JP2002027986A - 突然変異遺伝子の探索方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 変異遺伝子が特定されていない突然変異動物
における変異遺伝子を迅速に特定する方法を提供する。 【解決手段】 下記の工程ｉ）からｉｉ）： ｉ） 対照となる動物の組織または細胞と、対照動物の
系統から突然変異により得られ、該突然変異の結果、対
照動物には表れない特有の表現型の変化を表す動物（以
下「変異動物」という）の同じ組織または細胞から、そ
れぞれメッセンジャーＲＮＡを抽出し、該メッセンジャ
ーＲＮＡを出発材料としてｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調
製する工程；および ｉｉ） 上記工程ｉ）で得られたｃＲＮＡまたはｃＤＮ
Ａを用いて、変異動物と対照動物との間で発現量が著し
く変動している遺伝子を同定する工程、を含むことを特
徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】 本発明は、突然変異遺伝子
を検索、同定する新規方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】 ヒトゲノム研究の進展により遺伝子の
全体像が捕らえられつつあるが、十万余りあるといわれ
ているヒト遺伝子の機能解析が、ポストゲノムシークエ
ンス解析の課題となっている。ゲノム地図やシークエン
ス解析の進歩により、一遺伝子の異常による単因子性の
遺伝病はその原因遺伝子が明らかにされつつあるが、
癌、糖尿病などの多因子性疾患の遺伝子解析には多くの
遺伝子の発現変動、変異（多型：ＳＮＰ）を網羅的に検
索することが必要である。ＤＮＡマイクロアレイ、チッ
プ技術は全遺伝子の発現、多型等を包括的に検索できる
技術として登場し、遺伝子の配列が解明された後のポス
トゲノムシークエンスの世代を担う技術の一つと考えら
れている（Nature genetics suppliment (1999) 21,3-6
0）。

【０００３】マイクロアレイ技術は、個々の遺伝子の発
現を多くのポイントで簡便に検討できるが、変異遺伝子
が特定されていない突然変異動物における変異遺伝子を
特定する方法に用いられた例は知られていない。

【０００４】特表平９−５０８８００号公報には、健康
な動物と疾病を有する動物との間で差次的に発現される
遺伝子を同定する方法が記載されているが、実際にその
ような遺伝子を同定した具体例は開示されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】 本発明の目的は、マ
イクロアレイや遺伝子チップ等を用いた遺伝子解析によ
り、迅速かつ確実に変異遺伝子を検索する方法を提供す
ることにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】 本発明は、（１） 遺
伝子突然変異を有しており、かつその変異遺伝子が特定
されていない動物における変異遺伝子を特定する方法で
あって、下記の工程ｉ）からｉｉ）： ｉ） ある系統の動物（以下「対照動物」という）の組
織または細胞と、対照動物の系統から突然変異により得
られ、該突然変異の結果、対照動物が有する表現型と異
なった表現型を表す動物（以下「変異動物」という）の
対応する組織または細胞から、それぞれメッセンジャー
ＲＮＡを抽出し、該メッセンジャーＲＮＡを出発材料と
して相補的ＲＮＡまたは相補的ＤＮＡを調製する工程；
および ｉｉ） 上記工程ｉ）で得られた相補的ＲＮＡまたは相
補的ＤＮＡを用いて、変異動物と対照動物との間で発現
量が変動している遺伝子を同定する工程、 を含むことを特徴とする方法、（２） （１）記載の方
法において、変異動物にのみ表れる表現型が病変として
表れるものであることを特徴とする方法、（３）変異動
物および対照動物がマウスであることを特徴とする、
（１）または（２）記載の方法、（４） 変異動物がＫ
Ｋ／Ｓａｎマウス、対照動物がＫＫマウスであることを
特徴とする、（３）記載の方法、（５） （１）乃至
（４）のいずれか１つに記載の方法であって、工程ｉ
ｉ）において変異動物と対照動物との間で発現量が変動
している遺伝子を同定する手段として、変異動物および
対照動物と同種の動物の組織または細胞由来の相補的Ｄ
ＮＡ群または該ＤＮＡの部分配列で作製された遺伝子チ
ップを用いることを特徴とする方法、（６） 遺伝子突
然変異を有しており、かつその変異遺伝子が特定されて
いない動物における変異遺伝子を特定する方法であっ
て、下記の工程ｉ）からｉｉｉ）： ｉ） ある系統の動物（以下「対照動物」という）の組
織または細胞と、対照動物の系統から突然変異により得
られ、該突然変異の結果、対照動物が有する表現型と異
なった表現型を表す動物（以下「変異動物」という）の
対応する組織または細胞から、それぞれメッセンジャー
ＲＮＡを抽出し、該メッセンジャーＲＮＡを出発材料と
して相補的ＲＮＡまたは相補的ＤＮＡを調製する工程； ｉｉ） 上記工程ｉ）で得られた相補的ＲＮＡまたは相
補的ＤＮＡを用いて、変異動物と対照動物との間で発現
量が変動している遺伝子を同定する工程；および ｉｉｉ） 工程ｉｉ）の結果、対照動物より変異動物で
多く発現していると判定された遺伝子由来の相補的ＤＮ
Ａを対照動物または対照動物由来の細胞に高発現させ
て、変異動物と同様の表現型の変化が現れるか否かを検
定するか、または変異動物より対照動物で多く発現して
いると判定された遺伝子由来の相補的ＤＮＡを変異動物
または変異動物由来の細胞に高発現させて、変異動物の
表現型の変化が対照動物のもつ表現型に復帰するか否か
を検定する工程、 を含むことを特徴とする方法、（７） （６）記載の方
法において、変異動物にのみ表れる表現型が病変として
表れるものであることを特徴とする方法、（８）変異動
物および対照動物がマウスであることを特徴とする、
（６）または（７）記載の方法、（９） 変異動物がＫ
Ｋ／Ｓａｎマウス、対照動物がＫＫマウスであることを
特徴とする、（８）記載の方法、（１０） （６）乃至
（９）のいずれか１つに記載の方法であって、工程ｉ
ｉ）において変異動物と対照動物との間で発現量が変動
している遺伝子を同定する手段として、変異動物および
対照動物と同種の動物の組織または細胞由来の相補的Ｄ
ＮＡ群または該ＤＮＡの部分配列で作製された遺伝子チ
ップを用いることを特徴とする方法、（１１） （６）
乃至（１０）のいずれか１つに記載の方法において、工
程ｉｉｉ）記載の相補的ＤＮＡの導入が、該相補的ＤＮ
Ａが組み込まれたアデノウイルスベクターを含むアデノ
ウイルスの感染によるものであることを特徴とする方
法、に関する。

【０００７】本発明にいう「変異動物」は、対照動物の
系統から遺伝子突然変異によって得られ、対照動物とは
異なる表現型を表す家系の非ヒト動物（薬剤投与や放射
線照射による人為突然変異誘発操作を経て得られた変異
動物や、遺伝子操作で作製したノックアウト動物または
トランスジェニック動物等の人為的に得られた動物であ
っても、また非人為的乃至自然発生的に取得されたもの
であってもよい）である。そのような動物としては、例
えば、ショウジョウバエ、線虫、カエル、メダカ、ゼブ
ラフィッシュ等の哺乳類以外の実験動物も用いることが
できるが、好適には哺乳動物であり、より好適にはマウ
スであるが、これらに限定されない。

【０００８】また、本発明にいう「対照動物」とは、本
発明の方法に用いられる変異動物の源となった家系／系
統の動物であって、かつ変異動物とは明確に区別できる
表現型を示す動物をいう。したがって、例えば変異動物
で着目された表現型変化と明確に区別可能であるような
別の特異な表現型（病変等）を示しているものであって
も、本発明の方法においては対照動物として用いられ得
る。例えば、低脂血症マウスであるＫＫ／Ｓａｎマウス
は、高脂血症マウスであるＫＫマウスの突然変異によっ
て得られたものであり、本発明の方法ではＫＫ／Ｓａｎ
マウスを変異動物、ＫＫマウスを対照動物として用いる
ことができる。

【０００９】すなわち、ある動物の系統の継代・維持の
過程で、その中のある家系において表現型に何らかの変
化が生じ、かつその変化がその家系の子孫にも遺伝して
いることが明らかであるような場合、その変化が生じた
家系の子孫が本発明にいう「変異動物」となりうる。一
方、当該表現型の変化が生じないまま、変異動物の家系
と掛け合わせずに維持された家系の子孫が「対照動物」
となりうる。

【００１０】本発明の方法で探索・同定しようとする遺
伝子は、対照とする系統の動物から突然変異により得ら
れ、該突然変異の結果、対照動物にはない表現型の変化
を表すに至った動物（変異動物）の変異遺伝子であっ
て、かつその遺伝子の発現量に、対照動物と変異動物と
の間でメッセンジャーＲＮＡのレベルで検出可能な差が
現れるようなものである。なお、本発明における「変異
遺伝子」は、対照動物と変異動物との間でメッセンジャ
ーＲＮＡ発現量に差異がある遺伝子の、アミノ酸配列を
コードする領域に限定されるものではなく、その周辺の
非翻訳領域や発現調節領域を含みうる。

【００１１】ここに、「表現型の変化」とは、病変、生
化学的値の変化または行動様式の変化として観察できる
ものであり、好ましくは、ヒトの疾患に対応する病変、
すなわち、例えば代謝異常に起因する病変（肥満、動脈
硬化、血中の中性脂肪濃度の異常、血糖値の異常等）、
臓器機能不全、自己免疫疾患様の病変、良性乃至悪性の
新生物（腫瘍、癌、白血病等）、行動異常、発生遅延、
奇形、早老症等として観察されるものであるが、これら
に限定されない。

【００１２】変異動物と対照動物との間でメッセンジャ
ーＲＮＡ（以下「ｍＲＮＡ」という）のレベルで遺伝子
発現量を比較して、両者の間で発現量の異なる遺伝子が
あるとき、該遺伝子の発現異常は、表現型の変化の直接
的または間接的な原因となっているか、または表現型の
変化の結果となっているかのいずれかであると推測され
る。

【００１３】そのようなｍＲＮＡ量の変化の原因として
は、その変異遺伝子ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写制御が
活性化または抑制されることによって生じる場合（たと
えば遺伝子のプロモーター、エンハンサー内に変異が生
じて転写制御に変化が生じた場合、その遺伝子自体、ま
たは周辺の遺伝子の欠失、転座、逆位、重複、挿入等の
影響により転写制御に変化が生じた場合、エクソン、イ
ントロン内の点変異によりｍＲＮＡの不安定化が促進さ
れｍＲＮＡ量に変化が生じた場合など）、または上流に
位置する遺伝子の発現が変化していることにより、二次
的に下流に位置する変異遺伝子の転写、あるいはｍＲＮ
Ａの安定化が影響をうけて起こる場合などが挙げられ
る。これらいずれの場合でも、ｍＲＮＡ量の変化を指標
に特定された遺伝子が、表現型の変化として着目した病
変に関連する機能を有していることが解れば、それがそ
の病変の原因遺伝子またはマーカーであると考えられる
ので、例えばその発現異常を正常復帰させたり、発現異
常の効果を打ち消すような薬剤を開発することにより、
該病変の治療が可能となる。

