JP2014110789A - ウシ免疫不全ウイルス由来ベクター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a)BIVゲノムに由来するDNAセグメント、ビリオン内にRNAをパッケージするためにのパッケージング配列、該DNAセグメントに機能的に連結したプロモーター、第二プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子、を含むBIVベクター構築物;(b)少なくともBIVのgag又はpol遺伝子を含むBIV DNA配列断片、該BIV DNA断片に機能的に連結したプロモーター、及び、該BIV DNA断片の下流に位置するポリアデニル化配列、を含むBIVパッケージングベクター構築物;及び、(c)ウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター構築物、及び、目的の遺伝子を哺乳動物細胞内に移入する方法。
【選択図】図1
Description
本発明は、一般的には、組換えウイルスのベクターとしての使用、及び、より具体的には、所望のタンパク質を標的細胞内で発現させることが出来る、組換えウシ免疫不全ウイルス(BIV)由来のベクター構築物に関する。
更に本発明の特に好適な具体例として、BIV由来最小ベクターシステムが提供される。このシステムは、最小ベクター構築物、最小パッケージング構築物、及び最小ウイルス表面タンパク質発現構築物からなる。最小ベクター構築物は、第一BIV R領域に連結したプロモーター;該第一BIV R領域に連結したBIV U5要素;パッケージング配列;導入遺伝子;及び、第二BIV R領域に連結したBIV U3要素を含む。パッケージング構築物は、BIV gag/polコード配列に機能的に連結したプロモーター及びgag/polコード配列の3‘末端におけるポリアデニル化シグナルを含む。ウイルス表面タンパク質発現構築物は、ウイルスエンベロープコード配列に機能的に連結したプロモーター及び該コード配列の3‘末端におけるポリアデニル化シグナルを含む。
実施例1.1プラスミドの構築
(i)gag及びenv配列の量(BC vs.BC2prefix);(ii)eGFP発現を指示する内部プロモーター:CMV(CGsuffix)vs.PGK(ホスフォグリセレートキナーゼプロモーター(1);PGsuffix)vs.MND(骨髄増殖性肉腫ウイルスプロモーター(Robbins, P.B., X.J. Yu, D.M. Skelton, K.A. Pepper, R.M. Wasserman, L.Zhu, 及びD.B.Kohn, 1997, J. Virol. 71:9466-9474); MGsuffix);(iii)eGFPのベクター内での位置(推定BIVPREの上流又は下流;BC2vs.BC3prefix);及び(iv)推定BIVパッケージングシグナルの下流に挿入される付加セグメント(gag,ppt,sarsuffixes)において異なるベクターが作成される。更に、2つのベクターは修飾3‘LTRを含み、その中ではU3(TATAボックスを含む)の大きな部分が後期ポリアデニル化シグナル上流エンハンサー要素を含むSV40ウイルスセグメントと置換されている(USE; Schek, N., C. Cooke, 及びJ.C. Alwine, 1992 Mol. Cell Biol. 12:5386-5393; BC3 vs. BC4 prefix)。
細胞は以下のソースから入手する。293T細胞はGary Nolan (Stanford University, Palo Alto, CA)から入手した。CEMSS細胞はAIDS試薬プログラム(Rockville MD) から入手した。A−10及びD−17細胞はアメリカン・ティッシュ・タイプ・コレクション(ATCC、Manassas VA)から入手した。MN9D細胞(Choi, H.K., L.A. Won, P.J. Kontur, D. N. Hammond A.P. Fox, B.H. Wainer, P.C. Hoffmann, 及びA. Heller 1991, Brain Res. 552:67-76) はRainer Ortmann (Novartis, Basel, Switzerland) から入手した。胚性ウサギ上皮(EREp)細胞(Oberste, M.S., J.C. Williamson, J.D. Greenwood, K. Nagashima, T.D. Copeland, 及びM.A. Gonda 1993, J. Virol. 67:6935-6405) は国立衛生研究所(NIH, Rockville MD)から入手した。
