ES2281369T3 - Vectores basados en el virus de la inmunodeficiencia bovina recombinante (biv). - Google Patents

Abstract

Célula huésped humana in vitro que comprende un sistema de vector, donde dicho sistema de vector comprende: a) un segmento de ADN de un genoma BIV, una secuencia de empaquetamiento para empaquetar ARN en viriones; un promotor unido operativamente al segmento de ADN; y un transgen; b) un constructo de empaquetamiento BIV que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia codificadora gag/pol de BIV, una señal de poliadenilación en el extremo 3'' de la secuencia codificadora gag/pol y opcionalmente uno o más de los siguientes elementos: (i) un intrón heterólogo, (ii) un elemento de transporte de ARN y (iii) una secuencia codificadora de Rev; y c) un constructo de expresión que comprende un gen que codifica una proteína de superficie vírica.

Description

Vectores basados en el virus de la inmunodeficiencia bovina recombinante (BIV).

Estado de la técnica anterior a la invención

La presente invención se refiere en general a la utilización de virus recombinantes como vectores y más específicamente a constructos de vectores basados en el virus de la inmunodeficiencia bovina recombinante (BIV), capaces de expresar una proteína deseada en células diana.

La utilización de vectores de virus recombinantes en una diversidad de aplicaciones, incluyendo, por ejemplo, la terapia génica, requiere que el virus no sea capaz de replicarse en las células diana para evitar la posibilidad de proliferación incontrolada de virus o de las células. Además de las cuestiones de seguridad, el sistema de vector de virus recombinante debe ser eficiente y preciso.

Los retrovirus se han utilizado como vectores para mediar la transferencia génica en células eucariotas. Los retrovirus son virus de ARN que incluyen las subfamilias de los lentivirus, los espumavirus y los oncovirus. Dichos virus pueden replicarse e integrarse en un genoma de una célula huésped mediante un intermedio de ADN, generalmente denominado provirus.

Los vectores víricos se construyen generalmente de tal manera que la mayoría de los genes víricos se delecionan y se reemplazan por un gen de interés. En el caso más frecuente, el gen de interés se transcribe bajo el control de las secuencias reguladoras víricas que se encuentran en la secuencia de repetición terminal larga (LTR). Alternativamente, el gen de interés puede expresarse bajo la regulación de su propio promotor interno. Generalmente, uno o más constructos asistentes o constructos de empaquetamiento en una línea celular de empaquetamiento proporcionan los genes del vector que se han delecionado (Bender et al., J. Virol., 61: 1639-1649 (1987) y Millar et al., Biotechniques, 7: 980-990 (1989)). Véase también Markowitz et al., J. Virol. 62: 1120-1124 (1988) donde las porciones complementarias del constructo asistente se han dividido en dos constructos separados. La línea celular de empaquetamiento puede transfectarse con el vector retrovírico, produciendo de esta manera un vector de ARN que se empaqueta en las partículas víricas. Dichas partículas de virus liberadas son defectivas para la replicación y pueden utilizarse para distribuir a células diana el vector retrovírico que lleva un gen heterólogo de interés. La patente WO99/15641 describe sistemas de vectores lentivíricos de especies diferentes de primate, en particular FIV. La solicitud de patente US-A-5,380,830 describe clones moleculares de BIV. Sutton et al., J. Virol., 1998, 72: 5781-5788 describe la transducción de células madre hematopoyéticas con vectores HIV-1.

Para aumentar la seguridad, la eficiencia y la precisión de los sistemas de vectores recombinantes, se han construido diferentes sistemas recombinantes mejorados. Un tipo de mejora incluye hacer células de empaquetamiento más seguras que se regeneran mediante deleciones en la secuencia de repetición 3' terminal larga (LTR). Otras mejoras incluyen aumentar el rango de huéspedes reemplazando un gen vírico env con otro gen vírico env, creando de esta manera una línea productora híbrida que genera virus asistentes pseudotipados. Más específicamente, al HIV se le ha conferido un rango celular huésped extendido pseudotipado con los virus no relacionados VSV y HSV (Zhu et al., J. AIDS, 3: 215-219 (1990) y Naldini et al., Science, 272: 263-267 (1996)). Se han realizado más mejoras utilizando regiones codificadoras víricas mínimas en el vector. Adicionalmente, la mayoría de las líneas celulares de empaquetamiento que se utilizan actualmente se han transfectado con plásmidos separados, cada uno de ellos conteniendo una de las secuencias codificadoras necesarias, de manera que es necesario que tengan lugar eventos de recombinación múltiple antes de poder producirse un virus competente para la replicación.

En contraste con los vectores derivados de oncovirus, los lentivirus pueden infectar células que no se encuentran en estadio de división. Dicha propiedad es especialmente útil para la terapia génica in vivo.

El BIV generalmente no infecta células humanas y por lo tanto, la utilización de un esqueleto genómico de BIV en los vectores de la presente invención supera las dificultades del empaquetamiento previo de las líneas celulares y además proporciona otras ventajas relacionadas de cara a una construcción de vector mejorada.

Descripción resumida de la invención

En una realización, la invención proporciona una célula huésped humana in vitro que comprende un sistema de vector, donde el sistema de vector comprende: (a) un constructo de vector BIV que comprende un segmento de ADN de un genoma de BIV, una secuencia de empaquetamiento para empaquetar el ARN en viriones, un promotor unido operativamente al segmento de ADN; y un transgen; (b) un constructo de empaquetamiento de BIV que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia codificadora gag/pol de BIV, una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia codificadora gag/pol y opcionalmente uno o más de los siguientes elementos: (i) un intrón heterólogo, (ii) un elemento de transporte de ARN y (iii) una secuencia codificadora Rev; y (c) un constructo de expresión que comprende un gen que codifica una proteína de superficie vírica.

También se proporciona en la presente invención un procedimiento para producir un virión que comprende cultivar la célula huésped humana de la invención y recuperar un virión producido por el sistema vector.

La invención también proporciona la utilización de un virión para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un humano, procedimiento en el cual se transfiere un transgen a una célula humana, donde dicho virión es producido por un sistema vector que comprende: (a) un constructo de vector BIV que comprende un segmento de ADN de un genoma de BIV, una secuencia de empaquetamiento para empaquetar el ARN en viriones, un promotor unido operativamente al segmento de ADN; y un transgen; (b) un constructo de empaquetamiento de BIV que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia codificadora gag/pol de BIV, una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia codificadora gag/pol y opcionalmente uno o más de los siguientes elementos: (i) un intrón heterólogo, (ii) un elemento de transporte de ARN y (iii) una secuencia codificadora Rev; y (c) un constructo de expresión que comprende un gen que codifica una proteína de superficie vírica.

En la descripción que sigue se describe una variedad de otros productos y procedimientos relacionados con vectores y su utilización e incluyen:

Un constructo de vector de combinación BIV que comprende un segmento de ADN de un genoma BIV, donde el segmento de ADN comprende un gen gag, un gen pol, un segmento del gen env y una secuencia de empaquetamiento BIV para empaquetar ARN de BIV en viriones; un promotor unido operativamente al segmento de ADN; y un transgen unido operativamente al promotor, donde el transgen se inserta en el segmento del gen env. En una realización preferida, una parte del gen interior env se deleciona y el transgen se inserta en el espacio creado por la deleción. El segmento de ADN puede incluir uno o más de los siguientes genes vif, vpw, vpy, rev y tat, en particular tat y rev.

Un vector BIV que comprende un segmento de ADN de un genoma BIV, una secuencia de empaquetamiento para empaquetar ARN en viriones; un primer promotor unido operativamente al segmento de ADN; y un transgen unido operativamente a un segundo promotor. En una realización preferida, la secuencia de empaquetamiento es una secuencia de empaquetamiento BIV y el promotor es un promotor LTR o un promotor de citomegalovirus (CMV). En otra realización preferida, el segmento de ADN comprende también una porción de un gen gag. En otra realización, el vector incluye un elemento de respuesta a rev (RRE).

Un constructo de empaquetamiento BIV que comprende un fragmento de una secuencia de ADN BIV. Preferentemente, una secuencia de poliadenilación se localiza secuencia abajo del fragmento de ADN BIV. En otra realización, el constructo de empaquetamiento incluye un sitio de unión a ribosoma interno (IRES) y preferentemente incluye un intrón heterólogo. Un sistema de tres vectores que comprende: (1) un constructo de vector BIV que incluye un segmento de ADN de un genoma BIV, una secuencia de empaquetamiento para empaquetar ARN en viriones; un promotor unido operativamente al segmento de ADN; y un transgen unido operativamente a un segundo promotor; (2) un constructo de vector de empaquetamiento BIV que incluye un fragmento de una secuencia de ADN BIV que incluye como mínimo un gen gag o un gen pol de BIV; un promotor unido operativamente al fragmento de ADN BIV y una secuencia de poliadenilación localizada secuencia abajo del fragmento de ADN BIV; y (3) un vector de expresión que incluye un gen que codifica una proteína de superficie vírica. EN una realización, la proteína de superficie vírica es una glicoproteína de cubierta del virus de la estomatitis vesicular (VSV)-G. El segmento de ADN del constructo de vector BIV puede incluir una porción de un gen gag de BIV. EL constructo de vector BIV puede incluir uno o más genes BIV seleccionados entre el grupo que consiste en gag, vif, vpw, vpy, tat, rev y env.

Un procedimiento para transferir un gen de interés a una célula de mamífero obtenida por transfección de una célula huésped eucariota con el sistema de tres vectores descrito en el presente documento; cultivar la célula huésped transfectada; recolectar los viriones producidos; y administrar los viriones a una célula de mamífero para permitir la infección de la célula de mamífero y transferir el gen de interés. EN una realización, la célula de mamífero se localiza in vitro, y en otra realización la célula de mamífero se localiza in vivo.

Un sistema de dos vectores, incluyendo un primer constructo de vector que comprende un segmento de ADN de un genoma BIV, donde el segmento de ADN comprende genes gag y pol, una secuencia de empaquetamiento para empaquetar ARN en viriones; un promotor unido operativamente al segmento de ADN; y un transgen unido operativamente al promotor; y un vector de expresión de una proteína de superficie vírica. Preferentemente, dicho vector es un vector de expresión de la glicoproteína de cubierta del virus de la estomatitis vesicular (VSV)-G.

Un procedimiento para transferir un gen de interés a una célula de mamífero mediante la transfección de una célula huésped eucariota con el sistema de dos vectores reivindicado y descrito en el presente documento; cultivar la célula huésped transfetada; recolectar los viriones producidos; y administrar los viriones a una célula de mamífero para permitir la infección de la célula de mamífero y transferir el gen de interés.

Un sistema vector basado en BIV mínimo. El sistema comprende un constructo de vector mínimo, un constructo mínimo de empaquetamiento y un constructo de expresión de una proteína de superficie vírica mínima. El constructo de vector mínimo comprende un promotor unido a una primera región R SIV, un elemento U5 BIV unido a la primera región R BIV, una secuencia de empaquetamiento, un transgen y un elemento U3 BIV unido a una segunda región R BIV, donde el promotor inicia la transcripción del vector. El constructo de empaquetamiento comprende un promotor unido operativamente a la secuencia codificadora gag/pol BIV y una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia codificadora gag/pol. El constructo de expresión de la proteína de superficie vírica comprende un promotor unido operativamente a una secuencia que codifica una cubierta vírica y una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia codificadora.

Una célula de empaquetamiento. La célula de empaquetamiento comprende el constructo mínimo de empaquetamiento y el constructo de expresión de la proteína de superficie vírica mínimo.

La adición del constructo de vector mínimo da como resultado una célula productora. La célula productora produce viriones que contienen el vector. La infección de una célula con los viriones da como resultado la transferencia del transgen a la célula.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: ilustración esquemática del clon 127 del plasmado provírico BIV de tipo salvaje (pBIV).

Figura 2: para los constructos de empaquetamiento BIV: BIV de tipo salvaje, BIV dirigido por CMV y los tres constructos de empaquetamiento (BH 1-3), se indica los genes gag, pol y env; los genes accesorios no se muestran. También se inica el donador de corte y empalme vírico principal (MSD), un intrón quimérico pequeño (in), el elemento de respuesta a rev de HIV-1 (RRE), el ADNc de la N-acetiltransferasa de la puromicina unido a un sitio de entrada de ribosoma interna del virus de la encefalomiocarditis (IRES-puro) y la señal de poliadenilación tardía SV40 (SV40poliA).

Figura 3: vectores BIV y eficiencias de transducción. Todos los vectores contienen el promotor inmediato temprano del CMV, que acaba en la caja TATA, unido al sitio de inicio 5' LTR de BIV inmediatamente después de la caja TATA. Las secuencias BIV terminan en el codón de inicio gag (BCCG y BCPG) o aproximadamente 510 pb hacia dentro de la región codificadora gag (todos los demás). Todos los vectores contienen el ADNc de eGFP unido a un promotor "interno" heterólogo: CMV, PGK o MND. Algunos vectores contienen una o más inserciones entre el segmento 5' BIV y el promotor interno; dichas inserciones incluyen un tracto de polipurina central BIV, el segmento 5' del gen gag, la región de unión al esqueleto de interferón beta (SAR) y el elemento de respuesta a rev BIV putativo (RRE). Secuencia abajo del ADNc de eGFP se encuentra el LTR 3' de BIV y aproximadamente 130 pb (BCCG y BCPG), 1,2 kb (BC2CG, BC2PG y BC2MG) o 80 pb (todos los demás) de secuencias env adyacentes. Dos vectores (BC4MG y BC4MGppt) contienen LTRs 3' modificados en los cuales la mayoría de la región U3 de los LTR 3' se ha reemplazado por el elemento potenciador de la señal de poliadenilación tardía SV40 ("SINSV"). Los sitios de inicio de la transcripción y las direcciones se indican con flechas. En la parte inferior se indican dos vectores control HIV-1 utilizados en una serie de experimentos. A la derecha se encuentran las eficiencias de transducción de los vectores en células 293T 3 días después de la infección, utilizando los constructos de empaquetamiento BH2 y VSV-G, en una serie de experimentos. Las infecciones de los experimentos números 3-5 se llevan a cabo en presencia de un tampón adicional para retrasar el aumento de pH durante la espinoculación. Como resultado, aumentan las eficiencias de trasducción.

Figura 4. Ilustración esquemática del sistema de transferencia génica basado en BIV, que consiste en un constructo de empaquetamiento, un esqueleto vectorial y un constructo de expresión VSV-G. CMV: promotor temprano CMV, cPPT: tracto de poliurina central; RRE: elemento de respuesta a rev; MND: LTR de MND; SIN: autoinactivado; SV40USE; elemento de potenciación de poliadenilación secuencia arriba de SV40.

Figura 5. Sistema vectorial basado en BIV mínimo. La figura muestra un constructo de vector mínimo, un constructo mínimo de empaquetamiento y un constructo mínimo de expresión de una proteína de superficie vírica.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, biología molecular, cultivo celular, virología, inmunología y similares que se encuentran en el estado de la técnica. Dichas técnicas se han descrito completamente en la literatura y se hace referencia específicamente a Sambrook, Fritsch y Maniatis eds. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" -Clonaje Molecular, un Manual de Laboratorio-, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Celis J.E. "Cell Biology, A Laboratory Handbook" -Biología Celular, un Manual de Laboratorio-, Academic Press, Inc. (1994) y Bahnson et al, J. of Virol. Methods, 54: 131-143 (1995).

Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en este documento son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la técnica a la cual pertenece la presente invención.

