ES2314206T3 - Gen humano de predisposicion a la obesidad y usos del mismo. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para detectar la presencia de, o la predisposición a, la obesidad en un sujeto, comprendiendo el procedimiento (i) proporcionar una muestra del sujeto y (ii) detectar la presencia de una alteración en el locus del gen PPYR1 en dicha muestra, siendo dicha alteración SNP 718 (nucleótido 803 C/T en la SEC DE ID Nº 1).
Description
Gen humano de predisposición a la obesidad y
usos del mismo.
La presente invención se refiere generalmente a
los campos de la genética y la medicina. La presente invención
describe más concretamente la identificación de un gen humano de
predisposición a la obesidad, que se puede usar para el diagnóstico
de la obesidad. La invención describe más específicamente algunos
alelos del gen del receptor 1 del polipéptido pancreático (PPYR1,
NPY4R) relacionado con la predisposición a la obesidad y que
representa nuevas dianas para la intervención terapéutica. La
presente invención se refiere a mutaciones concretas en el gen
PPYR1. La invención se puede usar en el diagnóstico de la
predisposición a la obesidad.
Aproximadamente, de un tres a un ocho por ciento
de los costes sanitarios totales de los países industrializados
modernos se deben actualmente a los costes directos de la obesidad
(Wolf, 1996). En Alemania, los costes totales (directos e
indirectos) relacionados con la obesidad y los trastornos comórbidos
se estimaron en 21 billones de marcos alemanes en 1995 (Schneider,
1996). En 2030 estos costes aumentarán un 50% incluso si no aumenta
más la prevalencia de la obesidad.
La obesidad se define a menudo sencillamente
como una dolencia de acumulación anormal o excesiva de grasa en el
tejido adiposo, en tal extensión que la salud puede deteriorarse. La
enfermedad que subyace es el proceso de un balance indeseable de
energía positiva y la ganancia de peso. Una distribución de grasa
abdominal se asocia con riesgos más elevados para la salud que una
distribución de grasa ginoide.
El índice de masa corporal (IMC; kg/m^{2})
proporciona la medida de obesidad a nivel población más útil,
aunque grosera. Se puede usar éste para estimar la prevalencia de la
obesidad dentro de una población y los riesgos asociados con ésta.
Sin embargo, Sin embargo, el IMC no tiene en cuenta la composición
corporal o la distribución de grasa corporal (OMS, 1998).
Se ha definido también la obesidad usando los
percentiles 85º y 95º del IMC como cortes para la definición de la
obesidad y la obesidad grave. Se han calculado los percentiles del
IMC para diversas poblaciones, centiles para la población alemana
basándose en el Estudio de la Nutrición Nacional Alemana han estado
disponibles desde 1994 (Hebebrand y col., 1994, 1996). Debido a que
la clasificación de la OMS de las diferentes clases de pesos puede
aplicarse únicamente a adultos, ha llegado a ser habitual referirse
a los percentiles del IMC para la definición de obesidad en niños y
adolescentes.
El reciente aumento en la prevalencia de la
obesidad es un tema de preocupación principal de los sistemas
sanitarios de diversos países. En los Estados Unidos de América, el
aumento en la prevalencia de todas las clases de obesidad se ha
fechado en el período de tiempo aproximadamente entre 1976 y 1990.
Durante este lapso de tiempo, la prevalencia de la obesidad aumentó
en más de un semiaumento, desde un 14,5% a un 22,5%. Se han
observado tendencias similares en otros países en Europa y
Sudamérica.
Los niños y adolescentes no han estado exentos
de esta tendencia. Muy al contrario, el aumento en los Estados
Unidos de América ha sido sustancial. De esta manera, entre la
década de los 60 y 90 del siglo XX, el sobrepeso y la obesidad
aumentaron drásticamente en edades de 6 a 17 años. Los incrementos
se traducen en incrementos relativos del 40% usando el centil 85º
del IMC (calculado en la década de los 60 del siglo XX) como corte
y 100% hasta el uso del centil 95º. En un estudio cruzado de niños y
adolescentes alemanes tratados como pacientes hospitalizados por
obesidad extrema entre 1985 y 1995, los autores de la presente
invención han notado un aumento significativo del IMC promedio de
cerca de 2 kg/m^{2} durante este período de 10 años. Dentro de
este grupo extremo, los incrementos fueron más pronunciados en los
intervalos de IMC más altos.
El mecanismo subyacente de este aumento en la
prevalencia de la obesidad es desconocido. Se han invocado
comúnmente factores ambientales como la causa subyacente.
Básicamente, se han discutido tanto el aumento de la ingesta
calórica como un nivel reducido de actividad física. En Inglaterra,
el aumento en los índices de obesidad se ha atribuido al último
mecanismo. Así, en este país, la ingesta calórica promedio incluso
disminuyó algo en las dos últimas décadas mientras que la evidencia
indirecta obtenida del aumento en las horas gastadas en ver la
televisión y del número promedio de coches por hogar apunta a los
niveles reducidos de actividad física como factor causante
relevante.
Los problemas crónicos de la salud que amenazan
potencialmente la vida se clasifican en cuatro áreas principales:
1) problemas cardiovasculares, que incluyen hipertensión, enfermedad
cardiaca crónica y apoplejía, 2) dolencias asociadas con la
resistencia a la insulina, más exactamente diabetes mellitus no
dependiente de la insulina (NIDDM), 3) algunos tipos de cánceres,
principalmente los hormonalmente relacionados y cánceres de
intestino grueso, y 4) colecistopatía. Otros problemas asociados
con la obesidad incluyen dificultades respiratorias, problemas
músculo esqueléticos, problemas de la piel e infertilidad (OMS,
1998).
Las estrategias principales actualmente
disponibles para tratar estos trastornos incluyen restricción en la
dieta, incrementos de la actividad física, soluciones farmacológicas
y quirúrgicas. En adultos, la pérdida de peso a largo plazo es
excepcional usando intervenciones conservativas. Las intervenciones
farmacológicas actuales inducen normalmente una pérdida de peso de
entre cinco y quince kilogramos. Si la medicación se interrumpe, da
como resultado una ganancia de peso renovada. Los tratamientos
quirúrgicos son comparativamente satisfactorios y se reservan para
pacientes con obesidad extrema y/o con complicaciones médicas
serias.
Recientemente, una chica muy obesa de 10 años, a
la cual se le había detectado una mutación de deficiencia de
leptina, se trató satisfactoriamente con leptina recombinante. Este
es el primer individuo que se aprovechó terapéuticamente de la
detección de la mutación subyacente a su obesidad mórbida.
Se han llevado a cabo diversos estudios en
gemelos para estimar la heredabilidad del IMC, alguno de los cuales
ha abarcado más de 1000 parejas de gemelos. Los resultados han sido
muy coherentes: las correlaciones intrapareja entre gemelos
monozigóticos estuvieron normalmente entre 0,6 y 0,8,
independientemente de la edad y el género. En un estudio, las
correlaciones para gemelos monozigóticos y dizigóticos fueron
básicamente las mismas, independientemente de si los gemelos se
habían criado separados o juntos. Se estimó la heredabilidad del IMC
en 0,7; los factores ambientales no compartidos explican el 30%
restante de la varianza. Sorprendentemente, los factores ambientales
compartidos no explican una proporción sustancial de la varianza.
La alimentación hipercalórica e hipocalórica conduce a grados
similares de ganancia o pérdida de peso entre ambos miembros de
parejas de gemelos monozigóticos, indicando que los factores
genéticos regulan el efecto de la variación inducida genéticamente
de disponibilidad de la energía sobre el peso corporal. Las
reacciones y cambios metabólicos en la distribución de grasa en el
cuerpo tras comer en exceso y comer en defecto están también bajo
control genético (revisado por Hebebrand
y col., 1998).
y col., 1998).
Un estudio a largo plazo de adopción ha revelado
que el IMC de los adoptados está correlacionado con el de sus
padres biológicos y no con el IMC de los padres adoptivos.
Dependiendo del estudio de familia, la correlación entre el IMC de
hermanos está entre 0,2 y 0,40. Las correlaciones
padres-hijos son normalmente ligeramente
inferiores. Los análisis de segregación han sugerido repetidamente
un efecto mayor del gen recesivo. Basándose en estos análisis, se
han llevado a cabo cálculos del tamaño de muestra basándose en
aproximaciones concordantes y discordantes. A diferencia de lo
esperado, la aproximación concordante pareja de hermanos fue
superior, se necesitó un número bajo de familias para conseguir la
misma potencia.