【００１４】本発明者らは、遺伝子チップを用いた遺伝
子解析の結果、高脂血症マウスと、該高脂血症マウスか
ら突然変異によって得られた低脂血症マウスとの比較
で、前者にのみ高発現する遺伝子を特定した。この遺伝
子についてさらに解析した結果、該低脂血症マウスのこ
の遺伝子中に変異が起こっていることを確認し、本発明
を完成させた。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明は、下記の工程ｉ）からｉ
ｉ）： ｉ） 対照動物の組織または細胞と、変異動物の同じ組
織または細胞から、それぞれメッセンジャーＲＮＡを抽
出し、該メッセンジャーＲＮＡを出発材料としてｃＲＮ
ＡまたはｃＤＮＡを調製する工程；および ｉｉ） 上記工程ｉ）で得られたｃＲＮＡまたはｃＤＮ
Ａを用いて、変異動物と対照動物との間で発現量が著し
く変動している遺伝子を同定する工程、を順次行うこと
により実施することができる。さらに、工程ｉｉｉ）と
して、上記工程ｉｉ）の結果、対照動物より変異動物で
多く発現していると判定されたｃＤＮＡを対照動物また
は対照動物由来の細胞に高発現させて、変異動物と同様
の表現型の変化が現れるか否かを検定するか、または変
異動物より対照動物で多く発現していると判定されたｃ
ＤＮＡを変異動物または変異動物由来の細胞に高発現さ
せて、変異動物の表現型の変化が復帰するか否かを検定
する操作を行うことにより、変異遺伝子と表現型の変化
との関連を確認することができる。

【００１６】以下、各工程の実施の態様について述べ
る。

【００１７】工程ｉ） ｉ）−１．プローブ取得用試料の調製 まず、対照動物および変異動物由来のｍＲＮＡを抽出精
製する。選択された変異動物および対照動物のそれぞれ
に由来するｍＲＮＡは、各動物の臓器組織、または同組
織由来の細胞、あるいは株化された細胞等から抽出精製
される。例えば、変異動物に特有の表現型変化が病変と
して表れ、かつその原因が分泌性の因子の過剰であるよ
うな場合、変異遺伝子が過剰発現する部位は病巣そのも
のでないこともあるので、ｍＲＮＡ抽出精製にあたって
出発材料とする臓器組織（または細胞の由来臓器組織）
は、変異動物で着目された表現型変化が現れる部位に限
定されず、むしろ多種類の臓器組織から回収したそれぞ
れのｍＲＮＡ試料について検討を行うことが好ましい場
合もある。

【００１８】ＲＮＡ抽出に際しては、培養終了後直ちに
臓器、あるいは細胞をＲＮＡ抽出用の溶媒（例えばフェ
ノール等リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する
成分を含むもの）で直接溶解することが好ましい。ＲＮ
Ａの抽出方法としては、チオシアン酸グアニジン・塩化
セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフ
ェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グア
ニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski,
P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156
-159）などを採用しうるが、酸性チオシアン酸グアニジ
ン・フェノール・クロロホルム法が好適である。

【００１９】得られたＲＮＡからさらにｍＲＮＡを精製
する方法は以下に説明する通りである。すなわち、真核
細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末
端にポリ（Ａ）配列を持つことが知られているので、こ
の特徴を利用して、例えば、上記のようにして抽出した
ＲＮＡにビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブを加え
てポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを吸着させてから、それをストレ
プトアビジンを固定化した常磁性粒子担体に、ビオチン
／ストレプトアビジン間の結合を利用してポリ（Ａ）⁺
ＲＮＡを捕捉させ、洗浄操作の後、オリゴ（ｄＴ）プロ
ーブからポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを溶出する。また、オリゴ
（ｄＴ）セルロースカラムにポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを吸着
させて、次にこれを溶出して精製する方法も採用し得
る。その後、ショ糖密度勾配遠心法などにより、ｍＲＮ
Ａをさらに分画することもできる。

【００２０】ｉ）−２．プローブの標識 プローブは特定のｍＲＮＡクローンではなく、発現して
いる全てのｍＲＮＡを標識したものを用いる。そこで、
プローブ作製のための出発材料としては、精製していな
い全ＲＮＡを用いることもできるが、上記のようにして
精製されたポリ（Ａ）⁺ＲＮＡであることがより好まし
い。

【００２１】核酸ハイブリダイゼーションによる検出を
行うにあたり、プローブの標識方法と検出方法について
以下に述べる： ａ）アフィメトリクス社製チップを用いる解析のための
プローブ アフィメトリクス社製チップに添付されたプロトコール
に従い、ビオチン標識したｃＲＮＡプローブを用いる。

【００２２】ｂ）アレイを用いる解析用のためのプロー
ブ 逆転写酵素反応でポリ（Ａ）⁺ＲＮＡからｃＤＮＡを作
製する際に、蛍光色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）で
標識されたｄ−ＵＴＰなどを加えておくことによりｃＤ
ＮＡを蛍光標識する。このとき、病態モデル動物由来の
ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡと対照動物由来のポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ
をそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリ
ダイゼーション時には両者を混合して用いることができ
る。

【００２３】ｃ）メンブレンフィルターを用いる解析の
ためのプローブ 逆転写酵素反応でポリ（Ａ）⁺ＲＮＡからｃＤＮＡを作
製する際に、放射性同位元素（例えば³²Ｐ、³³Ｐ）で標
識されたｄ−ＣＴＰなどを加えておくことによりプロー
ブを標識する。

【００２４】工程ｉｉ） ｉｉ）−１．固相化試料 上記工程ｉ）で得られた標識プローブとハイブリダイズ
させるための固相化試料としては、以下のようなものを
挙げることができる。

【００２５】ａ）データベース上のＥＳＴ（expressed
sequence tag）配列またはｍＲＮＡ配列をもとに合成し
たアンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝
子チップ（アフィメトリクス社製）（Lipshutz, R. J.
et al. (1999) Nature genet. 21, suppliment、20-2
4）：上記ＥＳＴ配列またはｍＲＮＡ配列は、病態モデ
ル動物または対照動物と同種の動物由来のものであるこ
とが最も好ましいが、それに限定されず、例えば近縁種
の動物由来のものも使用可能である。

【００２６】ｂ）病態モデル動物と同種乃至近縁の動物
の臓器組織、もしくは該臓器組織から単離または株化さ
れた細胞から得られたｍＲＮＡより作製されたｃＤＮＡ
乃至ＲＴ−ＰＣＲ産物が固相化されたアレイまたはメン
ブレンフィルター：これらｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ
産物は、例えばｍＲＮＡの材料とした動物のＥＳＴデー
タベース等の配列情報をもとに作製されたプライマーで
逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン
化されたものである。このｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物
としては、予め、変異動物および対照動物のそれぞれに
由来するｍＲＮＡの間で発現量の異なるｍＲＮＡを、サ
ブトラクション法（Diatchenko, L. et al. (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 6025-6030）、ディフ
ァレンシャルディスプレイ法（Kato, K. (1995) Nuclei
c Acids Res. 23, 3685-3690）等を利用して選択しなが
ら作製されたものも含む。また、アレイやフィルターは
市販されているもの（例えば、宝酒造（株）社製インテ
リジーンや、クローンテック社製アトラスシステム等）
を使用してもよいし、スポッターを用いて作製すること
もできる（例えば、宝酒造（株）社製、ＧＭＳ４１７ア
レイヤー等）。

【００２７】この固相化資料にを、上記ｉ）で調製され
たプローブを用いて、同じ条件で別個に、あるいは混合
して同時にハイブリダイズさせる（Brown, P. O. et a
l. (1999) Nature genet. 21, suppliment、33-37）。

【００２８】ｉｉ）−２． 解析 ａ）アフィメトリクス社製チップを用いる解析の場合 アフィメトリックス社製チップに添付のプロトコールに
従って、ハイブリダイゼーションおよび解析を行う。

【００２９】ｂ）アレイを用いる解析の場合 例えば、宝酒造（株）社の市販アレイを用いる場合、同
社のプロトコールに従いハイブリダイゼーションおよび
洗浄を行って、蛍光シグナル検出機（例えばＧＭＳ４１
８アレイスキャナー（宝酒造（株）社製）等）で蛍光シ
グナルを検出後、解析を行う。

【００３０】ｃ）フィルターを用いる解析の場合 ハイブリダイゼーションは、本発明が属する技術分野に
おいて周知の方法で行われ得る。好ましくは例えば、既
製のフィルター製マイクロアレイを解析するシステム
（例えば、アトラスシステム（クローンテック社製））
を用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った
後、解析装置（例えば、アトラスイメージ（クローンテ
ック社製））を用いて解析を行う。

【００３１】上記いずれの場合も、同一ロットの固相化
試料に変異動物由来のプローブおよび対照動物由来のプ
ローブをそれぞれハイブリダイズさせる。このとき、使
用するプローブ以外のハイブリダイゼーションの条件は
同じとする。上記ｉ）−２に記載したように、それぞれ
のプローブを異なる蛍光色素で標識した場合は、一つの
固相化試料に両プローブの混合物をハイブリダイズさせ
ることもできる（Brown, P. O. et al. (1999) Nature
genet. 21, suppliment、33-37）。

【００３２】解析の結果、変異動物由来のプローブと対
照動物由来のプローブとの間で固相化試料にハイブリダ
イズした量の異なるクローンを同定する。例えば、アフ
ィメトリクス社製チップを用いる解析の場合は、クロー
ンの同定もアフィメトリックス社のプロトコールに従っ
て行うことができる。市販のマイクロアレイまたはフィ
ルターを使用する場合は、同定されたクローンに関する
情報を、例えばGenbank等の遺伝子配列データベースか
ら検索可能である。

【００３３】ｉｉ）−３． その他の解析方法 上記以外に、特定の組織細胞に特異的に発現する遺伝子
をクローニングする方法としては、例えばサブトラクシ
ョン法（Sive, H. L. and John, T. St. (1988) Nuclei
c Acids Research 16, 10937、Wang, Z., and Brown,
D. D. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 1
1505-11509）、ディファレンシャル・ディスプレイ法
（Liang, P., and Pardee, A. B. (1992) Science 257,
967-971、Liang, P., Averboukh, L.,Keyomarsi, K.,
Sager, R., and Pardee, A. B. (1992) Cancer Researc
h 52, 6966-6968）、ディファレンシャル・ハイブリダ
イゼーション法（John, T. St., and Davis, R. W. Cel
l (1979) 16, 443-452）、また、適当なプローブを用い
たクロスハイブリダイゼーション法（"Molecular Cloni
ng, A Laboratory Manual" Maniatis, T., Fritsch, E.
F., Sambrook, J. (1982) Cold Spring Harbor Laborat
ory Press）などを挙げることができる。

【００３４】サブトラクションクローニング法： 特定
の細胞に特異的に発現する遺伝子のｃＤＮＡを取得し、
該ｃＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングすることにより遺伝子をクローニングする
方法である。サブトラクションの方法としては、ｍＲＮ
Ａから一本鎖ｃＤＮＡを作製し、これと別の細胞から得
られたｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ハイドロキ
シアパタイトカラムでハイブリダイズしなかった一本鎖
ＤＮＡを単離し、このｃＤＮＡからｃＤＮＡライブラリ
ーを作製する方法（バイオマニュアルシリーズ３、遺伝
子クローニング実験法、羊土社 (1993)、カレント・プ
ロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）
や、ｃＤＮＡライブラリーをまず作製し、このライブラ
リーからヘルパーファージ等を用いて一本鎖ＤＮＡを調
製し、この一本鎖ＤＮＡと別の細胞から得られたｍＲＮ
Ａにビオチン標識したものとをハイブリダイズさせた
後、アビジンを利用してハイブリダイズしなかった一本
鎖ＤＮＡを単離し、ＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖
に戻してｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（Tanak
a, H., Yoshimura, Y., Nishina, Y., Nozaki, M., Noj
ima, H., and Nishimune,Y. (1994) FEBS Lett. 355, 4
-10）などが挙げられる。

