KR102141607B1 - 개의 망막위축증 조기 예측 또는 진단용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 개의 망막위축증 조기 예측 또는 진단용 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 개의 망막위축증 위험성과 관련이 높은 SNP 20개를 선별하여 해당 유전자형에 따른 망막위축증 위험도를 확인한 것인 바, 이를 이용한 개의 망막위축증 예측 또는 진단용 조성물은 유전적으로 발생하는 진행성 질환인 망막위축증의 위험성을 갖는 개에 대한 특별한 관리를 준비하거나, 번식을 위한 교배를 할 때 중요한 유전적 정보를 예측하여 망막위축증 위험성이 없는 우수한 개를 선발하는데 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 개의 망막위축증 조기 예측 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.
전세계적으로 개의 품종은 약 400여 종이 있으며, 이는 인간의 과도한 육종의 결과라 할 수 있다. 이에 따라 개는 근친교배율이 높아져 각종 유전질환에 노출되어 있다. 개의 유전질환으로 고관절탈구(고관절 이형성증, hip dysplasia), 비만, 백내장, 퇴행성 망막위축증, 알레르기, 간질 및 신장질환 등이 있으며, 특히 망막위축증은 상염색체 열성 유전의 후기 발현형 질환으로 PRCD 유전자의 과오 돌연변이에 의해 발병하는 것으로 알려져있으며, 다수의 견종에서 발병하는 질환이다.
개의 망막위축증의 증상은 보통 주간에는 잘 보이다가 어두운 곳을 두려워하거나 제대로 활동하지 못하는 야맹증과 비슷한 특징이 있다. 망막위축증은 망막 퇴행으로 인해 시력이 손상된 것으로, 진행 시기는 연령과 증상에 따라 다르게 나타나지만 결국 실명에 이르게 된다. 게다가 망막위축증의 치료법은 개발된 바 없기 때문에 발병되기 이전에 유전자 검사를 통해 유전자 변이를 확인하고, 망막전위도 검사 등을 통해 정기적인 관리가 필요하며, 유전적 원인으로 발병하는 질환이므로 질환을 가진 개체라면 번식을 피하는 것이 좋다. 특히, 특수 목적견으로 양성되는 품종의 경우 망막위축증을 예측 또는 조기에 진단하여 망막위축증 위험성이 없는 우수한 개를 선발할 필요가 있다.
말티즈 견에서 진행성망막위축증 (prcd-PRA)을 일으키는 변이유전자 확인 및 유전자빈도 연구, 건국대학교 대학원, 2016.
본 발명의 목적은 개의 망막위축증 예측 또는 진단용 조성물, 개의 망막위축증 예측 또는 진단용 키트, 또는 이를 이용한 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP); 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 T인 SNP; 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 14의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 15의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 17의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 18의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 19의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 및 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 개의 망막위축증 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 개의 망막위축증 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 개로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 14의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 15의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 17의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 18의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 19의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계로서, 상기 SNP는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 또는 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 61번 염기인, 단계; 및 2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계를 포함하는, 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 개의 망막위축증 위험성과 관련이 높은 SNP 20개를 선별하여 해당 유전자형에 따른 망막위축증 위험도를 확인한 것인 바, 이를 이용한 개의 망막위축증 예측 또는 진단용 조성물은 유전적으로 발생하는 진행성 질환인 망막위축증의 위험성을 갖는 개에 대한 특별한 관리를 준비하거나, 번식을 위한 교배를 할 때 중요한 유전적 정보를 예측하여 망막위축증 위험성이 없는 우수한 개를 선발하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP); 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 T인 SNP; 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 14의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 15의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 17의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 18의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 19의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 및 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 개의 망막위축증 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 폴리뉴클레오티드 내 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 SNP가 포함된 부위를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 상기 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
상기 "폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"에는 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단용 조성물을 포함하는 개의 망막위축증 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP); 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 T인 SNP; 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 14의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 15의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 17의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 서열번호 18의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; 서열번호 19의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 및 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는, 폴리뉴클레오티드 내 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 SNP가 포함된 부위를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 상기 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 키트는 PCR 키트, DNA 분석용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인하거나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 개의 망막위축증을 예측 또는 진단할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.
