KR101816605B1

KR101816605B1 - 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법

Info

Publication number: KR101816605B1
Application number: KR1020100110972A
Authority: KR
Inventors: 장길원; 김태헌; 이경태; 이승환; 최봉환; 박미림; 이현정
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2010-11-09
Filing date: 2010-11-09
Publication date: 2018-02-21
Also published as: KR20120049624A

Abstract

본 발명은 돼지의 육색에 관한 정보를 제공하고 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 돼지에서 핵산분자를 분리하여 이로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인하는 단계를 포함하는 돼지의 육질에 관한 정보를 제공하거나 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 돼지로부터 소량의 핵산분자만 획득하면 돼지의 육색에 관한 정보를 알 수 있고 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별할 수 있으며 특히 돼지를 죽이지 않고 육색에 관한 정보를 알 수 있으므로 우수한 육색 형질을 가지는 종돈을 선발 할 수 있다.

Description

육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법{Method for selecting pigs with excellent meat color trait}

본 발명은 돼지의 육색에 관한 정보를 제공하고 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 돼지에서 핵산분자를 분리하여 이로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인하는 단계를 포함하는 돼지의 육색에 관한 정보를 제공하거나 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법에 관한 것이다.

모든 생물의 게놈은 진화의 과정에서 자손의 서열에 변이체를 생기게 하는 자발적 돌연변이를 겪는다(Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55, 831-854, 1986). 변이체는 자손 형태에 비하여 진화적으로 이익 또는 불이익을 주거나 중성적일 수 있다.

어떤 경우는 변이체가 치사적 불이익을 주어 자손에게 전달되지 않는 경우도 있다. 다른 경우에는, 종에게 진화학적인 이익을 주고, 결국에는 종의 대부분에 DNA가 삽입되어 효과적으로 선조 형태가 된다. 많은 경우 이 선조 형태 및 변이체는 살아남아 종집단 중에 공존하게 된다. 서열의 복수 형태의 공존에 의하여, 다형(polymorphism)이 발생한다.

이러한 다형에는 RFLP(restriction fragment length polymorphism: 제한 단편 길이 다형), STR(short tandem repeats), SNP(single nucleotide polymorphism) 등이 알려져 있다. 이중 SNP(단일염기 다형성)는 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. SNP는 코딩 영역 서열에 발생하는 경우, 다형 형태 중 어느 하나에 의하여 결함 있거나 변이된 단백질이 발현될 수도 있다. 다른 경우에는 비코딩 영역 서열에 SNP가 발생할 수 있다. 이들 중 일부는 결함 있거나 변이된 단백질의 발현을 초래할 수 있다(예를 들면, 결함 있는 스플라이싱의 결과로서). 어떤 SNP는 표현형에 아무런 영향을 미치지 않을 수도 있다.

이들 SNP가 표현형에 영향을 미치는 경우, 상기 단일 염기 다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 표현형에 관한 정보를 제공하거나 우수한 표현형을 선별하는 데에 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 현재 여러 연구 기관에서 단일염기 분석 및 그 기능 분석에 관한 연구를 수행하고 있다.

식육의 품질은 최종적으로 소비자들에 의해 판정되며, 소비자들의 생활수준 향상에 따른 육류 소비량의 급증과 함께 최근에는 소비자들의 기호 또한 다양해지고 있다. 따라서 돼지 개량의 목표도 과거 육량 위주의 개량에서 고품질의 돈육 생산을 위한 육질개량으로 변화하고 있으며, 소비자들의 다양한 요구를 충족시킬 수 있는 육질의 개량이 현대 양돈산업에 있어서 중요한 경쟁력의 한 요인이 되고 있다.

육질에 영향을 미치는 요인들에는 연도, 보수성, 육색, 조직감, 사후pH의 변화, 전단력 등이 있으며, 이러한 대부분의 육질형질은 그 특성상 도축해야만 형질의 측정이 가능하기 때문에 표현형 성적을 얻기가 쉽지 않으며 경제적으로 많은 비용이 소요된다. 특히 우수한 형질의 종돈을 선발하기 위하여는 그 용도상 가축이 건강하게 살아있는 상태를 유지하며 형질에 관한 정보를 입수하여야 하므로 가축에 해를 입히지 아니하면서 가축의 형질에 관한 정보를 획득하는 수단이 필요하다.

