KR102194879B1 - 개의 주인 친근성 예측용 snp 마커 및 이를 이용한 예측 방법 - Google Patents

개의 주인 친근성 예측용 snp 마커 및 이를 이용한 예측 방법 Download PDF

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박종은
박원철
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Abstract

본 발명은 개에서 주인 친근성이 낮은 개체를 판별할 수 있는 SNP 10개를 선별하여 해당 유전자형에 따른 주인 친근성를 확인한 것인 바, 이를 이용한 개의 주인 친근성 예측용 SNP 조성물은 유전자 검사를 통해 주인 친근성을 예측하여 개에 대한 특별한 훈련 관리를 할 수 있고, 교배 시에도 부견과 모견의 유전자검사를 통해 태어난 자견의 주인 친근성을 극대화 하여 우수한 개를 선발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

개의 주인 친근성 예측용 SNP 마커 및 이를 이용한 예측 방법{SNP marker for prediction of dog's owner friendliness and prediction method using the same}
본 발명은 개의 주인 친근성 예측용 SNP 마커 및 이를 이용한 예측 방법에 관한 것이다.
개(dog)는 개과의 포유류로서, 포유류 중 가장 오래된 가축의 하나로 거의 전세계에서 사육되며 약 400여 품종이 있다. 개의 크기는 품종에 따라 다르며 어깨높이는 약 8 ∼ 90cm, 몸무게는 약 0.4 ∼ 120 kg인 것이 있고, 털의 유무 및 길이 등도 다양하다. 또한, 털의 빛깔이나 무늬가 다양하며, 꼬리 끝에 흰색무늬, 눈 위에 원형의 담색무늬, 어깨에 십자모양의 짙은 색 무늬 등을 나타내는 것이 많다.
개는 거의 주년(周年) 번식을 하는데, 봄과 가을에 가장 많은 새끼를 낳는다. 임신기간은 62 ∼ 68일, 한 배에 보통 4 ∼ 6마리를 낳는다. 새끼는 6 ∼ 7주간 젖을 먹지만 4주 정도에서 연한 먹이나 어미가 토해 낸 반소화된 먹이를 먹기 시작한다. 수명은 보통 12 ∼ 16년이지만 암컷은 5세가 되면 번식력이 저하되며 8세에서는 대체로 번식력을 상실하게 된다.
국내 반려동물 수는 약 1,000만 마리를 넘어섰고, 농림축산식품부에 따르면 2017년 기준 개, 고양이 등 반려동물과 함께 사는 가구 비율은 28.1%에 달한다. 이에, 반려동물 관련 산업도 크게 성장하여 국내 반려동물 관련 시장은 향후 3년 안에 6 조원 규모로 성장할 것이라는 전망도 나온다.
한편, 전세계적으로 개의 행동장애 발생은 심각한 수준으로, 최근 반려견에 의한 상해사고가 증가하면서 정부는 안전 대책을 강구하고 있으며, 캐나다 에드먼턴시의 경우 반려견 사고 관련 주요 대책 중 하나로, 반려견의 성향을 멀리서도 알 수 있는 인식표를 사용하여 타인의 접근을 방지하는 예방대책도 시행하고 있는 실정이다. 개의 공격적인 성향은 유전적 요인에 의해서도 발생할 수 있는 바, 개의 주인 친근성과 같은 행동학적 기질을 발굴할 필요성이 대두되고 있다.
이에, 본 발명자들은 개 50두의 혈액으로부터 DNA를 추출한 후, 개에 대한 170K SNP 칩을 이용하여 SNP 유전자형을 분석하고, 전장유전체 연관성 분석(Genome-wide association study, GWAS)을 통하여 개의 주인 친근성을 조기 예측 가능한 SNP 10개를 선별하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 개의 주인 친근성 예측용 조성물, 이를 포함하는 개의 주인 친근성 예측용 키트, 또는 이를 이용한 개의 주인 친근성 예측 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a)서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP); (b)서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; (c)서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; (d)서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; (e)서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; (f)서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 T 또는 A인 SNP; (g)서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP; (h)서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP; (i)서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 T인 SNP; 및 (j)서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP; 로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 개의 주인 친근성 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 개의 주인 친근성 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 개의 주인 친근성 예측용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 개로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1 내지 20의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및 2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 61번째 염기에 해당하는 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계를 포함하는, 개의 주인 친근성 예측 방법을 제공한다.