예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 개로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 14의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 15의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 17의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 18의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 19의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계로서, 상기 SNP는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 또는 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 61번 염기인, 단계; 및 2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계를 포함하는, 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, ProcNatlAcad Sci USA 86, 1173(1989)), 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, ProcNatl Acad Sci USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.
상기 단계 2)의 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계는 서열분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(minisequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 G인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 G인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 G인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 A인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 A인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 G인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 G인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 G인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 T인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 A인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 G인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 A인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 G인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 14의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 A인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 15의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 G인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 A인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 17의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 A인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 18의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 G인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 19의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 C인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
상기 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법에 있어서, 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 모두 G인 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 개 130두의 혈액으로부터 DNA를 추출한 후, 개에 대한 170K SNP 칩을 이용하여 SNP 유전자형을 분석하고, 전장유전체 연관성 분석(Genome-wide association study, GWAS)을 통하여 개의 망막위축증 위험도를 조기예측 가능한 SNP 20개를 선별하였다(표 1 내지 6 참조).
따라서, 본 발명의 SNP 조성물, 이를 포함하는 키트 또는 마이크로어레이 칩, 또는 본 발명의 SNP 조성물을 이용한 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법은 유전적으로 발생하는 진행성 질환인 망막위축증의 위험성을 갖는 개에 대한 특별한 관리를 준비거나, 번식을 위한 교배를 할 때 중요한 유전적 정보를 예측하여 망막위축증 위험성이 없는 우수한 개를 선발하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 개에 대한 SNP 유전자형 분석
개 130두의 혈액으로부터 DNA 정제 키트(Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega, 미국)를 이용하여 DNA를 추출한 후, 개에 대한 170K SNP 칩(CanineHD BeadChip, Illumina, 미국)을 이용하여 SNP 유전자형을 분석하였다.
<1-1>
1일차
: 증폭(Amplification)
MSA3 바코드를 붙인 96-웰 0.8 ㎖ MIDI 플레이트(이하, 'MSA3 플레이트')에 웰 당 20 ㎕의 MA1을 넣고, 개 130두의 혈액으로부터 추출한 DNA를 웰 당 4 ㎕씩 넣은 후, DNA ID 및 옮긴 MSA3 플레이트의 위치를 기록해두었다. 이후, 각 웰 당 4 ㎕의 0.1 N NaOH를 넣고, 96-웰 덮개(96 well cap mat)로 플레이트를 덮은 후 1,600 rpm에서 1분 동안 흔들어 섞어주고(vortexing), 280 × g에서 1분간 원심분리하였다. 이후, 10분 동안 실온에서 반응시킨 후, 웰 당 34 ㎕의 MA2를 넣고, 38 ㎕의 MSM을 넣은 후, 96-웰 덮개를 덮고 280 × g에서 1분간 원심분리하였다. 37℃의 오븐(Illumina Hybridization oven)에서 20 내지 24시간 동안 반응시켜 시료를 증폭시켰다.
<1-2>
2일차
: 조각(Fragment)
상기 실시예 1-1의 MSA3 플레이트를 오븐에서 꺼내 50 × g에서 1분간 원심분리하고, 각 웰 당 25 ㎕의 FMS를 넣은 후, 덮개로 플레이트를 덮어 1,600 rpm에서 1분간 흔들어 섞어주었다(vortexing). 이후, 플레이트를 50 × g에서 1분간 원심분리하고, 37℃ 히트 블록(heat block)에서 1시간 동안 반응시켰다.
<1-3>
2일차
: 침전(Precipitation)
상기 실시예 1-2의 플레이트에 각 웰 당 25 ㎕의 PM1을 넣은 후, 덮개를 덮고, 1,600 rpm에서 1분간 원심분리한 후, 37℃ 오븐에서 5분간 반응시켰다. 플레이트를 50 × g에서 1분간 원심분리한 후, 덮개를 벗기고, 각 웰 당 155 ㎕의 2-프로판올(2-propanol)을 넣었다. 새로운 96-웰 덮개로 플레이트를 덮고 10번 뒤집어 혼합한 뒤, 4℃에서 30분 동안 보관하였다. 이후, 4℃, 3,000 rpm에서 20분 동안 원심분리 후, 플레이트 덮개를 제거하고 빠르게 뒤집어 상층액을 버렸다. 키친타올에 10회 정도 가볍게 두드려 남아있는 상층액을 제거하고, 뒤집어진 플레이트를 그대로 튜브 렉에 올려놓고 1시간 동안 자연 건조시켜 DNA 침전만 남도록 하였다.