이러한 수단의 하나로 형질에 관한 유전자 발굴 및 SNP와 형질과의 관련성에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 현재까지 몇몇 유전자 또는 표지인자가 양돈산업에 활용되고 있으나 그 활용 정도가 미비하다.

따라서 가축에 해를 입히지 아니하면서 가축의 형질에 관한 정보를 획득하는 수단으로 가축에 대한 다양한 형질에 대하여 그 형질과 관련이 깊은 SNP의 발굴이 필요하다.

본 발명자들은 우수 형질의 돼지를 종돈으로 선발하기 위하여 돼지의 여러 형질에 대한 정보를 얻는 방법에 관하여 연구하던 중 특정 SNP가 돼지의 육색과 관련이 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은

(a) 돼지의 핵산분자를 분리하는 단계 및

(b) 상기 분리된 돼지의 핵산분자로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인하는 단계를 포함하는 돼지의 육색에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은

(a) 돼지의 핵산분자를 분리하는 단계 및

(b) 상기 분리된 돼지의 핵산분자로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인하는 단계를 포함하는 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에서 각 61번째 뉴클레오티드를 포함하며 10 내지 120개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 칩(chip)을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

(a) 돼지의 핵산분자를 분리하는 단계 및

(b) 상기 분리된 돼지의 핵산분자로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인하는 단계를 포함하는 돼지의 육색에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 돼지의 핵산분자를 분리하는 단계 및

(b) 상기 분리된 돼지의 핵산분자로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인하는 단계를 포함하는 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에서 각 61번째 뉴클레오티드를 포함하며 10 내지 120개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 칩(chip)을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 (a) 돼지의 핵산분자를 분리하는 단계 및 (b) 상기 분리된 돼지의 핵산분자로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인하는 단계를 포함하는 돼지의 육색에 관한 정보를 제공하는 방법 및 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 돼지(Sus scrofa)에 적용되며, 식용으로 사용되는 모든 품종의 돼지를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 돼지는 한국재래돼지, 랜드레이스, 요크셔, 버크셔, 햄프셔 및 이들의 교잡 후대 일 수 있다. 바람직하게는 한국재래돼지와 랜드레이스 품종을 교잡하여 구축한 참조축군의 F2일 수 있다.

(a) 단계에서는 돼지로부터 돼지의 핵산분자를 분리한다.

본 발명의 핵산분자는 genomic DNA, cDNA 및 RNA 분자를 모두 포함하며, 핵산분자를 구성하는 뉴클레오티드는 자연계에 존재하는 일반적인 뉴클레오티드 및 당 또는 염기부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.

본 발명의 핵산분자는 돼지의 다양한 조직으로부터 얻을 수 있다. 핵산분자를 얻을 수 있는 조직은 이에 한정되지 아니하나 예를 들어 근육, 표피, 혈액, 뼈 또는 장기조직으로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 핵산분자를 돼지로부터 분리하는 것은 당업계에 공지된 방법을 통하여 분리할 수 있다.

예를 들어, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다.

(b) 단계에서는 상기 분리된 돼지의 핵산분자로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인한다.

서열번호 1 내지 6 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기 타입은 돼지의 육색 형질과 연관성이 높다.

본 발명자들은 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드가 돼지의 육색 형질과 연관성이 높다는 것은 본 발명자들이 최초로 밝혀낸 것이다.

육색은 고기의 빛깔을 말하며 일반적으로 소고기는 적색도를 중요시 하며, 돼지고기는 명도가 주된 판단 기준이 된다. 본 발명의 육색은 CIE(Commission Internationale d'clairage) Lab에서 명도를 나타내는 CIE-L 값으로 표시한다. CIE-L의 경우 +100(백색)∼0(회색)∼-100(흑색)의 범위를 가진다. 일반적으로 돼지고기의 CIE-L은 보통 47∼55 범위에 있는 것이 바람직하다. 일반적으로 돼지를 반도체 상태에서 등심부분을 채취하여 측정한다.

