代，可以互补这一缺失，其中293细胞系含有整合拷贝的Ad5的左边部分，包括E1基因。异源DNA插入到这类载体的容量可以至多为约7kb。因此，这类载体可以用来构建按照本发明的包含三种分离重组载体的系统，每种载体含有其中一个必需的转录单位以构建所述反转录病毒第二载体。
替代的腺病毒载体是本领域已知的，它们在其它腺病毒基因中含有进一步的缺失，这些载体也适用于本发明。这些第二代腺病毒载体中的数种显示出免疫原性降低(例如E1+E2缺失Gorziglia等1996 J.Virol.70：4173-4178；E1+E4缺失Yeh等1996 J.Virol.70：559-565)。延伸的缺失用来提供额外的克隆容量以将多个基因引入所述载体。例如已经描述了25kb的缺失(Lieber等1996 J.Virol.70：8944-8960)，也报道了缺失所有病毒基因的克隆载体(Fisher等1996 Virology 217：11-22)，所述载体允许引入35kb以上的异源DNA。这类载体可以用来产生按照本发明的腺病毒第一载体，所述第一载体编码用于构建所述反转录病毒第二载体的两种或三种转录单位。
所述本发明的实施方案解决了与腺病毒载体和其它病毒载体有关的一个主要问题，即来自这类载体的基因表达是瞬时的。由所述第一靶细胞产生的反转录病毒颗粒可以感染第二靶细胞，在所述第二靶细胞中的基因表达稳定地保持，因为所述反转录病毒载体基因组整合入宿主细胞基因组中。所述第二靶细胞不表达大量的病毒蛋白抗原，因此其免疫原性低于用腺病毒载体转导的细胞。
用反转录病毒载体作为所述第二载体也是有利的，因为它例如通过允许导向快速分裂细胞，而允许一定程度的细胞辨别。此外，反转录病毒的整合允许在靶组织中稳定地表达治疗基因，包括在增殖性靶细胞中的稳定地表达。
所述第一病毒载体最好优先感染某种或某些细胞类型。所述第一载体更优选为定向载体，也就是说它与天然病毒相比组织嗜性改变，使得所述载体导向特定的细胞。术语“定向载体”不必与术语“靶位点”或“靶细胞”相关连。“靶细胞”就是指是天然或定向载体能够感染或转导的细胞。
按照本发明的优选的腺病毒第一载体也最好是定向载体，其中所述载体的组织嗜性改变而不同于野生型腺病毒。可以修饰腺病毒载体，以产生例如以下描述的定向腺病毒载体：Krasnykh等1996 J.Virol70：6839-6846；Wickham等1996 J.Virol 70：6831-6838；Stevenson等1997 J.Virol 71：4782-4790；Wickham等1995 Gene Therapy 2：750-756；Douglas等1997 Neuromuscul.Disord 7：284-298；Wickham等1996Nature Biotechnology 14：1570-1573。
用于按照本发明的载体系统的第一靶细胞包括但不限于：造血细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞或任何这些细胞的祖细胞)；内皮细胞；肿瘤细胞；基质细胞；星形胶质细胞或神经胶质细胞；肌细胞；和上皮细胞。
因此，能够产生所述第二病毒载体的按照本发明的第一靶细胞可以是上述细胞类型中的任何一种。在一个优选的实施方案中，按照本发明的第一靶细胞是用一种缺陷型腺病毒载体感染的单核细胞或巨噬细胞，所述缺陷型腺病毒载体含有用于反转录病毒gag-pol的第一转录单位和能够产生可包装缺陷型反转录病毒基因组的第二转录单位。在这种情况下，至少所述第二转录单位最好处于在机体内患病位置中优先有活性的启动子-增强子的控制之下，其中所述患病位置诸如局部缺血位点或实体瘤的微环境。在本发明该方面的一个具体的优选实施方案中，构建所述第二转录单位，使得将所述基因组插入所述第二靶细胞中时，产生一个内含子，以用来降低病毒env基因的表达，并允许有效地表达治疗基因。
所述第二病毒载体也可以是定向载体。对于反转录病毒载体，这可以通过修饰所述包膜蛋白来完成。所述反转录病毒第二载体的包膜蛋白需要是无毒的包膜或可以以无毒量在所述第一靶细胞中生产的包膜，诸如MMLV兼嗜性包膜或修饰的兼嗜性包膜。在这种情况下，所述安全特征最好是缺失反转录病毒组分之间同源的区域或序列。
所述第二靶细胞群体可以与所述第一靶细胞群体相同。例如，将本发明的第一载体传递至肿瘤细胞，导致可以转导其它肿瘤细胞的其它载体颗粒的复制和产生。或者，所述第二靶细胞群体可以不同于所述第一靶细胞群体。在这种情况下，所述第一靶细胞用作被治疗个体机体内的内源工厂，产生可以感染所述第二靶细胞群体的另外的载体颗粒。例如，所述第一靶细胞群体可以是用所述第一载体体内或活体外转导的造血细胞。然后，将所述第一靶细胞传递至或迁移至机体内诸如肿瘤的位点，并产生能够转导例如实体瘤中肿瘤细胞的所述第二载体颗粒。
本发明允许在随后有效转导第二靶细胞所需的一种或多种治疗蛋白的作用位点或其附近，体内定位产生高滴度的缺陷型反转录病毒载体颗粒。这比或者采用缺陷型腺病毒载体或者采用单独的缺陷型反转录病毒载体更加有效。
本发明也允许体内在非分裂细胞或缓慢分裂的细胞中产生诸如基于MMLV的载体的反转录病毒载体。仅在诸如体外增殖的适应于组织培养的细胞的快速分裂的细胞中，或在体内的快速分裂的肿瘤细胞中，产生基于MMLV的反转录病毒载体，这在先前已经是可能的。对于将基因传递至实体瘤的细胞(许多实体瘤细胞分裂缓慢)而言，以及对于应用非分裂细胞(诸如内皮细胞)和各种造血谱系的细胞作为生产治疗蛋白产物的内源工厂而言，扩展能够产生反转录病毒载体的细胞类型的范围是有利的。
由按照本发明的载体系统传递一种或多种治疗基因的方法可以单独采用或结合其它治疗或所述治疗组分使用。可以治疗的疾病包括但不限于：癌症、神经病、遗传病、心脏病、中风、关节炎、病毒感染和免疫系统疾病。合适的治疗基因包括编码以下物质的基因：肿瘤抑制蛋白、酶、前体药物活化酶、免疫调节分子、抗体、工程免疫球蛋白样分子、融合蛋白、激素、膜蛋白、血管活性蛋白或肽、细胞因子、趋化因子、抗病毒蛋白、反义RNA和核酶。
在按照本发明的治疗方法的一个优选实施方案中，用本发明的载体系统将编码前体药物活化酶的基因传递至肿瘤，并且随后用合适的前体药物治疗所述个体。前体药物的实例包括：磷酸鬼臼亚乙苷(与碱性磷酸酶一起使用，Senter等1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：4842-4846)；5-氟胞嘧啶(与胞嘧啶脱氨酶一起使用，Mullen等1994 CancerRes.54：1503-1506)；阿霉素-N-对羟基苯氧基乙酰胺(与青霉素-V酰胺酶一起使用，Kerr等1990 Cancer Immunol.Immunother.31：202-206)；对-N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸(与羧肽酶G2一起使用)；氨基甲酸头孢菌素氮芥(与b-内酰胺酶一起使用)；SR4233(与P450还原酶一起使用)；丙氧鸟苷(与HSV胸苷激酶一起使用，Borrelli等1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：7572-7576)；与硝基还原酶一起使用的芥子前体药物(Friedlos等1997 J Med Chem 40：1270-1275)和环磷酰胺或异环磷酰胺(与细胞色素P450一起使用，Chen等1996 Cancer Res 56：1331-1340)。
按照本发明还提供一种方法，控制治疗基因的生产，使得所述治疗基因优先在所述第二靶细胞群体中表达，而在所述第一靶细胞中表达差或不以生物学显著水平表达。
按照本发明，可以使用本领域技术人员技术水平内的标准分子生物学技术。这类技术全面描述于文献中。参见例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning：a laboratory manual；Hames和Glover(1985-1997)DNA Cloning：a practical approach，第I-IV卷(第二版)；在McCafferty等(1996)“Antibody Enginnering：A Practical Approach”中给出了将免疫球蛋白基因工程改造的方法。
总之，本发明涉及适用于将一种或多种NOI引入靶细胞的新型传递系统。
在一个广义方面，本发明涉及包含一个功能性剪接供体位点和一个功能性剪接受体位点的反转录病毒载体；其中所述功能性剪接供体位点和所述功能性剪接受体位点邻接一个第一目的核苷酸序列(“NOI”)；其中所述功能性剪接供体位点位于所述功能性剪接受体位点上游；其中所述反转录病毒载体衍生自反转录病毒原载体；其中所述反转录病毒原载体包含一个能够产生所述功能性剪接供体位点的第一核苷酸序列(“NS”)和一个能够产生所述功能性剪接受体位点的第二NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游；使得所述反转录病毒载体因所述反转录病毒原载体的反转录而形成。
在再一广义方面，本发明提供用于体内基因传递的杂种病毒载体系统，所述系统包含一种或多种编码第二病毒载体的第一病毒载体，所述第一载体能够感染第一靶细胞并能在其中表达所述第二病毒载体，所述第二载体能够转导第二靶细胞。
最好是，所述第一载体可得自或基于腺病毒载体和/或所述第二病毒载体可得自或基于反转录病毒载体，最好是慢病毒载体。
现在参考以下附图，通过实施例进一步描述本发明：
图1显示反转录病毒原病毒基因组的结构；
图2显示小T剪接供体pLTR的加入；
图3显示pL-SA-N的图解说明；
图4显示缺失一个剪接供体的pL-SA-N的图解说明；
图5显示MLV pICUT的序列；
图6显示于EIAV LTR质粒的CMV/R接点处插入一个剪接供体；
图7显示将一个剪接受体插入pEGASUS-1；
图8显示从EIAV载体去除一个野生型剪接供体；
图9显示pCMVLTR+SD与pEGASUS+SA(noSD)组合，产生pEICUT-1；
图10显示pEICUT-LacZ的构建；
图11显示pEICUT-LacZ序列；
图12显示在转染和转导的细胞中所述载体的结构；
图13显示基因表达限于或者包装细胞或者转导细胞；
图14显示MLV pICUT Neo-p450载体的构建，所述载体将潮霉素的表达限于生产细胞，而将2B6(一种p450同种型)的表达限于转导细胞；
图15显示突变的env(m4070A)与来自pol基因3’端的野生型MMLV序列的序列比较；
图16显示修饰的env基因m4070A的完整序列；
图17显示限制的基因表达构成物；4070A包膜限于第一细胞；p450限于第二细胞；
图18显示使用内含子将NOI(在该实施例中为p450)的表达限于转导细胞；
图19显示转移载体pE1sp1A的图解说明；
图20显示pE1sp1A构成物的图解说明；
图21显示pE1RevE构成物的图解说明；
图22显示pE1HORSE3.1-gagpol构成物的图解说明；
图23显示pE1PEGASUS4-基因组构成物的图解说明；
图24显示pCI-Neo构成物的图解说明；
图25显示pCI-Rab构成物的图解说明；
图26显示pE1Rab构成物的图解说明；
图27a以图解说明反转录病毒载体中的天然剪接结构；
图27b以图解说明已知的反转录病毒载体中的剪接结构；
图27c以图解说明按照本发明的剪接结构；和
图28以图解说明按照本发明的双杂种病毒载体系统；
以下是略为更详细的细节：
图1显示反转录病毒原病毒基因组的结构。在该方面，诸如鼠类致癌反转录病毒的最简单的反转录病毒具有三个可读框：gag、pol和env。在gag翻译期间的移码导致pol翻译。通过所示的剪接供体(SD)和剪接受体(SA)之间的剪接，完成Env的表达和翻译。包装信号以psi表示，且仅包含于全长的转录物中-而不包含于表达env的亚基因组转录物中，其中该信号在所述剪接事件期间被去除。
图2图示将小T剪接供体加入pLTR。在此，将所述小t剪接供体序列插入LTR载体的转录起始下游，但位于R序列上游，使得反转录时(在最终的构成物中)，所述U3-剪接供体-R盒“遗传”至所述原病毒载体的5’端，并且所表达的RNA转录物在其5’末端附近含有一个剪接供体序列。
图3显示pL-SA-N的示意图。共有剪接受体(T/C)nNC/TAG-G(Mount 1982 Nucleic Acids Res 10：459-472)和分支点用下划线和粗体显示。箭头显示内含子/外显子接点。在此，将所述共有剪接受体序列插入到pLXSN的Stu1/BamH1位点。因此通过这种定位，该受体将与任何上游的剪接供体(在最终的RNA转录物中)相互作用。
图4显示构建缺失一个剪接供体的pL-SA-N的示意图。通过用以下显示的两种寡核苷酸对pL-SA-N载体进行PCR反应，将gT变为gC。然后，将所得的产物以Spe1-Asc1片段克隆入pL-SA-N中，因而用gC取代野生型剪接供体gT。Spe1和Asc1位点均以粗体显示，Spe1寡核苷酸中的突变以大写粗体显示。