본 발명은 개에서 주인 친근성이 낮은 개체를 판별할 수 있는 SNP 10개를 선별하여 해당 유전자형에 따른 주인 친근성를 확인한 것인 바, 이를 이용한 개의 주인 친근성 예측용 SNP 조성물은 유전자 검사를 통해 주인 친근성을 예측하여 개에 대한 특별한 훈련 관리를 할 수 있고, 교배 시에도 부견과 모견의 유전자검사를 통해 태어난 자견의 주인 친근성을 극대화 하여 우수한 개를 선발하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a)서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP); (b)서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; (c)서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; (d)서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; (e)서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; (f)서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 T 또는 A인 SNP; (g)서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP; (h)서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP; (i)서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 T인 SNP; 및 (j)서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP; 로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 개의 주인 친근성 예측용 조성물을 제공한다.
상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 프라이머 또는 프로브일 수 있고, 구체적으로는 상기 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제에는 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 개의 주인 친근성 예측용 조성물을 포함하는 개의 주인 친근성 예측용 키트를 제공한다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 본 발명은 (a)서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP); (b)서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP; (c)서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; (d)서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP; (e)서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP; (f)서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 T 또는 A인 SNP; (g)서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP; (h)서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP; (i)서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 T인 SNP; 및 (j)서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP; 로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 프라이머 또는 프로브일 수 있고, 구체적으로는 상기 SNP가 포함된 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
상기 키트는 PCR 키트, DNA 분석용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인하거나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 개의 주인 친근성을 예측할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.
예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 개의 주인 친근성 예측용 조성물을 포함하는 개의 주인 친근성 예측용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 있어 마이크로어레이란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명은 1) 개로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1 내지 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및 2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 61번째 염기에 해당하는 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계를 포함하는, 개의 주인 친근성 예측 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, ProcNatlAcad Sci USA 86, 1173(1989)), 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, ProcNatl Acad Sci USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.
상기 단계 2)의 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계는 서열분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(minisequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 개의 주인 친근성 예측 방법에 있어서,
서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우;
서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
서열번호 6로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 및
서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C인 경우;로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 해당하면 주인 친근성이 낮은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 개 50두의 혈액으로부터 DNA를 추출한 후, 개에 대한 170K SNP 칩을 이용하여 SNP 유전자형을 분석하고, 전장유전체 연관성 분석(Genome-wide association study, GWAS)을 통하여 개의 주인 친근성을 조기 예측 가능한 SNP 10개를 선별하였다(표 1 내지 표 4 참조).
따라서, 본 발명에 따른 개에서 주인 친근성이 높은 개체를 판별할 수 있는 SNP 조성물, 이를 포함하는 개의 주인 친근성 예측용 키트, 또는 이를 이용한 개의 주인 친근성 예측 방법은 유전자 검사를 통해 주인 친근성을 예측하여 개에 대한 특별한 훈련 관리를 할 수 있고, 교배 시에도 부견과 모견의 유전자검사를 통해 태어난 자견의 주인 친근성을 극대화 하여 우수한 개를 선발하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 개에 대한 SNP 유전자형 분석
개 50두의 혈액으로부터 DNA 정제 키트(Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega, 미국)를 이용하여 각각 DNA를 추출한 후, 개에 대한 170K SNP 칩(CanineHD BeadChip, Illumina, 미국)을 이용하여 SNP 유전자형을 분석하였다.