【００３５】具体的には例えば、まず変異動物および対
照動物のそれぞれについて、目的とする特定の臓器また
は細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製す
る。次いで、対照動物から精製したｍＲＮＡを鋳型と
し、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α-
³²Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識すること
もできる。標識されたｃＤＮＡと鋳型となったｍＲＮＡ
は安定な二本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドを形成して
いるが、アルカリ存在下で高温処理することによりｍＲ
ＮＡのみを分解し一本鎖ｃＤＮＡを精製する。この一本
鎖ｃＤＮＡと、変異動物から抽出したＲＮＡとを混合
し、適当な条件下で静置すると、ヌクレオチド配列の相
補性に依存して安定な二本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッ
ドを形成する。すなわち、変異動物でも発現しているｍ
ＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡはハイブリッド
を形成するが、対照動物に特異的に発現しているｍＲＮ
Ａを鋳型としたｃＤＮＡは一本鎖のままである。ハイド
ロキシアパタイトカラムで二本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡハイブ
リッドと一本鎖ｃＤＮＡとを分離し、一本鎖ｃＤＮＡの
みを精製する。このステップを繰り返すことで目的とし
た細胞に特異的なｃＤＮＡを濃縮することができる。濃
縮された特異的ｃＤＮＡは放射性同位元素などで標識さ
れている場合は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グするプローブとして使用することができる。なお、こ
の操作は市販のキット（例えばＰＣＲセレクトｃＤＮＡ
サブトラクションキット（クロンテック社製）など）を
利用して行うこともできる。

【００３６】ディファレンシャル・ディスプレイ法：
Liangらの方法（Science (1992) 257, 967-971）に準
じ、例えば以下のように実施できる。まず対照動物およ
び変異動物各々の臓器または細胞からｍＲＮＡ（もしく
は全ＲＮＡ）を抽出し、逆転写酵素を用いてこれを一本
鎖ｃＤＮＡに変換する。次いで、得られた一本鎖ｃＤＮ
Ａを鋳型とし、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行
う。ここで、プライマーとしては、例えばランダムプラ
イマー（任意の配列からなる約１０〜１２ｍｅｒのプラ
イマー）を用いることができる。あるいは、プライマー
として、アンカードプライマー（anchoured primer）お
よびアービトラリープライマー（arbitraryprimer）各
一種ずつを組み合わせてプライマーとして用いて実施し
てもよく、このようなアンカードプライマーとしては、
オリゴｄ（Ｔ）_nＶＸ［ｎ＝１１〜１２；Ｖ＝グアニ
ン、アデニンまたはシトシン；Ｘ＝グアニン、アデニ
ン、チミンまたはシトシン］からなるプライマーを、ア
ービトラリープライマーとしては、任意の配列からなる
約１０ｍｅｒのランダムプライマーを用いればよい。こ
のようなＰＣＲを、種々のプライマーを組み合わせて行
うことで、より広い範囲の遺伝子群をスクリーニングす
ることが可能となる。続いて、得られたＰＣＲ産物をゲ
ル電気泳動し、ゲル上に展開（ディスプレイ）されるｍ
ＲＮＡの発現パターン（フィンガープリント）を比較解
析することにより、いずれかの動物由来の臓器または細
胞で特異的に発現している遺伝子を選択し、そのｃＤＮ
Ａ断片を単離することができる。なお、この方法は、市
販されているキット（例えばＲＮＡイメージ・キット
（ジェンハンター社製）など）を用いて行うこともでき
る。

【００３７】ディファレンシャル・ハイブリダイゼーシ
ョン法： 目的の細胞から精製したｍＲＮＡから作製し
たｃＤＮＡライブラリーを、目的の細胞のｍＲＮＡから
合成した³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブと対照の細胞のｍＲ
ＮＡから作製したプローブとを用いてスクリーニング
し、目的細胞のプローブとのみハイブリダイズするクロ
ーンを選択する方法である。すなわち、例えばまず対照
動物の臓器または細胞から精製したｍＲＮＡから常法に
従ってｃＤＮＡライブラリーを作製し、そのライブラリ
ーから２組のレプリカフィルターを作製する。次に、対
照動物の臓器または細胞から精製したｍＲＮＡを鋳型と
し、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α-
³²Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識する。標
識されたｃＤＮＡと鋳型となったｍＲＮＡは安定な二本
鎖ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アル
カリ存在下で高温処理することによりｍＲＮＡのみを分
解し、一本鎖ｃＤＮＡを精製する。同様にして変異動物
の臓器または細胞から精製したｍＲＮＡを鋳型にして³²
Ｐで標識された一本鎖ｃＤＮＡを作製する。両標識ｃＤ
ＮＡをそれぞれプローブとして対照動物ライブラリーか
ら作製したフィルターとハイブリダイゼーションを行
う。Ｘ線フィルムのオートラジオグラフィー像を比較
し、対照動物由来ｃＤＮＡプローブにのみハイブリダイ
ズするクローンを選ぶことにより、対照動物に特異的に
発現する遺伝子（すなわち、変異動物において発現がな
いかまたは低下している遺伝子）をクローニングするこ
とができる。

【００３８】クロスハイブリダイゼーション法： 対照
動物または変異動物のいずれかに由来するｃＤＮＡライ
ブラリーに対して、適当なＤＮＡをプローブとして、ス
トリンジェンシーの低い条件でハイブリダイゼーション
を行い、陽性クローンを得る。得られた陽性クローンを
プローブとして、対照動物および変異動物のそれぞれに
由来するｍＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーシ
ョンを行い、一方にのみ発現しているクローンを選択す
る。

【００３９】このようにして得られたｃＤＮＡをプロー
ブとし、対照動物または変異動物由来の臓器または細胞
から抽出したｍＲＮＡに対してノーザンブロッティング
を行うことにより、選択した遺伝子のｍＲＮＡが、対照
動物由来の臓器または細胞で特異的に発現していること
を確認することができる。かくして、対照動物ｍＲＮＡ
として高発現している遺伝子のｃＤＮＡを単離・取得す
ることができる。

【００４０】上記のようにして得られたｃＤＮＡをプロ
ーブとして用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングすることにより、全長ｃＤＮＡを取得できる。ま
た、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することによ
り、遺伝子産物のポリペプチドをコードする翻訳領域を
決定でき、このポリペプチドのアミノ酸配列を得ること
ができる。

【００４１】また、得られたｃＤＮＡをプローブとし
て、ゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより、染色体遺伝子を単離することができる。
さらに、他の哺乳動物のＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングすることにより異種生物由来の相同遺伝子を単離
することができる。このような哺乳動物としては例えば
ラット、マウス、ウサギ、サル、ヒトなどが挙げられ
る。

【００４２】ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノミックＤ
ＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例え
ば、"Molecular Cloning, A Laboratory Manual"（Mani
atis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Cold
Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法により
調製することができる。あるいは、市販のライブラリー
がある場合はこれを用いてもよい。

【００４３】工程ｉｉｉ） 上記工程ｉｉ）において同定された遺伝子が、変異動物
における表現型の変化に実際に関与しているか否かは、
さらに以下のような操作を行うことにより確認すること
ができる。

【００４４】上記工程ｉｉ）の結果、変異動物のある臓
器組織において対照動物の同一臓器組織より多く発現し
ていると判定された遺伝子断片が同定された場合、まず
該遺伝子断片をプローブとして、変異動物の該臓器組織
由来のｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダ
イゼーション法等、本発明の技術分野において周知の方
法を用いて完全長ｃＤＮＡを取得する。

【００４５】この完全長ｃＤＮＡを、対照動物に導入し
て高発現させ、その動物に変異動物と同様の表現型が表
れるか否かを検討する。ｃＤＮＡを動物個体内で高発現
させるには、得られた完全長ｃＤＮＡをウイルスベクタ
ーに組み込み、動物に投与する方法が挙げられる。ウイ
ルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレ
トロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、
ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイ
ルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウ
イルスまたはＲＮＡウイルスに、ＴＲ４あるいは変異Ｔ
Ｒ４をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙
げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイル
ス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた
方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法
としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法
（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン
法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム
法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮ
Ａワクチン法、リポソーム法が好ましい。

【００４６】例えば、アデノウイルスベクターにより遺
伝子導入する場合、組換えアデノウイルスベクターを構
築する方法として、市販のキット（例えば、アデノウイ
ルス・エクスプレッション・ベクター・キット、宝酒造
（株）社製）を用いる方法を例示できる。

【００４７】また、培養細胞レベルでは、完全長ｃＤＮ
Ａをその遺伝子が変異動物で高発現することが判明した
対照動物由来の臓器組織から単離されたかまたは株化さ
れた細胞へ導入し高発現させることにより、変異動物と
同様の表現型の変化が表れるか否か検討したり、逆に、
試験する遺伝子のｍＲＮＡ配列に対するアンチセンス配
列を有する一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを、変異動物の病
態を反映する表現型の変化が検出可能な臓器組織由来の
細胞へ導入し、該表現型が改善されるか否かを検討する
（Wickstrom, E. ed. (1991) Prospects for antisense
nucleic acidtherapy of cancer and AIDS. Wiley-Lis
s, Inc., New York. Field, A. K. andGoodchild, J.
(1995) Exp. Opin. Invest. Drugs. 4, 799-821）こと
もできる。

【００４８】完全長ｃＤＮＡを動物または細胞に導入す
るにあたっては、該ｃＤＮＡを適当なプロモーター、お
よび形質発現に関わる配列を導入されている適当なベク
ターＤＮＡに組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転
換させる。脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、
通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモー
ター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、
および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらに
これは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベク
ターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有す
るｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani, S. et al. (1981) Mo
l. Cell. Biol. 1, 854-864）等が挙げられるが、これ
に限定されない。該発現ベクターは、ジエチルアミノエ
チル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and
Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1
308)、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F.
L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-
457）、および電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al.
(1982) EMBO J. 1, 841-845）などにより細胞に取り込
ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得る
ことができる。

【００４９】また、遺伝子操作により、対照動物で試験
する遺伝子が高発現するように、トランスジェニック動
物を作製し、病態が出現するか否かを検討することも可
能である。逆に、変異動物において試験する遺伝子を破
壊したノックアウト動物を作製し、その病態が改善され
るか否かを検討することも可能である。トランスジェニ
ック動物は、動物から受精卵を取得し、遺伝子導入の
後、偽妊娠動物に移植し発生させることにより得ること
ができ、その手順については、既に確立されている方法
に従うことができる［発生工学実験マニュアル（野村達
次 監修、勝木元也 編、1987年刊）、マウス胚の操作
マニュアル（"Manipulating the Mouse Embryo, A Labo
ratory Manual" B. Hogan, F. Costantini and E. Lacy
著、山内一也、豊田裕、森庸厚、岩倉洋一郎 訳、1989
年刊）、特公平５−４８０９３号公報等参照］。具体的
には、例えばマウスの場合、まず雌マウス（例えばＫＫ
／Ｓａｎ）に排卵誘起剤を投与後、同系統の雄と交配
し、翌日雌マウスの卵管より前核受精卵を採取する。次
いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小ガラス管を用いて
受精卵の前核に注入する。なお、導入する遺伝子を動物
細胞内で発現させるための、プロモーターやエンハンサ
ー等の調節遺伝子としては、導入された動物の細胞内で
機能するものであればいずれも使用することができる。
ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親雌マウス（Ｓｌ
ｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、約２０日後に自然分娩
又は帝王切開により出生させる。このようにして得られ
た動物が導入した遺伝子を保持していることを確認する
方法としては、該動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該Ｄ
ＮＡを鋳型として導入遺伝子に特異的なセンスおよびア
ンチセンスプライマーを用いたＰＣＲを行う方法、該Ｄ
ＮＡを数種の制限酵素で消化後ゲル電気泳動し、ゲル中
のＤＮＡをニトロセルロース膜やナイロン膜等にブロッ
ティングしたものについて導入遺伝子の全部または一部
を標識したものをプローブとしたサザンブロット解析を
行なう方法等を挙げることができる。

