JPH11505125A

JPH11505125A - 血管拡張性運動失調症遺伝子及びそのゲノム構成

Info

Publication number: JPH11505125A
Application number: JP8535048A
Authority: JP
Inventors: ヨセフシロー
Original assignee: ラモットユニヴァーシティーオーソリティフォアアップライドリサーチアンドインダストリアルディヴェロプメントリミテッド
Priority date: 1995-05-16
Filing date: 1996-05-16
Publication date: 1999-05-18
Also published as: US5858661A; AU5860796A; EP0826031A4; MX9708791A; ATE288474T1; US6265158B1; DE69634296D1; WO1996036691A1; EP0826031B1; AU696397B2; EP0826031A1; US6200749B1; CA2217969A1

Abstract

(57)【要約】突然変異が血管拡張性運動失調症を生じる、ATM と称される、精製され、単離された遺伝子、そのゲノム構成、その欠損遺伝子の検出方法、その欠損遺伝子によりコードされた精製ポリペプチド、及びその欠損タンパク質を認識する抗体。

Description

【発明の詳細な説明】血管拡張性運動失調症遺伝子及びそのゲノム構成本発明は、ATM と称される突然変異が血管拡張性運動失調症(A-T)を引き起こす遺伝子配列の決定、及びA-T 遺伝子のキャリヤーの検出における遺伝子及び遺伝子産物の使用、並びにATM 遺伝子またはその他の種中のその同族体によりコードされた遺伝子産物が人工的に生産され、または天然ATM 遺伝子の発現が変更される天然生物及びトランスジェニック生物の調製に関する。発明の背景血管拡張性運動失調症(A-T)は中枢神経系及び免疫系を冒し、かつ染色体の不安定性、癌素因、放射線感受性、及び細胞サイクル異常を伴う進行性遺伝的疾患である。A-T の細胞表現型の研究は、ＤＮＡ損傷の特定の型を処理し、かつ細胞サイクルの進行及び修復を調節するシグナル変換経路を開始する推定の系の欠陥を指摘していた。血管拡張性運動失調症の一般の総説について、総説Ataxia-Te- langiectasis: Closer to Unraveling the Mystery ，Eur.J.Hum.Genet．(Shiloh ,1995)(これはその引用文献とともに参考として本明細書に含まれる)並びにHar- nden(1994)及びTaylorら(1994)による総説がここに参考として含まれる。過去20年にわたる広範な研究にもかかわらず、A-T は臨床上及び分子上の謎のままであった。A-T は1:40,000〜1:100,000 生産の世界の平均頻度及び米国の人口の１％の推定キャリヤー頻度で常染色体劣性様式で遺伝される多系疾患である。米国以外のA-T 患者の顕著な集中はトルコ、イタリア及びイスラエルである。イスラエルのA-T 患者はモロッコのユダヤ教徒、パレスチナのアラブ人、ベドウィン族及びドルーズ派である。汎発性運動障害に徐々に発達する小脳性運動失調は最初の臨床上の特徴であり、小脳中のプルキンエ細胞の進行性損失により生じる。眼皮膚の血管拡張（血管の拡張）は延髄結膜及び顔の皮膚中で発生し、その後に毛髪の灰色化及び皮膚の萎縮変化により伴われる。小脳性運動失調及び結膜そして時折の顔の皮膚の血管拡張−その疾患の第二の早期特徴−の同時発生は通常その他の小脳性運動失調からのA-T の差別的診断を証明する。体成長が殆どの患者で遅延され、卵巣発育不全が女性患者に典型的である。時折の内分泌異常の中で、インスリン耐性糖尿病が優勢であり、α−胎児タンパク質及び癌胎児抗原の血清レベルが上昇される。胸腺が不在または痕跡であり、またその他の免疫的欠陥として、血清IgA、IgE またはIgG2の低下されたレベル、末梢リンパ球減少、並びにウイルス抗原及び同種細胞に対する低下された応答（これらは多くの患者に再発性気道感染症を患わせる）が挙げられる。 A-T の癌素因は顕著である。患者の38％が悪性腫瘍、主としてリンパ細網腫瘍及び白血病を発生する。しかしながら、A-T 患者は急性放射線感受性を発現し、減少された放射線用量で治療される必要があり、放射線模擬化学療法では治療されない。典型的には寿命の第二または第三の10年間中のA-T に最も共通の死亡原因は悪性または非悪性の気道感染症である。その疾患の複雑さはまた細胞表現型に反映される。染色体の不安定性は増大された染色体の破壊及び免疫系遺伝子の遺伝子座を特別に伴うクローントランスロケーションのリンパ球の出現として表される。このようなクローンはその後にリンパ細網悪性腫瘍が現れる時に優勢になるかもしれない。A-T 患者からの原発性繊維芽細胞系は加速された老化、或る種の成長因子に対する増大された要求、及び欠損の細胞骨格構造を示す。イオン放射線及び或る種の放射線模擬薬品に対するA-T 細胞の異常な応答が最も顕著である。これらの薬剤の細胞毒性作用及び染色体異常誘発作用に過敏であるが、ＤＮＡ合成は正常細胞中よりも少ない程度にこれらの薬剤により抑制される。放射線誘発細胞サイクル遅延及びp53 タンパク質の放射線誘発上昇の減少の同時の欠如は細胞サイクルのG1期、Ｓ期及びG2期における欠損チェックポイントの証拠である。G1及びG2チェックポイント欠損はイオン放射線または放射線模擬薬品による治療後の細胞サイクル進行の低下された遅延として明らかであるが、放射線誘発G1停止と正常細胞中で通常関連するp53 タンパク質レベルの上昇がA-T 細胞中で遅延される。