본 발명의 방법에 의하는 경우 이미 보유하고 있는 집단의 육색을 고려하여 집단의 육색을 바람직한 방향으로 조절할 수 있는 종돈의 선발이 가능하다.

본 발명의 일실시예에서는 돼지 551두의 DNA를 추출하여 본 발명의 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 조사하고 이를 해당 돼지의 육색 정보와 비교하여 그 연관성을 측정하고 염기 타입에 따른 육색의 변화를 수치화 하였다.

그 결과 하기 [표 1]에서 보는 바와 같이 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입은 육색과 관련이 있으며 그 타입에 따라 육색이 우수한 정도를 예측할 수 있음을 확인하였다.

서열번호 1 내지 6의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 육색 및 육질과의 관련성에 대한 정보

서열번호	61번째 뉴클레오티드의 가능한 염기타입	육색 및 육질과의 관련성	영향력 수치
1	A	+	0.79
	G	-
2	C	+	1.02
	T	-
3	T	+	1.01
	C	-
4	T	+	0.79
	C	-
5	G	+	1.04
	A	-
6	T	+	2.03
	C	-

상기 표에서 +는 해당 염기타입을 가지는 경우 육색이 -로 표시된 염기타입을 가지는 경우에 비하여 해당 영향력 수치만큼 우수해지는 것을 뜻한다.

예를 들어 서열번호 1의 경우 AA, AG, GG형에 대하여 유전자의 상가적 효과(additive effect)를 회귀분석하여 구한 것으로 상기 영향력 수치는 회귀방정식의 기울기에 해당한다.

따라서 본 발명의 방법에 따라 돼지의 핵산분자를 분리하여 상기 분리된 돼지의 핵산분자로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인하면 해당 돼지의 육색 형질이 (평균 돼지)에 비하여 우수한지 여부를 알 수 있으며, 육색은 고기의 육질과 밀접한 관계가 있으므로 결과적으로 돼지의 육색 및 육질에 관한 정보를 알 수 있다.

본 발명의 방법은 특히 돼지를 죽이지 않고 육색에 관한 정보를 알 수 있으며 우수한 육색 형질을 가지는 종돈을 선발 할 수 있다.

(b) 단계에서 뉴클레오티드의 염기 타입을 확인하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 의할 수 있다. 이에 제한되지는 아니하나 예를 들어 직접 DNA의 염기서열을 결정하거나(sequencing), TaqMan 어세이, 분자 비컨 어세이, 대립유전자-특이적 프라이머 연장(ASPE, allele-specific primer extension), 대립유전자-특이적 PCR(AS-PCR), APEX(arrayed primer extension), 상동성 프라이머 연장 어세이(homogeneous primer extension assays), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), RFLP(restriction-fragment length polymorphism), SBE-Tag어세이(single base extension-tag assay), 인베이더 어세이, L-RCA(ligation-rolling circle amplification) 또는 DNA 마이크로어레이(microarray) 등의 핵산 어레이 방법에 의하여 확인될 수 있다.

이와 같은 뉴클레오티드의 염기 타입을 확인하는 것을 SNP 유전자 타이핑(Single nucleotide polymorphism genotyping)이라고 하며, 이러한 SNP 유전자 타이핑 방법들은 Chen et al., “Single nucleotide polymorphism genotyping: biochemistry, protocol, cost and throughput”, Pharmacogenomics J. 2003;3(2):77-96; Kwok et al., “Detection of single nucleotide polymorphisms”, Curr Issues Mol. Biol. 2003 April;5(2):43-60; Shi, “Technologies for individual genotyping: detection of genetic polymorphisms in drug targets and endometriosis genes”, Am J Pharmacogenomics. 2002;2(3):197-205; and Kwok, “Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms" Annu Rev Genomes Hum Genet 2001;2:235-58에 설명되어 있다. 다량-처리 SNP 유전자 타이핑에 대한 예시는 Marnellos, “High-throughput SNP analysis for gene association studies”, Curr Opin Drug Discov Devel. 2003 May;6(3):317-21에서 설명하고 있다.

