JP4190579B2

JP4190579B2 - 非分裂細胞への核酸運搬のためのベクターおよび使用方法

Info

Publication number: JP4190579B2
Application number: JP51431997A
Authority: JP
Inventors: バーマ，インダー; トロノ，ディディエ; ナルディニ，ルイジ; ガレイ，フィリップ
Original assignee: ザソークインスティチュートフォアバイオロジカルスタディーズ
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-09-26
Publication date: 2008-12-03
Anticipated expiration: 2016-09-26
Also published as: AU7168196A; US6013516A; DE69631795T2; JPH11512615A; AU720993B2; IL123833A0; DE69631795D1; ATE260981T1; ZA968382B; EP0871459B1; WO1997012622A1; EP0871459A4; EP0871459A1

Description

本発明は、米国国立衛生研究所から授与された助成第ROI AI37510号および第CA44360号の政府の援助によりなされたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、一般には、ウイルスベクターの分野、特に、非分裂細胞における核酸配列の導入および発現に有用な新規組換えレトロウイルスに関する。
発明の背景
遺伝的ベクターの開発は、体細胞遺伝子導入の分野の急速な発展の先駆けとなっている。モロニー白血病ウイルス（MLV）などの単純なレトロウイルスに基づくベクターが選択されることが多いが、その理由は、それらが、標的細胞のゲノム内に効率的に組込まれるからである。組込みは、導入遺伝子の長期にわたる発現の前提条件であると考えられる。しかしながら、現在入手可能なレトロウイルスベクターは、活発に分裂している細胞内に組込まれるにすぎず、このため、そのようなベクターをin vivo遺伝子導入に使用することが著しく制限されている。非分裂細胞は、体内で優勢な長寿命の細胞型であり、肝臓、筋肉、脳などを遺伝子導入の最も望ましい標的とするものである。造血幹細胞に導入することを意図したプロトコールでさえ、感染前にこれらの細胞に細胞分裂を誘発するための過度なex vivo操作が要求される。
レトロウイルスは、感染の初期段階で、その核タンパク質コアを標的細胞の細胞質内へ運搬する。ここで、ウイルスゲノムの逆転写が生じ、一方、コアは成熟して組込み前複合体となる。ウイルスＤＮＡが宿主細胞の染色体内へ組込まれるためには、この複合体が核へ到達しなければならない。単純なレトロウイルス（オンコレトロウイルス）の場合には、この段階において、有糸分裂前期に核膜が溶解される必要があるが、その理由は十中八九、組込み前複合体のサイズがかさだかいため、それが核膜孔を通って受動拡散されるのが妨げられるからである。
レトロウイルスベクターは、多くの種類のin vitro遺伝子導入研究に有用であるが、力価が低いなどの問題があるため、いくつかのin vitro研究およびほとんどのin vivo研究にそれを使用することが制限されている。さらに、もう１つの問題は、宿主ゲノム内へのレトロウイルスベクターの組込みが、ＤＮＡ複製を行なっている細胞に限定されると考えられたことである。したがって、広範なクラスの細胞型に感染しうるレトロウイルスベクターが公知であるものの、これらのベクターがプロウイルスで組込まれるためには細胞分裂が必要とされるのである。このため、レトロウイルスベクターの効率的な使用は、複製している細胞に事実上制限されてしまう。したがって、レトロウイルスは、非分裂細胞または分裂終了細胞内に遺伝子を導入するのに利用されていない。
この障害を避けると考えられる方法が、レンチウイルス疾患の病因論の最近の研究で示唆されている。レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、共通のレトロウイルス遺伝子であるgag、polおよびenvに加えて、調節または構造機能を有する他の遺伝子を含有する。このより高い複雑性のおかげで、このウイルスは、潜伏感染の過程でその生活環をモジュレーションすることができるのである。代表的なレンチウイルスとしては、エイズの病原体であるヒト免疫不全ウイルス（HIV）が挙げられる。in vivoでは、HIVは、ほとんど分裂しない終末分化細胞であるマクロファージに感染することができる。in vitroでは、HIVは、単球由来マクロファージ（MDM）の初代培養、およびアフィジコリン処理またはγ線照射により細胞周期を停止させたHeLa-Cd4またはTリンパ系細胞に感染することができる。これらの細胞への感染は、HIV組込み前複合体が標的細胞の核膜孔を通って能動輸送されることに依存する。これは、該複合体中の一部が重複した複数の分子決定因子と、標的細胞の核への輸送機構との相互作用により生じる。同定されている決定因子には、gag MAタンパク質中の機能的な核局在化シグナル（NLS）、核親和性ビリオン関連タンパク質vpr、およびgag MAタンパク質のサブセット中のC末端ホスホチロシン残基が含まれる。
発明の概要
本発明は、非分裂宿主細胞に感染し、核酸配列を導入する組換えレトロウイルス（該核酸配列はついで、宿主細胞内で発現されうる）を提供する。したがって、本発明は、核酸配列を非分裂細胞へ運搬する手段に関して長い間渇望されていた課題を解決するものである。
第１の実施態様において、本発明は、ウイルスのGAG、ウイルスのPOL、ウイルスのENV、調節核酸配列に作動可能に結合した異種核酸配列、並びに逆転写および組込みに必要なシス作用性核酸配列を含んでなる、非分裂細胞に感染する能力を有する組換えレトロウイルスを提供する。本発明の組換えレトロウイルスは、好ましくはレンチウイルスである。
もう１つの実施態様において、本発明は、非分裂細胞に感染する能力を有する組換えレトロウイルスの製造方法であって、ウイルスのgagおよびウイルスのpolをコードする核酸を付与するベクター、ウィルスのenvをコードする核酸を付与するベクター、逆転写および組込みのためのシス作用性核酸配列に隣接したパッケージングシグナルをコードする核酸配列を付与し、調節核酸配列に作動可能に結合した異種核酸配列を導入するためのクローニング部位を付与するベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクションし、そして該組換えウイルスを回収することを含んでなる前記製造方法を提供する。
さらにもう１つの実施態様において、本発明は、非分裂細胞における異種核酸配列の導入および発現方法であって、本発明の組換えウイルスを該非分裂細胞に感染させ、そして該異種核酸配列を該非分裂細胞内で発現させることを含んでなる前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、HIVに基づく組換えレトロウイルスの製造方法を示す図である。
図２は、濃縮の前および後にVSV.G env、LacZレポーター遺伝子、およびHIV（pCMVDR8）若しくはMLV gag/polを有するパッケージング構築物を使用する感染性ウイルス粒子の力価を示す表である（＝「収率」）。
図３は、HIVに基づくおよびMLVに基づくパッケージング構築物を293T細胞（繊維芽細胞パッケージング細胞系）に同時トランスフェクションした後の組換えウイルスの力価を示す表である。
図４は、増殖中のHeLa細胞、アフィジコリンによりG1/S間期で停止させた細胞、およびX線によりG2期で停止させた細胞内へHIVおよびMLVに基づくCMV−β−ガラクトシダーゼベクターが導入される効率を示すグラフである。