Ｓ期における欠損チェックポイントは放射線耐性ＤＮＡ合成(RDS)として容易に観察される。A-T 細胞中の増大された染色体内組換えがまた最近注目された。ＤＮＡ損傷薬剤及びRDS に対する細胞感受性がA-T 表現型の不可欠な部分であると通常考えられる。これらの臨床上及び細胞上の特徴は全ての“古典的な”A-T患者に共通と考えられるが、変化が注目されていた。その後の発症、遅い臨床的進行、低下された放射線感受性及びRDS の時折の不在を伴うその疾患の軽度の形態が幾つかの民族グループで記載されていた(Fiorilli，1985; Taylor ら，1987; Ziv ら，1989; Chessaら，1992)。A-T におそらく関係する付加的な表現型変動性が運動失調、免疫不全及び血管拡張によらない染色体不安定性の種々の組み合わせにより“部分A-T 表現型”を示す幾つかの疾患により示唆される(12-16)(Ying＆Decoteau， 1983; Byrne ら，1984; Aicardi ら，1988; Maseratiら，1988; Friedman＆Wei- tberg，1993)。更に、その他の疾患がA-T 表現型及び付加的な特徴を示す。A-T 特徴を血管拡張ではなく、小頭症、時折精神遅滞と合わせるニジメゲン(Nijmege n)破壊症候群が最も顕著である(Weemaesら，1994)。細胞発生分析またはＤＮＡ合成の測定を使用するA-T の出生前診断が報告されていたが、これらの試験は労力を要し、バックグラウンド変動を受け、それ故、広く使用されない。 A-T ホモ接合体はA-T 遺伝子の二つの欠損コピーを有し、その疾患で冒される。A-T ヘテロ接合体（キャリヤー）はその遺伝子の一つの正常なコピー及びその遺伝子の一つの欠損コピーを有し、一般に健康である。二つのキャリヤーが子供を有する場合、妊娠毎にA-T に冒された子供を産む25％のリスクがある。 A-T ヘテロ接合体は有意に過剰の種々の悪性腫瘍を示し、20〜80の年齢であらゆる癌について３〜４倍に増大されたリスクがあり、婦人では乳癌の５倍に増大されたリスクがある。これらの観察はA-T を公衆の健康問題に変え、重要性をA- T 研究、特にヘテロ接合体同定に加える。A-T ヘテロ接合体からの培養細胞は実際にＸ線感受性の中間の程度を示すが、正常な細胞との相違はこの基準をキャリヤー検出のための実験アッセイとして使用して正当化するのに常に充分に大きいとは限らない。このアッセイの信頼性のないことの主たる理由は放射線感受性に関してA-T ヘテロ接合体と非ヘテロ接合体の重なりの種々の程度である。キャリヤーに関する細胞発生アッセイは出生前診断と同じ問題を有し、それらは労力を要し、常に一致するとは限らない。 A-T 中に欠いているタンパク質の性質は知られていない。細胞融合研究はＡ、Ｃ、Ｄ及びＥと称される四つの相補性グループを証明し、少なくとも四つの遺伝子の可能な関与または対立遺伝子間の相補性による一つの遺伝子中の突然変異の四つの型を示唆した。これらの四つのグループは臨床上区別できず、今日まで類別された或る80人の患者の55％、28％、14％及び３％を占めることがわかった。イスラエルでは、幾人かのモロッコのユダヤ教徒患者がグループＣに指定され、一方、パレスチナのアラブ人患者がグループＡに指定された。推定の一種以上のA-T 遺伝子の一般の染色体局在化が測定されたが、その配列は測定されなかった。A-T(A)突然変異を含むA-T 遺伝子座が、Gatti ら(1988)によりリンケージ分析を使用して染色体11、領域q22-23に局在化された。A-T(C)遺伝子座が、本件出願人により延長されたユダヤ系モロッコ人A-T ファミリー(Ziv ら，1991)のリンケージ分析により染色体11の同領域、領域q22-23に局在化された。本件出願人が参加した国際コンソーシアムにより行われた更なる研究(McCo- nvilleら，1990; Foroudら，1991; Ziv ら，1992)は、一連の研究においてこの局在化を再確認し、A-T 遺伝子座を４センチモルガンで推定された間隔（これはおそらくまたA-T(E)突然変異を含む）に徐々に狭くした。相補性グループＤに提案された遺伝子は1995年３月７日に発行されたMurnane らの米国特許第5,395,767 号明細書に開示されている。この配列はA-T の相補性グループ中で突然変異されないことがわかった。更に、その遺伝子配列が推定A- T 遺伝子座から物理的に離れてマッピングされた。それ故、A-T の性質及び作用を良く理解するだけでなく、A-T に関する欠損遺伝子を有し得る個体を正確かつ一致して測定するために、突然変異がA-T を生じる原因である遺伝子配列を単離し、測定し、この配列をA-T のキャリヤーを検出するための基礎として利用し、それにより欠損遺伝子のこれらのキャリヤーの基礎となる条件及び素因を有利に操作することができることは有利であろう。本発明の要約及び利点本発明によれば、ATM と称される遺伝子及び血管拡張性運動失調症(A-T)を生じるこの遺伝子の突然変異が精製され、単離され、配列決定されただけでなく、その遺伝子の突然変異及び遺伝子のゲノム構成が測定された。更に、本発明は集団及び欠損A-T 遺伝子産物中の欠損A-T 遺伝子のキャリヤーの同定方法を含む。癌素因中のATM 遺伝子の役割はこの遺伝子をスクリーニングに重要な標的にする。A-T 突然変異キャリヤーの検出はそれらの放射線感受性に鑑みて特に重要であり、その結果、放射線へのキャリヤー暴露が適切に監視され、回避し得る。図面の簡単な説明本発明のその他の利点は添付図面と関連して考慮される時に以下の詳細な説明を参考とすることにより容易に認められると同時に更に良く理解されるようになる。