Los estudios de familia basados en pacientes
jóvenes indexados muy obesos, cualquiera de madre o padre o ambos,
tienen un IMC > 90º decil en la inmensa mayoría de familias.
Basándose en el índice de los pacientes con un IMC > de 95º
centil, aproximadamente un 20% de las respectivas familias tienen un
hermano con un IMC > 90º centil.
En conclusión, es aparente que los factores
ambientales interactúan con genotipos específicos volviendo a un
individuo más o menos susceptible al desarrollo de la obesidad.
Además, a pesar del hecho de que se han detectado los genes de
mayor influencia, es necesario considerar que el espectro alcanza
desde los genes de mayor influencia a los genes con sólo una
influencia menor.
El descubrimiento del gen de la leptina a
finales de 1994 (Zhang y col., 1994) ha estado seguido por una
explosión virtual de esfuerzos científicos para descubrir los
sistemas reguladores sobre los que subyacen el apetito y la
regulación del peso. Es actualmente el campo biomédico de más rápido
crecimiento. Esta mejora notable ha dado como resultado también
actividades genéticas moleculares a gran escala que, debido al
interés clínico obvio, se relacionan básicamente todas con la
obesidad en seres humanos, roedores y otros mamíferos (Hebebrand y
col., 1998).
A este respecto, se han clonado en roedores
muchos genes cuyas mutaciones conducen a formas monogénicas
actualmente conocidas de obesidad. Se están analizando actualmente
las consecuencias sistémicas de estas mutaciones. Estos modelos han
proporcionado nuevas percepciones de los sistemas reguladores
complejos implicados en la regulación del peso corporal, el mejor
conocido de los cuales incluye la leptina y su receptor.
En ratones, pero también en cerdos, se han
identificado unos 15 locus de rasgos cuantitativos (QTL por sus
siglas en inglés) que es más probable que sean relevantes en la
regulación del peso (Rankinen y col., 2002).
En seres humanos, se han descrito cuatro formas
recesivas autosómicas de la obesidad extremadamente raras a partir
de 1997. Mutaciones en los genes que codifican la leptina, el
receptor de la leptina, la prohormona convertasa 1 y la
pro-opiomelanocortina (POMC) han demostrado producir
gran obesidad de un tipo de desarrollo temprano, asociada con
hiperfagia. Distintas anormalidades clínicas (por ejemplo, pelo
rojo, amenorrea primaria) y/o endocrinológicas (por ejemplo,
niveles de leptina en suero marcadamente alterados, ausencia de
secreción de ACTH) adicionales, apuntan a los genes candidatos
respectivos. Los modelos animales monogénicos y las formas
monogénicas humanas han llevado a nuevas percepciones acerca del
complejo sistema que subyace en la regulación del peso corporal.
Muy recientemente, se ha descrito en seres
humanos la primera forma dominante autosómica de la obesidad. Se
observaron dos diferentes mutaciones dentro del gen receptor de la
melanocortina-4 (MC4R) que conducen a una
obesidad extrema en probandos heterozigóticos de estas variantes. A
diferencia de los hallazgos anteriormente mencionados, estas
mutaciones no implican anormalidades fenotípicas fácilmente obvias
diferentes de la obesidad extrema (Vaisse y col., 1998; Yeo y col.,
1998). De manera interesante, se detectaron mutaciones en ambos
grupos mediante selecciones sistemáticas en grupos de estudio
relativamente pequeños (n = 63 y n = 43).
Hinney y col. (1999) seleccionaron el
M4CR en un total de 492 niños y adolescentes obesos. Al final
de todo, se detectaron cuatro individuos con dos mutaciones
diferentes que condujeron a haploinsuficiencia. Una fue idéntica a
la anteriormente observada por Yeo y col. (1998). La otra mutación,
que se detectó en tres individuos, indujo una mutación de detención
en la región extracelular del receptor. Aproximadamente un uno por
ciento de individuos muy obesos albergaron mutaciones de
haploinsuficiencia en el M4CR. Adicionalmente a las dos
formas de haploinsuficiencia, Hinney y col. (1999) detectaron
también mutaciones adicionales que condujeron a intercambios de
aminoácidos conservativos y no conservativos. De manera interesante,
estas mutaciones se observaron principalmente en el grupo de
estudio de obesos. Las implicaciones funcionales de estas mutaciones
se desconocen actualmente.
La identificación de individuos con mutaciones
MC4R es interesante a la luz de posibles intervenciones
farmacológicas. De esta manera, la aplicación intranasal de
adrenocorticotropina_{4-10}
(ACTH_{4-10}), que representa una secuencia
central de todas las melanocortinas, dio como resultado reducción en
el peso, masa grasa corporal y concentraciones de leptina en plasma
en controles sanos. La pregunta estriba en cómo los vehículos de la
mutación reaccionarían a este tratamiento, que podría equilibrar
teóricamente su densidad reducida del receptor.
La implicación de genes específicos en la
regulación del peso está sustanciada además por los datos obtenidos
de ratones transgénicos. Por ejemplo, ratones deficientes en MC4R
desarrollan un inicio temprano de la obesidad (Huszar y col.,
1997).
Diferentes grupos están realizando escáneres del
genoma relacionados con la obesidad o los fenotipos dependientes
(IMC, niveles de leptina, masa grasa, etc.). Esta solución parece
muy prometedora, debido a que es sistemática y libre de modelos.
Adicionalmente, se ha demostrado ya que es excepcionalmente
satisfactoria. De esta manera, se han obtenido resultados de unión
positiva incluso analizando grupos de estudio comparativamente
pequeños. Más importante, se han replicado ya algunos hallazgos. Se
han identificado cada una de las siguientes regiones por al menos
dos grupos independientes: cromosoma 1q32, cromosoma 2p21, cromosoma
10 y cromosoma 20q13 (Rankinen y col. 2002).
El documento WO 95/17906 desvela un
procedimiento para detectar la predisposición a un trastorno
asociado con algún polimorfismo de restricción en el locus del gen
PPYR1 y éste es un datos disponible que implica a este receptor en
el control de la obesidad (páginas 41 y 83).
El documento WO 96/14331 enseña que el tercer
bucle intracelular del receptor PPYR1 comprende un tramo elástico
de 27 aminoácidos en la posiciones 236-263, y que
este segmento es esencial para la interacción con la proteína G,
una etapa necesaria en la cascada de transducción de la señal
(páginas 13-16). Adicionalmente, este documento
describe moléculas PPYR1 modificadas en las que algunos aminoácidos
se sustituyen con el fin de interrumpir la estructura de la hélice
y bloquear la interacción (página 30, línea 3) y sugiere la utilidad
de dichos receptores modificados en los compuestos identificados
para el tratamiento de la obesidad (véase el Resumen y la página
16).
La presente descripción desvela ahora la
identificación de un gen humano de predisposición a la obesidad,
que puede usarse para el diagnóstico de la obesidad. La descripción
demuestra más específicamente que algunos alelos del gen PPYR1 en
el cromosoma 10 están relacionados con la predisposición a la
obesidad y representan dianas nuevas para la intervención
terapéutica.
En el presente documento se describen diversos
SNP y mutaciones en el gen PPYR1 que se asocian con la obesidad.
Preferiblemente, dichos SNP asociados con la obesidad son SNP718 y
SNP826.
En concreto, la presente invención se dirige a
un procedimiento para detectar la presencia de o la predisposición
a la obesidad en un sujeto, comprendiendo el procedimiento (i)
proporcionar una muestra del sujeto y (ii) detectar la presencia de
una alteración en el locus del gen PPYR1 en dicha muestra, siendo
dicha alteración SNP 718 (nucleótido 803 C/T en la SEC DE ID Nº
1).
Opcionalmente, dicha alteración se detecta a
través de la genotipificación de un halotipo, comprendiendo dicho
halotipo SNP 718 (nucleótido 803 C/T en la SEC DE ID Nº 1), SNP 826
(nucleótido 911 G/A en la SEC DE ID Nº 1) y un SNP seleccionado
entre el grupo constituido por SNP 195 (nucleótido 280 G/A en la SEC
DE ID Nº 1), SNP 588 (nucleótido 673 G/A en la SEC DE ID Nº 1), SNP
897 (nucleótido 982 C/T en la SEC DE ID Nº 1), SNP 948 (nucleótido
1033 en la SEC DE ID Nº 1) y SNP 1047 (nucleótido 1132 C/T) en la
SEC DE ID Nº 1).