<1-4>
2일차
:
재현탁
(
Resuspend
)
상기 실시예 1-3의 DNA 침전이 들어있는 플레이트에 웰 당 23 ㎕의 RA1을 넣고, 남은 RA1은 추후 염색(XStain HD Bead Chip)을 위해 냉동보관하였다. 플레이트에 호일 실(foil seal)을 올리고, 히트-실러 블록(heat-sealer block)을 5초 동안 눌러 밀봉하였다. 밀봉한 플레이트를 48℃의 오븐에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1,800 rpm에서 1분간 흔들어 섞어주었고(vortexing), 280 × g에서 1분간 원심분리하였다.
<1-5>
2일차
:
혼성화
(Hybridization)
상기 실시예 1-4의 플레이트를 95℃ 히트 블록에 넣어 20분 동안 DNA 시료를 변성시켰다(denaturation). 이후, 플레이트를 실온에 30분 동안 두고 식히는 동안 혼성화 챔버(HybChamber)에 가스킷(gaskets)을 끼우고, 혼성화 챔버에 있는 8개의 버퍼 리저버(humidifying buffer reservoir)에 각 400 ㎕의 PB2를 넣고, 뚜껑을 닫아 실온에 두었다. 실온에서 식힌 DNA가 담긴 MSA3 플레이트를 280 × g에서 1분간 원심분리하였다. 냉장 보관하던 SNP 칩을 하나씩 꺼내 준비하고, 혼성화 챔버 인서트(insert)의 바코드 모양과 칩의 바코드 부분을 맞추어 놓은 후, 멀티채널 피펫으로 식힌 DNA 시료를 각 15 ㎕씩 칩의 양쪽 부분으로 로딩(loading)하였다. 각 칩의 시료 로딩이 끝나는 대로 혼성화 챔버에 넣고 다음 칩도 같은 방법으로 반복하였다. 챔버가 모두 채워지면 챔버 뚜껑을 닫고 48℃의 오븐에 넣고 속도를 5로 설정하여 16 내지 24시간 동안 반응시켰다.
<1-6>
3일차
: 세척(Washing bead chips)
상기 실시예 1-5의 혼성화 챔버를 오븐에서 꺼내고, 챔버 속의 인서트를 하나씩 꺼내, 칩에 붙어 있는 실(seal)을 잡아당겨 제거한 후, 실이 제거된 칩을 세척 렉(wash rack)에 꽂아 WB1이 담긴 세척 디쉬(wash dish)에 담갔다. 모든 칩이 WB1에 담긴 후 세척 렉을 디쉬에서 1분 동안 뺐다 넣었다 하면서 씻어주었고, PB1이 들어 있는 다른 세척 디쉬에 렉을 옮겨 1분 동안 뺐다 넣었다 하면서 씻어주었다. 세척이 끝난 후, 비드칩 얼라인먼트 픽스쳐(Multi-sample BeadChips Alignment fixture)에 백 프레임(back frame)을 올리고, 바코드 방향에 맞추어 칩을 한 장씩 올린 후, 흰색 부분과 분리한 투명한 부분의 스페이스를 얼라인먼트 픽스쳐의 윗부분과 아랫부분에 맞추어 끼웠다. 스페이스를 올린 후, 바코드가 없는 칩의 윗부분에 얼라인먼트 바(alignment bar)를 올리고, 유리판의 끝이 바에 닿도록 유리판을 덮은 후, 클립을 끼워 챔버 어셈블리(Flow-through chamber assembly)를 완성하였다. 얼라인먼트 바를 제거하고, 챔버 어셈블리 양끝의 스페이스 부분을 가위로 잘라주었다.