【００５０】一方、上記工程ｉｉ）の結果、変異動物の
ある臓器組織において対照動物の同一臓器組織より発現
量が少ない（発現していない場合も含む）と判定された
遺伝子断片が同定された場合も、まず該遺伝子断片をプ
ローブとして、変異動物の該臓器組織由来のｃＤＮＡラ
イブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法
等、本発明の技術分野において周知の方法を用いて完全
長ｃＤＮＡを取得する。

【００５１】そして、この完全長ｃＤＮＡを、変異動物
に導入して高発現させ、その動物の表現型の変化が復帰
するか否か（例えば、表現型の変化が疾患である場合
は、症状が改善するか否か）を検討する。もしくは、培
養細胞レベルでは、完全長ｃＤＮＡをその遺伝子が対照
動物で発現することが判明した変異動物由来の臓器組織
から単離されたかまたは株化された細胞へ導入し高発現
させることにより、表現型の変化を反映する現象が復帰
するか否かを検討したり、逆に、試験する遺伝子のｍＲ
ＮＡ配列に対するアンチセンス配列を有する一本鎖ＤＮ
ＡまたはＲＮＡを、変異動物において表現型の変化を検
出可能な臓器組織に対応する対照動物の臓器組織由来の
細胞へ導入し、変異動物と同様の表現型の変化が表れる
か否かを検討する。遺伝子導入は前述の方法に従って実
施することができる。また、遺伝子操作により、変異動
物で試験する遺伝子が高発現するように、トランスジェ
ニック動物を作製し、病態が改善されるか否かを検討す
るか、または対照動物において試験する遺伝子を破壊し
たノックアウト動物を作製し、その病態が出現するか否
かを検討する。

【００５２】このようにして、工程ｉｉ）で同定された
遺伝子が、着目した病態に実際に関与するか否かを検討
し、その結果、変異動物において過剰発現しており、か
つ対照動物に高発現させると同様の病態を引き起こす遺
伝子、または、対照動物では発現しているのに変異動物
においては発現が少ないかまたは発現しておらず、かつ
変異動物に高発現させると病態が改善される遺伝子は、
該病態の原因遺伝子の一つである可能性が高く、該病態
の効果的な治療法開発の標的となる。

【００５３】下記実施例に示すように、本発明の方法に
従って、先天性低脂血症マウスで発現が少ないことが判
明した遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込み、該
組換えアデノウイルスベクターを有する組換えアデノウ
イルスを、該低脂血症マウスに感染させ、該組換えアデ
ノウイルスベクターが保持する遺伝子を発現させると、
血中中性脂肪濃度の上昇が観察される。本発明の方法に
より疾患原因遺伝子の検索が可能であることは、この事
実から明らかである。

【００５４】

【実施例】 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００５５】

【実施例１】 マウス肝臓からの全ＲＮＡの抽出および
ｍＲＮＡの精製 ＫＫマウス（高脂血症マウス。日本クレア社より入手）
およびＫＫ／Ｓａｎマウス（低脂血症変異マウス。白木
ら、第７回糖尿病動物研究会（１９９３年））の肝臓
（liver）から全ＲＮＡの抽出を行った。１８週齢のＫ
ＫマウスおよびＫＫ／Ｓａｎマウスを解剖してそれぞれ
臓器を摘出し、速やかに液体窒素内に入れ急速冷凍した
後、使用時まで−８０℃に保存した。臓器０．５ｇに対
し約１５ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（ギブコ・ビーアール
エル社製）を加え、超高速ホモジナイザー（ポリトロ
ン。キネマティカ社製）を用いて氷上でホモジナイズを
行った（目盛６で２分間）。これを室温で５分間静置し
た後、３ｍｌのクロロホルムを加え、１５秒間激しく転
倒混和した。再び室温で３分間静置してから、１２００
０×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。遠心後、上層を
回収し、０．８容量のリボヌクレアーゼ不含イソプロピ
ルアルコールを加えて混和した。これを室温で１０分間
静置後、１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した
後、上清を除去してリボヌクレアーゼ不含７０％エタノ
ールを加えた。これを１２０００×ｇ、４℃で１０分間
遠心分離し、上清を除去して、沈殿を乾燥させることに
より、全ＲＮＡを得た。この全ＲＮＡ試料は、使用時ま
で、−８０℃に保存した。

【００５６】上記のようにして得られた全ＲＮＡを、ｍ
ＲＮＡ精製キット（アマシャム・ファルマシア社製クイ
ックプレップｍＲＮＡ精製キット）添付の抽出緩衝液
３．３ｍｌに懸濁し、以下、該精製キットを添付プロト
コールに従って用いることによりｍＲＮＡの精製を行っ
た。

【００５７】

【実施例２】 チップ解析 チップ解析は、アフィメトリクス社の発現解析技術マニ
ュアル（Expression Analysis Technical Manual）に従
って、以下に記載した方法により行った。

【００５８】ａ）ｃＤＮＡの合成 上記実施例１記載の方法で得られた各２μｇのｍＲＮＡ
を出発材料として、上記マニュアル記載に従ってｃＤＮ
Ａの合成および精製を行った（ファーストストランド合
成の反応条件は、３７℃、１．５時間とした）。

【００５９】ｂ）ｃＲＮＡの合成 上記のようにして得られたｃＤＮＡ １μｇを鋳型とし
て、上記マニュアル記載に従ってｃＲＮＡの作製を行っ
た（反応条件は３７℃、４．５時間とした）。この操作
で得られた２０μｇのｃＲＮＡを断片化し、うち１５μ
ｇ相当をプローブ溶液に加えた。

【００６０】ｃ）プローブ溶液の作製 プローブ溶液に加えるコントロールｃＲＮＡ作製用のプ
ラスミドＤＮＡを保持する形質転換大腸菌は、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）か
ら購入した（pglks-bioB（ATCC87487）、pglks-bioC（A
TCC87488）、pglks-bioD（ATCC87489）およびpglks-cre
（ATCC87490））。これら形質転換菌はそれぞれ２００
ｍｌの１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地
（１リットルあたり１２ｇのバクトトリプトン、２４ｇ
のバクトイーストエキストラクト、２．３ｇのＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄、１２．５ｇのＫ₂ＨＰＯ₄および４ｍｌのグリセロ
ールを含む）中で培養した後、アルカリ法にてプラスミ
ドを回収した。これらプラスミドは、さらに塩化セシウ
ム密度勾配超遠心法により精製された。以下、コントロ
ールｃＲＮＡの作製方法およびプローブ溶液の組成とも
に上記マニュアル記載に従った。

【００６１】ｄ）ハイブリダイゼーション 上記のようにして得られたプローブとハイブリダイズさ
せるチップとして、アフィメトリクス社製マウス１９Ｋ
セット（Murine 19K set：１９ｋＡ、１９ｋＢおよび１
９ｋＣ）およびマウス１１Ｋセット（Murine 11K set：
１１ｋＡおよび１１ｋＢ）を用いた。ハイブリダイゼー
ションとその後の洗浄操作は上記マニュアル記載に従っ
て行った（ハイブリダイゼーション条件は、４５℃、１
８−２２時間とした）。

【００６２】ｅ）解析 上記ｄ）でハイブリダイゼーション操作を行ったチップ
のデータ解析も、上記マニュアル記載に従って行った。
ＫＫ/Ｓａｎマウスのデータを基準にしてＫＫマウスで
得られたデータと比較検討した。その結果を図１に示し
た（１９ｋＢチップのデータ）。図中、「Accession Nu
mber」はＴＩＧＲデータベースにおける登録番号を、
「Fold Change」はＫＫ/Ｓａｎを基準としたＫＫマウス
の相対的発現量を表し、例えばある遺伝子のFold Chang
e値が−１０のとき、その遺伝子はＫＫマウスにおいて
ＫＫ／Ｓａｎマウスの１０倍多く発現していることを示
す。ＫＫマウスでＫＫ/Ｓａｎマウスより高発現してい
るものとして、登録番号ＴＣ３４０４３の遺伝子が同定
された（ＫＫマウスにおける発現量がＫＫ/Ｓａｎマウ
スの３５．６倍）。データベース解析より、ＥＳＴクラ
スターは配列表の配列番号１に示される配列であること
が判明し、この配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースに配
列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるマウ
ス・アンジオポエチン５をコードするヌクレオチド配列
として登録されているもの（登録番号：AF162224）と同
一であった。

【００６３】

【実施例３】 ゲノム解析 上記実施例２で同定された遺伝子のゲノミックＤＮＡの
第6エクソンとその周辺配列を基にして、下記の各配
列： 5'- catacttgta atcacagcac ttcgg -3'（ＬＰ３３：配
列表の配列番号３）； 5'- gtcagtcagg tcctgatctg tagtt -3'（ＬＰ３４：配
列表の配列番号４）；および 5'- cacatacacc atcaacatag tgagg -3'（ＬＰ３５：配
列表の配列番号５） からなるオリゴヌクレオチドプライマーを化学合成し
た。

【００６４】一方、文献（Archives of Virology 89, 1
13-130 (1986)）に従ってＫＫ／ＳａｎマウスおよびＫ
Ｋマウスの肝臓よりそれぞれゲノムＤＮＡを調製した。
ＫＫマウスまたはＫＫ／ＳａｎマウスのゲノムＤＮＡ
５００ｎｇ、プライマー（ＬＰ３３およびＬＰ３５）各
２５ｐｍｏｌ、ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡
（株）社製）２．５単位、１０×緩衝液（ｒＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼに添付、１０倍希釈時の終濃度は、５
０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウムおよび０．１
％ トライトンＸ−１００）５μｌ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ 各１０ｐｍｏｌ（＝ｄＮＴ
Ｐ：ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに添付）、および非
特異的増幅防止用抗体試薬（TaqStart Antibody：クロ
ンテック社製）３．５ｐｍｏｌを混合し、蒸留水で全量
５０μｌとしてＰＣＲを行った（温度条件：９４℃で４
５秒、６０℃で４５秒、７２℃で１分３０秒を３０サイ
クル。ジーンアンプＰＣＲシステム９７００（ＰＥバイ
オシステムズ社製）を使用）。

【００６５】これらＰＣＲ産物の一部を０．８％アガロ
ースゲルにて電気泳動し、それぞれ目的の長さの断片
（第６エクソンとその周辺を含む約０．６ｋｂｐの断
片）が増幅されたことを確認した。このＰＣＲ産物を精
製キット（QIAquick PCR purification kit（キアジェ
ン社製））を用いて精製し、得られたＤＮＡを吸光度計
にて定量した。５０ｎｇのＰＣＲ産物に対して３．２ｐ
ｍｏｌのプライマー（ＬＰ３３、ＬＰ３４またはＬＰ３
５）および８μｌのシークエンシング反応用試薬（ビッ
グダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンスＦＳ
レディ・リアクション・キット（ＰＥバイオシステムズ
社製）を加え、蒸留水で全量２０μｌとしてダイターミ
ネータ法によりサイクルシークエンスを行い（温度条
件：９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分を２
５サイクル）、ヌクレオチド配列解析を行った（ＡＢＩ
３７００シークエンサー（ＰＥバイオシステムズ社製）
を使用）。得られた配列をＤＮＡシーケンスソフト（Se
quencher（ジーンコーズ社製））を用いて編集した。