Tal como se utiliza en el presente documento y reivindicaciones, la forma singular "un/a" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, una partícula de virión incluye una pluralidad de partículas de virión. Los polinucleótidos o los ácidos nucleicos de la invención pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, incluyendo dicho ADN ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

El virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV) se clasifica en la subfamilia retrovírica lentivirus (Gonda et al., Nature, 330: 388-391 (1987)). Los lentivirus son retrovirus no oncogénicos exógenos e incluyen el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), los virus de la inmunodeficiencia de simios (SIVs), los virus de la pneumonía progresiva y pneumonía Visna de las ovejas, el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2). BIV tiene reactividad cruzada inmunológica con HIV, SIV y EIAV. Dichos virus contienen típicamente de 8.000 a 10.000 nucleótidos en su genoma, incluyendo los genes gag, pol y env, así como las secuencias de repetición terminal largas (LTR).

El gen "gag" es el gen más 5' de los genomas retrovíricos y codifica proteínas estructurales que forman la partícula de virus. Se traduce para dar una poliproteína precursora que se escinde a continuación para dar de tres a cinco proteínas estructurales.

El gen "pol" codifica enzimas que se necesitan para la escisión de la poliproteína, para la transcripción reversa y para la integración del ADN provírico en los cromosomas.

El gen "env" codifica las proteínas de cubierta. Tal como se utiliza en el presente documento, el gen env incluye no sólo las secuencias del gen natural env, sino también las modificaciones del gen env, incluyendo las modificaciones que alteran la especificidad diana de los retrovirus o de los genes env que se utilizan para generar retrovirus pseudotipados. Véase la publicación de la PCT WO 92/14829, publicada en 3 de septiembre de 1992, titulada "Partículas Víricas con un Rango Alterado de Huéspedes".

Los retrovirus comparten características del ciclo de replicación, incluyendo el empaquetamiento del ARN vírico en viriones, la infección de células diana, la producción de una copia de ADN del genoma ARN mediante la transcripción reversa del ARN en el virión para formar un provirus de ADN, el transporte del ADN al núcleo celular, la integración del ADN provírico en el genoma de la célula diana, la transcripción del ARN a partir del ADN vírico dirigido por un promotor que se encuentra dentro de la secuencia 5'LTR, la traducción de las proteínas gag, pol y env, la formación y maduración de las partículas víricas y la liberación de viriones recubiertos por una única membrana a partir de la célula. El LTR contiene secuencias de actuación cis importantes para la transcripción reversa, para la integración, para la transcripción y para la poliadenilación (Coffin J., J. Gen. Virology 42: 1-26 (1979)).

Los genomas de los lentivirus son complejos. Comparten los genes retrovíricos mencionados más arriba, gag, pol y env y además tienen una diversidad de genes no estructurales/reguladores que incluyen una "región central" (Braun et al., J. Virol., 61: 4046-4054 (1987) y Chakrabarti et al., Nature, 328: 543-547 (1987)).

Los genes complementarios no estructurales/reguladores que se encuentran en los genomas de fracciones aisladas a partir de diferentes especies difieren entre sí particularmente en las secuencias env. La organización genómica básica de BIV se describe en Garvey et al. Virology, 175: 391-409 (1990) y en la patente U.S. No. 5,380,830, la descripción de la cual se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad. Adicionalmente se describen procedimientos para obtener ADN genómico BIV a partir de células infectadas con BIV. Los genes gag y pol se encuentran en diferentes marcos y se solapan. Los genes pol y env se encuentran en el mismo marco de lectura y están separados por la "región central". Hay cinco marcos de lectura abiertos (ORFs) situados en la región central. Tres de ellos tienen una estructura similar a los exones para vif, tat y rev de HIV y de otros lentivirus. Los otros dos ORFs están situados en una posición en la región central análoga a vpr, vpx y vpu, que codifica los ORFs de HIV-1 y/o HIV-2. El ORF nef, localizado post-env en los genomas de otros lentivirus, no aparece en BIV (Garvey et al., 1990 supra).

Un exón es un segmento de un gen. Codifica una parte específica de la proteína. Un gen es un segmento de ácido nucleico implicado en la producción de una cadena polipeptídica que incluye regiones que preceden y siguen el segmento de la región codificadora de ADN.

El gen "tat" consiste en dos exones codificadores. El primero está contenido en la región central y el segundo en el extremo 3' de la secuencia codificadora env pero en un marco de lectura diferentes del de los exones env y rev.

El gen "rev" también está hecho de dos exones. El primero se localiza cerca del extremo 3' de la región central y solapa el extremo 5' de env. El segundo exón se encuentra en el extremo 3' de env pero en un marco de lectura diferente. El producto del gen "rev" transporta ARNms víricos que contienen intrones, incluyendo el ARN de longitud completa utilizado para la traducción gag-pol y para el empaquetamiento de viriones en el citoplasma sin proceso de corte y empalme.

Las secuencias que codifican BIV y los plásmidos que contienen genomas retrovíricos adecuados para su utilización en la preparación de los constructos de vectores de la invención pueden obtenerse fácilmente dada la descripción proporcionada en el presente documento o a partir de bancos y bases de datos como por ejemplo la Colección de Cultivo Tipo Americana (American Type Culture Collection (ATCC)), por ejemplo la adquisión ATCC No. 68092 y la adquisición ATCC No. 68093 y el GENBANK. En Garvey et al., más arriba, y en la patente U.S. No. 5,380,830 se describen diferentes clones BIV. Se hace referencia particular a BIV 127 y BIV 106, que tienen los números de adquisición ATCC 68092 y 68093, respectivamente.

Se entenderá que para la secuencia de nucleótidos del genoma BIV, pueden existir variaciones naturales entre virus BIV individuales. Dichas variaciones pueden dar como resultado deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o más nucleótidos siempre y cuando la función reivindicada del gen no se pierda. Las secuencias de ADN que codifican dichas variantes pueden crearse mediante procedimiento de clonación estándar o mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), patentes U.S. Nos. 4,683,195 y 4,683,202.

Un segmento de ácido nucleico de un genoma BIV puede obtenerse a partir de cualquier cepa o clon de BIV. En una realización, un constructo de vector BIV debe incluir un número suficiente de nucleótidos que correspondan a nucleótidos del genoma BIV para expresar uno o más genes BIV funcionales.

Un "constructo de vector combinación BIV" se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos e incluye una región LTR 5' que tiene una región con la secuencia de un promotor que es capaz de iniciar la trascripción de BIV; los genes gag y pol BIV unidos operativamente al promotor; un segmento de la región codificadora de env de BIV; una secuencia de empaquetamiento BIV; y un transgen unido operativamente a un promotor e insertado en el segmento de la región codificadora env. Preferentemente, el transgen se une operativamente a un segundo promotor que puede ser el mismo o diferente del promotor unido operativamente a los genes gag y pol BIV.

El gen env de BIV que se encuentra en el clon 127 de BIV tiene aproximadamente 2711 nucleótidos de longitud y empieza a aproximadamente el nucleótido 5415. En una realización preferida, se inserta un transgen en la región interior del gen env. Por ejemplo, el transgen puede insertarse en el segmento de la región codificadora env después de los segmentos del exón 1 que codifica tat y rev y antes de los segmentos del exón 2 que codifica tat y rev. Preferentemente, el transgen se inserta después del nucleótido 860 del segmento codificador de env, que corresponde al polinucleótido BIV 6275. En otra realización, se deleciona una sección de la región codificadora de env. Preferentemente, la sección delecionada es de la región interior del gen env y el transgen se inserta en el espacio creado por la deleción. La sección delecionada de la región codificadora de env puede ser sólo de 20 nucleótidos pero puede ser incluso de 1500 nucleótidos. Los procedimientos para delecionar una sección del gen env son bien conocidos por los expertos medios en la técnica.

Cualquier "constructo de vector BIV" se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos. El constructo de vector debe incluir una secuencia 5' (comprendiendo una región promotora) que es capaz de iniciar la transcripción de BIV; un segmento de ADN de un genoma BIV; una secuencia empaquetadora de BIV o de otro lentivirus o retrovirus; y un transgen unido operativamente a un segundo promotor. Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona un constructo de vector BIV que comprende: un segmento de ADN de un genoma BIV, una secuencia de empaquetamiento para empaquetar ARN en viriones; un primer promotor unido operativamente al segmento de ADN; y un transgen unido operativamente a un segundo promotor. En una realización preferida, la secuencia de empaquetamiento es una secuencia de empaquetamiento BIV.

Una porción de un gen gag de BIV puede incorporarse en el segmento de ADN. El gen gag de BIV tiene aproximadamente 1431 nucleótidos. Preferentemente, la porción del gen gag incluirá no más de aproximadamente 200 nucleótidos. El segmento de ADN puede comprender además un gen BIV seleccionado entre el grupo que consiste en vif, vpw, vpy, tat, rev y env.

En otra realización preferida, el transgen está unido operativamente a un promotor CMV, un promotor PGK o un promotor MND. El constructo de vector BIV puede comprender además uno o mñas de los siguientes elementos: elemento de respuesta a rev (RRE), región de unión al esqueleto del interferón beta, que preferentemente es de origen humano y/o un tracto de polipurinas, el cual se localiza preferentemente entre el segmento 5' BIV y el ("segundo") promotor interno. Así, en una realización preferida, el transgen unido operativamente a un segundo promotor se localiza secuencia abajo del putativo RRE BIV.

En otra realización preferida, el constructo de vector BIV de la invención es un vector de inactivación. En particular, una porción de la región U3 del LTR 3' del constructo de vector BIV puede delecionarse o sustituirse por una secuencia heteróloga. Se prefiere la sustitución de una porción de la región U3 del LTR 3' por el elemento potenciador de la señal de poliadenilación tardía SV40.

En una realización particularmente preferida, el constructo de vector BIV es un vector que se auto inactiva e incluye además un transgen que está unido operativamente a un promotor MND y que comprende un RRE y un tracto de polipurinas central (cPPT) secuencia arriba respecto el promotor MND.

Un "constructo de empaquetamiento BIV", al cual se hace también referencia a veces como constructo asistente, se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos donde la secuencia de nucleótidos incluye como mínimo el gen gag o el gen pol de BIV, un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos y una secuencia de poliadenilación situada secuencia debajo de la secuencia de nucleótidos que codifica los genes gag o pol. Preferentemente, la secuencia de poliadenilación se deriva del virus 40 de simio (SV40).

El constructo de vector BIV, el constructo de vector de combinación BIV y el constructo de empaquetamiento BIV discutidos más arriba pueden incluir otros genes BIV además de los genes específicos mencionados más arriba. Otros genes incluyen los genes pol, vif, vpw, vpy, tat, rev y env. En particular, los constructos BIV incluirían nucleótidos que corresponden a un gen funcional rev BIV. Sin embargo, los constructos BIV de la invención pueden también incluir un elemento de exportación nuclear, preferentemente un elemento de respuesta a rev (RRE), preferentemente secuencia abajo del inserto de transgen. El RRE puede ser de un lentivirus diferentes de BIV. Preferentemente, los constructos también incluirían un número suficiente de nucleótidos que corresponden a un gen funcional tat. El LTR 3' del genoma BIV también pueden incluirse tal como se describe más abajo.

En otra realización, se describe un procedimiento para producir una línea celular de empaquetamiento que incluye transformar, preferentemente transfectando una línea celular establecida con el constructo de vector de combinación BIV o con un constructo de empaquetamiento BIV tal como se ha descrito más arriba. Para aplicaciones de terapia génica, es necesario generar un gran volumen de sobrenadantes que no pueden prepararse fácilmente mediante transfección transiente. Por lo tanto, las líneas celulares productoras pueden utilizarse para transferir genes de interés a una célula diana. Una línea celular productora se refiere a una línea celular que es capaz de producir partículas BIV recombinantes. La línea celular productora debe incluir un constructo BIV integrado tal como se ha descrito más arriba. Puede incluirse una diversidad de vectores BIV en la partícula BIV recombinante, incluyendo los constructos BIV de la presente invención. En el estado de la técnica se conocen diferentes procedimientos para identificar las células de empaquetamiento retrovírico capaces de producir partículas de vector víricas recombinantes. Dichos procedimientos incluyen ELISA y Western Blot.

Algunos ejemplos no limitativos de líneas celulares de empaquetamiento incluyen PA12, PA317, FLYAL 3, PE501. PG13, CRIP, RD114, GP7C-tTA-G10, PPA-6, y PT67 (Miller et al., Mol. Cell, Biol. 6: 2895 (1986); Miller et al., Biotechniques 7:980 (1989); Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460 (1988); Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392 (1993) y Rigg et al., Virol. 218:290 (1996).

La invención puede utilizar un constructo de vector mínimo. El constructo de vector comprende un promotor unido a una primera región R SIV, un elemento U5 BIV unido a la primera región R BIV, una secuencia de empaquetamiento, un transgen y un elemento U3 BIV unido a una segunda región R BIV, donde el promotor inicia la transcripción del vector. Preferentemente la secuencia de empaquetamiento es una secuencia de empaquetamiento BIV. Alternativamente, puede ser de otro lentivirus o retrovirus. Además, se prefiere que cualquier codón de inicio en la secuencia de empaquetamiento se elimine por deleción o mutación. También se prefiere que el sitio donador principal del proceso de corte y empalme se inactive o elimine. Dichos cambios en la secuencia de empaquetamiento y en el sitio donador del proceso de corte y empalme se llevan a cabo mediante técnicas estándar.

En un aspecto particularmente preferido del vector mínimo, una o más secuencias en el elemento U3 se mutan o delecionan para disminuir o eliminar la transcripción mediada por U3 de cualquier gen situado secuencia abajo. Esto proporciona un vector capaz de auto-inactivarse. En una situación de este tipo, el transgen está operativamente unido a un promotor interno. Además, se prefiere que el elemento U3 contenga a demás una secuencia que potencie la poliadenilación. Un ejemplo preferido es el elemento potenciador situado secuencia arriba respecto la señal de poliadenilación tardía SV40 (Sehet et al., Mol. Cell Biol., 12: 5386.5393 (1992)).

El vector mínimo puede contener elementos adicionales. Uno de dichos elementos es un cPPT. Preferentemente, el cPPT es un cPPT BIV. El vector puede comprender también un tracto de polipurinas 3', el cual se sitúa inmediatamente secuencia arriba (es decir, 5') del elemento U3 3'.

Además, el vector puede comprender un elemento de transporte de ARN. Dicho elemento de transporte puede ser un RRE lentivírico. Preferentemente, el RRE lentivírico es un RRE BIV. Alternativamente, el elemento de transporte de ARN es un elemento de transporte constitutivo (CTE). Más preferentemente, el CTE es un CTE del virus de mono Mason-Pfizer. Un CRE preferido alternativo es un CTE del virus de la leucemia aviar.

La invención puede utilizar un constructo mínimo de empaquetamiento. El constructo comprende un promotor unido operativamente a la secuencia codificadora gag/pol DIV y una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia codificadora gag/pol. Preferentemente, el constructo de empaquetamiento contiene además un intrón heterólogo secuencia arriba (es decir 5') de la secuencia codificadora gag/pol. Además, el constructo de empaquetamiento puede contener un elemento de transporte de ARN. Dicho elemento puede ser un RRE lentivírico, preferentemente un RRE DIV, o puede ser un CTE tal como se ha descrito más arriba. El constructo de empaquetamiento puede contener también una secuencia codificadora Rev.

Puede incluirse un intrón heterólogo en los constructos, y particularmente en los constructos de empaquetamiento. Los intrones heterólogos son conocidos y algunos ejemplos no limitativos incluyen el intrón del gen de la beta-globulina humana. Algunos intrones utilizados en los constructos de la invención pueden obtenerse a partir del virus SV40 y el gen de la insulina humana. Preferentemente, el intrón se localizará secuencia arriba de las secuencias de nucleótidos gag y pol.