图5显示MLV pICUT的序列。
图6显示于EIAV LTR质粒的CMV/R接点处插入一个剪接供体的示意图。用以下概述的两种寡核苷酸进行PCR，将所得的PCR产物以Sac1-BamH1片段克隆入CMVLTR中，并去除相当的片段。在Sac1寡核苷酸中，所述箭头指示转录起始，新的插入片段以大写显示，并将剪接供体序列下划线。R的起始以斜体显示。
图7显示将一个剪接受体插入pEGASUS-1的示意图。在此，将下述的双链寡核苷酸插入Xho1-Bpul102消化的pEGASUS-1，产生质粒pEGASUS+SA。共有剪接受体(T/C)nNC/TAG-G(Mount 1982出处同上)和分支点均以下划线和粗体显示。箭头指出内含子/外显子接点。
图8显示从EIAV载体去除一个野生型剪接供体的示意图。用下述的寡核苷酸和模板pEGASUS+SA，通过重叠PCR，去除剪接供体序列。用寡聚物1+2和寡聚物3+4进行第一个单独的PCR反应。然后洗脱出所得的扩增产物，将其混合用于第三个PCR反应。该第三反应进行10个循环后，加入寡聚物2和寡聚物4。然后将所得的产物以Sal1-Sac1片段克隆入pEGASUS+SA中，产生质粒pEGASUS+SA(noSD)。显示了所述剪接供体(SD)的位置。在寡聚物1和互补的寡聚物3中，将野生型剪接供体从GT变为GC的点突变以粗体显示。
图9显示pCMVLTR+SD与pEGASUS+SA(noSD)组合，产生pEICUT-1的示意图。在此，我们将pEGASUS+SA(noSD)的Mlu1片段插入pCMV-LTR唯一的Mlu1位点。
图10显示构建pEICUT-LacZ的示意图。这通过如下概述的将pEGASUS-1的Xhol-Bpu1102 LacZ片段插入pEICUT-1的Xhol-Bpu1102位点来进行。
图11显示pEICUT-LacZ序列。
图12显示在转染和转导的细胞中所述载体结构的示意图。在此，起始pICUT载体在剪接受体(在该实例中，所述共有剪接受体衍生自IgSA)上游不含剪接供体，因此所得的RNA转录物将不被剪接。因此，所有转录物将为含包装信号的全长转录物(A)。然而转导时，所述剪接供体(在该实例中为小T剪接的供体)“遗传”至所述原病毒载体的5’端，使得现在产生的所有RNA转录物于剪接受体(即内含子)上游均含有剪接供体，并因此完成最大剪接(B)。
图13显示基因表达限于或者包装细胞或者转导细胞的示意图。通过将新霉素ORF上游的潮霉素ORF置于MLV pEICUT中，完成在该实例中基因表达的限制(a)。用该克隆策略，所得的载体现在表达的RNA转录物，仅在转染的细胞中表达潮霉素，因为核糖体依赖于5’帽的翻译将仅有效阅读上游ORF。然而，转导时，潮霉素现在包含于功能性内含子内，并因此从成熟的转录物(b)中缺失，因此新霉素ORF现在以5’帽依赖性方式翻译。
图14显示MLV pICUT Neo-p450载体构建的示意图，所述载体将潮霉素的表达限于生产细胞，而将2B6(一种p450同种型)的表达限于转导细胞。用于该构建的起始载体为图13的pICUT载体，它含有hygo和neo两者。neo基因用完整的p450 2B6 cDNA如下取代：通过用以下引物对人肝RNA(Clontech)进行RT-PCR，获得完整的2B6 cDNA：
5’ttcgatgatcaccaccatggaactcagcgtcctcctcttccttgcac3’
5’ttcgagccggctcatcagcggggcaggaagcggatctggtatgttg3’
这产生完整的2B6 cDNA，它具有邻接仅有的BclI和NgoM1位点的最适化kosak序列。然后将该cDNA克隆入pICUT-Hyg-Neo的Bcl1-NgoM1位点，因此用p450取代Neo(参见以下(A))。以下也显示了在转染(B)和转导(C)的细胞中的所述原病毒DNA构成物。
图15是突变的env(m4070A)与来自pol基因3’端的野生型MMLV序列的序列比较。
图16是改变的4070A的完整序列。
图17显示基因限制表达的反转录病毒载体，采用该载体，在所述起始载体中表达所述第一NOI(所述4070A包膜ORF)，而仅在载体复制后表达所述第二NOI(在该实例中为p450)。在复制后，4070A基因位于功能性内含子内，因此在RNA剪接期间被去除。
图18显示一种反转录病毒表达载体，使用该载体，在复制后p450基因的5’端(补平为(flush to)剪接供体)仅在p450基因的3’端(补平为SA)上游发现，因而仅在复制后为表达的功能性p450基因(来自剪接的mRNA)。
实施例
实施例1断裂-内含子MLV载体的构建。
(i)小T剪接供体的加入：
用于该构成物的起始质粒为pLXSN(Miller等1989出处同上)；首先，用Nhe1消化该构成物，将骨架再连接，产生一个LTR(U3-R-U5)质粒。然后，将含有所述剪接供体序列的寡核苷酸插入该质粒的Kpn1-Bbe1位点之间。MLV R序列至Kpn1也包含于该寡核苷酸内，位于所述剪接供体下游。所得的质粒命名为3’LTR-SD(参见图2)。
(ii)剪接受体的加入：
用于该构成物的剪接受体序列(包括分支点-参与内含子套索形成(Aebi等1987 Trends in Genetics 3：102-107)的剪接受体上游20碱基和40碱基之间的一个A残基)衍生自免疫球蛋白重链可变区mRNA(Bothwell等1981 Cell 24：625-637)，但具有共有/最适化受体位点。这种序列信号也存在于pCI(Promega)中。首先将该受体序列作为双链寡核苷酸插入pLXSN的BanH1-Stu1位点，产生载体pL-SA-N(注意：在克隆期间SV40启动子从pLXSN中丧失)。关于克隆策略的概述请参见图3。
(iii)从pL-SA-N中去除原始剪接供体。
通过基于PCR的定点诱变，完成包含于pL-SA-N的gag序列内的剪接供体的去除。使用两种寡核苷酸，以PCR扩增跨越pL-SA-N的Asc1和Spe1特有位点的区域。在所述跨越Spe1的寡核苷酸中，也加入agGTaag至agGCaag的改变，该改变也在剪接阴性pBABE载体中发现(Morgenstern等1990出处同上)。关于克隆策略的概述请参见图4。
(iv)将pL(noSD)-SA-N与3’LTR-SD组合。
pL(noSD)SA-N质粒含有一个正常MLV衍生的3’LTR。通过从pL(noSD)SA-N取出Nhe1插入片段，并将其加入Nhe1消化的3’LTR-SD载体中，用3’LTR-SD序列取代所述3’LTR。名为pICUT(转导时产生的内含子(Intron Created Upon Transduction))的所得的质粒含有这种新一代反转录病毒载体的所有特征(关于序列信息请参见图5)。
实施例2断裂-内含子慢病毒载体的构建。
起始EIAV慢病毒表达载体的构建(也参见专利申请GB 9727135.7)。
为了构建断裂功能的慢病毒载体，起始点为名为pEGASUS-1的载体(参见专利申请GB 9727135.7)。该载体衍生自感染性原病毒EIAV克隆pSPEIAV19(登记号：U01866；Payne等1994)。其构建概述如下：首先，将通过PCR扩增的EIAV LTR克隆入pBluescript II KS+(Stratagene)中。然后插入pSEIAV19的MluI/MluI(216/8124)片段，产生pBluescript II KS+中的野生型原病毒克隆(pONY2)(图1)。然后通过去除Hind III/Hind III片段使env区缺失，产生pONY2-H。另外，缺失pol中的BglII/NcoI片段(1901/4949)，并将由HCMV IE增强子/启动子驱动的β-半乳糖苷酶基因插入其位置。该质粒命名为pONY2.10nlsLacZ。为了将EIAV序列减至759个碱基对并将第一转录物与CMV启动子分离：首先，采用以下引物，从pONY2.10LacZ PCR扩增包含EIAV多嘌呤序列段(polypurine tract)(PPT)和3’LTR的序列：
PPTEIAV+(Y8198)：GACTACG ACTAGTGTATGTTTAGAAAAACAAGG，和
3’NEGSpeI(Y8199)：CTAGGCT ACTAGTACTGTAGGATCTCGAACAG然后将PCR产物克隆入pBS II KS+的Spe1位点；其取向使得U5邻近pBluescript II KS+中的Not1。
下一步，对于报道基因盒，通过Pst1消化取出来自pONY2.10nlsLacZ的CMV启动子/LacZ，并将其克隆入pBS.3’LTR的Pst1位点，其取向使得LacZ基因邻近所述3’LTR，该载体命名为pBSCMVLacZ.3’LTR。
在表达载体pCIEneo中构建所述EIAV载体的5’区，pCIEneo为pCIneo(Promega)的衍生物，由于包含得自先前定义的全长CMV启动子5’端的约400个碱基对而被修饰。采用以下引物，用pHIT60(Snoeoka等1995 Nucleic Aicds Res 23：628-633)作为模板，经PCR扩增获得该400个碱基对的片段：
VSAT1：(GGGCTATATG AGATCTTGAATAATAAAATGTGT)和
VSAT2：(TATTAATA ACTAGT)和该产物用BglII和SpeI消化，并克隆入的pCIEneo的BglII/SpeI位点。
用以下引物，从pSEIAV扩增EIAV基因组中从R区至gag编码区的nt 150的片段(nt 268-675)：
CMV5’EIAV2：
(Z0591)(GCTACGCAGAGCTCGTTTAGTGAACC GGGCACTCAGATTCTG：
(下划线的序列退火于EIAVR区)和
3’PSI.NEG(GCTGAGC TCTAGAGTCCTTTTCTTTTACAAAGTTGG)
所得的PCR产物邻近Xba1和Sac1位点。然后，将该产物酶切，并克隆入pCIEneo的Xba1/Sac1位点。称为pCIEneo5’EIAV的所得质粒现在于CMV启动子转录起始点含有EIAVR区的起始段。然后，通过从pBS.CMVLacZ.3LTR中取出Apa1至Not1的片段，并将其克隆入Sal1-Not1消化的pCIEneo5’EIAV中(在载体和插入片段分别以Not1消化之前，将所述Sal1和Apa1位点用T4“磨光”产生平端)，将CMVLacZ/3TLR盒插入pCIEneo5’EIAV质粒中。所得的质粒命名为pEGASUS-1。
为了用作基因传递载体，pEGASUS-1需要由包装细胞以反式提供的gag/pol和env的表达。关于gag/pol源，通过将pONY2-H的MluI/Mlu I片段插入哺乳动物表达质粒pCI-neo(Promega)中，制备EIAVgagpol表达质粒(pONY3)，使得gag-pol基因由hCMV-MIE启动子-增强子表达，并不含LTR序列。对于env源；常规使用pRV583 VSV-G表达质粒。这三种载体用于关于基于MLV的载体所述的三质粒共转染中(Someoka等1995 Nucl.Acids Res.23：628-633)。在D17成纤维细胞上通常所得病毒的滴度为104-105lacZ形成单位/ml。
构建pICUT的EIAV慢病毒形式的载体，命名为pEICUT
为了构建pEICUT，首先从pEIASUS-1中去除pEIASUS-1的Xma1-SexA 1片段，用T4聚合酶将末端“平端化”，将质粒再连接，产生仅含pEGASUS-1 CMV-R-U5部分的质粒，该质粒在骨架中保留SV40-Neo盒。该质粒命名为CMVLTR。为了于CMV-R边界插入一个剪接供体，用以下在图6显示和在图6说明中概述的两种寡核苷酸进行PCR。所得的质粒命名为pCMVLTR+SD。在该EIAV形式中使用与MLV pICUT(参见上文)相同的基于免疫球蛋白的共有剪接受体。用图7所述的寡核苷酸，将该共有剪接受体插入pEGASUS-1的XhoI-Bpu1102位点，产生质粒pEGASUS+SA。通过采用图8描述的寡核苷酸和方法，用pEGASUS+SA作为模板进行重叠PCR，去除EIAV的野生型剪接供体，产生质粒pEGASUS+SA(noSD)。然后为了产生pEICUT-1，则将pEGASUS+SA(noSD)的Mlu1-Mlu1片段插入pCMVLTR+SD的仅有的Mlu1位点，产生pEICUT-1(参见图9)。然后，通过Xho1-Bpul102消化和插入，可以将LacZ从pEGASUS-1转移入pEICUT-1，产生pEICUT-Z(参见图10；对于序列信息参见图11)。
MLV和EIAV的pICUT载体均含有所述剪接供体上游的强剪接受体，因此不含功能性内含子(内含子需要位于剪接受体5’的剪接供体)。为此，当将所述载体转染入生产细胞中时，产生的所得转录物将不剪接。因此，包装信号将不丧失，结果是可完成最大的包装(参见图12)。
