JP2000201677A

JP2000201677A - ８型脊髄小脳性運動失調及び検査方法

Info

Publication number: JP2000201677A
Application number: JP11306628A
Authority: JP
Inventors: P W Panumu Laura; ピー．ダブリュ．パヌムローラ; Michael D Koob; ディー．クーブマイケル; A Benzou Kerry; エー．ベンゾウケリー; A Moseree-Aldridge Merinda; エー．モセレー−オールドレッジメリンダ
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1998-10-28
Filing date: 1999-10-28
Publication date: 2000-07-25
Anticipated expiration: 2019-10-28
Also published as: CA2283758C; US20030235841A1; US20130029335A1; US7741458B2; US8748096B2; US20100317015A1; US9556488B2; US8247173B2; US20140322711A1; CA2283758A1; US6524791B1; JP4637982B2; US20130230849A9

Abstract

(57)【要約】本発明は単離された８型脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ
８）コード配列のリピート領域を含む染色体１３の長腕
内に位置する単離された核酸分子、及びこの核酸分子の
相補体を提供する。このリピート領域の同定を基礎とす
る診断方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野及び従来の技術】運動失調症
（ａｔａｘｉａ）は小脳、脳幹及び脊髄小脳管を多様に
冒す神経変性病の臨床的且つ遺伝学的に不均質なグルー
プである。いく例かの運動失調症及びその他の神経学的
疾患にとってトリヌクレオチドリピートの拡張（ｅｘｐ
ａｎｓｉｏｎ）がその突然変異機構の原因であることが
示されている。これらの病気に関係する病理の原因とな
る基礎的な分子機構は３つの広いカテゴリーに属する。
第一に、トリプレットリピート疾患の最大のグループは
ポリグルタミントラクトに翻訳されるＣＡＧ拡張に関係
するものである。ポリグルタミン拡張により惹起される
病気には脊髄及び延髄筋萎縮、ハンチングトン病、並び
に５種類の形態の優性遺伝脊髄小脳性運動失調症（ＳＣ
Ａ）が挙げられる。第二グループはぜい弱性Ｘ精神遅退
を惹起する５’ＣＣＧ拡張及びフリードリッヒ運動失調
症の原因となるイントロンＧＡＡ拡張を包含する。これ
らは共に対応のタンパク質生成物の発現の低下をもたら
す。最後に、第三のグループは筋緊張性ジストロフィー
−タンパク質キナーゼコード配列の３’未翻訳領域内の
拡張ＣＴＧリピートを包含する。このリピートは筋緊張
性ジストロフィーを惹起するが、どのようにしてこの突
然変異が分子レベル効果を発揮するかは解明されていな
い。

【０００２】運動失調症は優性もしくは劣性遺伝である
か、又は家系病歴なしで現れることがありうる。成人発
症性優性脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ）のうち、７種
類の遺伝子座がマッピングされている (S. GispertらNa
ture Genet., 4, 295-299 (1993) ; Y. TakiyamaらNatu
re Genet., 4, 300-304 (1993) ; K. Gardner らNeurol
ogy, 44, A361 (1994) ; S. Nagafuchi らNature Gene
t., 6, 14-18 (1994) ;L. P. W. Ranum らNature Gene
t., 8, 280-284 (1994) ; A. Benomar らNatureGenet.,
10, 84-88 (1995) ; L. G. GouwらNature Genet., 10,
89-93 (1995); O. ZhuchenkoらNature Genet., 15, 62
-69 (1997))。優性運動失調症の約６０％がＳＣＡ１，
２，３，６又は７遺伝子座のトリヌクレオチドＣＡＧリ
ピートにおける拡張に由来する (S. NagafuchiらNature
Genet., 6, 14-18 (1994) ; O.Zhuchenko らNature Ge
net., 15, 62-69 (1997) ; H. T. Orr らNature Gene
t.,4, 211-226 (1993) ; Y. Kawaguchi らNature Gene
t., 8, 221-228 (1994) ; R. Koide らNature Genet.,
6, 9-13 (1994) ; G. Imbert らNature Genet., 14,285
-291 (1996) ; S. -M. PulstらNature Genet., 14, 269
-276 (1996) ; K. Sanpei らNature Genet., 14, 277-2
84 (1996) ; G. DavidらNature Genet., 17,65-70 (199
7) ; M. D. KoobらNature Genet., 18, 72-75 (198
8))。残り４０％の遺伝子的に特定されていない優性家
系間での実質的な臨床変動は、数多くの他の運動失調症
コード配列が同定されずに残っていることを示唆する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】運動失調症コード配列
の同定はかかる病気を患う個体の診断のための改善され
た方法を提供でき、そして運動失調症の出生前／発症前
診断又はより良い分類の可能性を高める。

【０００４】

【課題を解決するための手段】運動失調症の症状を示す
個体が脊髄小脳性運動失調症を患っているか否かを決定
するために、その個体において存在するＳＣＡ１，ＳＣ
Ａ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ６又はＳＣＡ７コード配列のＣ
ＡＧリピートの数を決定することができる。これと同じ
タイプの検査を、個人が将来において脊髄小脳性運動失
調症の症状を発症しうるかの発症前同定のために利用で
きうる。一般に、特定のＳＣＡコード配列におけるＣＡ
Ｇリピートの概ね多い数は個体が脊髄小脳性運動失調症
を患っているか、又は将来において脊髄小脳性運動失調
症の症状を発症しうるかどうかを示唆する。脊髄小脳性
運動失調症の指標であるＣＡＧリピートの数はＳＣＡの
タイプによって一般に異なる。既知のタイプのＳＣＡの
このようなコード配列それぞれは中断のないグルタミン
アミノ酸トラクト（ポリグルタミントラクト）を含むポ
リペプチドをコードする。しかしながら、ＳＣＡ１，Ｓ
ＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ６及びＳＣＡ７コード配列が
原因となる優性運動失調症は約６０％にすぎない。

【０００５】８番目の脊髄小脳性運動失調症、８型脊髄
小脳性運動失調症のコード配列が同定及び単離された。
このコード配列をＳＣＡ８と称する。驚くべきことに、
ＳＣＡ１，ＳＣＡ２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ６及びＳＣＡ７
コード配列によりコードされるｍＲＮＡはリピートを含
み、そしてタンパク質へと翻訳されるが、ＳＣＡ８コー
ド配列によりコードされるｍＲＮＡはリーディングクレ
ーム全てにおいて停止コドンを有するリピートを含む。
その結果、翻訳されるようなタンパク質は同定されてい
ない。ＳＣＡ８コード配列の単離は脊髄小脳性運動失調
症の更なるタイプ、即ち、８型脊髄小脳性運動失調症の
診断を可能にする。

【０００６】ＳＣＡ８コード配列は多形性ＣＴＡリピー
ト及びＣＴＧリピートを含む。この２種類のリピートは
約１．２kbのフラグメント内に位置し、一般にその候補
領域の制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化により生成され
る。一般に、ＣＴＡリピートは不安定であり、そして異
なる家系の個体間で変動するが、典型的にはリピート領
域内のＣＴＡリピートの数は一家系内の個体間で変わら
ない。ＣＴＧリピートは不安定であり、そして典型的に
は８型脊髄小脳性運動失調症を有する個体間又は８型脊
髄小脳性運動失調症の発症のおそれのある者の間で変わ
る（即ち、拡張しているか又は収縮している）。かかる
ＣＴＧリピートの数の変動は異なる家系の個体間及び一
の家系内の個体間（即ち、一の世代と次の世代との間、
及び同胞間）の双方で起こりうる。例えば、これらのリ
ピートを含む領域のＰＣＲ分析は、改変したリピートの
サイズと、少なくとも一つの８型脊髄小脳性運動失調症
の症状を示す危険率との間での相関を実証する。このよ
うな結果はＳＣＡ８が、例えばＳＣＡ１、ぜい弱性Ｘ症
候群、筋緊縮性ジストロフィー、Ｘ−連鎖型脊髄延髄筋
萎縮及びハンチング病に関連する遺伝性運動失調症と同
様に、少なくとも一組の不安定なトリヌクレオチドリピ
ートの拡張を包含する突然変異機構を示す。

【０００７】本発明は単離した８型脊髄小脳性運動失調
症（ＳＣＡ８）コード配列のリピート領域を含む単離さ
れた核酸分子（当該コード配列は染色体１３の長腕内に
位置する）及び当該核酸分子の相補体を提供する。好ま
しくは、この核酸はＤＮＡであり、そしてそれはゲノム
ＤＮＡでもｃＤＮＡでもよい。一定の態様において、Ｓ
ＣＡ８コード配列はリピート領域が後続するＳＥＱＩ
ＤＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８を含んで成る。
別の態様において、このＳＣＡ８コード配列はリピート
領域が先行するＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド
７２６〜１，１５９を含んで成る。かかる核酸分子の例
はＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２及
びＳＥＱＩＤＮＯ：３に記載されている。

【０００８】好適な態様において、本発明はＳＥＱＩ
ＤＮＯ：１の１〜４４８を含んで成る単離された核酸
分子及びそれに対する相補体を提供する。別の好適な態
様はＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８
を含んで成り、そして更にはリピート領域を含んで成る
単離された核酸分子、及びその相補体を含む。更なる別
の好適な態様は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の７２６〜
１，１５９を含んで成る単離された核酸分子及びその相
補体である。かかる分子は必要ならベクターに組込まれ
ていてよい。

【０００９】本発明はプローブ及び／又はプライマーと
して利用できる単離されたオリゴヌクレオチドも提供す
る。一の態様において、この単離されたオリゴヌクレオ
チドはＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４
８に由来する少なくとも１５個のヌクレオチド及びその
相補性ヌクレオチドを含む。別の態様において、この単
離されたオリゴヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：１
のヌクレオチド７２６〜１，１５９由来の少なくとも１
５個のヌクレオチド含んで成り、その相補性ヌクレオチ
ドも含まれる。

【００１０】別の態様において、本発明は単離されたＳ
ＣＡ８コード配列のリピート領域を含む核酸分子にハイ
ブリダイズする単離されたオリゴヌクレオチドを提供す
る。かかるオリゴヌクレオチドは少なくとも約１１個の
ヌクレオチドを含む。更なる別の態様において、本発明
は異種ベクター配列に作用可能式に連結されたＳＥＱＩ
ＤＮＯ：１のヌクレオチドを含んで成る単離された組
換ベクターを提供する。

【００１１】本発明は更に方法を提供する。一の態様に
おいて、本発明はＳＣＡ８コード配列の危険性を有する
アレル内に位置するＤＮＡフラグメントの存在を検出す
るための方法を提供し、この方法は当該ＳＣＡ８コード
配列のリピート領域を含むＤＮＡフラグメントの独立の
相補ＤＮＡ分子をモル過剰量の２種類のオリゴヌクレオ
チドで処理し；当該プライマーを伸長させて前記リピー
ト領域を含む所望のＤＮＡフラグメントを合成するため
の鋳型を担う相補プライマー伸長生成物を形成し；そし
てＣＴＧリピートを含んで成るリピート領域についてこ
の増幅したＤＮＡフラグメントを分析する；ことを含ん
で成る。好ましくは、この２種類のオリゴヌクレオチド
プライマーの第一オリゴヌクレオチドプライマーはＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８から選ば
れ、そしてこの２種類のオリゴヌクレオチドプライマー
の第二のオリゴヌクレオチドプライマーはＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性の
ヌクレオチドから選ばれ、ここで各プライマーは少なく
とも１１個のヌクレオチドを有するものとする。より好
ましくは、この第一オリゴヌクレオチドプライマーはＳ
ＥＱＩＤＮＯ：５，ＳＥＱＩＤＮＯ：８及びＳ
ＥＱＩＤＮＯ：４から成る群より選ばれ、そしてこ
の第二オリゴヌクレオチドプライマーはＳＥＱＩＤ
ＮＯ：６，ＳＥＱＩＤＮＯ：９及びＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１２から成る群より選ばれる。この方法は、個体
が８型脊髄小脳性運動失調症を患うか、又はそれを発症
するおそれがあるかを決定するためのキットを利用して
実施してよく、かかるキットも本発明により提供され
る。かかるキットは上記のプライマーを含む。好ましく
は、この分析段階は（ＣＴＧ）_nリピート（ここでｎは
少なくとも約８０である）を含んで成るリピート領域を
分析することを含んで成る。より好ましくは、この分析
段階は組合せ（（ＣＴＧ）／（ＣＴＡ））_nリピート
（ＣＴＧとＣＴＡリピートの合計）（ここでｎは少なく
とも約９２である）を含んで成るリピート領域を分析す
ることを含んで成る。

【００１２】本発明はＳＣＡ８コード配列のリピート領
域を含む少なくとも一のＤＮＡ分子の存在を検出するた
めの別の方法を提供する。この方法は：ゲノムＤＮＡを
制限エンドヌクレアーゼで消化してＤＮＡフラグメント
を得；このＤＮＡフラグメントを変性させてＤＮＡ分子
にし、そしてそのＤＮＡ分子をハイブリダイゼーション
条件下で、単離されたＳＣＡ８コード配列のリピート領
域を含むＤＮＡ分子にハイブリダイズする検出可能ラベ
ル化プローブでプロービングし；当該ＤＮＡ分子にハイ
ブリダイズしたプローブを検出し；そして当該ＤＮＡ分
子を正常又は危険状態にあるＳＣＡ８コード配列の特徴
的なリピート領域について分析する；ことを包括する。
好ましくは、このプローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１の
ヌクレオチド１〜４４８から選ばれるか、又はＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９又は
その相補体から選ばれ、ここでこのプローブは少なくと
も２０個のヌクレオチドを有する。別の態様において、
このプローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド
１９〜４４９又はその相補体を含んで成る。この方法
は、個体が８型脊髄小脳性運動失調症を患うか又はその
発症のおそれがあるかを検査するためのキットで実施し
てよく、かかるキットも本発明により提供される。この
キットはＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド１〜４
４８から選ばれるプローブ又はＳＥＱＩＤＮＯ：１
のヌクレオチド７２６〜１，１５９又はその相補体から
選ばれるプローブを含む。ここで各プローブは少なくと
も２０個のヌクレオチドを有する。好ましくは、この方
法において、分析段階は（ＣＴＧ）_nリピート（ここで
ｎは少なくとも約８０である）を含んで成るリピート領
域を分析することを含んで成る。より好ましくは、この
分析段階は組合せ（（ＣＴＧ）／（ＣＴＡ））_nリピー
ト（ここでｎは少なくとも約９２である）を含んで成る
リピート領域を分析することを含んで成る。

【００１３】個体が８型脊髄小脳性運動失調症を患う又
はその発症の危険性があるかを決定するための別の方法
は８型脊髄小脳性運動失調症のリピート領域を分析する
ことを包含し、ここで８型脊髄小脳性運動失調症を発症
する危険性のない者は当該リピート領域の中に８０未満
のＣＴＧリピートしか有さない。