En otras realizaciones, los constructos utilizados en la invención pueden incluir un sitio de unión a ribosoma interno, el cual permite la traducción de un segundo gen, preferentemente un gen heterólogo. El gen heterólogo puede ser un gen marcador o un gen que codifica una proteína de interés, tal como se describe mejor más abajo.

Un requisito para la expresión de un gen BIV o de un transgen es un promotor adecuado unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico codificadora. El término "unido operativamente" se refiere a una disposición de elementos donde los componentes se configuran de tal manera que lleven a cabo su función habitual o esperada. El promotor y otros elementos de control no tienen que ser contiguos a la secuencia codificadora. Pueden haber residuos intermedios entre un promotor o un elemento control y la región codificadora siempre y cuando se mantenga la relación funcional.

Respecto a los constructos descritos en el presente documento, la elección del promotor entra dentro de la destreza de un experto en la técnica y se extiende a cualquier promotor eucariota, procariota o vírico capaz de dirigir la transcripción génica en una célula diana o célula huésped transformada con un constructo según la invención. El promotor puede ser un promotor específico de tejido, un promotor inducible, un promotor sintético o un promotor híbrido. Puede situarse más de un promotor en los constructos de la invención. Preferentemente, los genes BIV se unirán operativamente a un promotor y el inserto de transgen se unirá operativamente a un segundo promotor. Algunos ejemplos de promotores útiles en los constructos de la invención incluyen, pero no se limitan a, el promotor del fago lambda (PL), el promotor temprano SV40, el promotor del virus del herpes simples (HSV), un promotor de citomegalovirus (CMV), por ejemplo el promotor inmediato temprano del CMV humano; el sistema promotor trans-activador-receptivo controlado por tetraciclina (tet); un promotor de repetición terminal largo (LTR), por ejemplo el LTR MoMLV o un LTR HIV, el promotor de la región U3 del virus del sarcoma murino Molones; el promotor de Granzyme A, las secuencias reguladoras del gen de la metalotionina, el promotor CD34, el promotor CD8, el promotor de la timidina quinasa (TK), el promotor PGK promotor de parovirus B19, los promotores glucocorticoides, los promotores de la proteína de shock por calor (HSP), por ejemplo HSP65 y HSP70; los promotores de inmunoglobulina; el promotor MMTV, el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor lac; los promotores 35S CaMV; y el promotor de la nopalina sintetasa. Numerosos promotores se encuentran disponibles en fuentes comerciales, por ejemplo Stratagene (La Jolla, CA).

Algunos promotores preferidos incluyen la región promotora de los LTRs, por ejemplo el promotor LTR 5' de HIV o BIV. Adicionalmente, algunos promotores preferidos incluyen los promotores CMV y los promotores PGK. Se prefiere particularmente el promotor MND. También pueden incorporarse en los constructos de la invención otras secuencias control, por ejemplo potenciadores y regiones de unión a la matriz (SRAs). Se prefiere particularmente la región de unión a la matriz derivada del interferón-beta humano. Un experto medio en la técnica podrá determinar fácilmente las secuencias potenciadoras particulares.

Una "secuencia de empaquetamiento" se define como las secuencias necesarias para empaquetar ARN retrovírico en viriones. Las secuencias de empaquetamiento se localizan generalmente en la región entre el donador del proceso de corte y empalme principal y el codón de iniciación del gen gag. Aunque se prefiere una secuencia de empaquetamiento derivada de BIV, los vectores según la invención pueden incluir secuencias de empaquetamiento que correspondan a otros retrovirus, particularmente lentivirus y más particularmente que correspondan a HIV-1, HIV-2 o SIV. Las secuencias de empaquetamiento pueden incluir hasta 1000 nucleótidos o tan sólo 50 nucleótidos. Un experto medio en la técnica puede determinar el tamaño de la región de la secuencia de empaquetamiento.

Tal como se ha descrito más arriba, uno o más constructos para su utilización según la invención pueden incluir además una señal de poliadenilación (polyA) que se encuentra en 3' respecto la secuencia codificadora. La cola de polyA puede ser de cualquier tamaño que sea suficiente para promover la estabilidad en el citoplasma. La polyA puede derivar de un lentivirus, por ejemplo BIV, HIV y SIV. Sin embargo, la secuencia polyA puede derivar también de otros virus, por ejemplo la poly A de SV40.

Además de la región promotora, las secuencias de repetición terminales largas (LTR) de los retrovirus contienen elementos de actuación cis que son importantes para la transcripción reversa, la integración, la transcripción y la poliadenilación, y uno o más de dichos elementos puede incorporarse en los constructos de la invención. Preferentemente, los constructos comprenden nucleótidos que corresponden a un número suficiente de nucleótidos de una LTR en el extremo 5' para dar como resultado una LTR funcional. Los constructos pueden incluir también una región LTR 3'. El LTR provírica de BIV 127 tiene 589 polinucleótidos. El LTR comprende elementos U3, R y U5 (patente U.S. No. 5,380,830).

La invención utiliza tres sistemas de vectores, incluyendo el constructo de vector BIV y el constructo de empaquetamiento de BIV. En una realización el sistema de tres vectores comprenderá el constructo de vector BIV y el constructo de vector de empaquetamiento BIV tal como se ha definido más arriba, y además un tercer constructo. El tercer constructo es un constructo de vector de expresión que comprende un gen que codifica una proteína de superficie vírica de un virus diferente. La proteína de superficie vírica puede ser cualquier otra proteína de cubierta vírica, incluyendo la glicoproteína de cubierta del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), la proteína env MoMLV, o cubiertas derivadas del virus de la leucemia de mono Gibbon (GaLV), Rhabdoviride (Rabies, Mokola, Lyssa), Alfavirus (Ross River virus, Sindbis), Paramyvovirus (Sendai), Filovirus (Ebola, Marburg), Retrovirus (MLV, 10A1, Xeno), Arenaviruses (LCMV), virus de la Parainfluenza. En una realización preferida, la proteína de superfice es VSV-G (Bums et al., PNAS, 90:8033-8037 (1993) y Yee et al., PNAS 91: 9564-9568 (1994)). Véase también la patente U.S. Patent No. 5,817,491, publicada el 6 de octubre de 1998.

En una realización preferida, el constructo de vector de la proteína de superficie es un vector de expresión de la glicoproteína de cubierta del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G).

La valoración de las preparaciones del virus BIV psudotipado VSV-G puede incrementarse mediante la centrifugación del virus. Una preparación de virus BIB pseudotipado con VSV-G no concentrado debe tener una valoración de aproximadamente 5 x 106 unidades infecciosas (IU) por ml en la línea celular de epitelio de riñón humano 293T. Al aumentar la concentración de virus, la valoración puede aumentar significativamente.

Generalmente, la valoración de los vectores de la invención puede aumentarse mediante la recolección de las partículas de virus, primero, vía centrifugación del medio que contiene el virus, segundo, separando el sobrenadante y tercero, suspendiendo las partículas de virus en un pequeño volumen de medio fresco. Por ejemplo, concentrar el virus 10 veces mediante la suspensión del virus recolectado en un volumen de líquido 10 veces menor que el volumen original antes de la centrifugación, da como resultado aumentos de 3-10 veces en la eficiencia de transducción. Tal como entenderá un experto en la técnica, una concentración mayor del virus dará como resultado aumentos aún mayores en la eficiencia de transducción.

Los constructos basados en BIV utilizados según la invención utilizados de forma aislada o en combinación pueden utilizarse para transformar virtualmente cualquier línea celular humana o célula huésped humana in vitro. La transformación puede ser mediante transfección o traducción. La transfección es la transformación de células diana o células huésped con genomas de ADN aislados. Se hace referencia Kriegler, M., Gene Transfer y Expresión: A Laboratory Manual -Transferencia Génica y Expresión Génica: un Manual de Laboratorio-, W.H. Freman & Company NY (1990). Algunos procedimientos de transducción incluyen el co-cultivo directo de células con células productoras (Bregni et al., Blood 80: 1418-1422 (1992) o cultivar con sobrenadante vírico aislado o con factores de crecimiento apropiados (Xu et al., Exp-Hemat., 22: 223-230 (1994). También se hace referencia a paquetes disponibles comercialmente, por ejemplo el paquete CalPhos, (Clontech Inc. Palo Alto, CA) y el paquete Profection, (Promega, Madison Wl). Véase Kotani et al., Human Gene Ther. 5: 19-28 (1994) y Forstell et al., J. Virol. Methods 60: 171-178 (1996) en relación a procedimientos de espinoculación.

Una vez que una línea celular se transfecta o transduce con los constructos de la invención, los genes se expresarán y la célula hará nuevos viriones. Como resultado, los viriones pueden reunirse y utilizarse para infectar una célula diana, transfiriendo de esta manera el gen o genes de interés en el vector a la célula diana.

Las células y las líneas celulares descritas en el presente descripción y en los ejemplos adjuntos incluyen las células de mamífero; las células de primate; y especialmente las células humanas, por ejemplo las células de riñón embriónico humano (293T), las células de conejo EREp Cf2Th (ATCC No. CRL 1430), CHO, SW480, CV-1, la línea celular T humana CEMSS, Jurkat, la línea celular de perro MDCK y D17, HT1090, LINA, WES y la línea celular murina NIH3T3. Una línea celular o cultivo celular denota células eucariotas que se hacen crecer o se mantienen in Vitro. Se entiende que los descendientes de una célula pueden no ser completamente idénticos (bien morfológicamente, genotípicamente o fenotípicamente) a la célula madre.

Los constructos vector y de empaquetamiento pueden utilizarse para hacer células de empaquetamiento y células productoras. La célula de empaquetamiento comprende el constructo de empaquetamiento de la invención y un constructo de expresión de proteína de superficie vírica mínima. El último constructo comprende un promotor unido operativamente a una secuencia que codifica una cubierta vírica y una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia codificadora. La cubierta vírica es cualquiera de las descritas previamente en la presente descripción. Preferentemente, es la cubierta del virus VSV-G.

Una célula de empaquetamiento se transfecta con el constructo de vector mínimo para hacer una célula productora. La célula productora comprende: (i) una secuencia codificadora gag/pol BIV; (ii) una secuencia codificadora de una cubierta vírica; y (iii) un constructo de vector que comprende un promotor unido a una primera región R BIV, un elemento U5 BIV unido a la primera región R BIV, una secuencia de empaquetamiento, un transgen y un elemento U3 BIV unido a una segunda región R BIV. La célula produtora se cultiva y produce viriones que contienen el vector mínimo de la invención. Este vector mínimo es la versión de ARN del constructo de vector mínimo y no contiene el promotor unido a la primera región R BIV. Preferentemente, el vector de ARN comprende además un promotor interno, tal como se ha descrito en el presente documento, unido operativamente al transgen. Más preferentemente, dicho vector es un vector SIN tal como se describe en la presente descripción. Los viriones se utilizan para infectar células diana deseadas, transfiriendo de esta manera el transgen a la célula diana.

En el ejemplo adjunto, una variedad de células diana, incluyendo las líneas celulares y las células primarias de origen humano y no humano, se infectan con éxito con los vectores de la invención. Éstas incluyen la línea celular del osteosarcoma de perro D-17, la línea celular de músculo liso de rata A-10, la línea celular neuronal de ratón MN9D, la línea celular endotelial humana HUVEC, las células endoteliales primarias de rata, los linfocitos primarios humanos y las células madre hematopoyéticas primarias humanas.

Algunas células diana o células huésped incluyen las células hematopoyéticas humanas. Las células hematopoyéticas engloban las células madre hematopoyéticas, los eritrocitos, los neutrófilos, los monocitos, las plaquetas, los mastocitos, los eosinófilos, los basófilos, los linfocitos B y T. Las células madre hematopoyéticas y las células T se prefieren especialmente.

Antes de la transfección o de la transducción, las células hematopoyéticas pueden aislarse y seleccionarse. Algunos procedimientos para aislar y seleccionar células son bien conocidos en el estado de la técnica (patente U.S. Nos. 5,061,620; 5, 677. 136 y 5,750,397). Por ejemplo, se utilizan células CD34+ Thy-1+Lin- clasificadas, bien de médula adulta (ABM) o de la sangre periférica movilizada (PBM). Las células CD34+Thy-1+Lin- están altamente enriquecidas en células madre hematopoyéticas humanas y pueden aislarse de ABM y de MPB mediante citometría de flujo (patente U.S. No, 5, 061, 620).

La presente invención se refiere también a la preparación de un medicamento en un procedimiento para transferir un gen de interés a una célula humana tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Tal como se ha descrito más arriba, los procedimientos de transfección de células huésped son conocodidos, haciéndose también referencia a Graham y van der Eb, Virology 52:456-467, 1973.

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Algunos procedimientos de cultivo de células transfectadas y transducidas son bien conocidos, haciéndose referencia a Freshney, R.I. "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Techniques" -Cultivo de Células Animales, Un Manual de Técnicas Básicas-, Wiley-Liss Inc. (1994). Diversos medios de cultivo pueden adquirirse comercialmente y algunos ejemplos no limitativos incluyen DMEM, IMDM, X-vivo 15 y RPMI-1640. Las formulaciones pueden suplementarse con una diversidad de nutrientes y factores de crecimiento diferentes. Para cultivar las células madre hematopoyéticas CD34+ o las células progenitoras, se combinan preferentemente citoquinas en el medio. Dichas citoquinas incluyen, pero no se limitan a, IL-6, TPO, SCF, IL-3 y LIF. Los procedimientos de administración de células son bien conocidos y dichos procedimientos incluyen la administración a pacientes humanos para terapia génica.

Algunos procedimientos de recolección de viriones producidos por las células transfectadas se describen, por ejemplo en Rigg et al., Virology 218:290-295. Los viriones, que incluyen los constructos basados en BIV de la presente invención, pueden administrarse in vivo o in vitro a células de mamífero. Adicionalmente, se prefiere que el virión incluya un gen terapéutico heterólogo tal como se describe aquí. Los viriones producidos según la invención mediante la utilización de los constructos basados en BIV son partículas recombinantes o viriones. "Una partícula BIV recombinante o un virión BIV recombinante" se refiere a una partícula de virus que contiene ARN de un vector basado en BIV según la invención. En algunos casos, el constructo de vector BIV puede estar contenido en una partícula derivada de virus diferentes de BIV, por ejemplo otros retrovirus y particularmente otros lentivirus.

En el sentido utilizado en la presente descripción, el gen de interés al cual se hace referencia generalmente como un transgen, es un gen heterólogo, por ejemplo un gen marcador. La selección del gen marcador está dentro de la destreza de los expertos en la técnica, y algunos ejemplos no limitativos incluyen marcadores resistentes a fármacos, por ejemplo el gen (Neo'), que codifica la fosfotransferasa de neomicina; el gen HSV-tk, obtenido en células sensibles a agentes tipo aciclovir y ganciclovir; el receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (NGFR); la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP); la proteína fluorescente amarilla mejorada; el gen de la reductasa de dihidrofolato (DHFR); el gen hisD bacteriano, CD24 murino (HSA); CD8a(lyt) murino; los genes bacterianos que confieren resistencia a la puromicina, a la pleomicina o a la beta-galactosidasa (por ejemplo el gen lacZ); y un gen de la sintetasa de glutamina (GS). En una realización preferida, el gen marcador es eGFP. El gen marcador se encuentra preferentemente bajo el control de un promotor separado que permitirá la identificación de las células diana que contienen el gen marcador.