바람직하게는 본 발명의 뉴클레오티드의 염기 타입을 확인하는 방법은 DNA 마이크로어레이 일 수 있다.

상기 DNA 마이크로어레이 방법은 특정 뉴클레오티드의 염기 타입을 확인할 수 있도록 제작된 DNA 칩(DNA chip, 유전자 칩)에 시료인 핵산분자를 혼성화(hybridization)하여 혼성화 된 이중가닥의 형성을 검출하는 것이다.

따라서 본 발명의 (b) 단계의 염기타입을 확인하는 단계는 (i) 돼지의 핵산분자로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인할 수 있도록 제작된 DNA 칩(DNA chip)에 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산분자를 혼성화(hybridization)하는 단계 및 (ii) 혼성화된 이중 가닥의 형성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

DNA 칩이란 유리, 실리콘, 또는 나일론 등의 재질로 된 작은 고형의 기판 위에 프로브 역할을 할 수 있는 핵산들, 예컨대 그 서열이 알려진 DNA, DNA 단편, cDNA, 올리고뉴클레오티드 등의 핵산들을 적게는 수백 개부터 많게는 수십만 개까지 일정한 간격으로 배열하여 부착시킴으로써 시료 DNA에 포함된 뉴클레오티드의 염기타입을 탐지할 수 있는 생물학적 마이크로칩을 말한다. 시료에 함유되어 있는 핵산과 표면에 고정된 프로브는 염기 서열의 상보성 정도에 따라 각기 다른 정도로 결합하여 혼성화(hybridization) 상태를 이루게 되며, 이를 검출하고 해석함으로써 시료가 함유하는 핵산에 관한 정보를 동시에 얻을 수 있다.

DNA 마이크로어레이를 통한 분석에서, 본 발명의 DNA 칩은 확인 대상 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 상보적인 프로브를 하나 또는 둘 이상 포함한다. 상기 확인 대상 뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 6으로 표기되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드를 말한다.

프로브와 확인 대상 뉴클레오티드를 포함하는 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정한다. 상기 프로브는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 프로브는 최적의 혼성화를 위하여 단일가닥인 것이 바람작하다. 프로브는 바람직하게는 디옥시 리보뉴클레오티드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 확인 대상 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 서열목록 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드에 혼성화 될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 서열목록 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드에서 61번째 뉴클레오티드를 포함하며, 10 내지 120개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

혼성화(hybridization)이란 두 개 이상의 상보적인 염기 서열이 공유결합이 아닌 서열특이적 결합을 하여 하나의 하이브리드를 형성하는 것을 말한다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach , IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다.

상기 (ii) 단계의 혼성화된 이중 가닥의 형성을 검출은 DNA 마이크로어레이 방법에서 사용되는 공지의 검출방법이면 어떤 것이든 가능하며, 예를 들어 레이저 형광 유발법일 수 있다.

또한 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드에서 61번째 뉴클레오티드를 포함하며 10 내지 120개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩(DNA chip)을 제공한다.

본 발명의 DNA 칩 및 본 발명의 DNA 칩에 포함되는 폴리뉴클레오티드에 관한 것은 상기 기술한 바와 같다.

본 발명의 DNA 칩은 돼지의 육질, 특히 육색과 연관성이 높은 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드에서 61번째 뉴클레오티드를 포함하며 10 내지 120개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하므로 DNA 마이크로어레이 기법을 사용한 육질 및 육색이 우수한 돼지 선발에 사용할 수 있다.

따라서 이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 돼지의 육색에 관한 정보를 제공하고 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 돼지로부터 소량의 핵산분자만 획득하면 돼지의 육질에 관한 정보를 알 수 있고 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별할 수 있으며 특히 돼지를 죽이지 않고 육색에 관한 정보를 알 수 있으므로 우수한 육질 형질을 가지는 종돈을 선발 할 수 있다.