図1A-Eは一種以上のA-T 遺伝子を同定するための位置クローニング工程を示し、図1AはA-T 領域をスパンするゲノムコンティグ(contig)内にミクロサテライトマーカーを生じ、同コンティグを使用して利用可能なマーカーの物理的マッピングにより構築された染色体11q22-23（Vanagaite ら，1995）に関するA-T 領域の高密度マーカーマップであり、接頭辞“D11”がマーカー表示から省かれ、EDX: 副腎フェレドキシン遺伝子、ACAT: アセトアセチル−コエンザイムＡチオラーゼ遺伝子、点描されたボックスはコンソーシアムリンケージ研究(Langeら，1995) においてマーカーS1818 とS1819 の間の個々の組換え体により最近形成されたA- T 間隔を表し、中実ボックスはS1294 とS384の間の間でその研究で得られたA-T に関するツー−ロッド(two-lod)信頼間隔を示す。図1Bはこの領域を横切って構築されたYAC コンティグ(Rotman ら，1994c)の一部を示す。図1CはYAC クローンY16 及びY67 による染色体-11 特異性コスミドライブラリーのスクリーニング、そしてその後の物理マッピング(Shiloh，1995)によるコスミドクローンのコンティグアッセンブリーにより生じたS384-S1818間隔をスパンするコスミドコンティグの部分を示す。図1Dは遺伝子ハンティング実験の生産物を示し、中実ボックスは種々の組織からｃＤＮＡのハイブリッド選択(Lovett ら，1991; Tangleら，1993)のためにコスミド及びYAC クローンを使用することにより得られたｃＤＮＡフラグメントを表し、オープンボックスはエクソントラッピング(Church ら，1993)によりこれらのコスミドから単離された推定エクソンを表し、これらの配列は特定のコスミド（破線）に逆にハイブリッド形成され、これはコンティグの特定のサブ領域（点付きの枠）へのそれらの物理的局在化を可能にした。図1Eは1DのｃＤＮＡフラグメント及びエクソンをプローブとして使用して繊維芽細胞ｃＤＮＡライブラリー中で同定された7-9 と称される5.9 kbｃＤＮＡクローン（配列番号１）を示し、オープンボックスは5124ヌクレオチドの読み取り枠を表し、実線は翻訳されなかった領域を表し、空にされた矢じりは3'末端の二つのAlu 要素を表し、ｃＤＮＡフラグメントとエクソンｃＤＮＡの間に描かれた点線は配列の共直線性を示す。図２はATM 領域及びｃＤＮＡに対する関係の物理マップの線図であり、上部ラインは既知の遺伝子マーカー（接頭辞D11 がマーカー表示から省かれた）を含む領域の線形マップを表し、コスミドA12 の末端間のアーチでその領域をスパンするコスミドコンティグの一部が線形マップの下に示され、B4はゲノムPCR 産物を表し、ATM ORF をスパンするｃＤＮＡクローンのコンティグが図の下部に示され、破線はコスミドコンティグを有する特定のｃＤＮＡ配列の位置を表す。図３はATM 遺伝子のエクソン−イントロン構成の略図であり、垂直の線はATM エクソンの位置を表し、3'エクソン及び全てのイントロンが縮尺して描かれている。図４はATM 転写産物の読み取り枠（斜線）に沿った44のA-T 突然変異の略図であり、大きい欠失について、記号は5'切断点の位置をマークし、線の上の記号は ATM タンパク質を不活化すると予想される突然変異を表示し、線の下の記号はリオリ(priori)が軽度の表現型を有し得る突然変異を表示し、これらの記号は以下のとおりである。●トランケーション及びエクソンスキッピング欠失(37)、▼無効にされた開始コドン(1)、■無効にされた終止コドン(1)、○イン−フレームゲノム欠失及び9bp 以下の挿入(4)、及び□ミスセンス突然変異(1) 好ましい実施態様の詳細な説明本発明はATM と称される遺伝子（その中の突然変異が血管拡張性運動失調症を引き起こす）をコードする精製され、単離され、クローン化された核酸配列（配列番号２、８〜10、11〜63）及びその遺伝的多形性からなる。核酸はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡであってもよい。 ATM 遺伝子の完全コード配列が配列番号２に示され、受理番号U33841としてゲンバンクデータベースに提出された。12の異なる5'UTR を生じるATM 転写産物の 5'未翻訳領域(5'UTR)に広範なオルタナチブスプライシングがある。最長の5'UTR の配列が配列番号９に示される。この配列中の最初のエクソンが1bと称される。 1aと称される別のリーダーエクソン（配列番号10）がある。完全3'UTR の配列が配列番号８に示される。一緒になって、これらの配列はATM 転写産物の完全配列を含む。夫々のエクソンに関するゲノム配列及び隣接イントロン配列が表１及び５、並びに配列番号11〜63に示される。実施例４に示されるように、長い距離のPCR を使用して、この遺伝子のゲノムの構成、即ち、構造が決定され、エクソン−イントロン境界が同定された。ATM 遺伝子はゲノムＤＮＡの約150 kbをスパンし、66（64＋二つの別のエクソン１）のエクソンからなる。開始コドンは15番目のエクソン内にある。最後のエクソンは長さが3.6 kbであり、終止コドン及び約3800ヌクレオチドの3'未翻訳領域を含む。 ATM 遺伝子は66のエクソンを含む（図３並びに表１及び５）。最初の二つのエクソンはオルタナチブスプライシングされ、1a（配列番号10）及び1b（配列番号９）と称される。3'エクソンを除いて、ATM エクソン（配列番号11〜63）は64bp から372 boまでのサイズの範囲であり、平均で149 bpである。イントロンは100 bpから約11 kb までかなりサイズが変化し、大半が１〜３kbの範囲である。