ES2293494T3 - Identificacion del gen y mutacion para degeneracion progresiva de bastones y conos en un perro y metodo para ensayar el mismo. - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar si un perro es un vehículo de, o está predispuesto a, degeneración progresiva de bastones y conos, que comprende: ensayar en una muestra biológica que comprende ácidos nucleicos obtenida del perro una transversión de G a A en el gen F04 en una posición correspondiente a la posición de nucleótido 1298 de SEQ ID NO: 1, en la que la transversión de G a A en un alelo es indicativa de un vehículo de degeneración progresiva de bastones y conos, la transversión de G a A en ambos alelos es indicativa de un perro afectado con, o predispuesto a, degeneración progresiva de bastones y conos, y la ausencia de la transversión de G a A es indicativa de un perro que no es un vehículo de, ni está predispuesto a, degeneración progresiva de bastones y conos.
Description
Identificación del gen y mutación para
degeneración progresiva de bastones y conos en un perro y método
para ensayar el mismo.
La presente invención se refiere en general a
una clase de enfermedades genéticas, observada en caninos,
denominada degeneración progresiva de bastones y conos
("prcd"). Más particularmente la invención se refiere a un gen
y una mutación de nucleótidos simple en el gen asociado con
degeneración progresiva de bastones y conos en
perros.
perros.
La atrofia retinal progresiva (PRA) es una clase
heterogénea de trastornos retinales que comparte un fenotipo de
enfermedad clínica ampliamente similar, y afecta al perro (Canis
familiaris) (Aguirre, 1976). Los aspectos clínicos incluyen:
ceguera nocturna inicial seguida por reducción de la visión fotópica
que conduce a ceguera completa; reducción de los vasos retinales y
adelgazamiento retinal.; anormalidades en un electrorretinograma
("ERG") y desarrollo de cataratas. Las enfermedades de este
grupo son heredadas típicamente por medio de un defecto de un gen
recesivo autosómico aunque también se reconocen formas de PRA
dominantes y enlazadas a X (Kijas et al., 2002; Zhang et
al., 2002). La PRA puede clasificarse en enfermedades de
desarrollo y degenerativas. La clase de desarrollo comprende varias
enfermedades distintas genéticamente expresadas citológicamente en
el período post-natal inmediato cuando las células
visuales de la retina canina comienzan a diferenciarse (Acland
et al., 1989). Como contraste, la clase degenerativa
representa defectos en los que las células fotorreceptoras
degeneran después de haberse diferenciado normalmente; esta clase
incluye la enfermedad específica denominada degeneración progresiva
de bastones y conos (prcd). Esta forma específica de PRA es una
degeneración retinal de comienzo tardío, heredada recesivamente
autosómica, que afecta a varias razas de perros (Aguirre y Acland,
1988).
Las mutaciones en el lugar del gen de prcd dan
cuanta de la totalidad de las degeneraciones retinales hereditarias
de comienzo tardío recesivas autosómicas reconocidas hasta la fecha
en perros. Por experimentos de cruce de razas, se ha determinado
que el lugar del gen de prcd es responsable de atrofia retinal
progresiva en caniches (toys y miniatura), cocker spaniels
(americano e inglés), Labrador retrievers y perros de agua
portugueses (véase, por ejemplo, Aguirre y Acland, 1988, Aguire y
Acland, 1991; Pearce-Kelling et al., 2002).
Los experimentos de cruce de razas sugieren que la misma mutación
en el gen F04 (que es el gen responsable de prcd) también está
presente en varias otras razas en perros afectados con prcd; o
vehículos del trastorno. Sin embargo, en base a parámetros clínicos
y genéticos consecuentes con la enfermedad causada por mutaciones en
el lugar del gen de prcd, otras razas de perros de las que se
sospecha que tienen prcd como forma de atrofia retinal progresiva
observada incluyen akita, basenji, border collie, mastín inglés,
springer spaniel inglés, bichón habanero, pequeño perro león,
samoyedo, dachshund estándar de pelo duro, terriers tibetanos,
bernés de la montaña y schnauzer miniatura. Dependiendo de la raza
del perro, diferentes mutaciones responsables de variantes alélicas
del lugar del gen de prcd pueden regular la velocidad de progresión,
pero no el fenotipo, de la degeneración del fotorreceptor.
La diagnosis clínica de la enfermedad prcd es
complicada por la necesidad de métodos de ensayo sofisticados tales
como ERG, y por el comienzo tardío de la enfermedad. La edad a la
que puede diagnosticarse la enfermedad por los métodos actuales
puede ser pasada la vida reproductiva del perro. Por ejemplo, en
cocker spaniels ingleses, la atrofia retinal progresiva puede
diagnosticarse por ERG a los tres años de edad, y por oftalmoscopìa
a los 5-8 años de edad. Esta edad de diagnosis
tardía produce la diseminación del rasgo indeseable dentro de la
población, y un aumento de la frecuencia de la enfermedad.
El predominio estimado de la degeneración
progresiva de bastones y conos difiere entre las razas afectadas.
Se cree que aproximadamente el 2% de los Labrador retrievers de más
de 2 a 3 años de edad son afectados con degeneración progresiva de
bastones y conos; si es así, la proporción de Labrador retrievers de
los que se espera que sean heterocigóticos en el lugar de prcd
podría ser tan alta como el 24%. En caniches y cocker spaniels, la
proporción de la enfermedad es más alta que la observada en Labrador
retrievers y, por ello, sería de esperar que la proporción del
vehículo fuera más alta. De los resultados de un estudio de perros
de agua portugueses, la frecuencia del vehículo calculada es
aproximadamente el 40%.
Las medidas tradicionales para controlar
enfermedades hereditarias en una población incluían realizar
apareamientos de "ensayo" para identificar perros vehículo y
eliminar los vehículos identificados de programas de cría,
reduciendo por ello la frecuencia de una enfermedad genética en una
raza. En un apareamiento de ensayo, el perro evaluado como vehículo
potencial de la enfermedad genética se aparea con un perro del que
se sabe que está afectado con la enfermedad. Se observa después en
la progenie la ausencia o presencia de la enfermedad, y una camada
igual o mayor que 6, todos los cuales son descendientes no
afectados, "salva" típicamente al perro de ser un vehículo.