En una forma de realización, la presencia de una
alteración en el locus del gen PPYR1 se detecta mediante
secuenciamiento, hibridación selectiva y/o amplificación
selectiva.
En una forma de realización adicional, dicho
procedimiento comprende específicamente amplificar el gen PPYR1a,
preferiblemente con el cebador de amplificación FN1A (SEC DE ID Nº
9).
Opcionalmente, el procedimiento comprende
detectar la presencia de un polipéptido PPYR1 alterado, que
comprende un polimorfismo en el aminoácido 240: Arg/Cys.,
preferiblemente poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo
específico para dicho polipéptido PPYR1 alterado y determinar la
formación de un inmunocomplejo.
La invención se puede usar en el diagnóstico de
la predisposición a la obesidad.
Figura 1: Representación gráfica del punto de
unión en el cromosoma 10q11. Las curvas representan gráficamente los
resultados de la unión para el procedimiento GenomaHIP, los puntos
representan gráficamente los resultados de los microsatélites
marcadores en la región. Las líneas punteadas corresponden a los
umbrales Lander y Krygliak para la evidencia sugestiva y la
evidencia de la unión respectivamente. Se obtuvieron resultados de
la unión para 99 clones BAC en el cromosoma 10 humano tras el
procedimiento GenomaHIP^{R}. Cada punto en el eje x corresponde a
un clon. Se indican diversos clones por su nombre de biblioteca para
mejor orientación (por ejemplo RP11-70B16). Las dos
líneas horizontales en 3*10^{-4} y 2*10^{-5} para los valores p
corresponden a los niveles de significancia para la unión
significativa y sugestiva propuesta por Krygliak y Lander para
selecciones de genoma completo. Los dos picos más altos delimitan el
intervalo de clones con evidencia de unión tras el análisis
GenomaHIP^{R}.
Figura 2: Ejemplo de secuencia que muestra la
mutación en el nucleótido en la posición 718 de la secuencia de
codificación del receptor PPY1 humano. Figura 2A: Ejemplo de una
mutación heterocigótica tras la preamplificación con un cebador FN1A
específico. El emplazamiento de la mutación se indica mediante la
flecha. Los tripletes del codón se delimitan mediante las barras
verticales. Figura 2B: Ejemplo de una mutación heterocigótica tras
la amplificación con cebadores genéricos F5/R5. Tal como en el
emplazamiento A, la mutación se indica mediante la flecha. Los
tripletes del codón se delimitan mediante las barras verticales.
Como están presentes cuatro alelos, el alelo A mutante es apenas
visible bajo el pico G dominante (pico A pequeño bajo el pico G con
relación aparente 3:1). Figura 2C: Ejemplo de una mutación
homocigótica tras preamplificación con el cebador FN1A específico.
Figura 2D: Secuencia homocigótica de tipo natural para PPY1R tras la
preamplificación con el cebador FN1A específico.
Figura 3: Curvas de unión del receptor mutante.
Las curvas muestran los resultados de los experimentos de
sustitución por competición usando PYY y NPY humanos como
competidores del polipéptido pancreático (PP). Los constructos 1, 2
y 3 corresponden al tipo natural del receptor PPY1 humano, mutante
718 (codón 240, Arg -> Cys) y mutante 826 (codón 276, Val ->
Met) respectivamente.
Figura 4: Respuesta del segundo mensajero (AMPc)
de los receptores de tipo natural y mutante que soportan mutaciones
en las posiciones 718 u 826 respectivamente. Resultados de las
medidas del AMPc en comparación con el receptor NPY4r de tipo
natural (curva sólida) para los receptores de los dos mutantes que
soportan snp718 (curva punteada, 3^{er} bucle intracelular) y
snp826 (curva rota, 6ª región transmembrana). Disminución relativa
de la concentración de AMPc sobre el eje Y en unidades
arbitrarias.
La presente invención desvela la identificación
de PPYR1 como un gen humano de predisposición a la obesidad. Se
sometieron diversas muestras de ácido nucleico procedente de 89
familias a un procedimiento GenomaHIP concreto. Este procedimiento
conduce a la identificación de fragmentos concretos idénticos por
descendencia en dichas poblaciones que están alterados en sujetos
obesos. Seleccionando los fragmentos IBD, los autores de la presente
invención identificaron el gen del receptor Y del polipéptido
pancreático (PPYR1) como candidato para la obesidad y los fenotipos
relacionados. Este gen está por tanto presente en el intervalo
crítico y expresa un fenotipo funcional consistente con una
regulación genética de la obesidad. Se identificaron también
diversos alelos mutados y SNP del gen PPYR1 como correlacionados
con la obesidad en sujetos humanos. Se ha encontrado una mutación
puntual concreta en el codón 240 (SNP 718 C/T) en hasta un 60% de
los sujetos obesos evaluados y está fuertemente asociada con la
obesidad (tabla 3). Se encontraron otras mutaciones, por ejemplo, en
los codones 23, 40, 54, 99, 239, 247, 276, 287 y 343.
La presente invención propone de esta manera
usar el gen PPYR1 y los productos de expresión correspondientes para
el diagnóstico de la obesidad.
Obesidad y trastornos metabólicos: La obesidad
deberá considerarse como cualquier estado de acumulación anormal o
excesiva de grasa en el tejido adiposo, en tal extensión que la
salud puede deteriorarse. Los trastornos, enfermedades o patologías
asociados incluyen, más específicamente, cualquier trastorno
metabólico, que incluye hipo-alfalipoproteinimia,
hiperlipidemia familiar combinada, síndrome X resistente a la
insulina o trastorno metabólico múltiple, enfermedad de la arteria
coronaria, diabetes mellitus e hipertensión dislipidémica. La
invención se puede usar en diversos sujetos, concretamente seres
humanos, que incluyen adultos, niños y en la etapa prenatal.
Dentro del contexto de esta invención, el locus
del gen PPYR1 designa todas las secuencias PPYR1 de productos en
una célula u organismo, que incluyen las secuencias que codifican
PPYR1, las secuencias que no codifican PPYR1 (por ejemplo,
intrones, las secuencias reguladoras de PPYR1 que controlan la
transcripción y/o la traducción (por ejemplo, promotor, mejorador,
terminador, etc.), así como todos los productos de expresión
correspondientes, tales como los ARN de PPYR1 (por ejemplo, los
ARNm) y los polipéptidos PPYR1 (por ejemplo, una preproteína y una
proteína madura).
Tal como se usa en la presente solicitud, el
término "gen PPYR1" designa el gen del Receptor 1 del
Polipéptido Pancreático en el cromosoma 10 humano, así como las
variantes, análogos y fragmentos del mismo, incluyendo los alelos
del mismo (por ejemplo, mutaciones en la línea germinal) que están
relacionadas con la predisposición a la obesidad y trastornos
metabólicos. El gen PPYR1 puede denominarse también como gen Y4, el
gen NPY4R o el gen PP 1.
Deberá considerarse que el término "gen"
incluye cualquier tipo de ácido nucleico codificante, incluyendo
ADN genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc), ADN sintético o
semisintético, así como cualquier forma de ARN correspondiente. El
término gen incluye concretamente los ácidos nucleicos recombinantes
que codifican PPYR1, es decir, cualquier molécula de ácido nucleico
creada artificialmente que no se produce naturalmente, por ejemplo,
ensamblando, cortando, ligando o amplificando secuencias. Un gen
PPYR1 es normalmente de doble cadena, aunque se pueden contemplar
otras formas, tales como de cadena única. Se pueden obtener los
genes PPYR1 a partir de diversas fuentes y de acuerdo con diversas
técnicas conocidas en la técnica, tales como mediante selección de
bibliotecas de ADN o mediante amplificación a partir de diversas
fuentes naturales. Se pueden preparar ácidos nucleicos
recombinantes mediante técnicas convencionales que incluyen la
síntesis química, ingeniería genética, técnicas enzimáticas, o una
combinación de las mismas. Se pueden encontrar las secuencias
adecuadas del gen PPYR1 en los bancos de genes, tales como el
Unigene Cluster para el PPYR1 (Hs. 54426), NM_005972 de Unigene
Representative Sequence, ARNm de REFSEQ: NM-005972,
ensamblaje MIPS: H8600S1, ensamblaje DOTS: DT.406393 y
gen/secuencias de ADNc adicionales: U35232, U42387, Z66526.