図５は、G0期において４、７、11および15日後にラット208F繊維芽細胞内へHIVおよびMLV CMV−ルシフェラーゼベクターが導入される効率を示すグラフである。
図６は、ヒト一次マクロファージ内へHIVおよびMLV CMV−ルシフェラーゼベクターが導入される効率を示すグラフである。
図７は、３週間停止させ、ベクターを接種し、感染後の示されている時点で分裂を誘導した細胞内でのHIVおよびMLVに基づくベクターの生存を示すグラフである。
好ましい実施態様の説明
本発明は、非分裂細胞に感染する能力を有する組換えレトロウイルスを提供する。該ウイルスは、遺伝子核酸配列のin vivoおよびex vivoでの導入および発現（例えば、非分裂細胞におけるもの）に有用である。
レトロウイルスは、ウイルスゲノムがＲＮＡであるＲＮＡウイルスである。宿主細胞にレトロウイルスが感染すると、ゲノムＲＮＡがＤＮＡ中間体に逆転写され、このＤＮＡ中間体は、感染細胞の染色体ＤＮＡ内に非常に効率よく組込まれる。この組込まれたＤＮＡ中間体は、プロウイルスと称される。プロウイルスの転写および感染性ウイルスへの組立ては、適当なヘルパーウイルスの存在下で、あるいは汚染ヘルパーウイルスを同時に産生することなく包膜を可能にする適当な配列を含有する細胞系で生じる。以下に記載するとおり、包膜のための配列は、適当なベクターの同時トランスフェクションにより与えられるため、本発明の組換えレトロウイルスの産生には、ヘルパーウイルスは必要でない。
レトロウイルスのゲノムおよびプロウイルスＤＮＡはgag、polおよびenvの３つの遺伝子を有し、これらは２つの長い末端反復（LTR）配列に隣接している。gag遺伝子は内部構造（マトリックス、キャプシドおよびヌクレオキャプシド）タンパク質をコードし、pol遺伝子はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードし、env遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。5’および3’のLTRは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進するように機能する。LTRは、ウイルスの複製に必要なすべての他のシス作用性配列を含有する。レンチウイルスは、vif、vpr、tat、rev、vpu、nefおよびvpxを含むさらなる遺伝子を有する（HIV-1、HIV-2および／またはSIVの場合）。
5’LTRの隣には、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および粒子内へのウイルスＲＮＡの効率的な包膜に必要な配列（Psi部位）がある。包膜（または感染性ビリオン内へのレトロウイルスＲＮＡのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムに欠けている場合は、産物がシス欠損体となり、このため、ゲノムＲＮＡの包膜が妨げられる。しかしながら、得られる突然変異体は、依然として、すべてのビリオンタンパク質の合成を指令する能力を有する。
第１の実施態様において、本発明は、非分裂細胞に感染する能力を有する組換えレトロウイルスを提供する。該組換えレトロウイルスは、前記のとおり、ウイルスのGAG、ウイルスのPOL、ウイルスのENV、調節核酸配列に作動可能に結合した異種核酸配列、並びにパッケージング、逆転写および組込みに必要なシス作用性核酸配列を含む。本発明の組換えレトロウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞に感染する能力を有すると理解されるべきである。
したがって、本発明の組換えレトロウイルスは、遺伝的に改変されており、天然ウイルスの構造的な感染性遺伝子のいくつかが除去され、標的非分裂細胞へ運搬しようとする核酸配列で置換されている。このウイルスは、細胞に感染後、その核酸を該細胞内へ注入し、レトロウイルスの遺伝物質を宿主ゲノム内に組込むことができる。導入されたレトロウイルスの遺伝物質は、その後、宿主細胞内で転写されタンパク質に翻訳される。
本発明は、非分裂細胞に感染する能力を有する組換えレトロウイルスの製造方法であって、ウイルスのgagおよびウイルスのpolをコードする核酸を付与するベクター、ウイルスのenvをコードする核酸を付与するベクター、逆転写および組込みのためのシス作用性核酸配列に隣接したパッケージングシグナルをコードする核酸配列を付与し、調節核酸配列に作動可能に結合した異種遺伝子を導入するためのクローニング部位を付与するベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクションし、そして該組換えウイルスを回収することを含んでなる前記製造方法を提供する。本発明の方法で使用する個々のベクターを、図１に例示する。
本発明の方法は、組換えビリオンまたは組換えレトロウイルスを製造するために、少なくとも３つのベクターの組合せを含む。第１のベクターは、ウイルスのgagおよびウイルスのpolをコードする核酸を付与する（図１に例示されているパッケージング構築物を参照されたい）。前記のとおり、これらの配列は、それぞれ、群特異的抗原および逆転写酵素（並びに成熟および逆転写に必要なインテグラーゼおよびプロテアーゼ酵素）をコードする。最も好ましくは、ウイルスのgagおよびpolは、レンチウイルス（最も好ましくはHIV）に由来する。
第２のベクターは、ウイルスエンベロープ（env）をコードする核酸を付与する。env遺伝子は、レトロウイルスなどのいずれのウイルスに由来するものであってもよい。envは、ヒトおよび他の種の細胞への導入を可能にする両種指向性エンベロープタンパク質であってもよいし、あるいは、マウスおよびラットのみの細胞に導入しうる同種指向性エンベロープタンパク質であってもよい。さらに、エンベロープタンパク質を抗体または特定のリガンド（特定の細胞型の受容体へ標的化するためのもの）と結合させることにより、組換えウイルスを標的化するのが望ましいかもしれない。例えば、対象となる配列（調節領域を含む）を、特異的標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子と共に挿入することにより、今度は該ベクターが標的特異的となる。レトロウイルスベクターは、例えば糖脂質またはタンパク質を挿入することにより、標的特異的とすることができる。標的化は、レトロウイルスベクターを標的化するための抗体を使用して行なうことが多い。当業者であれば、特異的な標的へのレトロウイルスベクターの運搬を達成するための具体的な方法を知っているか、あるいは過度な実験を行なわなくても容易に確認しうるであろう。
レトロウイルス由来のenv遺伝子としては、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMuLV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳癌ウイルス（MuMTV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、水疱性口内炎ウイルス（VSV）（Gタンパク質）などの他のenv遺伝子も使用することができる。
ウイルスのenv核酸配列を付与するベクターは、調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）に作動可能に結合している（図１のシュードタイプENVプラスミドを参照されたい）。好ましくは、調節配列は、ウイルスプロモーターである。調節配列は、例えばモロニーマウス白血病ウイルスプロモーター−エンハンサー要素、ヒトサイトメガロウイルスエンハンサー（例示する実施例で使用するもの）またはワクシニアP7.5プロモーターなどの、任意の真核プロモーターまたはエンハンサーであってもよい。モロニーマウス白血病ウイルスプロモーター−エンハンサー要素などのいくつかの場合には、これらのプロモーター−エンハンサー要素が、LTR配列内またはそれに隣接して位置する。