【００６６】このようにして得られたヌクレオチド配列
を比較した結果、ＫＫ／ＳａｎマウスとＫＫマウスにつ
いて発現の著しく異なる遺伝子の第６エクソンの、ＫＫ
／Ｓａｎマウス側において４個（aaga）の挿入が認めら
れた（図２）。この挿入によりフレームシフトが生じる
ことになり、この遺伝子がコードずるタンパク質に関し
ては、ＫＫ／Ｓａｎマウスではオープンリーディングフ
レームがＫＫマウスの場合より１１０アミノ酸残基分短
くなり、少なくとも完全長のものは産生されないことが
判明した。また、この遺伝子の他のエクソンについても
同様に検索を行ったが、ＫＫ／ＳａｎマウスとＫＫマウ
スとの間で相違は見られなかった。

【００６７】

【参考例１】 ｃＤＮＡのクローニング マウス肝臓を材料として、下記の方法に従って実施例２
で同定された配列表の配列番号１に示されるヌクレオチ
ド配列を有するｃＤＮＡを取得した。

【００６８】ａ）マウス肝臓からのｍＲＮＡの抽出 ９週齢のＫＫマウス（雄、浜松医科大学付属動物実験施
設より入手）２匹より解剖して肝臓を摘出後、速やかに
液体窒素中に入れて急速凍結させた。この重量を測定
し、３．１ｇを乳鉢上で液体窒素存在下で粉砕した。
５．５Ｍ グアニジンチオシアネート（以下ＧＴ）緩衝
液（５．５Ｍ グアニジンチオシアネート、２５ｍＭ
クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％ サルコ
シル、０．２Ｍ β−メルカプトエタノール）（３０ｍ
ｌ）を加え、乳棒で破砕し、新たにＧＴ緩衝液（１０ｍ
ｌ）を加え、乳棒で破砕後、溶解液を回収した。また、
ＧＴ緩衝液（２０ｍｌ）で乳鉢を洗浄しこの溶液も回収
した。３６ｍｌの回収液を３０００ｒｐｍ、１０℃で１
０分間遠心後、上清を新しいチューブに移し、各々１８
ゲージの注射針で２０回吸引排出を繰り返した。次にセ
シウム・トリフルオロ酢酸（ＣｓＴＦＡ）を用いた密度
勾配遠心による全ＲＮＡの分離を行った。ＣｓＴＦＡ原
液（１９ｍｌ）をリボヌクレアーゼ不含再蒸留水（１
８．９２４ｍｌ）で希釈し、この希釈液（６．１８ｍ
ｌ）を６本の１３ＰＡ（ベックマン製）チューブに入
れ、先に回収したサンプル（１チューブあたり５．２ｍ
ｌ）を重層した。このものをスイングローター（日立工
機（株）社製Ｐ４０ＳＴ）を用い超遠心機（日立ＳＣＰ
７０Ｈ型）で３００００ｒｐｍ（約１２５０００ｇ）、
２０℃で２０．５時間遠心した後、上清を除去して得ら
れたペレットをｍＲＮＡ精製キット（アマシャム・ファ
ルマシア社製クイックプレップｍＲＮＡ精製キット）添
付の抽出緩衝液 ３．３ｍｌに懸濁した。ｍＲＮＡの精
製は該精製キットを添付プロトコールに従って用いるこ
とにより行った。このようにして得られた５μｇのｍＲ
ＮＡを鋳型とし、ｃＤＮＡライブラリー作製キット（ス
トラタジーン社製ＺＡＰエクスプレス・ｃＤＮＡ・ギガ
パックＩＩＩゴールド・クローニングキット）をその添
付プロトコールに従って用いることにより、λファージ
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００６９】ｂ）ｃＤＮＡライブラリーの１次スクリー
ニング 上記ａ）記載の方法で得られたλファージｃＤＮＡライ
ブラリーを感染させた大腸菌を、直径９ｃｍの培養シャ
ーレに作成した寒天培地プレート（ＮＺＹ培地：０．５
％ 塩化ナトリウム、０．２％ 硫酸マグネシウム７水
和物、０．５％イーストエキストラクト、１％ カゼイ
ン加水分解物、１．５％ 寒天）に、プレート１枚あた
り１．８×１０⁵個のプラークが形成されるように分散
させ、３７℃で８時間培養した。このプラーク形成され
た寒天培地の１４ヶ所について、２５０μｌ用の広径ピ
ペットチップ（ＲＡＩＮＩＮ社製）の底部を用いて寒天
培地をプラークごと抜き取り、それら寒天培地片をそれ
ぞれ１００μｌのＳＭ緩衝液（０．１Ｍ 塩化ナトリウ
ム、８ｍＭ 硫酸マグネシウム、５０ｍＭ トリス−塩
酸（ｐＨ７．５）、０．０１％ ゼラチン）の入ったプ
ラスチック遠心管に入れ、ボルテックスミキサーを用い
て激しく混濁させてから４℃で１〜２時間放置した後、
１２０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収し、フ
ァージ懸濁液とした。

【００７０】一方、ＰＣＲに用いるプライマーとして、
下記のヌクレオチド配列： 5'- gactgatcaa atatgttgag ctt -3'（プライマー１：
配列表の配列番号６）； および 5'- tgcatccaga gtggatccag a -3'（プライマー２：配
列表の配列番号７） を有するオリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡ合成機（モ
デル３９４：（株）パーキンエルマージャパン・アプラ
イドバイオシステムズ事業部製）を用い、ホスホアミダ
イト法（Matteucci, M. D., and Caruthers, M. H. (19
81) J. Am. Chem.Soc. 103, 3185-3191）に従って合成
した。

【００７１】上記のようにして得られたファージ懸濁液
５μｌを、２．５μｌの１０×ＰＣＲ用緩衝液（宝酒造
（株）社製のＴａｑポリメラーゼに添付）、４μｌのｄ
ＮＴＰ混液（各２．５ｍＭ、宝酒造（株）社製のＴａｑ
ポリメラーゼに添付）、各１μｌの各７．５μＭに調整
した上記プライマー１および２、０．２５μｌのＴａｑ
ポリメラーゼ（宝酒造（株）社製）、１１．２５μｌの
滅菌水と混和し、まず９４℃で５分加熱した後、引き続
き９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の
温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で７分間
保温してから、４℃に保存した。反応物は４％のアガロ
ースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ ３：１アガロース（ＦＭＣ
バイオプロダクツ社製）で調製した）で電気泳動して、
特異的断片の増幅を解析した。このようにして１４のフ
ァージ懸濁液をスクリーニングした結果、目的のｃＤＮ
Ａの断片が特異的に増幅される２つの陽性サンプルを得
た。

【００７２】ｃ）２次スクリーニング マウスゲノムＤＮＡ（クローンテック社製）１００ｎｇ
を鋳型にして上記ｂ）に記載した条件でＰＣＲを行い、
アガロース電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片を回
収した。このＤＮＡ断片を鋳型として、マルチプライム
ＤＮＡラベリングシステム（アマシャム・ファルマシア
社）を用いて³²Ｐで標識されたＤＮＡ断片を生成する反
応を行った後、反応液をニックカラム（アマシャム・フ
ァルマシア社製）に注入した。このカラムに４００μｌ
のＴＥ（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）を流して一回洗浄し、さらに４００μｌ
のＴＥを流して溶出液を回収した。この溶出画分全量を
以下の２次スクリーニングに標識プローブとして用い
た。

【００７３】一方、上記ｂ）で陽性と判定されたファー
ジ懸濁液をＳＭ緩衝液で１００倍希釈し、そのうち２μ
ｌ分のファージを感染させた大腸菌を、直径９ｃｍの培
養シャーレに作成した寒天培地プレートに分散させ、３
７℃で８時間培養した。このプラーク形成された寒天培
地上に、シャーレ内径に合わせた円形のナイロンメンブ
レン（アマシャム・ファルマシア社製、ハイボンドＮ
＋）をのせて、４℃にて５分間放置することによりプラ
ークを移しとった。１８Ｇの注射針を用いてメンブレン
の３ヶ所を寒天培地まで貫通することにより位置合わせ
用の目印をつけた後、メンブレンを剥がしてアルカリ溶
液（１．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリ
ウム）に２分間、次いで中和溶液（１．５Ｍ 塩化ナト
リウム、０．５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．０））に５
分間、さらに２×ＳＳＣ、０．２Ｍ トリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．５）を含む溶液に３０秒間浸した後、室温で完全
に風乾させた。

【００７４】このメンブレンを２０ｍｌのハイブリダイ
ゼーション溶液（ExpressHyb Hybridization Solutio
n、クローンテック社製）中で６８℃、１時間インキュ
ベーション（プレハイブリダイゼーション）した後、標
識プローブを含む８ｍｌのハイブリダイゼーション溶液
に交換して６８℃、６時間インキュベーションした。次
いで、このメンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤ
Ｓを含む溶液で、室温下、１５分間緩やかに振盪しなが
ら洗浄する操作を３回繰り返した後、さらに０．１×Ｓ
ＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液で５０℃、３０分間
洗浄する操作を３回繰り返した。

【００７５】洗浄後のメンブレンについてオートラジオ
グラフィーを行い、陽性と認められた位置の元のプラー
クを寒天培地から回収して、そのファージ懸濁液につい
て上記ｂ）に記載した条件でＰＣＲを実施した結果、陽
性プラーク試料１０個中６個においてＤＮＡ断片の特異
的増幅が認められた。

【００７６】このうちもっとも強く増幅が認められた試
料のファージ懸濁液について、ＺＡＰエクスプレス・ｃ
ＤＮＡ・ギガパックＩＩＩゴールド・クローニングキッ
ト（ストラタジーン社製）に添付されたヘルパーファー
ジおよび宿主菌を用いて、該キットに添付のプロトコー
ルに従ってインビボ切り出し（In Vivo Excision）を行
い、寒天培地上にファージミドを含む大腸菌コロニーを
形成させた。これらのコロニーを単離してそれぞれファ
ージミドを抽出し、上記ｂ）に記載の方法でＰＣＲを実
施した結果、ＤＮＡ断片の特異的増幅が見られたコロニ
ーを選択、培養し、１．６ｋｂｐのｃＤＮＡインサート
を有するファージミド＃５５−１を保持する形質転換大
腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＢＫ／ｍ５５−１ ＳＡＮＫ ７
２１９９を単離した。

【００７７】得られたファージミド＃５５−１に挿入さ
れているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列を（株）パーキ
ンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業
部製ＡＢＩプリズム３７７ＤＮＡシークエンサー、ある
いは３７００ＤＮＡシークエンサーを用いて解析した結
果、配列表の配列番号１に示される配列（ＧｅｎＢａｎ
ｋデータベース中のマウス・アンジオポエチン５（登録
番号：AF162224）と同一）であることを確認した。な
お、このファージミド＃５５−１を保持する形質転換大
腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＢＫ／ｍ５５−１ ＳＡＮＫ ７
２１９９は、１９９９（平成１１）年１１月１９日付で
工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４０が付された。