<1-1> 1일차: 증폭(Amplification)
MSA3 바코드를 붙인 96-웰 0.8 ㎖ MIDI 플레이트(이하, 'MSA3 플레이트')에 웰 당 20 ㎕의 MA1을 넣고, 개 50두의 혈액으로부터 추출한 각 DNA를 웰 당 4 ㎕씩 넣은 후, DNA ID 및 옮긴 MSA3 플레이트의 위치를 기록해두었다. 이후, 각 웰 당 4 ㎕의 0.1 N NaOH를 넣고, 96-웰 덮개(96 well cap mat)로 플레이트를 덮은 후 1,600 rpm에서 1분 동안 흔들어 섞어주고(vortexing), 280 × g에서 1분간 원심분리하였다. 이후, 10분 동안 실온에서 반응시킨 후, 웰 당 34 ㎕의 MA2를 넣고, 38 ㎕의 MSM을 넣은 후, 96-웰 덮개를 덮고 280 × g에서 1분간 원심분리하였다. 37℃의 오븐(Illumina Hybridization oven)에서 20 내지 24시간 동안 반응시켜 시료를 증폭시켰다.
<1-2> 2일차: 조각(Fragment)
상기 실시예 1-1의 MSA3 플레이트를 오븐에서 꺼내 50 × g에서 1분간 원심분리하고, 각 웰 당 25 ㎕의 FMS를 넣은 후, 덮개로 플레이트를 덮어 1,600 rpm에서 1분간 흔들어 섞어주었다(vortexing). 이후, 플레이트를 50 × g에서 1분간 원심분리하고, 37℃ 히트 블록(heat block)에서 1시간 동안 반응시켰다.
<1-3> 2일차: 침전(Precipitation)
상기 실시예 1-2의 플레이트에 각 웰 당 25 ㎕의 PM1을 넣은 후, 덮개를 덮고, 1,600 rpm에서 1분간 원심분리한 후, 37℃ 오븐에서 5분간 반응시켰다. 플레이트를 50 × g에서 1분간 원심분리한 후, 덮개를 벗기고, 각 웰 당 155 ㎕의 2-프로판올(2-propanol)을 넣었다. 새로운 96-웰 덮개로 플레이트를 덮고 10번 뒤집어 혼합한 뒤, 4℃에서 30분 동안 보관하였다. 이후, 4℃, 3,000 rpm에서 20분 동안 원심분리 후, 플레이트 덮개를 제거하고 빠르게 뒤집어 상층액을 버렸다. 키친타올에 10회 정도 가볍게 두드려 남아있는 상층액을 제거하고, 뒤집어진 플레이트를 그대로 튜브 렉에 올려놓고 1시간 동안 자연 건조시켜 DNA 침전만 남도록 하였다.
<1-4> 2일차: 재현탁(Resuspend)
상기 실시예 1-3의 DNA 침전이 들어있는 플레이트에 웰 당 23 ㎕의 RA1을 넣고, 남은 RA1은 추후 염색(XStain HD Bead Chip)을 위해 냉동보관하였다. 플레이트에 호일 실(foil seal)을 올리고, 히트-실러 블록(heat-sealer block)을 5초 동안 눌러 밀봉하였다. 밀봉한 플레이트를 48℃의 오븐에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1,800 rpm에서 1분간 흔들어 섞어주었고(vortexing), 280 × g에서 1분간 원심분리하였다.