コンセンサスジヌクレオチドGT及びAGは、イントロン3'中でエクソン52まで存在する GCジヌクレオチド(Jackson，1991に概説される)を有する可変ドナー部位を除いて、全てのイントロンのドナー及びアクセプタースプライス部位に見られた。読み取り枠の最初のメチオニンはエクソン４中に配置され、一方、終止コドンは3. 6 kbの3'の最大のエクソン（エクソン65；配列番号63）中に配置される。このエクソンは約3800ヌクレオチドの3'未翻訳領域(UTR)(配列番号８)を含む。多形性は異なる配列を有するとともに機能上均等な遺伝子産物を生じる異なる民族的位置及び地理的位置の間に一般に見られる配列の変異体である。現在の突然変異データ（表２及び３に示されるような）は、A-T がかなりの対立遺伝子異質性を特徴とする疾患であることを示す。欠損をA-T 遺伝子に付与する突然変異は点突然変異、欠失または挿入であってもよい。突然変異はATM 遺伝子のいずれかまたは両方の対立遺伝子のヌクレオチド配列内に存在することができ、その結果、ATM タンパク質産物の得られるアミノ酸配列が遺伝子産物の一つまたは両方のコピー中で変化される（両方のコピー中に存在する場合、血管拡張性運動失調症を生じる）。また、点突然変異、欠失、挿入及び再配列からなる群から選ばれた突然変異イベントがATM の隣接配列及び／または調節配列内で起こることができ、その結果、ATM の調節が変化されて、血管拡張性運動失調症を生じる。表２はA-T 患者に見られるATM 遺伝子中の10の突然変異を示す。ATM 遺伝子中の突然変異が相補性グループの全てに見られ、ATM が全てのA-T 症例に原因の唯一の遺伝子であることを示唆した。表３及び４は本件出願人の患者コホート中で現在までに同定された54の突然変異を示し、44の新しいものと表２に既にリストされた10種を含む。これらの突然変異は55のA-T ファミリー中で見られた。多くが単一ファミリーに特異であるが、その他は幾つかのファミリー、最も顕著には4nt 欠失、7517de14により共有され、これはサウス−セントラルイタリアからの６A-T ファミリーに共通である。表３に示されたようなA-T 突然変異の性質及び位置は、ATM タンパク質の機能及びこの多面発現疾患の分子基礎に識見を与える。 54のA-T 突然変異のこのシリーズは欠失及び挿入により支配される。12nt未満の小さいものはゲノムＤＮＡ中の同じ配列変化を反映する。ATM 転写産物の大きいセグメントをスパンする欠失は、相当するゲノム欠失ではなく、エクソンスキッピングを反映することがわかった。同定された54のA-T 突然変異のうちの45（ 83.3％）はそれをトランケートすることにより、翻訳の正確な開始または終止を無効にすることにより、または大きいセグメントを欠失することによりATM タンパク質を失活するものと予想される。付加的な突然変異は四つの小さいイン−フレーム(in-frame)欠失及び挿入、並びにPI 3- キナーゼドメインにおける高度に保存されたアミノ酸の一つの置換である。こうして、A-T を生じる突然変異の出現プロフィールはATM タンパク質を完全に失活すると予想されたものにより支配される。軽度の効果を有するATM 突然変異は、A-T に関係するが、同一ではない表現型をもたらすことが明らかである。ATM 遺伝子の多面発現の性質に鑑みて、種々のATM 遺伝子型と関連する表現型の範囲は更に広いかもしれず、また以下の実施例３に説明されるような明らかな臨床実体として常に特定されるとは限らない軽度の進行性症状を含む。このような症例におけるこの遺伝子中の突然変異に関するスクリーニングは、ATM 遺伝子と関連する分子上の病因について広い境界を明らかにするであろう。それ故、本発明はA-T に関係する表現型を有する被験者中のこれらの突然変異の同定を可能にする。 ATM 遺伝子は突然変異に大きな余地を残す。それは大きい転写産物をコードする。この研究において同定された突然変異の多様性は実際に豊富な突然変異レパートリーを示す。この豊富な突然変異にもかかわらず、それらの構造の特徴はAT M タンパク質を失活または排除するものについて有限のバイアスを指摘する。これらの突然変異中のゲノム欠失の性質または分布はこのような突然変異、例えば、ジストロフィン遺伝子(Anderson 及びKunkel，1992)またはステロイドスルファターゼ遺伝子(Ballabio ら，1989)(これらは特にこのような欠失を起こしやすい)の突然変異についてATM 遺伝子の特別な優勢を示唆していない。こうして、ミスセンス突然変異の強い提示がまた予想され、これらは通常多くの疾患遺伝子中の分子損傷のかなりの部分を構成する(Cooper 及びKrawczak，1993; Sommer， 1995)。しかしながら、わずかに二つのこのような突然変異が本研究において同定された。このシリーズで反映されたその他の点突然変異は、多くの患者で観察されたエクソンスキッピング欠失をおそらく生じて、再度、ATM タンパク質に苛酷な構造上の作用を与えるものである。 A-T について遺伝子をクローン化する際に（実施例２を参照のこと）、使用した戦略は、当業界で公知であるように、位置クローニングとして知られている未知のタンパク質産物で疾患遺伝子を同定するという通常の戦略であった。位置クローニングにおいて、標的遺伝子が疾患とＤＮＡ多形性により特定されたランダム遺伝子マーカーとのリンケージを証明することにより特定の染色体領域に局在化される。遺伝子分析による遺伝子に関する最小の研究間隔の特定に続いて、長い範囲のゲノムクローニング及び間隔内の転写された配列の同定が行われる。次いで疾患遺伝子が、主として患者中の突然変異を研究することによりこれらの配列中で同定される。