Una gran variedad de secuencias de nucleótidos a las cuales se hace referencia generalmente como transgenes pueden ser transportadas por un constructo basado en BIV según la presente invención, además de o alternativamente, en ausencia de un gen marcador. Preferentemente, las secuencias de nucleótidos deben ser de un tamaño suficiente para permitir la producción de partículas de virus viables. Una lista no exhaustiva de dichos transgenes (genes heterólogos) incluye las secuencias que codifican proteínas, antígenos, ribozimas, así como secuencias antisentido.

La proteína puede ser una proteína terapéutica o una proteína estructural. Además, la proteína puede ser la proteína entera o solo el fragmento activo funcional de la misma. La proteína puede incluir, por ejemplo, una que regula la diferenciación celular o un gen terapéutico capaz de compensar una deficiencia en un paciente que resulta de un gen endógeno defectivo. El gen terapéutico puede ser uno que antagonice la producción o la función de un agente infeccioso, que antagonice procesos patológicos, que mejore la composición genética del huésped o que facilite el injerto.

Algunos ejemplos específicos de genes terapéuticos o secuencias génicas son aquellas efectivas en el tratamiento de la deficiencia deaminasa de la adenosina (ADA); la anemia de células falciformes, la deficiencia de recombinasa, la deficiencia del gen regulador de la recombinasa, HIV, por ejemplo el gen REV antisentido o transdominante, o un gen que lleva la timidina quinasa del virus de la herpes simples (HSV-tk). El gen terapéutico puede ser un gen no humano, por ejemplo un gen de levadura (Seo et al., Proc.Natl. Acad. Sci. 95:9167 (1998)).

Las secuencias de nucleótidos de los transgenes pueden obtenerse a partir de diferentes bases de datos, por ejemplo el GENBANK y a partir de fuentes comerciales, por ejemplo Advanced Biotechnologies (MD). Adicionalmente, pueden obtenerse las secuencias de ADNc que codifican la secuencia heteróloga a partir de las células que expresan o que contienen la secuencia mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, utilizando por ejemplo PCR.

Adicionalmente, el gen de interés puede seleccionarse entre las secuencias de ADN que codifican los genes del factor de la necrosis tumoral, por ejemplo TNF-\alpha; los genes que codifican interferones, por ejemplo interferón-\alpha, interferón-\beta e interferón-\gamma; los genes que codifican interleuquinas, por ejemplo IL-1, IL-1b, y las interleuquinas 2 a 14, en particular IL-2, IL-4, IL-6 y IL-10; los genes que codifican GMCSF o G-CSF; los genes que codifican la deaminasa de adenosina o ADA; los genes que codifican factores de crecimiento celular, por ejemplo las linfoquinas, que son factores de crecimiento de linfocitos; los genes que codifican CD4 soluble; el Factor VIII ; el Factor IX; los receptores de células T; el receptor LDL, ApoE, ApoC, ApoAl y otros genes implicados en el transporte del colesterol y en el metabolismo; el gen de la alfa-1 antitripsina, el gen de la ornitina transcarbamilasa, el gen de CFTR, el gen de la insulina, el gen de NDI-1, marcadores selectivos negativos o genes "suicidas", por ejemplo los genes víricos de la timidina quinasa, por ejemplo el gen de la timidina quinasa del virus del Herpes Simplex Virus, el gen de la timidina quinasa del virus citomegalovirus y el gen de la timidina quinasa del virus de la varicela-zoster virus; los receptores Fc de los dominios de unión a antígeno de los anticuerpos y secuencias antisentido que inhiben la replicación vírica. Las secuencias antisentido se diseñan de manera que unan transcriptos de ARN y de esta manera impidan la síntesis celular de una proteína particular o impidan la utilización de dicha secuencia de ARN por la célula.

En el caso de pacientes humanos, un gen terapéutico será generalmente de origen humano, aunque pueden utilizarse genes de especies relacionadas cercanamente que exhiban una alta homología y una función idéntica biológicamente o equivalente biológicamente en humanos, si el gen no produce una reacción inmune adversa en el receptor. Una cantidad terapéutica activa de una secuencia de un ácido nucleico o de un gen terapéutico es una cantidad efectiva en la dosis necesaria y por un período de tiempo necesario para conseguir el resultado deseado. Dicha cantidad puede variar según diversos factores incluyendo, pero no limitándose a, sexo, edad, peso de un sujeto y similares.

Algunos procedimientos conocidos en la técnica pueden utilizarse para ensayar la expresión de un transgen en la célula diana. Dichos procedimientos incluyen la selección por citometría de flujo, la detección de proteína mediante análisis de western blot, la utilización de PCR (patente U.S. Nos. 4,683,195 y 4,683,202), la selección de nucleótidos mediante northern blot o southern blot y los inmunoensayos enzimáticos, Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" - Clonaje Molecular: un Manual de Laboratorio - Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y Métodos

Ejemplo 1.1

Construcción de plásmidos

Se generan vectores que difieren en (i) la cantidad de secuencias gag y env (prefijo BC vs. BC2); (ii) el promotor interno que dirige la expresión eGFP: CMV (sufijo CG) vs. PGK (promotor de la fosfoglicerato quinasa (1); sufijo PG) vs. MND (promotor del virus del sarcoma proliferativo mieloide (Robbins, P. B., X. J. Yu, D. M. Skelton, K. A. Pepper, R. M. Wasserman, L. Zhu, y D. B. Kohn. 1997. J Virol. 71: 9466-9474); sufijo MG); (iii) la situación de eGFP en el vector (es decir, secuencia arriba o secuencia abajo respecto el putativo RRE BIV; prefijo BC2 vs. BC3); y (iv) segmentos adicionales insertados secuencia abajo respecto la señal de empaquetamiento BIV (sufijos gag, ppt, sar). Además, dos vectores contienen una LTR 3' modificada en la cual se ha sustituido una larga porción de U3 (incluyendo la caja TATA) por un pequeño segmento del virus SV40 que contiene el elemento potenciador de la señal de poliadenilación tardía, situado secuencia arriba (USE; Schek, N., C. Cooke, y J. C. Alwine. 1992. Mol Cell Biol. 12: 5386-5393; prefijo BC3 vs. BC4).

Todas las endonucleasas de restricción se compraron a Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN). El plásmido pBIV, que contiene el clon BIV provírico 127 (Garvey, K. J., M. S. Oberste, J. E. Elser, M. J. Braun, y M. A. Gonda. 1990, Virology. 175: 391-409), se obtiene en "the National Institutes of Health" -los Institutos Nacionales de la Salud-.

El pCl plasmídico se obtiene de Promega (Madison, WI). El plásmido pCIGL contiene el ADNc de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) (Burns, J. C., T. Friedmann, W. Driever, M. Burrascano, y J. K. Yee. 1993. Proc Natl Acad Sci U S A. 90: 8033-8037, Yee, J. K., A. Miyanohara, P. Laporte, K. Bouic, J. C. Burns, y T. Friedmann. 1994, Proc Natl Acad Sci US A. 91: 9564-9568) en la secuencia de poliunión pCI, secuencia abajo del promotor inmediato temprano del cytomegalovirus humano (CMV) y del intrón quimérico y secuencia arriba respecto la señal de poliadenilación tardía del virus de simio 40 (SV40).

El plásmido pCrev, que contiene el ADNc de rev HIV-1 bajo el control del promoter CMV, se ha descrito previamente (Malim, M. H., J. Hauber, R. Fenrick, y B. R. Cullen. 1988. Nature. 335:181-183).

El plásmido pBH1 se genera mediante la inserción secuencial de dos segmentos pBIV en la secuencia de poliunión pCl utilizando técnicas estándar: un fragmento Smal-Xbal fragment de 5.5kb que contiene los genes gag, pol, vif, vpw, y vpy genes, así como los primeros exones que codifican los genes tat y rev; y un fragmento DraIII-PvuII de 1.3kb que contiene el elemento de respuesta a rev putativo y los segundos codones que codifican los genes tat y rev.

Los plásmidos pBH2 y pBH3 se construyen de la misma manera, pero se deleciona el intrón quimérico; además, el fragmento BIV 5' pBH2 también contiene el extremo 3' de 70bp de la secuencia guía, incluyendo el sitio donador principal del proceso de corte y empalme.

Los plásmidos pBH1 y pBH3 también se modifican por inserción de (1) un fragmento de HIV-1 de aproximadamente 500 pb que contiene la RRE, (2) un sitio interno de entrada a ribosoma (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (Jang, S. K., M. V. Davies, R. J. Kaufman, y E. Wimmer. 1989. J Virol. 63: 1651-1660), y (3) el ADNc de la N-acetiltransferasa puromicina (Vara, J. A., A. Portela, J. Ortin, y A. Jimenez. 1986. Nuc Acids Res. 14:4617-4624).

El plásmido se genera digiriendo el plásmido pBIV con BfrI y BgIII para retirar la mayor parte de la región codificadora y inserto en el espacio libre una secuencia de poliunión corta creada mediante la anelación de los oligonucleótidos BB5 (5'-TTAAGATTTAAATACGCGTGCGGCCGCA-3') y BB3 (5'-GATCTGCGGCCGCACGCGTATTTAAATC-3').

Se modifica el constructo de empaquetamiento BH2 y el constructo de empaquetamiento HIV-1 (el constructo de empaquetamiento HIV empieza con el promotor CMV, seguido de un intrón heterólogo, el donador del proceso de corte y empalme principal de HIV, la secuencia codificadora entera de HIV excepto por las deleciones en vpu, env y nef, luego el RRE de HIV-1 y finalmente el sitio de poliadenilación de SV40; véase también Douglas, J., W.-Y. Lin, M. Panis, y G. Veres. Human Gene Therapy, "Efficient HIV-based vector transduction of unstimulated human CD34+ cells in the SCID-hu Thy/Liv model of human T cell lymphopoiesis" -transducción eficiente con el vector basado en HIV de células CD34+ humanas no estimuladas en el modelo SCID-hu Thy/Liv de la linfopoyesis de las células T humanas) mediante la inserción en cada uno de ellos de los oligonucleótidos de hemaglutinina (HA) inmediatamente secuencia arriba respecto el codón de terminación de gag y mediante la deleción de la mayor parte de la región codificadora de pol, tal como se explica a continuación. En primer lugar, un pequeño fragmento que contiene el codón de terminación de gag de cada constructo de empaquetamiento (fragmento ApaI-AccI de 290bp de BIV, fragmento ApaI-BstXI de 360 pb de HIV-1), se liga a pBluescriptSK+ digerido con ApaI/EcoRV (Stratagene, La Jolla, CA). A continuación, cada subclon se somete a una amplificación de PCR reversa utilizando los cebadores que contienen las etiquetas HA: HHAS 5'-TATCCATACGATGTTCCAGATTATGCTTAAAGATAGGGGGGCAAT
TAAAG-3' y HHAA 5'-AGCATAATCTGGAACATCGTATGGATATTGTGACGAGGGGTCGCTG-3' para HIV-1 y BHAS 5'-TATCCATACGATGTTCCAGATTATGCTTAGACAAACAGCCTTTTATAAAG-3' y BHAA 5'-AGCA
TAATCTGGAACATCGTATGGATAATCTAATATAAGAGGGGGTGC-3' para BIV. Cada producto de PCR se circularías, luego el fragmento gag modificado se escinde con ApaI/SmaI y se liga en el constructo de empaquetamiento original con una deleción entre la diana de restricción ApaI en gag y el extremo 3' de pol (Asp718 para HIV-1, NsiI para BIV).

El potenciador/promotor inmediato temprano del CMV se utiliza para sustituir el promotor BIV en el LTR 5' en los plásmidos pBIV y pBBB, como se describe a continuación. Primero, la región CMV secuencia arriba de la caja TATA se somete a una amplificación PCR con los cebadores CB5 (5'-CGGGATCCCGTAGTTATTAATAGTAAT
CAATTACGG-3') y CMVBIV3 (5'-AGATATGGTTTATATAGACCTCCCACCGTACA-3') mientras que la región BIV secuencia arriba de la caja TATA se somete a una amplificación por PCR con los cebadores CMVBIV5
(5'-GGGAGGTCTATATAAACCATATCTTCACTCTGT-3') y Bgag3 (5'-GCCGTTTCTGTACTCTCTGGT-3').

En segundo lugar, los dos productos amplificados se mezclan y se someten a una amplificación utilizando los cebadores CB5 y Bgag3. El producto final se digiere con XmaCl y se liga en los plásmidos pBIV y pBBB digeridos previamente con NruI y XmaCI, generando los plásmidos pBIVC y pBBBC.

El plásmido pBIVC se digiere entonces con SmaI y AfIIII para quitar la mayor parte de la región codificadora y se liga con extremos romos a un segmento de ADN que contiene bien el promotor de CMV o bien el promotor de la fosfoglicerato quinasa de ratón (PGK) (Adra, C. N., P. H. Boer, y M. W. McBurney. 1987. Gene. 60: 65-74) unido al ADNc de la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) (Promega, Madison WI), generando los plásmidos pBCCG (también denominado pBIVC-SACG) y pBCPG (también denominado pBIVC-SAPG), respectivamente.

El plásmido pBIVC también se digiere con BfrI y BgIII para quitar un pequeño segmento de la región codificadora, y enconces se liga con extremos romos a los casetes CMV-eGFP y PGK-eGFP, así como a un segmento de ADN que contiene eGFP unido al promotor del virus del sarcoma proliferativo mieloide (MND) (Robbins, P. B., X. J. Yu, D. M. Skelton, K. A. Pepper, R. M. Wasserman, L. Zhu, y D. B. Kohn. 1997. J Virol. 71:9466-9474), generando los plásmidos pBC2CG (también denominado pBIVCBBCG), pBC2PG (también denominado pBIVC-BBPG), y pBC2MG, respectivamente.

El plásmido pBBBC también se digiere con Munl y Hpal para quitar las secuencias BIV entre el putativo RRE y el LTR 3', luego se liga a los casetes MND-eGFP y PGK-eGFP para generar los plásmidos pBC3MG y pBC3PG, respectivamente. El casete CMV-eGFP también se inserta en la diana de restricción BstEII del plásmido pBIV para generar pBCG.

El plásmido pBC3MG se digiere con BfrI y BgIII para quitar la secuencia de poliunión corta y luego (1) se liga a un framento BgIII de 500 pb del gen pol de pBIV (que contiene el tracto de polipurina central putativo) para producir el plásmido pBC3MGppt; (2) se liga a un fragmento BfrI de pBIV de \sim1 kb (que contiene el extremo 5' del gen gag de BIV) para producir el plásmido pBC3MGgag; o (3) se liga a un fragmento de -800bp que contiene la región de unión al esqueleto del interferón beta humano (SAR; Agarwal, M., T. W. Austin, F. Morel, J. Chen, E. Böhnlein, y I. Plavec. 1998., 72:3720-3728) para producir el plásmido pBC3MGsar.

El plásmido pBC3MGgag se lineariza con BfrI y se liga a los fragmentos SAR y cPPT para producir los plásmidos pBC3MGgagSAR y pBC3MGgagppt, respectivamente.

El plásmido pBC3MGppt se lineariza con BfrI y se liga al fragmento SAR para producir los plásmidos
pBC3MGpptsar.

Los plásmidos pBC3MP y pBC3MPsar se generan a partir de los plásmidos pBC3MG y pBC3MGsar, respectivamente, mediante la sustitución del ADNc de eGFP cDNA con el ADNc de la N-acetiltransferasa de puromicina (Vara, J. A., A. Portela, J. Ortin, y A. Jimenez. 1986. Nuc Acids Res. 14:4617-4624).

