JP4776841B2 - 脈管形成分野におけるＫｒｉｔ１遺伝子の使用 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明はＫｒｉｔ１遺伝子における突然変異を検出するための海綿血管腫(cavernous angiomas or cavernomas)の診断方法に関する。詳しくはこの検出は本発明の対象でもあるヌクレオチド配列を用いて行われる。本発明はまた、前脈管形成または抗脈管形成の分野において治療を目的とするＫｒｉｔ１遺伝子の総てまたは一部の使用に関する。
【０００２】
海面血管腫とは最も一般的には中枢神経系に、また網膜、肝臓、腎臓などにも存在する血管形成異常であり、脳実質の関与なく異常に拡張した毛管腔を特徴とする(Russell et al.)。臨床症状としては頭痛、出血、癲癇発作、および局部神経性欠損症が含まれる。一般集団では海面血管腫の罹患率は０．５％近くである(Otten et al.)。これらの血管腫は５０％近くの症例において常染色体優性型で遺伝的に受け継がれる(Rigamonti et al.)。 脳海綿状形成異常（ＣＣＭ）に関する３つの遺伝子座が第７染色体の長腕、第７染色体の短腕および第３染色体の長腕（それぞれ７ｑ、７ｐおよび３ｑ）で同定されている。ラテンアメリカ系集団で著しい創立者効果（founder effect）が見られており、総ての家系が７ｑ上に位置するＣＣＭ１座と結びついていた(Rigamonti et al.; Dubovsky et al.; Gunel et al.;およびCraig et al.)。
【０００３】
発明者らは最近、５７のフランス系家系において海面血管腫の遺伝学的・臨床的特徴および遺伝的特徴を確立した(Labauge et al.)。神経画像の研究から遺伝性海面血管腫中の高頻度の多病巣が確認された。また、病巣数と患者の年齢の間には極めて有意な相関も示され、このことは過誤腫とも呼ばれるこれらの血管形成異常の動的性質を強く示唆する。これらの家系のうち３６家系で行った遺伝子連鎖解析では、それらの６５％がＣＣＭ１座と連鎖しており、創立者効果はないことが示された(Laberge et al.)。
【０００４】
１９９５年、ＣＣＭ１座を含む遺伝子間隔は４センチモルガンに縮まり、ＣＣＭ１座はＤ７Ｓ２４１０とＤ７Ｓ６８９にフランクされていた(Johnson et al.)。発明者らは実質的にin silico的アプローチを用い、ＣＣＭ１の物理・転写マップを確立した。必須領域内にマッピングされた５３の転写単位のうち１つは、その産物が細胞増殖、分化および形態形成に関与するＲａｓ遺伝子系のメンバーであるＲａｐ１Ａ（Ｋｒｅｖ１とも呼ばれる）と相互作用する遺伝子Ｋｒｉｔ１に相当していた(Bos et al.)。発明者らはＳＳＣＰ法と配列決定法を併用して、関連のない８種のＣＣＭ１系において、末端切断型Ｋｒｉｔ１タンパク質をもたらす可能性が極めて高い突然変異を同定した。これらの突然変異と罹患表現型とが同時に分離することは、Ｋｒｉｔ１がＣＣＭ１座と連鎖した海面血管種を罹患する家系において変異したタンパク質であることを強く示唆し、さらにＲａｐ１Ａシグナル伝達経路が血管形成および／または脈管形成に関与することを示唆するものである。
【０００５】
発明者らはこれまでに公開されているＹＡＣコンティグおよび公開配列データベース（ワシントン大学第７染色体プロジェクト）を用い、１６００Ｋｂと見積もられる、ＣＣＭ１領域の９０％にわたるＢＡＣ／ＰＡＣコンティグを構築した（図１）。観察に基づいてＣＣＭ１座と連鎖する確率が９０％を超えることがこれまでに示されている、情報が得られそうな１７９の減数分裂を含む２０系統を用い、ＢＡＣ／ＰＡＣ配列を用いて同定される多型マーカーを有するこの遺伝子座を最終的にマッピングした（図１）。罹患個体において見られた組換え結果(Labauge et al.によれば２７系統)により発明者らはこの間隔を若干縮めることとなり、現在ではこれはＭ２４５６（動原体限界）とＤ７Ｓ６８９（テロメア限界）にフランクされている。ヒトゲノム遺伝地図、ＵｎｉｇｅｎｅおよびｄＢＥＳＴなどの公開データベースのスクリーニングから、発明者らはこの間に５７４発現配列タグ（ＥＳＴＳ）をマッピングすることができ、これらは次ぎにすでに知られている６つの遺伝子：ＣＤＫ６、ＨＵＭＩ．Ｄ１４、ＫＲＩＴ１、ＰＥＸ−１．ｍＭＴＥＲＦおよびＹｏｔｉａｏを含んでなる５３の推定転写単位に再分類された。