Aunque se han usado eficazmente apareamientos de ensayo para razas
que tienen grandes tamaños de camadas, y para enfermedades que
comienzan temprano, tal procedimiento no es práctico para reducir
la frecuencia de prcd. Además de las desventajas de los
apareamientos de ensayo tales como grandes gastos de tiempo y
esfuerzo hechos para salvar a un perro y que los perros afectados
puedan nacer si el perro a evaluar es un vehículo, los
apareamientos de ensayo no son particularmente adecuados para la
detección de vehículos de prcd por el comienzo tardío de los
síntomas clínicos asociados con la enfermedad, y porque algunas de
las razas afectadas tienen camadas pequeñas (demasiado pequeñas para
establecer probabilidad estadística).
Aunque el gen que lleva la mutación o mutaciones
que causan prcd ha sido desconocido previamente, estudios de enlace
genético en familias de prcd han mostrado que el gen que causa la
enfermedad en perros reside en el extremo centrómero del cromosoma
canino 9, un área que es homóloga con el extremo telómero del brazo
largo del cromosoma humano 17 (Acland et al., 1999; Sidjanin
et al., 2003).
A pesar de los esfuerzos extensos en la técnica
para encontrar al gen responsable de prcd, hasta ahora el gen ha
permanecido difícil de encontrar. La identificación, el aislamiento,
la clonación y la determinación de secuencia del gen de prcd
permitirían el diseño y fabricación de productos útiles para la
diagnosis y examen de prcd. Por tanto, ha habido una necesidad
continua en la industria de la cría canina de un ensayo genético
que permita la identificación directa de perros que tengan la forma
de prcd de la atrofia retinal progresiva (por ejemplo, antes del
comienzo detectable de síntomas clínicos), así como que permita la
determinación del genotipo de perros con riesgo de prcd para
establecer si son afectados, vehículos o normales genéticamente.
Casse C. et al., ARVO Annual Meeting
Abstract Search and Progran planner Vol. 2003, Abstract No. 2318,
XP002342659, describen un gen implicado potencialmente en
degeneración progresiva de bastones y conos (PRCD).
El documento WO 99/02731 describe el cromosoma 9
y marcadores y ensayos genéticos de la enfermedad degeneración
progresiva de bastones y conos.
La presente invención proporciona un método para
identificar si un perro es un vehículo de, o está predispuesto a,
degeneración progresiva de bastones y conos, que comprende: ensayar
en una muestra biológica que comprende ácidos nucleicos obtenida
del perro una transversión de G a A en el gen F04 en una posición
correspondiente a la posición de nucleótido 1298 de SEQ ID NO: 1,
en la que la transversión de G a A en un alelo es indicativa de un
vehículo de degeneración progresiva de bastones y conos, la
transversión de G a A en ambos alelos es indicativa de un perro
afectado con, o predispuesto a, degeneración progresiva de bastones
y conos, y la ausencia de la transversión de G a A es indicativa de
un perro que no es un vehículo de, ni está predispuesto a,
degeneración progresiva de bastones y conos.
La presente invención proporciona así una
molécula de ácido nucleico aislado que codifica un nuevo gen canino
asociado con enfermedad, al que se hace referencia aquí como gen
F04. La invención proporciona además el gen F04 que tiene una
mutación de G a A en posición 1298 de SEQ ID NO: 1. Esta
transversión está asociada con, y es indicativa de, prcd.
La presente invención se refiere también a un
método para identificar perros que son genéticamente normales,
vehículos de, o afectados con, la enfermedad prcd. Perros
genéticamente normales son aquellos en los que ambos alelos del gen
F04 tienen G como nucleótido en una posición correspondiente a la
posición de nucleótido 1298 de SEQ ID NO: 1. Perros afectados o
perros predispuestos son aquellos en los que ambos alelos del gen
F04 tienen A como nucleótido en una posición correspondiente a la
posición de nucleótido 1298 de SEQ ID NO: 1. Perros vehículo son
aquellos en los que un alelo del gen F04 tiene G y el otro alelo
tiene A como nucleótido en una posición correspondiente a la
posición de nucleótido 1298 de SEQ ID NO: 1. Un cambio de G a A en
el gen F04 en una posición correspondiente a la posición de
nucleótido 1298 de SEQ ID NO: 1 se denomina aquí "mutación de
prcd". La posición de nucleótido 1298 en SEQ ID NO: 1 corresponde
también a la posición de nucleótido 115 en la secuencia de cADN
mostrada en SEQ ID NO: 3.
El método comprende las etapas de obtener una
muestra biológica de un perro y ensayar la muestra biológica para
identificar si está o no presente G en una posición correspondiente
a la posición de nucleótido 1298 del gen F04. En una realización,
el método comprende detectar una mutación de G a A en una posición
correspondiente a la posición de nucleótido 1298 de SEQ ID NO: 1 en
uno o ambos alelos, que es indicativa de un perro que es vehículo
de, o un perro que está afectado con (o predispuesto a), prcd,
respectivamente.
La presente invención proporciona también un
método para seleccionar perros para cría. Este método comprende
obtener una muestra biológica de un perro, ensayar en la muestra
biológica el gen F04 que tiene una mutación de prcd en uno o ambos
alelos, y eliminar perros con la mutación de prcd de los animales
reproductores, o criar los perros con la mutación de prcd con perros
genéticamente normales.
La Figura 1 muestra la secuencia genómica del
gen F04 canino.
La Figura 2 muestra la secuencia del cADN del
gen F04 canino.
La Figura 3 es una representación de la
digestión con endonucleasa de restricción de productos multiplicados
de perros normales genéticamente, vehículo o perros afectados con
prcd. La Figura 3A muestra la digestión con la endonucleasa de
restricción RsaI y la Figura 3B muestra la digestión con la
endonucleasa de restricción ApaLI.
La Figura 4 es una ilustración de la disposición
experimental usada para identificar si un perro es un vehículo, está
afectado con, o es normal con respecto a la mutación de prcd, usando
análisis Pyrosequencing®.
Esta invención proporciona una molécula de ácido
nucleico que codifica un nuevo gen F04 localizado en el cromosoma 9
en perros. La secuencia del gen F04 de tipo natural se presenta en
la Figura 1 y los detalles pertenecientes a la secuencia son como
sigue.
La secuencia genómica del gen F04 tiene 18592 pb
de longitud. La secuencia listada en SEQ ID NO: 1 incluye todos los
polimorfismos identificados hasta ahora. Se mujestran en
bastardillas los intercambios de nucleótidos como sigue: W = A/T; M
= A/C; R = A/G; Y = C/T; S = C/G; K = G/T. Se muestran en
bastardillas y se subrayan inserción/supresiones. Las secuencias
para el alelo afectado y alternativo para todos los polimorfismos
mostrados en la secuencia se presentan en una tabla de
polimorfismos separada (Ejemplo 2). Se muestra también en
bastardillas y se encajona un microsatelite en posición
13.146-13.278 pb.