【００１４】本発明の更なる別の方法はＳＣＡ８コード
配列の危険性のあるアレル内に位置するＤＮＡフラグメ
ントの存在を検出するための方法である。この方法は：
ＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含むＤＮＡフラグ
メントの独立の相補ＤＮＡ分子をモル過剰量の第一オリ
ゴヌクレオチドプライマーペアーで処理し；この第一プ
ライマーペアーを伸長させて前記リピート領域を含む第
一の所望のＤＮＡフラグメントを合成するための鋳型を
担う相補プライマー伸長生成物を形成し；当該リピート
領域を含む第一の所望のＤＮＡフラグメントを取り出
し；当該リピート領域を含むこの第一の所望のＤＮＡフ
ラグメントの独立の相補鎖をモル過剰量の第二のオリゴ
ヌクレオチドプライマーペアーで処理し、この第二のプ
ライマーペアーを伸長させて当該リピート領域を含む第
二の所望のＤＮＡフラグメントを合成するための鋳型を
担う相補プライマー伸長生成物を形成し；このようにし
て増幅させた第二の所望のＤＮＡフラグメントを検出
し；そしてこの増幅したＤＮＡフラグメントをリピート
領域について分析する；ことを含む。好ましくは、この
第一のオリゴヌクレオチドプライマーペアーはＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８から選ばれる
第一オリゴヌクレオチドプライマー及びＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌ
クレオチドから選ばれる第二オリゴヌクレオチドプライ
マーを含んで成り、ここで各プライマーは少なくとも１
１個のヌクレオチドを有する。より好ましくは、この第
一のオリゴヌクレオチドプライマーはＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：５，ＳＥＱＩＤＮＯ：８及びＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：４から成る群より選ばれ、そしてこの第二のオリゴ
ヌクレオチドプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：６，Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：９及びＳＥＱＩＤＮＯ：１２か
ら成る群より選ばれる。好ましくは、この第二オリゴヌ
クレオチドプライマーペアーはＳＥＱＩＤＮＯ：１
のヌクレオチド４４９〜７２５から選ばれる第一オリゴ
ヌクレオチドプライマー及びＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌ
クレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチド
から選ばれる第二オリゴヌクレオチドプライマーを含ん
で成り、ここで各プライマーは少なくとも１１個のヌク
レオチドを有する。より好ましくは、この第二オリゴヌ
クレオチドプライマーペアーは、３組のＣＴＧリピート
が後続する３組のＣＴＡリピートを有する第一オリゴヌ
クレオチドプライマー及びＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌ
クレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチド
から選ばれる第二オリゴヌクレオチドプライマーを含ん
で成る。これらのプライマー含むかかる方法を実施する
ためのキットも提供する。

【００１５】定義本明細書で用いる「コード配列」及び「コード領域」と
は、適当な調節配列のコントロール下に置かれたときに
ポリペプチドへと翻訳されうる又はされないｍＲＮＡを
コードするヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、
コード配列の発現は当該コード配列により発現されるｍ
ＲＮＡのレベルをアッセイすることにより決定する。

【００１６】本明細書で用いる「リピート領域」及び
「トリヌクレオチドリピート領域」とは、典型的に一組
のトリヌクレオチド、好ましくはトリヌクレオチドＣＴ
Ｇ（即ち、ＣＴＧリピート）及び一組のトリヌクレオチ
ドＣＴＡ（即ち、ＣＴＡリピート）を含むＳＣＡ８コー
ド配列の領域を意味する。このＳＣＡ８コード配列によ
りコードされるｍＲＮＡのリピート領域は典型的には一
組のＣＵＡリピート及び一組のＣＵＧリピートを含む。
このリピート領域のＣＴＧリピートは、トリヌクレオチ
ドＣＴＧ以外のヌクレオチド、特にトリヌクレオチド又
はその多量体を含んでよい。

【００１７】本明細書で用いる８型脊髄小脳性運動失調
症の症状には、軽い呼吸及び歩行不安定性、緊張温度及
び失調性搆音障害、眼振、四肢及び歩行失調、四肢痙性
及び振動知覚の低下が挙げられる。重篤な個体は歩行不
能となりはじめることがある。

【００１８】本明細書で用いるＳＣＡ８の「アレル」と
は、染色体１３の長腕上に位置するＳＣＡ８コード配列
の位置を占めているヌクレオチド配列のいくつかの異な
る形態の一つを意味する。染色体１３の長腕上のＳＣＡ
８コード配列の位置はＳＣＡ８座と呼ぶ。

【００１９】本明細書で用いる「危険性にある」とは、
８型脊髄小脳性運動失調症に関連するＳＣＡ８コード配
列のアレルを有する個体を意味する。ここでは、これは
脊髄小脳性運動失調症の少なくとも一の症状を示しうる
個体、及び将来において脊髄小脳性運動失調症の少なく
とも一の症状を発症しうる個体を含む。８型脊髄小脳性
運動失調症に関連するＳＣＡ８コード配列のアレルを本
明細書では「危険性のある」アレルと呼んでいる。ＳＣ
Ａ８の危険性のあるアレルを有する個体はその寿命の間
に少なくとも一の８型脊髄小脳性運動失調症もの症状を
示しうる。ＳＣＡ８の「正常」なアレルを有する個体は
生きている間に８型脊髄小脳性運動失調症の症状を示さ
ないであろう。個体が危険性にあるかどうかの検試はＳ
ＣＡ８コード配列のリピート領域の中のトリヌクレオチ
ドリピートの数に一般に依存する。

【００２０】本明細書で用いる「ハイブリダイズ」、
「ハイブリダイズする」及び「ハイブリダイゼーショ
ン」とは、オリゴヌクレオチドが標準の条件下で標的Ｄ
ＮＡ分子と非共有相互作用を形成することを意味する。
標準のハイブリダイゼーション条件はオリゴヌクレオチ
ドプローブ又はプライマーが標的ＤＮＡ分子にハイブリ
ダイズすることを可能とする条件である。かかる条件は
当業界に周知の技術を利用し、オリゴヌクレオチドプロ
ーブ又はプライマー及び標的ＤＮＡ分子について容易に
決定される。例えばSambrookら、Molecular Cloning :
A Laboratory Manual ; Cold Spring Harber Laborator
y : New York (1989) を参照のこと。本発明において有
用な好適なプローブ及びプライマーは下記の条件下でＳ
ＣＡ８コード配列のリピート領域を含む。ＤＮＡ分子に
ハイブリダイズする：Express Hybe (Clontech, Cat. N
o. 8015-1)中でのその製造者により提唱の通りの６０℃
で１時間のプレハイブリダイゼーション、Express Hybe
中でのＤＮＡプローブ（その製造者により提唱の通り、
Randam Primers DNA Labeling System, Gibco BRL, Ca
t. No. 18187-013 を利用して調製；４×１０⁷カウン
ト）との６０℃で３時間のハイブリダイゼーション、室
温にて２×のＳＳＣ，０．０５％のＳＤＳの中での１５
分づつ２回の洗浄、次いで５０℃において０．１％のＳ
ＳＣ，０．１％のＳＤＳでの１５分づつ２回の洗浄。標
準ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は一般にオリゴヌクレ
オチドプライマー又はプローブに相補性の配列である。
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは非共有相互作
用の形成を妨害しない非ハイブリダイゼーションヌクレ
オチド、例えばクローニングを促進する制限酵素認識部
位を含みうる。かくして、オリゴヌクレオチドプローブ
又はプライマーは、標準ハイブリダイゼーション条件下
でハイブリダイゼーションが起こる限り、標的ＤＮＡ配
列のヌクレオチド全体に対する相補性を有さない。

【００２１】本明細書で用いる語「ＤＮＡ分子」とはヌ
クレオチドの一本線形鎖を意味する。

【００２２】本明細書で用いる語「ＤＮＡフラグメン
ト」とは、互いと相補性であり、そして互いとハイブリ
ダイゼーションし合ってＤＮＡの二量体を形成する２本
のＤＮＡ分子を意味する。本明細書で用いる語「増幅し
たＤＮＡフラグメント」とはオリジナルＤＮＡフラグメ
ントのコピーであるＤＮＡフラグメントを意味する。Ｄ
ＮＡフラグメントはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を
利用して増幅できる。ＤＮＡフラグメントはオリジナル
のＤＮＡフラグメントをプラスミドにライゲーションさ
せ、そして得られるプラスミドを宿主細胞、例えばＥ．
コリの中で増殖させることによっても増幅できる。増幅
させたＤＮＡフラグメントは典型的にはオリジナルＤＮ
Ａフラグメントの少なくとも一部に対してヌクレオチド
配列同一性である。

【００２３】本明細書で用いる語「相補体」及び「相補
性」とは、２本のＤＮＡ分子が互いと塩基対合する能力
を意味し、ここで一方のＤＮＡ分子上のアデニンは第二
ＤＮＡ分子上のグアニンと塩基対合し、そして一方のＤ
ＮＡ分子上のシトシンは第二ＤＮＡ分子上のチミンと塩
基対合する。２本のＤＮＡ分子は、一方のＤＮＡ分子上
のヌクレオチド配列が第二ＤＮＡ分子におけるヌクレオ
チド配列と塩基対合できるなら、互いと相補性である。
例えば、２本のＤＮＡ分子５’ＡＴＧＣと５’ＧＣＡＴ
は相補性であり、そしてＤＮＡ分子５’−ＡＴＧＣの相
補体は５’−ＧＣＡＴである。相補体及び相補性なる語
は、２本のＤＮＡ分子であって、一方のＤＮＡ分子が第
二ＤＮＡ分子上に存在する少なくとも１個のヌクレオチ
ドに対して塩基対合しない少なくとも１個のヌクレオチ
ド含む場合も含む。例えば、２本のＤＮＡ分子５’−Ａ
ＴＴＧＣ及び５’−ＧＣＴＡＴの各々の３番目のヌクレ
オチドは塩基対合しないが、これら２本のＤＮＡ分子は
本明細書における定義に従うと相補性である。典型的に
は、２本のＤＮＡ分子はそれらが上記の標準条件下でハ
イブリダイズするなら相補性である。典型的には、２本
のＤＮＡ分子はそれらが少なくとも約８０％の同一性、
好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有するな
ら相補性という。

【００２４】本明細書で用いる語「プライマーペアー」
とは、増幅すべきＤＮＡの領域に隣接する２本のオリゴ
ヌクレオチドを意味する。一方のプライマーは増幅すべ
きＤＮＡフラグメントの一端にあるセンス鎖上に存在す
るヌクレオチドに対して相補性であり、そして他方のプ
ライマーは増幅すべきＤＮＡフラグメントの他端にある
アンチセンス鎖上に存在するヌクレオチドに対して相補
性である。増幅すべきＤＮＡフラグメントは鋳型ＤＮＡ
と呼ぶことができる。プライマーが相補性であるＤＮＡ
フラグメントのヌクレオチドは標的配列又は標的ＤＮＡ
と呼ぶ。プライマーは少なくとも約１１個のヌクレオチ
ドを有してよく、そして好ましくは約１６個以上、約３
５個以下のヌクレオチドを有しうる。典型的には、プラ
イマーはそのプライマーがハイブリダイズする標的ＤＮ
Ａの少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少な
くとも約９０％の配列同一性を有する。プライマーはＤ
ＮＡポリメラーゼのための出発点を担うことができ、か
かるポリメラーゼは必須物質の存在下で鋳型ＤＮＡに相
補性のＤＮＡ分子を合成する。典型的には、プライマー
ペアーはＰＣＲによりＤＮＡフラグメントを増幅するの
に利用する。

【００２５】本明細書で用いる語「単離された」とは天
然ＤＮＡフラグメント、ＤＮＡ分子、コード配列又はオ
リゴヌクレオチドがそのもとの環境から取り出されてい
ることを意味するか、又は合成分子又はクローン化生成
物を意味する。好ましくは、ＤＮＡフラグメント、ＤＮ
Ａ分子、コード配列又はオリゴヌクレオチドは精製され
ており、即ち、任意のその他のＤＮＡフラグメント、Ｄ
ＮＡ分子、コード配列又はオリゴヌクレオチド、及び一
体化した細胞性生成物又はその他の不純物を本質的に含
まない。

【００２６】本明細書で用いる語、「診断」とは運動失
調症の危険性にある個体の発症前の同定であってよく、
家系病歴のない個体の同定が含まれる。診断は、少なく
とも一種の運動失調症を示す個体における少なくとも一
種の症状の遺伝子基準の同定も意味しうる。

【００２７】

【発明の実施の形態】Ａ．診断方法病気に関係するコード配列の同定はその病気の改善され
た診断を可能にする。かくして、本発明は８型脊髄小脳
性運動失調症を発症する危険性のある個体及びかかる病
気の症状を示している個体の診断方法に関連する。本発
明の別の観点は危険性のない個体の診断方法に関連す
る。一般に、これらの方法はゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ
内のＤＮＡフラグメントの存在を検出できる。好ましく
は、このＤＮＡフラグメントはゲノムＤＮＡ内に存在す
るヌクレオチドを含んで成る。好ましくは、このＤＮＡ
フラグメントは染色体１３の長腕のＳＣＡ８座内に位置
する。このＳＣＡ８座は危険性のあるＳＣＡ８アレル又
は正常ＳＣＡ８アレルを含みうる。このＳＣＡ８座は一
般にリピート領域を含む。

【００２８】典型的には、ＳＣＡ８アレルのリピート領
域内に存在するＣＴＧリピートの数は決定できる。一般
に、ＳＣＡ８の危険性のあるアレルはＳＣＡ８リピート
領域内に少なくとも約８０組のＣＴＧリピートを有する
アレルである。一般に、８０ＣＴＧリピート未満のＳＣ
Ａ８アレルは正常アレルであり、これは８型脊髄小脳性
運動失調症の症状を発症しないであろう個体の指標であ
る。

【００２９】好ましくは、ＳＣＡ８アレルのリピート領
域内に存在するＣＴＧ及びＣＴＡリピートの数を決定す
ることができる。危険性のあるアレルは好ましくはＳＣ
Ａ８コード配列のリピート領域内に少なくとも約９２組
の組合せＣＴＡ及びＣＴＧリピートを有するものであ
る。組合せＣＴＡリピート及びＣＴＧリピートの数は
（（ＣＴＧ）／（ＣＴＡ））_nと呼ぶことができ、ここ
でｎはＣＴＡリピートとＣＴＧリピートの数である。Ｓ
ＣＡ８コード配列のリピート領域内で約９１組の組合せ
ＣＴＡ及びＣＴＧリピート、好ましくは約３３組以下の
それを有するＳＣＡ８アレルは一般にＳＣＡ８コード配
列のアレルが正常であることを示唆する。一般に、今日
まで評価された正常アレルには多少のＣＴＡ及びＣＴＧ
リピート、典型的には約１６組のそれがある。