【０００６】
Ｋｒｉｔ１は、Ｒａｓ遺伝子系のメンバーＲａｐ１Ａ／Ｋｒｅｖ１と相互作用するタンパク質を同定しようとするスクリーニングの際に、同定された(Serebriiski et al.)。それは４つのアンキリンドメインを含んで、そのカルボキシ末端領域によってＲａｐ１Ａ／Ｋｒｅｖ１と相互作用する５２９個のアミノ酸をコードしている。Ｋｒｉｔ１メッセンジャーＲＮＡは脳をはじめとする多くの組織において低レベルで発現することがすでに示されている。Ｋｒｉｔ１の厳密な機能はなお分かっていないが、発明者らはいくつかの理由からＣＣＭ１の確かな候補遺伝子であると考えた。Ｒａｐ１Ａ／Ｋｒｅｖ１ＡはショウジョウバエのＲａｓ相同体であるＤｒａｓ３とのその相同性を基に、またＫ−ｒａｓで形質転換した繊維芽細胞のその分裂阻害活性を基に同定された(Pizon et al., 1988/Kitayama et al., 1989)。in vitroで見られたこの分裂阻害作用の生理学的関連性はin vivoではまだ確立されていないが、これはＲａｓアンタゴニストと考えられるこのタンパク質をもたらした。血管形成および脈管形成におけるＲａｓシグナル伝達経路に関する役割が、この経路に関与するタンパク質、例えばｒａｆまたはＧＡＰ１２０タンパク質に関してノックアウトされたネズミモデルで見られた血管異常によって強く示唆されている(Henkemeyer et al., 1995; Wojnowski et al., 1997)。推定されるこのＲａｓアンタゴニストとしての役割に加え、Ｒａｐ１Ａ／Ｋｒｅｖ１は細胞の分化および形態形成に関連づけられている(Asha et al., 1999; Quarck et al., 1996; Pizon et al., 1988)。
【０００７】
言い換えれば、末端切断型Ｋｒｉｔ１タンパク質が内皮細胞の増殖によって達成される脈管形成の異常を生じるとすれば、Ｋｒｉｔ１遺伝子は脈管形成の制御において役割を持つと推測するのが理に適っている。
【０００８】
このように本発明において、発明者らは末端切断型Ｋｒｉｔ１タンパク質を生じ得るＫｒｉｔ１遺伝子の突然変異は血管異常の発生の一因であることを示した。これらの血管異常は脳および皮膚をはじめとする様々な領域に影響を与え、様々な形態をとり得る（海面血管腫、網静脈血管種）。見られる突然変異の性質（タンパク質の末端切断をもたらす突然変異）と組み合わさって、見られる病巣のタイプは（異常血管疾患の発症）は、このタンパク質が脈管形成に対して制御を発揮し、脈管形成阻害の分野、特に腫瘍分野で治療的に使用できることを強く示唆している。
【０００９】
この間隔に位置するＢＡＣの１つであるＢＡＣ ＡＣ００００２０を含むＫｒｉｔ１ ｃＤＮＡのアライメントにより、発明者らはＫｒｉｔ１のゲノム構造を決定することができた。この遺伝子は総てＢＡＣ ＡＣ００００２０に含まれる１２のエキソンによってコードされている。発明者らはこれらエキソンの増幅を意図したイントロンオリゴヌクレオチドプライマー（表１）および連結配列（表２）を示した。これらのプライマーは、Ｋｒｉｔ１はＡとＴが豊富であって、Ｋｒｉｔ１に極めて特異的であることから特に巧妙に開発されたものである。このように、本発明の主題は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列である。
【００１０】
このプライマーによって発明者らはエキソンを総て増幅することができた。ＨＯＭＯＧ解析によって観察に基づいてＣＣＭ１座と連鎖している確率が９０％を超えることが示された家系に属する２０人の関連のないＣＣＭ患者群により、４つの異なる条件下の一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）タイプのアプローチと配列決定法とを組み合わせた解析を用いて突然変異がスクリーニングできるようになった。