【００７８】

【参考例２】 ノーザンブロット解析 ａ）マウス臓器からの全ＲＮＡの抽出 参考例１で得られたｃＤＮＡの発現している組織を調べ
るため、また、チップ解析から得られた結果を確認する
目的で、ノーザンブロット解析を実施した。まず、ＫＫ
マウス（高脂血症マウス）およびＫＫ／Ｓａｎマウスの
精巣（testis）、脾臓（spleen）、腎臓（kidney）、小
腸（small intestine）、肝臓（liver）および脳（brai
n）から全ＲＮＡの抽出を行った。１８週齢のＫＫマウ
スおよびＫＫ／Ｓａｎマウスを解剖してそれぞれ各臓器
を摘出後、速やかに液体窒素内に入れ急凍した後−８０
℃に保存した。臓器０．５ｇに対し約１５ｍｌのＴＲＩ
ｚｏｌ試薬（ギブコ・ビーアールエル社製）を加え、超
高速ホモジナイザーポリトロン（キネマティカ社製）を
用いて氷上でホモジナイズを行った（目盛６で２分
間）。これを室温で５分間静置した後、３ｍｌのクロロ
ホルムを加え、手で１５秒間激しく転倒混和した。再び
室温で３分間静置してから、１２０００×ｇ、４℃で１
５分間遠心分離した。遠心後、上層を回収し、０．８容
量のリボヌクレアーゼ不含イソプロピルアルコールを加
えて混和した。これを室温で１０分間静置後、１２００
０×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清を除去し
てリボヌクレアーゼ不含７０％エタノールを加えた。こ
れを１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清
を除去して、沈殿を乾燥させてから、−８０℃に保存し
た。

【００７９】ｂ）全ＲＮＡの電気泳動およびブロッティ
ング 回収した各臓器の全ＲＮＡをリボヌクレアーゼ不含再蒸
留水で４μｇ／μｌに調整した後、このＲＮＡ液５μｌ
とＲＮＡ試料緩衝液（１．１５×ＭＯＰＳ緩衝液（１×
ＭＯＰＳ緩衝液は２０ｍＭ ＭＯＰＳ、５ｍＭ 酢酸ナ
トリウム、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（以下「Ｅ
ＤＴＡ」という）を含む）、２．４Ｍホルムアルデヒ
ド、５７％ ホルムアミド、７％ グリセロール、１８
μｇ／ｍｌ ブロモフェノールブルー、１８μｇ／ｍｌ
キシレンシアノール、０．１８ｍＭ ＥＤＴＡ）１６
μｌを混合し、６５℃で１０分間保温した後、氷上で５
分間放置した。この試料液全量を、１．１７％ホルマリ
ンを含む電気泳動用アガロースゲル（１×ＭＯＰＳ緩衝
液、１．１７％ アガロース（高強度、分析用、バイオ
ラッド社製）、０．６６Ｍ ホルムアルデヒド）の１つ
のウェルへ注入し電気泳動した。電気泳動は、５００ｎ
ｇ／ｍｌ 臭化エチジウムの入った１×ＭＯＰＳ緩衝液
の入ったサブマリン電気泳動槽中、５０Ｖで約１時間通
電した後、さらに１００Ｖで約１．５時間通電すること
により行った。電気泳動終了後、アガロースゲル中のＲ
ＮＡをキャピラリートランスファー法（Maniatis, T. e
t al.(1982) in "Molecular Cloning A Laboratory Man
ual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY）に従ってナ
イロンメンブレン（ハイボンドＮ＋、アマシャム・ファ
ルマシア社製）に一晩かけて転写した（転写用溶液は２
０×ＳＳＣを使用した）。このメンブレンを２×ＳＳＣ
で５分間洗浄し、風乾させ、クロスリンク用紫外線照射
装置（スペクトロリンカーＸＬ−１０００、トミー精工
（株）社製）で紫外線を照射（１２００Ｊ／ｃｍ²）し
てＲＮＡを固定した。

【００８０】ｃ）プローブの調製 参考例１のｂ）で合成したプライマーを用い、サーマル
サイクラー（ジーンアンプＰＣＲシステム９６００、
（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシ
ステムズ事業部製）を使用して以下の条件でＰＣＲを行
った。まずプライマー（終濃度各０．５μＭ）とツイー
ン２０（シグマ社製、終濃度０．１％）に滅菌水を加え
て７．５μｌとした後、２×ＰＣＲソルーション・プレ
ミックスＴａｑ（宝酒造（株）社製：０．０５単位／μ
ｌ Ｔａｑポリメラーゼ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２
０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１００ｍＭ 塩
化カリウム、３ｍＭ 塩化マグネシウムを含む）を７．
５μｌ添加した。さらにマウスゲノムＤＮＡ（クローン
テック社製）を１μｌ（１００ｎｇ相当）加え、反応液
を調製した。この反応液を、まず９４℃で３分間加熱し
た後、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で４５秒
の温度サイクルを３５回繰り返してから、４℃で保温し
た。

【００８１】このＰＣＲ後の反応液１μｌをとり、ＴＡ
クローニングキット（デュアルプロモーターバージョン
Ａ、インビトロジェン社製）を添付のプロトコールに従
って用いて、増幅されたＤＮＡ断片をプラスミドベクタ
ーにクローニングした。この組換えプラスミドベクター
でコンピテント大腸菌を形質転換し、５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結
果アンピシリン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニ
ーを選択して、４ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含む液体ＬＢ培地で３７℃で一晩培養した。このうち
３．５ｍｌの培養液からプラスミド自動抽出装置（ＰＩ
−５０、クラボウ社製）を使用してプラスミドＤＮＡを
回収した。得られたプラスミドＤＮＡについてヌクレオ
チド配列解析を行い、目的のＰＣＲ産物が挿入されてい
たプラスミドを以下の操作に用いた。

【００８２】選択されたプラスミドＤＮＡ ８μｇを、
制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、フェノール／クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿を滅
菌水１０μｌに溶解した。この溶液に色素液（０．２５
％ ブロモフェノールブルー、０．２５％ キシレンシ
アノール、１５％ フィコール（タイプ４００））を２
μｌ加えて、全量をポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度８％、１００Ｖ、室温、３時間）した。電気
泳動後のゲルを臭化エチジウムで染色した後、紫外線照
射下で目的のＤＮＡに相当するバンド（約２００ｂｐ、
配列表の配列番号１１）部分のゲル片を剃刀刃で切り取
り、微量遠心チューブに移して粉砕した。このものに３
００μｌの溶出緩衝液（０．５Ｍ 酢酸アンモニウム、
１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％ ＳＤＳ）
を加え、３７℃で一晩保温した後、フェノール／クロロ
ホルム抽出を２回、エタノール沈殿を１回行って、沈殿
を滅菌水２０μｌに溶解した。

【００８３】得られたＤＮＡ溶液５μｌについて、参考
例１のｃ）記載の方法で、³²Ｐで標識されたプローブ
（４００μｌ）を調製した。

【００８４】ｄ）ハイブリダイゼーション 上記ｂ）で作成したメンブレンを２０ｍｌのハイブリダ
イゼーション溶液（ExpressHyb Hybridization Solutio
n、クローンテック社製）中に入れて６８℃で１時間イ
ンキュベーション（プレハイブリダイゼーション）した
後、³²Ｐ標識プローブを含む２０ｍｌのハイブリダイゼ
ーション溶液中で、６８℃で一晩インキュベーションし
た。その後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤ
Ｓを含む溶液中、室温で２０分間、３回洗浄し、さらに
０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液中、５０
℃で２０分間、３回洗浄してから、オートラジオグラフ
ィーを行った。

【００８５】その結果、検出した遺伝子の発現は肝臓の
みでみられ、またその発現量はＫＫマウス（高脂血症マ
ウス）よりもＫＫ／Ｓａｎマウス（低脂血症マウス）で
著しく低下していることが明らかとなった（図３）。こ
の結果はチップ解析で得られた結果と相関するものであ
った。

【００８６】上記実験系において、例えば被検物質存在
下または非存在下で培養したＫＫマウス初代培養肝細胞
からＲＮＡ試料を調製し、以下同様の操作を行うことに
より、被検物質の高脂血症の治療または予防剤としての
効果を調べることができる。この実験において検出され
る遺伝子の発現量を低下させるような被検物質は高脂血
症の治療または予防剤となり得る。多検体処理を行う場
合には、電気泳動を省略してドットブロットやスロット
ブロットを行うこともできる。

【００８７】

【参考例３】 ヒトｃＤＮＡのクローニング １）プローブの調製 配列表の配列番号１に示されるマウスｃＤＮＡに対応す
るヒトｃＤＮＡを取得するため、下記のヌクレオチド配
列： 5'- tcctctagtt atttcctcca g -3'（配列表の配列番号
８）；および 5'- tggtttgcca gcgatagatc -3'（配列表の配列番号
９） を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。

【００８８】次に、ヒトゲノムＤＮＡ（ベーリンガーマ
ンハイム社製、２００ｍｇ／ｍｌ）１μｌ、Ｔａｑポリ
メラーゼ（ｒＴａｑ、宝酒造（株）社製、５単位／μ
ｌ）１μｌ、１０×ＰＣＲ用緩衝液（宝酒造（株）社
製）１０μｌ、ｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）１６μ
ｌ、２０μＭのプライマー各２μｌ、および滅菌水６８
μｌを混合した。この反応液を、９４℃で５分間加熱し
た後、引き続き９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２
℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７
２℃で１０分間保温してから、４℃に保存した。この反
応液を２％ アガロースゲルにて電気泳動した後、増幅
されたＤＮＡバンド部分のゲルを切り出して精製した。
このようにして得られたＤＮＡをＤＮＡ標識キット（Bc
aBestラベリングキット、宝酒造（株）社製）を用いて
³²Ｐで標識したものを下記２）においてプローブとして
用いた。

【００８９】２）ｃＤＮＡライブラリーの１次スクリー
ニング 市販のヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリー（Human Live
r 5'-STRETCH cDNA Library、クローンテック社製）の
うち、１×１０⁶プラークのＤＮＡをナイロンメンブレ
ンに固定した。すなわち、ｃＤＮＡライブラリーを感染
させた大腸菌を直径９ｃｍの培養シャーレに作成した寒
天培地プレート２０枚に、１枚あたり５×１０⁴個のプ
ラークが形成されるように分散させ、３７℃で８時間培
養した。このプラーク形成された寒天培地上に、シャー
レ内径に合わせた円形のナイロンメンブレン（アマシャ
ム・ファルマシア社製、ハイボンドＮ＋）をのせて、４
℃にて５分間放置することによりプラークを移しとっ
た。１８Ｇの注射針を用いてメンブレンの３ヶ所を寒天
培地まで貫通することにより位置合わせ用の目印をつけ
た後、メンブレンを剥がしてアルカリ溶液（１．５Ｍ
塩化ナトリウム、０．５Ｍ 水酸化ナトリウム）に２分
間、次いで中和溶液（１．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．
５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．０））に５分間、さらに
２×ＳＳＣ、０．２Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）を
含む溶液に３０秒間浸した後、室温で完全に風乾させ
た。次いで、クロスリンク用紫外線照射装置（スペクト
ロリンカーＸＬ−１０００、トミー精工（株）社製）で
紫外線を照射（１２００Ｊ／ｃｍ²）してＤＮＡを固定
した。

【００９０】このようにして調製されたメンブレンを、
上記１）で得られた標識プローブを含むハイブリダイゼ
ーション溶液（ExpressHyb solution、クローンテック
社製）中で６５℃で一晩インキュベーションした。その
後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳを含
む溶液で１５分ずつ３回、室温で洗浄してから、さらに
０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液で３０分
ずつ３回、５０℃で洗浄した後、オートラジオグラフィ
ーを行った。

【００９１】その結果判明した陽性のシグナルの位置に
あったプラークを、上記寒天培地プレートから培地ごと
採取し、それぞれ１００μｌのＳＭ緩衝液（０．１Ｍ
塩化ナトリウム、８ｍＭ 硫酸マグネシウム、５０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％ ゼラチ
ン）中に入れてよく懸濁してから４℃で２時間放置した
後、１２０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収し
た。