【００３０】このリピート領域はリピート内に中断を有
してよい。例えば、ＣＴＧリピートの５’側、即ち、Ｃ
ＴＡリピートに最も近いＣＴＧリピート側に非ＣＴＧト
リヌクレオチドリピートがあってよい。ＣＴＧリピート
は（ｉ）リピートの６又は９番目のトリプレットとして
のＣＣＧ、（ii）リピートの６〜８、又は６〜９番目の
トリプレットとしてのＣＣＧトリヌクレオチド、(iii）
リピートの６及び１４番目のトリプレットとしてのＣＣ
Ｇトリヌクレオチド、又は（iv）リピートの２０，２
７，３３及び３８番目のトリプレットとしてのＣＣＧト
リヌクレオチドを含みうることが認められた。また、Ｃ
ＴＧリピートはリピートの３及び５番目のトリプレット
としてＣＴＡトリヌクレオチドを含みうる。更に、ＣＴ
Ａ及びＣＴＧリピートは６個までのヌクレオチドで隔て
られていてよいこともわかった。例えば、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１はリピート領域を構成するＣＴＡとＣＴＧリ
ピートとの間に６個のヌクレオチド（ヌクレオチド４４
９〜５５４）を開示する。ＣＴＡリピートとＣＴＧリピ
ートとの間のこの領域を構成するヌクレオチドは種々の
ＳＣＡ８アレル間で変わり、そしていくつかのＳＣＡ８
アレルには存在しない。かくして、８０のリピートを有
するＣＴＧリピートが、最少数のＣＴＧではない介在ト
リヌクレオチドを有するものでありうる。

【００３１】本発明の診断方法は特異的なＤＮＡフラグ
メントを検出するための公知の方法、例えばＤＮＡの直
接検出又はＲＮＡの検出を介する間接検出を包括しう
る。例えば、ＰＣＲ技術はＳＣＡ８コード配列のリピー
ト領域を増幅させる新規のプライマーで利用できる。他
方、ラベル化プローブを利用するサザン又はノーザンブ
ロッティングハイブリダイゼーション技術を利用でき
る。その他の核酸配列決定技術もトリヌクレオチドリピ
ートの数を決定するために利用できる。これらの方法は
ＳＣＡ８の症状を有する個体又は将来においてかかる症
状を発症する危険性のある個体に適用できる。

【００３２】本発明の一の態様において、ＤＮＡプロー
ブをＳＣＡ８コード配列の危険性のあるアレルのＤＮＡ
フラグメント又はＤＮＡ分子を同定するために利用でき
る。ＤＮＡプローブは、同定しようとするコード配列に
由来する相補ＤＮＡ分子とハイブリダイズする又は非共
有結合するラベル化一本鎖ＤＮＡ分子である。このプロ
ーブは放射能及び非放射能ラベルを含む当業界周知の適
当なラベルでラベルしてよい。典型的な放射能ラベルに
は³²Ｐ，¹²⁵Ｉ，³⁵Ｓ等が含まれる。非放射能ラベルに
は、例えばリガンド、例えばビオチン又はジゴキシゲニ
ン、並びに酵素、例えばホスファターゼ又はペルオキシ
ダーゼ、又は様々な化学発光物質、例えばルシフェリ
ン、又は蛍光化合物、例えばフルオレセイン及びその誘
導体が含まれる。プローブは分離のし易さのために異な
るタイプのラベルで両端をラベルしてもよく、例えば一
端をアイソトープラベル、そして他端をビオチンラベル
を用いてラベルしてよい。

【００３３】本発明はリピート領域を含む少なくとも一
種のＤＮＡ分子の存在を検出するための方法に関連し、
これではゲノムＤＮＡのサンプルを例えば制限エンドヌ
クレアーゼによる消化により分断し、そして得られるＤ
ＮＡフラグメントをオリゴヌクレオチドプローブでプロ
ービングする。ＤＮＡプローブ分析を利用し、ＳＣＡ８
コード配列を含む染色体１３の長腕由来のＤＮＡを含む
多種多様なコード配列由来のＤＮＡを含む複合混合物を
得るようにゲノムＤＮＡを酵素消化、分断及び変性にか
けることにより標的ＤＮＡを誘導することができる。好
ましくは、ＤＮＡプローブは標的ＤＮＡにだけハイブリ
ダイズする。好ましくは、この標的ＤＮＡはＳＣＡ８コ
ード配列、即ち、ＳＣＡ８コード配列の一部であるか、
又は制限エンドヌクレアーゼによる消化を経たリピート
領域の近くにあるＤＮＡ又は同じＤＮＡ分子であり、そ
して得られる複合体は当業界公知の技術により単離及び
同定できる。一の態様において、この方法はゲノムＤＮ
Ａを制限エンドヌクレアーゼで消化してＤＮＡフラグメ
ントを得、そのフラグメントを分断してＤＮＡ分子を
得、その分子を標準のハイブリダイゼーション条件で検
出可能式にラベルされたプローブでプロービングし（こ
のプローブは単離されたＳＣＡ８コード配列のリピート
領域を含むＤＮＡ分子にハイブリダイズする）、前記Ｄ
ＮＡ分子にハイブリダイズするプローブＤＮＡを検出
し、そしてこのＤＮＡフラグメントをＳＣＡ８コード配
列の正常又は危険状態の特徴的なリピート領域について
分析することを包括する。

【００３４】本発明は更にプローブを提供する。このプ
ローブはオリゴヌクレオチド又は長めのヌクレオチド配
列であってよく、合成又は天然のいずれでもよく、リピ
ート領域に隣接するＤＮＡ配列領域にハイブリダイズ
し、且つ任意的にリピート領域を含むＤＮＡ配列にハイ
ブリダイズする。好ましくは、このプローブは染色体１
３の長腕のＳＣＡ８コード配列にハイブリダイズする。
このプローブはリピート領域を有するＳＣＡ８コード配
列のフラグメント（好ましくは約１．２kbのＥｃｏＲＩ
フラグメント）の危険性のあるアレル又は正常アレルの
鎖の一部に対して相補性なヌクレオチド配列を含む。こ
のプローブは少なくとも約２０個のヌクレオチドであっ
てよく、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドであ
る。これらのプローブはそのヌクレオチド配列が危険性
のある又は正常なＳＣＡ８アレルの鎖の一部に対し、リ
ピート領域に直結する部分を含むリピート領域の５’側
の好ましくは約４５０ヌクレオチド内で相補性となるよ
うに選定する。好ましくは、このプローブのヌクレオチ
ド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド１〜４
４９から選ばれる又はそれに対して相補性である。他
方、これらのプローブはそのヌクレオチド配列が危険性
のある又は正常なＳＣＡ８アレルの鎖の一部に対し、リ
ピート領域に直結している部分を含むリピート領域の
３’側の好ましくは約４３５ヌクレオチド内で相補性と
なるように選定する。好ましくは、このプローブのヌク
レオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド
７２６〜１，１５９から選ばれる又はそれに対して相補
性である。プローブの非限定例はＳＥＱＩＤＮＯ：１
のヌクレオチド１９〜４４９及びそれに対して相補性の
ヌクレオチドである。このプローブはニトロセルロース
に転写したＳＣＡ８アレルに対して下記の条件下でハイ
ブリダイズするであろう：Express Hybe (Clontech, Ca
t. No. 8015-1)中でのその製造者により提唱の通りの６
０℃で１時間のプレハイブリダイゼーション、Ｅｘｐｒ
ｅｓｓＨｙｂｅ中でのＤＮＡプローブ（その製造者に
より提唱の通り、Randam Primers DNA Labeling Syste
m, Gibco BRL, Cat. No. 18187-013 を利用して調製；
４×１０⁷カウント）との６０℃で３時間のハイブリダ
イゼーション、室温にて２×のＳＳＣ，０．０５％のＳ
ＤＳの中での１５分づつ２回の洗浄、次いで５０℃にお
いて０．１％のＳＳＣ，０．１％のＳＤＳでの１５分づ
つ２回の洗浄。

【００３５】一般に、ＳＣＡ８コード配列内に位置する
ＤＮＡフラグメントの存在を検出するため、ゲノムＤＮ
Ａを制限エンドヌクレアーゼで消化してＤＮＡフラグメ
ントを得る。検査すべきゲノムＤＮＡの起源はＤＮＡを
含む生物学的検体であってよい。その例には血液、精
液、膣スワブ、組織、毛髪及び体液の検体が含まれる。
制限エンドヌクレアーゼはゲノムＤＮＡを特定のヌクレ
オチド配列を有する二本鎖ＤＮＡのフラグメントに切断
するであろうものであってよい。数多くのエンドヌクレ
アーゼの特異性が周知であり、そして様々な公開物、例
えばSambrookら ;Molecular Cloning : A Laboratory M
anual ; Cold Spring Harbor Laboratory: New York (1
989)に見い出せうる。好適な制限エンドヌクレアーゼ酵
素にはＥｃｏＲＩ，ＴａｑＩ及びＢｓｅＮＩが含まれ
る。ＥｃｏＲＩが特に好適である。

【００３６】病気の診断は他に新規のプライマーを利用
するポリメラーゼ連鎖反応配列増幅（ＰＣＲ）の利用を
包括することができる。米国特許第４，６８３，１９５
号（Ｍｕｌｌｉｓら、１９８７年７月２８日特許）が核
酸配列の増幅、検出及び／又はクローニングのための方
法を述べている。この方法はＳＣＡ８コード配列のリピ
ート領域を含むＤＮＡフラグメントの独立の相補ＤＮＡ
分子をモル過剰量の２種類のオリゴヌクレオチドプライ
マーで処理し；これらのプライマーを伸長させて前記リ
ピート領域を含む所望のＤＮＡフラグメントを合成する
ための鋳型を担う相補プライマー伸長生成物を形成し；
このようにして増幅したフラグメントを検出し；そして
この増幅したＤＮＡフラグメントをリピート領域につい
て分析することを包含する。

【００３７】より詳しくは、当該ＤＮＡフラグメントを
プライマーで処理し、そしてそのプライマーを伸長させ
る方法工程は下記の段階を含む：オリゴヌクレオチドプ
ライマーのペアーを添加する（ここでこのペアーの一方
のプライマーは当該ＤＮＡフラグメントのセンス鎖内の
ヌクレオチド配列の一部に対して相補性であり、そして
各ペアーの他方のプライマーは当該ＤＮＡフラグメント
の相補アンチセンス鎖内の同じヌクレオチド配列の別の
部分に対して相補性である）；この対合したプライマー
をこの相補ＤＮＡ分子にアニーリングする；同時に、こ
のアニーリングしたプライマーを各プライマーの３’末
端から伸長し、各プライマーにアニーリングさせた鎖に
相補性な伸長生成物を合成する（ここでこの伸長生成物
はその相補体から分離させた後、各プライマーの他方の
プライマーについての伸長生成物の合成のための鋳型を
担う）；そしてこの伸長生成物を前記鋳型から分離さ
せ、一本鎖分子を生成する。この方法の変法が米国特許
第４，６８３，１９４号（Ｓａｉｋｉら、１９８７年７
月２８日特許）に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反
応配列増幅方法はＳａｉｋｉらScience, 230, 1350-135
4 (1985)及びScarf ら、Science, 324, 163-166 (1986)
に記載されている。ＰＣＲはＳＣＡ８リピート領域を含
むヌクレオチド配列を検出するために利用できる。

【００３８】本発明は更にプライマーを提供する。これ
らのプライマーはオリゴヌクレオチドであり、合成又は
天然のいずれでもよく、染色体１３の長腕のＳＣＡ８コ
ード配列のリピート領域を含むＤＮＡ配列領域に対して
相補性の生成物の合成の開始点を担うことができる。好
ましくは、このプライマーはリピート領域を有するＳＣ
Ａ８コード配列のフラグメントの危険性のあるアレル又
は正常アレル（好ましくは約１．２kbのＥｃｏＲＩフラ
グメント）の鎖の一部に対して相補性なヌクレオチド配
列を含む。このプライマー配列は少なくとも約１１個の
ヌクレオチド、そして好ましくは約１６以上、約３５以
下のヌクレオチドを有しうる。典型的には、このプライ
マーはそれらが約７０塩基対〜約１００塩基対、好まし
くは約１００塩基対〜約４５０塩基対のプライミング化
生成物を供するように選ぶ。より好ましくは、これらの
プライマーは危険性のあるアレル又は正常アレルの鎖の
一部に対し、そのリピート領域に直結する部分を含むリ
ピート領域のいずれかの例の約１５０ヌクレオチド以内
に対して相補性である。

【００３９】プライマーペアーの第一プライマーはＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８から選ば
れ、そしてプライマーペアーの第二プライマーはＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９に
対して相補性のヌクレオチドから選ばれうる。このプラ
イマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド１〜４
４８の中の及びＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド
７２６〜１，１５９に対して相補性なヌクレオチドの中
のどこから選んでもよい。好ましくは、第一プライマー
はＳＣＡ８−Ｆ３（５’−ＴＴＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴ
ＴＧＴＧＡＧＧＡＣＴＧＡＧＡＡＴＧ−３’）（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：５）、ＳＣＡ８−Ｆ４（ＧＴＡＡＧＡＧ
ＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧ）（Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：８）又はＳＣＡ８−Ｆ５（ＴＣＡＡ
ＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧ）
（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）である。好ましくは、第二
プライマーはＳＣＡ８−Ｒ２（５’−ＣＣＴＣＡＴＧＴ
ＴＡＧＡＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＴ−３’）（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：６）、Ｐ（ＧＣＣＣＴＡＴＣＣＣＡＡＴＴＣ
ＣＴＴＧＧＣＴＡＧＡ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）
又はＳＣＡ８−Ｒ４（ＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＡＧ
ＡＡＡＡＣＣＴＧＧＣＴ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）
である。ＳＣＡ８−Ｆ３及びＳＣＡ８−Ｒ２プライマー
を利用するＤＮＡフラグメントの増幅のための条件は例
えば２００μＭのｄＮＴＰ、１０mMのＴｒｉｓ pH９．
０、５０mMのＫＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、１．０mMのＭｇＣｌ₂、１０％のＤＭＳＯ、０．
１ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，
Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ））サイクル
数３５回（９４℃で４５秒、５３℃で７５秒、及び７２
℃で７５秒）でありうる。