【００１１】
これらの患者のうち８人の増幅産物は、５０人の対照患者のいずれにも見られなかった異常なコンホメーション変異が示された。これらの増幅物の配列を解析したところ、これら８人の患者で異型接合性の突然変異が明らかとなった（表３および図３）。これら８人の患者ではこれらの突然変異は罹患表現型とともに分離した。
【００１２】
本発明の主題はまた、生物学的サンプルからＫｒｉｔ１遺伝子における突然変異、好ましくは上記で定義された血管異常の発生に関連した突然変異の存在を検出するための、上記で定義された少なくとの１つのヌクレオチド配列を使用することである。好ましくは生物学的サンプルは血液である。
【００１３】
さらに詳しくは系統６はエキソン１０のヌクレオチド１３４２においてＡの欠失を示す。この欠失はリーディングフレームに、従って早期停止コドンに変異をもたらす。系統１０では、エキソン１０のヌクレオチド１２８３におけるＣからＴへの置換がグルタミンから停止コドンへの置換をもたらす。系統５８では、それ自身、ここでもエキソン１０においてヌクレオチド１２７１の後にＣの挿入を示し、これはリーディングフレームにおける変異と早期停止コドンをもたらす。系統４１はエキソン５においてトリプトファンから早期停止コドンへの置換をもたらすヌクレオチド６１５におけるＧからＡへの置換を示す。系統４２はエキソン６における４ｂｐの欠失（ヌクレオチド６８１〜６８４）を示し、これは早期停止コドンを形成する。系統３５はエキソン８において２６ｂｐの欠失（ヌクレオチド１０１２〜１０３７）を示し、この欠失はコドン３３２におけるリーディングフレームにおける変異と早期停止コドンをもたらす。系統１８はエキソン２においてヌクレオチド２４７の後にＣの挿入を示し、この挿入はリーディングフレームにおける変異と早期停止コドンをもたらす。系統１９はヌクレオチド２６１においてＧからＡへの置換を示し、この置換はリーディングフレームにおける変異とここでもコドン７９における早期停止コドンをもたらす。
【００１４】
罹患型または非罹患型メンバーのＳＳＣＰ解析では、これら８系統のそれぞれにおいてその突然変異が罹患表現型と完全にともに分離することが示された（図３）。
【００１５】
このように本発明のヌクレオチドは、Ｋｒｉｔ１遺伝子の少なくとも１つのエキソンにおいて突然変異を検出するのに用いられる。さらに詳しくは、これらのヌクレオチド配列は以下の割り当て：
エキソン１については配列番号１／配列番号２、
エキソン２については配列番号３／配列番号４、
エキソン３については配列番号５／配列番号６、
エキソン４については配列番号７／配列番号８、
エキソン５については配列番号９／配列番号１０、
エキソン６については配列番号１１／配列番号１２
エキソン７については配列番号１３／配列番号１４、
エキソン８については配列番号１５／配列番号１６、
エキソン９については配列番号１７／配列番号１８、
エキソン１０については配列番号１９／配列番号２０、
エキソン１０については配列番号２１／配列番号２２
エキソン１１については配列番号２３／配列番号２４、
エキソン１２については配列番号２５／配列番号２６、
エキソン１２については配列番号２７／配列番号２８
に従い、一つのエキソンに特異的なものとなるように対で使用すればよい。
【００１６】
Ｋｒｉｔ１における突然変異の検出は、エキソンを増幅して、そこで突然変異を探すことで行うのが有利であるが、この増幅はＰＣＲまたはＰＣＲ様増幅法によって行えばよい。
【００１７】
これらの突然変異の末端切断性、健常な対照にはそれらがないこと、およびそれらが罹患表現型とともに分離することは、それらがこれらの系統で有害な突然変異であることを強く示唆している。
【００１８】