【００９２】このようにして得られた１次陽性ファージ
液を再び大腸菌に感染させたものを、直径９ｃｍの培養
用シャーレに作製した寒天培地上に、シャーレ１枚あた
り５００個のプラークが形成されるように培養し、上記
の手法を繰り返すことにより２次スクリーニングを行っ
た。得られた２次陽性クローンファージを大腸菌株ＢＭ
２５．８（クローンテック社製）に感染させたものを寒
天培地上で３７℃で培養して、ファージミドを含む大腸
菌コロニーを形成させた。コロニーを単離し、液体培地
で少量培養してファージミドを抽出し、制限酵素消化に
よる挿入断片の解析を行った結果、１．６ｋｂｐの挿入
断片を有する、クローン＃ｈ５−１を有する大腸菌Ｅ．
ｃｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１ ＳＡＮＫ ７２２
９９を単離した。このクローンの挿入断片のヌクレオチ
ド配列を解析した結果、ＧｅｎＢａｎｋにヒト・アンジ
オポエチン−５として登録されているのｃＤＮＡ配列
（登録番号：AF152562）と一致した。なお、このファー
ジミド＃ｈ５−１を保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１ ＳＡＮＫ ７２２９９
は、１９９９（平成１１）年１１月１９日付で工業技術
院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６９４１が付された。

【００９３】

【実施例４】 組換えアデノウイルスの作製および培養
細胞における発現 参考例１で得られたマウス由来のｃＤＮＡを強制発現さ
せるための組換えアデノウイルスは、市販のキット（ア
デノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キッ
ト、宝酒造（株）社製）を用いて作製した。すなわち、
参考例１で得られたファージミドクローン＃５５−１
を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、得ら
れた約１．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をを平滑化したも
のを挿入ＤＮＡ断片として以下の操作に用いた。

【００９４】また、サイトメガロウイルスエンハンサー
とニワトリβ−アクチンプロモーターにより発現される
ように設計されているコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ
（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キ
ットに添付）の制限酵素ＳｗａＩ認識部位にインサート
ＤＮＡ断片を挿入したコスミドｐＡｘＣＡ／ｍＡＰ５を
作製した。ｐＡｘＣＡ／ｍＡＰ５ ＤＮＡおよび末端蛋
白質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイ
ルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）
をリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（ラ
イフテック社製）を用いて２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ１５７３）にコ・トランスフェクションして、組換え
アデノウイルスＡｄ／ｍＡＰ−５を単離し、さらに２９
３細胞中で増幅させた。また、コントロールコスミドｐ
ＡｘＣＡｉＬａｃＺから切り出したＬａｃＺ遺伝子が組
み込まれた組換えアデノウイルスベクターを有するアデ
ノウイルスＡｄ／ＬａｃＺを同様に作製し２９３細胞で
増幅させた。増幅させたウイルスの２９３細胞からの回
収は、まずウイルス感染２９３細胞に３０秒×４回の超
音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を行
い、次いで塩化セシウム密度勾配遠心による精製を２回
繰り返すことによって行った。得られたウイルス液を、
１０％ グリセロールを添加したＰＢＳに対して４℃で
透析した後、使用するまで−７０℃以下で凍結保存し
た。

【００９５】このようにして得られた組換えアデノウイ
ルスを、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２）に約５ｍ．
ｏ．ｉ．（multiplicity of infection：多重感染度）
で感染させ、無血清培地（ダルベッコ修正イーグル培地
（ＤＭＥＭ））で３〜４日培養した後の培養上清を回収
した。この上清１ｍｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチ
ューブに入れ、１００μｌのトリクロロ酢酸を添加して
室温で３分放置した後、卓上遠心機にて１５０００ｒｐ
ｍで５分間遠心した。上清を除去し、氷冷したアセトン
を０．５ｍｌ加えて良く攪拌し、再度卓上遠心機にて１
５０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を除去し、再び
氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて良く攪拌し、卓上
遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分間遠心して、上清を
除いた後、沈殿物を真空乾燥させた。この沈殿物を１０
μｌの蒸留水に溶解させ、２−メルカプトエタノールを
含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオラッド社製）
と混合した後、９９℃で５分間加熱して、電気泳動用試
料を調製した。試料を中でゲル濃度４−２０％のポリア
クリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動した（電気泳動
用緩衝液：２５ｍＭ トリス、１９２ｍＭ グリシン、
０．１％ ＳＤＳ）後、転写緩衝液中で４℃、１時間、
２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレンに転写
した。転写したメンブレンは０．５％ スキムミルクを
添加したＰＢＳ液で４℃で一晩ブロッキングし、洗浄液
（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄し
た。次いで、メンブレンを、５５−１−Ｎ１抗体の精製
前の抗血清と５５−１−Ｃ１抗体の精製前の抗血清を混
合したものを５％ ウシ胎児血清を含む０．０５％ Ｔ
ｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１００００倍希釈した反応液中
に入れて室温で１時間インキュベーションした後、洗浄
液で３回洗浄した。さらに、メンブレンを西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（バ
イオラッド社製）を５％ ウシ胎児血清を含む０．０５
％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１００００倍希釈した反
応液中で室温で１時間インキュベーションした後、洗浄
液で５回洗浄した。このメンブレンをラップフィルム上
に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液に１
分間浸した後、１時間室温で放置してバックグラウンド
を減衰させてから、Ｘ線フィルムを感光させた（３秒
間）。その結果、組換えアデノウイルスＡｄ／ｍＡＰ−
５を感染させたＨｅＬａ細胞培養上清中に特異的なバン
ドが検出された（図４）。

【００９６】一方、ファージミドクローン＃ｈ５−１が
保持するｃＤＮＡがアデノウイルスベクターに組み込ま
れたものを有する組換えアデノウイルス（Ａｄ／ｈＡＰ
５）を調製して同様の実験を行い、ＨｅＬａ細胞に発現
させた培養上清のウエスタンブロット解析を行った結
果、同様に特異的なバンドが検出された（図４）。

【００９７】

【実施例５】 組換えアデノウイルスを用いたインビボ
での発現 上記のようにして精製された組換えアデノウイルスＡｄ
／ｍＡＰ−５またはＡｄ／ＬａｃＺを、１０％グリセロ
ールを含むＰＢＳで２×１０¹⁰ｐｆｕ（plaqueforming
unit）／ｍｌに希釈し、それぞれ３匹（Ａｄ／ｍＡＰ−
５）または２匹（Ａｄ／ＬａｃＺ）の１３−１４週齢の
雄ＫＫ／Ｓａｎマウスに１００μｌ（２×１０⁹ｐｆ
ｕ）ずつ尾静脈注射により接種した。接種１日後に各マ
ウスの眼底よりヘマトクリット管で採血して、卓上遠心
機で５２００ｒｐｍ１５分遠心して血漿を分離し、中性
脂肪測定用キット（トリグリセリドＥ−テストワコー、
和光純薬（株）社製）を用いて中性脂肪濃度を測定し
た。Ａｄ／ＬａｃＺ接種マウス群では血中の中性脂肪濃
度に有意な差が認められなかったのに対し、Ａｄ／ｍＡ
Ｐ５接種マウス群と他の２群の間には血中の中性脂肪濃
度に有意な差が認められた（図５）。

【００９８】一方、ファージミドクローン＃ｈ５−１が
保持するｃＤＮＡがアデノウイルスベクターに組み込ま
れたものを有する組換えアデノウイルス（Ａｄ／ｈＡＰ
５）で同様の実験を行い、雄ＫＫ／Ｓａｎマウスに発現
させた結果、血中の中性脂肪濃度の有意な上昇がみら
れ、ヒト型分子がマウス体内でも機能することが判明し
た（図５）。

【００９９】また、これら血中の中性脂肪濃度に有意差
が認められたアデノウイルス感染マウス群の肝臓から全
ＲＮＡを回収し、参考例２記載の方法でノーザンブロッ
ト解析を行ったところ、導入した遺伝子が実際に高発現
していることが確認された（図６）。アデノウイルス感
染ＫＫ／Ｓａｎマウス群で検出されるバンドは、遺伝子
操作を行っていないＫＫマウスで検出されるバンドより
も大きいが、これは組換えアデノウイルスベクター中で
有効な転写開始点またはポリ（Ａ）付加シグナルが本来
の遺伝子上のものとは異なることに起因すると考えられ
る。いずれにせよ、組換えアデノウイルスベクターに組
み込まれたｃＤＮＡ中の最初の翻訳開始コドンのすぐ
５’末端側には、該翻訳開始コドンと同一読み枠上に終
始コドンが存在するため、このｍＲＮＡの大きさの違い
は翻訳されるアミノ酸配列には影響しない。

【０１００】

【発明の効果】 以上述べたように、本発明により、変
異遺伝子を検索する新規な方法が提供された。本発明の
方法は、タンパク質の産生異常に起因する種々の疾患の
原因遺伝子の同定に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 チップ解析の結果を表す図。