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Los plásmidos pBC4MG y pBC4MGppt, en los cuales el LTR 3' contiene una larga deleción en la región U3 y una inserción del elemento potenciador de la señal de poliadenilación tardía secuencia arriba (USE; Schek, N., C. Cooke, y J. C. Alwine. 1992. Mol Cell Biol. 12:5386-5393), se generan a partir de los plásmidos pBC3MG y pBC3MGppt, respectivamente, tal como se indica a continuación. En primer lugar, la porción 5' de lñas regiones LTR y SV40 se somete a una amplificación por amplificación por PCR con los cebadores GFP5 (5'-GAGGACGGCAACATCCTGG-3') y BSINSV3 (5'-AGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAACACATATGGGAAGTCCGGGG-3') mientras que la porción 3' se somete a una amplificación o PCRE con los cebadores BSINSV5 (5'-GTGAAATTTGTGATGC
TATTGCTTTATTTGTAATCTGTACTTCAGCTCGTGTAG-3') y BIV3 (5'-TCGCCGACATCACCGATGG-3').

En segundo lugar, los dos productos amplificados se mezclan y se someten a una amplificación utilizando los cebadores GFP5 y BIV3. El producto final se digiere con SspBI y SphI y se liga a los plásmidos pBC3MG y pBC3MGppt digeridos previamente con SspBI y SphI. Los plásmidos resultantes, pBC4MG y pBC4MGppt, contiene los 40 pb del USE de SV40 en vez de los 332 pb de la región U3.

Para la determinación relativa del sistema de transferencia de BIV, se utilizan los sistemas de transferencia génica HIV-1 y MLV. La construcción y la utilización de dichos sistemas para este propósito implica técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica.

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Ejemplo 1.2

Células Inmortalizadas

Se obtienen células de las siguientes Fuentes. Se obtienen células 293T de Gary Nolan (Universidad de Stanford, Palo Alto CA). Las células CEMSS se obtienen de AIDS Reagent Program (Rockville MD). Las células A-10 y las células D-17 se obtienen de la Colección Tipo Americana ("the American Tissue Type Collection", ATCC, Manassas VA). Las células MN9D (Choi, H. K., L. A. Won, P. J. Kontur, D. N. Hammond, A. P. Fox, B. H. Wainer, P. C. Hoffmann, y A. Heller. 1991. Brain Res. 552: 67-76) se obtienen de Rainer Ortmann (Novartis, Basel, Switzerly). Las células epiteliales de conejo embrional (EREp) (Oberste, M. S., J. C. Williamson, J. D. Greenwood, K. Nagashima, T. D. Copely, y M. A. Gonda. 1993. J Virol. 67:6395-6405) se obtienen de los Institutos Nacionales de la Salud ("the National Institutes of Health", Rockville MD).

Las células HUVEC (20) y las células de aorta (músculo liso) de rata primarias se obtienen de Clonetics (San Diego CA).

Las células HUVEC se cultivan en medio basal EBM con el kit bullet FGM que contiene un 0.1% de factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF), un 2% de suero bovino fetal (FCS), un 0.4% de extracto w de cerebro bovino/heparina, un 0.1% de GA-1000 (gentamicina, amfotericina B), y un 0.1% de hidrocortisona.

Se mantienen células de aorta de rata en medio basal EBM con el kit bullet EGM-MV que contiene un 0.1% de hEGF, un 5% de FCS, un 0.4% de extracto w de cerebro bovino/ heparina, un 0.1% de GA-1000, un 0.1% de hidrocortisona, y se cultivan en recipientes para el cultivo de tejidos Primaria (Becton Dickinson Biosciences, San Jose CA).

Las células CEMSS se cultivan en medio RPMI-1640 suplementado con un 10% e FCS. El resto de líneas celulares se cultivan en medio de Eagle modificado Dulbecco modificado (DMEM) suplementado con un 10% de FCS. Se suspenden 1,25x105 células HUVEC en 5ml de medio y se irradian con 8000 rad a partir de fuente de irradiación 137Cs (J. L. Shepherd, San Fernando CA), luego se transfieren a una placa de 6 pozos y se incuban durante dos días para permitir la sincronización de la fase G2/M del ciclo celular.

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Ejemplo 1.3

Producción de Virus

4-10 x 10^{6} células 293T se sembran en placas de 10 cm durante una noche y se transfectan al día siguiente con 20-30 \mug de ADn plasmídico mediante el procedimiento de fosfato cálcico (Clontech, Palo Alto CA). Típicamente se utilizan 20 \mug de vector, 10 \mu del constructo de empaquetamiento y 3 \mug del plásmido VSV-G. En los casos en los cuales se requiere proteína HIV-1 rev, se añade 4 \mug de plásmido pCrev. 24-72 horas más tarde, las células o el medio que contiene virus se recoge y se analiza de diferentes maneras (véase más abajo). Para determinar la eficiencia de la transfección, se analiza la expresión de eGFP de una porción de las células mediante citometría de flujo, utilizando FACScan (Becton Dickinson Biosciences, San Jose CA). Para medir la cantidad de virus shed/ liberado en el medio, se elimina el debris celular del medio mediante centrifugación a velocidad lenta, entonces se lisan 10 \mul y se analiza la actividd RT utilizando un paquete comercial (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN).

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Ejemplo 1.4

Análisis de los niveles de ARN: Ensayo Northern

Las células transfectadas se lisan y el ARN citoplasmático se prepara utilizando un paquete comercial (Qiagen, Valencia CA). Además, se recoge el medio que contiene el virus, se somete a una centrifugación a baja velocidad para separar el debris celular y luego se somete a una centrifugación a alta velocidad (50,000 x g durante 90 minutos a 4ºC) para recoger las partículas de virus. El sedimento vírico se lisa y se prepara el ARN vírico utilizando un paquete comercial (Qiagen, Valencia CA). Una cantidad fija (10 \mug) de ARN citoplasmático o de ARN vírico (una tercera parte de la preparación de ARN, no cuantificada) se somete a una electroforesis en gel de agarosa al 1% y se transfiere a un filtro de nylon (Bio-Rad, Hercules CA). El filtro se expone a 40x106 cpm de un fragmento de ADN cebado de forma aleatoria con 32P-dCTP utilizando un paquete comercial (Ambion, Austin TX), luego se lava y se analiza la sonda unida con un sistema de análisis de imágenes "phosphoimager" (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA). Las sondas incluyen un fragmento gag de BIV, un fragmento gag de HIV-1 (ambos de \sim1kb de tamaño), un fragmento U3 de BIV de -330bp BIV U3 y un fragmento eGFP de -800bp.

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Ejemplo 1.5

Análisis de Niveles de Proteína: Ensayo Western

Las células transfectadas se lisan sobre hielo durante 1 hora en un tampón que contiene 1% NP-40, 150mM NaCl, 10mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA, e inhibidor de proteasas Pefabloc (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). El lisado se somete a una centrigugación a 8.000 x g durante 20 minutos a 4ºC para eliminar las proteínas precipitadas y otros debris. Alternativamente, el medio que contiene virus se recoge, se somete a una centrifugación breve para eliminar el debris celular y a continuación se somete a una centrifugación a alta velocidad (50,000 x g durante 90 minutos a 4ºC) para recoger las partículas de virus. El sedimento vírico se lisa directamente en tampón de muestra SDS-PAGE (Novex, San Diego CA). Una cantidad fija de lisado celular o vírico se somete a electroforesis en gel de acrilamida y se transfiere a un filtro de nitrocelulosa. El filtro se expone a suero de conejo específico para la proteína Gag de BIV (obtenida de los Institutos Nacionales de la Salud "the National Institutes of Health"), a continuación al anticuerpo Ig anti-conejo de cabra conjugado con la peroxidasa de rábano picante (HRP) (Zymed, South San Francisco CA), después al sustrato de HRP OPD (Sigma, St. Louis MO). Estándares de peso molecular preteñidos (Bio-Rad, Hercules CA) se utilizan para determiner el peso molecular aproximado de las bandas Gag de BIV. Para el ensayo western blot de HIV, el filtro se expone a anticuerpo Gag anti-HIV biotinilado (Beckman Coulter, Fullteron CA) y luego a HRP conjugado con esteptavidina (Beckman Coulter, Fullteron CA) antes de la reacción OPD. Para el ensayo western blot HA, el filtro se expone a anticuerpo anti-HA biotinilado (Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN), a continuación a HRP conjugado con esteptavidina antes de la reacción OPD. Para el ensayo western blot VSV-G, el filtro se expone a anticuerpo monoclonal anti-VSV-G de ratón (Sigma, St. Louis MO), a continuación a HRP conjugado con esteptavidina antes de la reacción OPD (Zymed, South San
Francisco CA).

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Ejemplo 1.6

Análisis de Transducción

Para transducir las células, el medio que contiene el virus se somete a una breve centrifugación para eliminar el debris celular, a continuación se añade 1 ml de células frescas en tubos de polipropileno (5x105 de células CEMSS) o en placas de 6 pozos (3-6 x 105 de células adherentes sembradas por pozo el día anterior). Se añade sulfato de protamina (Sigma, St. Louis MO) a los pozos a una concentración final de 8 \mug/ml y los tubos/las placas se someten a centrifugación ("espinoculación") a 3000 rpm durante 2-3 horas a 32-37ºC. En experimentos posteriores, los tubos/pozos se suplementan también con tampón HEPES 10 mM antes de la espinoculación para prevenir que el pH del medio aumente mientras las células están en la centrífuga. Después de la espinoculación, los tubos y placas se procesan de diferentes maneras: se aspira el sobrenadante de los tubos, las células CEMSS se suspenden en medio fresco y se transfieren a placas de 6 pozos. En contraste con lo anterior, las placas espinoculadas se colocan otra vez en el incubador durante 30-60 minutos, a continuación se separa el medio y se añade medio fresco a los pozos. 2-3 días después de la espinoculación, una porción de las células se extrae de la placa y se analiza la expresión de eGFP en las mismas mediante citometría de flujo, utilizando un FACScan (Becton Dickinson Biosciences, San Jose CA). En el caso de las preparaciones de virus que contienen los vectores pBC3MP y pBC3MPsar, las células 293T se someten a espinoculación con diluciones en serie del medio que contiene el virus y se añade medio fresco suplementado con 5 \mug/ml de puromicina a las células 24 horas después de la espinoculación. 7-10 días más tarde se cuentan las colonias mediante visualización directa.

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Ejemplo 1.7

Infección de Células T Primarias

Se aíslan células mononucleares de la sangre periférica humana (PBMC) a partir de sangre completa periférica adulta mediante una centrifugación en gradiente de densidad Ficoll, se lava en solución salina tamponada fosfato (PBS) y y se suspenden en medio RPMI-1640 suplementado con un 10% de FCS. Una porción de las PBMC se activan mediante la adición de IL2 (Peprotech, Rocky Hill NJ) al medio hasta una concentración final de 200 U/ml y se cultivan las células durante 3 días en placas de 12 pozos (3x106 células por pozo) pre-recubiertas de la manera que se detalla a continuación: las placas se incuban con 1 \mug/ml de Fc de Ig anti-ratón de cabra (Pierce, Rockford IL) durante 3 horas, se lava con PBS, se incuba con una mezcla de 1 \mug/ml de anti-CD3 (OKT3) y 10 ng/ml de anticuerpos monoclonales anti-CD28 (BD Pharmingen, San Diego CA) durante 1 hora y se lava con medio. Se espinoculan 5 x 105 PBMC activadas o non estimuladas con sobrenadante vírico en tubos de polipropileno similares a las células CEMSS (véase más arriba); después de la espinoculación, las células se lavan y suspenden en medio que contiene IL2 y se cultivan en placas de 24 pozos pre-recubiertas con los mAbs anti-CD3 y anti-CD28. Cuatro días y dos semanas más tarde, una porción de las células se extrae del pozo y se analiza la expresión de eGFP en las mismas mediante citometría de flujo utilizando un FACScan (Becton Dickinson Biosciences, San Jose CA). Se identifican las células T por las propiedades de dispersión de la luz y por la expresión de CD4 y CD8, utilizando mAbs anti-CDA conjugados a APC y mAbs anti-CD8 conjugados a PerCP (Becton Dickinson Biosciences, San Jose CA).

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Ejemplo 1.8

Infección de Células Madre Hematopoyéticas(HSCs)

Se aíslan células CD34+ humanas a partir de sangre completa periférica movilizada con G-CSF a partir de donadores normales Isolex 300SA (Baxter, IL). Las células (80-90% de pureza, CD34+) se dividen en alícuotas (1 X 107) y se congelan en medio que consiste en un 45% de medio de Eagle modificado Iscove (IMDM), un 45% de FCS y un 10% de DMSO. Antes de la transducción, las células congeladas se descongelan en una solución tamponada que contiene un 2% de FCS, 1% de HEPES, y 10 U/ml Heparin. Después de la descongelación, las células (5x105) bien se espinoculan (véase más arriba) con sobrenadante vírico en ausencia de citoquinas, o bien se cultivan durante 48 horas en medio que contiene citoquinas (medio X-vivo 15 (BioWhittaker, Walkersville MD), un mimético de la trombopoyetina (tpo) (50 ng/ml; Novartis, Basel, Suiza), ligando fit3 (100 ng/ml), y ligando c-kit (100 ng/ml; ambos de Systemix, Palo Alto CA)) y a continuación se espinolulan con subrenadante vírico. Después de la infección las células se cultivan en medio que contiene citoquinas. Tres días o dos semanas más tarde, una porción de las células se tiñe con anticuerpo anti-CD34 conjugado con APC (Becton Dickinson Biosciences, San Jose CA) y se analiza la expresión de eGFP sobre las células CD34+ en un FACScan (Becton Dickinson Biosciences, San Jose CA).

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Ejemplo 2 Transducción de Células Humanas con BIV

El genoma BIV de tipo salvaje se modifica mediante la inserción del gen marcador de la proteína fluorescente verde mejorada, produciendo el constructo BCG (para detalles de la construcción de plásmido, véase el Ejemplo 1). El gen eGFP se inserta en una posición interior del gen de la cubierta vírica de manera que no quede afectada la expresión de rev o tat vírico o la función del elemento de respuesta a rev (RRE). La línea celular de carcinoma de riñón humano 293T se cotransfecta con el constructo BCG y con la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G); dos días después, el medio que contiene el virus se recoge y se expone a células 293T frescas. Además, se adiciona medio a la línea celular epithelial de conejo embrional EREp, que soporta la replicación de BIV de tipo salvaje (Oberste, M. S., J. C. Williamson, J. D. Greenwood, K. Nagashima, T. D. Copely, y M. A. Gonda. 1993. J Virol. 67:6395-6405.). Tres días después, se ensaya la expresión de eGFP en las células expuestas mediante citometría de flujo. Un subgrupo de las células 293T (aproximadamente el 5%) expresa eGFP, lo cual indica que BIV puede llevar a cabo todas las funciones (incluyendo la transcripción reversa y la integración) requeridas para la transducción de las células humanas. Se observan eficiencias de transducción similares para la línea celular EREp.

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Ejemplo 3 Constructos de Empaquetamiento BIV

Se generan los constructos de empaquetamiento que contienen los genes víricos tal como se describe en el ejemplo 1 (Fig. 2) y se ensaya la expresión de ARNm gag y la producción de virus en el sistema de expresión transiente
(Tabla 1).