幾つかの重要かつ長く探究されていた疾患遺伝子が最近この方法で単離された (Collins，1992; Attreeら，1992; Bergerら，1992; Chellyら，1993; Vetrieら，1993; Trofatter ら，1993; The Huntington's Disease Collaborative Resea rch Group，1993; The European Polycystic Kidney Disease Consortium，1994 ; Mikiら，1994)。二つの相補性方法が転写された配列の同定（遺伝子ハンティング）、種々の起源からのｃＤＮＡとのゲノムＤＮＡの直接ハイブリダイゼーションに基くハイブリッド選択(Parimooら，1991; Lovettら，1991)、及びエクソントラッピング(また、エクソン増幅とも称される)(これはそれらのスプライシング能によりゲノムＤＮＡ中の推定エクソンを同定する(Church ら，1993))に使用された。ハイブリッド選択実験において、磁気ビード捕獲プロトコル(Morgan ら，1992; Tagleら，1993)を使用して、コスミド及びYAC クローンが胎盤、胸腺及び胎児の脳からのｃＤＮＡコレクション中で交差ハイブリッド形成配列を捕獲するのに利用できた。平行実験において、YAC クローンが固体マトリックスに結合され、幾つかのヒト組織に相当する不均一ｃＤＮＡコレクションからｃＤＮＡフラグメントを選択するのに使用された(Parimooら，1993)。また、コスミドがpSPL3 ベクターによるエクソントラッピングに使用された(Church ら，1994)。捕獲されたｃＤＮＡフラグメント及びトラップされたエクソンは11q22-23領域の種々の部分を含む幾つかの放射線ハイブリッド(Richardら，1993; James ら，1994)、及びこの間隔をスパンする全てのYAC 及びコスミドを含む高密度グリッドへのハイブリダイゼーションによりA-T 領域に逆マッピングされた。こうして、A-T 領域の広範な転写マップが構築された(Shiloh ら，1994a)。同じ転写単位に収束すると予想された隣接ｃＤＮＡフラグメント及びエクソンのプールが、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用された。５種のｃＤＮＡフラグメント及び３種のエクソンのクラスターがマーカーD11S535 に接近してマッピングされ、そこでA-T に関する位置スコアがピークに達した(Lan geら，1995)。全てのこれらの配列が繊維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーから得られたｃＤＮＡクローン、7-9(配列番号１)の同じ5.9 kbにハイブリッドを形成した。放射線ハイブリッドパネルへの7-9 ｃＤＮＡクローンのハイブリダイゼーションは、全転写産物が染色体11遺伝子座に由来することを示した。このクローンの全配列（配列番号１）がショットガン戦略を使用して得られ、全ての読み取り枠中に5124ヌクレオチドの読み取り枠(ORF)、538 bp 3' 未翻訳領域(3'UTR)、及び終止コドンを含む259 bp 5' 非コード配列を含む5921 bp を含むことがわかった（ゲンバンク受理番号U26455）。二つのAlu 反復要素がこのクローンの3'末端及び同ｃＤＮＡライブラリーからのこの遺伝子に相当する９の小さいクローン中で観察された。ポリアデニル化シグナルがこれらのｃＤＮＡクローン中で同定されなかったので、それらのポリ(A)トラクトはこれらの転写産物の真正ポリ(A)鎖であるのではなく、Alu 要素と関連するものと推定された。この仮定は、本件出願人が典型的なポリアデニル化シグナルを含むオルタナチブ3'UTR で同遺伝子に由来するｃＤＮＡクローンを白血球ｃＤＮＡライブラリー中で同定した時にその後に支持された。ゲノム物理マップによるｃＤＮＡの配列は、相当する遺伝子が動原体からテロメアに転写されることを示した。種々の組織及び細胞系からのノーザンブロットへのクローン7-9 の全ORF を含むプローブのハイブリダイゼーションは、試験した全ての組織及び細胞型中の12 kbの主要転写産物（その後に13kbであることが示された）、及びおそらく相当する遺伝子またはその他の相同配列のオルタナチブスプライシングされた転写産物に相当する、幾つかの組織中の種々のサイズの微量の種を明らかにした。その後、ゲノム配列決定がクローン7-9 の5'非コード領域をスプライシングされなかった隣接イントロンの配列として同定した。白血球ｃＤＮＡライブラリーからの２種のその他のｃＤＮＡクローンがそれらの5'末端にこのイントロン配列を含むことがわかった。これらのクローンはスプライシング中間体に相当し得る。 7-9 ｃＤＮＡクローンはATM 遺伝子転写産物の一部のみに相当する。ランダムにプライミングされたｃＤＮＡライブラリーの連続スクリーニングは一連の部分的にオーバーラップするｃＤＮＡクローンを同定し、約10 kb のｃＤＮＡコンティグの構築を可能にした（図２）。この転写産物をコードする遺伝子はゲノムＤＮＡの約150 kbをスパンする。 9860 bp の複合ｃＤＮＡ（ゲンバンク受理番号U33841; 配列番号２）は全ての読み取り枠中に9168ヌクレオチドの読み取り枠、538 bp 3' 未翻訳領域(UTR)、及び終止コドンを含む164 bp 5'UTRを含む。最初のインーフレーム開始コドンの周囲の配列(ACCATG A)は翻訳の最適の開始についてKozak ら(1987)により提案されたコンセンサス配列、(A/G)CC ATG G に近似している。ポリアデニル化シグナルが3'UTR に見られなかった。