4−10x106個の293T細胞を10cmディッシュに蒔き一晩の後、翌日にリン酸カルシウム法(Clontech, Palo Alto CA)により20−30μgプラスミドDNAでトランスフェクトする。典型的には、ベクター20μg、パッケージング構築物10μg、及びVSV−Gプラスミド3μgを使用する。HIV−1revタンパク質が必要とされる場合には、4μgのプラスミドpCrevを追加する。24−72時間後、細胞又はウイルス含有培地を回収し、様々な方法で分析する(以下を参照)。トランスフェクション効率を評価するには、細胞の一部を、FACScan(Becton dickinson Biosciences, San Jose CA)を用いるフローサイトメトリーによるeGFP発現に関して分析する。培地中に放出されたウイルス量を測定するには、培地から低速遠心によって細胞残渣(デブリス)を除去し、10μlを溶解し、市販のキット(Roche Molecular Biochemicals , Indianapolis IN) を用いてRT活性を分析する。
トランスフェクトした細胞を溶解し、市販のキット(Qiagen, Valencia CA) を用いて細胞質RNAを調製する。更に、ウイルス含有培地を回収し、低速遠心によって細胞残渣(デブリス)を除去し、次に、高速遠心(50,000 x g、90分間、4℃)でウイルス粒子を回収する。ウイルスペレットを溶解し、市販のキット(Qiagen, Valencia CA) を用いてウイルスRNAを調製する。細胞質RNAの固定量(10μg)又はウイルスRNA(RNA調製物の三分の一、定量せず)を1%アガロースゲル電気泳動にかけ、ナイロンフィルター(Bio-Rad, Hercules, CA) に移す。このフィルターを市販キット(Ambion, Austin TX)を用いて32P−dCTPによりランダムに標識化(random-primed) されたDNA断片(40x106cpm)に暴露し、次いで、洗浄し、結合したプローブをホスフォイメージャー(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)で分析する。プローブはBIVgag断片、HIV−1gag断片(〜1kb大きさ)、〜330bpのBIVU3断片、及び〜800bpのeGFP断片が含まれている。
1%NP−40,150mMNaCl,10mMTris−HCl(pH7.4)、1mMEDTA及びPefablocプロテアーゼインヒビター(Roche Molecular Biosciences, Indianapolis IN)を含む緩衝液中で、トランスフェクトした細胞を氷上で1時間溶解する。溶解物を遠心(8,000xg、20分間、4℃)して沈殿したタンパク質及び他の残渣を除去する。又は、ウイルス含有培地を回収し、短い遠心にかけて細胞残渣を除去し、次いで、高速遠心(50,000xg、90分間、4℃)にかけてウイルス粒子を回収する。ウイルスペレットを直接SDS−PAGE試料緩衝液(Novex, San Diego, CA)内で溶解する。細胞又はウイルス残渣の固定量をアクリルアミドゲル電気泳動にかけてニトロセルロースフィルターに移す。該フィルターをBIVGagタンパク質に対して特異的なウサギ血清(NIHから入手)、次いで、西洋ワサビペーオキシダーゼ(HRP)共役ヤギ抗ウサギIg抗体(Zymed, South San Francisco CA)、次いで、HRP基質OPD(Sigma, St. Louis MO)に暴露する。予め染色された分子量標準(Bio-Rad, Hercules CA) をBIVGagバンドのおおよその分子量を測定するのに使用する。HIVウェスタンブロットの場合には、OPD反応前に、フィルターはビオチニル化抗HIVGag抗体(Beckman Coulter,Fullteron CA)、次いで、ステプタビジン共役HRP(Beckman Coulter,Fullteron CA)に暴露する。HAウェスタンブロットの場合には、OPD反応前に、フィルターはビオチニル化抗HA抗体(Roche Molecular Biosciences, Indianapolis IN)、次いで、ステプタビジン共役HRP(Beckman Coulter,Fullteron CA)に暴露する。VSV-Gウェスタンブロットの場合には、OPD反応前に、フィルターはマウス抗VSV-Gモノクローナル抗体(Sigma, St. Louis MO)及びHRP共役ヤギ抗マウスIg抗体(Zymed, South San Francisco CA)に暴露する。