도 1은 돼지 1번 염색체 상의 육색과 연관성이 높은 SNP의 염색체상 위치 및 이들의 p-value를 나타낸 그래프이다.
도 2는은 돼지 16번 염색체 상의 육색과 연관성이 높은 SNP의 염색체상 위치 및 이들의 p-value를 나타낸 그래프이다.
도 3은 돼지 18번 염색체 상의 육색과 연관성이 높은 SNP의 염색체상 위치 및 이들의 p-value를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

유전자형 분석

육색 등 생산형질의 자료를 가지고 있는 돼지 551두의 혈액으로부터 Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 형질관련 유전자 발굴에는 참조축군(reference family)이 많이 활용되고 있다. 사용된 돼지는 한국재래돼지와 랜드레이스를 교잡하여 구축한 참조축군의 F2 개체이다. 측정은 돼지를 도축 후 반도체 상태에서 일반적으로 육질 분석에 사용되는 부위인 등심부분을 채취하여 사용하였다.

본 집단에서 조사된 육색은 가장 낮은 것이 34.65이며, 가장 높은 것이 67.07이다. 돼지고기는 CIE-L 값이 50에 근접할수록 육색이 우수함을 뜻한다.

상기 추출한 DNA를 대상으로 전체 62,163개의 SNP 정보로 구성되어 있는 iSelect Infinium Porcine ArrayChips(Illumina, San Diego, 미국)를 이용하여 SNP 유전자형 분석을 실시하였다.

분석은 Illumina 사의 Sentrix BeadChip Array 12-sample HD DNA Analysis BC PorcineSNP60(Cat.No. WG-410-1001)을 사용하여 키트의 사용자 매뉴얼에 따라 수행하였다. chip Scan은 Illumina 사의 iScan^TM System을 사용하여 수행하였다.

<실시예 2>

육색 관련 SNP 발굴 - 통계 분석

얻어진 모든 SNP자료는 R/SNPassoc 패키지를 이용하여 검정하였다. 검정을 통하여 하디-바인베르그 평형(HWE)과 minor allele의 빈도(MAF)가 일정 조건(HWE: P<0.05, MAF: <10%)에 맞지 않는 결과는 유전체전장(whole genome) 연관성 분석에서 배제하였다. 육색 표현형과 SNP 마커 사이의 연관성은 single marker regression분석으로 검정하였다.

육색 표현형에 대한 각 SNP 마커들의 상가적유전효과(additive effect)를 수학식 1과 같이 R-통계 패키지(R/assoc package)를 이용하여 유의적인 SNP를 선발하였다.

<수학식 1> y=Xb + Za + e

y는 도체시 성별과 연령이 포함된 고정효과(성과 연령같이 분석하는데 있어서 고정적으로 효과를 미치는 부분)에 대한 표현형 벡터를, X는 SNP에 대한 접속행렬(incidence matrix)을, b는 단일 SNP 유전자형에 대한 회귀계수 벡터를, Z는 animal 효과(개체간의 랜덤 효과)에 대한 접속행렬을, a는 개체효과에 대한 벡터를, e는 잔차에 대한 벡터를 의미한다.

<수학식 1>을 통하여 선발된 유의한 SNP 중 육색과 관련된 최적의 SNP조합을 찾기 위하여 1차로 선발된 유의한 모든 SNP를 수학식의 인자로 포함하는 multiple regression 분석을 ASReml프로그램으로 <수학식 2>에 따라 분석하였다.

<수학식 2> y=Xβ + Za + Zqi + e

y는 표현형 벡터, β는 고정효과에 대한 회귀계수, a는 랜덤 animal 효과, q는 수학식 1에서 검출된 유의한 모든 SNP(QTL), e는 랜덤 잔차 효과를 의미한다.