第３のベクターは、ウイルスの生活環に必要なシス作用性ウイルス配列を付与する。そのような配列としては、Ψパッケージング配列、逆転写シグナル、組込みシグナル、ウイルスプロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化配列が挙げられる。この第３のベクターはまた、非分裂細胞内に導入する異種核酸配列のクローニング部位を含有する。適当なベクターの概略を図１に示す。
当該技術分野における標準的な方法により産生される組換えレトロウイルスは欠損性であるため、感染性ベクター粒子を産生させるためには、そのような組換えレトロウイルスを援助する必要がある。典型的には、この援助は、例えば、欠けているウイルス機能を付与するヘルパー細胞系を使用することにより行なう。これらのプラスミドは、パッケージング機構がＲＮＡ転写産物を認識して包膜するのを可能にするヌクレオチド配列を欠く。パッケージングシグナルの欠失を有するヘルパー細胞系には、例えば、Ψ２、PA317およびPA12が含まれるが、これらに限定されるものではない。適当な細胞系では、ゲノムがパッケージングされないため、中空ビリオンが産生される。そのような細胞内へ、パッケージングシグナルは完全であるが構造遺伝子が他の対象となる遺伝子で置換されているレトロウイルスベクターを導入すれば、このベクターがパッケージングされ、ベクタービリオンが産生されうる。
本発明の組換えレトロウイルスの製造方法は、前記の標準的なヘルパーウイルス／パッケージング細胞系法とは異なる。適当なパッケージング細胞系に同時トランスフェクションするのに使用する３つ以上の個々のベクターは、非分裂細胞への核酸の感染および導入、組換えウイルスの産生に要求される遺伝子のすべてを全体として含有する。その結果、ヘルパーウイルスは全く必要ない。
異種核酸配列は、調節核酸配列に作動可能に結合している。本発明で用いる「異種」核酸配列なる語は、異なる種に由来する配列を意味するが、同じ種に由来する場合であっても、該核酸配列が、そのもとの形態から実質的に修飾されていればよい。あるいは、通常は細胞内で発現されない未変化の核酸配列は、異種核酸配列である。「作動可能に結合」なる語は、調節配列と異種核酸配列とが機能的に結合していることを意味する。好ましくは、異種核酸配列がプロモーターに結合してキメラ遺伝子を与える。異種核酸配列は、好ましくは、ウイルスLTRプロモーター−エンハンサーシグナルまたは内部プロモーターのいずれかの制御下にあり、レトロウイルスLTR内に保持されているシグナルは、依然として、宿主細胞ゲノム内へのベクターの効率的な組込みを引き起こすことができる。
プロモーター配列は、所望の遺伝子配列と同種であっても異種であってもよい。ウイルスまたは哺乳動物のプロモーターなどの広範なプロモーターを利用することができる。遺伝子配列の発現を特異的細胞集団内に標的化するために、細胞または組織に特異的なプロモーターを利用することができる。本発明に適した哺乳動物およびウイルスのプロモーターは、当該技術分野で入手可能である。
好ましくは、クローニング段階においては、パッケージングシグナルおよび異種クローニング部位を有する導入ベクターと称される核酸構築物は、選択マーカー遺伝子をも含有する。マーカー遺伝子を利用して、該ベクターの存在に関してアッセイし、それにより感染および組込みを確認する。このマーカー遺伝子の存在により、該インサートを発現する宿主細胞のみの増殖が保証される。代表的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒性物質（例えば、ヒスチジノール、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキセートなど）に対する耐性を付与するタンパク質をコードする。本発明において例示する実施例では、β−ガラクトシダーゼ（LacZ）若しくはルシフェラーゼレポーターまたはマーカー系を利用する。
本発明の組換えウイルスは、非分裂細胞内へ核酸配列を導入する能力を有する。核酸配列なる語は、任意の核酸分子、好ましくはＤＮＡを意味する。この核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組合せを含む種々の起源に由来するものであってもよい。そのような核酸配列は、天然に存在するイントロンを含んでいても含んでいなくてもよいゲノムＤＮＡを含んでいてもよい。さらに、そのようなゲノムＤＮＡは、プロモーター領域、イントロンまたはポリA配列と共に得ることができる。ゲノムＤＮＡは、当該技術分野でよく知られている手段により、適当な細胞から抽出し精製することができる。あるいは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を細胞から単離し、それを使用して、逆転写または他の手段によりｃＤＮＡを得ることができる。
「非分裂」細胞なる語は、有糸分裂しない細胞を意味する。非分裂細胞は、活発に分裂していない限り、細胞周期のいずれの時点（例えば、G₀/G₁、G₁/S、G₂/M）で阻止されていてもよい。ex vivo感染の場合は、照射、アフィジコリン処理、血清飢餓、接触阻害などの当業者が用いる標準的な方法により細胞分裂を阻止するために分裂細胞を処理することができる。しかしながら、多数の細胞（例えば、幹細胞）は既に停止しているため、ex vivo感染は、該細胞を分裂阻止することなく行なうことが多いと理解されるべきである。本発明の組換えレトロウイルスベクターは、細胞分裂を阻止するのに用いるメカニズムまたは細胞を阻止する細胞周期時点とは無関係に、任意の非分裂細胞に感染する能力を有する。以前から存在する体内の非分裂細胞には、例えば、ニューロン、筋肉、肝臓、皮膚、心臓、肺および骨髄の細胞およびそれらの誘導体が含まれる。
好ましくは、本発明の方法により製造される組換えレトロウイルスは、レンチウイルスに由来し、より好ましくは、組換えレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の誘導体である。公共社会政策的な理由で、典型的には、レトロウイルスがHIVの場合、envは、HIV以外のウイルスに由来するものとなる。
本発明の方法は、前記のとおり、組換えビリオンのパッケージングに要求される機能のすべてを付与する少なくとも３つのベクターを提供する。該方法はまた、vpr、vif、nef、vpx、tat、rev、vpuなどのウイルス遺伝子を含むベクターのトランスフェクションを意図する。これらの遺伝子のいくつかまたはすべてが、例えばパッケージング構築物ベクター上に含まれていてもよいし、あるいは、それらが別個のベクター上に位置していてもよい。単一の組換えレトロウイルスを製造するためにパッケージング細胞系に同時トランスフェクションされる限り、使用するベクターの数は何ら限定されるものではない。例えば、env核酸配列を、gagおよびpolと同じ構築物上に置くこともできるであろう。
該ベクターは、パッケージング細胞系にトランスフェクションまたは感染を介して導入する。パッケージング細胞系は、ベクターゲノムを含有するウイルス粒子を産生する。トランスフェクションまたは感染の方法は、当業者によく知られている。それらの少なくとも３つのベクターをパッケージング細胞系に同時トランスフェクションした後、組換えウイルスを、当業者が用いる標準的な方法により、培地から回収し力価測定する。
もう１つの実施態様において、本発明は、前記のとおりに本発明の方法により製造される組換えレトロウイルスを提供する。
本発明はまた、ウイルスのGAG、ウイルスのPOL、ウイルスのENV、調節核酸配列に作動可能に結合した異種核酸配列、並びにパッケージング、逆転写および組込みに必要なシス作用性核酸配列を含んでなる、非分裂細胞に感染する能力を有する組換えレトロウイルスを提供する。該組換えレトロウイルスは、好ましくはレンチウイルス、最も好ましくはHIVである。前記の組換えレトロウイルスの製造方法に関して既に記載したとおり、本発明の組換えレトロウイルスはさらに、VPR、VIF、NEF、VPX、TAT、REVおよびVPUタンパク質の少なくとも１つを含んでいてもよい。ある特定の理論に拘泥されるものではないが、これらの遺伝子／タンパク質産物の１以上は、産生された組換えレトロウイルスのウイルス力価を上昇させるのに重要であるか（例えば、NEF）、あるいは、選択したパッケージング細胞系によっては、ビリオンの感染およびパッケージングに必要かもしれない（例えば、VIF）と考えられる。