同ポリ(A)鎖が本件出願人の研究所で現在まで単離された全てのｃＤＮＡクローン及び3'RACE産物中に見られたが、おそらくこのポリ(A)鎖は3'UTR 中に含まれるAlu 要素に属する。８種の異なる組織に相当する11のｃＤＮＡライブラリーから得られた32の部分 ATM cDNAクローンの配列決定及びPCR 分析は、それらがスプライシングされていないイントロン配列を含む場合を除いて、コード領域にわたって共直線性であった。こうして、ATM コード領域内のオルタナチブスプライシングは起こらないかもしれず、また非常に低い頻度で起こるかもしれず、または未だ解明されていない細胞型に制限されるかもしれない。更に、本発明はATM 遺伝子によりコードされた精製タンパク質（配列番号３）並びにその類縁体及び突然変異（配列番号２）を提供する。更に、本発明は、例えば、表２及び３に示されたような、血管拡張性運動失調症を生じる配列番号３中の突然変異を提供する。 Th2 ATM 読み取り枠（配列番号２）産物は350.6 kDa の予想分子量を有する30 56アミノ酸の大きいタンパク質である。ATM 遺伝子産物（配列番号３）はコドン 2855-2875 にあるPI-3キナーゼサイン(signature)、及びコドン1217-1238 にある潜在的ロイシンジッパーを含む。このロイシンジッパーの存在はATM タンパク質の可能な二量体化または付加的なタンパク質との相互作用を示唆し得る。核局在化シグナル、トランスメンブランドメインまたはその他のモチーフがこのタンパク質配列中で観察されなかった。 ATM 遺伝子産物はPI-3キナーゼの触媒ドメインに対し高い配列相同性を示す約 300 アミノ酸の高度に保存されたカルボキシ末端領域を共有する大きいタンパク質のファミリーの員である。これらのタンパク質の中に、出芽酵母中のTe11p 及びMec1p、分裂酵母中のrad3p、酵母及びそれらの哺乳類相対物、FRAP（RAFT1）中のTOR タンパク質、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster )中のMEI-41、及び哺乳類中のＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ(DNA-PKcs)の触媒サブユニットがある。これらのタンパク質の全てが細胞サイクル調節に関係し、Mec1p、rad3p 及びDNA-PKcsのようなそれらの幾つかがＤＮＡ損傷に対する応答に関与している（表４）。PI-3キナーゼ様ドメインの中央コアは、タンパク質及びPI-3キナーゼを含む、殆ど全てのキナーゼ中に存在する高度に保存された残基を有する二つのサブドメインを含む。残基Asp 及びAsn(ATM 中の位置2870及び 2875にある)、並びにトリプレットAsp-Phe-Gly(位置2889-2891 にある)(これはタンパク質キナーゼ触媒ドメイン中の最も高度に保存された短いストレッチに相当する)が、ATP の結合及びホスホトランスフェラーゼ活性に関係していた。これらのタンパク質をコードする遺伝子中の突然変異は、A-T と特徴を共有する種々の表現型、例えば、放射線感受性、染色体不安定性、テロメア短縮、及び欠損細胞サイクルチェックポイントをもたらす（Savitskyら,1995a及びb; Zakian,19 95により概説されている）。 ATM タンパク質の機能に関する可能な研究モデルは、ＤＮＡ二本鎖分解により in vitroで活性化され、幾つかの調節タンパク質(Gottlieb 及びJackson，1994) をリン酸化することにより応答するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼであるDNA-PKである。ATM タンパク質は、おそらく脂質またはタンパク質リン酸化により、特定のＤＮＡ損傷により誘発されたシグナルを種々のチェックポイント系に輸送することを担うかもしれない。更に、本発明は配列番号２または配列番号３によりコードされた組換えタンパク質またはその類縁体を含む。この組換えタンパク質は当業者に知られている技術により単離され、精製される。類縁体は一般に機能上関連する部分にわたって少なくとも70％相同であろう。更に好ましい実施態様において、相同性は少なくとも80％であり、ATM タンパク質に対して95％の相同性に達し得る。類縁体のアミノ酸配列は、少なくとも一つの残基が欠失、挿入または置換されるが、そのタンパク質が機能性のままであり、 A-T を生じない時にATM タンパク質の配列とは異なるかもしれない。グリコシル化の相違が類縁体を与え得る。本発明はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を提供し、これはATM 遺伝子によりコードされたポリペプチド／タンパク質のエピトープ、または突然変異体エピトープに特異的に結合する。抗体を調製する際に、ATM 遺伝子及びその多形性によりコードされたタンパク質（突然変異を含み、または含まない）が免疫原の源として使用される。配列番号３に示されたアミノ酸配列から単離されたペプチドアミノ酸配列または突然変異体ペプチド配列がまた免疫原として使用し得る。また、本発明は下記のペプチドの抗体を提供する。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。抗体はその配列に基く合成ペプチドに対し調製され、またはクローニング技術により組換えにより調製されることが好都合であり、または天然遺伝子産物及び／またはその部分が単離され、免疫原として使用されてもよい。このようなタンパク質またはペプチドが一般にHarlow及びLane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988に記載されているような当業者に公知の通常の抗体産生技術により抗体を産生するのに使用し得る。