細胞を形質導入するために、ウイルス含有培地を短時間の遠心にかけ、細胞残渣を除去し、1mlをポリプロピレンチューブ内の新鮮な細胞(5x105CEMSS細胞)又は6ウェル(前日に蒔いたウェル当たり3−6x105付着細胞)に添加する。硫酸プロタミン(Sigma, St. Louis MO)を最終濃度8μg/mlとなるようにウェルに添加し、チューブ又はディッシュを3000prm、2−3時間、32−37℃で遠心(スピノキュレーション)にかける。後の実験では、チューブ又はディッシュには10mMのHEPES緩衝液をスピノキュレーションの前に添加し、細胞を遠心中に培地のpHが上昇するのを防ぐ。スピノキュレーションの後に、チューブ又はディッシュを異なる方法で処理する。上清をチューブから吸引し、CEMSS細胞を新鮮な培地に懸濁し6ウェルディッシュに移す。対照的に、スピノキュレーションしたディッシュはインキュベーターに戻して30−60分間放置し、その後、培地を除去し、新鮮な培地をウェルに添加する。スピノキュレーションの2−3日後に、細胞の一部をプレートから取り出し、FACScan (Becton Dicknson Biosciences, San Jose CA) 用いるフローサイトメトリーによりeGFP発現を分析する。ベクターpBC3MP及びpBC3MPsarを含むウイルス調製物の場合には、293T細胞は連続希釈したウイルス含有培地と共にスピノキュレーションにかけ、スピノキュレーションの24時間後に5μg/mlプロマイシン含有の新鮮な培地を細胞に添加し、7−10日後に、コロニーを直接目視により計測する。
成人末梢全血からフィコール密度勾配遠心によりヒト末梢血単核球(PBMC)を単離し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、10%FCS添加RPMI-1640培地に懸濁する。培地にIL2(Peprotech, Rocky Hill NJ)を最終濃度が200U/mlとなるように添加してPBMCの一部を活性化し、該細胞を以下のように予めコートした12ウェルディッシュ中(ウェル当たり3x106個の細胞)で3日間培養する。即ち、ディッシュを1ug/mlのヤギ抗マウスIgFc(Pierce, Rockford IL) と共に3時間インキュベートし、PBSですすぎ、1ug/mlの抗CD3(OKT3)及び10ng/mlの抗CD28(BD Pharmingen, San Diego CA)モノクローナル抗体混合物と共に1時間インキュベートし、培地ですすぐ。5x105個の活性化又は刺激されていないPBMCをポリプロピレンチューブ中でCEMSS細胞と同様にウイルス上清と共にスピノキュレーションする(上記)。スピノキュレーションの後に、細胞をすすぎ、IL2含有培地に懸濁し、抗CD3及び抗CD28モノクローナル抗体で予めコートした24ウェルディッシュ内で培養する。4日及び2週間後に、細胞の一部を取り出し、FACScan (Becton Dicknson Biosciences, San Jose CA) 用いるフローサイトメトリーによりeGFP発現を分析する。T細胞は光散乱特性、並びに、APC共役抗CD4モノクローナル抗体及びPerCP共役抗CD8モノクローナル抗体(Becton Dicknson Biosciences, San Jose CA) を用いるCD4及びCD8の発現により同定する。
ヒトCD34+細胞を、Isolex 300SA (Baxter, IL) を用いて正常ドナーのG-CSF可動化末梢全血から単離する。この細胞(80−90%純度のCD34+)を分取(1x107)し、45%イスコフ変性イーグル培地(IMDM),45%FCS及び10%DMSOから成る培地中で凍結する。形質導入に先立ち、まず、2%FCS,1%HEPES、及び10U/mlヘパリン含有緩衝液中で凍結細胞を融解する。融解後に、細胞(5x105)をサイトカイニンなしでウイルス上清と共にスピノキュレーション(上記)するか、又は、サイトカイニン含有培地(X-vivo15培地(BioWhittaker, Walkersville MD)、トロンボポイエチン(tpo)様(50ng/ml; Novartis, Basel Switzerland)、flt3リガンド(100ng/ml; Systemix, Palo Alto CA))、及びc−kitリガンド(100ng/ml; Systemix, Palo Alto CA))中で48時間培養し、その後、ウイルス上清と共にスピノキュレーションする。感染後に、細胞をサイトカイニン含有培地中で培養する。3日間又は2週間後に、細胞の一部をAPC共役抗CD34抗体FACScan (Becton Dicknson Biosciences, San Jose CA)で染色し、FACScan (Becton Dicknson Biosciences, San Jose CA) 用いるフローサイトメトリーによりCD34+細胞におけるeGFP発現を分析する。