<1-5> 2일차: 혼성화(Hybridazation)
상기 실시예 1-4의 플레이트를 95℃ 히트 블록(Heat block)에 넣어 20분 동안 DNA 시료를 변성시켰다(denaturation). 이후, 플레이트를 실온에 30분 동안 두고 식히는 동안 혼성화 챔버(HybChamber)에 가스킷(gaskets)을 끼우고, 혼성화 챔버에 있는 8개의 버퍼 리저버(humidifying buffer reservoir)에 각 400 ㎕의 PB2를 넣고, 뚜껑을 닫아 실온에 두었다. 실온에서 식힌 DNA가 담긴 MSA3 플레이트를 280 × g에서 1분간 원심분리하였다. 냉장 보관하던 SNP 칩을 하나씩 꺼내 준비하고, 혼성화 챔버 인서트(insert)의 바코드 모양과 칩의 바코드 부분을 맞추어 놓은 후, 멀티채널 피펫으로 식힌 DNA 시료를 각 15 ㎕씩 칩의 양쪽 부분으로 로딩(loading)하였다. 각 칩의 시료 로딩이 끝나는 대로 혼성화 챔버에 넣고 다음 칩도 같은 방법으로 반복하였다. 챔버가 모두 채워지면 챔버 뚜껑을 닫고 48℃의 오븐에 넣고 속도를 5로 설정하여 16 내지 24시간 동안 반응시켰다.
<1-6> 3일차: 세척(Washing bead chips)
상기 실시예 1-5의 혼성화 챔버를 오븐에서 꺼내고, 챔버 속의 인서트를 하나씩 꺼내, 칩에 붙어 있는 실(seal)을 잡아당겨 제거한 후, 실이 제거된 칩을 세척 렉(wash rack)에 꽂아 WB1이 담긴 세척 디쉬(wash dish)에 담갔다. 모든 칩이 WB1에 담긴 후 세척 렉을 디쉬에서 1분 동안 뺐다 넣었다 하면서 씻어주었고, PB1이 들어 있는 다른 세척 디쉬에 렉을 옮겨 1분 동안 뺐다 넣었다 하면서 씻어주었다. 세척이 끝난 후, 비드칩 얼라인먼트 픽스쳐(Multi-sample BeadChips Alignment fixture)에 백 프레임(back frame)을 올리고, 바코드 방향에 맞추어 칩을 한 장씩 올린 후, 흰색 부분과 분리한 투명한 부분의 스페이스를 얼라인먼트 픽스쳐의 윗부분과 아랫부분에 맞추어 끼웠다. 스페이스를 올린 후, 바코드가 없는 칩의 윗부분에 얼라인먼트 바(alignment bar)를 올리고, 유리판의 끝이 바에 닿도록 유리판을 덮은 후, 클립을 끼워 챔버 어셈블리(Flow-through chamber assembly)를 완성하였다. 얼라인먼트 바를 제거하고, 챔버 어셈블리 양끝의 스페이스 부분을 가위로 잘라주었다.
<1-7> 3일차: 염색(XStain Beadchips)
챔버 렉의 온도를 44℃로 맞춘 후, 상기 실시예 1-6의 챔버 어셈블리를 챔버 렉에 끼웠다. 각 칩에 150 ㎕의 RA1을 넣고 30초 동안 반응시키는 과정을 6번 반복한 후, 450 ㎕의 XC1, 450 ㎕의 XC2 및 200 ㎕의 TEM을 순차적으로 각 칩에 넣고 각각 10분씩 반응시켰다. 450 ㎕의 95% 포름아미드(formamide)/1mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 각 칩에 넣고 1분 동안 반응시킨 후, 다시 한번 더 동일하게 넣고 5분 동안 반응시켰다. LTM 튜브의 라벨에 적혀 있는 온도를 확인하고 해당 온도로 챔버 렉의 온도를 바꾸고, 450 ㎕의 XC3을 각 칩에 넣고 1분 동안 반응시킨 후, 다시 한번 더 동일하게 넣고 상기 설정한 챔버 렉의 온도에 도달할 때까지 기다렸다. 이후, 하기 표 1의 A - B - A - B - A의 순서로 각 칩에 시약을 넣고 반응시켰다.