TABLA 1 Producción de virus por los constructos BIVa

100

^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} El medio que contiene virus se obtiene a partir de las células 293T transfectadas con el constructo indicado y se analiza mediante un ensayo RT. Se llevan a cabo siete transfecciones. Se indican los valores en pg de proteína RT por ml de medio.\end{minipage}

Un constructo, BIVC, es idéntico al BIV de tipo salvaje excepto por la sustitución precisa de la región U3 LTR 5' por el promotor inmediato-temprano del citomegalovirus humano (CMV). La union entre los dos segmentos se localiza en las cajas TATA idénticas para maximizar las probabilidades de que el ARN vírico contenga el extremo 5' adecuado para la infección de las células diana. Los otros tres constructos de empaquetamiento BIV contienen el promotor CMV unido a la secuencia guía de BIV cerca del gen gag, delecionando el LTR 5' y el sitio de unión al cebador y -en el caso de los constructos BH1 y BH3- el donador principal del proceso de corte y empalme. El constructo BH1 contiene un pequeño intrón quimérico insertado entre los segmentos CMV y BIV. Secuencia abajo del gen pol el constructo BH2 contiene todas las secuencias codificadoras víricas excepto por una deleción (de aproximadamente 1 kb) del interior de env (la cual se predice que no afecta la expresión de tat y rev o la función RRE), mientras que los constructos BH1 y BH3 contienen secuencias BIV que terminan aproximadamente 250 pb secuencia abajo del gen pol. Dado que BH1 y BH3 carecen del gen rev y de RRE, se inserta RRE de HIV-1 secuencia abajo de las secuencias BIV y se proporciona la proteína rev de HIV-1 en trans cuando se caracterizan los constructos. Además, estos dos constructos contienen el ADNc de la N-acetiltransferasa de la puromicina (Vara, J. A., A. Portela, J. Ortin, y A. Jimenez. 1986 Nuc Acids Res. 14:4617-4624) acoplada al sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (ECMV; Jang, S. K., M. V. Davies, R. J. Kaufman, y E. Wimmer. J Virol. 63:1651-1660), para seleccionar las líneas celulares que producen de forma estable el constructo de empaquetamiento.

El análisis Northern del ARN citoplasmático de las células transfectadas indica que el constructo BIVC produjo niveles estacionarios de ARNm de gag mayores (816 cpm) que BIV de tipo salvaje (249 cpm) o que el constructo BCG (113 cpm), lo cual sugiere que el promotor CMV es má activo que el LTR BIV en las células 293T. Los constructos de empaquetamiento BH1 (70 cpm) y BH3 (39 cpm) expresan niveles menores de ARNm gag, pero BH2 (861 cpm) expresa niveles mayores comparables a los del constructo BIVC. Para comparar, se observa que un constructo de empaquetamiento derivado de HIV-1 expresa niveles incluso mayores de ARNm gag (1120 cpm).

El ensayo de la transcriptasa reversa (Tabla 1) y el análisis de Western Blot de virus obtenido a partir de las células transfectadas indican que BIVC produce más partículas de virus que BIV de tipo salvaje, BH1 y BH3, pero mucho menos que BH2 o que el constructo de empaquetamiento HIV-1. La baja cantidad de virus BIVC puede ser debida a una toxicidad en las células transfectadas, producida por el alto nivel de expresión por parte de BIVC de la proteína de cubierta BIV de tipo salvaje, dado que se observan efectos citopáticos y sincicios en el cultivo. El análisis de Western Blot indica que tanto las preparaciones de BIVC como las de virus BH2 han experimentado una maduración, es decir, que la poliproteína Gag se ha procesado casi por completo.

El ensayo RT indica que la cantidad de virus producido por BH2 es similar a la producida por el constructo de empaquetamiento HIV-1. Para verificar que las cantidades de virus son similares, estos dos constructos de empaquetamiento se modifican mediante la inserción de dos etiquetas de hemaglutinina (HA) consecutivas inmediatamente secuencia arriba del codón de terminación de gag. Los constructos etiquetados con HA, en los cuales además se deleciona la mayor parte del gen pol para bloquear el procesamiento de la poliproteína Gag, se introducen en las células 293T a lo largo de los constructos parentales/originales/madre. El virus modificado se obtiene dos días después y se compara al virus original mediante un ensayo de western blot utilizando anticuerpos específicos para la proteína Gag: ambos constructos modificados producen cantidades de virus similares a los constructos parentales. Los virus modificados se normalizan entonces mediante un ensayo RT de los constructos parentales (649pg para HIV-1, 205pg para BH2) y se analiza el contenido de etiqueta HA mediante ensayo de western blot. Las cantidades de poliproteína Gag HIV-1 etiquetada con HA y de poliproteína Gag de BIV etiquetada con HA son similares, corroborando el ensayo RT: el constructo de empaquetamiento BH2 produce niveles de virus aproximadamente similares al constructo de empaquetamiento HIV-1.

El análisis de Western blot se lleva a cabo también sobre las preparaciones NH2 y HIV-1 para determinar la eficiencia de la incorporación de VSV-G. Se obtiene el virus a partir de las células 293T transfectadas con cada constructo de empaquetamiento y con el constructo VSV-G, luego se normaliza mediante el ensayo RT y se somete a un análisis de Western blot utilizando un anticuerpo monoclonal específico para VSV-G. La cantidad de VSV-G detectado en las muestras BH2 y HIV-1 es similar, indicando que BIV incorpora VSV-G de forma tan eficiente como HIV-1.

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Ejemplo 4 Vectores BIV

Se generan vectores derivados de BIV, tal como se describe con detalle en el Ejemplo 1, los cuales contienen el gen marcador eGFP y todos los elementos víricos requeridos en cis para la transferencia a células diana.

En primer lugar, los dos vectores (BCCG y BCPG) contienen la secuencia guía completa, pero ninguna secuencia gag y secuencias env mínimas (es decir, no RRE) se comparan con los vectores análogos (BC2CG y BC2PG) que contienen aproximadamente 500 pb de secuencias gag y 1,2 kb de secuencias env (incluyendo el RRE putative). Los últimos vectores se generan porque estudios previos con otros retrovirus han indicado que el extremo 5' del gen gag aumenta el grado de encapsidación en las partículas de virus, bien por contener elementos de empaquetamiento o por estabilizar elementos de empaquetamiento situados más allá secuencia arriba (Bender, M. A., T. D. Palmer, R. E. Gelinas, y A. D. Miller. 1987. J Virol. 61:1639-1646, Buchschacher, G. L., y A. T. Panganiban. 1992. J Virol. 66:2731-2739; Parolin, C. P., T. Dorfman, G. Palu, H. Gottlinger, y J. Sodroski. 1994. J Virol. 68:3888-3895). Además, algunos estudios con HIV-1 han indicado que el gen gag contiene secuencias que bloquean la exportación de ARN a partir del núcleo y que RRE elimina dicho bloqueo en presencia de la proteína rev (Malim, M. H., J. Hauber, S. Y. Le, J. V. Maizel, y B. R. Cullen. 1989. Nature. 338:254-257; Schwartz, S., B.K. Felber, y G. N. Pavlakis. 1992. J Virol. 66:150-159). Se analiza la transducción en células 293T en los dos vectores que contienen el promotor interno PGK, utilizando el constructo de empaquetamiento BH2 pseudotipado con VSV-G: BC2PG transduce el 5% de las células, mientras que BCPG no transduce ninguna de las células (Fig. 3, Exp.#1). Se determina entonces para los cuatro vectores la expresión de ARN citoplasmático en células 293T transfectadas y en viriones BH2 recogidos, mediante análisis de western blot. Cada uno de los vectores produce altos niveles de ARN del vector de longitud completa en el citoplasma celular transfectado, pero solo los ARN de longitud completa de BC2CG y BC2PG son encapsidados de forma eficiente por los viriones BH2. Por lo tanto, es probable que el extremo 5' del gen gag de BIV contenga secuencias requeridas de forma directa o indirecta para la encapsidación de ARN vírico. De forma interesante, sin dichas secuencias en los ARNs de longitud completa de BCPG y BCCG, los ARNm iniciados internamente se encapsidan, lo cual sugiere que otros elementos de empaquetamiento residen en la porción 3' del genoma (Berkowitz, R. D., J. Fisher, y S. P. Goff. 1996. Current Topics in Microbiology y Immunology. 214:177-218).

A continuación, el promoter PGK se compara al promotor MND en dos contextos, es ecir, con el casete promotor-eGFP secuencia arriba (BC2PG y BC2MG) o secuencia abajo (BC3PG y BC3MG) del putativo RRE de BIV. En las células 293T, el ultimo contexto produce eficiencias de transducción ligeramente superiores que el primer contexto (14% vs. 6% par alos vectores PGK y 35% vs. 29% para los vectores MND), y en ambos contextos, el promotor MND funciona mejor que el promotor PGK (Fig. 3, Exp.#2). Sin embargo, todos los vectores transducen sustancialmente menos células que un virus BIV-1 que contenga un vector PGK-eGFP análogo (un 75% de transducción).

Entonces se produce un virus que contiene el vector óptimo, BC3MG, y se analiza su capacidad de ser concentrado por centrifugación, su capacidad de translucir una línea celular linfoide y el cambio en la frecuencia de la expresión de eGFP más de dos semanas después de la infección. Una porción de los viriones se recogen por centrifugación, se suspenden en un volumen 100 veces menor que el volumen original y después se diluyen, bien 10 veces o 100 veces. Aunque el virus x 1 exhibe menores eficiencias de transducción, la línea celular linfoide T CEMSS se transduce de forma más eficiente (12%) que las células 293T (5%). Además, el virus x 10 transduce un porcentaje 10 veces mayor de células 293T y un porcentaje 4,5 veces mayor de células CEM. Además, el porcentaje de células eGFP+ disminuye aproximadamente 5 veces después de dos semanas en la línea celular 293T y en un grado mucho menor en la línea CEMSS. Infecciones posteriores con preparaciones de virus nuevas, no concentradas, indica que la magnitud de reducción en el porcentaje de células 293T eGFp+ a lo largo del tiempo correlaciona de forma inversa con el porcentaje inicial de células eGFP+. Por ejemplo, se pone de manifiesto que las células 293T que son eGFP+ en un 73%, 2 semanas después de la infección son eGFP+ en un 43%, y 4 semanas después de la infección son eGFP+ en un 28%.

Las eficiencias de transducción mayores que exhiben los vectores BC3 en comparación con los vectores BC2 pueden deberse a una mayor estabilidad de la señal de empaquetamiento, a su posicionamiento lejos de las secuencias no víricas es decir, del promotor interno (Kaye, J. F., J. H. Richardson, y A. M. L. Lever. 1995. J Virol. 69:6588-6592). Por lo tanto, se insertan segmentos víricos adicionales inmediatamente secuencia debajo de la región gag en el vector BC3MG, incluyendo un segmento de aproximadamente 500 pb del gen pol, que contiene tractos de polipurina que pueden funcionar de manera análoga a la región del tracto de polipurinas central (cPPT) de HIV-1 (Charneau, P., M. Alizon, y F. Clavel. 1992. J Virol. 66:2814-2820, Charneau, P., Mirambeau., R. G, P., S. Paulous, H. Buc, y F. Clavel. 1994. J Mol Biol. 241:651-662). Adicionalmente, se inserta la porción 3' (aproximadamente 1 kb) del gen gag: dicho vector (BC3MGgag) contiene el gen gag complete excepto aproximadamente 200 pb en el dominio del cápside. Se pone de manifiesto que los dos nuevos vectores transducen frecuencias de células 293T ligeramente (70% y 73%) que el vector parental BC3MG (55%) cuando se utiliza con BH2 y VSV-G (Fig. 3, Exp.#3). A modo comparativo, un virus HIV-1 que contiene un vector MND-eGFP transduce el 100% de las células.

La región de unión al esqueleto de interferon \beta (SAR), que ha mostrado potenciar la expresión del vector a partir de ADN provírico integrado (Agarwal, M., T. W. Austin, F. Morel, J. Chen, E. Böhnlein, y I. Plavec. 1998. Journal of Virology. 72:3720-3728), también se inserta inmediatamente secuencia abajo de la señal de empaquetamiento. Dicho vector, BC3MGsar, transluce una frecuencia ligeramente mayor de células 293T que el vector BC3MGppt (71% vs. 60%; Fig. 3, Exp.#4). Adicionalmente, se generan vectores que contienen combinaciones pares del segmento SAR, el segmento gag 3' y el segmento cPPT; sin embargo, ninguno de estos vectores exhibe eficiencias de transducción mayores que los vectores que contienen los segmentos individuales aislados (Fig. 3, Exp.#4).

Después se comparan los vectores BC3MG y BC3MGppt con sus homólogos SIN, BC4MG y BC4MGppt. Dichos vectores SIN se han sometido a una deleción en el interior de 322 pb de la región U3 de LTR 3', reteniendo 55 pb en el extremo 5' y 7 pb en el extremo 3'; como resultado, la caja TATA y la mayoría de los elementos promotores se eliminan. Los vectores que se han sometido a deleción en dicha área se denominan "de auto-inactivación", o SIN, porque el vector integrado en la célula diana posee un LTR 5' incapz de dirigir la transcripción (Miyoshi, H., U. Blomer, M. Takahashi, F. H. Gage, y I. M. Verma. 1998. J Virol. 72:8150-8157, Zufferey, R., T. Dull, R. J. Myel, A. Bukovsky, D. Quiroz, L. Naldini, y D. Trono. 1998. J Virol. 72:9873-9880). Este efecto no solo aumenta la seguridad del vector, sino que en los casos en los cuales la transcripción desde LTR 5' interfiere con la transcripción a partir del promotor interno del vector, la deleción SIN puede aumentar también la expresión transgénica en la célula transducida. También se ha descrito previamente que la transcripción de translectura tiene lugar a partir de un provirus HIV-1 integrado (Dron, M., L. Hameau, L. Benboudjema, J. Guymarho, C. Cajean-Feroldi, C. Rizza PGodard, C. Jasmin, M. G. Tovey, y M. C. Lang. 1999. Arch Virol. 144:19-28), lo cual sugiere que los transciptos HIV-1 no siempre terminan en LTR 3'. Dado que este fenómeno también puede ocurrir en los vectores BIV y que puede disminuir la valoración del sistema de transferencia génica (Carswell, S., y J. C. Alwine. 1989. Mol Cell Biol. 9:4248-4258), el elemento potenciador de la señal de poliadenilación tardía SV40 situada secuencia arriba (USE; Schek, N., C. Cooke, y J. C. Alwine. 1992. Mol Cell Biol. 12:5386-5393) se inserta en el espacio creado por la deleción SIN. Se analiza la eficiencia de transducción de los dos nuevos vectores (BC4MG y BC4MGppt) con el constructo de empaquetamiento BH2 y VSV-G: BC4MG transduce el 68% de las células 293T, mientras que BC4MGppt transduce el 90% (Fig. 3, Exp.#5). Sin embargo, dado que los vectores no SIN parenterales exhiben eficiencias de transducción similares (68% y 84%, respectivamente), la deleción Sin y la inserción USE SV 40 no aumenta sustancialmente la valoración del sistema de transferencia del gen BIV.

Para determinar la valoración de los virus BIV con precisión, se elimina el ADNc de eGFP de los vectores BC3MG y BC3MGppt y se sustituye por el ADNc de la N-acetiltransferasa de puromicina (Vara, J. A., A. Portela, J. Ortin, y A. Jimenez. 1986. Nuc Acids Res. 14:4617-4624), generando los vectores BC3MP y BC3MPppt. Se repite el mismo procedimiento para el vector HIV-1 que contiene el casete MND-eGFP. Los tres virus se preparan en células 293T y se exponen diluciones en serie a células 293T frescas; después de dos días, las células se tratan con puromicina para matar las células no transducidas. Después de una semana en cultivo, el número de colonias que crece en las placas se cuenta y se utiliza para calcular la valoración de los virus originales. La valoración del virus HIV es de 1.2x10^{7} por ml, la valoración del virus BC3MP es de 3x10^{5} por ml y la valoración de BC3MPppt es de 4.5x10^{5} por ml.