Un ejemplo concreto de PPYR1 comprende la SEC DE
ID Nº: 1.
El término "gen PPYR1" incluye cualquier
variante, fragmento o análogo de la SEC DE ID Nº: 1 o cualquier
secuencia de codificación tal como se identifica anteriormente.
Dichas variantes incluyen, por ejemplo, variantes que se producen
naturalmente debidas a variaciones alélicas entre individuos (por
ejemplo, polimorfismos), alelos mutados relacionados con la
obesidad, formas de ajustamiento alternativas, etc. El término
variante incluye también las secuencias del gen PPRY1 de otras
fuentes u organismos. Las variantes son preferiblemente
sustancialmente homólogas a la SEC de ID Nº: 1, es decir, presentan
una identidad en la secuencia de nucleótidos de al menos
aproximadamente el 65%, normalmente al menos aproximadamente el 75%,
preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 95% con la secuencia de
identidad Nº 1: Las variantes y análogos de un gen PPYR1 incluyen
también las secuencias de ácido nucleico, que se hibridan a una
secuencia tal como se define anteriormente (o una cadena
complementaria de la misma) bajo condiciones de hibridación
restrictiva. Las condiciones de hibridación restrictiva normales
incluyen temperaturas por encima de 30ºC, preferiblemente por
encima de 35ºC, más preferiblemente por encima de 42ºC, y/o
salinidad de menos de aproximadamente 500 mM, preferiblemente menos
de 200 mM. Se pueden ajustar las condiciones de hibridación por la
persona experta modificando la temperatura, salinidad y/o la
concentración de otros reactivos tales como SDS, SSC, etc.
Un fragmento del gen PPYR1 designa cualquier
porción de al menos 8 nucleótidos consecutivos de una secuencia tal
como se describe anteriormente, preferiblemente al menos
aproximadamente 15, más preferiblemente al menos aproximadamente 20
nucleótidos, preferiblemente adicionalmente de al menos 30
nucleótidos. Los fragmentos incluyen toda la longitud posible del
nucleótido entre 8 y 100 nucleótidos, preferiblemente entre 15 y
100, más preferiblemente entre 20 y 100.
\newpage
Un polipéptido PPYR1 designa cualquier proteína
o polipéptido codificado por un gen PPYR1 tal como se describe
anteriormente. El término "polipéptido" se refiere a cualquier
molécula que comprende un tramo de aminoácidos. Este término
incluye moléculas de diversas longitudes, tales como péptidos y
proteínas. Se puede modificar el polipéptido, tal como mediante
glicosilaciones y/o acetilaciones y/o reacción química o
acoplamiento, y puede contener uno o diversos aminoácidos no
naturales o sintéticos. Un ejemplo específico de un polipéptido
PPYR1 comprende toda o parte de la SEC DE ID Nº: 2 o una variante de
la misma.
Dentro del contexto de la presente invención, el
término "diagnóstico" incluye la detección, seguimiento,
dosificación, comparación, etc., en diversas etapas, que incluyen
las etapas temprana, presintomática y las últimas etapas, en
adultos, niños y antes del nacimiento. El diagnóstico incluye
normalmente la prognosis, la evaluación de una predisposición o
riesgo d desarrollo, la caracterización de un sujeto para definir el
tratamiento más apropiado (farmacogenética), etc.
Un objeto concreto de esta invención reside en
un procedimiento para detectar la presencia o la predisposición a
la obesidad en un sujeto, comprendiendo el procedimiento detectar en
una muestra del sujeto la presencia de una alteración en el locus
del gen PPYR1, siendo dicha alteración SWP718 (nucleótido 803 C/T en
la SEC DE ID Nº: 1), el cebador FN1A directo (SEC DE ID Nº 9)
permite una amplificación específica del gen PPYR1a (véanse los
Ejemplos).
Se puede determinar la alteración en el ADNg, el
ARN o el polipéptido PPYR1. Opcionalmente, la detección se lleva a
cabo secuenciando todo o parte del gen PPYR1 o mediante hibridación
o amplificación selectiva de todo o parte del gen PPYR1. Más
preferiblemente, se lleva a cabo una amplificación específica del
gen PPYR1 antes de la etapa de identificación de la alteración.
A este respecto, la presente invención desvela
ahora diversos SNP y mutaciones en el gen PPYR1, que se asocian con
la obesidad. En la siguiente tabla 2 se indican estas mutaciones
puntuales
Estas mutaciones puntuales afectan la región de
codificación del gen PPYR1 y dan como resultado, para alguna de
ellas, un resto de aminoácido alterado en el polipéptido codificado.
Se han detectado estas mutaciones puntuales en sujetos que tienen
obesidad. Se construyeron los halotipos de todos estos SNP para
determinar la fase que se produce naturalmente para cada posible
combinación de SNP. Los resultados muestran que SNP 588 está en un
desequilibrio de unión casi completo con todos los demás productos
que no codifican SNP y se puede usar como un denominador fiable
para los diferentes halotipos que implican cambios de aminoácidos.
Los halotipos que comprende SNP 5888 y cualquier combinación de SNP
que cambian aminoácidos se usaron a continuación para evaluar la
asociación entre todos los alelos resultantes y la obesidad. Los
resultados muestran que los halotipos caracterizados por una
mutación puntual en el codón 240 (véase la tabla 2 anterior) se
asocian fuertemente con la obesidad (tablas 3 y 4):
Tal como se indica anteriormente, se pueden usar
diversas técnicas conocidas en la técnica para detectar o
cuantificar el gen o la secuencia alterada de PPYR1 que incluyen el
secuenciamiento, hibridación, amplificación y/o unión a ligandos
específicos (tales como anticuerpos). Otros procedimientos adecuados
incluyen, oligonucleótidos alelo específicos (ASO), amplificación
alelo específica, inmunoemborronado (para ADN), inmunoemborronado
Northern (para ARN), análisis de conformación de cadena única
(SSCA), PFGE, hibridación fluorescente in situ (FISH),
migración en gel, electroforesis en gel desnaturalizado humedecido,
análisis heteroduplex, protección de la ARNasa, rotura por
emparejamiento químico; ELISA, radioinmunoensayos (RIA) y ensayos
inmunoenzimáticos (IEMA).
Algunas de estas soluciones (por ejemplo, SSCA y
CGGE) se basan en un cambio en la movilidad electroforética de los
ácidos nucleicos, como resultado de la presencia de una secuencia
alterada. De acuerdo con estas técnicas, la secuencia alterada se
visualiza mediante un cambio en la movilidad sobre los geles. A
continuación se pueden secuenciar los fragmentos para confirmar la
alteración.
Algunas otras se basan en la hibridación
específica entre los ácidos nucleicos del sujeto y una sonda
específica para el gen o el ARN de PPYR1 de tipo natural o
alterado. La sonda puede estar en suspensión o inmovilizada sobre
un sustrato. La sonda se marca normalmente para facilitar la
detección de los híbridos.
Algunas de estas soluciones son particularmente
adecuadas para evaluar una secuencia de polipéptido tal como por
inmunoemborronado Northern, ELISA y RIA. Este último requiere el uso
de un ligando específico para el polipéptido, más preferiblemente de
un anticuerpo específico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede llevar a cabo el secuenciamiento usando
técnicas bien conocidas en la técnica, usando secuenciadores
automáticos. Se puede llevar a cabo el secuenciamiento en el gen
PPYR1 completo o, más preferiblemente, en las regiones específicas
del mismo, normalmente aquellas conocidas o sospechosas de
transportar mutaciones perjudiciales u otras alteraciones.
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación se basa en la formación de
híbridos específicos entre secuencias complementarias de ácido
nucleico que sirven para iniciar la reproducción del ácido
nucleico.
Se puede llevar a cabo la amplificación de
acuerdo con diversas técnicas conocidas en la técnica, tales como
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en
cadena de la ligasa (LCR), amplificación por desplazamiento de
cadena (SDA), y amplificación basada en la secuencia de ácido
nucleico (NASBA). Se pueden llevar a cabo estas técnicas usando
reactivos y protocolos comercialmente disponibles. Las técnicas
preferidas usan PCR alelo específica o PCR-SSCP. La
amplificación requiere usualmente el uso de cebadores específicos de
ácido nucleico para iniciar la reacción.