En el conjunto de la secuencia del genoma canino
de dominio público (canFam1) fechada en Julio de 2004
(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?org=Dog&db=canFam1&hgsid=42443361),
la secuencia genómica de F04 está localizada incorrectamente en
chr18:26.568.308-26.586.788. Los presentes
inventores creen que esto es incorrecto, como han establecido a
través de su BAC contig, y por FISH y representación de mapa de
enlaces meióticos que, como se predice por comparación con las
regiones homólogas de los genomas humano y de ratón, esta región
genómica canina está localizada apropiadamente en CFA9. Esta
discrepancia no afecta a la precisión o la utilidad de los ensayos
descritos aquí.
Por toda esta secuencia, los exones propuestos y
las regiones UTR se muestran en letras de caja alta y los exones
definidos están en negrita. Las regiones intrónicas están en letras
de caja baja.
- Exón 1:
- pb 1-1.367
\vskip1.000000\baselineskip
Incluye una caja TATA en posición
727-731, tres lugares de unión CRX en posiciones
1.122-1.128; 1.159-1.165;
1.177.1.183 y la señal de ATG que indica el comienzo del ORF en
posición 1.294-1.296 todos subrayados y
encajados.
La mutación de prcd en posición 1.298 se
representa en bastardillas, negritas y encajada. La mutación es un
cambio de G a A y se muestra como "R".
- Exón 2:
- pb 1.650-1.718
- Exón 3:
- pb 3.746-3.826
\vskip1.000000\baselineskip
Incluye el codón de detención en posición
3.765-3.767 representado subrayado y encajado.
- Exón 4:
- pb 4.161-4.256
- 3'UTR:
- pb 4.257-18.592
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro de esta región hay varias señales de
adenilación potenciales que se señalan subrayadas y encajadas.
También se ha mostrado que la región titulada 3'UTR contiene
regiones de empalme alternativo (indicadas en negritas), que definen
además dentro de esta región:
- Exón 5a:
- pb 4.806-5.399
- Exón 5b:
- pb 4.839-5.399
- Exón 5c:
- pb 5.093-5.399
- Exón 6:
- pb 6.558-6.665
- Exón 7:
- pb 6.927-7.164
- Exón 8:
- pb 7.547-7.720
- Exón 9:
- pb 12.275-18.592
La secuencia de aminoácidos deducida de una
proteína putativa codificada por el gen F04, en base a la secuencia
de
SEQ ID NO:1, y suponiendo un lugar de iniciación en posición 1294 se muestra a continuación como SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO:1, y suponiendo un lugar de iniciación en posición 1294 se muestra a continuación como SEQ ID NO: 2.
En este caso, la mutación de prcd produciría que
se sustituyera cisteína (el 2º aminoácido) por tirosina.
Se han identificado varias variantes de empalme
del gen F04, todas las cuales incluyen el mismo ORF. La variante de
empalme de longitud completa más corta tiene 695 pb de longitud; el
cADN (SEQ ID NO: 3) para esta variante del gen F04 se muestra en la
Figura 2. Los expertos en la técnica reconocerán que una
identificación futura potencial de exones adicionales, que no
alteren el ORF de F04 como se describe aquí (tal como un exón no
codificante 5' a exón 1, o 3' a exón 3), no afectará a la
asociación demostrada de la mutación de prcd con PRA o la detección
de la mutación de prcd como se describe aquí.
La secuencia de cADN empotra el ORF de 165 pb,
situado en la posición 111-275 (ambos codones de
iniciación y detención están resaltados en negrita). La mutación
está situada dentro del ORF en posición 115 mostrada en
bastardilla, negrita y encajada (alelo normal = G; alelo mutante =
A). Otros polimorfismos (por ejemplo, Y = C/T, nt 312 SEQ ID
NO: 3, polimorfismo 55, Tabla 1; y R = G/A, nt 633 SEQ ID NO:
3), polimorfismo 57, Tabla 1) en la 3'UTR no están asociados con la
enfermedad porque ambos alelos se han identificado en cromosomas
normales. Todos los cADNs que incluyen el ORF de F04 incorporan el
exón 1 (pb 1-184), el exón 2 (pb
185-253), el exón 3 (pb 254-334) y
el exón 4 (pb 335-695), sin embargo, los cADNs
parciales obtenidos usando diferentes conjuntos de cebadores
establecen que diferentes variantes de empalme en la 3'UTR pueden
incluir al menos los exones 5 y 8 como se ha definido en la
secuencia genómica. Otros aspectos son los mismos que en el ADN
genómico.
La detección de la mutación de prcd en el gen
F04 puede realizarse en cualquier muestra biológica adecuada
obtenida de un perro. En una realización preferida, la muestra
biológica es cualquier tejido que contenga ADN genomico. Las
fuentes adecuadas de muestra biológica incluyen sangre, pelo,
raspaduras mucósicas, semen, biopsia de tejidos o saliva. En una
realización, la muestra biológica es sangre.
Los perros que llevan la mutación de prcd en el
gen F04 pueden detectarse ensayando el ADN o el ARN, usando una
variedad de métodos que son muy conocidos en la técnica. El ADN
genómico usado para la diagnosis puede obtenerse de una muestra
biológica como se ha descrito antes. El ADN puede usarse
directamente o puede multiplicarse enzimáticamente in vitro
mediante el uso de PCR (Saiki et al., Science,
239:487-491 (1988)) u otros métodos de
multiplicación in vitro tales como la reacción en cadena de
ligasa (LCR) (Wu y Wallace, Genomics, 4:560-569
(1989)), multiplicación por desplazamiento de cadena (SDA) (Walker
et al., PNAS USA, 89:392-396 (1992)),
replicación de secuencia autosostenida (3SR) (Fahy et al.,
PCR Methods Appl., 1:25-33 (1992)), antes del
análisis de la mutación. La metodología para preparar ácidos
nucleicos en una forma que sea adecuada para detección de mutación
es muy conocida en la técnica.