통계적 추론을 위하여 복합 가설검정에 대해 Benjamini와 Hochberg("Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing" Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological) 57 (1): 289300)가 제시한 false discovery rate(FDR)을 계산에 이용하였으며 모든 유의적 가치(value)는 5% chromosome-wise FDR 수준에서 계산되었다.

그 결과 [표 2]에서 보는 바와 같이 총 돼지 유전체상에 존재하는 62,163개의 SNPs 중 육색 형질에 유의성을 가지는 SNPs를 1번, 16번 18번 염색체에서 2개, 1개, 3개 씩 각각 발굴하였다(chromosome-wise P<0.05).

또한 발굴된 SNP의 변화와 육색 형질과의 관계를 수치로 측정한 결과, [표 3]에서 보는 바와 같이 육색 형질과 유의적인 관련이 있음을 확인하였다.

[표 3]의 estimate 값은 SNP가 minor 뉴클레오티드로 변하는 경우 변화하는 육색의 값이다.

[표 3]의 estimate 값(영향력 수치)은 각 개체들의 유전자형 분석을 통해 (예를 들어 서열번호 1의 경우) AA, AG, GG형에 대하여 유전자의 상가적 효과를 회귀분석하여 구한 것으로 회귀방정식의 기울기에 해당한다.

1번 염색체의 서얼번호 1에 표시된 SNP는 AA(두 개의 1번 상동 염색체의 해당 SNP가 모두 A)인 경우가 GG인 경우에 비하여 CIE-L 수치가 평균 0.79 가량 증가하는 것을 확인하였다.

1번 염색체의 서열번호 2에 표시된 SNP는 CC인 경우가 TT인 경우에 비하여 CIE-L 수치가 평균 1.02 가량 증가하며, 16번 염색체의 서열번호 3에 표시된 SNP는 TT인 경우가 CC인 경우에 비하여 1.01 가량 증가하며, 18번 염색체의 서열번호 4에 표시되는 SNP는 TT인 경우가 CC인 경우에 비하여 0.79 가량 증가하며, 18번 염색체의 서열번호 5에 표시되는 SNP는 GG인 경우가 AA인 경우에 비하여 1.04 가량 증가하며, 18번 염색체의 서열번호 6에 표시되는 SNP는 TT인 경우가 CC인 경우에 비하여 2.03 가량 CIE-L 수치가 증가하여 육색의 명도가 증가하는 것을 확인하였다.

이러한 유전자형은 육색을 예측하는데 활용이 가능하여 육색 형질이 우수한 종돈 선발을 위한 DNA marker로서 효과가 있을 것으로 판단된다.

각 SNP에 대한 염기서열 정보

서열번호	SNPs	염기서열
1	M1GA0000069	ATCCAACTCCGAAACTCTGAACACGTGAAGTACGTCTGATACTGTTGTAAATACTTGGTG[A/G]CACCGGCCCCCGCGGAGTTTAACGTTACCAAGACGCCCTTGTGGGCTTGAAGGACTTCTT
2	ASGA0003937	CAGAGGGAATGCTGTCTATCTGTTTAGAAGCTAAAAATTAAAGAGAGAATTAAATGAGTC[T/C]CACATAAATAGTATTTGGGGGAGAGTTTTTTAGTGTCTGCACTTAAAAACAAAAAACAAA
3	ASGA0072751	TCTCTTCTTAGGACATTTTACACCTGTTCACTTTCCCCACAGCCTGGGACGTTGTAGCTC[T/C]CTCTCCGTCCTAAACTAACCATTGTCTTTACACATCTCTTTTCTATGAAGTCTCCTGTGC
4	ALGA0116114	NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTGCAAGGCCCTGTCTGTCTG[T/C]CATGAGATGGGGAAGTGTCATCTTCTAGTGTGCCAGAAAGCCGAGGAGACCAGACGACGG
5	DIAS0004239	GGATCTGTTTGACCAATTTGCACCGGTTTTATCCTTAATGATGGATTTAACAGCATGACA[A/G]AAATTATTATTTTTTTGTTCTTAATGGAGATTAAGATGCCTTGAATTGTCTAAGGTGTTG
6	H3GA0051149	CCTCCCATCGCCCGTCCCAGTATTCATCCCACTGTGAATGACTGCTGCATCTTTTACCGT[T/C]TTTTGGTCTTTTTAGGGCCACACCCATGGCATATGGAGGTTCCCAGGCTGGGGGTCCAAT