然而，由于反转录病毒复制的特有方式，因此，在转导时，由整合的pICUT载体产生的转录物将不同于上述转染细胞的转录物。这是因为在复制期间，3’U3启动子(直至R的5’起始)拷贝，并用作转导细胞中的5’启动子。为此，由整合的pICUT产生的转录物现在将含有强剪接受体5’端的强剪接供体，这两者均位于neo ORF上游。这类转录物将因此在5’UTR中(非翻译区)含有一个功能性内含子，并因此进行最大剪接和翻译。
上述这类载体的另一优点是，因为所述内含子仅在转导时产生，因而将基因表达限于或者包装细胞或者转导细胞是可能的。如何完成这一点的一个实例概述于图13。该策略需要克隆所述剪接受体上游的一个第二基因(在该实施例中为潮霉素)。通过取出SelctaVector Hygro(Ingenius；Oxfordshire，UK)的SalI片段上的潮霉素cDNA，并将其克隆入pICUT的Xho1位点(位于所述剪接受体上游)，而完成这一步。该载体在转染的细胞中选择性地表达潮霉素，而在转导的细胞中选择性地表达新霉素。其原因是，在任何一种mRNA转录物中，在无内部核糖体结合位点(IRES)的辅助下，仅所述第一基因由核糖体翻译。在转染的细胞中，该基因为潮霉素。然而，在转导的细胞中，因为潮霉素可读框(ORF)包含于一种功能性内含子内，所以该基因现在将从成熟mRNA转录物中去除，因此允许neo ORF翻译。
具有这类细胞特异性基因表达的载体因种种原因可能具有临床用途；作为实例，可以将抗性标记的表达局限于需要它们的生产细胞中，而不在它们可能具有免疫原性的转导细胞中表达。作为另一实例，诸如蓖麻毒蛋白的毒性基因的表达和显性负信号蛋白的表达，可以被局限于转导的细胞，在此可能需要它们来任选地使细胞生长停滞或杀伤细胞，但在这类特征阻止高滴度病毒产生的生产细胞中不表达。图14显示Neo-p450 MLV pICUT构成物，使得仅Neo在生产细胞中表达，而前体药物p450 2B6同种型在转导细胞中表达。
转导时产生内含子的另一个益处是，载体功能所需的任何必需元件现在均可以置于功能性内含子内，该内含子在转导时产生，并从转导细胞的转录物中去除。作为实例，关于MLV和慢病毒载体(lentivector)的pICUT载体，所述病毒转录物在一个内含子内含有功能性Psi包装信号(关于Psi在MLV中的位置，参见Bender等1987；关于Psi在EIAV中的位置，参见专利申请GB 9727135.7)，所述内含子在转导时产生，而从转导细胞的转录物中去除。
得自这种布置的益处包括：
(i)增强来自所得转录物的翻译，因为在存在Psi二级结构(如果有的话)的情况下，核糖体可能“一阵一阵地动(stutter)”(Krall等1996出处同上和其中引用的参考文献)。
(ii)在缺乏包装信号的情况下，防止由内源反转录病毒进行转录物包装。
(iii)当诸如gag(和其它潜在的ATG翻译起始位点)的病毒基本元件从转导细胞中表达的转录物中去除时，防止不想要的成熟前翻译起始。当EIAV和MLV pICUT载体均将包装信号延伸到gag中时，这特别有益。
(iv)可以将启动子、增强子和抑制基因置于转导时产生的内含子内，因此模仿其它转录物布置，如由CMV产生的在内含子中含有这类实体的布置(Chapman等1991出处同上)。
总之，本发明描述的新型pICUT载体系统促进以下布置：
(i)在生产细胞中进行最大包装和减少转录物的翻译。
(ii)在转导细胞中进行最大剪接，且因此进行内含子增强的转录物翻译。
(iii)将基因和/或病毒基本元件的表达局限于或者生产细胞或者转导细胞。
实施例3构建与pol基因和gag-pol转录盒具有最小同源性的MMLV兼嗜性env基因
在莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)中，env编码序列的前约60bp与pol基因的3’端序列重叠。去除这两个基因之间的同源区，以在表达这两种基因的细胞中防止它们之间重组的可能性。
如下将env编码序列的前60bp的DNA序列改变，而保留所编码蛋白的氨基酸序列。构建合成的寡核苷酸，以改变env 5’端的密码子用法(参见图15)，并将其插入如下的env的其余部分中。
用于再构建4070A基因5’端的起始质粒是pCI质粒(Promega)，其中先前已经克隆了含pHIT456(Soneoka等1995出处同上)的4070A基因的Xba1-Xba1片段，以形成pCI-4070A。用引物A和B(图15)，在pCI4070A上进行PCR反应，产生600个碱基对的产物。然后将该产物克隆到pCI-4070A的Nhe1和Xbo1位点之间。对所得构成物的Nhe1/Xho1区进行测序。尽管所得基因的氨基酸序列与原始4070A的序列相同，但去除了与pol基因的同源区。
图16给出了修饰的env基因m4070A的完整序列。用标准技术将该序列插入表达载体pCI(Promega)中。由pHIT60(Soneoka等1995出处同上)获得CMV gag-pol转录单位。
实施例4从反转录病毒包装信号缺失gag序列
采用以下寡核苷酸引物，经PCR反应，由反转录病毒载体MFG(Bandara等1993 Proc Natl Acad Sci 90：10764-10768)或MMLV原病毒DNA获得含LTR和最小功能包装信号的DNA片段：
HindIIIR：GCATTAAAGCTTTGCTCT
L523：GCCTCGAGCAAAAATTCAGACGGA该PCR片段含有MMLV核苷酸+1至+523，因此不含起始于+621的gag编码序列(编号基于MMLV的核苷酸序列，Shinnick等1981 Nature293：543-548)。
通过用HindIII和XhoI限制性酶消化，并用标准技术进行亚克隆，用所述PCR片段可构建反转录病毒基因组载体。这类载体与gag编码序列无同源性。
实施例5缺陷型反转录病毒基因组的构建
能够产生缺陷型反转录病毒基因组的转录单位示于图17。它含有以下元件：低氧调节启动子增强子，包含3个拷贝的PGK基因HRE以及缺失72bp的SV40启动子和pGL3(Promega)的重复增强子；一个含R、U5和包装信号的MMLV序列；m4070A的编码序列(实施例3)；一个剪接受体；一个用于插入治疗蛋白编码序列的克隆位点；MMLV的多嘧啶序列段；一个第二拷贝的含HRE启动子-增强子；一个剪接供体位点；和一个第二拷贝的R、U5。
在所述载体反转录并整合入第二靶细胞后，所述剪接供体立即被引入env基因的上游，从而导致将其从mRNA中剪接去除，因此仅允许治疗基因在第二靶细胞中有效地表达(参见图17)。
实施例6构建用于细胞色素P450的条件表达载体
图18显示了把细胞色素P450基因分为两半的反转录病毒表达载体cDNA编码序列的结构，该结构使得仅转导后完成了正确的剪接，才允许P450表达。因此这将表达局限于转导的细胞。
1)用于构建该载体的起始质粒为pLNSX(Miller和Rosman 1989BioTechniques 7：980-990)。通过用ALTERED SITES II诱变试剂盒(Promega)和以下序列的合成寡核苷酸，经PCR诱变使包含于pLNSX的包装信号内的天然剪接供体(...agGTaag...)(781/782位)突变：5′-caaccaccgggagGCaagctggccagcaactta-3′
2)用以下两种寡核苷酸，经PCR分离pCI表达载体(Promega)的CMV启动子：
引物1：5′-atcggctagcagatcttcaatattggccattagccatat-3′
引物2：5′-atcgagatctgcggccgcttacctgcccagtgcctcacgaccaa-3′
这产生含CMV启动子与5’Nhe1位点(引物1)和3’Not1和Xba1位点(引物2)的片段。用Nhe1和Xba1将其酶切，将其克隆入已经去除Nhe1-Nhe1片段的pLNSX中。
3)用以下引物，经RT-PCR从人肝RNA(Clontech)中分离细胞色素P450 cDNA编码序列的5’端：
引物3：5′-atcggcggccgcccaccatggaactcagcgtcctcctcttccttgcaccctagg-3′
引物4：5′-atcggcggccgcacttacCtgtgtgccccaggaaagtatttcaagaagccag-3′
这扩增了p450从ATG至残基693的5’端(从翻译起始位点编号Yamano等1989 Biochem 28：7340-7348)。在该片段的5’端(衍生自引物3)上也含有一个Not1位点和一个最佳化的“Kozak”翻译起始信号。在该序列的3’端(衍生自引物4)含有另一个Not1位点和一个共有剪接供体序列(也发现于pCI中，最初衍生自人β珠蛋白基因)，GT剪接供体对直接对着P450的残基704的位置(在引物4中互补残基以大写显示)。该片段用Not1消化，并克隆入用Not1消化的步骤2中产生的质粒中。
4)然后将步骤2克隆期间取出的Nhe1-Nhe1片段再引入步骤3的质粒中。这产生图17所述的反转录病毒载体，但缺失P450 3’端。
5)用以下引物，经RT-PCR扩增，从人肝RNA(Clontech)中分离P450编码序列的3’端：
引物5：actgtgatcataggcacctattggtcttactgacatccactttctctccacagGcaagtttacaaaacctgcaggaaatcaatgcttacatt-3′
引物6：actgatcgatttccctcagccccttcagcggggcaggaagc-3′
这产生PCR扩增的从残基705(在引物5中以大写显示)并延伸通过翻译终止密码子的P450 3’端。在该产物5’端内包含一个由引物5产生的Bcl1限制性位点和一个共有剪接受体，分支点(也发现于pCI中，最初来自免疫球蛋白基因)位于残基705的上游。于终止密码子下游的该产物的3’端包含一个由引物6产生的Cla1位点。然后将该PCR产物用Bcl1和Cla1消化，并克隆入除去Bcl1-Cla1片段的步骤3的载体中，产生图18所示的反转录病毒载体。
以下实施例描述一种腺慢病毒(adenolentiviral)系统的构建，所述系统可用来在体外或体内瞬时产生慢病毒。
第一代重组腺病毒
第一代腺病毒载体包含所述病毒的E1和E3区缺失，允许插入外源DNA，通常插入该病毒左臂，邻近左反向末端重复序列(ITR)。病毒包装信号(194-358nt)与E1a增强子重叠，因此存在于大多数E1缺失的载体中。该序列可以易位至病毒基因组的右端(Hearing和Shenk，1983 Cell 33：59-74)。因此，在E1缺失载体中，可以缺失3.2kb(358-3525nt)。
腺病毒能够包装105％长度的基因组，因此允许加入额外的2.1kb。因此，在E1/E3缺失病毒载体中，其克隆容量变为7-8kb(2.1kb+1.9kb(除去E3)+3.2kb(除去E1))。因为所述重组腺病毒缺乏必需的E1早期基因，所以它不能在非E1互补细胞系中复制。293细胞系由Graham等研制(1977 J Gen Virol 36：59-74)，含有来自Ad5基因组左端的约4kb，包括ITR、包装信号、E1a、E1b和pIX。所述细胞稳定地表达E1a和E1b基因产物，但即使pIX序列在E1b内，也不表达晚期蛋白IX。在非互补细胞中，E1缺失病毒转导所述细胞，并被转运至细胞核，但没有来自E1缺失基因组的表达。
第一代腺病毒生产系统
Microbix Biosystems-nb1 Gene Science
图19中的图解显示采用microbix系统用来产生重组腺病毒的一般策略。
所述一般策略涉及将外源DNA克隆入E1穿梭载体，其中402-3328bp的E1区被所述外源DNA盒取代。然后，将所述重组质粒与pJM17质粒一起共同转染入293细胞。pJM17含有E3区的缺失和于3.7图谱单位的E1区中的原核pBRX载体的插入(包括氨苄青霉素抗性序列和细菌ori序列)。因此，该40kb质粒太大而不能包装入腺核壳中，但可以在细菌中增殖。在293细胞中的细胞内重组，导致外源DNA插入片段取代ampr和ori序列。
实施例7构建转移质粒用于产生含EIAV组分的腺病毒
为了产生慢病毒载体，需要制造四种腺病毒：基因组、gagpol、包膜(狂犬病G)和Rev。由异源启动子表达慢病毒组分，它们含有内含子(需要时(用于高表达gagpol、Rev和狂犬病包膜))以及多腺苷酸化信号。当将这四种病毒转导入E1a-细胞中时，所述腺病毒组分将不表达，但异源启动子将允许表达慢病毒组分。以下(例1)概述一个构建EIAV腺病毒系统的实例(申请号：9727135.7)。所述EIAV基于缺乏任何非必需EIAV编码蛋白(S2、Tat或包膜)的基本系统。用来使所述EIAV假型化的包膜是狂犬病包膜(G蛋白)。已经表明这很好地使EIAV假型化(申请号：9811152.9)。