発明者らは試験した２０系統のうち１２系統では異常なＳＳＣＰコンホメーション変異を検出できなかった。このことを説明するためにはいくつかの仮説が提案される。ここでのケースがそうであるように、ＳＳＣＰはいくつかのタイプの条件を用いたとしても１００％の感受性があるわけではない。興味深いことに、これらの異常なコンホメーション変異はいずれも、グリセロールを用いずに２０℃で行った最初のスクリーニングでは認められなかった。さらに、このアプローチを用いて、プライマーとハイブリダイズする配列を含む領域を取り去るような欠失を検出することはできなかった。最後に、これらの系統のいくつかはＣＣＭ１座と連鎖している高い可能性を示すが、実際には他のＣＣＭ座の１つと連鎖しているかもしれない。
【００１９】
本発明の主題はまた、個体における血管異常を遺伝子型的に診断する方法であって、個体から生物学的サンプルをとり、Ｋｒｉｔ１遺伝子における突然変異の存在をそのサンプルに存在する核酸配列を解析することにより検出することを含んでなり、かかる突然変異が血管異常の発生と連鎖している。解析される核酸配列は独立して、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡであってよい。この解析はハイブリダイゼーション、配列決定、または電気泳動、特にＳＳＣＰもしくはＤＧＧＥ（変性勾配ゲル電気泳動）によって行ってよい。これらの突然変異の検出はまた、末端切断型タンパク質の存在を直接検出できる方法論、例えば「プロテイン・トランケーション・テスト」法（in vitroにおいてｃＤＮＡ逆転写物を翻訳し、次ぎに抗体を用いるか、または標識アミノ酸を用いてタンパク質を標識した後にタンパク質を検出する）を用いて行ってもよい。最後に、突然変異の探索は全ＲＮＡから（特にＥＢＶウイルスで形質転換した細胞由来のもの、我々はその細胞でＫｒｉｔ１転写物の発現を示した）調製したｃＤＮＡ逆転写物を直接解析することによって行ってもよい。
【００２０】
Ｋｒｉｔ１遺伝子に相当する核酸配列の総てまたは一部を突然変異の存在を検出するに先立って増幅することが有利であり、この増幅はＰＣＲまたはＰＣＲ様増幅によって行うことができる。もっぱら好ましくは、この増幅は本発明の核酸配列から選択される、例えば上記分布にに従って使用するプライマーを用いて行えばよい。
【００２１】
従ってこれらの突然変異をどう理解するかという主要な問題が、海面血管種につながり得ることとなった。血管の形成異常または過誤腫と考えられるこれらの病巣の性質については実際のところほとんど分かっていない。胎生期においてこれらの形成異常がいつ現れるかは完全には分からないことは明らかであろう。さらに、ある場合、特に家族性の場合にはこれらの過誤腫の進行性の進展が記載されており、これらの病巣が脈管形成に関与する因子および／または受容体を発現し得ることが示唆されている(Rothbart et al., 1996; Notelet et al., 1997)。
【００２２】
発明者らが検討した４系統において(Labauge et al., 1999)、皮膚形成異常（血管種とも呼ばれる）は脳海面血管種とともに分離し得ることを指摘しておくべきであろう。
【００２３】
本明細書で報告した突然変異は総て、それらが末端切断型であったとすれば、Ｒａｐ１Ａ／Ｋｒｅｖ１と相互作用する領域の欠失した末端切断型Ｋｒｉｔ１タンパク質を産生する。
【００２４】
Ｒａｐ１Ａ／Ｋｒｅｖ１の厳密な機能は完全には解明されていない。このＲａｓ ＧＴＰアーゼ系のメンバーは特に好中球、血小板および脳で偏在発現し、エインドサイトーシス／リソソームコンパートメントに存在する。Ｒａｐ１ＡはＢ−Ｒａｆと相互作用することが示されており、全く興味深いことにＢ−Ｒａｆ欠損マウスで見られる旺盛な内皮細胞アポトーシスを示す(Wojnowski et al., 1997)。最近、酵母およびショウジョウバエなどの下等真核生物におけるin vivo研究から、分化および形態形成におけるＲａｐ１Ａの機能を考えるいくつかの示唆が得られた(Asha et al.)。
【００２５】