세트 순서 각 칩에 넣는 시약 시약 넣은 후 반응시간
A 1 250 ㎕의 LTM 10분
2 450 ㎕의 XC3 1분
3 450 ㎕의 XC3 5분
B 1 250 ㎕의 ATM 10분
2 450 ㎕의 XC3 1분
3 450 ㎕의 XC3 5분
상기 반응 종료 후, 즉시 챔버 어셈블리에서 챔버 렉을 분리하고 실온의 실험 테이블로 옮겨 평평하게 꺼내 두었다. 310 ㎖의 PB1을 세척 용기에 넣고 염색용 렉을 용기 안에 담가 두었다. 기구를 이용하여 챔버 렉의 클립을 벗기고 유리 블록을 들어서 제거한 후, 칩의 비드(bead) 부분을 건드리지 않도록 하면서 스페이스를 제거하였다. 칩에 붙였던 부착물을 모두 제거한 후, PB1에 담겨 있는 염색용 렉(staining rack)에 꽂아 PB1에 담가 두었다. 모든 칩을 순차적으로 상기와 동일하게 처리하였다. 염색용 렉을 천천히 10번 정도 위 아래로 움직여 칩을 담금질한 후, 5분 동안 담가두었다가 다른 세척용 용기에 XC4 310 ㎖을 채우고 상기와 동일하게 칩을 담금질한 후 5분 동안 담가두었다. 이후, 염색용 렉을 꺼내고 집게를 이용하여 칩을 조심스럽게 꺼내 튜브 렉 위에 올려두었다. 칩을 올린 튜브 렉을 진공 건조기에 넣고 508 mmHg(0.68 bar)의 진공 상태로 55분 동안 건조시켰다. 에탄올에 적신 티슈(KIMWIPES)를 이용하여 비드 부분을 건드리지 않도록 주의하면서 건조된 칩의 가장자리를 닦아주었다. 실험이 완료된 비드 칩은 72시간 이내에 스캐너를 이용하여 이미지화시켰다.
<실험예 1> 개의 주인 친근성을 조기 예측 가능한 10개 SNP의 선별
개 50두에 대한 고밀도 SNP 170K 칩 분석 및 전장유전체 연관성 분석(Genome-wide association study, GWAS)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 얻은 이미지를 분석하여 개 50 두의 유전자형을 분석하였다. 이후, 전장유전체 유전자형 데이터 품질관리(quality control, QC) 및 데이터베이스 구축을 위하여 SNP를 필터링하여 하디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE) 검사 및 MAF(minor allele frequency)에 대해 R/SNPassoc 패키지의 chi-square 검정을 실시하여, 조건에 부적합한 유전자들을 제외하였다(HWE p < 0.001, MAF < 0.001).
개의 주인 친근성에 대한 표현형질을 하기와 같이 측정하여 점수화하였다.
1점: 주인에게 반가움의 표현으로 꼬리를 흔들며 안기는 경우
2점: 주인에게 꼬리를 흔들지만, 쉽게 오지는 않으나 복종하는 경우
3점: 주인에게 꼬리를 흔들지만, 쉽게 오지 않으며 피하는 경우
4점: 주인에게 경계심을 가지고 짖거나 구석에 숨는 경우
이후, 상기 주인 친근성 점수 표현형과 SNP 마커 사이의 연관성을 검정하는데 하기 일반식 1로 점수화하여 유전자형 별로 개의 주인 친근성 표현형 수치를 계산하였다. 전장유전체 연관성 분석을 통하여 SNP 칩으로부터 분석한 유전자형에 따른 주인 친근성 점수 표현형과의 관련성 정도를 계산하고, Single marker regression에 대한 R-통계 패키지를 이용하여 주인 친근성에 대한 각 SNP 마커와의 상가적 유전효과(additive effect)를 분석하여 유의한 SNP를 탐색하였다.
[일반식 1]
y = μ + Sexi + SNPj + eij
(상기 일반식 1에서, y는 주인 친근성 점수, μ는 전체 평균, Sexi는 유전자형 효과(i=암컷, 수컷 및 중성화된 수컷), SNPj는 유전자형 효과(j=AA, AB, BB), eij는 임의오차, N~(0, σ2 e))
유전체전장 연관분석(genome wide association test)과 같은 다중분석(multiple testing)의 문제점인 임의 발생 오류로 인한 오류 검정(False Positive)을 위하여 10,000번의 permutation test를 수행하여 0.1% 수준으로 genome-wise P-값을 계산하였다.