转移质粒
以下描述含EIAV组分的转移质粒的构建。所述转移质粒为pE1sp1A(图20)。
所述重组转移质粒可以用来通过在293细胞中的同源重组，来制备重组腺病毒。
附上以下质粒的图解说明。
A)pE1RevE-Rev构成物
用Apa LI和Cla I切割质粒pCI-Rev。用Klenow聚合酶将编码EIAV Rev的2.3kb带平端化，并将其插入pE1sp1A的Eco RV位点，产生质粒pE1RevE(图21)。
B)pE1HORSE3.1-gagpol构成物
用Sna BI和Not I切割pHORSE3.1。将编码EIAV gagpol的6.1kb带插入用Sna BI和Not I切割的pE1 RevE(纯化7.5kb带)。这产生质粒pE1HORSE3.1(图22)。
C)pE1PEGASUS-基因组构成物
用Bgl II和Not I切割pEGASUS4。将含有EIAV载体基因组的6.8kb带插入用Bgl II和Not I切割的pE1RevE(纯化6.7kb带)。这产生质粒pE1PEGASUS(图23)。
D)pCI-Rab-狂犬病构成物
为了制备pE1Rab，通过用Nsi I和Ahd I切割质粒pSA91RbG，将狂犬病可读框插入pCI-Neo(图24)中。用T4DNA聚合酶将1.25kb带平端化，并将其插入用Sma I切割的pCI-Neo中。这产生质粒pCI-Rab(图25)。
F)pE1Rab-狂犬病构成物
用Sna BI和Not I切割pCI-Rab。将编码狂犬病包膜的1.9kb带插入用Sna BI和Not I切割的pE1RevE(纯化7.5kb带)。这产生质粒pE1Rab(图26)。
概要
本发明涉及适用于将一种或多种NOI引入靶细胞的新型传递系统。
在一个优选方面，本发明包括包含一个功能性剪接供体位点和一个功能性剪接受体位点的反转录病毒载体；其中所述功能性剪接供体位点和所述功能性剪接受体位点邻接一个第一目的核苷酸序列(“NOI”)；其中所述功能性剪接供体位点位于所述功能性剪接受体位点上游；其中所述反转录病毒载体衍生自反转录病毒原载体；其中所述反转录病毒原载体包含一个能够产生所述功能性剪接供体位点的第一核苷酸序列(“NS”)和一个能够产生所述功能性剪接受体位点的第二NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游；使得所述反转录病毒载体因所述反转录病毒原载体的反转录而形成。
换句话说，该方面包括一种新型传递系统，所述系统包含一种或多种邻接一个功能性SD和SA的NOI，条件是该系统已经由原载体产生，在原载体中，所述SD和SA的顺序反转，使得所述剪接无功能。
本发明的该方面可称为“断裂-内含子”方面。图27c中提供了显示本发明该方面的示意图。相比之下，图27a和图27b显示已知反转录病毒载体中的剪接结构。
本发明的另一广义方面包括一种新型传递系统，所述系统包含能够包装一种或多种慢病毒载体组分的一种或多种腺病毒载体组分，其中所述慢病毒载体任选地包含一个断裂内含子结构。
一般而言，本发明的该方面可以称为杂种病毒载体系统。在该特定情况下，腺病毒组分和慢病毒组分的组合可以称为双杂种病毒载体系统。
图28提供了显示本发明该方面的示意图。
本文讨论了本发明的这些方面和其它广义方面。
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用结合到本文中。在不偏离本发明范围和精神的情况下进行的本发明所述方法和系统的各种修改和变化，对本领域技术人员而言是显而易见的。尽管本发明已经结合具体优选实施方案进行了描述，但应该理解，要求保护的本发明不应过度限于这类具体实施方案。实际上，对分子生物学相关领域技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改，均属于以下权利要求书的范围。
序列表
SEQ ID NO.1
GCTAGCTTAAGTAACGCCACTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAAAAGTTCAGATCAAGG
TCAGGAACAAAGAAACAGCTGAATACCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCGGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCA
AGAACAGATGAGACAGCTGAGTGATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCGGGG
CCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGTGAATCATCAGATGTTTCCAGGGT
GCCCCAAGGACCTGAAAATGACCCTGTACCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGC
GCGCTTCCGCTCTCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCTTCCGATAGACTG
CGTCGCCCGGGTACCCGTATTCCCAATAAAGCCTCTTGCTGTTTGCATCCGAATCGTGGTCTCGCTGTTCCTT
GGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCACGACGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATTTGGA
GACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGCAAGCTGGCCAGCAACTTATCTGTGTCTGTCCGAT
TGTCTAGTGTCTATGTTTGATGTTATGCGCCTGCGTCTGTACTAGTTAGCTAACTAGCTCTGTATCTGGCGGA
CCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCTGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTTGGGGGCCG
TTTTTGTGGCCCGACCTGAGGAAGGGAGTCGATGTGGAATCCGACCCCGTCAGGATATGTGGTTCTGGTAGGA
GACGAGAACCTAAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGAACCGAAGCCGCGCGTCTT
GTCTGCTGCAGCGCTGCAGCATCGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAAAATTA
GGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAAC
CAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGAT
GGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTGGCCCGCA
TGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCAAG
CCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTT
CGACCCCGCCTCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCGGAATTCGTTAACTCGAGGA
TCTAACCTAGGTCTCGAGTGTTTAAACACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCA
CCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGG
GCTGCAGGTCGAGGCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGC
ACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTC
TGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCC
CTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGC
TCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATC
TCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCT
ACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCG
ATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCAT
GCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGC
TTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTG
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GCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGATAAAATAAAAG
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CGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGG
AACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGAT
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CCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCGTTAACACTAGTAAGCTTGCTCTAAGGT
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TCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTC
AGCGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATCGGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCG
GGAGGTAAGCTGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGAC
GGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGG
TGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGA
GCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATC
AGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTC
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TAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGC
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TTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGG
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GCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCC
GGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTC
CGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTAC
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CGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGC
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ACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGA
AGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAAT
ATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACA
AATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTA
ACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTCATACCAGATCACCGAAAACTGTCCT
CCAAATGTGTCCCCCTCACACTCCCAAATTCGCGGGCTTCTGCCTCTTAGACCACTCTACCCTATTCCCCACA
CTCACCGGAGCCAAAGCCGCGGCCCTTCCGTTTCTTTGCTTTTGAAAGACCCCACCCGTAGGTGGCAA
SEQ TD NO.2
TGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTTTGAGATTTCTGTCGCCGACTAAATTCATGTCGCGC
GATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGAGATGGCGATATTGGAAAAATTGATATTTGAAAATATGGCATATTGAAA
ATGTCGCCGATGTGAGTTTCTGTGTAACTGATATCGCCATTTTTCCAAAAGTGATTTTTGGGCATACGCGATA
TCTGGCGATAGCGCTTATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTTGGGCGATTCTGTGTG
TCGCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCTATATCGCCGATAGAGGCGACATCAAGC
TGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTGAATCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTA
TATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCGTAATATGTACATTTATATT
GGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGT
CATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCC
CAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGA
CGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGC
CCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCC
TACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGG
CGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGC
ACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGT
AGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGA
GTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTG
TCTGTTCGAGATCCTACAGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGG
CTGATCGTAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTCCTGGCCAGAACAC
AGGAGGACAGGTAAGATGGGAGACCCTTTGACATGGAGCAAGGCGCTCAAGAAGTTAGAGAAGGTGACGGTAC
AAGGGTCTCAGAAATTAACTACTGGTAACTGTAATTGGGCGCTAAGTCTAGTAGACTTATTTCATGATACCAA
CTTTGTAAAAGAAAAGGACTCTAGAGTCGACCCCCTCGACGTTTAAACACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGA
CTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTCACGTGA
AGCTAGCCTCGAGGATCTGCGGATCCGGGGAATTCCCCAGTCTCAGGATCCACCATGGGGGATCCCGTCGTTT
TACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAG
CTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGC
TTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTG
TCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTAC
GGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGC
TGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGC
GCTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGA
AAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGTTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATG
AGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTC
GCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCT
ACGGGTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAATT
ATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCG
CCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGC
CTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATT
CGAGGCGTTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATA
TCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTGGTACAC
GCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAAT
CGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTA
ATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCG
CTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGAT
ATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAA
AATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCT
TGGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGG
GTGGATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATA
CGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGACGGA
AGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTG
TTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAG
TGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGG
GCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCC
TGGCAGCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGA
CCACCAGCGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCT
TTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACCGCTG
GATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGG
GCCATTACCAGGCCGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGAC
CGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGT
CAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCC
AGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTAC
TGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAAC
GGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAACATCA
GCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGCGGAAGAAGGCACATGGCT
GAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAG
CTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAATAATAACCGGGCAGGGGGGATCCGC
AGATCCGGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCA
AAGCATGCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTGTATGTTTAGAAAAACAAGGGGGGAACTGTGGGGTTTTTAT
GAGGGGTTTTATAAATGATTATAAGAGTAAAAAGAAAGTTGCTGATGCTCTCATAACCTTGTATAACCCAAAG
GACTAGCTCATGTTGCTAGGCAACTAAACCGCAATAACCGCATTTGTGACGCGAGTTCCCCATTGGTGACGCG
TTTTGAGATTTCTGTCGCCGACTAAATTCATGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGAGATGGCGATA
TTGGAAAAATTGATATTTGAAAATATGGCATATTGAAAATGTCGCCGATGTGAGTTTCTGTGTAACTGATATC