Ｋｒｉｔ１およびＲａｐ１Ａの相互作用は、Ｋｒｉｔ１がＲａｐ１Ａを調節するか、またはＲａｐ１Ａのエフェクターであるかのいずれかであり得ることを示唆するものである(Bos et al.)。本明細書で報告した突然変異はドミナントネガティブ効果によるものであるか、または機能欠損によるものであるかのいずれかであり得る。Ｋｒｉｔ１の完全な欠失を示す系統を調べると、この仮説を支持する強い証拠となろう。さらに、散発型の海面血管種がそれ自体主として単一病巣として現れ、家族性型がそれ自体多病巣を示さないという事実は、これらの病巣が「Knudsonダブルヒット」の法則(Knudson 1971)に従い、Ｋｒｉｔ１機能の完全な欠損が海面血管種の発生に必要であり得ることを強く示唆している。
【００２６】
言い換えれば、優性型のこの疾病において、異型接合状態の生物の細胞総てに存在する第１の突然変異が存在する。海面血管種病巣の発生はこの遺伝子のもう一方の対立遺伝子に作用する第２の突然変異（この突然変異は体細胞に生じる）の発生によって条件付けられると考えられる。これまでに最も研究されている散発型では、個体は胚の突然変異を全く示さず、その単一病巣は同じ細胞で生じた２つの突然変異によるものと考えられる。
【００２７】
しかし、上記以外の散発型海面血管種も存在すると考えられる。発明者らは実際にそれ自体多病巣として現れる散発型を実証し、それはおそらくは罹患した患者の親のうち一方の胚細胞におけるＫｒｉｔ１遺伝子のde nove変異によるものである（データは示されていない）。
【００２８】
要するに、本明細書で報告したデータは、Ｋｒｉｔ１の末端切断型突然変異がＣＣＭ１系で、またある種の散発型でも見られる脳海面血管種の発生の一因であることを強く示唆しており、これらのメカニズムにおけるＲａｐ１Ａシグナル伝達経路の推定される役割を強調するものである。
【００２９】
本発明で考えられる治療適用には、種々の形態の血管形成異常、血管異形成、血管種および／または異常な脈管形成が存在するいずれの状態もが挙げられる。
【００３０】
このように本発明の主題はまた、医薬品を製造するためのＫｒｉｔ１遺伝子もしくはこの遺伝子由来の配列の使用、または特にＫｒｉｔ１遺伝子もしくはこの遺伝子由来の配列のin situ過剰発現によって脈管形成を制御または阻害することを意図した遺伝子治療タイプのアプローチにおけるその使用である。
【００３１】
「この遺伝子由来の配列」とは、正常型もしくは変異型配列のいずれも、または全機能対照配列と同様およびそれに匹敵する活性を示す、Ｋｒｉｔ１遺伝子の配列の一部を意味するものとする。
【００３２】
本発明の主題はまた、Ｋｒｉｔ１遺伝子配列またはこの遺伝子由来の配列（この由来配列は上記で定義）を含んでなり、好適な宿主細胞で発現させるためのベクターである。異常な脈管形成を抑制することを目的とする場合、注目される対象となる配列を過剰発現させるのが有利であり、このことから本発明のベクターはこの過剰発現に必要とされるエレメントを含むのが有利である。
【００３３】
特に本発明のベクターは遺伝子治療を意図してもよく、その作用部位を限定することを目的とする場合、このベクターは組織特異的ターゲッティングおよび／またはそれが含む配列の発現のための配列を含めばよい。
【００３４】
最後に、本発明の主題は、例えば末端切断型タンパク質を置換し、欠損を補足するための、有効成分として正常型または改変型Ｋｒｉｔ１タンパク質の総てまたは一部を含んでなる治療組成物である。またこの有効成分は上記のようなベクターであってもよい。
【００３５】
図１はＣＣＭ１座の遺伝・物理・転写地図を示す。
【００３６】
図１ａはＣＣＭ１座の遺伝地図を示す。この遺伝子座はこれまでにＤ７Ｓ２４１０〜Ｄ７Ｓ６８９間で定義されてきた。短縮されたＭＳ２４５６〜Ｄ７Ｓ６８９遺伝子間は水平な角括弧で示されている。すでに公開されているマイクロサテライトは四角で囲んである。新規のマイクロサテライトは太字で示されている。ＳＴＳもいくつか示されている。ＳＴＳ ｓＷＳＳ １７０３はＫｒｉｔ１のヌクレオチド３９３〜６５８に相当する。垂直な各括弧の間のマーカーは１ｋｂ以上は離れていない。
【００３７】