本発明はまた、ある特定の核酸配列を発現させるために、非分裂細胞へ核酸を導入する方法を提供する。したがって、もう１つの実施態様において、本発明は、非分裂細胞における異種核酸配列の導入および発現方法であって、本発明の組換えウイルスを該非分裂細胞に感染させ、そして該異種核酸配列を該非分裂細胞内で発現させることを含んでなる前記方法を提供する。
本発明の方法により分子を導入することにより、細胞内での遺伝子調節分子の発現をモジュレーションするのが望ましいかもしれない。「モジュレーション」なる語は、遺伝子が過剰発現された場合の該遺伝子の発現の抑制、あるいは過少発現された場合の発現の増強をいう。細胞増殖性障害が遺伝子の発現と関連している場合には、遺伝子の発現を翻訳レベルで妨げる核酸配列を使用することができる。このアプローチでは、例えば、アンチセンス核酸、リボザイムまたは三本鎖物質を利用して、アンチセンス核酸または三本鎖物質で特定のｍＲＮＡをマスクしたり、あるいはリボザイムでそれを切断することにより、そのｍＲＮＡの転写または翻訳を阻止する。
アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部と相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子である（Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990）。細胞内では、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖となったｍＲＮＡを翻訳しないため、アンチセンス核酸はｍＲＮＡの翻訳を妨げる。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。なぜなら、それらは、合成が容易であり、標的細胞内へ導入された場合に問題を引き起こす可能性が、それより大きな分子より低いからである。遺伝子のin vitro翻訳を阻害するためにアンチセンス法を用いることは、当該技術分野でよく知られている（Marcos-Sakura, Anal. Biochem.,172:289, 1988）。
突然変異タンパク質または優性に活性な遺伝子産物（例えば、アルツハイマー病において蓄積するアミロイド前駆体タンパク質）の発現を阻止するために、アンチセンス核酸を使用することができる。また、そのような方法は、ハンチントン病、遺伝性パーキンソン症および他の疾患の治療に有用である。また、アンチセンス核酸は、毒性と関連したタンパク質の発現の抑制に有用である。
転写を阻止するためのオリゴヌクレオチドの使用は、該オリゴマーが、二重らせんＤＮＡの周囲に巻き付いて三本鎖らせんを形成するため、三本鎖法として公知である。したがって、これらの三本鎖化合物は、選択した遺伝子上のユニークな部位を認識するよう設計することができる（Maherら, Antisense Res. and Dev.,1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991）。
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと同様に他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾を通じて、ＲＮＡ分子内の特異的なヌクレオチド配列を認識しそれを切断する分子を操作することが可能となる（Cech, J. Amer. Med. Assn.,260:3030, 1988）。このアプローチの大きな利点は、それらが配列特異的であるため、特定の配列を有するｍＲＮＡのみが不活性化されることである。
生体応答調節物質をコードする核酸を導入するのが望ましいかもしれない。この範疇に含まれるものとしては、「インターロイキン」として分類される多数のサイトカインをコードする核酸を含む免疫増強物質が挙げられる。これらには、例えば、インターロイキン１〜12が含まれる。また、必ずしも同じメカニズムで作用するわけではないが、インターフェロン、特にガンマインターフェロン（γ-IFN）、腫瘍壊死因子（TNF）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）もこの範疇に含まれる。酵素欠損症または免疫不全を治療するために、そのような核酸を骨髄細胞またはマクロファージへ運搬するのが望ましいかもしれない。また、増殖因子、毒性ペプチド、リガンド、受容体または他の生理的に重要なタンパク質をコードする核酸を、特異的な非分裂細胞内へ導入することもできる。
抗HIV分子でHIV感染細胞（例えば、T細胞またはマクロファージ）を治療するために、本発明の組換えレトロウイルスを使用することができる。さらに、例えば、嚢胞性繊維症の治療のために、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（CFTR）の遺伝子を有する本発明の組換えレトロウイルスを呼吸上皮に感染させることができる。
本発明の方法はまた、本発明の組換えレトロウイルスにex vivoで感染した細胞の移植を含む、ニューロンまたはグリア細胞の移植（transplantation）または「移植（grafting）」、あるいは中枢神経系内または脳室腔内または宿主の脳表面上の硬膜下へのin vivoでの感染に有用である。移植のためのそのような方法は、当業者によく知られており、参考として本明細書に組入れるNeural Grafting in the Mammalian CNS, Bjorklund and Stenevi編（1985）に記載されている。操作手順には、移植時に脳実質に付着するよう宿主脳内組織の注射または沈着により達成される実質内（すなわち宿主脳内）移植が含まれる。
レシピエント被験者の脳の選択された領域内への細胞またはウイルスの投与は、微量注射器の針の挿入が可能となるよう、穴をあけ、硬膜に突き刺すことにより行なってもよい。別法として、細胞または組換えレトロウイルスを、脊髄領域内へ鞘内注射することができる。ex vivoで感染させた細胞調製物または本発明の組換えレトロウイルスは、脳または脊髄内の予め定められた任意の部位へのニューロン細胞の移植を可能にし、また、同じ細胞懸濁液またはウイルス懸濁液を使用して、いくつかの異なる部位での複数の同時移植を可能にし、また、種々の解剖学的領域からの細胞の混合を可能にする。
例えばニューロン障害の治療に使用する本発明の組換えレトロウイルスにin vivoまたはex vivoで感染した細胞は、任意に、外因性遺伝子、例えば、受容体をコードする遺伝子またはリガンドをコードする遺伝子を含有していてもよい。そのような受容体としては、前記のとおり、ドーパミン、GABA、アドレナリン、ノルアドレナリン、セロトニン、グルタミン酸、アセチルコリンおよび他の神経ペプチドに応答する受容体が挙げられる。ニューロン障害において治療効果を与えうるリガンドとしては、例えば、ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、γ−アミノ酪酸およびセロトニンが含まれる。感染ドナー細胞による分泌後の必要リガンドの拡散および取込みは、その被験者の神経細胞がそのような遺伝子産物の産生を欠損している障害において有益であろう。治療しなければ死に至る可能性があるコリン作動性ニューロンの変性を予防するために、神経成長因子（NGF）などの神経栄養因子を分泌するよう遺伝的に修飾されている細胞を使用してもよい。あるいは、パーキンソン病などの脳幹神経節の障害を有する被験者へ移植する細胞を、ドーパミンの前駆体であるL-DOPAをコードする外因性遺伝子を含有するよう改変することができる。パーキンソン病は、主要標的器官として脳幹神経節を有する中脳の黒質内のドーパミンニューロンの喪失により特徴づけられる。