【００４０】他方、ＰＣＲは、センス鎖に由来する第一
プライマーを含んで成る、即ち、ＳＥＱＩＤＮＯ：
１のヌクレオチドの一部を含んで成り、第一プライマー
がＳＥＱＩＤＮＯ：１に相補性のヌクレオチドにハ
イブリダイズするプライマーペアーを利用することによ
り、ＣＴＡリピートではなくＣＴＧリピートを増幅する
のに利用できる。ＳＥＱＩＤＮＯ：１にはリピート
領域を構成するＣＴＡとＣＴＧリピートとの間の６個の
ヌクレオチド（ヌクレオチド４４９〜５５４）を開示す
る。ＣＴＡリピートとＣＴＧリピートとの間の領域を構
成するヌクレオチドは異なるＳＣＡ８アレル間で変わ
り、そしていくつかのＳＣＡ８アレルの中にはない。第
一プライマーはＣＴＡリピートを構成するヌクレオチド
の少なくとも一部を含んで成るか、又は第一プライマー
はＣＴＡリピートを構成するヌクレオチドの少なくとも
一部とＣＴＧリピートを構成するヌクレオチドの少なく
とも一部を含んで成ってよい。例えば、プライマーペア
ーの第一プライマーは３組以下のＣＴＡリピート、それ
に続く９組未満のＣＴＧリピートを含んで成ってよく、
好ましくは３組のＣＴＡリピート、それに続く６組以下
のＣＴＧリピートを含んで成ってよく、最も好ましくは
３組以下のＣＴＡリピート、それに続く３組以下のＣＴ
Ｇリピートを含んで成ってよい。３種超のＣＴＧリピー
トを有する第一プライマーは、ＣＴＧリピートの長さが
検査すべき個体のゲノムＤＮＡ内のその他の位置に存在
するＣＴＧリピートとのこの第一プライマーの結合を及
ぼしてしまうようなものでないことを条件に、利用でき
る。多重のＣＴＡ及びＣＴＧリピートを含んで成る第一
プライマーのハイブリダイゼーションを可能にするた
め、ハイブリダイゼーション温度は下げてよい。例え
ば、ハイブリダイゼーション温度は約５５℃にまで下げ
てよい。

【００４１】一般に、本発明のこの観点のプライマーペ
アーの第二プライマーはセンス鎖内のヌクレオチド配列
の一部に対して相補性であり、そしてハイブリダイズす
る。好ましくは、このプライマーがハイブリダイズする
ヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチ
ド７２６〜１，１５９、即ち、ＣＴＧリピートの３’側
のヌクレオチドの短い部分（少なくとも約１１ヌクレオ
チド、そして好ましくは約１６以上、約３５以下のヌク
レオチド）を含んで成る。本発明のこの観点は、増幅す
るヌクレオチド配列が存在する全ＤＮＡのごくわずかで
ある場合、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのサンプルで実施
してよい。

【００４２】他方、且つ好ましくは、本発明のこの観点
は既に増幅したＤＮＡのフラグメントに対して実施して
よい。例えば、リピート領域、即ち、ＣＴＡ及びＣＴＧ
リピートの双方を含む、ヌクレオチド配列を第一プライ
マーペアーを利用してゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのサン
プルからＰＣＲ増幅することができ、そしてＰＣＲによ
り増幅したヌクレオチド配列をこの第一プライマーペア
ーから単離し、そして任意的に増幅していないゲノムＤ
ＮＡ配列が単離してよい。この単離した増幅ヌクレオチ
ド配列は、ＣＴＡリピートではなくリピート領域のＣＴ
Ｇリピートを増幅する第二プライマーペアーを利用する
２回目の増幅にかけることができる。本発明のこの観点
において、好ましくはこの第二プライマーペアーは第一
プライマーペアーにより増幅したヌクレオチド配列の中
に存在するＳＣＡ８コード配列のヌクレオチドに対して
ハイブリダイズし、そして第二プライマーペアーはＣＴ
ＡリピートではなくＣＴＧリピートを増幅する。

【００４３】別の態様において、リピート領域、即ち、
ＣＴＡ及びＣＴＧリピートの双方を含むＤＮＡフラグメ
ントは第一プライマーペアーを利用してゲノムＤＮＡ又
はｃＤＮＡのサンプルから増幅してよく、そして増幅Ｄ
ＮＡフラグメントを第一プライマーペアーから取り出
し、そして任意的に増幅していないゲノムＤＮＡ配列か
ら取り出してよい。この増幅したＤＮＡフラグメントを
例えばポリアクリルアミドゲルで分解してＤＮＡフラグ
メント内のＣＴＡ及びＣＴＧリピートの数を決定するこ
とができる。単離した増幅ＤＮＡフラグメントはＣＴＧ
リピートではなくリピート領域のＣＴＡリピートを増幅
する第二プライマーペアーを利用して２回目の増幅にか
けることができる。本発明のこの観点において、好まし
くは第二プライマーペアーは第一プライマーペアーによ
り増幅したヌクレオチド配列の中に存在するＳＣＡ８コ
ード配列のヌクレオチドに対してハイブリダイズし、そ
して第二プライマーペアーはＣＴＧリピートではなくＣ
ＴＡリピートを増幅する。本発明のこの観点はＳＣＡ８
アレルのリピート領域内のＣＴＡリピートの数を決定す
るために利用できる。ＣＴＡリピートの数が決定できた
ら、それはＤＮＡフラグメント内のＣＴＧリピートの数
を決定するために利用できる。

【００４４】ＳＣＡ８のリピート領域に対して５’及び
３’側の領域は一般に様々なＳＣＡ８アレル間で９９．
９％保存されている。ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適す
るオリゴヌクレオチドはリピート領域の５’及び３’側
双方のリピート領域は隣接する領域から選ばれうる。オ
リゴヌクレオチドプライマーを選定するＳＣＡ８コード
配列の領域はＳＥＱＩＤＮＯ：２又はＳＥＱＩＤ
ＮＯ：３、好ましくはＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌク
レオチドから選ばれる。好適なプライマーペアーはＳＥ
ＱＩＤＮＯ：５とＳＥＱＩＤＮＯ：６，ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：４とＳＥＱＩＤＮＯ：１２、及びＳ
ＥＱＩＤＮＯ：８とＳＥＱＩＤＮＯ：９である。
これらのプライマーペアーはそれぞれＰＣＲ技術を利用
して注目のリピート領域を有効に増幅する。このような
オリゴヌクレオチドは脊髄小脳性運動失調症を患う又は
その危険性のあると予測される個体から採取したＤＮＡ
由来のＳＣＡ８コード配列からリピート領域を増幅する
ために有用である。この増幅フラグメントをゲル上で泳
動させ、リピート領域の長さを検定し、そしてＳＣＡ８
アレルを危険又は正常に分類することができる。他方、
このプライマーペアーはＳＣＡ８遺伝子を配列決定する
ための様々な公知技術、例えばＣＴＧリピートの数又は
ＣＴＡ及びＣＴＧリピートの数を決定する技術に利用で
きうる。

【００４５】本発明は更に、個体がリピート領域に関係
する病気を発症する危険性を有するか否かを検査するた
めのキットに関連する。この個体がリピート領域に関係
する病気を発症する危険性を有するか否かを検査するた
めのキットは上記のプローブ及び／又はプライマーを含
む。典型的には、検出するリピート領域はＣＴＧリピー
ト、好ましくはＣＴＧ及びＣＴＡリピートである。好ま
しくは、このリピート領域はＳＣＡ８コード配列の中に
存在する又はそれによりコードされる。

【００４６】前述の通り、その他の診断方法を同様に利
用してよい。これらはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲ
ＮＡのリピート領域の単離及び同定を基礎としうる。こ
れには、例えばＳＣＡ８コード配列のヌクレオチド配列
内のささいな変化を検出する様々な電気泳動技術の利用
が含まれる。更なる非限定例には変性勾配電気泳動、一
本鎖コンホメーショナル多形態ゲル、非変性ゲル電気泳
動技術、及びＤＮＡチップ又はＤＮＡのマイクロチップ
アレーが挙げられる。

【００４７】ＳＣＡ８コード配列のマッピング及びクロ
ーニングは生物学的検体、例えば血液の簡易検査を利用
する一のタイプの優性遺伝運動失調症の具体的な診断を
可能にする。これは優性運動失調症の明確な分子分類に
対する第一ステップとなる。運動失調症についての簡易
且つ信頼できる分類システムは重要であり、なぜなら臨
床症状はＳＣＡ８及び非ＳＣＡ８疾患形態で著しく重な
っているからである。更に、唯一わかっているＳＣＡ８
突然変異についての分子検査は既知のＳＣＡ８家系にお
ける病気の発症前診断を可能にし、そして家系病歴のな
い場合、散在又は単独ＳＣＡ８リピート領域拡張又は収
縮の同定を可能にする。かくして、本発明は家族カウン
セリング、医療処置計画、及び原因不明の運動失調症を
患う患者の標準処置に利用される。

【００４８】Ｂ．リピート領域に隣接する配列を利用し
ての全長遺伝子のクローニング本発明はリピート領域を含むコード配列全体及びその一
部に対応する核酸分子を含むリピート領域を含む核酸分
子に関する。好ましくは、このリピート領域は単離され
たＳＣＡ８コード配列のリピート領域であり、そして好
ましくはこの核酸分子はＳＣＡ８コード配列全体及びそ
の一部に対応する核酸分子である。本発明は更に、異種
ベクター配列に作用可能式に連結されたＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２又はＳＥＱＩＤ
ＮＯ：３のヌクレオチドを含んで成る単離された組換ベ
クターを含む、ＳＣＡ８コード配列全体及び一部を含ん
で成るベクター及び単離された組換ベクターに関する。

【００４９】適当な複製可能ベクターへのＤＮＡのクロ
ーニングはリピート領域に隣接する配列の決定及び全長
コード配列のその後の単離を供する。クローニングはコ
ード配列によりコードされるｍＲＮＡの発現を可能にす
る。

【００５０】１．ＤＮＡの単離リピート領域を含むコード配列を含むＤＮＡは当該コー
ド配列によりコードされるｍＲＮＡを保有し、且つ検出
可能なレベルにおいてそれを発現するものと信じられて
いる組織から調製したｃＤＮＡから得たライブラリーで
あってよい。他に、ＳＣＡ８コード配列はゲノムＤＮＡ
ライブラリーから、又は完全ヌクレオチド配列からのｉ
ｎｖｉｔｒｏオリゴヌクレオチド合成により得られう
る。

【００５１】ライブラリーは注目のコード配列を同定す
るためにデザインされた適当なプローブでスクリーニン
グする。好ましくは、これらのプローブはリピート領域
の両側のヌクレオチド配列に由来する。選定のプローブ
によるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニン
グは標準の手順を利用して成し遂げられうる。プローブ
として合成オリゴヌクレオチドを利用するｃＤＮＡライ
ブラリーのスクリーニングは本発明の実施の好適な方法
である。プローブとして選定されるオリゴヌクレオチド
は偽陽性を最小限とするのに十分な長さ及び十分な精度
を有するべきである。異なる種に由来するＤＮＡを含む
ライブラリーをスクリーニングする場合、プローブの実
際のヌクレオチド配列は通常、最低限のコドン冗長性を
有する伸長リピートに隣接するヌクレオチドの領域を基
準に設計される。このオリゴヌクレオチドは１又は複数
の位置において縮重していてよく、即ち、所定の位置に
おいて２種類以上のヌクレオチドがオリゴヌクレオチド
に組込まれていてよく、これにより多重の合成オリゴヌ
クレオチドが得られる。縮重オリゴヌクレオチドの利用
は、優先的なコドン用法のわかっていない種からライブ
ラリーをスクリーニングするときに時に重要である。

【００５２】このオリゴヌクレオチドは、スクリーニン
グするライブラリー内のＤＮＡに対するハイブリダイゼ
ーションにより検出できるようにラベルしてよい。ラベ
リングの好適な方法はオリゴヌクレオチドの５’末端を
放射性ラベリングするためのＡＴＰ及びポリヌクレオチ
ドキナーゼの利用である。しかしながら、オリゴヌクレ
オチドをラベルするのにその他の方法、例えば限定する
ことなく、ビオチニル化又は酵素ラベリングを利用して
よい。

【００５３】リピート領域を含むコード配列を単離する
ための別の手段はＰＣＲ方法論を利用することにある。
この方法はＳＣＡ８コード配列にハイブリダイズするオ
リゴヌクレオチドプライマープローブの利用を必要とす
る。ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドの選択のため
の戦略は以下に説明する。

【００５４】２．ベクターへのＤＮＡの挿入リピート領域を含む当該コード配列を含む核酸（例えば
ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は好ましくは更なるクロー
ニングのため（ＤＮＡの増幅）又は当該コード配列によ
りコードされるｍＲＮＡの発現のための複製可能ベクタ
ーの中に挿入する。多くのベクターが有用であり、そし
て適当なベクターの選択は：１）それがＤＮＡ増幅のた
め又はｍＲＮＡの発現のために利用されるかどうか；
２）このベクターの中に挿入すべき核酸のサイズ；及び
３）このベクターにより形質転換すべき宿主細胞；に依
存する。

【００５５】適当なベクターの構築は当業界において公
知の標準のライゲーション技術を利用する。単離したプ
ラスミド又はＤＮＡフラグメントを切断し、仕立し、そ
して必須のプラスミドを構築するのに所望される形態で
再ライゲーションする。典型的には、Ｅ．コリを形質転
換するためにライゲーション混合物を利用し、そして有
効な形質転換体は適宜アンピシリン又はテトラサイクリ
ン耐性により選別する。形質転換体由来のプラスミドは
当業界公知の方法により調製し、制限エンドヌクレアー
ゼ消化により分析し、及び／又は配列決定する。例え
ば、Messing ら、Nucl. Acids Res., 9, 309 (1981) 及
びMaxam ら、Methods in Enzymology, 65,499 (1980)
を参照のこと。

【００５６】複製可能なクローニング及び発現ベクター
成分は一般に、限定することなく、１又は複数の下記の
成分を含む：シグナル配列、複製起点、１又は複数のマ
ーカーコード配列、エンハンサー要素、プロモーター及
び転写終止配列。現時点で、様々な有能な宿主細胞によ
り認識されている数多くのこれらの成分各々が当業界に
周知である。成分は標準の分子生物学技術を利用してそ
の起源ＤＮＡから取り出し、そして特定の種に内因性で
あるその他の成分と一緒に利用できうることが当業界に
周知でもある。他方、異種成分を一緒に利用し、クロー
ン化ＤＮＡの安定な複製又はクローン化ＤＮＡによりコ
ードされるｍＲＮＡの発現をもたらしてよい。トリヌク
レオチドリピートを含むコード配列のクローニングに利
用できる成分の非限定的な説明は１９９４年６月２８日
に出願された米国出願第０８／２６７，８０３号に見い
出うる。

【００５７】３．宿主細胞本明細書に記載のベクターをクローニング及び発現する
のに適当な宿主細胞は原核細胞、糸状菌粒、酵母、原生
動物並びに高等真核細胞、例えば脊椎動物、無脊椎動物
及び植物細胞である。好ましくは、この宿主細胞は最少
限量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。宿主細
胞内でのクローン化ＤＮＡを含むベクターの増殖は近年
ルーチン的な手順となっており、そして当業界において
周知である。