GCCATTTTTCCAAAAGTGATTTTTGGGCATACGCGATATCTGGCGATAGCGCTTATATCGTTTACGGGGGATG
GCGATAGACGACTTTGGTGACTTGGGCGATTCTGTGTGTCGCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGAC
GATATGAGGCTATATCGCCGATAGAGGCGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTG
AATCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGC
ATACGTTGTATCCATATCGTAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTG
ATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTT
ACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGT
ATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCA
CTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCC
TGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTA
TTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAG
TCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAAGGGGACTTTCCAAAATGTCGTAAC
AACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGC
TCGTTTAGTGAACCGACTTAAGTCTTCCTGCAGGGGCTCTAAGGTAAATAGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTG
AGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTT
GTCTGTTCGAGATCCTACAGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTG
GCTGATCGTAGGATCCCCGGCCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATG
CATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCG
CCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCT
ATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGATTCTTCTGACACAACA
GTCTCGAACTTAAGGCTAGAGCCACCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGT
GGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCA
GCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAG
CGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAG
GGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTA
TCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGA
AACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCA
TCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTG
ACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCC
GGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGA
ATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTT
CTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACG
ATGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGCGATAAG
GATCGATCCGCGTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCC
GCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTC
TCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATAC
GCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGT
GCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGA
TAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTT
TTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTT
GGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAA
CGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAG
AGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCT
TACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTA
CTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCC
TTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAAT
GGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGG
ATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAAT
CTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGT
AGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCA
CTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTT
AATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTT
CCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGC
TGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTC
CGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCA
CTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGC
GATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGG
GGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATG
AGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAG
CGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTG
AGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACG
GTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGGCTCGACAGATCT
SEQ ID NO.3
参见图16
<110>Oxford Biomedica(UK)Limited
<120>载体
<130>4644wo
<140>
<141>
<160>20
<170>Patentln Ver.2.0
<210>1
<211>5689
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核酸
<400>1
gctagcttaa gtaacgccac tttgcaaggc atggaaaaat acataactga gaatagaaaa    60
gttcagatca aggtcaggaa caaagaaaca gctgaatacc aaacaggata tctgtggtaa    120
gcggttcctg ccccggctca gggccaagaa cagatgagac agctgagtga tgggccaaac    180
aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcggggc caagaacaga tggtccccag    240
atgcggtcca gccctcagca gtttctagtg aatcatcaga tgtttccagg gtgccccaag    300
gacctgaaaa tgaccctgta ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg    360
ttcgcgcgct tccgctctcc gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggcgcgc    420
cagtcttccg atagactgcg tcgcccgggt acccgtattc ccaataaagc ctcttgctgt    480
ttgcatccga atcgtggtct cgctgttcct tgggagggtc tcctctgagt gattgactac    540
ccacgacggg ggtctttcat ttgggggctc gtccgggatt tggagacccc tgcccaggga    600
ccaccgaccc accaccggga ggcaagctgg ccagcaactt atctgtgtct gtccgattgt    660
ctagtgtcta tgtttgatgt tatgcgcctg cgtctgtact agttagctaa ctagctctgt    720
atctggcgga cccgtggtgg aactgacgag ttctgaacac ccggccgcaa ccctgggaga    780
cgtcccaggg actttggggg ccgtttttgt ggcccgacct gaggaaggga gtcgatgtgg    840
aatccgaccc cgtcaggata tgtggttctg gtaggagacg agaacctaaa acagttcccg    900
cctccgtctg aatttttgct ttcggtttgg aaccgaagcc gcgcgtcttg tctgctgcag    960
cgctgcagca tcgttctgtg ttgtctctgt ctgactgtgt ttctgtattt gtctgaaaat    1020
tagggccaga ctgttaccac tcccttaagt ttgaccttag gtcactggaa agatgtcgag    1080