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Ejemplo 5 Transducción de Otras Líneas Celulares y Células en Estadio de No División

El virus BIV concentrado, preparado en células 293T utilizando el constructo de empaquetamiento BH2, el vector BC3MG y VSV-G se utiliza para transducir un panel de líneas celulares: D-17, una línea de osteosarcoma de perro; A-10, una línea celular de músculo liso de rata; HUVEC, una línea celular de células endoteliales humanas; y MN9D, una línea celular neuronal de ratón. En cada una de dichas líneas celulares, el virus BIV transdujo un gran porcentaje (63-88%) de las células, incluso dos semanas después de la infección. Adicionalmente, se transducen células endoteliales de rata primaria con el virus BIV, aunque no de forma tan eficiente como las líneas inmortalizadas (22%).

Para determinar la capacidad del virus BIV de transducir células en estadio de no división, se ensaya la capacidad del virus BIV concentrado (10x) de transducir células HUVEC irradiadas y de los linfocitos de la sangre periférica humana (PBLs). La línea HUVEC se irradia dos días antes de la exposición al virus BIV, para sincronizar las células en la fase G2/M del ciclo celular. Como era de esperar, se observa que una preparación de virus de la leucemia murina (MLV) transduce readily las células no tratadas pero no las células irradiadas. En constraste con lo anterior, tanto el virus BIV como el HIV-1 transduce fácilmente las células no tratadas y las células irradiadas con eficiencias similares, lo cual indica que cada lentivirus es capaz de trasnducir las células en estadio de no división de manera eficiente.

En Pals humano no estimulados, el virus BIV exhibe eficiencias de transducción similares a las del virus HIV-1 cuando se ensayan las células cuatro días después de la infección, aunque la mayor parte de las células transducidas con BIV expresa niveles muy bajos de eGFP. Dos semanas después de la infección, sin embargo, dichas células atenuadas están casi ausentes en la población. Como resultado, el porcentaje de células transducidas es bajo: un 1% de virus 10x y un 6% del virus 40x. Sin embargo, el virus muestra también eficiencias de transducción bajas en Pals preactivados (es decir, en estadio de proliferación), dado que los virus 10x transducen sólo el 5% de las células. En contraste con lo anterior, el virus HIV-1 10x transdujo el 81% de las células preactivadas y el 44% de las células no estimuladas, mientras que el virus MLV 10x transdujo el 43% de las células preactivadas pero sólo el 1% de las células no estimuladas.

Finalmente, el virus BIV concentrado se utilizó para transducir células madre hematopoyéticas CD34+ (HSCs), la mayoría de las cuales son quiescentes (Knaan-Shanzer, F., D. Valerio, y V. W. van Beusechem. 1996. Hum. Gene Ther. 3:323-333 Uchida, N., D. He, A. Friera, M. Reitsma, D. Sasaki, B. Chen, y A. Tsukamoto. 1997. Blood. 89:465-472). La preparación BIV 10x transduce el 19% de las HSCs tres días después de la infección, mientras que el virus BIV 40x transdujo el 31% de las células. De forma interesante, casi todas las células transducidas con el virus BIV 10x expresan altos niveles de eGFP y dichas células no desaparecen cuando se analizan las células 11 días más tarde. Las células infectadas con el virus BIV 40x contienen dos poblaciones eGFP+: una (18% de las células) que expresa niveles muy bajos de eGFP y una (13% de las células) que expresa altos niveles de eGFP. Ambas poblaciones mostraron reducciones en un factor de 6 en la frecuencia al cabo de los siguientes 11 días.

Ejemplo 6 Sistema de Transferencia Génica basado en BIV

Ejemplo 6.1

Abreviaturas

HIV:

Virus de la Inmunodeficiencia Humana

BIV:

Virus de la Inmunodeficiencia Bovina

VSV-G:

Glicoproteína G de la Cubierta del Virus de la Estomatitis Vesicular

MLV:

Virus de la Leucemia Murina

AAV:

Virus Adeno-Asociado

IU:

Unidades Infecciosas

HSkMC:

Células de Músculo Esquelético Primario Humano

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Ejemplo 6.2

Introducción

Se han explorado diversos vectores víricos como vehículos para distribuir genes terapéuticos para la terapia génica humana. Se han utilizado ampliamente para dichos objetivos vectores basados en el virus de la leucemia murina(MLV), adenovirus, y virus adeno asociados (AAV). Sin embargo, todos dichos sistemas de vectores tienen sus ventajas y desventajas. Los vectores basados en MLV han mostrado ser seguros para la terapia génica humana, aunque sufren de la incapacidad de transducir células en estado de no división, cuyas células son a menudo las dianas terapéuticas in vivo. El vector basado en adenovirus humano es capaz de transducir de forma eficiente una diversidad de células diana en estadio de no división. Sin embargo, una fuerte reacción inmune del huésped y una expresión génica transiente han limitado las aplicaciones de los vectores adenovíricos más comúnmente utilizados. La baja capacidad codificadora de los vectores basados en AAV disminuye la utilidad de dichos vectores.

Recientemente, se han estudiado extensivamente sistemas de vectores basados en lentivirus en cuanto a su potencial utilización como sistema de distribución génica. Los vectores lentivíricos pueden transducir eficientemente tanto las células en estadio de división como las células en estado de no división y se integran de forma estable en los cromosomas del huésped, dando como resultado una expresión génica a largo plazo. El sistema de vector ofrece también un amplio tropismo debido a su capacidad de pseudotipar con cubiertas víricas heterólogas. Adicionalmente, los vectores lentivíricos no plantean ninguna cuestión en relación con el problema de la reacción inmune, debido al hecho de que sólo se expresa el transgen en las células diana. In vitro, se ha puesto de manifiesto que los vectores lentivíricos pseudotipados con VSV-G basados en el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) transducen una diversidad de células en estado de no división, por microfagos, neuronas, células hepaticas, células fotoreceptoras, y células madre hematopoyéticas. In vivo, los vectores lentivíricos han mostrado ser capaces de transducir neuronas de rata, lo cual da como resultado una expresión transgénica a largo plazo.

Para sortear las cuestiones de seguridad asociadas a los vectores lentivíricos basados en HIV, hemos desarrollado un vector lentivírico basado en el virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV). BIV no es un patógeno humano y no provoca la enfermedad obvia en su huésped natural, ganado vacuno. Mostramos aquí que 1) nuestro vector lentivírico basado en BIV tiene una titulación de 1,2x10^{6} i.u./ml, lo cual es comparable con sistemas basados en HIV; 2) los vectores basados en BIV pueden concentrarse más de 150 veces mediante una etapa de ultracentrifugación; y 3) los vectores basados en BIV transducen de forma eficiente las células primarias del músculo esquelético humano tanto en estadio de división como en estadio de no división.

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Ejemplo 6.3

Procedimientos

Células. Células primarias del músculo esquelético humano (hSkMC) se compraron en Clonetics (Clonetics, Walkersville, MD) y se mantuvieron y cultivaron según las instrucciones del fabricante. Las células del riñón embriónico humano 293T se cultivaron en Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, BioWhittaker, Walkersville, MD) que contenía un 10% de suero bovino fetal (medio DMEM completo) (FBS, Hyclone Labs, Logan, UT).

Sistema de transferencia génica basado en BIV. El sistema de transferencia génica basado en BIV contiene tres constructos plasmídicos: un constructo de empaquetamiento BIV para proporcionar la función asistente; un esqueleto de vector lentivírico que codifica un gen marcador, por ejemplo eGFP, o un gen resistente a fármaco, por ejemplo el gen resistente a la puromicina; y un constructo de expresión que codifica el gen de expresión VSV-G. El esqueleto de vector lentivírico y el constructo de expresión VSV-G son esencialmente los mismos que se han descrito más arriba. Sin embargo, el constructo de empaquetamiento BH2 se modificó. Específicamente, se delecionó una secuencia de empaquetamiento putativa de 15 pb desde el ditio principal donador del proceso de corte y empalme (MSD) hasta el codón de inicio de gag de BIV, generando BH2\Delta\Psi. Para delecionar la secuencia de empaquetamiento putativa, la región entre MSD hasta el codón de inicio de ag se sometió a una amplificación por PCR con dos cebadores PackageDel 5 (5'-CGACCCGGGCGGCCGCTTCG-3') y PackageDel 3 (5'-CTACTCACCTGTCCGGAGTC-3').

El producto de PCR amplificado se digirió con SmaI y se ligó al plásmido BH2 digerido previamente con SmaI, dando lugar a BH2\Delta\Psi.

Preparación del vector lentivírico BIV. Para generar el vector lentivírico BIV, se transfectaron células 293T con 85% de confluencia en una placa de 10 cm con 15 \mug de plásmido de empaquetamiento BH2\Delta\Psi, 15 \mug de plásmido vector (BIVMNDeGFP o BIVMNDPuro) y 4.5 \mug VSV-G de plásmido de expresión (pCMV.VSV-G) utilizando un sistema de trnasfección basado en fosfato cálcico. El sobrenadante con el vector se recogió 48 horas después de la transfección y se filtró a través de un filtro 0,45 \muM. A continuación se dividió el vector en alícuotas y se almacenó a -80ºC hasta su utilización. Para concentrar el vector lentivírico BIV, el sobrenadante de vector recogido se sometió a ultracentrifugación durante 90 minutos a 100.000 x g a 4ºC. El vector sedimentado se resuspendió en un pequeño volumen de medio DMEM y las alícuotas se almacenaron a -80ºC hasta su utilización.

Transducción. Las células diana se transdujeron con vector lentivírico durante cuatro horas en presencia de 8 \mug/ml de sulfato de (Sigma, St. Luis, MO). Las células se lavaron entonces cno medio de cultivo celular dos veces y se cultivaron contínuamente durante 48 horas adicionales. Se analizó la expresión de eGFP en las células transducidas con FCAScan.

Valoración del vector lentivírico BIV. Para valorar el vector lentivírico basado en BIV, se cultivaron 5 x 10^{4} células T por cada pozo de una placa de seis pozos en el día uno. En el día dos, un vector lentivírico (5 \mul de fracción no concentrada suplementada con 2 ml de medio DMEM completo) que codificaba el gen de resistencia a la puromicina se utilizó para transducir las células en presencia de 8 \mug/ml de sulfato de protamina. En el día tres, las células transducidas se tripsinizaron y un 5% de las células transducidas de cada pozo se cultivaron en una placa de 6 cm con medio DMEM completo en presencia de 5 \mug/ml de (Sigma, St. Luis, MO). Tres días más tarde, se sustituyó el medio por medio de cultivo celular fresco con puromicina. El día siete después de la transducción. El medio de cultivo celular se aspiró y los clones resistentes a la puromicina se tiñeron con azul de Coomassie y se contaron.

Ensayo de la transcriptasa reversa. Aprovechando el hecho de que RT de BIV reacciona de manera cruzada con RT de HIV, cuantificamos RT de BIV con un paquete de ensayo de RT HIV comprado a Roche.

Incorporación BrdU. Para determinar si las células se estaban dividiendo activamente cuando las células se transdujeron, las células se etiquetaron con BrdU (BrdU labeling kit -paquete de etiquetado BrdU-, comprado a Phamingen, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante.

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Ejemplo 6.4

Resultados

Sistema de transferencia génica basado en BIV. El sistema de transferencia génica basado en BIV consiste en un constructo de empaquetamiento BIV, un constructo de vector BIV y un constructo de expresión VS-G (Figura 4). Para generar el vector lentivírico BIV, los tres constructos se transfectaron en células 293T y el sobrenadante del vector vírico se recogió 48 horas después de la transfección, tal como se describe en los Procedimientos.

Titulación de un vector lentivírico basado en BIV. Para determinar la valoración aproximada de un vector lentivírico basado en BIV se cotransfectó en células 293T BH2\Delta\Psi (15 \mug), BMNDpuro (un esqueleto de vector lentivírico BIV con el gen promotor de resistencia a la puromicina MND) (15 \mug) y pCMV.VSV-G (4.5 \mug), tal como se ha descrito en los Procedimientos. Como control, se sustituyó BMNDpuro por BMNDeGFP (se sustituyó el gen codificador de la resistencia a la puromicina en BMNDpuro por el gen codificador de eGFP). Los vectores lentivíricos resultantes, que codifican el gen de resistencia a la puromicina o eGFP, se utilizaron para transducir las células 293T. Después de la selección de puromicina, los clones resistentes a la puromicina se contaron. El vector consiguió aproximadamente 1.2x10^{6} clones resistentes a la puromicina por ml, lo cual sugiere que el vector lentivírico BIV tiene una valoración de aproximadamente 1,2 x 10^{6} i.u./ml. Dichos clones eran específicos para BIVMNDpuro, dado que no se encontraron clones resistentes a la puromicina en las células transducidas con BIVMNDeGFP.

Concentración del Vector lentivírico basado en BIV. Para obtener una mayor valoración del vector lentivírico BIV, el sobrenadante con el vector se sometió a ultracentrifugación. La actividad Rt del vector antes y después de la concentración se midió y se comparó. Como se muestra en la Tabla 2, de las tres preparaciones de vector independientes, la actividad RT aumentó en más de 150 veces.

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TABLA 2 Concentración de vectores lentivíricos basados en BIV. Se sometieron a ultracentrifugación tres preparaciones de vector lentivírico independientes. La actividad transcriptasa reversa (RT) se midió antes y después de la concen- tración. Después de una ronda de ultracentrifugación, las actividades RT aumentaron más de 150 veces para las tres preparaciones independientes con dos vectores BIV diferentes

101

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Transducción de células primarias del músculo liso humano en división mediante un vector lentivírico BIV. Fracciones de 1x10^{5} células primarias del músculo liso humano por pozo se cultivaron en una placa de seis pozos. Al día siguiente, las células se marcaron con BrdU o se transdujeron con BMNDeGFP (120 ng de equivalente RT por cada pozo) durante 3 horas en presencia de sulfato de protamina, tal como se describe en los Procedimientos. Se analizó la incorporación de BrdU en las células transducidas 16 horas después de la transducción o la expresión de eGFp 48 horas después de la transducción con un citómetro de flujo. Las células hSkSMC se transdujeron eficientemente con el vector lentivírico BIV BMNDeGFP. Más del 56% de las células dieron positivo para la expresión eGFP con una intensidad media eGFP de más de 2300, lo cual sugiere que el vector lentivírico basado en BIV puede transducir eficientemente las células primarias del músculo esquelético humano. Dichas células se encontraban activamente en estadio de división en el momento en que las células se transdujeron, tal como indica la incorporación activa de BrdU por las células.

Transducción de células primarias del músculo liso humano en estadio de no división mediante un vector lentivírico BIV. Para detener el ciclo celular, se irradiaron células hSkSMC con un irradiador gamma a 3500 rads. Fracciones de 2x10^{5} de células irradiadas por pozo se cultivaron en una placa de seis pozos. Al día siguiente, las células se marcaron con BrdU o se transdujeron con BMNDeGFP (120 ng de equivalente RT por cada pozo) durante 3 horas en presencia de sulfato de protamina, tal como se describe en los Procedimientos. Se analizó la incorporación de BrdU en las células transducidas 16 horas después de la transducción o la expresión de eGFp 48 horas después de la transducción con un citómetro de flujo. Las células hSkSMC en estadio de no división se transdujeron eficientemente con el vector lentivírico BIV BMNDeGFP. Más del 59% de las células dieron positivo para la expresión eGFP con una intensidad media eGFP de más de 1500, lo cual sugiere que el vector lentivírico basado en BIV puede transducir eficientemente las células primarias del músculo esquelético humano en estadio de no división. Se confirma que dichas células se encontraban en estadio de no división en el momento en que las células se transdujeron, tal como indica la ausencia de incorporación de BrdU.