【００５８】他方、ｉｎｖｉｔｒｏクローニング方
法、例えばＰＣＲ又はその他の核酸ポリメラーゼ反応が
適当である。

【００５９】４．トランスフェクション及び形質転換宿主細胞を本発明の上述の発現又はクローニングベクタ
ーによりトランスフェクション及び好適には形質転換
し、そしてプロモーターを誘導、形質転換体を選別、又
は所望の配列をコードするコード配列を増幅するために
適宜改良された慣用の栄養培地の中で培養する。

【００６０】クローン化ＤＮＡを含むベクターの取り込
みを促進するための宿主細胞の処理の数多くの方法が当
業界に知られ、例えばリン酸カルシウム沈殿、エレクト
ロポレーション、塩化カルシウム処理、核注入、プロト
プラスト融合又はマイクロプロジェクチルボンバードメ
インも利用されうる。

【００６１】宿主細胞の活性及びクローニングベクター
の運搬を助長する適当な培地の中でのクローニングベク
ターを含む宿主細胞の培養が当業界に周知である。当業
者に公知の任意の必須添加物を適当な濃度で含ませても
よい。培養条件、例えば温度、pH等は当業者に明らかと
なるであろう。本明細書中で言及する宿主細胞はｉｎｖ
ｉｔｒｏ培養物及び宿主動物内のものを含む。

【００６２】

【実施例】実験コード配列の同定された全ての優性形態の脊髄小脳性運
動失調症（ＳＣＡ１，２，３，６及び７）はポリグラタ
ミントラクトとして翻訳されるＣＡＧリピートの拡張を
原因とする。その他の形質の運動失調症がこの突然変異
機構を共有するかどうかを決定するため、ＣＡＧリピー
トについてのリピート拡張検出（ＲＥＤ）を未知の形態
の優性遺伝運動失調症を有する運動失調症家系のコレク
ション由来のＤＮＡサンプルに対して実施した（L. P.
W. Ranumら、Am. J. Hum. Genet., 57, 603-608 (199
5)）。新規の形態の脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ８）
の原因となる今まで発表されていないＣＴＧ拡張の同定
を説明する。

【００６３】ａ．方法ＲＥＤ，２Ｄ−ＲＥＤ及びＲＡＰＩＤクローニングＳＣＡ８アレルのリピート拡張検出（ＲＥＤ）、二次元
ＲＥＤ（２Ｄ−ＲＥＤ）及びＲＡＰＩＤクローニングを
記載の通りに実施した（M. D. Koobら、NatureGenet.,
18, 72-75 (1998))。簡単には、ゲノムＤＮＡを家系Ａ
のプロバンド（図２）から標準の手順を利用して単離し
た。この単離したＤＮＡを、１９９８年８月１８日に出
願のL. P. W. Ranumらの米国出願第０９／１３５，９９
４号に記載のその後の２Ｄ−ＲＥＤ及びＲＡＰＩＤクロ
ーニング手順に利用するため、ＥｃｏＲＩで消化した。
ＲＥＤ陽性画分を約５×１０⁵クローンから成るサブゲ
ノムライブラリーの構築のために利用した。約５×１０
⁴クローンの内のクローンプールを個別にＲＥＤ⁺クロ
ーンについてスクリーニングした。これらのプールのう
ちの一つがＲＥＤ８０生成物を構築する。このプール由
来のプラスミドを記載の通りにして（M. D. Koobら、前
掲）（ＣＴＧ）₁₀オリゴを利用してＣＡＧ拡張を含むク
ローンについて濃縮し、そしてその結果得られたクロー
ンを３６の個別のクローンのプールにおいてスクリーニ
ングした。次に、ＲＥＤ⁺プールの一つ由来のクローン
を個別にスクリーニングした。ＲＥＤ８０生成物を構築
する２つのクローンがこのプールから同定された。ＣＴ
Ｇ拡張及び隣接のゲノムＤＮＡを含む１．２kbのインサ
ートを次に配列決定した（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）。

【００６４】拡張ＳＣＡ８リピートのＰＣＲアッセイＳＣＡ８リピート拡張アッセイをＳＣＡ８−Ｆ３（５’
−ＴＴＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴＴＧＴＧＡＧＧＡＣＴＧ
ＡＧＡＡＴＧ−３’）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）及び
ＳＣＡ８−Ｒ２（５’−ＣＣＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡ
ＡＣＴＧＧＣＴＴＴ−３’）（ＳＥＱＩＤＮＯ：
６）プライマーにより、ＰＣＲ反応（２００μＭのｄＮ
ＴＰ、１０mMのＴｒｉｓ pH９．０、５０mMのＫＣｌ、
０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．０mMのＭｇ
Ｃｌ₂、１０％のＤＭＳＯ、０．１ＵのＡｍｐｌｉＴａ
ｑ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏ
ｎｎｅｃｔｉｃｕｔ））サイクル数３５回（９４℃で４
５秒、５３℃で７５秒及び７２℃で７５秒）で実施し
た。ＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡのサザン分析を、ＰＣ
Ｒにより確実に増幅されるには大きすぎる拡張アレルの
サイズを確認するために用いた（即ち、＞２００リピー
トを有するアレル）。このプローブはＣＴＧリピートの
５’側の全てのエクソンＣ及びエクソンＡの一部を含む
ＳＥＱＩＤＮＯ：３のヌクレオチド２６７〜６０４
を含んで成る約３４０bpのｃＤＮＡＳＣＡ８プローブ
であり、そしてKit Randam Prime (GIBCO BRL, Rockvil
le, MD) でその製造者の提唱に従いラベリングした。４
０の Center d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH)
対照家族（Coriell, Canden, NJ)の祖父母及び既知の形
質の運動失調症を有する患者の配偶者由来のＤＮＡをＳ
ＣＡ８ＰＣＲアッセイのための正常コントロールとし
て用いた。

【００６５】ＳＣＡ８拡張のマッピングＳＣＡ８リピートを上記のＰＣＲアッセイによりＣＥＰ
ＨヒトＹＡＣＤＮＡプール（Research Genetics, Hun
tsville, AL 、製品番号95011A及び95011B）のスクリー
ニングにより物理的にマッピングした。簡単には、ＰＣ
Ｒ分析はＳＣＡ８ＣＴＧリピートを含むＹＡＣクロー
ンを同定するため、プライマーＳＣＡ８−Ｆ３及びＳＣ
Ａ８−Ｒ２を利用するプールしたＹＡＣのＤＮＡアリコ
ートに対して実施した。３つの重複ＹＡＣ（７５８Ｂ
１，７４４Ｆ１１及び８１０Ｇ９）が同定された。プラ
イマーＳＣＡ８−Ｆ３及びＳＣＡ８−Ｒ２を利用するそ
の後のＰＣＲ分析は重複するＹＡＣがＳＣＡ８ＣＴＧ
リピートを含むことを確証した。

【００６６】これらのＹＡＣは染色体１３ｑ２１にマッ
ピングされた大型ＹＡＣコンティグの一部である。染色
体１３の位置決めは染色体細胞ハイブリドパネルＮＩＧ
ＭＳパネル＃２（Ｃｏｒｉｅｌｌ，Ｃａｍｄｅｎ，Ｎ
Ｊ）を利用して個別に確認した。簡単には、ＰＣＲ分析
をプライマーＳＣＡ８−Ｆ３及びＳＣＡ８−Ｒ２を利用
してＤＮＡアリコートに対して実施し、ＳＣＡ８ＣＴ
Ｇリピートを含むヒト染色体を同定した。

【００６７】連鎖分析連鎖分析（例えばOtt. J., Analysis of Human Genetic
Linkage, 改訂版、The Johns Hopkins University Pre
ss, Bultimore, 1991 参照）をＬＩＮＫＡＧＥパッケー
ジコンピュータープログラム（バージョン５．１）を利
用し、そのプログラムの開発者の提唱に従い実施した
（G. M. Lathrop ら、Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 81,
3443-3446 (1984)）。５つの年令依存性浸透クラスが
その家系の年令発症プロフィールを基準に危険性のある
発症していない個体について確立された（０〜２０才
１０％；２１〜３０才３０％；３１〜４５才５０
％；４６〜６０才６０％；６０才超７０％）。発症
した個体及び未発症の配偶者を別のクラスに分けた。一
般集団の運動失調症の発症率は１／１０，０００と推定
された。ＳＣＡ８マーカーについてのアレル頻度はＣＥ
ＰＨ祖父母由来のデータを基礎とした。

【００６８】ＳＣＡ８アレルのクローニング及び配列決
定ＰＣＲをＰｒｉｋｉｎＥｌｍｅｒ由来のＸＬＰＣＲ
キット（Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を
利用し、供給バッファー１０mMのＭｇ（ＯＡＣ）を、１
０％のＤＭＳＯ、３ＵのｒＴｔｈＤＮＡポリメラー
ゼ、ＸＬ及びプライマーＳＣＡ８−Ｆ４（ＧＴＡＡＧＡ
ＧＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧ）
（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）及びＳＣＡ８−Ｒ４（ＧＧ
ＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＣＴ）
（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）を用い、前述の「拡張ＳＣ
Ａ８リピートのＰＣＲアッセイ」で述べた通りのサイク
ルで実施した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル精製し、
リン酸化し（３３mMのトリス酢酸、pH７．８、６６mMの
酢酸カリウム、１０mMの酢酸マグネシウム、５００mMの
ＤＴＴ、６２mMのＡＴＰ及び５ＵのＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Ｅｄｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ
Ｉ）、３７℃で３０分インキュベーション）、そしてＣ
ＩＰ処理したＳｍａＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳ
Ｋ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，
ＣＡ）にクローニングした。プラスミドを標準のミニプ
レップ手順を利用して精製し、そして二本鎖ジデオキシ
配列決定を一のＰＣＲ生成物につき少なくとも２つの独
立のクローンで実施した。

【００６９】ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）５’ＲＡＣＥシステム（バージョン２．０）（Gibco BR
L Life Technologies,Rockville, MD, Cat. No. 18374-
041）をｃＤＮＡ５’末端の迅速増幅のために用い
た。５’ＲＡＣＥシステムを利用する反応のため、第一
鎖合成はＨｕｍａｎＢｒａｉｎＣａｒｅｂｅｌｌｕ
ｍｍＲＮＡ（ヒト脳小脳ｍＲＮＡ）（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６５４３−１）及び２．５ｐｍｄｅ
のｃＤＮＡ特異的プライマー（以下参照）を利用してそ
の製造者の提唱に従い実施した。ｃＤＮＡの精製及びＴ
ｄＴテーリングは５’ＲＡＣＥシステムの製造者のプロ
トコールに記載の通りに実施した。

【００７０】第一ラウンドのＰＣＲはｃＤＮＡプライマ
ーの５’側の配列からデザインした入れ子式プライマー
及びこのキットに供与されている５’ＲＡＣＥ省略型ア
ンカープライマーで実施した。反応はＡｄｖａｎｔａｇ
ｅｃＤＮＡポリメラーゼキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
で実施し、そしてサイクル数は３５回とした（９４℃で
５０秒、６５℃で４分）。

【００７１】第二ラウンドＰＣＲは１：２０の希釈率の
第一ラウンド生成物で実施した。この反応に用いたプラ
イマーは第二の入れ子式プライマー及び５’ＲＡＣＥシ
ステムに供与されている省略型万能増幅プライマー（Ａ
ＵＡＰ）とした。ＧｅｎｅＡｍｐＸＬＰＣＲ（Ｐｅ
ｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）成分を下記のＰＣＲプロフィー
ルで用いた：９４℃でのホットスタート、次いでサイク
ル数５回（９４℃で３０秒、７２℃で２分）；サイクル
数５回（９４℃で３０秒、７０℃で２分）；そして最後
にサイクル数３２回（９４℃で３０秒、６８℃で２
分）。

【００７２】第一の５’ＲＡＣＥ反応において、第一鎖
合成は製造者の提唱に従いＨｕｍａｎＢｒａｉｎＣ
ｅｒｅｂｅｌｌｕｍｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及
び２．５ｐｍｏｌｅのｃＤＮＡ−特異的プライマーＦ５
（ＴＣＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴ
ＡＡＧ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）を利用して実施し
た。第一ＰＣＲは製造者供給のＡＡＰプライマー及びＦ
４プライマー（ＧＴＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＴ
ＧＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）
を利用した。第二の入れ子式ＰＣＲは製造者供給のＡＡ
ＵＰプライマー並びにＩ−ｌｏｎｇプライマー（ＧＴＣ
ＴＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＴＡＧＧＧＣＴＴ
Ｃ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）及びＣ２５プライマ
ー（ＧＡＣＴＣＣＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣ
ＣＡ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）の双方を利用し
た。この結果はＳＣＡ８転写物の５’末端となった。

【００７３】第二の５’ＲＡＣＥ反応においては、第一
鎖は製造者の提唱に従いＨｕｍａｎＢｒａｉｎＣｅｒ
ｅｂｅｌｌｕｍｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び
２．５ｐｍｏｌｅのｃＤＮＡ−特異的プライマーＦ２７
Ｒ（ＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＧＣＴＣ
ＡＧＣＡ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）を利用して実
施した。第一ＰＣＲは製造者供給のＡＡＰプライマー及
びＦ２３Ｒプライマー（ＴＴＧＡＡＴＧＧＣＣＧＧＴＴ
ＧＡＴＧＡＣＡＧ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）を利
用した。第二の入れ子式ＰＣＲは製造者供給のＡＡＵＰ
プライマー及びＥ２２Ｒプライマー（ＣＴＧＣＴＧＡＧ
ＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧ）（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１７）を利用した。その結果はＢＫＲＰ転写物の
５’末端であった。

【００７４】Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ
（小脳ｃＤＮＡ，Ｃａｔ．ｎｏ．７４０１−１）（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ，ｐｏｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を５’及び
３’ｃＤＮＡ端の双方のために用いた。Ｍａｒａｔｈｏ
ｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ反応に関しては、２ラウンド
の入れ子式ＰＣＲラセットを上記の通り、そのキットに
供与されているプライマーＡＰ１及びＡＰ２、並びに別
のＳＣＡ８−特異的プライマー（下記参照）を利用して
実施したが、ただし双方の反応は下記のＰＣＲプロフィ
ールを利用した：９４℃でのホットスタート、次いでサ
イクル数５回（９４℃で３０秒、７２℃で２分）；サイ
クル数５回（９４℃で３０秒、７０℃で２分）；そして
最後にサイクル数２５回（９４℃で３０秒、６８℃で２
分）。

【００７５】第一のＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡ反応に
おいて、第一のＰＣＲはＡＰＩプライマー及びＦ４プラ
イマーを利用した。第二の入れ子式ＰＣＲはＡＰＩプラ
イマー及びＮプライマー（ＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧ
ＴＡＡＡＧＣＣＡＧＧＴＴ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１
８）を利用した。この結果はＳＣＡ８転写物の第一部で
あった。