本発明の方法により同様に治療しうる他のニューロン障害としては、アルツハイマー病、ハンチントン病、卒中によるニューロン傷害および脊髄の傷害が挙げられる。アルツハイマー病は、基底前脳のコリン作動性ニューロンの変性により特徴づけられる。これらのニューロンの神経伝達物質はアセチルコリンであり、これは、該ニューロンの生存に必要である。これらのニューロンの生存を促進する因子の外因性遺伝子を含有する本発明の組換えレトロウイルスに感染したコリン作動性細胞の生着は、記載されているとおり本発明の方法により達成することができる。卒中の後、海馬のCA1内の細胞の選択的な喪失、並びにこれらの患者において認識機能および記憶の喪失を引き起こしうる皮質細胞の喪失が認められる。CA1細胞死を引き起こす分子が一旦同定されれば、該分子を本発明の方法により阻害することができる。例えば、アンチセンス配列、またはアンタゴニストをコードする遺伝子を、ニューロン細胞へ導入し、脳の海馬領域内へ移植することができる。
また、核酸の導入方法においては、神経芽細胞の移植を、CNSの障害の治療に有用な他の治療方法と共に実施することが意図される。例えば、レトロウイルス感染細胞を、増殖因子、ガングリオシド、抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、毒素、神経突起促進分子、代謝拮抗物質などの物質およびドーパミン前駆体（L-DOPA）などのこれらの分子の前駆体と共に投与することができる。
さらに、多数の遺伝性神経疾患において、欠損遺伝子を置換することができ、このような疾患としては、例えば、リソソーム蓄積疾患（例えば、β−ヘキソサミニダーゼまたはグルコセレブロシダーゼが関与しているもの）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の欠損症（「レッシュ・ナイハン症候群」）、アミロイド多発性神経障害（プレアルブミン）、デュシェンヌ筋ジストロフィーおよび網膜芽細胞腫が挙げられる。
タンパク質産物の欠損による疾患の場合、遺伝子導入により、罹患組織内へ正常な遺伝子を導入して置換療法を行なったり、また、アンチセンス突然変異を用いて疾患の動物モデルを作製することができるであろう。例えば、肝細胞の筋肉に感染させるレトロウイルス内へ、IX因子をコードする核酸を挿入するのが望ましいかもしれない。
以下の実施例は、本発明の例示にすぎず、本発明を限定するものではない。そのような実施例は使用しうる代表例であるが、それらの代わりに、当業者に公知の他の方法を利用することもできる。
実施例
以下の実施例では、本発明の３プラスミドレンチウイルスベクター系を例示する。非感染性プラスミドは、エンベロープを除くHIVの構造タンパク質および調節タンパク質をトランスで付与する（パッケージング構築物、pCMVΔR8）。導入ベクターは、HIVのすべての公知のシス作用性配列および導入遺伝子の導入のためのクローニング部位を含有する（ベクタープラスミド、pHR’）。以下に記載する実験では、ヒトサイトメガロウイルス前初期エンハンサー／プロモーター（CMVまたはC）により駆動される２つのマーカー遺伝子［大腸菌（E. coli）β−ガラクトシダーゼ（LacZ）およびホタルルシフェラーゼ（Lucif）］を、ベクタープラスミド中にクローニングして、pHR’CLacZおよびpHR’-Clucifを得た（図１）。
第３のプラスミドは、該ウイルス粒子がシュードタイプとなるよう、異種エンベロープをコードしている。シュードタイプにすることにより、ベクターの宿主域が広がると同時に、その生物的安全性が増大する。３つのタイプのenvコードプラスミドを、本実施例で使用した。プラスミドpSV-A-MLV-env（Pageら, 1990, J. Virol., 64:5270, 1990）は、MLV LTRの転写制御下で4070モロニー白血病ウイルスの両種指向性エンベロープ（MLV/Ampho）をコードしている。プラスミドpCMV-Eco envは、CMVプロモーターの転写制御下でモロニー白血病ウイルスの同種指向性エンベロープ（MLV/Eco）をコードしている（N. Somia, Salk Institute, La Jolla, CA）。プラスミドpMD. Gは、CMVプロモーターの転写制御下で水疱性口内炎ウイルスのエンベロープGタンパク質（VSV. G）をコードしている（D. OryおよびR. Mulligan, Whitehead Institute, Cambridge, MA）。
それらの３つのプラスミドを293Tヒト腎細胞に一過性に同時トランスフェクションすることにより、複製欠損ウイルス粒子を産生させた。標準的な方法により、順化培地を収穫し、濾過し、標的細胞内へのレポーター遺伝子の導入についてアッセイした。ヒトHeLa細胞およびラット208F繊維芽細胞を、種々の増殖条件で試験し、細胞周期の進行に対する導入の依存性を評価した。増殖の密度依存性阻止による増殖停止（G0）を、薬理学的または他の手段による細胞周期停止（より後の周期段階）と比較した。また、マクロファージ、ニューロンなどの非分裂終末分化細胞の導入を、in vitroおよびin vivoの両方で試験した。
実施例１
pCMVΔR8の構築
パッケージングプラスミドpCMVDR8を、プロウイルスHIV ＤＮＡの感染性分子クローンであるプラスミドpR8から出発する一連の工程において構築した。完全長nefリーディングフレームを有するHIV-1 HXB2dプロウイルスＤＮＡ（Shawら, Science,226:1165, 1984）を含有するプラスミドpR7（Kimら, J. Virol.,63:3708, 1989; von Schwedlerら, J. Virol.,67:4945, 1993）内のBamHI-BssHII断片を、NL4.3 HIVプロウイルスＤＮＡからの相同断片で置換することにより、pR8を作製した。NL4.3は、完全長で機能的なvprおよびvpuリーディングフレームを含有する分子的に構築されたプロウイルスである（Adachiら, J. Virol.,59:284, 1986）。プラスミドpR7/R8のバックボーンは、プラスミドsp65からのAmp耐性遺伝子およびpUC複製起点、並びにプラスミドpSVgptからのSV40複製起点およびgpt遺伝子を含有する。envリーディングフレームをフレームシフトするStuI部位6831に挿入されているMluIリンカーを含有するpΔER7からの相同断片で、2.7kbpのSall-BamHI断片を置換することにより、pR8のenv欠損体であるpΔER8を作製した（Tronoら, Cell, 59:113, 1989）。パッケージングシグナル内の既に記載されている欠失（AldoviniおよびYoung, J. Virol., 64:1920, 1990）を含有する相同な758断片で797bpのBssHII-SpeI断片を置換することにより、5’スプライス供与部位とgag遺伝子の開始コドンとの間のΨ配列内の39bpの内部欠失をpΔER8内へ導入した。得られたプラスミドを、pΔΨΔER8と称することにした。nefリーディングフレームを完全な状態で維持しているインスリンゲノムＤＮＡのポリアデニル化部位（Tronoら, Cell, 59:113, 1989）で3’HIV LTRを置換することにより、プラスミドpAΔΨΔER8を構築した。それは、PCRにより、nefリーディングフレームとポリAシグナルとの間の結合位置にユニークなNotI部位を導入することにより構築した。