cggatcgctc acaaccagtc ggtagatgtc aagaagagac gttgggttac cttctgctct    1140
gcagaatggc caacctttaa cgtcggatgg ccgcgagacg gcacctttaa ccgagacctc    1200
atcacccagg ttaagatcaa ggtcttttca cctggcccgc atggacaccc agaccaggtc    1260
ccctacatcg tgacctggga agccttggct tttgaccccc ctccctgggt caagcccttt    1320
gtacacccta agcctccgcc tcctcttcct ccatccgccc cgtctctccc ccttgaacct    1380
cctcgttcga ccccgcctcg atcctccctt tatccagccc tcactccttc tctaggcgcc    1440
ggaattcgtt aactcgagga tctaacctag gtctcgagtg tttaaacact gggcttgtcg    1500
agacagagaa gactcttgcg tttctgatag gcacctattg gtcttactga catccacttt    1560
gcctttctct ccacaggtga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgggctg caggtcgagg    1620
cggatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca    1680
cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac    1740
aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt    1800
tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc    1860
gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg    1920
aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc    1980
tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc    2040
ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat    2100
ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc    2160
cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca    2220
tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga    2280
ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat    2340
tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc    2400
tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact    2460
ctggggttcg ataaaataaa agattttatt tagtctccag aaaaaggggg gaatgaaaga    2520
ccccacctgt aggtttggca agctagctta agtaacgcca ttttgcaagg catggaaaaa    2580
tacataactg agaatagaga agttcagatc aaggtcagga acagatggaa cagctgaata    2640
tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga    2700
tggaacagct gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc    2760
agggccaaga acagatggtc cccagatgcg gtccagccct cagcagtttc tagagaacca    2820
tcagatgttt ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac    2880
caatcagttc gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag    2940
cccacaaccc ctcactcggg gcgccgttaa cactagtaag cttgctctaa ggtaaatatg    3000
tcgacaggcc tgcgccagtc ctccgattga ctgagtcgcc cgggtacccg tgtatccaat    3060
aaaccctctt gcagttgcat ccgacttgtg gtctcgctgt tccttgggag ggtctcctct    3120
gagtgattga ctacccgtca gcgggggtct ttcatttggg ggctcgtccg ggatcgggag    3180
acccctgccc agggaccacc gacccaccac cgggaggtaa gctggctgcc tcgcgcgttt    3240
cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct    3300
gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg    3360
tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat    3420
gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga    3480
tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg    3540
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta    3600
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc    3660
aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag    3720
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac    3780
caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc    3840
ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt    3900
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc    3960
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga    4020
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta    4080
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta    4140
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga    4200
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg    4260
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag    4320
tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc    4380
tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact    4440
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt    4500
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta    4560
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta    4620
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc    4680
gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat    4740
agtttgcgca acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt    4800
atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg    4860
tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca    4920
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta    4980
agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg    5040
cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact    5100
ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg    5160
ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt    5220
actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga    5280
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caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt    5460
attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa    5520
ttcataccag atcaccgaaa actgtcctcc aaatgtgtcc ccctcacact cccaaattcg    5580
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<210>2
<211>9756
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核酸
<400>2
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gtatccatat cgtaatatgt acatttatat tggctcatgt ccaacattac cgccatgttg    540
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ttaatgttga tgaaagctgg ctacaggaag gccagacgcg aattattttt gatggcgtta    2160
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<210>3
<211>1964
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核酸
<400>3