Los cebadores de ácido nucleico útiles para
amplificar secuencias del gen o el locus de PPYR1 son capaces de
hibridar específicamente con una porción del locus del gen PPYR1 que
flanquea una región diana de dicho locus, estando dicha región
diana alterada en algunos sujetos que tienen obesidad o trastornos
asociados y facilitándose dichas regiones diana en la Tabla 2
anterior. Más concretamente, la amplificación es específica del gen
PPYR1a.
Los ejemplos específicos de cebadores que se
puede usar para amplificar la región diana de PPYR1 comprende
SNP718 que tiene una secuencia idéntica o complementaria a la
porción de la SEC DE ID Nº: 1 localizada entre los restos de
nicleótido 700 a 800 o 805 a 900. Los cebadores que se pueden usar
para amplificar la región diana de PPYR1 comprenden otros SNP tal
como se identifica en la tabla 2 que pueden diseñarse basándose en
la secuencia de la SEC DE ID Nº: 1.
Los cebadores que se pueden usar para amplificar
específicamente la región diana de PPYR1 comprenden SNP718
deberían, por ejemplo, comprender una secuencia idéntica o
complementaria de una porción de la SEC DE ID Nº: 1 localizada
entre los residuos nucleótidos 800 y 805. Un ejemplo específico de
dicho cebador comprende la secuencia CGGTGC (residuos nucleótidos
800-805 de la SEC DE ID Nº: 1 con SNP718):
La descripción se refiere a un cebador de ácido
nucleico, en el que dicho cebador es complementario a y se hibrida
específicamente a una porción de un gen o ARN de PPYR1, en el que
dicha porción comprende un nucleótido T en la posición 801 y/o un
nucleótido A en la posición 911 de la SEC DE ID Nº 1.
Los cebadores típicos son moléculas de ácido
nucleico de cadena única de aproximadamente 5 a 60 nucleótidos, más
preferiblemente de 8 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud.
Se puede derivar la secuencia directamente de la secuencia del
locus del gen PPYR. Se prefiere una complementariedad perfecta, para
asegurar una elevada especificidad. Sin embargo, se puede tolerar
algún emparejamiento.
Los procedimientos de detección de la
hibridación se basan en la formación de híbridos específicos entre
secuencias complementarias de ácido nucleico que sirven para
detectar la(s) alteración(es) en la secuencia de ácido
nucleico.
Una técnica de detección concreta implica el uso
de una sonda de ácido nucleico específica para el gen o el ARN de
PPYR1 natural o alterado, seguido por la detección de la presencia
de un híbrido. La sonda puede estar en suspensión o inmovilizada en
un sustrato o soporte (como en una matriz de ácido nucleico o
tecnologías de chips). La sonda está normalmente marcada para
facilitar la detección de híbridos.
A este respecto, una forma de realización
concreta de esta invención comprende poner en contacto la muestra
del sujeto con una sonda de ácido nucleico específica para un locus
del PPYR1 alterado, y evaluar la formación de un híbrido. En una
forma de realización concreta, el procedimiento comprende poner en
contacto simultáneamente la muestra con un conjunto de sondas que
son específicas, respectivamente, para el locus del gen PPYR1 de
tipo natural y para diversas formas alteradas del mismo. En esta
forma de realización, es posible detectar directamente la presencia
de diversas formas de alteraciones en el locus del gen PPYR1 en la
muestra. También, se pueden tratar en paralelos diversas muestras de
diversos sujetos.
Dentro del contexto de esta invención, una sonda
se refiere a una secuencia de polinucleótidos que es complementaria
a y capaz de hibridación específica con un (porción diana de un) gen
o ARN de PPYR1, y que es adecuada para detectar polimorfismos de
polinucleótidos asociados con alelos PPYR1 que predisponen a o están
asociados con obesidad o trastornos metabólicos. Las sondas son
complementarias perfectamente al gen PPYR1, el ARN, o la porción
diana del mismo. Las sondas comprenden normalmente ácidos nucleicos
de cadena única de entre 8 a 1000 nucleótidos de longitud, por
ejemplo, de entre 10 y 800, más preferiblemente de entre 15 y 700,
normalmente de entre 20 y 500. Debería entenderse también que se
pueden usar sondas más largas. Una sonda preferida es una molécula
de ácido nucleico de cadena única de entre 8 a 500 nucleótidos de
longitud, que se puede hibridar específicamente a una región de un
gen o ARN de PPYR1 que transporta una alteración.
Una sonda específica es una sonda de ácido
nucleico específica para un gen o ARN de PPYR1 alterado (por
ejemplo, un mutado), es decir, una sonda de ácido nucleico que se
hibrida específicamente a dicho gen o ARN de PPYR1 alterado y
esencialmente no se hibrida a un gen o ARN de PPYR1 que carece de
dicha alteración. Específicamente indica que la hibridación de la
secuencia diana genera una señal específica que se puede distinguir
de la señal generada mediante la hibridación no específica. Se
prefieren las secuencias perfectamente complementarias para diseñar
las sondas. Debería entenderse, sin embargo, que se puede tolerar
algún emparejamiento, siempre que se pueda distinguir la señal
específica de la hibridación no específica.
Los ejemplos concretos de dicha sondas son
secuencias de ácido nucleico complementarias a la porción diana del
gen o ARN de PPYR1 que transporta una mutación puntual tal como se
relaciona en la Tabla 2 anterior, más preferiblemente un nucleótido
T en la posición 152 (SNP67), un nucleótido A en la posición 203
(SNP118), un nucleótido A en la posición 245 (SNP160), un
nucleótido T en la posición 800 (SNP715), un nucleótido A en la
posición 801 (SNP716), un nucleótido A en la posición 824 (SNP739),
un nucleótido A en la posición 911 (SNP826), un nucleótido C en la
posición 945 (SNP860), y/o un nucleótido A en la posición 1114
(SNP1029) de la SEC DE ID Nº 1 o una de sus combinaciones, más
preferiblemente aún un nucleótido T en la posición 800, un
nucleótido A en la posición 801 y/o un nucleótido A en la posición
911 d la SEC DE ID Nº 1 o una de sus combinaciones.
Se puede derivar la secuencia de las sondas de
las secuencias del gen y el ARN de PPYR1 tal como se proporciona en
la presente solicitud. Se pueden llevar a cabo sustituciones de
nucleótidos, así como modificaciones químicas de la sonda. Pueden
llevarse a cabo dichas modificaciones químicas para aumentar la
estabilidad de los híbridos (por ejemplo, grupos intercalantes) o
para marcar la sonda. Los ejemplos típicos de marcas incluyen, sin
limitación, radioactividad, fluorescencia, luminiscencia, marcado
enzimático, etc.
Tal como se indica anteriormente, se puede
detectar también la alteración en el locus del gen PPYR1
seleccionando la(s) alteración(es) en el polipéptido
PPYR1 que comprende polimorfismos en el aminoácido 240: Arg/Cys. A
este respecto, una forma de realización específica de esta invención
comprende poner en contacto la muestra con un ligando específico de
un polipéptido PPYR1 que comprende polimorfismo en el aminoácido
240: Arg/Cys y determinar la formación de un complejo.
Se pueden usar diferentes tipos de ligandos,
tales como anticuerpos específicos. En una forma de realización
específica que comprende polimorfismo en el aminoácido 240. Arg/Cys,
la muestra se pone en contacto con un anticuerpo específico de un
polipéptido PPYR1 y se determina la formación de un inmunocomplejo.
Se pueden usar diversos procedimientos para detectar un
inmunocomplejo, tales como ELISA, radioinmunoensayos (RIA) y ensayos
inmunoenzimáticos (IEMA).
Dentro del contexto de esta invención, un
anticuerpo designa un anticuerpo policlonal, un anticuerpo
monoclonal, así como los fragmentos o derivados de los mismos que
tienen sustancialmente la misma especificidad antigénica. Los
fragmentos incluyen Fab, Fab'2, regiones CDR, etc. Los derivados
incluyen anticuerpos de cadena única, anticuerpos humanizados,
anticuerpos polifuncionales, etc.
Un anticuerpo específico de un polipéptido PPYR1
que comprende polimorfismo en el aminoácido 240: Arg/Cys designa un
anticuerpo que une selectivamente un polipéptido PPYR1 que comprende
polimorfismo en el aminoácido 240: Arg/Cys, es decir, un anticuerpo
potenciado frente a un polipéptido PPYR1 que comprende polimorfismo
en el aminoácido 240: Arg/Cys o un fragmento del mismo que contiene
el epitopo. Aunque se puede producir la unión no específica con
otros antígenos, la unión al polipéptido PPYR1 diana que comprende
polimorfismo en el aminoácido 240: Arg/Cys se produce con una
afinidad mayor y se puede discriminar de manera fiable de la unión
no específica.