図１ｂはＣＣＭ１座の物理・転写地図を示す。ＢＡＣコンティグはＣＣＭ１間にわたって分布している。ＢＡＣ ＡＣ０００１２０は最も太いラインで示されている。ＳＴＳまたはマイクロサテライトマーカーいずれかとの重複は小さな垂直バーで示されている。黒い矢印はＫｒｉｔ１に相当し、白い矢印は十分同定されているヒト遺伝子に相当し、白抜きの矢印は他種由来の遺伝子（ヒトでは同定されていない）と強い相同性を示す遺伝子に相当する。
【００３８】
図２はコンホメーション変異と罹患表現型とが８系統間でともに分離することを示している（ＳＳＣＰ）。
【００３９】
白抜きの記号は脳のＭＲＩ検査が正常である個体を表し、半分が黒い記号はＭＲＩ検査では海面血管種を示す無症候性患者に相当し、黒い記号はＭＲＩ検査で海面血管種を示す症候性患者に相当し、「？」は状態が不明な個体に相当し、「＼」は罹患患者に相当する。罹患患者または状態が不明な患者は突然変異に関して試験しなかったが、家族性の構造を明らかにするという点から表している。異常なバンドは矢印で示されている。
【００４０】
図３はＫｒｉｔ１変異を表す。
【００４１】
図３ａはＫｒｉｔ１遺伝子およびその対応する推定タンパク質の構造を示している。「ｎｓ」はナンセンスを表し、「ｄｅｌ」は欠失を表し、「ｉｎｓ」は挿入を表す。挿入については、ヌクレオチド番号はその挿入の前のヌクレオチドに当たる。「Ｋｒｅｖ相互作用領域」とは、酵母における二重ハイブリッド試験の際にその欠失がＫｒｅｖとの相互作用を損なう領域（アミノ酸４８３〜５９２）に相当する。
【００４２】
図３ｂは上記の８系統で確認されたＫｒｉｔ１変異を示す。矢印は変異部位を示す。ＷＴは野生型配列を表し、ＭＴは変異型配列を示す。系統４２において、示されたクロマトグラムおよび配列はネガティブ鎖に相当し、ポジティブ鎖は正常配列と異常配列が完全に重なることを示し、欠失の開始部位を十分視覚化することはできなかった。
【００４３】
【実施例】
材料および方法
患者
遺伝様式で海面血管種を示すことが知られている家系に属する関連のない２０人の患者から自由意志で本研究に参加することに同意を得た(Labauge et al.)。
【００４４】
ＨＯＭＯＧ試験を用いてこの家系パネルを解析したところ、これらの家系が観察に基づいてＣＣＭ１座と連鎖する確率が９０％を超えていることが示された。
【００４５】
分子生物学と生物情報科学を組み合わせたアプローチを用いてＣＣＭ１座の物理・転写マップを作製した。これまでにJohnson et al. (1995)によって公開されているＹＡＣコンティグのバリデーションの後、筆者らはＰＣＲにより、in silicoアプローチを用いてこの領域に５７４ＥＳＴ（発現配列タグ）を位置づけ、それらは５３のグループへと分類した。
【００４６】
遺伝距離の短縮
Ｄ７Ｓ２４１０−Ｄ７Ｓ６８９間の１２の多型マイクロサテライトマーカーを連鎖解析のために選択した。それらのうちＤ７Ｓ２４１０、Ｄ７Ｓ２４０９、Ｄ７Ｓ１８１３、Ｄ７Ｓ１７８９、Ｄ７Ｓ６４６、Ｄ７Ｓ６８９およびＤ７Ｓ５５８の７つは従来公知のものであり、いくつかのチームによって用いられたものである(Gunel et al. in Neurosurgery, Craig et al., Labauge et al., Laberge et al.)。残りのものＭＳ６５、ＭＳ２４５３Ａ、ＭＳ２４５６Ａ、ＭＳ１１９およびＭＳ１２０は発明者らにより、この領域にマッピングされたＢＡＣの配列データベースを基にして同定されたものである。
【００４７】
突然変異の検出および同定
Ｋｒｉｔ１ ｃＤＮＡおよびＢＡＣ ＡＣ ０００００１２０の配列の比較を基にして発明者らはゲノムＤＮＡを用いてＫｒｉｔ１の１２のエキソンおよびエキソン／イントロン連結部位を増幅するために１４セットのプライマーを決定した。ＰＣＲ反応は以下のように行った：９４℃（４分）の最初の初期変性ステップの後、９４℃（１５秒）、４５℃から５５℃の間の至適ハイブリダイゼーション温度（１５秒）および７２℃（１５秒）からなる３０回の増幅、次いで７２℃（１０分）の最終伸張ステップ。ＰＣＲ産物は、３５ｍＡの一定電流条件下で用いるMighty Small II装置(Pharmacia-Biogen)にて４タイプの条件（４℃および２０℃にてグリセロールを含むまたは含まない１０％アクリルアミド）下で電気泳動にかけた。コンホメーション変異は銀で検出した（Silver Stain Plus kit, Biorad)。典型的でないＳＳＣＰバンドパターンを示す増幅物を配列決定した(AB1377, Perkin Elmer)。配列決定の際に検出された突然変異は総てＳＳＣＰアプローチを用いて、罹患表現型とともに分離するかどうか試験した。