그 결과, 개의 주인 친근성을 조기 예측할 수 있는 10개의 SNP를 선별하였고, 선별한 각 표현형 수치들의 평균 및 표준편차(Standard Deviation,SD)를 구하고, 각 표준편차를 유전자형별 개수의 제곱으로 나누어 표준오차(Standard error, SE)를 계산하였다(표 2 내지 표 4). 각 표현형 별로 평균값이 높을수록 주인 친근성이 낮음을 의미한다.
<개의 주인 친근성을 조기 예측할 수 있는 10개 SNP의 통계분석>
번호 SNP
단일염기변이 이름		 Chr
염색체		 bp(위치) A1 A2 유전자빈도 베타통계량 표준오차 p(확률값)
1 BICF2G6303508 39 115588191 A G 0.08 0.64675 0.22428 0.00393
2 BICF2G6303463 39 115632520 A G 0.08 0.64675 0.22428 0.00393
3 BICF2G6303301 39 116027066 G A 0.08 0.64675 0.22428 0.00393
4 BICF2P618822 3 26212315 A C 0.34 0.550786 0.20036 0.00598
5 BICF2P563532 3 19884385 G A 0.13 -0.764485 0.28369 0.00704
6 BICF2P1508594 26 36299811 T A 0.35 -0.577708 0.21597 0.00747
7 BICF2P1508585 26 36301531 C A 0.35 -0.577708 0.21597 0.00747
8 BICF2G630198118 26 37105977 C A 0.44 -0.553301 0.2122 0.00912
9 TIGRP2P169496_rs8979930 12 60280615 A T 0.10 0.801654 0.30805 0.00926
10 BICF2P1163482 16 48970635 C A 0.42 0.411069 0.15824 0.00938
<개의 주인 친근성을 조기예측 가능한 SNP의 염기서열 정보>
번호 단일염기다형 이름 염색체 염기서열변이영역 주인 불친근성
유전자형
1 BICF2G6303508 39 ATCAAAATAAGTTTCCACCAGTAAGGAAGAAAAGATGATGAACAGATTGGG
TAGATACCT[A/G]CCCATGCCTACCATGGCCTAAAGCTAACAGGCTCCTA
CCCTTTTATTAAGTGATCTTCAT		 A
2 BICF2G6303463 39 GCTAGTAGATCTACTGTTTCATACTGTACAGAAGATTCGAAAGAAGAAGAG
TAATGACCC[A/G]GACCAGAAATCATATTTTCAAGTTAATACCTTTACCT
GGCCAACCATCAGTGAAATGCAA		 A
3 BICF2G6303301 39 TCTCTTATTGGCCTAATACAGTTCAGCTCTCAGTTCTCCATAAATCCCTAA
TAGAAAGCA[A/G]AAGATCCAGTGTGAAGTGAAAAGTGATGTCTAGATTT
ATTACCTCCTCAAACTGTTGCCA		 G
4 BICF2P618822 3 TTTGGCACAGAAGTGACAGTGATCATTGACTTCTATGTGAATATCAAGTSG
TTGGCAATA[A/C]ATACGTAAACTGGAGATCAGAAACTTAGTGCAGAAGG
TCAGGTAGGCATCTGTCTTTGCT		 A
5 BICF2P563532 3 TTTCAAAACTATGGAAATAATGCTTYTCTTGGCAAAAGTTCAGATAATCTA
CACCTGTGG[A/G]CTGTAAAAGAGCATGATTTCTCCAGTAAGGAATAAGG
GCCTGGGTGACAGGAGAGCCTCA		 A
6 BICF2P1508594 26 TTCACATATATTTTTTTTTTTGAATTTCCCTATATATTTTTAGGGTTATTT
TAATCTGTT[A/T]TTGGCCACTGAGTATTTGGACAACTGCAACAATAAGC
ACTCACTCTATAATTCTTCCTGC		 A
7 BICF2P1508585 26 AAAAGTATTAAATGAACTGACATTTGTGAAGTGCAATTTACTATGTACTGG
ATAAGTCAC[A/C]ATTTATTAAGTTTATAAATACAAAATGCCTAATACTA
AATTCAAACAATATATTTCACAT		 A
8 BICF2G630198118 26 ATTTAAGACATGGAAGATTTTAATAAGACTTCCCTTCCCCTTCCTGGCTAG
AAAACATGG[A/C]TCCCAAATTGAGGAGGGAAGCCCTAAAAAAAGAACTT
TGTTGTTCCTGGAAAAACTCATG		 A
9 TIGRP2P169496_
rs8979930		 12 TCCCTTATGGAGCTAGTGACTCGGAGACGCTACATGCCGTCAAGAATTACA
AGACATGAC[A/T]CTGCTCAAATTCTGGGTGAGCAGAAGCAGAGTGGGAC
TTCAATGACACCAGCAACCTTTC		 A
10 BICF2P1163482 16 CCCTCCCCGCTAGGCGGCCTCCTCCACTGTTCTCAAGACTTTTAAGAAAAG
GAACATTAT[A/C]TTTCTGTGGTGGCTTGTTCATATTTTGAGTCCAGAAT
GAGCAGGGCCTGCAAGGAATGAG		 C
<개의 주인 친근성와 연관된 유전자형별 평균치와 표준오차 값>
번호 단일염기다형 이름 염색체 항목 유전자형-1 유전자형-2 유전자형-3
1 BICF2G6303508 39 변이(개체수) AA(4) AG(0) GG(46)
평균 3.00 1.65
표준오차 0.41 　 0.14
2 BICF2G6303463 39 변이(개체수) AA(4) AG(0) GG(46)
평균 3.00 1.65
표준오차 0.41 　 0.14
3 BICF2G6303301 39 변이(개체수) AA(46) AG(0) GG(4)