【図２】 ＫＫマウスとＫＫ／Ｓａｎマウスとの間で見
つかった変異部分のヌクレオチド配列比較図。

【図３】ＫＫマウス臓器由来の試料についてのノーザン
ブロット解析の結果を表す図。

【図４】 遺伝子導入ＨｅＬａ細胞培養上清を試料とし
たウエスタンブロット解析の結果を表す図。

【図５】 組換えアデノウイルスを感染させたＫＫ／Ｓ
ａｎマウスの末梢血中の中性脂肪濃度測定結果を表す
図。

【図６】 ＫＫマウスおよび組換えアデノウイルスを感
染させたＫＫ／Ｓａｎマウスの肝臓由来の試料について
のノーザンブロット解析の結果を表す図。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sankyo Company, Limited <120> Method for Searching a Mutated Gene <130> 2000100SS <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1604 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (47)..(1411) <400> 1 ggcacgaggt tccaaattgc ttaaaattga ataattgaga caaaaa atg cac aca 55 Met His Thr 1 att aaa tta ttc ctt ttt gtt gtt cct tta gta att gca tcc aga gtg 103 Ile Lys Leu Phe Leu Phe Val Val Pro Leu Val Ile Ala Ser Arg Val 5 10 15 gat cca gac ctt tca tca ttt gat tct gca cct tca gag cca aaa tca 151 Asp Pro Asp Leu Ser Ser Phe Asp Ser Ala Pro Ser Glu Pro Lys Ser 20 25 30 35 aga ttt gct atg ttg gat gat gtc aaa att tta gcg aat ggc ctc ctg 199 Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn Gly Leu Leu 40 45 50 cag ctg ggt cat gga ctt aaa gat ttt gtc cat aag act aag gga caa 247 Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr Lys Gly Gln 55 60 65 att aac gac ata ttt cag aag ctc aac ata ttt gat cag tct ttt tat 295 Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln Ser Phe Tyr 70 75 80 gac cta tca ctt cga acc aat gaa atc aaa gaa gag gaa aag gag cta 343 Asp Leu Ser Leu Arg Thr Asn Glu Ile Lys Glu Glu Glu Lys Glu Leu 85 90 95 aga aga act aca tct aca cta caa gtt aaa aac gag gag gtg aag aac 391 Arg Arg Thr Thr Ser Thr Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu Val Lys Asn 100 105 110 115 atg tca gta gaa ctg aac tca aag ctt gag agt ctg ctg gaa gag aag 439 Met Ser Val Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu Glu Glu Lys 120 125 130 aca gcc ctt caa cac aag gtc agg gct ttg gag gag cag cta acc aac 487 Thr Ala Leu Gln His Lys Val Arg Ala Leu Glu Glu Gln Leu Thr Asn 135 140 145 tta att cta agc cca gct ggg gct cag gag cac cca gaa gta aca tca 535 Leu Ile Leu Ser Pro Ala Gly Ala Gln Glu His Pro Glu Val Thr Ser 150 155 160 ctc aaa agt ttt gta gaa cag caa gac aac agc ata aga gaa ctc ctc 583 Leu Lys Ser Phe Val Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ile Arg Glu Leu Leu 165 170 175 cag agt gtg gaa gaa cag tat aaa caa tta agt caa cag cac atg cag 631 Gln Ser Val Glu Glu Gln Tyr Lys Gln Leu Ser Gln Gln His Met Gln 180 185 190 195 ata aaa gaa ata gaa aag cag ctc aga aag act ggt att caa gaa ccc 679 Ile Lys Glu Ile Glu Lys Gln Leu Arg Lys Thr Gly Ile Gln Glu Pro 200 205 210 tca gaa aat tct ctt tct tct aaa tca aga gca cca aga act act ccc 727 Ser Glu Asn Ser Leu Ser Ser Lys Ser Arg Ala Pro Arg Thr Thr Pro 215 220 225 cct ctt caa ctg aac gaa aca gaa aat aca gaa caa gat gac ctt cct 775 Pro Leu Gln Leu Asn Glu Thr Glu Asn Thr Glu Gln Asp Asp Leu Pro 230 235 240 gcc gac tgc tct gcc gtt tat aac aga ggc gaa cat aca agt ggc gtg 823 Ala Asp Cys Ser Ala Val Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Val 245 250 255 tac act att aaa cca aga aac tcc caa ggg ttt aat gtc tac tgt gat 871 Tyr Thr Ile Lys Pro Arg Asn Ser Gln Gly Phe Asn Val Tyr Cys Asp 260 265 270 275 acc caa tca ggc agt cca tgg aca tta att caa cac cgg aaa gat ggc 919 Thr Gln Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Lys Asp Gly 280 285 290 tca cag gac ttc aac gaa aca tgg gaa aac tac gaa aag ggc ttt ggg 967 Ser Gln Asp Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Glu Lys Gly Phe Gly 295 300 305 agg ctc gat gga gaa ttt tgg ttg ggc cta gag aag atc tat gct ata 1015 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ala Ile 310 315 320 gtc caa cag tct aac tac att tta cga ctc gag cta caa gac tgg aaa 1063 Val Gln Gln Ser Asn Tyr Ile Leu Arg Leu Glu Leu Gln Asp Trp Lys 325 330 335 gac agc aag cac tac gtt gaa tac tcc ttt cac ctg ggc agt cac gaa 1111 Asp Ser Lys His Tyr Val Glu Tyr Ser Phe His Leu Gly Ser His Glu 340 345 350 355 acc aac tac acg cta cat gtg gct gag att gct ggc aat atc cct ggg 1159 Thr Asn Tyr Thr Leu His Val Ala Glu Ile Ala Gly Asn Ile Pro Gly 360 365 370 gcc ctc cca gag cac aca gac ctg atg ttt tct aca tgg aat cac aga 1207 Ala Leu Pro Glu His Thr Asp Leu Met Phe Ser Thr Trp Asn His Arg 375 380 385 gca aag gga cag ctc tac tgt cca gaa agt tac tca ggt ggc tgg tgg 1255 Ala Lys Gly Gln Leu Tyr Cys Pro Glu Ser Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 390 395 400 tgg aat gac ata tgt gga gaa aac aac cta aat gga aaa tac aac aaa 1303 Trp Asn Asp Ile Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 405 410 415 ccc aga acc aaa tcc aga cca gag aga aga aga ggg atc tac tgg aga 1351 Pro Arg Thr Lys Ser Arg Pro Glu Arg Arg Arg Gly Ile Tyr Trp Arg 420 425 430 435 cct cag agc aga aag ctc tat gct atc aaa tca tcc aaa atg atg ctc 1399 Pro Gln Ser Arg Lys Leu Tyr Ala Ile Lys Ser Ser Lys Met Met Leu 440 445 450 cag ccc acc acc taagaagctt caactgaact gagacaaaat aaaagatcaa 1451 Gln Pro Thr Thr 455 taaattaaat attaaagtcc tcccgatcac tgtagtaatc tggtattaaa attttaatgg 1511 aaagcttgag aattgaattt caattaggtt taaactcatt gttaagatca gatatcaccg 1571 aatcaacgta aacaaaattt atctttttca atc 1604 <210> 2 <211> 455 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met His Thr Ile Lys Leu Phe Leu Phe Val Val Pro Leu Val Ile Ala 1 5 10 15 Ser Arg Val Asp Pro Asp Leu Ser Ser Phe Asp Ser Ala Pro Ser Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Arg Thr Asn Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Ser Thr Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Val Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Thr Ala Leu Gln His Lys Val Arg Ala Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Asn Leu Ile Leu Ser Pro Ala Gly Ala Gln Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Ser Phe Val Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ile Arg 165 170 175 Glu Leu Leu Gln Ser Val Glu Glu Gln Tyr Lys Gln Leu Ser Gln Gln 180 185 190 His Met Gln Ile Lys Glu Ile Glu Lys Gln Leu Arg Lys Thr Gly Ile 195 200 205 Gln Glu Pro Ser Glu Asn Ser Leu Ser Ser Lys Ser Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Pro Leu Gln Leu Asn Glu Thr Glu Asn Thr Glu Gln Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Ala Asp Cys Ser Ala Val Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255 Ser Gly Val Tyr Thr Ile Lys Pro Arg Asn Ser Gln Gly Phe Asn Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Thr Gln Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 275 280 285 Lys Asp Gly Ser Gln Asp Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Glu Lys 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ala Ile Val Gln Gln Ser Asn Tyr Ile Leu Arg Leu Glu Leu Gln 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Ser Lys His Tyr Val Glu Tyr Ser Phe His Leu Gly 340 345 350 Ser His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Val Ala Glu Ile Ala Gly Asn 355 360 365 Ile Pro Gly Ala Leu Pro Glu His Thr Asp Leu Met Phe Ser Thr Trp 370 375 380 Asn His Arg Ala Lys Gly Gln Leu Tyr Cys Pro Glu Ser Tyr Ser Gly 385 390 395 400 Gly Trp Trp Trp Asn Asp Ile Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 405 410 415 Tyr Asn Lys Pro Arg Thr Lys Ser Arg Pro Glu Arg Arg Arg Gly Ile 420 425 430 Tyr Trp Arg Pro Gln Ser Arg Lys Leu Tyr Ala Ile Lys Ser Ser Lys 435 440 445 Met Met Leu Gln Pro Thr Thr 450 455 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 catacttgta atcacagcac ttcgg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 gtcagtcagg tcctgatctg tagtt 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 cacatacacc atcaacatag tgagg 25 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 gactgatcaa atatgttgag ctt 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 tgcatccaga gtggatccag a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tcctctagtt atttcctcca g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tggtttgcca gcgatagatc 20

フロントページの続き (72)発明者 古川 秀比古 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA03 CA04 CA09 CA12 DA02 DA06 EA02 EA03 EA04 GA11 GA18 GA19 GA25 HA14 4B029 AA07 FA15 4B063 QA01 QA07 QA17 QA19 QQ53 QQ58 QR35 QR56 QR84 QS05 QS34 QS36 QS38 QX02

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子突然変異を有しており、かつその
   変異遺伝子が特定されていない動物における変異遺伝子
   を特定する方法であって、下記の工程ｉ）からｉｉ）： ｉ） ある系統の動物（以下「対照動物」という）の組
   織または細胞と、対照動物の系統から突然変異により得
   られ、該突然変異の結果、対照動物が有する表現型と異
   なった表現型を表す動物（以下「変異動物」という）の
   対応する組織または細胞から、それぞれメッセンジャー
   ＲＮＡを抽出し、該メッセンジャーＲＮＡを出発材料と
   して相補的ＲＮＡまたは相補的ＤＮＡを調製する工程；
   および ｉｉ） 上記工程ｉ）で得られた相補的ＲＮＡまたは相
   補的ＤＮＡを用いて、変異動物と対照動物との間で発現
   量が変動している遺伝子を同定する工程、を含むことを
   特徴とする方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の方法において、変異動物
   にのみ表れる表現型が病変として表れるものであること
   を特徴とする方法。
3. 【請求項３】変異動物および対照動物がマウスであるこ
   とを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
4. 【請求項４】 変異動物がＫＫ／Ｓａｎマウス、対照動
   物がＫＫマウスであることを特徴とする、請求項３記載
   の方法。
5. 【請求項５】 請求項１乃至４のいずれか１つに記載の
   方法であって、工程ｉｉ）において変異動物と対照動物
   との間で発現量が変動している遺伝子を同定する手段と
   して、変異動物および対照動物と同種の動物の組織また
   は細胞由来の相補的ＤＮＡ群または該ＤＮＡの部分配列
   で作製された遺伝子チップを用いることを特徴とする方
   法。
6. 【請求項６】 遺伝子突然変異を有しており、かつその
   変異遺伝子が特定されていない動物における変異遺伝子
   を特定する方法であって、下記の工程ｉ）からｉｉ
   ｉ）： ｉ） ある系統の動物（以下「対照動物」という）の組
   織または細胞と、対照動物の系統から突然変異により得
   られ、該突然変異の結果、対照動物が有する表現型と異
   なった表現型を表す動物（以下「変異動物」という）の
   対応する組織または細胞から、それぞれメッセンジャー
   ＲＮＡを抽出し、該メッセンジャーＲＮＡを出発材料と
   して相補的ＲＮＡまたは相補的ＤＮＡを調製する工程； ｉｉ） 上記工程ｉ）で得られた相補的ＲＮＡまたは相
   補的ＤＮＡを用いて、変異動物と対照動物との間で発現
   量が変動している遺伝子を同定する工程；および ｉｉｉ） 工程ｉｉ）の結果、対照動物より変異動物で
   多く発現していると判定された遺伝子由来の相補的ＤＮ
   Ａを対照動物または対照動物由来の細胞に高発現させ
   て、変異動物と同様の表現型の変化が現れるか否かを検
   定するか、または変異動物より対照動物で多く発現して
   いると判定された遺伝子由来の相補的ＤＮＡを変異動物
   または変異動物由来の細胞に高発現させて、変異動物の
   表現型の変化が対照動物のもつ表現型に復帰するか否か
   を検定する工程、を含むことを特徴とする方法。
7. 【請求項７】 請求項６記載の方法において、変異動物
   にのみ表れる表現型が病変として表れるものであること
   を特徴とする方法。
8. 【請求項８】変異動物および対照動物がマウスであるこ
   とを特徴とする、請求項６または７記載の方法。
9. 【請求項９】 変異動物がＫＫ／Ｓａｎマウス、対照動
   物がＫＫマウスであることを特徴とする、請求項８記載
   の方法。
10. 【請求項１０】 請求項６乃至９のいずれか１つに記載
    の方法であって、工程ｉｉ）において変異動物と対照動
    物との間で発現量が変動している遺伝子を同定する手段
    として、変異動物および対照動物と同種の動物の組織ま
    たは細胞由来の相補的ＤＮＡ群または該ＤＮＡの部分配
    列で作製された遺伝子チップを用いることを特徴とする
    方法。
11. 【請求項１１】 請求項６乃至１０のいずれか１つに記
    載の方法において、工程ｉｉｉ）記載の相補的ＤＮＡの
    導入が、該相補的ＤＮＡが組み込まれたアデノウイルス
    ベクターを含むアデノウイルスの感染によるものである
    ことを特徴とする方法。