【００４８】
【表１】

【表２】

【表３】

参照文献
【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【図面の簡単な説明】
【図１】 ＣＣＭ１座の遺伝・物理・転写地図を示す図である。図１ａはＣＣＭ１座の遺伝地図を示し、図１ｂはＣＣＭ１座の物理・転写地図を示す。
【図２】 コンホメーション変異と罹患表現型とが８系統間でともに分離することを示す図である（ＳＳＣＰ）。
【図３】 Ｋｒｉｔ１変異を表す図である。図３ａはＫｒｉｔ１遺伝子およびその対応する推定タンパク質の構造を示し、図３ｂは上記の８系統で確認されたＫｒｉｔ１変異を示す。
【配列表】

Claims (9)

1. 個体における海綿血管腫の発生と連鎖する遺伝子型を検出する方法であって、Ｋｒｉｔ１遺伝子における突然変異の存在を該個体からの生物学的サンプルに存在する核酸配列を解析することにより検出し、ここで該解析がＫｒｉｔ１タンパク質のＣ末端の短縮を検出することを目的とする方法によって行われ、該突然変異が海綿血管腫の発生と連鎖しているものであることを特徴とする、方法。
2. 核酸配列がゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
3. 解析がハイブリダイゼーションによって行われる、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
4. 解析が配列決定によって行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 解析が電気泳動、特にはＳＳＣＰまたはＤＧＧＥによって行われる、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
6. 突然変異の存在を検出するのに先立ってＫｒｉｔ１遺伝子に相当する核酸配列の総てまたは一部が増幅される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 増幅がＰＣＲまたはＰＣＲ様増幅によって行われる、請求項６に記載の方法。
8. 増幅を行うためのプライマーが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８からなる群から選択されるものである、請求項７に記載の方法。
9. 増幅を行うためのプライマー対が
   エキソン１については配列番号１／配列番号２、
   エキソン２については配列番号３／配列番号４、
   エキソン３については配列番号５／配列番号６、
   エキソン４については配列番号７／配列番号８、
   エキソン５については配列番号９／配列番号１０、
   エキソン６については配列番号１１／配列番号１２
   エキソン７については配列番号１３／配列番号１４、
   エキソン８については配列番号１５／配列番号１６、
   エキソン９については配列番号１７／配列番号１８、
   エキソン１０については配列番号１９／配列番号２０
   エキソン１０については配列番号２１／配列番号２２
   エキソン１１については配列番号２３／配列番号２４、
   エキソン１２については配列番号２５／配列番号２６、
   エキソン１２については配列番号２７／配列番号２８
   からなる群から選択される、請求項７または８のいずれかに記載の方法。

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