La detección de mutaciones de secuencias de ADN,
tales como la mutación de prcd en el gen F04, puede conseguirse por
una variedad de métodos que incluyen, aunque sin limitarse a ellos,
detección de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción
basada en división por endonucleasa de restricción específica para
alelo (Kan y Dozy Lancet, 2(8096):910-912
(1978)), hibridación con sondas de oligonucleótidos específicas para
alelos (Wallace et al., Nucl Acids Res.,
6:3543-3557 (1978)) que incluyen oligonucleótidos
inmovilizados (Saiki et al., PNAS USA, 86:6230-6234
(1989)) o disposiciones de oligonucleótidos (Maskos y Southern, Nucl
Acids Res., 21:2269-2270 (1993)), PCR específica
para alelos (Newton et al., Nucl Acids Res.,
17:2503-25 16 (1989)), detección de
desadaptación-reparación (MRD) (Faham y Cox, Genome
Res., 5:474-482 (1995)), electroforesis en gel con
gradiente desnaturalizante (DGGE) (Fisher y Lerman et al.,
PNAS USA, 80:1579-1583 (1983)), detección de
polimorfismo de conformación de cadena sencilla (Orita et
al., Genomics, 5:874-879 (1983)), división por
ARNasa en pares de bases desadaptados (Myers et al.,
Science, 230:1242 (1985)), división química (Cotton et al.,
PNAS USA, 85:4397-4401 (1988)) o enzimática (Youil
et al., PNAS USA, 92:87-91 (1995)) de ADN
heterodúplex, métodos basados en extensión de cebador específica
para alelo (Syvanen et al., Genomics
8:684-692 (1990)), análisis de fragmentos genéticos
(GBA) (Nikiforov et al., Nucl Acids Res.,
22:4167-4175 (1994)), el ensayo de ligación de
oligonucleótidos (OLA) (Landegren et al., Science, 241:1077
(1988)), reacción en cadena de ligación específica para alelo (LCR)
(Barrany, PNAS USA, 88:189-193 (1991)),
gap-LCR (Abravaya et al., Nucl Acids Res.,
23:675-68 (1995)), y determinación de secuencia de
ADN radioactiva y/o fluorescente usando procedimientos estándares
muy conocidos en la técnica.
Además, se han descrito varias técnicas nuevas
que incluyen hibridación dinámica específica para alelo (DASH),
electroforesis en gel diagonal de disposición de microplacas
(MADGE), pirodeterminación de secuencia, el sistema TaqMan así como
diversas tecnologías de "recortes" de ADN tales como los
recortes de polimorfismo Affymetrix. Estos métodos requieren
multiplicación de la región genética objetivo, típicamente por PCR.
Todavía otros métodos recién desarrollados, que pueden no necesitar
PCR, se basan en la generación de pequeñas moléculas señal por
división invasiva seguida por espectrometría de masas o sondas de
candado inmovilizadas y multiplicación de círculo rodante. Varios
de los métodos conocidos en la técnica para detectar polimorfismos
de nucleótidos simples específicos se describen en la Patente de
los EE.UU. nº 6.720.141, y la descripción de estos métodos se
incorpora aquí como referencia.
Como se apreciará, el análisis de mutación puede
realizarse también en muestras de ARN por transcripción inversa en
cADN de ellas.
Se puede usar cualquiera o cualquier combinación
de tales técnicas según la invención para el diseño de un
dispositivo de diagnóstico y un método para el examen en muestras de
ADN o ARN de mutación del gen de prcd de G a A en una posición
correspondiente a la posición de nucleótido 1298 de SEQ ID NO: 1 del
gen F04. Así, según la invención, se proporciona un ensayo basado
en ácido nucleico para la mutación del gen de prcd, que comprende
proporcionar una muestra de un ADN o ARN de perro y valorar en el
ADN o ARN la presencia de la mutación de prcd. Pueden obtenerse
fácilmente muestras de ADN o ARN de perro (o secuencias genómicas,
transcritas, transcritas inversas y/o complementarias del gen de
prcd). Mediante la identificación y caracterización del gen F04
como se enseña y describe en la presente invención, un experto
ordinario en la técnica puede identificar fácilmente las secuencias
genómicas, transcritas, transcritas inversas y/o complementarias de
la secuencia del gen de prcd en una muestra y detectar fácilmente
diferencias en ellas.
Por consiguiente, en una realización, la
presente invención proporciona fragmentos de ácidos nucleicos para
detección de ácidos nucleicos en los que está presente la mutación.
En general, los métodos de detección se basan en técnicas de
hibridación de ADN, en las que la hibridación con secuencias de ADN
se realiza en condiciones rigurosas de tal modo que pueda
detectarse un cambio en un nucleótido. El rigor óptimo se obtiene
normalmente ajustando la temperatura de reacción y/o la
concentración de sal de modo que la sonda se hibride sólo con su
objetivo específico, aunque los expertos en la técnica reconocerán
que se dispone fácilmente de métodos alternativos para optimizar la
hibridación específica para el objetivo.
Así, pueden hibridarse sondas específicas para
alelos en condiciones que sean suficientemente rigurosas de manera
que haya una diferencia significativa en la intensidad de los dos
alelos. Preferiblemente, las condiciones de hibridación son lo
suficientemente rigurosas para producir una respuesta esencialmente
binaria (es decir, la sonda se hibrida con uno pero no con el otro
alelo).
Además, pueden diseñarse cebadores que se
hibriden con una secuencia objetivo de tal modo que, por
multiplicación, se generen productos que contengan el lugar de
mutación de prcd. Los cebadores deben ser lo suficientemente largos
para ser útiles en reacciones tales como el procedimiento de
reacción en cadena de polimerasa (PCR) o como sondas en un
procedimiento de reacción en cadena de ligasa (LCR). Generalmente,
se consideran adecuados para reacciones de multiplicación
fragmentos que tengan al menos doce bases de longitud. Los productos
de multiplicación pueden someterse a tratamiento con endonucleasas
de restricción e identificarse por electroforesis en gel con
gradiente desnaturalizante para distinguir entre los productos de
multiplicación de los dos alelos.
Pueden identificarse fragmentos adecuados útiles
para hibridación a partir de la secuencia del gen F04 presentada
aquí o pueden identificarse por hibridación con la secuencia de
ácidos nucleicos del gen F04 (SEQ ID NO: 1) o el cADN (SEQ ID NO: 3)
en condiciones rigurosas como se ha descrito antes.