<1-7>
3일차
: 염색(
XStain
Beadchips
)
챔버 렉의 온도를 44℃로 맞춘 후, 상기 실시예 1-6의 챔버 어셈블리를 챔버 렉에 끼웠다. 각 칩에 150 ㎕의 RA1을 넣고 30초 동안 반응시키는 과정을 6번 반복한 후, 450 ㎕의 XC1, 450 ㎕의 XC2 및 200 ㎕의 TEM을 순차적으로 각 칩에 넣고 각각 10분씩 반응시켰다. 450 ㎕의 95% 포름아미드(formamide)/1 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 각 칩에 넣고 1분 동안 반응시킨 후, 다시 한번 더 동일하게 넣고 5분 동안 반응시켰다. LTM 튜브의 라벨에 적혀 있는 온도를 확인하고 해당 온도로 챔버 렉의 온도를 바꾸고, 450 ㎕의 XC3을 각 칩에 넣고 1분 동안 반응시킨 후, 다시 한번 더 동일하게 넣고 상기 설정한 챔버 렉의 온도에 도달할 때까지 기다렸다. 이후, 하기 표 1의 A - B - A - B - A의 순서로 각 칩에 시약을 넣고 반응시켰다.
| 세트 | 순서 | 각 칩에 넣는 시약 | 시약 넣은 후 반응시간 |
| A | 1 | 250 ㎕의 LTM | 10분 |
| 2 | 450 ㎕의 XC3 | 1분 | |
| 3 | 450 ㎕의 XC3 | 5분 | |
| B | 1 | 250 ㎕의 ATM | 10분 |
| 2 | 450 ㎕의 XC3 | 1분 | |
| 3 | 450 ㎕의 XC3 | 5분 |
상기 반응 종료 후, 즉시 챔버 어셈블리에서 챔버 렉을 분리하고 실온의 실험 테이블로 옮겨 평평하게 꺼내 두었다. 310 ㎖의 PB1을 세척 용기에 넣고 염색용 렉을 용기 안에 담가 두었다. 기구를 이용하여 챔버 렉의 클립을 벗기고 유리 블록을 들어서 제거한 후, 칩의 비드(bead) 부분을 건드리지 않도록 하면서 스페이스를 제거하였다. 칩에 붙였던 부착물을 모두 제거한 후, PB1에 담겨 있는 염색용 렉(staining rack)에 꽂아 PB1에 담가 두었다. 모든 칩을 순차적으로 상기와 동일하게 처리하였다. 염색용 렉을 천천히 10번 정도 위 아래로 움직여 칩을 담금질한 후, 5분 동안 담가두었다가 다른 세척용 용기에 XC4 310 ㎖을 채우고 상기와 동일하게 칩을 담금질한 후 5분 동안 담가두었다. 이후, 염색용 렉을 꺼내고 집게를 이용하여 칩을 조심스럽게 꺼내 튜브 렉 위에 올려두었다. 칩을 올린 튜브 렉을 진공 건조기에 넣고 508 mmHg(0.68 bar)의 진공 상태로 55분 동안 건조시켰다. 에탄올에 적신 티슈(KIMWIPES)를 이용하여 비드 부분을 건드리지 않도록 주의하면서 건조된 칩의 가장자리를 닦아주었다. 실험이 완료된 비드 칩은 72시간 이내에 스캐너를 이용하여 이미지화시켰다.
<
실험예
1> 개의
망막위축증
위험도를 조기예측 가능한 20개 SNP 선별
개 130두에 대한 고밀도 SNP 170K 칩 분석 및 전장유전체 연관성 분석(Genome-wide association study, GWAS)을 통하여 개의 망막위축증 위험도를 조기예측 가능한 SNP 20개를 선별하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 얻은 이미지를 분석하여 개 130 두의 유전자형을 분석하였다. 이후, 전장유전체 유전자형 데이터 품질관리(quality control, QC) 및 데이터베이스 구축을 위하여 PLINK 및 R/SNPassoc package를 이용하여 SNP를 필터링하여 하디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE) 검사 및 MAF(minor allele frequency) 조건에 부적합한 유전자들을 제외하였다(HWE p < 0.001, MAF < 0.001, call rate < 90%). 이후, 개 130두의 망막위축증 여부를 관찰하여 정상인 경우 1점, 망막위축증인 경우 2점으로 주어 망막위축증의 표현형을 점수화하였다. 전장유전체 연관성 분석을 통하여 SNP 칩으로부터 분석한 유전자형에 따른 망막위축증 위험도와의 관련성 정도를 계산하고, 혼합 선형 모형 연관분석 기법(Mixed Linear Model based Association analysis, MLMA)을 이용하여 유의한 SNP를 탐색하였다.