ポリクローナル抗体を産生するために、ウサギまたはヤギの如き宿主が一般にアジュバントとともに、必要により、キャリヤーにカップリングされたタンパク質またはペプチドで免疫される。タンパク質の抗体が血清から回収される。モノクローナル抗体を産生するために、その技術はタンパク質またはペプチドフラグメントによる適当なドナー、一般にマウスの過免疫化及び脾臓抗体産生細胞の単離を伴う。これらの細胞は不死性(immortality)を有する細胞、例えば、ミエローマ細胞に融合されて、不死性を有し、かつ必要とされる抗体を分泌する融合細胞ハイブリッドを与える。次いで細胞がバルクで培養され、モノクローナル抗体が使用のために培地から回収される。抗体は、当業界で公知であるように、固体担体基質に結合でき、または検出可能な部分と接合でき、または結合され、かつ接合される両方であってもよい。蛍光部分または酵素部分の接合の一般の説明について、Johnstone 及びThorpe，Im munochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publications，Oxford，19 82を参照のこと。固体担体基質への抗体の結合がまた当業界で公知である（一般の説明について、Harlow及びLane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Sp ring Harbor Laboratory Publications，New York，1988 を参照のこと）。本発明により意図される検出可能な部分として、蛍光マーカー、金属マーカー、酵素マーカー及び放射能マーカー、例えば、ビオチン、金、フェリチン、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、¹⁴C 及びヨウ素標識が挙げられるが、これらに限定されない。本発明はATM 遺伝子の核酸配列、配列番号２及びその部分並びにA-T の発現をもたらす突然変異体配列に操作により結合された発現調節配列を含むベクターを提供する。更に、本発明は、これらのベクターで形質転換される好適な真核細胞及び原核細胞から選ばれた宿主細胞を提供する。本発明を使用して、適当なベクターを使用してE.coliを含む宿主細胞を形質転換することが可能であり、その結果、それらはATM 転写産物に由来し、もしくは全ATM 転写産物をその正常な形態で含む組換えＤＮＡ配列またはＤＮＡの点突然変異、欠失、挿入または再配列を含む突然変異された配列を有する。このような形質転換細胞はA-T 遺伝子の機能及び調節の研究を可能にする。組換えにより形質転換された宿主細胞の使用はA-T のメカニズムの研究を可能にし、特にそれは A-T 遺伝子領域中で突然変異により妨げられた遺伝子機能の研究を可能にするであろう。ベクターは知られており、または当業者により構築でき、かつ配列の所望の転写を得るのに必要な全ての発現要素を含むべきである。また、その他の有益な特徴、例えば、異なる形態の核酸の回収のためのメカニズムがベクター中に含まれる。ファージミドがこのような有益なベクターの特別な例である。何となれば、それらはプラスミドまたはバクテリオファージベクターとして使用し得るからである。その他のベクターの例として、ウイルス、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス及びレトロウイルス、ＤＮＡウイルス、コスミド、プラスミド及びその他の組換えベクターが挙げられる。また、ベクターは原核宿主系または真核宿主系中の使用のための要素を含むことができる。当業者はどの宿主系が特別なベクターと適合性であるのかを知っているであろう。ベクターは当業界内で知られている種々の方法のいずれか一つにより細胞または組織に導入し得る。このような方法が一般にSambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York（1992）、Au subel ら，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，B altimore，Maryland(1989)、Chang ら，Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，MI(1995)、Vegaら，Gene Targeting，CRC Press，Ann Arbor，MI(1995) 及びGilboaら(1986)に記載されて知られており、例えば、安定トランスフェクションまたは一時トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション及び組換えウイルスベクターによる感染を含む。感染による核酸の導入はその他のリストされた方法よりも幾つかの利点を与える。高効率がそれらの感染性のために得られる。また、米国特許第5,487,992 号及び同第5,464,764 号明細書を参照のこと。更に、ウイルスは非常に特殊化され、典型的には特別な細胞型を感染し、その中で増殖する。こうして、それらの自然特異性がベクターをin viv o または組織もしくは細胞の混合培養物内で特別な細胞型にターゲッティングするのに使用し得る。また、ウイルスベクターは特定のレセプターまたはリガンドで修飾されてレセプター介在性イベントにより標的特異性を変化することができる。また、当業界で知られている組換え方法が標的核酸のセンス、アンチセンスまたはトリプレックスの抑制を得るのに使用し得る。例えば、アンチセンス核酸を含むベクターがタンパク質またはアンチセンスメッセージを発現して標的核酸の発現、ひいてはその活性を減少するのに使用し得る。