Usando las herramientas y el método descritos
aquí, pueden identificarse perros que sean genéticamente normales
para la enfermedad (G en ambos alelos), vehículos de la enfermedad
prcd (transversión de G a A en un alelo) y perros que estén
afectados por (o predispuestos a) degeneración progresiva de
bastones y conos (transversión de G a A en ambos alelos). Tras la
identificación, tales perros afectados (o predispuestos) o vehículos
pueden eliminarse de los animales reproductores. Alternativamente,
pueden aparearse perros que estén afectados (o predispuestos) con
prcd, o vehículos de la enfermedad prcd, con perros normales
genéticamente (sin la transversión de G a A) para asegurar la
ausencia en la camada de perros afectados con prcd.
Esta invención puede usarse para cualquier raza
de perro, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, akita, cocker
spaniel americano, esquimal americano, boyero australiano, boyero
australiano de cola corta, basenji, bernés de la montaña, border
collie, retriever de la bahía de Chesapeake, crestado chino, cocker
spaniel inglés, mastín inglés, springer spaniel inglés, boyero de
la montaña de Entlebuch, finlándes de Laponia, braco alemán de pelo
corto, schnauzer gigante, bichón habanero, Labrador retrievers,
pequeño perro león, caniche miniatura, schnauzer miniatura,
cobrador de patos de Nueva Escocia, perros de agua portugueses,
samoyedo, terrier sedoso, spitz, caniche estándar, dachshund
estándar de pelo duro, terriers tibetanos y caniche toy. Puesto que
la mutación de prcd idéntica en el gen F04 ha demostrado estar
presente, y causar PRA, en tantas razas diferentes, esta mutación
parece haber surgido mucho antes de la diferenciación de la
población de perros en estas razas diferentes. Es de esperar así
que se probará que la misma mutación está presente en otras razas de
perros en los que su presencia no está reconocida actualmente.
Según una realización preferida de la presente
invención, los métodos de identificación descritos se realizan
in vitro. Así, según una realización preferida de la presente
invención, los métodos descritos se realizan en muestras aisladas, y
no se practican por tanto (directamente) en el cuerpo humano.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Según una realización preferida de la presente
invención, el ensayo de la muestra biológica se realiza por
pirodeterminación de secuencia. La pirodeterminación de secuencia
proporciona ventajosamente información de secuencia rápidamente,
típicamente en minutos. La pirodeterminación de secuencia puede, en
una realización, comprender una o más de las siguientes etapas:
incubación de plantilla de ácido nucleico (preferiblemente, ADN de
cadena sencilla, opcionalmente multiplicado por PCR) con enzimas de
pirodeterminación de secuencia tales como polimerasa de ADN,
sulfurilasa de ATP, luciferasa y apirasa, y sustratos de
pirodeterminación de secuencia tales como adenosina 5' fosfosulfato
(APS) y luciferina; adición secuencial e incorporación catalítica
de dNTPs en una cadena de ADN por emparejamiento de bases
complementarias, acompañado por liberación de pirofosfato (PPi),
preferiblemente en una cantidad equimolar con la cantidad de
nucleótido incorporado; detección de la cantidad de PPi liberado.
La detección de PPi puede, en una realización, realizarse
convirtiendo PPi en ATP (por ejemplo, por ATP sulfurilasa en
presencia de APS) y detectando después la cantidad de ATP generado.
La etapa de detección puede ser mediada por luz. Por ejemplo, en
una realización, el ATP puede impulsar la conversión de luciferina
en oxiluciferina, generando por ello luz visible en cantidades
proporcionales a la cantidad de ATP. La luz puede detectarse y
verse como un pico en un gráfico, en el que la altura del pico es
proporcional al número de nucleótidos incorporados. La reacción de
pirodeterminación de secuencia puede incluir una etapa de
regeneración, en la que se regenera la solución de reacción antes de
añadir el siguiente dNTP. A modo de ejemplo, esta etapa puede
realizarse por la enzima apirasa, que degrada ATP y dNTPs no
incorporados. A medida que se añaden dNTPs a la reacción de
pirodeterminación de secuencia, se forma la cadena de ADN
complementario y puede determinarse la secuencia de nucleótidos,
por ejemplo, a partir de picos de señal de luz. En una realización
de
la reacción de pirodeterminación de secuencia, se sustituye dATP por dATP\alphaS, que no es reconocido por luciferasa.
la reacción de pirodeterminación de secuencia, se sustituye dATP por dATP\alphaS, que no es reconocido por luciferasa.
La invención se entenderá adicionalmente
mediante los siguientes Ejemplos, que se pretende que sean
ilustrativos y no restrictivos en modo alguno.
Se ha producido una genoteca de EST canina
específica para retina a partir de beagles de 16 semanas de edad.
Un grupo de 5 clones de EST solapantes individuales formaban un
contig, cuyo mapa se representó en el área CFA9 especificada
previamente (Sidjanin et al., 2003) y se investigó por tanto
adicionalmente. Esta secuencia contenía el último exón 8 de F04
definido (véase después, contig de clones de EST, 1085 pb).
De la información de secuencia del anterior
contig de EST, y la de genes humanos hipotéticos situados dentro de
la región correspondiente de la secuencia del genoma humano
depositada en GenBank, se diseñaron dos cebadores para
RT-PCR:
| Directo: | 5'-caccttggccatgctctggc-3' (situado en el extremo del exón 1) - | SEQ ID NO: 4 |
| Inverso: | 5-aatgcatataaataaagcacttggc-3' (situado en el exón 8) - | SEQ ID NO: 5 |
Se realizó RT-PCR a partir de un
perro normal de 3,3 semanas produciendo un producto de 707 pb (clon
9) que se extiende sobre el extremo del exón 1, exón 2, exón 3, exón
4 y exón 8.
El análisis comparativo in silico de la
secuencia genómica canina del contig de BAC de los inventores
(véase siguiente Ejemplo 2), con secuencia genómica humana y de
ratón de dominio público, identificó una región altamente
conservada, contigua al extremo 5' del clon 9, que incluía lugares
de unión de CRX potenciales seguidos por un codón de iniciación de
la traducción ATG inmediatamente aguas arriba de la secuencia del
clon 9, y se predijo un ORF que comienza con esta ATG y termina con
un codón de detención en el exón 3. Esta secuencia de ORF no se
correspondía con la de ningún gen conocido en Genbank, ni sus
dominios reconocibles de contribución a la traducción putativos con,
o similitud de secuencia con, cualquier otra proteína conocida en
Genbank.