En una forma de realización específica, el
procedimiento comprende poner en contacto una muestra del sujeto
con (un soporte recubierto con) un anticuerpo específico para una
forma alterada de un polipéptido PPYR1, que comprende polimorfismo
en el aminoácido 240: Arg/Cys y determinar la presencia de un
inmunocomplejo. En una forma de realización concreta, se puede
poner en contacto la muestra simultáneamente, o en paralelo, o
secuencialmente, con diversos (soportes recubiertos con) anticuerpos
específicos para diferentes formas de un polipéptido PPYR1 tal como
un tipo natural y diversas formas alteradas del mismo.
Los ejemplos concretos de dichos ligandos
específicos son anticuerpos específicos para una secuencia del
polipéptido PPYR1 alterado que resulta de las mutaciones
relacionadas en la Tabla 2 anterior. Más concretamente estos
ligandos son específicos de algunas mutaciones en los codones 23,
40, 54, 239, 240, 247, 276, 287 y 343 tal como se relaciona en la
Tabla 2 o alguna combinación de aquellas mutaciones. Más
preferiblemente, dichos ligandos son específicos de algunas
mutaciones en los codones 239, 240 y/o 276 relacionados en la Tabla
2 anterior.
Se pueden llevar a cabo procedimientos de
diagnóstico in vitro o ex vivo. Usan una muestra del
sujeto para evaluar el estado del locus del gen PPYR1. La muestra
puede ser cualquier muestra biológica derivada de un sujeto que
contenga ácido nucleicos o polipéptidos. Los ejemplos de dichas
muestras incluyen fluidos, tejidos, muestras celulares, órganos,
biopsias, etc. Las muestras más preferidas son sangre, plasma,
saliva, orina, fluido seminal, etc. Se puede llevar a cambio
también el diagnóstico prenatal ensayando por ejemplo células
fetales o células placentales. Se puede recoger la muestra de
acuerdo con las técnicas convencionales y usarse directamente para
el diagnóstico o almacenarse. Se puede tratar la muestra antes de
llevar a cabo el procedimiento con el fin de devolver o mejorar la
disponibilidad de ácidos nucleicos o polipéptidos para ensayar. Los
tratamientos incluyen, por ejemplo, lisis (por ejemplo, mecánica,
física, química, etc.), centrifugación, etc. También, se pueden
prepurificar o enriquecer los ácidos nucleicos y/o polipéptidos
mediante técnicas convencionales, y/o reducirse en complejidad. Se
pueden tratar también los ácidos nucleicos y polipéptidos con
enzimas u otros tratamientos químicos o físicos para producir
fragmentos de los mismos. Considerando la elevada sensibilidad de
los procedimientos reivindicados, son suficientes muy pocas
cantidades de muestra para llevar a cabo el ensayo.
Tal como se indica, la muestra se pone en
contacto preferiblemente con reactivos tales como sondas, cebadores
o ligandos con el fin de evaluar la presencia de un locus alterado
del gen PPYR1. Se puede llevar a cabo el contacto en cualquier
dispositivo adecuado, tal como una placa, tubo, pocillo, vidrio,
etc. En las formas de realización específicas, el contacto se lleva
a cabo en un sustrato recubierto con el reactivo, tal como una
matriz de ácido nucleico o una matriz específica del ligando. El
sustrato puede ser un sustrato sólido o semisólido tal como
cualquier soporte que comprenda vidrio, plástico, nylon, papel,
metal, polímeros y similares. El sustrato puede ser de diversas
formas y tamaños, tales como un porta, una membrana, una perla, una
columna, un gel, etc. Se puede hacer el contacto bajo cualquier
condición adecuada para que se forme un complejo entre el reactivo y
los ácidos nucleicos o polipéptidos de la muestra.
El hallazgo de un polipéptido PPYR1 alterado,
ARN o ADN en la muestra tal como se reivindica es indicativo de la
presencia de un locus alterado del gen PPYR1 en el sujeto, que se
puede correlacionar con la predisposición a la obesidad. Por
ejemplo, un individuo que tenga una mutación en la línea germinal de
PPYR1 tal como se reivindica tiene un riesgo aumentado de
desarrollar obesidad o trastornos metabólicos.
Los aspectos y ventajas de la presente invención
se describirán en la siguiente sección experimental, que deberá
contemplarse como ilustrativa y no limitante del alcance de la
presente solicitud.
Hager y col. (1998) identificaron por primera
vez un locus en el cromosoma 10 humano ligado a obesidad humana
masiva. El estudio de unión mostró evidencias de unión entre los
marcadores D10S191 y D10S220 con un MLS máximo en el marcador
D10S197. La región completa cubrió un intervalo de aproximadamente
39 centimorgan.
El locus en el cromosoma 10p puede justificar un
21-36% de la obesidad en el grupo de estudio
analizado por el grupo francés (Hager y col., 1998).
Hinney y col. (2000) replicaron la unión en el
cromosoma 10. Con este objetivo, se genotipificaron 94 familias
alemanas con dos niños obesos para 12 microsatélites marcadores en
la región anteriormente identificada por Hager y col. (1998). El
MLS es 2,3. Un estudio adicional (Price RA, 2001) confirmó de manera
independiente la unión de este locus en una población americana. Es
por tanto actualmente seguro concluir que un número sustancial de
familias obesas alberga (un) alelo(s) que predisponen a la
obesidad en un gen del cromosoma 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha resaltado anteriormente, el
intervalo cromosómico de los hallazgos iniciales de unión es enorme
(39 cM) no permitiendo una solución de clonación posicional para
identificar el gen de predisposición a la obesidad en esta región.
Los autores de la presente invención aplicaron su plataforma
GenomeHip para reducir la región a un intervalo pequeño que podría
permitir la rápida identificación del gen susceptible a la
obesidad.
De manera breve, la tecnología consiste en la
formación de parejas a partir del ADN de los individuos
relacionados. Cada ADN se marca con una marca específica que
permite su identificación. A continuación se forman híbridos entre
los dos ADN. A continuación se aplicó un procedimiento particular
(documento WO 00/53802) que selecciona todos los fragmentos
idénticos por descendencia (IBD) a partir de los dos ADN en un
procedimiento multietapa. A continuación se puntuó el IBD restante
enriquecido con ADN frente a un clon BAC derivado de una micromatriz
de ADN lo que permite el posicionamiento de la fracción IBD en un
cromosoma.
La aplicación de este procedimiento sobre muchas
familias diferentes dio como resultado una matriz de fracciones IBD
para cada pareja de cada familia. A continuación el análisis
estadístico calculó las regiones IBD mínimas que se compartían
entre todas las familias ensayadas. Los resultados significativos
(valores p) son evidencia de la unión de la región positiva con el
rasgo de interés (aquí obesidad). Se puede delimitar el intervalo de
unión mediante los dos clones más distantes que muestran valores p
significativos.
En el presente estudio, se sometieron 89
familias de origen alemán (117 parejas de hermanos independientes)
concordantes para la obesidad masiva (tal como se define mediante un
índice de masa corporal > percentil 90) al procedimiento
GenomeHIP. A continuación se marcaron las fracciones IBD resultantes
enriquecidas con ADN con tintes fluorescentes Cy5 y se hibridaron
frente a una matriz de ADN constituida por 99 cromosomas 10
derivados de clones BAC humanos dando como resultado una resolución
del cromosoma amplio promedio de 250 kilobases. Se usó ADN no
seleccionado marcado con Cy3 para normalizar los valores de la señal
y calcular relaciones para cada clon. A continuación se llevó a
cabo el agrupamiento de los resultados de la relación para
determinar el estado IBD para cada clon y pareja.
Aplicando este procedimiento, se identificaron
diversos clones BAC ampliando una región de aproximadamente 4
megabases en el cromosoma 10 (bases 44000000 a 48000000), que
mostraron evidencias significativas de unión para la obesidad (tabla
2).
\vskip1.000000\baselineskip
Seleccionando la región cromosómica de 4
megabases anteriormente mencionada, los autores de la presente
invención identificaron el gen del receptor Y del polipéptido
pancreático (PPYR1) como candidato para la obesidad y los fenotipos
relacionados. Este gen está por tanto presente en el intervalo
crítico, con evidencias de unión delimitada por los clones
resaltados en el B anterior.