一連の第１の増幅において、HIV1HXB2のgp41内のBamHI部位と重複するオリゴヌクレオチドgp41.4(s)およびnef27(a)で、pΔER8鋳型から、961bpの断片を増幅し、XbaI部位を含有するオリゴヌクレオチドLN-A(s)およびLN-B(a)で、インスリン遺伝子のポリアデニル化部位を含有するＤＮＡ鋳型から、402bpの断片を増幅した。オリゴヌクレオチドnef27(a)およびLN-A(s)は、NotI制限部位を保持する相補的配列を含有する。その２つの増幅体を精製し、混合し、オリゴヌクレオチドgp41.4(s)およびLN-B(a)による第２の増幅の鋳型として使用した（オリゴ配列については表１を参照されたい）。最後の1.3kbpの産物を精製し、BamHIおよびXbaIで消化し、pΔΨΔER8の13.5kbpのBamHI-XbaI断片内へクローニングした。pAΔΨΔER8内の5’LTRおよびリーダー配列をCMVプロモーターで置換することにより、プラスミドpCMVΔ8を構築した。CMVプロモーターを含有する0.8kbpの断片を、SmaIおよびHpaIでの二重消化により、プラスミドpCMVpA（W.W. Chang, University of Texas, M.D. Anderson Cancer Center, Houston, TX）から取り出した。MluIリンカーを、HpaI末端に付加し、該断片を、pAΔΨΔER8の14.5kbpのBssHII-HpaI断片内にクローニングした。当業者であれば、過度な実験を行なわなくても、本明細書中の教示に基づき、同様の出発プラスミドおよび配列を特定しうるであろう。

実施例２
pHR’の構築
RRE（応答配列）およびHIV-1 HXB2プロウイルスＤＮＡの２つのLTRの間のスプライス受容部位を含むenv遺伝子の断片をクローニングすることにより、ベクタープラスミドpHR’を構築した。リーダーおよびΨ配列を、gag遺伝子の5’ 0.3kbp（伸長したパッケージングシグナルを構成するために既に示されているもの）と共に構築物内に残した。854bpのenv断片（BglII7620〜BamHI8474）を、pR7から得た。フィルインされているBglII末端へ、NotIリンカーを付加した。該断片を、gagコドン113、114および118（最後のものは、オリゴヌクレオチドGag31(s)の場合と同じ配列であるユニークNotIクローニング部位を導入する）に突然変異を含有するpR7誘導体であるプラスミドpMAKK¹¹³TTR7の8.9kbpのNotI-BamHI断片内へクローニングした。プラスミドpHRを得た。該構築物内に保持される遺伝子断片のリーディングフレームを閉じるgag遺伝子AUGの42bp下流にフレームシフト突然変異を導入することにより、プラスミドpHR’を得た。該突然変異は、ClaI部位を開きフィルインすることにより導入した。２つのユニークなBamHIおよびXhoI部位は、3’LTRの上流のpHR’においてクローニング挿入するのに利用可能である。
実施例３
pHR’-CLacZおよびpHR’-Clucifの構築
CMVプロモーターの転写制御下で大腸菌（E. coli）β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するSalI-XhoIの3.6kbpの断片を、プラスミドpSLX-CMVLacZから得た（Scharfmannら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4626, 1991）。SalI末端をフィルインした後、該断片をpHR’の8.9kbpのXhoI-BamHI断片（そのBamHI末端は既にフィルインされている）内へクローニングした。pHR’-ClacZを得た。LacZリーディングフレームを含有するpHR’-CLacZ内の3.1kbpのBamHI-XhoI断片を、ホタルルシフェラーゼリーディングフレームを含有するpGEM-luc（Promega）からの1.7kbのBamHI-XhoI断片で置換することにより、pHR’-CLucifを得た。
実施例４
ベクター粒子の産生
前記プラスミドを293Tヒト腎細胞内へ一過性に同時トランスフェクションすることにより、複製欠損ウイルス粒子を産生させた。標準的な分子生物学的方法により、すべてのプラスミドを形質転換し、大腸菌（E. coli）HB101細菌内で増殖させた。真核細胞へのトランスフェクションのために、CsCl−臭化エチジウム勾配中での平衡遠心分離によりプラスミドＤＮＡを２回精製した。10cm皿中の培養物へのトランスフェクションのために、合計40μgのＤＮＡ（以下の比率：10μg pCMVΔR8、20μg pHR’、およびMLV/Ampho、MLV/EcoまたはVSV.Gのいずれかの10μg envプラスミド）を使用した。プラスミドを加えないか、異なる比率で加える場合は、細胞へ加えるＤＮＡの合計量を一定に維持するためにpGEM-LacZを加えた。293T細胞を、10％ウシ胎児血清および抗生物質を補充したDMEM中、10％CO₂インキュベーター内で増殖させた。トランスフェクションの前日に、細胞を、1.3×10⁶/10cm皿の密度でプレーティングした。トランスフェクションの４〜６時間前に培地を変えた。リン酸カルシウム−ＤＮＡ複合体を、ChenおよびOkayama（Mol. Cell. Biol., 7:2745, 1987）の方法により調製し、５％CO₂の雰囲気中で該細胞と共に一晩インキュベートした。翌朝、培地を置換し、培養を10％CO₂に戻した。順化培地をトランスフェクションの48〜60時間後に収穫し、低速遠心（300×g、10分）により細胞デブリを除去し、0.45μmの低タンパク質結合フィルターで濾過した。順化培地を、直ちに感染に使用するか、あるいは−80℃で凍結保存した。ウイルス粒子の含量を、p24 gag抗原ELISA（Du Pont）によりモニターした。
また、以下のプラスミドを293T細胞内へ一過性に同時トランスフェクションすることにより、MLVに基づくベクターも製造した。プラスミドpSLX-CMVLacZ（Scharfmannら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4626, 1991）は、CMVに駆動される大腸菌（E. coli）β−ガラクトシダーゼ遺伝子を担持するMLV由来のベクターである。pCLプラスミド系は、パッケージング細胞内でのCMVで駆動される転写および標的細胞内での機能的LTRの再構成を可能にするハイブリッドCMV-LTRプロモーターを担持する（R. Naviaux. Salk Institute, La Jolla, CA）。プラスミドpCLNC-Lucifは、CMVで駆動されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を担持するMLV由来のベクターである。その作製は、ルシフェラーゼリーディングフレームを含有するpGEM-luc（Promega）からの1.7kbpのHindIII-StuI断片を、pCLNCXの８kbpのClal-HindIII断片内へ、Clal末端をフィルインした後でクローニングすることにより行なった。プラスミドpCL-ECOは、同種指向性パッケージングプラスミドである。プラスミドpCMV-GAGPOL（N. Somia, Salk Institute, La Jolla, CA）は、MLVからのCMVに駆動されるgag-pol遺伝子を担持するセミパッケージングプラスミドである。それをpMD.Gと併用して、VSV.GでシュードタイプにしたMLVに基づくベクターをパッケージングした。
図２は、208F繊維芽細胞上でアッセイした組換えレンチウイルス（HIV）構築物とMLV構築物との間の感染力価の比較を示す。その結果は、本発明のHIVベクタ−が、標準的なMLVベクターと少なくとも同等に感染性であることを示す。精製ストックは、超遠心により上清を濃縮した後の力価を示した。収率は、濃縮後のウイルスの回収の割合（％）を表す。