Puesto que el clon de F04 se identificó a partir
de la genoteca de los inventores específica para retina, estos
datos combinados indicaban que el ORF correspondiente a F04
representa un nuevo gen expresado en la retina no reconocido
previamente. La presencia de lugares de unión para el factor de
transcripción específico para fotorreceptor CRX, y la estructura
altamente conservada de la región 5' con el codón de iniciación
identificado, identificó al exón putativo 1 como el primer exón de
codificación de un gen expresado en la retina. En base a esta
información, se diseñó un nuevo conjunto de cebadores para incluir
el codón de iniciación potencial y extenderse sobre los exones
1-4:
| Directo: | 5'-ccagtggcagcaggaacc-3' (5' del exón 1) - | SEQ ID NO: 6 |
| Inverso: | 5'-ccaagccagggcatgagc-3' (3' del exón 4) - | SEQ ID NO: 7 |
Se realizó RT-PCR en un animal
normal de 10,4 semanas y en un individuo afectado con prcd de 8,6
semanas, produciendo en ambos animales un producto de 562 pb (véase
después, RT-PCR exones 1-4). La
única diferencia observada fue un cambio de G a A observado en el
individuo afectado que se identificó en consecuencia como la
mutación de prcd.
Para identificar los extremos 5' y 3' de este
gen, se creó una genoteca de retina por RACE 5' de un perro normal
de 10 semanas de edad y un perro afectado de 8 semanas de edad. La
multiplicación de los extremos 5' se hizo con diferentes cebadores
específicos situados en el exón 1 (CCAAGGTGCTGAGTAGGAAGAGGGTGGTG -
SEQ ID NO: 8) o el exón 3 (AGTCCCTGGGGCCGAGCTCCGCCTGAC - SEQ ID NO:
9). La multiplicación de los extremos 3' se hizo usando un cebador
específico situado en el exón 1 (CACCACCCTCTTCCTACTCAGCACCTTGG - SEQ
ID NO: 10) que es la secuencia de complemento exacta del cebador
específico que se usa para dirigir la RACE 5'. Se hizo PCR
semiinclusiva con un cebador situado en el exón 3
(AGGGACTGGGATCAGCTGGCAGAGGCAG - SEQ ID NO: 11) para verificar la
especificidad del producto.
La secuencia de consenso a partir de estos
experimentos es el clon que los inventores consideran como el cADN
para el gen F04 (véase SEQ ID NO: 3) que se muestra en la Figura 2.
Se han proporcionado antes detalles de la secuencia de cADN.
Para validar la secuencia de consenso predicha
por RACE 5' y 3', se usaron dos cebadores para multiplicar la
secuencia de consenso de cADN de retina afectado y no afectado.
| 5'-AGTGGCAGCAGGAACCTCAGG-3' | SEQ ID NO: 29 |
| 5'-GGATTATATTAGGGATGAATGAGAAG-3' | SEQ ID NO: 30 |
Puesto que los resultados de una RACE 5' y una
RACE 3' son resultados independientes, esta etapa es necesaria para
probar que este transcripto está presente en la retina afectada y no
afectada. La RT-PCR confirmó la presencia de tal
transcripto.
Por el método descrito antes, se obtuvieron las
siguientes secuencias.
Contig de clones de EST:
Los clones contenidos originalmente en la
genoteca de EST producían la siguiente secuencia de consenso de 5
clones: 1085 pb:
Clon 9:
Producido por RT-PCR usando
cebadores desde el exón 8 y el extremo del exón 1 (707 pb):
RT-PCR-Exones
1-4:
Esta secuencia se creó a partir de
RT-PCR para comparar los ORF de animales afectados y
no afectados (562 pb):
La mutación de F04 está en negrita y se presenta
como un G en perros normales y un A en perros afectados con
prcd.
Además del empalme alternativo observado en
alguna de las secuencias obtenidas por todo el procedimiento de
clonación del gen F04 (descrito antes), se identificaron diferentes
variantes de empalme usando RT-PCR con cebadores
situados en los exones 2 y 3, y con cebadores situados en exones
predichos aguas abajo (véase después).
Clon 1:
Se realizó RT-PCR usando un
cebador de los exones 3
(CAGTCGTGGGCAGCAGGTCGG - SEQ ID NO: 15) y uno
del exón 8
(AATGCATATAAATAAAGCACTTGGC - SEQ ID NO: 16) que
produce un producto de 316 pb:
Se usaron cebadores del exón 2
(GCAGCAGGTCGGAGAGAGAC - SEQ ID NO: 18) y el exón 5
(CTTCCCTCAGATGTGGAGTCAG - SEQ ID NO: 19) para multiplicar cADN
obtenido de retina normal y afectada. Se obtuvieron tres productos
diferentes como se muestra seguidamente.
Producto número 1:
Producto número 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Producto número 3:
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo RT-PCR en retina
afectada y no afectada usando los siguientes cebadores:
| 5'-TTAATCAGTCTGCACAAGGTCG-3' | SEQ ID NO: 31 |
| 5'-GGCTCATTGCAAGGATTATATTAGG-3' | SEQ ID NO:32 |
\newpage
Se observaron dos variantes de empalme:
Producto número 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Producto número 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados anteriores indican que hay varias
variantes de empalme retinales de F04. En base a estas variantes de
empalme y análisis genómico comparativo, se caracterizó la
organización genómica de F04. Sin embargo, todas las variantes de
empalme relevantes para prcd incluyen los exones 1-4
y el transcripto revelante para tal enfermedad más corto y
expresado más abundantemente es el cADN identificado como SEQ ID NO:
3.