野生型BIVゲノムに増強された(enhanced)緑蛍光タンパク質(eGFP)マーカー遺伝子を挿入することで修飾し、構築物BCGを作成する(詳細については実施例1のプラスミド構築を参照)。eGFP遺伝子はウイルスエンベロープ遺伝子内の内部位置に挿入されているので、ウイルスrev又はtat発現、若しくはrev応答要素(RRE)機能には影響を与えない。ヒト腎臓腫瘍セルラインである293Tを構築物BCG及び水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G)をコードするプラスミドでコトランスフェクションする。2日後に、ウイルス含有培地を回収し、新鮮な293T細胞に接触させる。更に、野生型BIV複製を支持する胚性ウサギ内皮セルラインEREp(Oberste, M.S., J.C. Williamson, J.D. Greenwood, K. Nagashima, T.D. Copeland 及びM.A. Gonda, 1993 J. Viorl. 67:6395-6405)を培地に添加する。3日後に、この細胞に関してフローサイトメトリーによりeGFP発現を分析する。293T細胞のサブセット(約5%)はeGFPを発現し、BIVがヒト細胞に形質導入するに必要な全ての機能(逆転写及び組み込み)を備えていることが示された。同様な形質導入効率がEREpセルラインについても認められる。
ウイルス遺伝子を含むパッケージング構築物は実施例1に記載のように作成し(図2)、gagmRNA発現及び一過性発現システムにおけるウイルス生産(表1)につきアッセイする。
実施例1に詳細に記載されているように、eGFPマーカー遺伝子及び標的細胞への移入にシスで必要な全てのウイルス要素を含むBIV由来ベクターを作成した。
第一に、gag配列以外の全てを含む完全なリーダー及び最小env配列(即ち、RREなし)を含有する2つのベクター(BCCG及びBCPG)を、約500bpのgag配列及び1.2kbのenv配列を含むアナログベクター(BC2CG及びBC2PG)と比較する。他のレトロウイルスを用いた以前の研究によってパッケージング要素を含むか又はより上流のパッケージング要素を安定化させるかによって、gag遺伝子の5‘がウイルス粒子内へのベクターRNAの包み込み(encapsidation)を増加することが示されているので(Bender, M.A., T. D.Paler, R.E. Gelinas, 及びA.D. Miller 1987, J.Virol. 61:1639-1646, Buchschacher, G.L., 及びA.T. Panganiban, 1992, J. Virol. 66:2731-2739;Parolin, C.P., T. Dorfman, G. Palu, H. Gottlinger, 及びJ. Sodroski, 1994 J. Virol.68:3888-3895)、後者のベクターを作成した。更に、HIV−1の研究によって、gag遺伝子は核からのRNA輸送を阻害する配列を含み、RREはこの阻害をrevタンパク質存在下で除去することが示されている(Malim, M.H., J. Hauber, S.Y. Le, J.V. Maizel,及び B.R. Cullen 1989 Nature 338:254-257;Schwartz, S., B. K. Felber, 及びG.N. Pavlakis 1992 J. Virol. 66:150-159)。PGK内部プロモーターを有する2つのベクターの293T細胞への形質導入を、VSV−Gで偽性化されたBH2パッケージング構築物を用いて分析する。BC2PGは細胞の5%に形質導入し、BCPGはいずれの細胞に形質導入しない(第3図、実験#1)。4つの全てのベクターをトランスフェクトした293T細胞及び回収したBH2ビリオンにおける細胞質RNA発現をノーザンブロット分析で評価する。