그 결과, 개의 망막위축증 위험도를 조기예측할 수 있는 20개 SNP를 선별하였으며 (표 2 내지 표 4), 선별한 각 SNP의 위험성 유전자형을 가진 개는 망막위축증 위험도가 높은 것으로 나타났다 (표 5 및 표 6).
<110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Composition for predicting or diagnosing progressive retinal
atrophy in dog
<130> 2018P-11-078
<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BICF2P1385201
<220>
<221> variation
<222> (61)
<223> n is A or G
<400> 1
catgttctgc ctttttgtag aaagggtacg aaggaagaaa acaaatttac attagtgagc 60
ncgtacaata ccttttgaag cttatatgaa taattgatga cttttggttg cccctgaggg 120
t 121
<210> 2
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BICF2P301950
<220>
<221> variation
<222> (61)
<223> n is A or G
<400> 2
ctttaggtgg tggaactgac attttgagga tgcacctgga agatttgtga gtgacctaga 60
nagggaattg gggtaatagg ttttagtggg agtttctggg agagtaggac accggttatg 120
g 121
<210> 3
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BICF2S23260261
<220>
<221> variation
<222> (61)
<223> n is A or G
<400> 3
aaatagtttt cttctgcact tctgstcttc acctcaatca agctgctttt cactgcttct 60
ntagagacat aataacttaa gaagtgttct gggacctcgt gtatagtaga catttctgta 120
t 121
<210> 4
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BICF2P145876
<220>
<221> variation
<222> (61)
<223> n is A or G
<400> 4
tgatcctcct acagtgtgtg ctttatgttt cttaaaatac tgtgggaatg aatatttccc 60
ngctttctct gtaagctccc aagtcagacc tctgtttata aaggtgtcgg cgggaggcgg 120
t 121
<210> 5
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BICF2P1198381
<220>
<221> variation
<222> (61)
<223> n is A or C
<400> 5
tttaccctga attagtatag ctaagccttt gagaataggt ttcgcggtaa ctcagttttg 60
ntaaggaaaa gagtacagaa atatattaga gaatcaaata tgaatgtagc tctgctgaaa 120
a 121
<210> 6
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> variation
<222> (61)
<223> n is A or G
<400> 6
tggggtaagt ggggctgaat ggagcatttg aagttgagaa gaattttcaa tcttttacaa 60
natcaaagac ttgctgtatt ttgttctaag caactggcct accgaacaga agccatcata 120
a 121
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<213> Artificial Sequence
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<221> variation
<222> (61)
<223> n is A or G
<400> 7
ggagcatcca ccatactgga tagttggtgg tagggtgttt atgccctgag attggccagc 60
ntctaccctg aatcacccca ctgcttgcaa tatagatcta aaatggaaag gccctgggaa 120
g 121
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<222> (61)
<223> n is A or G
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gcrtttcaaa atgcattagt ccagttatcg ctttgtctct gtctctcgcc ttatatttcc 60
nacagcttta cagcrtgggg ctgctttctt gaagacccca aagttaaata cattttwaaa 120
a 121
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<221> variation
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tgggcataaa agtcactaat tatcagctcc atgaaagtgg aacagcggac tctgcctctg 60
nggtgccatc cccaggcttc tcagggattt atagtcccta gcccgagtga atgcctgtag 120
a 121
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ttcaattgtg ttcctttttt acaaaaacaa cagatcttcg ccgtagcaag tcgataaaag 60
nctaagaatc acaaagaatg gaaaaccgcc catagtgcca atcgtcayaa agtcttaacc 120
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cgccaggcct tgaggaattc ggttaacaga aaggatgtac ccgtcttccg tgacgacttc 60
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c 121
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ttgttgtttg attttggttt tttgcttttt ttaaaaaata tgttctccac cagggtcaat 60
ntgtcaggtt gtttgcccag agtgctagta aagactttta tctataaara tatcaatact 120
t 121
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aagagtgcca gatgtcggta ggtgaaggag acagccatct gcaggaagct gctcactcct 60
ngggccaggc cagggagcgt ctgagacagg ccagggagaa cacaagatct tttttcagag 120
c 121
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<222> (61)
<223> n is A or C
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aatagtagtc tggttattta acactcattg ctggtcctag atgctcagac agctctctgc 60
nctgtgctgg ggtgtccttg ctgtcctgag gctgtcgggg tgtgtggtgg ctgggaagcc 120
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<222> (61)
<223> n is A or G
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ggctcctatt tctggagaat cccaagggcc ctctgccctg ccccgcacgt gagtagggag 60
ngaagaatat atgtctataa tgtgcctaat cctgtcctgg acatcacagt ggatgataca 120
g 121
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<222> (61)
<223> n is A or G
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agaggaaaga atccaaccag cacaaagatt gccctccact ctaattggag gggraagggt 60
ntacagcttc taatgtgcaa gccatttggg tacatattaa tgtctctgtc cagatttatt 120
c 121
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<223> n is A or C
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tgaaaaagtc attcaagaac ccagacccaa ataaaggatt atctgatttt gaatcataaa 60
nataaaactg aatggcaaca agctttgata atggaaatta tagactgttt gatcagggtc 120
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<223> TIGRP2P294253_rs9146382
<220>
<221> variation
<222> (61)
<223> n is A or G
<400> 18
tgacataaaa cttagaatag tgcatttcaa tcatatagat ggttcattaa gataacctgc 60
ngcattgata gatttatact gaggtttggt tacatacctt atgaggcttc aagttatggt 120