【００７６】第二のＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡ反応に
おいては、第一ＰＣＲはＡＰＩプライマー及びＰプライ
マー（ＧＣＣＣＴＡＴＣＣＣＡＡＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴ
ＡＧＡ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）を利用した。第
二の入れ子式ＰＣＲはＡＰＩプライマー及びＲ４プライ
マー（ＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣＴ
ＧＧＣＴ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）を利用した。そ
の結果はＳＣＡ８転写物の３’−ポリＡ末端であった。

【００７７】第三のＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡ反応に
おいては、第一ＰＣＲはＡＰＩプライマー及びＤ２３プ
ライマー（ＡＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴＣＧＣＣＴＧＣ
ＴＣＡ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）を利用した。第二
の入れ子式ＰＣＲはＡＰＩプライマー及びＤ２４プライ
マー（ＣＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＣＣＣＣＧＴＣＣＴＣ
ＴＴ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）を利用した。その
結果はＳＣＡ８転写物の３’−ポリＡ末端であった。

【００７８】生成物を１．２％のＳｅｕＰｌａｑｕｅ
ＧＴＧ（ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓＣｈｉｃ
ａｇｏ，ＩＬ）低融点アガロースゲル上で１×のＴＡＥ
バッファー（４０mMのトリス酢酸、１mMのＥＤＴＡ）で
分解した。分解したＰＣＲ生成物のバンドを無菌レーザ
ーブレードで切り出し、そしてアガロースをＡｇａｒＡ
ＣＥ（０．２Ｕ；ＰｒｏｍｅｇａＭａｄｉｓｏｎ，Ｗ
Ｉ）により供給者の説明書に従い酵素的に除去した。Ｄ
ＮＡはＥｔＯＨ沈殿により濃縮し、乾かし、そして１０
μｌの１０mMのトリス、１mMのＥＤＴＡ（pH７．５）バ
ッファーに再懸濁した。そのＰＣＲ生成物をプラスミド
ベクターｐＢＳＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）のＳｍａＩ部位の中にクロー
ニングした。ＰＣＲインサートのヌクレオチド配列を標
準技術を利用して決定した。配列分析はNational Cente
r for Biotechnology Information ウェブページ（www.
ncbi. nlm. nih. gov）を通じて入手できるインターネ
ットソフトウェアを利用して実施した。

【００７９】ノーザン及びポリＡ⁺ＲＮＡドットブロッ
ト分析 Human Brain Multiple Tissue Northern (Clontech) 及
びRNA Master Blot (Clontech)をノーザン分析のために
用いた。最初に、ＢＫＲＰ転写物の３’未翻訳領域由来
の約７００bpのｃＤＮＡプローブ（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１０）をRandam Prime (GIBCO BRL, Rockville, M
D) を利用してラベリングし、そしてExpress Hybe (Clo
ntech) を利用して双方のブロットにハイブリダイズさ
せた。製造者の推奨はハイブリダイゼーション及び洗浄
に関して利用した。次いでブロットをストリッピング
し、そしてRandam Prime (GIBCO BRL)を利用してラベル
したＳＥＱＩＤＮＯ：３のヌクレオチド２６７〜６
０４を含んで成る３４０bpのｃＤＮＡＳＣＡ８プロー
ブと再ハイブリダイズさせた。

【００８０】Ｂ．結果運動失調症患者由来の拡張ＣＴＧリピートのＲＡＰＩＤ
クローニング未知の形態の優性遺伝運動失調症を有する運動失調症家
族の集団からの一の家系由来の疾患を有する母及び疾患
を有する娘由来のＤＮＡサンプルは８０組のＣＡＧリピ
ートを有するＲＥＤ生成物を構築した（ＲＥＤ８０）。
娘由来のＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡの２Ｄ−ＲＥＤ分
析はＲＥＤ８０生成物が既知のＣＡＧ拡張により構築さ
れないことを示した（図１ａ）。このＣＡＧ拡張を更に
特性決定するため、拡張を含む約１．２kbのＥｃｏＲＩ
フラグメントをＲＡＰＩＤクローニング手順を利用して
クローニングし、そして得られるクローン内のゲノムイ
ンサートのヌクレオチド配列を決定した。

【００８１】配列分析はこの拡張が８０組の中断のない
ＣＡＧリピート、それに続く１０組のＴＡＧリピートの
ストレッチから成ることを示した（図７ａ：ＣＴＧ及び
ＣＴＡリピートを含む相補鎖をこの図に示す）。この拡
張に広がっている有意義なオープンリーディングフレー
ムはなく、そして特にポリグルタミン拡張を供するであ
ろうリーディングフレームは反復したＴＡＧ停止コドン
を含む。ＰＣＲプライマーはゲノム配列からリピートを
またいで増幅するようにデザインされ、そして染色体ハ
イブリドパネルのＰＣＲ分析及びＣＥＰＨＹＡＣライ
ブラリーはこの拡張を多形態マーカーＤ１３Ｓ２７５及
びＤ１３Ｓ１３５付近の染色体１３ｑ２１に物理的にマ
ッピングした。今までこの座において運動失調症コード
配列はマッピングされていない。

【００８２】新規の優先運動失調症（ＳＣＡ８）を有す
る拡張したＣＴＧリピートの共分離ＣＴＧリピートのＰ
ＣＲ分析は家系Ａ由来のゲノムサンプルに対して実施し
た（図２）。疾患を有する個体及び２人の危険性を有す
る個体の双方がこのアレルの一つにおいて拡張を有する
ことが見い出され、そしてその拡張は３回の遺伝のうち
２回においてサイズが大きくなった。運動失調症家族集
団をこのＰＣＲアッセイでスクリーニングし、そしてこ
の拡張を有する運動失調症患者のいる別の７つの家系が
同定された。図２は５組のこれらの家系の個体において
見い出されたＣＴＧ拡張のサイズを示す。これらの家族
のうちの最大の家族（家系Ｅ，図２）は７世代家系であ
り、その構成員８９人を臨床的に評価し、そして拡張に
ついて試験した。ＰＣＲ分析はこれらの家系における疾
患を有する個体全員がこの遺伝子座に拡張アレルを有す
ることを示した。家系Ｅについての運動失調症と拡張と
の間での連鎖分析（表Ｉ）は６．６の最大ＬＯＤ点を示
した。この結果は、この遺伝子座での拡張が新規の形態
の優性遺伝脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ８）の原因で
ありうることを示唆する。

【００８３】これらのＳＣＡ８家系由来の家族構成員を
診断した神経学者はこの遺伝子試験結果について目かく
した。全員で２５人の臨床的に疾患を有する個体を同定
した。発症年令は１０〜６０才に範囲した（３５±１７
の平均±ＳＤ）、疾患を有する家族構成員の初期検査時
の年令は３７〜６８才（平均４８±１２）に範囲し、検
査時の疾患期間は０〜３５年であった。搆音障害、軽い
呼吸及び歩行不安定性は一般に初期症状であった。検査
発見には痙性及び運動失調症障害、眼振、四肢及び歩行
運動失調症、回復痙性及び低下振動認知が挙げられる。
ＳＣＡ８拡張についてホモ接合性である患者及びそのヘ
テロ接合同胞（図２、家系Ｅ、ＶＩ：２４−２６）は同
程度の疾患を有し、発症及び病気の進行速度は同程度で
あった。

【００８４】拡張リピートを有するが評価時に臨床的に
疾患を有さない２１人の個体がいた。無症候キャリヤー
の評価時の年令は１４〜７４才であり、その平均（４４
±１７才）であり、疾患を有する家族構成員の年齢と同
程度であった。この不完全な浸透度を理由に、ＳＣＡ８
形態の運動失調症を有する個体は常に明確な運動失調症
の優性家系歴を有するものではなかった。我々のコレク
ションにおいて同定した８組のＳＣＡ８家族のうち６組
が優性運動失調症を有する家系歴として、１組（家系
Ｄ）はおそらくは劣性形態の運動失調症として（即ち、
多発的に疾患を有する同胞及び疾患のない親）、そして
１組は（示していない）は運動失調症病歴のない疾患を
有する個体（散発的）として分類された。後者の２家系
を除くと、ＳＣＡ８は我々の家系コレクション中の優性
遺伝運動失調症の３．４％（６／１７５）を占め、ＳＣ
Ａ１（１０／１７５）及びＳＣＡ７（８／１７５）と似
た頻度であった。

【００８５】ＳＣＡ８病原性拡張は大きく、且つ不安定
である疾患を有する及びその危険性のある個体の多大なＳＣＡ
８ＰＣＲ分析を実施し（図３）、そして６９２の疾患の
ないアレルを代表するコントロールゲノムＤＮＡサンプ
ルのパネルを分析した。この分析の結果を図４にまとめ
る。ＣＴＧ及びＣＴＡリピートは共に多形性であるた
め、我々のＰＣＲアッセイはこれら２種類のリピートの
組合さったサイズを決定するものであり、そしてこれが
図４に示している値である。１６〜９１組の組合せＣＴ
Ｇ／ＣＴＡリピートを有する正常ＳＣＡ８アレルが見つ
かったが、正常アレルの＞９９％が１９〜３４の総リピ
ートを有していた。ＳＣＡ８拡張を有する運動失調症患
者の間で、９２〜１７９組の範囲の組合せＣＴＧ／ＣＴ
Ａリピートが見つかった。疾患を有するアレルの配列決
定はＣＴＡが３〜１７組のリピートのサイズで変動する
ことを示したが、ＣＴＧリピートのみが一の世代から次
の世代との間で拡張し、又はサイズ変化することがわか
った。疾患を有する個体におけるＣＴＧ拡張のみのサイ
ズは８０〜１７０組の中断のないリピートに範囲した。
このように疾患を有するアレルのサイズはその他ＳＣＡ
を及ぼすどのＣＡＧ拡張について一般に認められるもの
よりも相当大きいが、成人発症ＤＭ患者間で見い出せる
ＣＴＧ拡張とサイズにおいて似かよっている（Ｔ．Ａｓ
ｈｉｚａｗａら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４２，１８７７
−８３（１９９２））。疾患を有さない最大のアレルの
一つ（８１組の組合せリピート）も配列決定し、そして
６８組の中断のないＣＴＧリピートが見つかった。中断
のないＣＴＧ及びＣＴＡリピートトラクトの間に見い出
せたＣＴＧ／ＣＴＡリピートに対するささいな単一ヌク
レオチド変化の数及び位置は配列決定したアレルの多く
の間で幅広く変動した。

【００８６】ＣＴＧリピート数の世代間変化は一般にそ
の他の優性ＳＣＡよりもＳＣＡ８に関して大きいが、一
般にＤＭほどは大きくない。ＳＣＡ８拡張の母方及び父
方遺伝におけるＣＴＧリピート数の変化の棒グラフを図
５に示す。ほとんどの父方遺伝はＣＴＧリピート（−３
６〜＋７）の収縮をもたらし（即ち、この拡張は最大３
６リピートの消失から最大７リピートの増加で変化し
た）、そしてほとんどの母方遺伝は拡張をもたらした
（−７〜＋５７５）。筋緊張性ジストロフィーにおいて
認められるものとサイズにおいて似かよったリピートの
長さの３通りの非常に大きい増加（＋２５０，＋３５
０，＋５７５）は全て母方遺伝に由来する。拡張の母方
遺伝への片寄りはその他のＳＣＡ（ＳＣＡ１，ＳＣＡ
２，ＳＣＡ３，ＳＣＡ８及びＳＣＡ７）については報告
されていないが、筋緊張性ジストロフィーについては似
ている。

【００８７】疾患浸透度の母方への片寄り驚くべきことに、症候性ＳＣＡ８の２７の記録遺伝のう
ちの２５が母方であった（図２）。リピート拡張を有す
る１８の無症候個体のうち３人が母方遺伝であり、１５
人が父方遺伝であった。家系Ｄ（図２）がＳＣＡ８の記
録父方遺伝子を有する唯一の家系である。父は、臨床学
的に疾患を有さないが、異常に大きいＳＣＡ８拡張を有
し（２００リピート）、そして彼の臨床学的に疾患を有
する子供はそれよりは小さいにしても大きいＣＴＧ拡張
を受け継いでいた（１６４及び１７０リピート）。

【００８８】ＳＣＡ８拡張のサイズは発症年令及び症度
とは相関しないその他の優性脊髄小脳性運動失調症とは異なり、ＳＣＡ
８の発症年令はＣＴＧ拡張のサイズと有意に相関しない
ようである（図６）。図６の分析の中に含まれていない
４人の発症前個体は更に、リピート長が発症年令を予測
するのに利用できないことを示した。見つけられた最大
のＳＣＡＰ拡張（約４００，５００及び７００リピー
ト）は運動失調症徴候を示さない１５〜２４才の危険性
のある個体に存在し、そして家系Ｄの無症候キャリヤー
（図２）は２００のＣＴＧリピートを有したが、＞２式
でもまだ発症していない。発症年令とリピート長との間
での相関の似たような欠如が約５００未満のＣＴＧリピ
ートを有するＤＭ患者についても認められている。

【００８９】ＳＣＡ８患者間で幅広く変動する疾患の間
の症度も患者のリピート長又は発症年令と有意な相関が
ないことがわかる。しかしながら、ＳＣＡ８疾患の期間
は疾患を有する同胞間で似かよっており、このことはリ
ピート長以外の環境的又は遺伝的要因がＳＣＡ８の病因
に強い影響を有することを示唆しうる。

【００９０】ＳＣＡ８トリヌクレオチドリピートは天然
のアンチセンス転写物における非翻訳ＣＴＧであるＳＣＡ８ＣＡＧリピートを含むｃＤＮＡを同定するた
め、小脳ｍＲＮＡから構築したラムダｃＤＮＡライブラ
リーをスクーニングし、そしてたった一つのｃＤＮＡク
ローンが同定された。このクローン由来のインサートの
配列決定はｃＤＮＡが明らかに、ＣＴＧ方向においてＳ
ＣＡ８リピートを通じて転写されたポリアデニル化ｍＲ
ＮＡに由来することを示した。この結果はゲノムＳＣＡ
８配列の更なる分析を裏付けし、その分析はＣＴＧリピ
ートの１０４bp３’側の共通ポリアデニル化シグナル及
びＣＴＡリピートの１１２bp５’側の推定スプライシン
グアクセプター部位の存在を示した（図７）。

【００９１】ＲＡＣＥの反復ラウンドを実施して全長プ
ロセシング化ＳＣＡ８転写物を同定し、それを図８に模
式的に示す。連鎖したｃＤＮＡの３’又は５’末端の両
側を同定するＭａｒａｔｈｏｎＲＡＣＥ手順（ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ）を利用した。ゲノム配列分析から予測の通
り、多重スプライス変異体の配列決定は、ＣＴＧリピー
トが予測のスプライシングアクセプター部位で始まる
３’末端エキソンの中に存在することを確証した。同定
された最長の転写物はＣＴＧ／ＣＴＡリピートを除くと
長さ１２００ntであり、そして４つのエクソンから成
る。エクソンＢを有さない短めの変異体も同定された。
これらの転写物は有意義なオープンリーディングフレー
ムを有さず、また公知のコード配列との有意義な相同性
を有さない。