各ベクターはトランスフェクトした細胞質内での高レベルな完全長RNAを生産するが、BC2CG及びBC2PGの完全長RNAのみがBH2ビリオンに効率的に包み込まれる。従って、BIVgag遺伝子の5’末端はウイルスRNAの包み込みに直接的又は間接的に要求される配列を含むことが多い。面白いことに、このような配列がBCPG及びBCCGの完全長RNA上にない場合、内部開始mRNAが取り込まれる。これは、他のパッケージング要素がBIVゲノムの3‘部分に存在することを示している (Berkowita R.D. J. Fisher, 及びS.P. Goff, 1996 Current Topics in Microbiology and Immunology 214:177-218) 。
パッケージング構築物BH2、ベクターBC3MG及びVSV−Gを用いて293T細胞内で調製した、濃縮BIVウイルスを用いて以下の一連の細胞を形質導入した:イヌ骨肉種ラインであるD−17;ラット平滑筋セルラインであるA−10;ヒト内皮セルラインであるHUVEC;及び、マウス神経セルラインであるMN9D。これらの各セルラインにおいて、感染2週間後でもBIVウイルスは細胞のかなりのパーセンテージ(63−88%)を形質導入した。更に、初代ラット内皮細胞をBIVウイルスで形質導入したが、不死化ラインのような効率ではなかった。(22%)。
HIV:ヒト免疫不全ウイルス
BIV:ウシ免疫不全ウイルス
VSV-G:水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質G
MLV:マウス白血病ウイルス
AAV:アデノ随伴ウイルス
IU:感染ユニット(単位)
HSkMC:ヒト初代骨格筋細胞
ヒト遺伝子治療用の治療遺伝子を輸送するために、様々なウイルスベクターが開発されてきた。マウス白血病ウイルス(MLV)、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス(AAV)に基づくベクターはこのような目的の為に広く使用されている。しかしながら、これらの全てのベクターシステムは利点と同時に欠点も有している。MLV由来ベクターはヒト遺伝子治療に対して安全性が証明されているが、しばしばインビボにおける治療標的となる非分裂細胞に形質導入する能力がないことが欠点である。ヒトアデノウイルス由来ベクターは様々な非分裂標的細胞に効率的に形質導入することができるしかしながら、強力な宿主免役反応及び一過性遺伝子発現のために、最も一般的に使用されるアデノウイルスベクターを利用することが制限される。AAVウイルス由来ベクターはそのコード能力が低いために、このベクターの有用性は低い。
細胞。ヒト初代骨格筋細胞(hSkMC)はクローンティクス(Clonetics, Walkersville, MD) から購入し、製造者の指示に従って維持及び培養した。ヒト胚性腎臓293T細胞は, 10%ウシ胎児血清(FBS: Hyclone Labs, Logan, UT)含有ダルベッコ変性イーグル培地(DMEM:BioWhittaker,Walksville,MD)(完全DMEM培地)で培養した。
BIV由来遺伝子移入システム。BIV由来遺伝子移入システムはBIVパッケージング構築物、BIVベクター構築物、及びVSV−G発現構築物から構成されている(図4)。BIVレンチウイルスベクターを作成するために、これら3つの構築物を293T細胞にコトランスフェクトし、上記のように、感染後48時間にウイルスベクター上清を回収した。
レンチウイルス由来ベクターはヒト遺伝子治療用の有力な遺伝子移入技術として現れてきた。レンチウイルスベクターは分裂及び非分裂細胞の双方に対してインビボ及びインビトロで効率的に形質導入することが出来、長期間に亘って導入遺伝子を発現する。治療効果を達成するために一生にわたる長期の遺伝子発現が要求されるような利用例においては、長期間に亘る治療遺伝子の発現が必要とされる。これらの例としては、神経性疾患、代謝疾患、及び眼疾患を挙げることが出来る。これら疾患の多くのものには効果的な治療法がない。