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Ejemplo 6.5

Discusión

Los vectores basados en lentivirus han surgido como una tecnología de transferencia génica prometedora para la terapia génica humana. Los vectores lentivíricos son capaces de transducir eficientemente tanto las células que se encuentran en estadio de división como las que se encuentran en estadio de no división tanto in vitro como in vivo, dando como resultado una expresión transgénica a largo plazo. Se requierer una expresión génica terapéutica sostenida a largo plazao para ciertas aplicaciones en las cuales se necesita una expresión génica de vida larga para conseguir el efecto terapéutico. Estas incluyen enfermedades como por ejemplo las enfermedades neuronales, las enfermedades metabólicas y algunas enfermedades oculares. La mayoría de dichas enfermedades no tienen terapias efectivas.

Aunque se ha documentado una diversidad de sistemas de transferencia génica basados en lentivirus, el sistema más eficiente estaba basado en HIV. La seguridad es de suprema importancia para la terapia génica basada en vector vírico. Para sortear las potenciales cuestiones de seguridad relacionadas con los vectores lentivíricos basados en HIV, hemos desarrollado un sistema de transferencia génica basado en BIV. Hasta donde sabemos, BIV no es un patógeno humano y no provoca ninguna enfermedad obvia en su huésped natural.

BIV no se ha estudiado intensivamente. Por ejemplo, la señal de empaquetamiento no se ha identificado. Como consecuencia, en algunos constructos previos, tanto los transcriptos de empaquetamiento como los transcriptos de vector se empaquetaron en partículas de vector, dando como resultado una menor valoración de vector lentivírico BIV. En este ejemplo, delecionamos la secuencia de empaquetamiento putativa, una región desde el MSD hasta el codón de inicio de gag. Encontramos que esta secuencia es parte de la señal de empaquetamiento BIV (datos no mostrados). También encontramos que la secuencia en la región secuencia arriba de MSD y los primeros 200 pb de gag contienen los elementos adicionales para empaquetar de manera eficiente el transcripto BIV.

Hemos determinado la valoración aproximada de nuestro vector lentivírico BIV actual utilizando un vector que codifica el marcador de selección resistente a la puromicina. La valoración del vector BIV ascendió aproximadamente a 1,2 x 10^{6} unidades infecciosas por ml, lo cual es comparable a los vectores lentivíricos basados en HIV. También hemos determinado que el vector lentivírico BIV pseudotipado con VSV-G puede concentrarse a una valoración mayor con una simple etapa de ultracentrifugación.

De hecho, también hemos confirmado que nuestro vector lentivírico basado en BIV es capaz de integrarse en el cromosoma celular, dando como resultado una expresión génica sostenida a largo plazo, tal como indica en análisis de Southern blot y el paso continuo de células humanas transducidas BIV.

Las células del músculo esquelético representan dianas ideales para la terapia génica humana, especialmente para las proteínas terapéuticas secretoras, dado que es fácil administrar un agente intramuscularmente. En este estudio, transducimos las células primarias del musculo esquelético tanto en estado de división como en estadio de no división. Encontramos que nuestro vector lentivírico basado en BIV no concentrado transduce efectivamente dichas células.

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Ejemplo 6.6

Resumen

Los sistemas de transferencia génica basados en lentivius representan una tecnología de distribución génica prometedora debido a su capacidad de transducir eficientemente una diversidad de células diana en estadio de no división in vitro e in vivo. La incorporación en el cromosoma celular da como resultado una expresión transgénica a largo plazo. Adicionalmente, la expresión génica mediada por vector lentivírico no requiere la síntesis de novo de la proteína vírica, reduciendo la potencial eliminación de células diana por el sistema inmune del huésped. Sin embargo, los sistemas de lentivirus con los resultados más prometedores hasta la fecha son los basados en HIV. HIV es el agente causante del SIDA. Se han desarrollado diferentes sistemas de transferencia génica basados en lentivirus animales. Aunque dichos sistemas proporcionan alternativas a los vectores basados en HIV, la valoración y la eficiencia de transducción de vectores lentivíricos animales son menores en comparación con los vectores basados en HIV. En este ejemplo, describimos un sistema de vector lentivírico basado en BIV mejorado que consiguió una valoración de 1x10^{6} i.u./ml (unidades infecciosas por ml) (no concentrado) y que puede concentrarse más de 150 veces. Los vectores lentivíricos basados en BIV transducen eficientemente tanto las células musculares esqueléticas humanas que se encuentran en estadio de división como las que se encuentran en estadio de no división. Nuestros datos indican que el vector lentivírico basado en BIV puede proporcionar un sistema de transferencia génica excelente para la terapia génica humana.

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Ejemplo 7 Generación de un Sistema Vector basado en BIV Mínimo

Un sistema de vector lentivírico mínimo basado en BIV deseado consiste en un constructo de vector mínimo, un constructo mínimo de empaquetamiento y un constructo de vector de expresión de proteína de superficie vírica.

Ejemplo 7.1

Constructo de Vector Mínimo

Un constructo mínimo de vector basado en BIV (designado BC4MG.min) contiene un LTR 5' BIV modificado, un sitio donador principal del proceso de corte y empalme mutado, una secuencia de empaquetamiento, una secuencia gag mínima, cPPT, un transgen unido operativamente a un promotor interno CTE (elemento de transporte constitutivo del virus de mono Mason-Pfizer), PPT 3' y LTR 3'. Véase la Figura 5. Específicamente, el promoter inmediato-temprano CMV, que acaba en la caja TATA, se une al inicio LTR 5' de BIV inmediatamente después de la caja TATA. Las secuencias BIV terminan a 200 pb en la región codificadora gag. Todos los vectores contienen ADNc de un gen indicador o de otro transgen unido a un promotor interno heterólogo: CMV, PGK, o MND. Secuencia abajo del ADNc del transgen se encuentra el LTR 3' de BIV y 80 pb de secuencias env adyacentes que contienen un PPT 3'. Un cPPT putativo se inserta secuencia arriba del promotor interno y una copia o múltiples copias de CTE se insertan secuencia abajo del transgen. El LTR 3' contiene una larga deleción en la región U3 y una inserción del elemento potenciador situado secuencia arriba de la señal de poliadenilación tardía SV40, tal como se describe en el Ejemplo 1.

El vector mínimo basado en BIV se genera sobre la base BC4MGppt con las siguientes modificaciones: (i) deleción adicional de la secuencia gag a 200 pb; (ii) mutación del codón de inicio ATG de gag; (iii) mutación del of the sitio donador principal del proceso de corte y empalme (MSD); y (iv) sustitución del elemento de respuesta a rev de BIV putativo (RRE) con CTE.

Para facilitar la manipulación del plásmido, BC4MGppt se digiere con BspMI, y el fragmento resultante de 4743 pb que contiene la secuencia completa del vector se clona pBluescript digerido previamente con HincII, dando lugar aBS4MGppt.

Para realizar una deleción adicional en la secuencia gag, BS4MGppt se digiere con EcoNI y BqIII, el fragmento resultante de 7287 se autoliga para dar el plásmido BS4MGppt.\Deltagag. El vector resultante contiene sólo una secuencia de gag de BIV de 200 pb.

Para mutar el sitio donador principal del proceso de corte y empalme, el plásmido BS4MGppt.\Deltagag desde la región secuencia arriba del promotor CMV hasta la región MSD se amplifica por PCR con los MSD5 (5'-GCTCTAGAAC
TAGTGGATCCCCCGGCATCCCG-3') y MSD3 (5'-GGGGAAAACACGCAACTTCTCTCCTGTCCGGAG-3').

El producto amplificado se digiere con SpeI y SmaII y se liga en el fragmento de 6373bp resultante de digerir previamente BS4MGppt.\Deltagag con SpeI y SmaII. El plásmido resultante se designa BS4MGppt.\DeltagagATG.

Para realizar una mutación en el codón de inicio gag, el plásmido BS4MGppt.\DeltaMSD desde la región secuencia arriba del promotor CMV hasta la región gag se amplifica por PCR con los cebadores gag5 (5'-TCTAGAACTAGTG
GATCCCCC-3') y gag3 (5'-CTCTTCAACCCGGGGAAAAC-3').

El producto amplificado se digiere con SpeI y SmaII y se liga en el fragmento de 6373bp resultante de digerir previamente BS4MGppt.\DeltagagATG.

Para sustituir el elemento de respuesta a rev BIV putatitvo (BIVRRE) con CTE, la secuencia CTE se inserta en la diana de restricción SspBI del plásmido BS4MGppt.\DeltagagATG y a continuación se elimina completamente el BIVRRE. Para insertar CTE, se amplifica el CTE del virus de mono Mason-Pfizer (CTE de MPMV) con los cebadores CTE5' (5'-TGATCTGTACAAGTAAGCTAGCACCTCCCCTGTGAG-3') y CTE3' (5'-CCTTTTGTACAGTC
GACATGCATGACACATCCC-3').

El producto amplificado se digiere con SspBI y se liga en BS4MGppt.\DeltagagATG digerido SspBI. El plásmido resultante se denomina BS4MGpptCTE.\DeltagagATG. Para eliminar BIVRRE, en primer lugar se somete la región secuencia arriba de BIVRRE a una amplificación por PCR con los cebadores RRE1 (5'-GTTGGCGCCCAACGTGGGGCTC
GAGTAAGAGAG-3') y RRE2 (5'-TAAGTGACCTATTTCTTCAGTGGTGTGTGT-3') mientras que la region secuencia abajo de BIVRRE se somete a una amplificación de PCR con los cebadores RRE3 (5'-ATAGGTCACTTA
TATGGGAATGAAAGACCC-3') y RRE4 (5'-AACTGCTGAGGGCGGGACCGCATCTGG-3').

En segundo lugar, los dos productos amplificados se mezclan y se someten a una amplificación por PCR con los cebadores RRE1 y RRE4. El producto final se digiere con Kasl y BbvCl y se liga en el plásmido BS4MGpptCTE.
\DeltagagATG digerido previamente con Kasl y BbvCl, generando un constructo de vector mínimo basado en BIV
BS4MG.min.

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Ejemplo 7.2

Constructo mínimo de empaquetamiento

Un constructo mínimo de empaquetamiento contiene secuencias codificadoras gag y pol de BIV unidas a una copia o a múltiples copias de un CTE. Véase la Figura 5.

Para generar el constructo mínimo de empaquetamiento, en primer lugar se amplificó CTE por PCR con dos cebadores CTE1 (5'-CGGGGTACCACCTCCCCTGTGAGCTAG-3') y CTE2 (TGCTCTAGAGACACATCCCTCG
GAGGC-3').

El producto amplificado se digiere con Kpnl y Xbal y se liga a un plásmido pCI digerido previamente Kpnl y Xbal, generando pCI.CTE. En segundo lugar se amplifica por PCR la secuencia codificadora gag y pol de BIV con dos cebadores GAG5 (5'-CCGCTCGAGATGAAGAGAAGGGAGTTAGAA-3') y POL3 (5'-CCGCTCGAGTCAC
GAACTCCCATCTTGGAT-3').

El producto amplificado se digiere con Xhol y se liga a pCI.CTE previamente digerido Xhol, generando un constructo mínimo de empaquetamiento basado en BIV, BIVGPCTE.

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Ejemplo 7.3

Constructo de vector de Expresión

El sistema de vector lentivírico mínimo basado en BIV contiene además un tercer constructo, un constructo de vector de expresión que comprende un gen que codifica una proteína de cubierta vírica de un virus diferente. La proteína de superficie vírica puede ser cualquier otra proteína de cubierta vírica, incluyendo la glicoproteína de la cubierta del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) y otros. Véase la Figura 5.

<110> Novartis AG

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Vectores Basados en el Virus de la Inmunodeficiencia Bovina (BIV)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 4-30922A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 09/734,836

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2000-12-12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/US00/33725

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-12-14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de poliunión con diana de restricción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de poliunión con diana de restricción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de poliunión con diana de restricción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de poliunión con diana de restricción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (50)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (46)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (50)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (48)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (36)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (32)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(33)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(21)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (50)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) . . (54)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (19)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (20)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Inmunodeficiencia Bovina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (32)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Inmunodeficiencia Bovina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (21)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Inmunodeficiencia Bovina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (36)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (33)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Inmunodeficiencia Bovina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Inmunodeficiencia Bovina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Inmunodeficiencia Bovina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Inmunodeficiencia Bovina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (27)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión al cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (27)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Inmunodeficiencia Bovina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Inmunodeficiencia Bovina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

131

Claims (15)

1. Célula huésped humana in vitro que comprende un sistema de vector, donde dicho sistema de vector comprende:

a)

un segmento de ADN de un genoma BIV, una secuencia de empaquetamiento para empaquetar ARN en viriones; un promotor unido operativamente al segmento de ADN; y un transgen;

b)

un constructo de empaquetamiento BIV que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia codificadora gag/pol de BIV, una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia codificadora gag/pol y opcionalmente uno o más de los siguientes elementos: (i) un intrón heterólogo, (ii) un elemento de transporte de ARN y (iii) una secuencia codificadora de Rev; y

c)

un constructo de expresión que comprende un gen que codifica una proteína de superficie vírica.

2. Célula huésped humana que comprende un sistema de vector según la reivindicación 1, donde el transgen está unido operativamente a un promotor interno.

3. Célula huésped humana que comprende un sistema de vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la secuencia de empaquetamiento es una secuencia de empaquetamiento de BIV.

4. Célula huésped humana que comprende un sistema de vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde cualquier codón de inicio en la secuencia de empaquetamiento del constructo de vector se elimina mediante deleción o mutación.

5. Célula huésped humana que comprende un sistema de vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sitio donador principal del proceso de corte y empalme se ha inactivado o elminado del constructo de vector.

6. Célula huésped humana que comprende un sistema de vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el vector comprende además un cPPT.

7. Célula huésped humana que comprende un sistema de vector según la reivindicación 6, donde el cPPT es un cPPT de BIV.

8. Célula huésped humana que comprende un sistema de vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el vector comprende además un elemento de transporte de ARN.

9. Célula huésped humana que comprende un sistema de vector según la reivindicación 8, donde el elemento de transporte de ARN es un elemento de respuesta a rev (RRE) lentivírico.

10. Célula huésped humana que comprende un sistema de vector según la reivindicación 9, donde el RRE lentiviral es un RRE de BIV.

11. Célula huésped humana que comprende un sistema de vector según la reivindicación 9, donde el elemento de transporte de ARN es un elemento de transporte constitutivo (CTE).

12. Célula huésped humana que comprende un sistema de vector según la reivindicación 11, donde el CTE es un CTE de virus de mono de Mason-Pfizer.

13. Célula huésped según la reivindicación 1 que comprende además una secuencia codificadora de Rev.

14. Procedimiento para producir un virión que comprende cultivar la célula huésped humana de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y recuperar un virión producido por el sistema de vector.

15. Utilización de un virión para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un humano, en cuyo método se transfiere un transgen a una célula humana, donde dicho virión se produce mediante un sistema de vector que comprende:

a)

un segmento de ADN de un genoma BIV, una secuencia de empaquetamiento para empaquetar ARN en viriones; un promotor unido operativamente al segmento de ADN; y un transgen;

b)

un constructo de empaquetamiento BIV que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia codificadora gag/pol de BIV, una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia codificadora gag/pol y opcionalmente uno o más de los siguientes elementos: (i) un intrón heterólogo, (ii) un elemento de transporte de ARN y (iii) una secuencia codificadora de Rev; y

c)

un constructo de expresión que comprende un gen que codifica una proteína de superficie vírica.