평균 1.65 3.00
표준오차 0.14 　 0.41
4 BICF2P618822 3 변이(개체수) AA(4) AC(26) CC(20)
평균 3.00 1.85 1.40
표준오차 0.41 0.21 0.15
5 BICF2P563532 3 변이(개체수) AA(37) AG(13) GG(0)
평균 1.97 1.15
표준오차 0.17 0.10 　
6 BICF2P1508594 26 변이(개체수) AA(18) AT(29) TT(3)
평균 2.22 1.55 1.00
표준오차 0.27 0.15 0.00
7 BICF2P1508585 26 변이(개체수) AA(18) AC(29) CC(3)
평균 2.22 1.55 1.00
표준오차 0.27 0.15 0.00
8 BICF2G630198118 26 변이(개체수) AA(12) AC(32) CC(6)
평균 2.08 1.78 1.00
표준오차 0.31 0.17 0.00
9 TIGRP2P169496_rs8979930 12 변이(개체수) AA(0) AT(10) TT(40)
평균 2.30 1.63
표준오차 0.37 0.14
10 BICF2P1163482 16 변이(개체수) AA(20) AC(18) CC(12)
평균 1.55 1.83 2.00
표준오차 0.17 0.26 0.33
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> SNP marker for prediction of dog's owner friendliness and prediction method using the same <130> 2019p-09-032 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BICF2G6303508 <220> <221> variation <222> (61) <223> n is A or G <400> 1 atcaaaataa gtttccacca gtaaggaaga aaagatgatg aacagattgg gtagatacct 60 ncccatgcct accatggcct aaagctaaca ggctcctacc cttttattaa gtgatcttca 120 t 121 <210> 2 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BICF2G6303463 <220> <221> variation <222> (61) <223> n is A or G <400> 2 gctagtagat ctactgtttc atactgtaca gaagattcga aagaagaaga gtaatgaccc 60 ngaccagaaa tcatattttc aagttaatac ctttacctgg ccaaccatca gtgaaatgca 120 a 121 <210> 3 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BICF2G6303301 <220> <221> variation <222> (61) <223> n is A or G <400> 3 tctcttattg gcctaataca gttcagctct cagttctcca taaatcccta atagaaagca 60 naagatccag tgtgaagtga aaagtgatgt ctagatttat tacctcctca aactgttgcc 120 a 121 <210> 4 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BICF2P618822 <220> <221> variation <222> (61) <223> n is A or C <400> 4 tttggcacag aagtgacagt gatcattgac ttctatgtga atatcaagts gttggcaata 60 natacgtaaa ctggagatca gaaacttagt gcagaaggtc aggtaggcat ctgtctttgc 120 t 121 <210> 5 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BICF2P563532 <220> <221> variation <222> (61) <223> n is A or G <400> 5 tttcaaaact atggaaataa tgcttytctt ggcaaaagtt cagataatct acacctgtgg 60 nctgtaaaag agcatgattt ctccagtaag gaataagggc ctgggtgaca ggagagcctc 120 a 121 <210> 6 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BICF2P1508594 <220> <221> variation <222> (61) <223> n is A or T <400> 6 ttcacatata tttttttttt tgaatttccc tatatatttt tagggttatt ttaatctgtt 60 nttggccact gagtatttgg acaactgcaa caataagcac tcactctata attcttcctg 120 c 121 <210> 7 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BICF2P1508585 <220> <221> variation <222> (61) <223> n is A or C <400> 7 aaaagtatta aatgaactga catttgtgaa gtgcaattta ctatgtactg gataagtcac 60 natttattaa gtttataaat acaaaatgcc taatactaaa ttcaaacaat atatttcaca 120 t 121 <210> 8 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BICF2G630198118 <220> <221> variation <222> (61) <223> n is A or C <400> 8 atttaagaca tggaagattt taataagact tcccttcccc ttcctggcta gaaaacatgg 60 ntcccaaatt gaggagggaa gccctaaaaa aagaactttg ttgttcctgg aaaaactcat 120 g 121 <210> 9 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIGRP2P169496_ <220> <221> variation <222> (61) <223> n is A or T <400> 9 tcccttatgg agctagtgac tcggagacgc tacatgccgt caagaattac aagacatgac 60 nctgctcaaa ttctgggtga gcagaagcag agtgggactt caatgacacc agcaaccttt 120 c 121 <210> 10 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BICF2P1163482 <220> <221> variation <222> (61) <223> n is A or C <400> 10 ccctccccgc taggcggcct cctccactgt tctcaagact tttaagaaaa ggaacattat 60 ntttctgtgg tggcttgttc atattttgag tccagaatga gcagggcctg caaggaatga 120 g 121

Claims (6)

  1. (a)서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP);
    (b)서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G인 SNP;
    (c)서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
    (d)서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C인 SNP;
    (e)서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G 또는 A인 SNP;
    (f)서열번호 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 T 또는 A인 SNP;
    (g)서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP;
    (h)서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP;
    (i)서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 T인 SNP; 및
    (j)서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C 또는 A인 SNP;
    를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 개의 주인 친근성 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SNP를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 개의 주인 친근성 예측용 조성물.
  3. 제1항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 개의 주인 친근성 예측용 키트.
  4. 제1항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 개의 주인 친근성 예측용 마이크로어레이.
  5. 1) 개로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1 내지 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및
    2) 상기 증폭된 SNP를 포함하는 부위에서 61번째 염기에 해당하는 SNP의 염기 종류를 결정하는 단계를 포함하는, 개의 주인 친근성 예측 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
    서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
    서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우;
    서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
    서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
    서열번호 6로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
    서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
    서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우;
    서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 및
    서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C인 경우;
    로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 해당하면 주인 친근성이 낮은 것으로 판단하는, 개의 주인 친근성 예측 방법.

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