図３は、パッケージング構築物、envをコードする構築物および導入ベクター（図１のとおり）の同時トランスフェクションの結果を示す。両種指向性および同種指向性のenv遺伝子ならびにVSV.G envを使用して、HIVおよびMLVに基づく種々のパッケージング構築物を比較した。この図は、得られた組換えレトロウイルスをラット208F細胞に感染させた場合の比較を示している。MLV（両種指向性）またはVSV.G envを有するHIV構築物についての力価は、標準的なMLVに基づくベクターの場合と同様であった（約10⁵）。MLV同種指向性envを有するHIVに基づく構築物についての感染力価は、両種指向性envより約10倍低かった（約10⁴）。
実施例５
ウイルス粒子の濃縮
前記のとおりに収穫した順化培地のプールを、PBS中の20％ショ糖溶液のクッション上に重層し、Beckman SW28ローター内で50,000×gで90分間遠心した。そのペレットを、インキュベーションおよび穏やかなピペッティング（１〜４mlのPBS中、30〜60分）により再懸濁し、ついでBeckmann SW55ローター内で50,000×g×90分で再遠心した。そのペレットを、PBSの最小容量（20〜50μl）に再懸濁し、直ちに感染に使用するか、あるいは−80℃で凍結アリコートとして保存した。
実施例６
培養細胞の感染
培養細胞への感染のために、293T一過性トランスフェクト体からの順化培地および濃縮ウイルスストックの系列希釈物を、８μg/mlポリブレンを補充された培地へ加えた。該細胞を、３時間から一晩インキュベートし、ついで培地を置換し、導入遺伝子の発現をアッセイする前に、該細胞をさらに36時間インキュベートした。該培養物を冷２％ホルムアルデヒド／0.2％グルタルアルデヒド（PBS中）中で５分間固定し、PBSで２回洗浄し、５mMのフェリシアン化カリウムおよびフェロシアン化カリウムのそれぞれ、並びに２mM MgCl₂を含有するPBS中の１mg/ml X-galで４時間から一晩37℃で染色することにより、β−ガラクトシダーゼ（β-Gal）の発現を評価した。１ウェル当たりの個々の青色細胞のフォーカスを計数し、加えたベクターストックの容量および希釈率をそれに掛けて、力価を計算した。該培養物をTBSで２回洗浄し、該細胞を、５mM MgCl₂を含有するTBS中の200μl/ウェルの0.5％NP40で抽出することにより、ルシフェラーゼの発現をアッセイした。該抽出物を、15,000×gで10分間遠心することにより清澄化した。抽出物の50μlを、75mM Tris-HCl（pH7.8）、15mM酢酸マグネシウムおよび４mM ATP150μlで希釈し、１mMルシフェリン100μlを加えたルミノメーター内でルミネセンスに関してアッセイした。
ヒトHeLa細胞（ATCC）を、RPMI 1640−10％ウシ胎児血清中、５％CO₂の雰囲気中で増殖させた。分裂培養物への感染のために、感染の前日に、６ウェルトレー中1.6×10⁵/ウェルの密度で細胞をまいた。感染の２日前に２×10⁵細胞/ウェルでまき、感染の24時間前に15μg/mlアフィジコリンを加えることにより、G1/S期停止培養物を調製した。アフィジコリンは、記載されているとおりに感染および感染後の全体を通じて培地に毎日加えた。感染の前日に200ラド/分で検量した⁶¹Co源に該細胞を20分間さらし、該細胞を４×10⁵/ウェルでまくことにより、G2期停止細胞を調製した。示されている周期段階での細胞周期停止は、プロピジウムヨージド染色およびフローサイトメトリーにより確認した。
図４は、HeLa細胞内へのCMV-β-Galの導入の相対効率を示す。薬理学的手段（アフィジコリン）またはX線照射のいずれかにより、該細胞の増殖を停止させた。HIVに基づくベクターの感染率は、アフィジコリンによりG1/S間期で細胞を停止させた場合に、より効率的であったが、HIVに基づくベクターは、全体的に、MLVに基づくベクターより効率的であった。
ラット208F繊維芽細胞（B. Sefton, Salk Institute, La Jolla, CAから贈呈）を、DMEM−10％ウシ血清中、10％CO₂の雰囲気中で増殖させた。増殖中の培養物への感染のために、感染の前日に６ウェルトレー中に10⁵細胞/ウェルの密度で細胞をまいた。６ウェル組織培養トレー中に2.5×10⁵細胞/ウェルでまき、Millerら（Mol. Cell. Biol., 10:4239, 1990）に記載されているとおり、該培養物がコンフルエンスに達した後、該培養物を、５％ウシ血清および２μMデキサメタゾンを含有する培地へ移すことにより、増殖停止培養物を調製した。３〜４日毎に培地を変え、該培養を２〜４週間維持した。特に示さない限り、G₀培養物は、コンフルエンスに達した３週間後に使用した。増殖停止は、プロピジウムヨージド染色およびフローサイトメトリーにより確認した。S期の細胞の割合は、増殖細胞の40〜50％であり、コンフルエンスに達した後は、その後の経過時間に応じて10％から２％へ減少した。レスキュー実験では、感染したG₀培養物を、感染後の示されている時点でトリプシン処理し、該細胞を、いくつかの希釈度にて再プレーティングした。β-Galの発現を、再プレーティングの48時間後に評価した。
図５は、４、７、11または15日間増殖停止させた細胞における、HIVおよびMLVに基づくベクターによるラット208F繊維芽細胞内へのCMV−ルシフェラーゼの導入の相対効率を示す。その結果は、それらの両ベクターが、増殖細胞に効率的に感染することを示す。HIVに基づくベクターの導入の効率は、増殖停止時間の長さに応じて、MLVに基づくベクターより約４〜10倍高かった。
既に記載されているとおりに（von Schwedlerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6992, 1994）、ヒト末梢血単球を健康なドナーのバフィーコートから調製した。単球由来のマクロファージを、感染前に２〜４週間、RPM１-10％ヒト血清（Sigma）中で培養した。図６は、HIVおよびMLVに基づくベクターをエンベロープの存在下または不存在下で使用して、ヒト一次マクロファージ内へCMV−ルシフェラーゼを導入した場合の結果を示す。MLVに基づくベクターは、該細胞への感染においてほとんど完全に無効であり、感染力は、エンベロープなしのウイルスと同様であった。これに対して、HIVに基づくベクターは、一次マクロファージへの導入において非常に効率的であった。
さらに、HIVに基づくベクターの生存を、２〜８日間にわたり継代した増殖停止細胞において評価した。MLVに基づくベクターの生存は、G0期の細胞において、並びに２、４および８日目に再プレーティングした後の細胞においては非常に低かった。しかしながら、HIVに基づくベクターは、同様の細胞において約45〜50％の感染力を維持した。ある特定の理論に拘泥するものではないが、MLVと異なり、HIVは、分解されることなく染色体外に維持されうると考えられる。したがって、HIVは、組込まれなくても安定である。
実施例７
in vivoでの感染
in vivo実験では、CMV-LacZマーカー遺伝子を担持するHIVに基づくおよびMLVに基づくベクターを使用した。両ベクター型は、VSV.Gエンベロープタンパク質を用いてシュードタイプとした。ベクターを精製し、２μg/mlポリブレンを補充した無菌PBSのビヒクル中で３×10⁸I.U./mlの力価まで濃縮した。すべての操作は、動物実験に関して制度的に承認されているプロトコールに従い、生物安全性レベル３（BSL3）の環境中で行なった。正常な成体雌Fischerラットを、0.9％ NaCl中のケタミン（44mg/kg）、アセプロマジン（0.75mg/kg）およびキシロジン（４mg/kg）の混合物で麻酔した。26ゲージの傾斜針の付いた５μl Hamiltonシリンジを使用し、定位固定性補助（stereotactical guide）を用いて、ウイルス懸濁液２μlを脳の両側の線条体内へゆっくり注射した。注射の７日後、該ラットを深く麻酔し、４％ホルムアルデヒド／0.1％グルタルアルデヒドを潅流した。脳を取り出し、自由浮遊冠側（free-floating coronal）凍結ミクロトーム切片（40μm）を、各５回の切断ごとの平行する一連の１切片において加工した。一連の１つの切片は、モノクローナル抗体によるβ-Gal免疫細胞化学に関して加工し、アビジン／ビオチンペルオキシダーゼおよび基質としてのジアミノベンジジン／NiCl₂で染色した。一連の別の切片は、FITC、テキサスレッドまたはCy5で標識された二次抗体を使用するβ-Gal（ウサギ）、NeuN（モノクローナル）およびGFAP（モルモット）抗体による三重の免疫蛍光に関して加工した。NeuNは、終末分化ニューロン中に存在すると報告されている核マーカーである（Mullen, Develop., 116:201, 1992）。グリア繊維酸性タンパク質（GFAP）は、星状細胞分化マーカーである。ついで、該切片を、共焦点レーザー走査顕微鏡（bioRad MRT C600）により分析した。免疫蛍光シグナルを集め、デジタル的に色を増強し、重ね合わせた。Adobe Photoshop（Adobe System Inc.）を使用して、偽色像を電子的に生成させた。