PPYR1 es un gen carente de intrón que codifica
un polipéptido predicho de 375 aminoácidos que tiene homología más
elevada con el gen del receptor Y1 (42% de identidad de
aminoácidos). PPY1R es un miembro de la familia de neuropéptidos
del receptor Y que comprende hasta el momento 5 miembros
identificados en seres humanos (NPY1R; NPY2R, NPY4R (PPY1R), NPY5R
y NPY6R) que muestran afinidades específicas con una familia de
neuropéptidos (NPY, PPY y PP). Casi todos estos péptidos y
receptores han mostrado jugar un papel en el metabolismo de
regulación de la energía (ingesta de alimento y regulación del
gasto de energía). De todos los receptores, PPY1R es el único que
se expresa principalmente en los tejidos periféricos (intestino,
tejido adiposo) mientras que los otros se expresan principalmente
en diferentes partes del cerebro. Se ha demostrado en diversos
estudios que el deterioro del receptor PPY1 está implicado en el
mal funcionamiento de la regulación de la ingesta de alimento y la
ganancia de peso en estudios en animales. El papel fisiológico del
receptor PPY1 periférico parece situarse en una señal inhibidora
que sigue a la unión de su ligando fisiológico con el polipéptido
pancreático (PP) que activa por tanto una cascada que inhibe la
ingesta de alimento en respuesta a este factor de saciedad. Las
mutaciones en el receptor podrían por tanto disminuir el impacto del
factor PP de saciedad y están implicadas en la etiología de
la
obesidad.
obesidad.
Tomados en conjunto, los resultados de la unión
proporcionados en la presente solicitud identifican el gen PPYR1
humano en el intervalo crítico de alteraciones genéticas unidas a la
obesidad en el cromosoma 10, que es una supuesta implicación en las
rutas de señalización de NPY/PP, concluimos que las alteraciones
(por ejemplo, mutaciones y/o polimorfismos) en el gen PPYR1 o sus
secuencias reguladoras pueden contribuir al desarrollo de la
obesidad humana y representan una nueva diana para el diagnóstico o
la intervención terapéutica.
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90 familias con al menos un individuo con
obesidad extrema de inicio temprano y sus padres se incluyeron en
la selección de la mutación. Adicionalmente, se seleccionaron 10
árboles genealógicos entre el conjunto CEPH de familias para las
mutaciones en el gen PPYR1 para permitir la determinación sin
ambigüedad de haplotipos multi-SNP.
Se diseñaron cebadores para amplificar el exón
único del gen PPYR1 en tres fragmentos solapantes. La secuencia de
los cebadores se proporciona a continuación:
Los productos resultantes de la amplificación se
secuenciaron directamente mediante secuenciación con tinte
terminador para identificar las mutaciones y polimorfismos en el
gen. Las muestras ambiguas se volvieron a amplificar y se volvieron
a secuenciar mediante secuenciación con tinte terminador y tinte
cebador.
Se detectaron un total de 12 polimorfismos de
nucleótido único en el gen (para las posiciones, véase la tabla 2).
Cuatro de estos dieron como resultado cambios de los aminoácidos en
los codones respectivos, tal como se ilustra en la tabla 2.
Se construyeron los haplotipos de los 12 SNP
para identificar la fase de todos los SNP. Algunos SNP (véase el
listados de haplotipos) estaban en completo desequilibrio de unión
(LD). Por esto, se seleccionó un SNP (SNP 588) representativo del
grupo LG para análisis adicionales de los haplotipos. Finalmente, se
seleccionaron tres SNP para el análisis de asociación de
haplotipos. Se analizaron los haplotipos en dos vías:
para la unión como marcador multialélico y
para la asociación usando todos los haplotipos
identificados para llevar a cabo un ensayo de desequilibrio de la
transmisión (TDT).
El TDT es un potente ensayo de asociación ya que
es insensible a los problemas de estratificación de la población en
la muestra ensayada. De manera breve, se ensaya la segregación de
alelos de los padres heterocigóticos en su descendencia afectada.
Se compara la porción de alelos transmitida a la descendencia
afectada en comparación con los alelos no transmitidos para la
relación esperada bajo distribución aleatoria. Un exceso
significativo de transmisión alélica sobre el valor esperado es
evidencia de una asociación de los alelos respectivos con el
fenotipo (aquí la obesidad) en cuestión.
De manera breve, se genotipificaron 400 tríos
familiares para tres SNP (588, 718 y 826). Se construyeron los
haplotipos usando el paquete GENEHUNTER para TDT (versión 2.1_r2).
Los resultados de este análisis muestran que algunos alelos o
haplotipos, caracterizados todos por la presencia de una mutación en
la posición 718 en la región de codificación (codón 240 que da como
resultado un cambio de aminoácido de Arg a Cys) está fuertemente
asociada con la obesidad. En la población ensayada, los haplotipos
que tienen SNP718 están fuertemente correlacionados con la obesidad
(132 transmitidos frente a 90 no transmitidos, Chi2 = 7,6, p =
0,004, tal como se determino mediante TDT), mientras que los
haplotipos desprovistos de TDT no se transmiten preferentemente a
sujetos obesos (Chi2 = 2,48,
p = 0,12). Por tanto, los haplotipos que no portan SNP718 muestran una tendencia a estar infrarrepresentados en sujetos obesos (95 transmitidos frente a 118 no transmitidos) fortaleciendo la evidencia estadística de que esta mutación está implicada en el desarrollo de la obesidad en estos sujetos. En la tabla 3 se proporcionan ejemplos de haplotipos con transmisión preferente de SNP718 a individuos obesos.
p = 0,12). Por tanto, los haplotipos que no portan SNP718 muestran una tendencia a estar infrarrepresentados en sujetos obesos (95 transmitidos frente a 118 no transmitidos) fortaleciendo la evidencia estadística de que esta mutación está implicada en el desarrollo de la obesidad en estos sujetos. En la tabla 3 se proporcionan ejemplos de haplotipos con transmisión preferente de SNP718 a individuos obesos.
Los SNP en el codón 239 que conducen a cambios
del aminoácido tal como se describe en la tabla 2 son más raros que
SNP18, pero muestran también una tendencia estadística a
transmitirse preferente a sujetos obesos
Leyenda: Los haplotipos se relacionan en la
dirección 5'-3'. 1 y 2 denotan las posibilidades de
dos nucleótidos para cada SNP que se relaciona en la tabla 2. Las
posiciones 1-3 de los SNP relacionados corresponden
a los SNP 588, 718 y 826 respectivamente según se relacionan en la
tabla 2. No se incluyeron otros SNP debido a que estuvieron en
completo desequilibrio de unión con al menos uno de los siete SNP en
el haplotipo. Los SNP representan mutaciones raras en las que no se
ensaya individualmente ya que su baja frecuencia no permite
estudios significativos de asociación, en la tabla 3 se muestra una
lista de estas mutaciones con sus frecuencias respectivas en el
grupo de estudio.
Se llevó a cabo la PCR específica de locus para
cada individuo para amplificar específicamente únicamente el locus
PPYR1a o el PPYR1bis. Se amplificó el locus PPYR1a usando el cebador
de sentido inverso FN1A
(5'-CAGGGCTCTAGCACATGAAT-3' de la
SEC DE ID Nº 9) en combinación con el cebador 7 directo (SEC DE ID
Nº 8) y se amplificó el locus PPYR1bis usando el cebador de sentido
inverso FN1G
(5'-CAGGGCTCTAGCACATGAAC-3' de la
SEC DE ID Nº 10) en combinación con el mismo cebador 7 directo. Se
llevaron a cabo las reacciones de amplificación en placas de 96
pocillos en un volumen de reacción de 25 \mul en un DYAD (MJ
Research) usando el Expand Long Template PCR System (Roche
Molecular Biochemicals), 7,5 pmol de cada cebador directo y de
sentido inverso, 175 \muM de dNTP, 1,25 unidades de mezcla de
enzima Expand (Roche Molecular Biochemicals) y 25 ng de ADN
genómico. Tras 3 min a 94ºC se llevó a cabo la amplificación
durante 35 ciclos que comprendieron 30 s a 94ºC, 30 s a 58ºC, 4 min
a 68ºC, seguido por la incubación a 72ºC durante 10 min.