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<210>4
<211>63
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<220>
<223>人工序列的描述：核酸
<400>4
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ccc                                                                  63
<210>5
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核酸
<400>5
atggccagaa gcaccctgag caagccaccc caggacaaaa atccctggaa acctctgatc    60
gtc                                                                  63
<210>6
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>6
tattaataac tagt                                                     14
<210>7
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>7
gctacgcaga gctcgtttag tgaaccgggc actcagattc tg                     42
<210>8
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>8
gctgagctct agagtccttttcttttacaa agttgg                                36
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>9
gcattaaagc tttgctct                                                   18
<210>10
<211>24
<21 2>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>10
gcctcgagca aaaattcaga cgga                                            24
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>11
caaccaccgg gaggcaagct ggccagcaac tta                                  33
<210>12
<211>39
<21 2>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>12
atcggctagc agatcttcaa tattggccat tagccatat                            39
<210>13
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>13
atcgagatct gcggccgctt acctgcccag tgcctcacga ccaa                     44
<210>14
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>14
atcggcggcc gcccaccatg gaactcagcg tcctcctctt ccttgcaccc tagg          54
<210>15
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>1 5
atcggcggcc gcacttacct gtgtgcccca ggaaagtatt tcaagaagcc ag            52
<210>16
<211>92
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>16
actgtgatca taggcaccta ttggtcttac tgacatccac tttctctcca caggcaagtt    60
tacaaaacct gcaggaaatc aatgcttaca tt                                  92
<210>17
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>17
actgatcgat ttccctcagc cccttcagcg gggcaggaag c                        41
<210>18
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>18
gactacgact agtgtatgtt tagaaaaaca agg                                  33
<210>19
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>19
ctaggctact agtactgtag gatctcgaac ag                                   32
<210>20
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>20
gggctatatg agatcttgaa taataaaatg tgt                                  33

Claims (36)

1.一种反转录病毒载体，包括
一个功能性剪接供体位点和
一个功能性剪接受体位点，其中所述功能性剪接供体位点和功能性剪接受体位点位于第一目的核苷酸序列(NOI)的两侧；其中所述功能性剪接供体位点位于所述功能性剪接受体位点的上游；其中所述反转录病毒载体衍生自反转录病毒原载体；其中所述反转录病毒原载体包含一个能产生所述功能性剪接供体位点的第一核苷酸序列(NS)和
一个能产生所述功能性剪接受体位点的第二NS；其中第一NS位于第二NS的下游；其中第一NS位于反转录病毒原载体的3’U3区，或位于3’U3区和3’R区之间，从而使得所述反转录病毒载体因所述反转录病毒原载体的反转录而形成，因为在反转录过程中，第一NS的一个拷贝从反转录病毒原载体的3’U3-R区转位到反转录病毒载体的5’-长末端重复序列(5’LTR)。
2.根据权利要求1的反转录病毒载体，其中所述反转录病毒原载体包含一个位于所述第二核苷酸序列上游的第三NS；其中所述第三NS能够产生非功能性剪接供体位点。
3.根据权利要求2的反转录病毒载体，其中所述反转录病毒载体还包含一个第二NOI；其中所述第二NOI位于所述功能性剪接受体位点的下游。
4.根据权利要求3的反转录病毒载体，其中所述反转录病毒原载体包含所述第二NOI，其中所述第二NOI位于所述第二核苷酸序列下游。
5.根据权利要求4的反转录病毒载体，其中所述第二NOI或其表达产物为治疗剂或诊断剂或包含治疗剂或诊断剂。
6.根据权利要求1的反转录病毒载体，其中所述第一NOI或其表达产物为或包含任何一种或多种赋予选择性的因子、病毒必需元件或其部分或它们的组合。
7.根据权利要求1的反转录病毒载体，其中所述反转录病毒原载体的所述3’U3区和/或所述第一NS包含一个为第三NOI的NS；其中所述NOI为转录控制元件、编码序列或其部分的任何一种或多种。
8.根据权利要求1的反转录病毒载体，其中所述第一NS得自病毒。
9.根据权利要求8的反转录病毒载体，其中所述第一NS为内含子或其部分。
10.根据权利要求9的反转录病毒载体，其中所述内含子得自SV40病毒的小t-内含子。
11.根据权利要求1的反转录病毒载体，其中所述反转录病毒原载体包含一个反转录病毒包装信号；并且其中所述第二NS位于所述反转录病毒包装信号下游，使得防止于第一靶位点进行剪接。
12.根据权利要求1的反转录病毒载体，其中所述第二NS位于所述第一NOI下游，使得所述第一NOI能够于第一靶位点表达。
13.根据权利要求1的反转录病毒载体，其中所述第二NS置于一个多克隆位点上游，使得可以插入一种或多种额外的NOI。
14.根据权利要求1的反转录病毒载体，其中所述第二NS为编码免疫分子或其部分的核苷酸序列。
15.根据权利要求14的反转录病毒载体，其中所述免疫分子为免疫球蛋白。
16.根据权利要求15的反转录病毒载体，其中所述第二NS为编码免疫球蛋白重链可变区的核苷酸序列。
17.根据权利要求1的反转录病毒载体，其中所述载体还包含一种功能性内含子。
18.根据权利要求17的反转录病毒载体，其中所述功能性内含子被置于使得它能够将至少一种所述的NOI的表达限于所需靶位点的位置。
19.根据权利要求1的反转录病毒载体，其中所述靶位点为一种细胞。
20.根据权利要求1的反转录病毒载体，其中所述反转录病毒载体是鼠类致癌反转录病毒载体或慢病毒载体，其中所述反转录病毒原载体是鼠类致癌反转录病毒原载体或慢病毒原载体。
21.根据权利要求21的反转录病毒载体，其中所述反转录病毒载体是MMLV、MSV、MMTV或EIAV反转录病毒载体，并且其中的反转录病毒原载体是MMLV、MSV、MMTV或EIAV反转录病毒原载体。
22.权利要求1-5任一项的反转录病毒载体，其中所述反转录病毒载体被整合进宿主DNA中。
23.得自根据权利要求1-22任一项的反转录病毒载体的反转录病毒颗粒。
24.用根据权利要求1-22中任一项的反转录病毒载体或根据权利要求23的反转录病毒颗粒转染或转导的细胞。
25.权利要求1-22中定义的反转录病毒原载体。
26.能够将一种或多种NOI的表达限于所需靶位点的功能性内含子的用途，其中所述功能性内含子是由权利要求1-22任一项的反转录病毒传递的。
27.反转录酶反转录反转录病毒原载体以形成权利要求1的反转录病毒载体的用途，其中反转录酶将第一NS从反转录病毒原载体的3’端传递至反转录病毒载体的5’端。
28.用于体内基因传递的杂种病毒载体系统，所述系统包含一种或多种编码第二病毒载体的第一病毒载体，所述第一载体能够感染第一靶细胞并在其中表达所述第二病毒载体，所述第二载体能够转导第二靶细胞，其中第一病毒载体包括反转录病毒原载体，而第二病毒载体包括权利要求1-22中任一项的反转录病毒载体。
29.根据权利要求28的杂种病毒载体系统，其中所述第一载体得自或基于腺病毒载体和/或所述第二病毒载体得自或基于反转录病毒载体。
30.根据权利要求29的杂种病毒载体系统，其中所述第二病毒载体得自或基于慢病毒载体。
31.根据权利要求29的杂种病毒载体系统的用途，其中所述反转录病毒载体具有断裂-内含子结构。
32.权利要求29的杂种病毒载体系统，其中所述反转录病毒载体包含断裂-内含子结构或能够传递断裂-内含子结构。
33.用于体内基因传递的慢病毒载体系统，其中所述系统包含断裂-内含子结构或能够传递断裂-内含子结构，并且其中该系统包括一种或多种编码第二载体的第一慢病毒载体，所述第一慢病毒载体能够感染第一靶细胞并在其中表达所述第二载体，所述第二载体能够转导第二靶细胞，其中所述慢病毒载体系统包括第一病毒载体和第二病毒载体，第一病毒载体包括反转录病毒原载体，而第二病毒载体包括权利要求1的反转录病毒载体。
34.用于体内传递基因的腺病毒载体系统，其中所述系统包含断裂-内含子结构或能够传递断裂-内含子结构，并且其中该系统包括一种或多种编码第二载体的第一腺病毒载体，所述第一腺病毒载体能够感染第一靶细胞并在其中表达所述第二载体，所述第二载体能够转导第二靶细胞，其中所述腺病毒载体系统包括第一病毒载体和第二病毒载体，第一病毒载体包括反转录病毒原载体，而第二病毒载体包括权利要求1的反转录病毒载体。
35.用于制备权利要求29和/或34的腺病毒载体的基于或得自以下任何一种或多种实体的载体或质粒：pE1sp1A、pCI-Neo、pE1RevE、pE1HORSE3.1、pE1PEGASUS4、pCI-Rab、pE1Rab。
36.用于体内基因传递的杂种病毒载体系统，其中所述杂种病毒载体系统包含一个第一病毒载体和一个第二病毒载体，所述第一病毒载体包含权利要求1中限定的反转录病毒原载体，而所述第二病毒载体包含权利要求1的反转录病毒载体。
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