【００９２】驚くべきことに、長さ３kbまでの転写物の
独立のセットが、ＭａｒａｔｈｏｎＲＡＣＥ手順をＳＣ
Ａ８転写物の５’エキソンＤ由来のプライマーを利用し
て実施したときに同定された。配列決定はこれらのポリ
アデニル化ｃＤＮＡが長いオープンリーディングフレー
ムを有するが、ＳＣＡ８転写物とは反対方向で転写され
たｍＲＮＡに由来することを示した。これらの転写物に
特異的なプライマーを利用する反復した５’ＲＡＣＥ分
析はエキソンＤ及びＣの接点に非常に近いＳＣＡ８転写
物のエクソンＤ内に属する５’末端を同定した（図７参
照のこと）。これらのデーターはＳＣＡ８転写物が、そ
のプロセシングされた形態において３．４kbのｍＲＮＡ
と５１６bpの重複を有する点で天然のアンチセンスＲＮ
Ａであることを示唆する。５１６塩基対の重複はＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２の最初の５１６ヌクレオチドに対応す
る。ＳＣＡ８ＣＴＧリピートはアンチセンスの中にあ
るが、センス転写物の中にはない。

【００９３】センスｍＲＮＡ内のオープンリーディング
フレームは長さが５４７個のアミノ酸であり、且つ環抗
管のアクチン結合成分であるドロソフィラ・ケルヒ（Ｄ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａｋｅｌｃｈ）タンパク質（Ｄ．
Ｎ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，
１３８，７９９−８１０（１９９７））との高い相同性
を有するタンパク質をコードする。この新しいコード配
列を脳ケルヒ−関連タンパク質（ＢｒａｉｎＫｅｌｃ
ｈ−ＲｅｌａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎ：ＢＫＲＰ）と命
名する。ＢＫＲＰは配列分析からケルヒ及び多数のジン
クフィンガータンパク質の中に存在するＰＯＺ／ＢＴＢ
タンパク質：タンパク質相互作用ドメインを有すること
が予測され、そしてケルヒのアクチン結合ドメインを構
成するものと考えられる６つの「ケルヒモチーフ」リピ
ートも有するものと予測される。ＢＫＲＰは環状管に対
するケルヒの局在化の時期を担うケルヒのアミノ末端に
対する相同性を有さない。ＢＫＲＰのドメイン組織は最
近発表されたケルヒ関連神経特異的ヒトコード配列ＮＲ
Ｐ／Ｂ（Ｔ．Ａ．Ｋｉｍら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．
１４１，５５３−６６（１９９８））及び本質的に同一
のマウスコード配列ＥＮＣ−１（Ｍ．Ｃ．Ｈｅｒｎａｎ
ｄｅｚら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７，３０３８−
５１（１９９７））のそれと非常に似ている（ＢＫＲＰ
はこれらのタンパク質と同一性２８％及び類似性４８％
である）。脊椎動物における神経誘導の特異的な分子マ
ーカーとして同定されたＥＮＣ−１タンパク質はアクチ
ン細胞骨格の構造に関与するものと仮定され、そして神
経過程情報に関与することの示されているＮＲＰ／Ｒは
核マトリックスタンパク質であると信じられている。

【００９４】５０人の成人及び胎児組織由来の標準化量
のｍＲＮＡで作った多重組織ブロット（ＲＮＡＭａｓ
ｔｅｒＢｌｏｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び８の脳式組
織から作ったノーザンブロット（ＨｕｍａｎＢｒａｉ
ｎＭＴＮＢｌｏｔ II，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から作
ったノーザンブロットをＢＫＲＰｍＲＮＡ及びＳＣＡ
８アンチセンス転写物に特異的なプローブで順次プロー
ビングした。

【００９５】ＳＣＡ８プローブはドットブロット上に示
されているほとんどの組織から非常に弱いシグナルを検
出したが、このシグナルのレベルの低さはその他の転写
物とのバックグランドハイブリダイゼーションから明確
に区別できなかった。ＳＣＡ８ｃＤＮＡが小脳ｍＲＮ
ＡからＰＣＲベース法により作られたという事実とは関
係なく、ＳＣＡ８プローブはノーザンブロット上の転写
物を明確に検出できなかった。ポリＡ⁺ドットブロット
のＢＫＲＰプロービングは黒質由来のｍＲＮＡにおける
最大レベルの転写物、小脳、前葉及び視床下部核におけ
る低めのレベルの発現、そして延髄、腎臓及び肺におけ
る更に低いレベルを検出した。全胎児脳由来のｍＲＮＡ
は全成人脳由来のｍＲＮＡよりも有共に高いレベルのＢ
ＫＲＰ転写物を含んだ。長さ約３．５kbの単一のＢＫＲ
Ｐ転写物がノーザンブロット上で、小脳、延髄及び前葉
由来のｍＲＮＡの中で検出され、大脳皮質、骨髄、後頭
極、側頭葉及び被殻由来のｍＲＮＡでは検出されなかっ
た。

【００９６】配列表の説明ＳＥＱＩＤＮＯ：２はエクソンＤ，Ｃ，Ｂ及びＡを
含んで成る人工配列：ｃＤＮＡである。ＳＥＱＩＤＮＯ：３はエクソンＥ，Ｃ及びＡを含ん
で成る人工配列：ｃＤＮＡである。ＳＥＱＩＤＮＯ：４〜９及び１１〜１８は人工配
列：プライマーである。ＳＥＱＩＤＮＯ：１０はＢＫＲＰ転写物由来の人工
配列：ｃＤＮＡである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＣＡ８拡張ＣＴＧリピートのＲＡＰＩＤクロ
ーニングを示す。ａ）優性遺伝運動失調症を有する個体から単離したＥｃ
ｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡの２Ｄ−ＲＥＤ分析（星付きの
個体は図２の家系Ａ）。構築されたＲＥＤ生成物のサイ
ズをパネルの横に示し、そしてＲＥＤ生成物を構築した
４つの画分をパネルの下に示す。ＲＥＤ３０，ＲＥＤ７
０及びＲＥＤ４０生成物を構築したゲノムＤＮＡサイズ
画分は多くの疾患を有する個体に存在する大きな非病理
性「バックグランド」ＣＴＧリピートを含む。ＲＥＤ８
０ＣＴＧ拡張を含むサイズ分画（星印で示す）はこの
運動失調症患者に固有であり、従って記載の通りにクロ
ーニングした。ｂ）ＲＥＤ陽性一次クローンプールに由来するＣＴＧ濃
厚クローンプールのＲＥＤ分析（方法の欄参照のこ
と）。各プールは３６人の個体のクローンに由来するＤ
ＮＡを含む。プール９の中の個別のクローン由来のプラ
スミドＤＮＡのＲＥＤ分析は拡張ＣＴＧリピートを含む
２つのクローンを同定した。これらのクローンの配列分
析は８０組の中断のないリピートを有する拡張したＣＴ
Ｇトラクトを示した。

【図２】ＳＣＡ８ＣＴＧリピート拡張についての５組
の運動失調症家系を示す。べた塗り記号は運動失調症を
有する個体を示し、点付き記号はＣＴＧ拡張が遺伝され
ているが運動失調症の臨床的に発症していない個体を示
す。拡張したアレルのＣＴＧリピート長は記号の下に示
す。拡張ＣＴＧの単離された患者を家系Ａの中で黒を付
けて示す。家族Ｅ内で見つかったＣＴＧリピート拡張の
配列の中断は、Ｖ：１５及びＶ：１６により寄与される
拡張アレルをその子孫から区別することを可能にする。
「Ｍ」又は「Ｐ」はＣＴＧ拡張を含むアレルが母方又は
父方遺伝のそれぞれであることを示す。

【図３】危険性のあるアレル及び正常アレルのＳＣＡ８
ＣＴＧのＰＣＲ分析。疾患を有する及び危険性のある
個体におけるＳＣＡ８アレルのＰＣＲサイズ決定。拡張
（Ｅ）及び正常（Ｅ）アレルはパネルの核に示す。Ｍ１
３のサイズのはしごをサイズ対比のために含ませてい
る。

【図４】図３と同様、危険性のあるアレル及び正常アレ
ルのＳＣＡ８ＣＴＧのＰＣＲ分析。コントロール染色
体（ｎ＝６９２）とＳＣＡ８アレルとの間でのリピート
領域長の分布を示す。安定に遺伝した多形態ＣＴＡ（３
〜１７リピート）はＣＴＧストレッチの５’末端に位置
する。

【図５】母方及び父方遺伝についてのリピート数の世代
間変動。リピート変異をＣＴＧリピート単位の減少
（−）又は増加（＋）で示す。母方遺伝は灰色の棒で示
し、そして父方遺伝は黒色の棒で示す。

【図６】発症年令と拡張アレルのＣＴＧリピート長との
関係の相関係数ｒ＝−０．３３１６５が計算され、発症
分の変動のわずか１１％（ｒ²＝０．１１）が疾患染色
体上のＣＴＧリピート長に原因しうることを示す。

【図７】ＳＣＡ８リピート領域のゲノム（ａ）及びｍＲ
ＮＡ（ｂ）の内容を模式的に示す。ａ）ＣＴＧ拡張のゲノムの内容。ＣＴＡ及びＣＴＧリピ
ートのコンホメーションをＲＡＰＩＤクローニングによ
り単離されたリピート拡張について示す（「リピート領
域」）。ＣＴＧ鎖のみ示す。スプライシングアクセブタ
ー部位はＣＴＧ拡張の５’側のゲノム配列の中にあり、
そして共通ポリアデニル化シグナルはリピートの３’側
の配列にある。ＳＣＡ８リピートはＣＴＧ方向で転写さ
れ、そして完全にプロセシングされたアンチセンス転写
物の中にある。水平線分はｃＤＮＡ配列を示し、そして
鉛直線分はおよそのスプライシング接点を示す。ＳＣＡ
８転写物を４つのエクソン（Ａ〜Ｄ）と一緒に示すが、
エクソンＤ，Ｂ及びＡ、又はエクソンＥ，Ｃ及びＡのみ
を含むスプライス変異体も単離された（エクソンＥは示
さない）。エクソンＤは反対方向で転写されたｍＲＮＡ
の５’ＵＴＲに対して相補性である。

【図８】ヌクレオチド配列を示す。Ａ）ＳＣＡ８のリピート領域を含むゲノムＤＮＡのＥｃ
ｏＲＩフラグメントである（ＳＥＱＩＤＮＯ：
１）。Ｂ）ＳＣＡ８コード配列のｍＲＮＡである（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：２）。これらのｍＲＮＡはエクソンＤ，Ｃ，
Ｂ及びＡを含む。

【図９】図８の続きである。Ｃ）ＳＣＡ８コード配列のｍＲＮＡである（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：３）。このｍＲＮＡはエクソンＥ，Ｃ及びＡ
を含む。

【図１０】図９の続きである。Ｄ）ＢＫＲＰ転写物の３’非翻訳領域由来の約７００bp
のｃＤＮＡプローブを示す（ＳＥＱＩＤＮＯ：１
０）。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ranum, Laura P.W. Koob, Michael <120> SPINOCEREBELLAR ATAXIA TYPE 8 AND METHODS OF DETECTION <130> 11000900101 <140> JP 11-306628 <141> 1999-10-28 <150> US. 09/181,585 <151> 1998-10-28 <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1159 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaattcatgc ctataattta taagatctgc caccctacca gccttactgt ttttctcatt 60 ggtaatattc atgaagtcac tggtaatttt acattttaaa atatgcagta tgaattgcat 120 atatagtact tcttaaatgt caacacattt atcttaaatc atttatcgaa gtatgagaag 180 tacctatcat attttggtaa ataatacctt taggtttttc ctagttcttg gctccagact 240 aaccatcttg acctgtcatt ctagttttta cttctgagac attctatagt ctgtgtctga 300 tattctctac tatttcctca tttgtccttg cattcagatt gccttttctg actcccagct 360 tccacggaga gattaactct gttggctgaa gccctatccc aattccttgg ctagaccctg 420 ggtccttcat gttagaaaac ctggctttac tactactact actactacta ctactactac 480 tactgctact gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc 540 tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc 600 tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct 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agggtgccat tcagcggatt gaaggaagag gaggaagagg 240 acggggagga cgatgaagag gaagaggagg aaggcttctt ccagaaagtg ctcacaccgc 300 ttctctcttg gcttttgagc aggcgactct ggctgggtcc ccagtgctca aagctgccac 360 tgccgtcctg ttgcaggcag cctccccccg ccgggccgcc ggtggaagga gacgggtggc 420 tgaagagttt ccagcggagt cgcagaatgt gcttcacatc gaagtctttt cgcccagagc 480 ctgacatgct ttacgcacag aaggcaaaag gctggcagct cacgcagggt tctggaggct 540 gggaagttca agaccaatgc acgagaattt ggtctaaaga gaatcttctt gctctgaaca 600 cacatagtag aaggcagaag ggcaagagag agaacaaagt ctgtgtctcc acatggcaga 660 agagcagagg agacagaacc tactcctcta tggcaaccac cccatcaatg acaaaaatcc 720 tagaaggatg tatgtatagg aagttgaagt gttgagaaga gaatggctca gagtcaagcg 780 ggaacaagat tcaaacttca gagagagagg gaagaaaaac atttaaatat atctggcata 840 atccagacta tttacgacaa gtgttctgtg tttctaataa taaaacagac ttcacctcgg 900 agtacctgca gaactgggac cccaatgacc agggagaatg aagaacaact tgtttgaaga 960 ttgccttttc tgactcccag cttccacgga gagattaact ctgttggctg aagccctatc 1020 ccaattcctt ggctagaccc tgggtccttc atgttagaaa acctggcttt actactacta 1080 ctactactac tactactact actactgcta ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg 1140 ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg 1200 ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg 1260 ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg 1320 ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgcat tttttaaaaa tatattatct tattttacta 1380 tttgatgtta taattgttat atatttttcc atacttcctc atactgctta tctcttactt 1440 aagaatttat gaataaagaa ttgatttttc a 1471 <210> 3 <211> 1037 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA comprising exons E, C, and A <400> 3 aagcgtaccc ctcgccagat ctcttggtgc acctgcgccc ctgtccctgg ccttttcgag 60 gatgccccga tagcctgccg ggtggctctg agaaagtcaa ttgctttctg caatgccaga 120 agaggtggtt ttatatagtc agtttgtaaa agagaaaaat agatattcta gcgcatatag 180 ggaggcaaaa gaaaaagccc gcctgtgaag ctgtcaaggt cctcacagta caattttctc 240 tctgcctcag cgcctcctcc tcccctttct ggaggctggg aagttcaaga ccaatgcacg 300 agaatttggt ctaaagagaa tcttcttgct ctgaacacac atagtagaag gcagaagggc 360 aagagagaga acaaagtctg tgtctccaca tggcagaaga gcagaggaga cagaacctac 420 tcctctatgg caaccacccc atcaatgaca aaaatcctag aaggatgtat gtataggaag 480 ttgaagtgtt gagaagagaa tggctcagag tcaagcggga acaagattgc cttttctgac 540 tcccagcttc cacggagaga ttaactctgt tggctgaagc cctatcccaa ttccttggct 600 agaccctggg tccttcatgt tagaaaacct ggctttacta ctactactac tactactact 660 actactacta ctgctactgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct 720 gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct 780 gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct 840 gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct 900 gctgctgctg ctgcattttt taaaaatata ttatcttatt ttactatttg atgttataat 960 tgttatatat ttttccatac ttcctcatac tgcttatctc ttacttaaga atttatgaat 1020 aaagaattga tttttca 1037 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 4 tcaattcttt attcataaat tcttaag 27 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 5 tttgagaaag gcttgtgagg actgagaatg 30 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 6 cctcatgtta gaaaactggc ttt 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 7 acccagccag agtcgcctgc tca 23 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 8 gtaagagata agcagtatga ggaagtatg 29 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 9 ggtccttcat gttagaaaac ctggct 26 <210> 10 <211> 682 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA from BKRP transcript <400> 10 agtggacaca gatggcttcc ttgaatattg ggagagcagg tgcctgtgtg gtagtcatca 60 agcaaccttg acttattgat attttacttg gaaagatttt acttgctgga gtggttattt 120 ttatattgaa tggcaagaat gagaacttcc agagatgaaa actcttcaag aacaaggatc 180 tctgtagcgt tacctactga tgttgaaaga gttagtagat caaacagaat agtaggaaac 240 aagaaaacat taaacttata caggaaaaat gtctggccat atgttagtta gttcgggaat 300 ggttattggt aatttgtttt gtattatagc atacaataac tagagttacc aaaggcttgt 360 tttttcttga gcagttgaaa ggagagacca atatttgtga catggatagt ttcatgacca 420 caactcattc aatcatttta tagtctatgg caatatccaa gagattgcca agagtagaag 480 acagaatatt tcatctgaca gtatctgatt ggtttactgt ttttctaatc atatgtggtc 540 ataacgggaa gcagaattat gctttattca aacaaacctg cttctgcctc attttcctaa 600 gctatgagaa caattagaga aacagattca tgcttgtatc ttgcattcag aaaacaaact 660 gtcctactaa tcaaagctgc at 682 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 11 cttcatcgtc ctccccgtcc tctt 24 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 12 gccctatccc aattccttgg ctaga 25 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 13 gtctagccaa ggaattggga tagggcttc 29 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 14 gactccgctg gaaactcttc agcca 25 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 15 tccatctttc tgaaggtttg ctcagca 27 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 16 ttgaatggcc ggttgatgac ag 22 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 17 ctgctgagtg ccctgcccag gag 23 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 18 gtagtagtag tagtaaagcc aggtt 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マイケルディー．クーブアメリカ合衆国，ミネソタ 55113，ローズビル，ドラパーアベニュ 2186 (72)発明者ケリーエー．ベンゾウアメリカ合衆国，ミネソタ 55441，プリマス，エイティーンスアベニュノース 11911 (72)発明者メリンダエー．モセレー−オールドレッジアメリカ合衆国，ミネソタ 55102 セントポール，アッシュランドアベニュ 579