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<223> BICF2P756570
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<223> n is A or C
<400> 19
atcatccgga acaccccaat gggatcctga tcggatacac tctcaaatat gtggcttgta 60
ngttccatcc ttctttctct tcatctggga ttcagaaacc ccattctcac catttcacta 120
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<212> DNA
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<223> BICF2G630775131
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<221> variation
<222> (61)
<223> n is A or G
<400> 20
actgccaacc actycttgct cccctttact atgacttcag ccaaaatcag ttgatgatgt 60
nagacccttc tctgccaaac ctgcatcctc aaggttgaga gtcaccaggg atggctggcc 120
a 121
Claims (8)
- 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP);
서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP;
서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 T인 SNP;
서열번호 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 11의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP;
서열번호 13의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 14의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP;
서열번호 15의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 17의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP;
서열번호 18의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
서열번호 19의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; 및
서열번호 20의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개의 망막위축증 예측 또는 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 프라이머 세트 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 개의 망막위축증 예측 또는 진단용 조성물.
- 제1항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 개의 망막위축증 예측 또는 진단용 키트.
- 1) 개로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 14의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 15의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 17의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 18의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 19의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계로서,
상기 SNP는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 및 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 61번 염기인, 단계; 및
2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개의 망막위축증 예측 또는 진단 방법.
- 제4항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 의 SNP인 61번 염기;
서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기;
서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기;
서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기;
서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기;
서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기;
서열번호 11의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기;
서열번호 13의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기;
서열번호 15의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기;
서열번호 18의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기; 또는
서열번호 20의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 G인 경우, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 대응되는 위치에서 상기 유전자형에 상보적인 염기가 확인되는 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단하는 것인, 방법.
- 제4항에 있어서, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 의 SNP인 61번 염기;
서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기;
서열번호 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기;
서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기;
서열번호 14의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기;
서열번호 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기; 또는
서열번호 17의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 A인 경우, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 대응되는 위치에서 상기 유전자형에 상보적인 염기가 확인되는 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단하는 것인, 방법.
- 제4항에 있어서, 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 T인 경우, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 대응되는 위치에서 상기 유전자형에 상보적인 염기가 확인되는 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단하는 것인, 방법.
- 제4항에 있어서, 서열번호 19의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP인 61번 염기가 C인 경우, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 대응되는 위치에서 상기 유전자형에 상보적인 염기가 확인되는 경우, 개의 망막위축증 위험도가 증가된 것으로 판단하는 것인, 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020180162493A KR102141607B1 (ko) | 2018-12-14 | 2018-12-14 | 개의 망막위축증 조기 예측 또는 진단용 조성물 |
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Citations (3)
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| EP1609876B1 (en) * | 2004-06-21 | 2007-09-19 | Cornell Research Foundation, Inc. | Identification of the gene and mutation for progressive rod-cone degeneration in dog and method for testing same |
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| WO2013179001A1 (en) * | 2012-05-28 | 2013-12-05 | Animal Health Trust | Ttc8 as prognostic gene for progressive retinal atrophy in dogs |
-
2018
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Molecular Vision (2013) 19:1871-1884* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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