レンチウイルス由来遺伝子移入システムはインビボ及びインビトロにおいて様々な非分裂標的細胞を効率的に形質導入することができるので、有力な遺伝子移入技術である。細胞染色体内への取り込みによって導入遺伝子が長期間発現される。更に、レンチウイルスベクター媒介遺伝子発現はウイルスタンパク質の新生(de novo)合成を必要をしないために、宿主免疫システムにより標的細胞が除去される可能性を減少させる。しかしながら、これまでに最も有力な結果が得られていたレンチウイルスシステムはHIVに由来するものであった。HIVはAIDSの原因因子である。幾つかの動物レンチウイルスに由来する遺伝子移入システムが開発されて来た。これらのシステムはHIV由来ベクターの代わりとなるものであるが、これら動物レンチウイルスベクター由来の力価及び形質導入効率はHIV由来ベクターと比較して低いものであった。本発明の実施例においては、改良されたBIV由来のレンチウイルスベクターシステムが1.2x106i.u./mlの力価(非濃縮)を達成し、、更に150倍以上に濃縮出来ることを記載されている。BIV由来のレンチウイルスベクターシステムは効率的に分裂及び非分裂ヒト骨格筋細胞に形質導入する。我々のデータによれば、BIV由来のレンチウイルスベクターはヒト遺伝子治療用の優れた遺伝子移入システムを提供するものである。
BIV由来最小ベクター(「BC4MG.min」と命名)は、修飾BIV5‘LTR、変異主要スプライスドナー部位、パッケージング配列、最小gag配列、cPPT、内部プロモーターに機能的に連結された導入遺伝子、CTE(マッソンーファイザーサルウイルス由来の構成的輸送要素システム)、3’PPT、及び、修飾3‘LTRを含む。図5参照のこと。具体的には、TATAボックス内で終了するCMV−前初期プロモーターが、TATAボックスの直後から開始するBIV5’LTRに連結している。BIV配列はgagコード領域内の200bpで終了している。全てのベクターは、異種である内部プロモーターに連結したレポーター遺伝子又はその他の導入遺伝子cDNAを含む。導入遺伝子cDNAの下流にBIV3‘LTR、及び3’PPTを含む80bpの隣接env配列が存在する。推定cPPTは内部プロモーターの上流に挿入され、導入遺伝子の下流にCTEの一つ又は複数のコピーが挿入される。実施例1のように、3‘LTRはU3領域の大きな欠失及びSV40後期ポリアデニル化シグナル上流エンハンサー要素を含む。
CMVプロモーター領域の上流からMSD領域まで以下のプライマーを用いてPCR増幅した:MSD5(5‘−GCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGCATCCCG−3’)及びMSD3(5‘−GGGGAAAACACGCAACTTCTCTCCTGTCCGGAG−3’)。増幅産物をSpeI及びSmalIで消化し、予めBS4MGppt.ΔgagをSpeI及びSmalIで消化して得られた6373bp断片に内に連結して、プラスミドBS4MGpptΔMSDを作成する。
最小パッケージング構築物は、CTEの一つ又は複数のコピーに連結したBIVgag及びpolコード配列を含む。図5を参照のこと。
BIV由来最小レンチウイルスベクターシステムは更に第三構築物、即ち、異なるウイルス由来のウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター構築物を含む。このウイルス表面タンパク質は水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質(VSV−G)及びその他のものを含む、任意のウイルスエンベロープタンパク質であり得る。図5参照。
Claims (12)
- BIV U5要素に連結した第一BIV R領域、パッケージング配列、プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子、及び、第二BIV R領域に連結したBIV U3要素を含むRNAベクターを含むビリオン。
- 主要スプライスドナー部位が不活性化又は消滅している、請求項1記載のビリオン。
- 更にcPPTを含む、請求項1記載のビリオン。
- cPPTがBIVcPPTである、請求項3記載のビリオン。
- 更に3‘ポリプリン区域を含む、請求項1記載のビリオン。
- 更にRNA輸送要素を含む、請求項1記載のビリオン。
- RNA輸送要素がレンチウイルスrev応答要素(RRE)である、請求項6記載のビリオン。
- レンチウイルスRREがBIVRREである、請求項7記載のビリオン。
- RNA輸送要素が構成的輸送要素(CTE)である、請求項6記載のビリオン。
- CTEがマッソンファイザー(Mason-Pfizer)サルウイルスCTEである、請求項9記載のビリオン。
- ベクターが更にスカフォールド付着領域(SAR)を含む、請求項1記載のビリオン。
- SARがヒトインターフェロンβのスカフォールド付着領域(SAR)を含む、請求項11記載のビリオン。
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