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】８型脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ８）コ
ード配列の危険性のあるアレル内に位置するＤＮＡフラ
グメントの存在を検査するための方法であって、（ａ）前記ＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含むＤ
ＮＡフラグメントの独立の相補ＤＮＡ分子をモル過剰量
の２種類のオリゴヌクレオチドプライマーで処理し；（ｂ）当該プライマーを伸長させて前記リピート領域を
含む所望のＤＮＡフラグメントを合成するための鋳型を
担う相補プライマー伸長生成物を形成し；（ｃ）このようにして増幅した前記フラグメントを検出
し；そして（ｄ）この増幅したＤＮＡフラグメントをＣＴＧリピー
トを含んで成るリピート領域について分析する；ことを
含んで成る方法。
【請求項２】前記２種類のオリゴヌクレオチドプライ
マーの第一オリゴヌクレオチドプライマーがＳＥＱＩ
ＤＮＯ：１のヌクレオチド１〜４４８から選ばれ、そ
して当該２種類のオリゴヌクレオチドプライマーの第二
オリゴヌクレオチドプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ：
１のヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレ
オチドから選ばれ、ここで各プライマーが少なくとも１
１個のヌクレオチドを有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】前記第一オリゴヌクレオチドプライマー
がＳＥＱＩＤＮＯ：５，ＳＥＱＩＤＮＯ：８及
びＳＥＱＩＤＮＯ：４から成る群より選ばれ、そし
て前記第二オリゴヌクレオチドプライマーがＳＥＱＩ
ＤＮＯ：６，ＳＥＱＩＤＮＯ：９及びＳＥＱＩ
ＤＮＯ：１２から成る群より選ばれる、請求項２記載
の方法。
【請求項４】個体が８型脊髄小脳性運動失調症を患っ
ているか又はそれを発症する危険性を有するか否かを検
査するためのキットであって、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の
ヌクレオチド１〜４４８から選ばれる第一オリゴヌクレ
オチドプライマー及びＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレ
オチド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから
選ばれる第二オリゴヌクレオチドプライマーを含んで成
り、ここで各プライマーが少なくとも１１個のヌクレオ
チドを有する、キット。
【請求項５】前記分析の段階が、（ＣＴＧ）_nリピー
ト（式中、ｎは少なくとも約８０である）を含んで成る
リピート領域を分析することを含んで成る、請求項１記
載の方法。
【請求項６】前記分析の段階が、組合せ（（ＣＴＧ）
／（ＣＴＡ））_nリピート（式中、ｎは少なくとも約９
２である）を含んで成るリピート領域を分析することを
含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項７】ＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含
む少なくとも一種のＤＮＡ分子の存在を検出するための
方法であって：（ａ）ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し
てＤＮＡフラグメントを得る；（ｂ）当該ＤＮＡフラグメントを変性させてＤＮＡ分子
を得、そしてこのＤＮＡ分子をハイブリダイゼーション
条件下で検出可能式にラベルされたプローブでプロービ
ングする、ここで当該プローブは単離されたＳＣＡ８コ
ード配列のリピート領域を含むＤＮＡ分子にハイブリダ
イズする；（ｃ）前記ＤＮＡ分子にハイブリダイズした前記プロー
ブを検出する；そして（ｄ）当該ＤＮＡ分子を正常なＳＣＡ８コード配列又は
危険性のある状態のＳＣＡ８コード配列を特徴とするリ
ピート領域について分析する；ことを含んで成る方法。
【請求項８】前記プローブがＳＥＱＩＤＮＯ：１
のヌクレオチド１〜４４８もしくはＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９、又はそれら
の相補体から選ばれ、ここで当該プローブが少なくとも
２０個のヌクレオチドを有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】前記プローブがＳＥＱＩＤＮＯ：１
のヌクレオチド１９〜４４９、又はその相補体を含んで
成る、請求項７記載の方法。
【請求項１０】個体が８型脊髄小脳性運動失調症を患
っている又はそれを発症する危険性があるか否かを検査
するためのキットであって、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌ
クレオチド１〜４４８もしくはＳＥＱＩＤＮＯ：１
のヌクレオチド７２６〜１，１５９、又はその相補体か
ら選ばれるプローブを含んで成り、ここで各プローブは
少なくとも２０個のヌクレオチドを有するキット。
【請求項１１】前記分析の段階が、（ＣＴＧ）_nリピ
ート（式中、ｎは少なくとも約８０である）を含んで成
るリピート領域を分析することを含んで成る、請求項７
記載の方法。
【請求項１２】前記分析の段階が、組合せ（（ＣＴ
Ｇ）／（ＣＴＡ））_nリピート（式中、ｎは少なくとも
約９２である）を含んで成るリピート領域を分析するこ
とを含んで成る、請求項７記載の方法。
【請求項１３】個体が８型脊髄小脳性運動失調症を患
っているか又はそれを発症する危険性があるか否かを決
定するための方法であって、８型脊髄小脳性運動失調症
コード配列のリピート領域を分析することを含んで成
り、ここで８型脊髄小脳性運動失調症の発症の危険性の
ない個体は当該リピート領域内に８０組未満のＣＴＧリ
ピートを有する、方法。
【請求項１４】ＳＣＡ８コード配列の危険性のあるア
レル内に位置するＤＮＡフラグメントの存在を検出する
ための方法であって：（ａ）前記ＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含むＤ
ＮＡフラグメントの独立の相補ＤＮＡ分子をモル過剰量
の第一オリゴヌクレオチドプライマーペアーで処理す
る；（ｂ）当該第一プライマーペアーを伸長させて、前記リ
ピート領域を含む第一の所望のＤＮＡフラグメントを合
成するための鋳型を担う相補プライマー伸長生成物を形
成する；（ｃ）当該リピート領域を含む第一の所望のＤＮＡフラ
グメントを取り出す；（ｄ）当該リピート領域を含む第一の所望のＤＮＡフラ
グメントの独立の相補鎖をモル過剰量の第二オリゴヌク
レオチドプライマーペアーで処理する；（ｅ）当該第二プライマーペアーを伸長させて、前記リ
ピート領域を含む第二の所望のＤＮＡフラグメントを合
成するための鋳型を担う相補プライマー伸長生成物を形
成する；（ｆ）このようにして増幅した当該第二の所望のＤＮＡ
フラグメントを検出する；そして（ｇ）この増幅したＤＮＡフラグメントをリピート領域
について分析する；ことを含んで成る方法。
【請求項１５】前記第一オリゴヌクレオチドプライマ
ーペアーが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド１〜
４４８から選ばれる第一オリゴヌクレオチドプライマー
と、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜
１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれる第二オ
リゴヌクレオチドプライマーとを含んで成り、ここで各
プライマーが少なくとも１１個のヌクレオチドを有す
る、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】前記第一オリゴヌクレオチドプライマ
ーがＳＥＱＩＤＮＯ：５，ＳＥＱＩＤＮＯ：８及
びＳＥＱＩＤＮＯ：４から成る群より選ばれ、そし
て前記第二オリゴヌクレオチドプライマーがＳＥＱＩ
ＤＮＯ：６，ＳＥＱＩＤＮＯ：９及びＳＥＱＩ
ＤＮＯ：１２から成る群より選ばれる、請求項１５記
載の方法。
【請求項１７】前記第二オリゴヌクレオチドプライマ
ーペアーがＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド４４９
〜７２５から選ばれる第一オリゴヌクレオチドプライマ
ーと、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜
１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれる第二オ
リゴヌクレオチドプライマーとを含んで成り、ここで各
プライマーは少なくとも１１個のヌクレオチドを有す
る、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】個体が８型脊髄小脳性運動失調症を患
っているか又はそれを発症する危険性があるか否かを検
査するためのキットであって、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の
ヌクレオチド１〜４４８から選ばれる第一オリゴヌクレ
オチドプライマーとＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオ
チド７２６〜１，１５９に相補性のヌクレオチドから選
ばれる第二オリゴヌクレオチドプライマーとを含んで成
る第一オリゴヌクレオチドプライマーペアー、及びＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド４４９〜７２５から
選ばれる第一オリゴヌクレオチドプライマーとＳＥＱＩ
ＤＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜１，１５９に相補
性のヌクレオチドから選ばれる第二オリゴヌクレオチド
プライマーとを含んで成る第二オリゴヌクレオチドプラ
イマーペアーを含んで成り、ここで各プライマーは少な
くとも１１個のヌクレオチドを有する、キット。
【請求項１９】前記第二オリゴヌクレオチドプライマ
ーペアーが３組のＣＴＧリピートが後続する３組のＣＴ
Ａリピートを有する第一オリゴヌクレオチドプライマー
と、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド７２６〜
１，１５９に相補性のヌクレオチドから選ばれる第二オ
リゴヌクレオチドプライマーとを含んで成る、請求項１
４記載の方法。
【請求項２０】前記分析段階が（ＣＴＧ）_nリピート
（式中、ｎは少なくとも約８０である）を含んで成るリ
ピート領域を分析することを含んで成る、請求項１４記
載の方法。
【請求項２１】染色体１３の長腕内に位置する単離さ
れた８型脊髄小脳性運動失調症（ＳＣＡ８）コード配列
のリピート領域を含む単離された核酸分子及び当該核酸
分子の相補体。
【請求項２２】前記核酸がＤＮＡを含んで成る、請求
項２１記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項
２２記載の核酸分子。
【請求項２４】前記ｃＤＮＡがＳＥＱＩＤＮＯ：
２を含んで成る、請求項２２記載の核酸分子。
【請求項２５】前記ｃＤＮＡがＳＥＱＩＤＮＯ：
３を含んで成る、請求項２２記載の核酸分子。
【請求項２６】前記核酸がＳＥＱＩＤＮＯ：１を
含んで成る、請求項２１記載の核酸分子。
【請求項２７】ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチ
ド１〜４４８を含んで成る単離された核酸分子及びその
相補体。
【請求項２８】ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチ
ド７２６〜１，１５９を含んで成る単離された核酸分子
及びその相補体。
【請求項２９】前記ＳＣＡ８コード配列が、リピート
領域の後続するＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド
１〜４４８を含んで成る、請求項２１記載の単離された
核酸分子。
【請求項３０】前記ＳＣＡ８コード配列が、リピート
領域の先行するＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド
７２６〜１，１５９を含んで成る、請求項２１記載の単
離された核酸分子。
【請求項３１】ベクターの中にＳＥＱＩＤＮＯ：
１のヌクレオチド１〜４４８を含んで成る単離された核
酸分子。
【請求項３２】ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチ
ド１〜４４８及びリピート領域を含んで成る単離された
核酸分子、並びにその相補体。
【請求項３３】ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチ
ド１〜４４８由来の少なくとも１５個のヌクレオチドを
含んで成る単離されたオリゴヌクレオチド、及びその相
補ヌクレオチド。
【請求項３４】ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチ
ド７２６〜１，１５９由来の少なくとも１５個のヌクレ
オチドを含んで成る単離されたオリゴヌクレオチド、及
びその相補ヌクレオチド。
【請求項３５】少なくとも約１１個のヌクレオチドを
有する、ＳＣＡ８コード配列のリピート領域を含む核酸
分子にハイブリダイズする単離されたオリゴヌクレオチ
ド。
【請求項３６】異種ベクター配列に作用可能式を連結
されたＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチドを含んで成
る単離された組換ベクター。