この結果は、HIVに基づくベクターを注射した領域内に多数のβ-gal陽性ニューロンを示したが、MLVに基づくベクターを接種した領域内にはそのようなニューロンを示さなかった。
総括
これらの結果は、レンチウイルスベクターを使用する遺伝子導入の実施が可能なことを示した。増殖細胞を使用した場合は、３プラスミドの一過性パッケージング系で得られる導入効率は、同様に構築した従来（MLVに基づく）のレトロウイルスベクターで得られるものに匹敵した。MLVに基づくベクターとは著しく対照的に、レンチウイルスベクターは、標的細胞が分裂していない場合にも効率的に遺伝子導入する能力を有していた。非分裂細胞内へのin vitroでの導入効率は、細胞周期の停止段階に左右された。G1/S期およびG2期で停止している細胞への感染は、増殖細胞で認められるものと同等に効率的であった。in vitroにおけるG₀期で停止している細胞への感染は、それほど効率的ではなく、培養物がG₀期にある時間が長いほど、その効率は低下した。しかしながら、長期的なG₀期培養物においては、該ベクターは安定な中間体として生存し、それをレスキューして、細胞の分裂を刺激することによりその感染サイクルを完全なものにすることができた。終末分化細胞（例えば、in vitroでのヒト一次マクロファージおよびin vivoでのラット脳ニューロン）内へのマーカー遺伝子の導入が認められた。
本発明は、現在好ましい実施態様に関して記載されているが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の改変を施すことができると理解されるべきである。したがって、本発明は、以下の請求の範囲により限定されるにすぎない。

Claims

非分裂細胞に感染する能力を有する組換えウイルスベクターの製造方法であって、
a)以下のベクター、すなわち
その配列が少なくとも１つの異種調節核酸配列に作動可能に結合した、レトロウイルスgag核酸配列およびレトロウイルスpol核酸配列をコードする核酸を含んでなり、機能的なレトロウイルスENVタンパク質をコードする核酸配列を欠損しており、且つその核酸がレトロウイルスゲノムのスプライス供与部位の上流およびスプライス供与部位とgag開始部位との間の両方のレトロウイルスの配列の欠損を有する、レトロウイルスパッケージングベクター；
非HIV ENVタンパク質をコードする核酸を含んでなる、非HIVエンベロープベクター；ならびに
逆転写および組込みのためのレトロウイルスのシス作用性核酸配列に隣接したレトロウイルスのパッケージングシグナルを含有する核酸配列、調節核酸配列に作動可能に結合した異種核酸配列、および少なくとも一部分において欠損を有するgag構造遺伝子を含んでなる、レトロウイルス導入ベクター；
を適当なパッケージング宿主細胞にトランスフェクションすること、および
b)生じる組換えウイルスベクターをパッケージング宿主細胞より回収するが、ここで該組換えウイルスベクターが少なくとも10⁵感染単位/mlの力価を有して製造されていること
を含む、上記方法。
前記レトロウイルスgagまたはpol配列がヒト免疫不全ウイルス（HIV）に由来するものである、請求項１に記載の方法。
前記レトロウイルスパッケージングベクターが更に、プロモーターに作動可能に結合した、VPR、VIF、NEF、VPX、TAT、REV、VPUおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも１個の更なる核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記トランスフェクションが更に、プロモーターに作動可能に結合した、VPR、VIF、NEF、VPX、TAT、REV、VPUおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする第４のベクターの核酸配列を付与することを含む、請求項１に記載の方法。
前記gag構造遺伝子が閉じたリーディングフレーム（closed reading frame）を含んでなる、請求項１に記載の方法。
レトロウイルスパッケージングベクター；
非HIVエンベロープベクター；および
レトロウイルス導入ベクター
を含んでなるベクターの組み合わせであって、
該レトロウイルスパッケージングベクターは、その配列が少なくとも１つの異種調節核酸配列に作動可能に結合した、レトロウイルスgag配列およびレトロウイルスpol配列をコードする核酸を含んでなり、機能的なレトロウイルスENVタンパク質をコードする核酸配列を欠損しており、且つその核酸がレトロウイルスゲノムのスプライス供与部位の上流およびスプライス供与部位とgag開始部位との間の両方のレトロウイルスの配列の欠損を有し；
該非HIVエンベロープベクターは、非HIV ENVタンパク質をコードする核酸を含んでなり；且つ、
該レトロウイルス導入ベクターは、逆転写および組込みのためのレトロウイルスのシス作用性核酸配列に隣接したレトロウイルスのパッケージングシグナルを含有する核酸配列、調節核酸配列に作動可能に結合した異種核酸配列、および少なくとも一部分において欠損を有するgag構造遺伝子を含んでなり、
ここで、該レトロウイルスパッケージングベクターが該組成物により少なくとも10⁵感染単位/mlの力価を有してパッケージングされるものである、上記ベクターの組み合わせ。
請求項１の方法に従い製造される、組換えウイルスベクター。
前記レトロウイルス導入ベクターが１以上のアクセサリー遺伝子を含んでなる、請求項６に記載のベクターの組み合わせ。
前記レトロウイルスパッケージングベクター、前記非HIVエンベロープベクター、および前記レトロウイルス導入ベクターを宿主細胞に導入した場合に、複製欠損性の組換えウイルスベクターが製造される、請求項６に記載のベクターの組み合わせ。
レトロウイルス由来のスプライス供与部位、gag遺伝子、およびpol遺伝子をコードする核酸配列を含んでなり、スプライス供与部位の上流およびスプライス供与部位とgag開始部位との間の両方のレトロウイルスの配列の欠損を有し、且つpCMVDR8により示されるもの以下の自己パッケージング活性を示すレトロウイルスパッケージングベクター。
前記レトロウイルスgagおよびpol遺伝子がヒト免疫不全ウイルス由来である、請求項10に記載のベクター。
モロニー白血病ウイルスENVタンパク質および水疱性口内炎ウイルスENVタンパク質からなる群から選択されるENVタンパク質を更に含んでなる、請求項11に記載のベクター。
VPR、VIF、NEF、VPX、TAT、REV、およびVPUからなる群から選択される少なくとも１種のウイルスタンパク質を更に含んでなる、請求項11に記載のベクター。
前記レトロウイルスパッケージングベクターがpCMVDR8により示されるもの以下の自己パッケージング活性を示す、請求項１に記載の方法。
前記レトロウイルスパッケージングベクターがpCMVDR8により示されるもの以下の自己パッケージング活性を示す、請求項６に記載のベクターの組み合わせ。