Desde que representaron el mapa del lugar de
prcd para el cromosoma canino 9 (CFA9), los presentes
inventores representaron el mapa del intervalo de la enfermedad
prcd con mayor resolución, estrecharon la región genómica canina
identificada en la que está situado el gen de prcd y ensayaron todos
los genes candidatos dentro de esta región. Inicialmente, se creó
un mapa físico de la región usando BACs caninos (sidjanin, 2003) y
se identificaron marcadores polimórficos múltiples dentro y
flanqueando esta región. El examen de genotipos de perros afectados
con prcd de razas múltiples para estos marcadores polimórficos
estableció que, dentro de las razas, el haplotipo que se
cosegregaba con la mutación de prcd se extendía a través de una
amplia región, incluyendo el intervalo representado en mapa
físicamente (Sidjanin et al., 2003). Sin embargo, la
comparación de estos genotipos reveló que los haplotipos
específicos para la raza variaban entre razas dentro del área
publicada inicialmente (Sidjanin et al., 2003), pero eran
consecuentes para todas las razas para un conjunto de marcadores
situados físicamente dentro de un clon de BAC simple (BAC 10M13; Li
et al., 1999) localizado adyacente al área publicada
inicialmente. Este clon de BAC contenía varios genes. Se
identificaron polimorfismos de nucleótidos simples para cada uno de
estos genes, y se construyó un haplotipo simple que diferenciaba el
CFA9 que transmite prcd del de todos los perros normales ensayados
(Tabla 1) en todas las razas que se conocen ser afectadas con
prcd.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada uno de estos genes, se determinó la
secuencia de los exones y se examinaron, y se encontró un cambio de
secuencia asociado a enfermedad (es decir, una mutación) en sólo un
gen. Este gen, al que se hace referencia aquí como F04, está
situado dentro del intervalo descrito en la Patente de los EE.UU. nº
5.804.388. Se han proporcionado antes detalles de la secuencia de
cADN canino y ADN genómico para F04. La mutación, en el nucleótido
1298 de SEQ ID NO: 1, representa una transición de G a A, de
secuencia normal a afectada. Se hace referencia a este cambio de
secuencia como "mutación de prcd" en el presente gen F04 y se
muestra como polimorfismo nº 42 en la tabla anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe un ensayo de digestión con
enzima de restricción basada en PCR desarrollado para identificar el
cambio de secuencia en el gen F04. Se usaron los siguientes
cebadores:
| cebador 1: | ccagtggcagcaggaacc - | SEQ ID NO: 27 |
| cebador 2: | ccgacctgctgcccacgactg - | SEQ ID NO: 28 |
Se realiza PCR en condiciones estándares
(temperatura de reasociación 58 grados C, MgCl_{2} 1,5) en 25
microlitros, 35 ciclos. El producto de multiplicación tiene de
tamaño 512 pb (correspondiente a los pb 1182 a 1693 en SEQ ID NO:
1). La enzima de restricción RsaI digiere el producto de
multiplicación que lleva el alelo A pero no el alelo G. A la
inversa, ApaLI digiere el alelo G pero no el alelo A. Ambas
digestiones se realizaron a 37ºC durante 2 horas.
La digestión con restricción produce así los
resultados de diagnóstico mostrados en la Tabla 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó una gran población de perros
afectados con prcd. Se han ensayado más de 100 animales afectados
de 13 razas o variedades de razas diferentes. Éstos incluyen: 36
boyeros australianos, 2 crestados chinos, 5 cocker spaniels
ingleses, 5 finlandeses de Laponia, 48 Labrador retrievers, 45
caniches miniatura o toy, 1 cobrador de patos de Nueva Escocia, 3
perros de agua portugueses, 1 terrier sedoso, 25 esquimales
americanos y 14 boyeros de la montaña de Entlebuch.
Un ejemplo de la identificación del alelo G
(normal) y el alelo A (alelo afectado) tras la digestión con RsaI
se muestra en la Figura 3A y, tras la digestión con ApaLI, se
muestra en la Figura 3B. Para la digestión con RsaI (Figura 3A), un
perro normal (GG) muestra un producto de 512 pb, un perro afectado
(AA) muestra productos de 396 pb y 116 pb, mientras que un perro
vehículo (AG) muestra productos de 512 pb, 396 pb y 116 pb. Para la
digestión con ApaLI (Figura 3B), un perro normal (GG) muestra
productos de 397 pb y 115 pb, un perro afectado (AA) muestra un
producto de 512 pb y un perro vehículo (AG) muestra productos de 512
pb, 397 pb y 115 pb. Así, este método puede usarse para identificar
perros normales (es decir, en el que ambos alelos del gen F04
tienen G como nucleótido en una posición correspondiente a la
posición de nucleótido 1298 de SEQ ID NO: 1), perros vehículo (es
decir, en los que un alelo tiene G y el otro alelo tiene A como
nucleótido en una posición correspondiente a la posición de
nucleótido 1298 de SEQ ID NO: 1) y perros afectados o predispuestos
(es decir, perros en los que ambos alelos del gen F04 tienen A como
nucleótido en una posición correspondiente a la posición de
nucleótido 1298 de SEQ ID NO: 1).
Para confirmar la exclusión del alelo afectado
de la población general de perros, se ensayaron 1.000 animales de
67 razas de las que no se sabe que tengan la forma prcd de PRA, para
establecer la ausencia del alelo "A". Se ensayaron los perros
por análisis Pyrosequencing® (Biotage, Charlottesville, VA;
http://www.pyrosequencing.com/DynPage.aspx) como sigue. La
técnica se basa en la multiplicación de la secuencia objetivo con un
cebador directo no marcado y un cebador inverso marcado con biotina
(5'Bio), que se usan para aislar un producto de ADN de cadena
sencilla. Se usa un cebador de determinación de secuencia para
iniciar una extensión de cebador específica para nucleótido
subsiguiente y se registra la presencia o ausencia de un nucleótido
de una manera dependiente de la frecuencia de alelos en base a una
reacción de luciferasa.
| Cebador directo: | 5'TTGTGAGAGCCGGCAGG3' - | SEQ ID NO: 23 |
| Cebador inverso: | 5'Bio/ATGGCCAAGGTGCTGAGTAG3' - | SEQ ID NO: 24 |
| Cebador de determinación de secuencia: | 5'GGGGCAGCTGAGCCA3' - | SEQ ID NO: 25 |
Producto: 113 pb (la secuencia del cebador se
muestra en letras mayúsculas, el polimorfismo G/A está en negrita y
Bio indica la marca de biotina:
TTGTGAGAGCCGGCAGGggccattttggcctttctcctgcagactctgtccgggaggggatGGGGCAGCTGAGCCAtgtg/acacca
ccctcttcCTACTCAGCACCTTGGCCAT - Bio - SEQ ID NO:26.
ccctcttcCTACTCAGCACCTTGGCCAT - Bio - SEQ ID NO:26.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 4 ilustra la disposición de ensayo
para los procedimientos de este Ejemplo. En base a la secuencia de
ensayo, se inyecta una serie de nucleótidos uno en cada momento
durante la extensión del cebador (la secuencia se muestra en el
fondo de cada panel) y se registra la reacción de luz resultante
(indicada por la barra para cada nucleótido, directamente
proporcional a la cantidad de alelos presentes). Los nucleótidos uno
(C) y 7 (G) de la secuencia son testigos negativos y no deben
producir ninguna reacción de luz. Las posiciones 2, 3, 4, 8 y 9 son
testigos positivos y reaccionan igual en todas las muestras basadas
en la secuencia ensayada. La mutación en cuestión corresponde a los
nucleótidos 5 y 6. En animales normales, sólo está presente el alelo
G y produce una reacción de la misma fuerza que los testigos
positivos. En individuos afectados, lo mismo es cierto para el
alelo A, mientras que los vehículos tienen ambos alelos en una
relación 50/50 y, por tanto, producen la mitad de la intensidad en
cada posición. En todos los casos, los animales ensayados por
análisis Pyrosequencing® eran "GG", es decir, tenían G en
ambos alelos del gen F04 en una posición correspondiente a la
posición 1298 de SEQ ID NO: 1.