상기 [표 1]에서 [ / ] 안에 표시는 염기가 상호치환 되는 SNP을 표시한다. 예를 들어 [A/G]는 A가 G로 치환 되는 것을 말하며, 하기 [표 3]의 estimate값은 이러한 치환이 일어나는 경우 변화하는 육색(CIE-L 값)의 변화를 수치화 한 것이다.

돼지 육색과 연관성이 있는 SNP의 정보

SNPs	Chr	Pos	estimates	p-value	R2
M1GA0000069	1	382854	0.789354	7.60E-09	0.95
ASGA0003937	1	99375008	-1.02291	9.08E-07	0.95
ASGA0072751	16	22495462	1.00802	1.64E-06	0.95
ALGA0116114	18	12975360	0.785558	0.00055	0.95
DIAS0004239	18	37358166	-1.04431	8.10E-06	0.95
H3GA0051149	18	49174649	2.02928	0.00066	0.95

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 돼지의 육색에 관한 정보를 제공하고 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 돼지로부터 소량의 핵산분자만 획득하면 돼지의 육질에 관한 정보를 알 수 있고 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별할 수 있으며 특히 돼지를 죽이지 않고 육색에 관한 정보를 알 수 있으므로 우수한 육질 형질을 가지는 종돈을 선발 할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Method for selecting pigs with excellent shear force trait <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 atccaactcc gaaactctga acacgtgaag tacgtctgat actgttgtaa atacttggtg 60 rcaccggccc ccgcggagtt taacgttacc aagacgccct tgtgggcttg aaggacttct 120 t 121 <210> 2 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 2 cagagggaat gctgtctatc tgtttagaag ctaaaaatta aagagagaat taaatgagtc 60 ycacataaat agtatttggg ggagagtttt ttagtgtctg cacttaaaaa caaaaaacaa 120 a 121 <210> 3 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 3 tctcttctta ggacatttta cacctgttca ctttccccac agcctgggac gttgtagctc 60 yctctccgtc ctaaactaac cattgtcttt acacatctct tttctatgaa gtctcctgtg 120 c 121 <210> 4 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 4 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc tgcaaggccc tgtctgtctg 60 ycatgagatg gggaagtgtc atcttctagt gtgccagaaa gccgaggaga ccagacgacg 120 g 121 <210> 5 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 5 ggatctgttt gaccaatttg caccggtttt atccttaatg atggatttaa cagcatgaca 60 raaattatta tttttttgtt cttaatggag attaagatgc cttgaattgt ctaaggtgtt 120 g 121 <210> 6 <211> 121 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 6 cctcccatcg cccgtcccag tattcatccc actgtgaatg actgctgcat cttttaccgt 60 yttttggtct ttttagggcc acacccatgg catatggagg ttcccaggct gggggtccaa 120 t 121

Claims

(a) 돼지의 핵산분자를 분리하는 단계 및
(b) 상기 분리된 돼지의 핵산분자로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인하는 단계를 포함하는 돼지의 육색에 관한 정보를 제공하는 방법.
(a) 돼지의 핵산분자를 분리하는 단계 및
(b) 상기 분리된 돼지의 핵산분자로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인하는 단계를 포함하는 CIE-L값이 47 내지 55 범위인 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (b) 단계의 염기타입을 확인하는 단계는
(i) 돼지의 핵산분자로부터 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 뉴클레오티드의 염기타입을 확인할 수 있도록 제작된 DNA 칩(DNA chip)에 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산분자를 혼성화(hybridization)하는 단계 및
(ii) 혼성화된 이중 가닥의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, DNA 칩(DNA chip)은 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 폴리뉴클레오티드에서 61번째 뉴클레오티드를 포함하며 10 내지 120개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제