Las reacciones de la PCR específica de locus se
diluyeron 1:100 en agua en una placa de 96 pocillos. Se usó una
alícuota de 2 \mul de las reacciones diluidas de la PCR específica
de locus en las reacciones de la PCR anidad con cebadores F5 (SEC
DE ID Nº 3) y R5 (SEC DE ID Nº 4). Se llevaron a cabo las reacciones
de la PCR en placas de 96 pocillos en un volumen de 20 \mul en un
Perkin Elmer 9600 que contenía un tampón II de PCR 1 x GeneAMP
(Applied BIOsystem), 5 pmol de cada cebador directo y de sentido
inverso, 200 \muM de dNTP, 2 mM de MgCl_{2}, 1,25 unidades de
AmpliTaq Gold polimerasa (Applied Biosystems) y 2 \mul diluidos
1:100 de producto de PCR específica de locus. Tras calentar a 94ºC
durante 5 min, se llevó a cabo la amplificación durante 30 ciclos.
Cada ciclo comprende: 30 s a 94ºC, 30 s a 60ºC, y 40 s a 72ºC,
seguido por una incubación final durante 10 min a 72ºC.
Amplificación de la secuencia que codifica el
receptor NPY4(a/bis) a partir de 3 ADN genómicos diferentes
mediante la PCR (siendo cada individuo homocigótico para cualquier
posición 718 u 826 de la secuencia que codifica el receptor NPY4a
respectivamente). La meta fue obtener 3 constructos diferentes:
Uno con la secuencia de tipo natural en las
posiciones 718 y 826 (718-C y
826-G)
Uno con la variación en la posición 718
(718-T, Arg-Cys)
Uno con la variación en la posición 826
(826-A, Val-Met)
El cebador directo contiene (desde 5' a 3'):
- -
- una secuencia de cola no específica (6 bases)
- -
- la secuencia del emplazamiento de restricción Xho I (CTGGAG)
- -
- y 12 bases complementarias a la secuencia de codificación inicial que incluyen el codón de inicio ATG (tccacATGaac)
El cebador de sentido inverso contiene (desde 5'
a 3')
- -
- una secuencia de cola no específica (6 bases)
- -
- la secuencia del emplazamiento de restricción Pme I (GTTTAAAC)
- -
- y 20 bases corriente abajo del codón TAA, comenzando con 7 bases después del codón de detención
Se llevó a cabo la PCR usando Expand Taq
Polymerase de Roche Diagnostics.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirieron los productos obtenidos de la PCR
(alrededor de 1200 pb) con Xho I y Pmel simultáneamente durante la
noche a 37ºC y se purificaron usando el kit de purificación de la
PCR Quiaquick.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirió este vector con Xho I y Pmel
simultáneamente durante la noche a 37ºC. El vector digerido se cargó
sobre un gel de agarosa, y la banda correspondiente al vector
digerido (5400 pb) se eliminó del gel. A continuación se purificó el
vector usando el kit Qiaquick de extracción en gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos digeridos de la PCR y el vector
digerido se ligaron usando la T4 ADN Ligasa (de Promega durante la
noche a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformó una cepa de E. coli
competente (JM109) con las mezclas de ligadura usando un
procedimiento de choque térmico (30 min en hielo, 3º s de calor a
42ºC y 1 min en hielo). Se llevó a cabo la selección de las
bacterias transformadas en placas LB que contenían ampicilina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionaron los clones mediante la PCR de
colonia usando los cebadores T7 Directo y BGH de Sentido Inverso. Se
conservaron únicamente los clones que contenían productos de la PCR
de la longitud esperada (1,2 kb).
\vskip1.000000\baselineskip
Se secuenciaron los clones conservados usando
los mismos cebadores. Para cada constructo, se conservó un clon que
contenía la secuencia esperada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionó un clon positivo de cada
constructo y se llevó a cabo una Midiprep clásica (kit de Qiagen).
Se estableció la concentración de ADN mediante análisis de
espectrofotometría por UV, y se precipitaron 150 \mug de cada
constructo en 150 \mul de etanol (100%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogió el precipitado (se guardó el
sobrenadante) de las tres muestras (alelos de tipo natural más dos
mutantes) y se disolvió en 150 ul de agua (concentración esperada 1
ug/ul).
Se transfectó una placa de células COS por cada
constructo con 12 \mul (supuestamente 12 ug) de plásmido para
obtener una línea celular transitoria de cada constructo. Se inició
la rotura del plásmido (12 ul) con Sspl. Se cosecharon las células
transfectadas y se congelaron a -80.
Se llevó a cabo el ensayo de unión con
diferentes diluciones de membrana para confirmar la unión y para
determinar qué dilución sería necesaria. Radioligando: hPP
yodado.
Se determinaron las cantidades de membrana del
receptor para los experimentos de competición.
Transfecciones transitorias. Dos placas para
cada plásmido basándose en la nueva determinación de la
concentración. Volúmenes mayores de soluciones de plásmidos.
Cantidades transfectadas:
Constructo 1: 1,4 ug
Constructo 2: 1,4 ug
Constructo 3: 1,8 ug
Plásmido pUC control: 0,1 ug/\mul tal como se
esperaba, por tanto las medidas se juzgaron fiables.
Se verificó la concentración sobre gel de
agarosa.
Se transformaron los plásmidos en bacterias
competentes, cepa DH5-alfa, para ser capaces de
preparar el ADN del plásmido para las transfecciones
adicionales.
Se llevó a cabo el maxipreps del plásmido.
Volumen final 400 ul.
Constructo 1: 1,4 ug/\mul
Constructo 2: 1,3 ug/\mul
Constructo 3: 1,3 ug/\mul
Experimentos de competición: Una curva de
competición para cada constructo (muestras por duplicado).
Radioligando hPP. Ligando competente hPYY.
Experimentos de competición en membranas de
transfección 2. Una curva para cada constructo (incluyendo
hY4-pTEJ) y cada uno de los ligandos hPP, hPYY y
hNPY.
Evaluación de los experimentos de competición
(véase la tabla 5 y la Fig 3).
Conclusión: No hay diferencia aparente
entre los dos mutantes y el tipo natural. El constructo 2
proporcionó resultados completamente variables para hPYY con un SEM
muy elevado. El experimento se ha repetido 6 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo las transfecciones en las
células CHO para la expresión estable. Se transfectaron
aproximadamente 500 ng de cada plásmido linealizado.
La selección de las células CHO para la
expresión estable se inició con G418.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados demostraron que el receptor de
tipo natural (tras estimulación con forkolina) respondió a hPP con
una reducción del 30% en la producción de AMPc. Los constructos 2 y
3 no mostraron respuesta a más estímulos de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1673
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (86).. (1213)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 21
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (6)
1. Un procedimiento para detectar la presencia
de, o la predisposición a, la obesidad en un sujeto, comprendiendo
el procedimiento (i) proporcionar una muestra del sujeto y (ii)
detectar la presencia de una alteración en el locus del gen PPYR1 en
dicha muestra, siendo dicha alteración SNP 718 (nucleótido 803 C/T
en la SEC DE ID Nº 1).
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que se detecta dicha alteración mediante la
genotipificación de un haplotipo, comprendiendo dicho haplotipo SNP
718 (nucleótido 803 C/T en la SEC DE ID Nº 1), SNP 826 (nucleótido
911 G/A en la SEC DE ID Nº 1) y un SNP seleccionado entre el grupo
constituido por SNP 195 (nucleótido 280 G/A en la SEC DE ID Nº 1),
SNP 588 (nucleótido 673 G/A en la SEC DE ID Nº 1), SNP 897
(nucleótido 982 C/T en la SEC DE ID Nº 1), SNP 948 (nucleótido 1033
C/T en la SEC DE ID Nº 1) y SNP 1047 (nucleótido 1132 C/T en la SEC
DE ID Nº 1).
3. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la
presencia de una alteración en el locus del gen PPYR1 se detecta
mediante secuenciación, hibridación selectiva y/o amplificación
selectiva.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que dicho procedimiento comprende amplificar
específicamente el gen PPYR1, preferiblemente con el cebador de
amplificación FN1A (SEC DE ID Nº 9).
5. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende detectar la presencia de un polipéptido PPYR1 alterado,
que comprende un polimorfismo en el aminoácido 240: Arg/Cys.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, que
comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo específico
para dicho polipéptido PPYR1 alterado y determinar la formación de
un complejo inmune.
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