Se apreciará por los expertos en la técnica que
pueden hacerse modificaciones rutinarias a las diversas
realizaciones descritas aquí. Se pretende que tales modificaciones
estén dentro del alcance de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
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\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Aguirre, Gus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Identificación del gen y mutación
para degeneración progresiva de bastones y conos en un perro y un
método para ensayar el mismo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 18617.0103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/581.499
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
21-06-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18592
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> canis familiaris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> canis familiaris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 695
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> canis familiaris
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo para
RT-PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccttggcc atgctctggc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso para
RT-PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatgcatata aataaagcac ttggc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo para
RT-PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagtggcag caggaacc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso para
RT-PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagccagg gcatgagc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso situado en el exón
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaggtgct gagtaggaag agggtggtg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso situado en el exón
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtccctggg gccgagctcc gcctgac
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo situado en el exón
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccaccctc ttcctactca gcaccttgg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo situado en el exón
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggactggg atcagctggc agaggcag
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1084
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> contig de clones de EST
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 707
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> no seguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 598, 602
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia para el clon 9; producto
para RT-PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 562
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
RT-PCR-exones
1-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo para
RT-PCR del exón 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtcgtggg cagcaggtcg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso para
RT-PCR del exón 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatgcatata aataaagcac ttggc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 316
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto para
RT-PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo para
RT-PCR del exón 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagcaggtc ggagagagac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso para
RT-PCR del exón 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttccctcag atgtggagtc ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 796
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto nº 1 para
RT-PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 763
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto nº 2 para
RT-PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 509
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto nº 3 para
RT-PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> seeuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo para análisis
Pyrosequencing
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgtgagagc cggcagg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso marcado con biotina
para análisis Pyrosequencing
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggccaagg tgctgagtag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de oligo para análisis
Pyrosequencing
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggcagctg agcca
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto PCR para análisis
Pyrosequencing
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagtggcag caggaacc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgacctgct gcccacgact g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo para
RT-PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtggcagca ggaacctcag g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso para
RT-PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggattatatt agggatgaat gagaag
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo para
RT-PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaatcagtc tgcacaaggt cg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador inverso para
RT-PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de multiplicación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtcattgc aaggattata ttagg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1815
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto nº 1 de la variante de
empalme para RT-PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 733
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> producto nº 2 de la variante de
empalme para RT-PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
Claims (16)
1. Un método para identificar si un perro es un
vehículo de, o está predispuesto a, degeneración progresiva de
bastones y conos, que comprende:
ensayar en una muestra biológica que comprende
ácidos nucleicos obtenida del perro una transversión de G a A en el
gen F04 en una posición correspondiente a la posición de nucleótido
1298 de SEQ ID NO: 1, en la que la transversión de G a A en un alelo
es indicativa de un vehículo de degeneración progresiva de bastones
y conos, la transversión de G a A en ambos alelos es indicativa de
un perro afectado con, o predispuesto a, degeneración progresiva de
bastones y conos, y la ausencia de la transversión de G a A es
indicativa de un perro que no es un vehículo de, ni está
predispuesto a, degeneración progresiva de bastones y conos.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
el ensayo se realiza multiplicando los ácidos nucleicos de la
muestra biológica, digiriendo los ácidos nucleicos multiplicados con
una o más endonucleasas de restricción e identificando la
transversión de G a A en los ácidos nucleicos multiplicados y
digeridos.
3. El método de la reivindicación 2, en el que
la multiplicación se realiza por reacción en cadena de
polimerasa.
4. El método de la reivindicación 2, en el que
la endonucleasa de restricción es RsaI.
5. El método de la reivindicación 2, en el que
la endonucleasa de restricción es ApaLI.
6. El método de la reivindicación 3, en el que
la multiplicación se realiza usando cebadores de SEQ ID NO: 24 y SEQ
ID NO: 25.
7. El método de cualquier reivindicación
precedente, en el que el ensayo se realizó por pirodeterminación de
secuencia.
8. El método de la reivindicación 7, en el que
la pirodeterminación de secuencia se realizó usando cebadores de SEQ
ID NOs: 20, 21 y 22.
9. El método de cualquier reivindicación
precedente, en el que el ácido nucleico es ADN.
10. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, en el que el ácido nucleico es
mARN.
11. El método de cualquier reivindicación
precedente, en el que la muestra biológica es cualquier tejido que
contenga ADN o mARN genómicos.
12. El método de la reivindicación 11, en el que
la muestra biológica se selecciona del grupo constituido por sangre,
pelo, raspaduras mucósicas, semen, biopsia de tejidos y saliva.
13. El método de la reivindicación 12, en el que
la muestra biológica es sangre.
14. El método de cualquier reivindicación
precedente, en el que el perro se selecciona del grupo constituido
por akita, cocker spaniel americano, esquimal americano, boyero
australiano, boyero australiano de cola corta, basenji, bernés de la
montaña, border collie, retriever de la bahía de Chesapeake,
crestado chino, cocker spaniel inglés, mastín inglés, springer
spaniel inglés, boyero de la montaña de Entlebuch, finlándes de
Laponia, braco alemán de pelo corto, schnauzer gigante, bichón
habanero, Labrador retrievers, pequeño perro león, caniche
miniatura, schnauzer miniatura, cobrador de patos de Nueva Escocia,
perros de agua portugueses, samoyedo, terrier sedoso, spitz, caniche
estándar, dachshund estándar de pelo duro, terriers tibetanos y
caniche toy.
15. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1, una secuencia de ARN
correspondiente a SEQ ID NO: 1, una secuencia de ADN complementaria
de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de ARN complementaria de SEQ ID NO:
1.
16. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de ADN de SEQ ID NO: 3, una secuencia de ARN
correspondiente a SEQ ID NO: 3, una secuencia de ADN complementaria
de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de ARN complementaria de SEQ ID NO:
3.
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