アンチセンス核酸を導入し、発現するためのＤＮＡウイルスベクターの特別な例はアデノウイルス由来ベクターアデノp53TK である。このベクターは正または負の選択のためのヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)遺伝子及びアンチセンス配列の如き所望の組換え配列のための発現カセットを発現する。このベクターは上皮起源並びにその他の殆どの癌を含むアデノウイルスレセプターを有する細胞を感染するのに使用し得る。このベクター並びに同様の所望の機能を示すその他のベクターが細胞の混合集団（例えば、細胞のin vitroまたはex vivo 培養物、組織またはヒト被験者を含む）を治療するのに使用し得る。付加的な特徴がベクターに加えられてその安全性を確保し、かつ／またはその治療効力を増進し得る。このような特徴として、例えば、組換えウイルスで感染された細胞に対し負に選択するのに使用し得るマーカーが挙げられる。このような負の選択マーカーの例は、抗ウイルスガンシクロビルに対する感受性を与える上記のTK遺伝子である。それ故、負の選択は、感染が調節し得る手段である。何となれば、それは抗生物質の添加により誘導自己不活化を与えるからである。このような保護は、例えば、ウイルスベクターまたは配列の変化した形態を生じる突然変異が起こる場合に、細胞形質転換が起こらないことを確実にする。また、発現を特別な細胞型に制限する特徴が含まれる。このような特徴として、例えば、所望の細胞型に特異性であるプロモーター及び調節要素が挙げられる。組換えウイルスベクターは所望の核酸のin vivo 発現に有益なベクターの別の例である。何となれば、それらは外感染(lateral infection)及びターゲッティング特異性の如き利点を与えるからである。外感染は、例えば、レトロウイルスの寿命サイクルに固有であり、単一感染細胞が分離して隣接細胞を感染する多くの子孫ウイルス粒子を生じるプロセスである。その結果、大きい領域が迅速に感染されるようになり、その殆どが最初にもとのウイルス粒子により感染されていなかった。これは、感染物質が娘子孫のみにより広がる感染の垂直型とは対照的である。また、外に広がることができないウイルスベクターが生成し得る。この特徴は、所望の目的が特定の遺伝子を局在化された数の標的細胞のみに導入することである場合に有益であり得る。上記のように、ウイルスは、多くの場合に、宿主防御メカニズムを回避するために発生した非常に特殊化された感染物質である。典型的には、ウイルスは特別な細胞型を感染し、その中で増殖する。ウイルスベクターのターゲッティング特異性はその自然特異性を利用して所定の細胞型を特異的に標的とし、それにより組換え遺伝子を感染細胞に導入する。本発明の方法に使用されるベクターは標的とされる所望の細胞型に依存するであろう。例えば、乳癌が治療される場合、このような上皮細胞に特異性のベクターが使用されるべきである。同様に、造血系の疾患または症状が治療される場合、血液細胞及びそれらの前駆細胞、好ましくは造血細胞の特別な型に特異性であるウイルスベクターが使用されるべきである。レトロウイルスベクターは感染性粒子として機能し、または感染の単一の開始ラウンドのみを受けるように構築し得る。前者の場合、ウイルスのゲノムは、それが新しいウイルスタンパク質及びＲＮＡを合成するのに必要な全ての遺伝子、調節配列及びパッケージングシグナルを維持するように修飾される。これらの分子が一旦合成されると、宿主細胞はＲＮＡを感染の更なるラウンドを受けることができる新しいウイルス粒子にパッケージする。また、ベクターのゲノムは所望の組換え遺伝子をコードし、発現するように操作される。非感染性ウイルスベクターの場合、ベクターゲノムが通常突然変異されて、ＲＮＡをウイルス粒子に封入するのに必要とされるウイルスパッケージングシグナルを破壊する。このようなシグナルを有しないと、形成される粒子はゲノムを含まず、それ故、感染のその後のラウンドを続行することができない。ベクターの特別な型は目的とする用途に依存するであろう。また、実際のベクターが知られており、当業界で容易に利用でき、または公知の方法を使用して当業者により構築し得る。ウイルスベクターが使用される場合、例えば、その操作はそれらの標的特異性を利用することができ、それ故、疾患部位で局所投与される必要がない。しかしながら、局所投与は迅速かつ有効な治療を与えることがあり、また投与は、例えば、被験者への静脈内注射または皮下注射により行い得る。また、脊髄液へのウイルスベクターの注射が、特に神経変性疾患の場合に投与の様式として使用し得る。注射後に、ウイルスベクターは、それらが感染に適した標的特異性で宿主細胞を認識するまで循環するであろう。また、リポソームの如きトランスフェクションビヒクルが上記非ウイルスベクターを接種領域内のレシピエント細胞に導入するのに使用し得る。このようなトランスフェクションビヒクルが当業者により知られている。本発明はA-T の表現型発現を示すトランスジェニック生物及びノックアウト生物の構築を含む。本発明はトランスジェニックATM 遺伝子及び突然変異体ATM 遺伝子動物並びに細胞（細胞系）モデルを提供するだけでなく、ノックアウトATM モデルを提供する。トランスジェニックモデルとして、配列番号２、８、９（または10）に示された配列を有するモデルが挙げられる。これらのモデルは当業界で知られており、米国特許第5,487,992 号、同第5,464,764 号、同第5,387,742 号、同第5,360,735 号、同第5,347,075 号、同第5,298,422 号、同第5,288,846 号、同第5,221,778 号、同第5,175,385 号、同第5,175,384 号、同第5,175,383 号、同第4,736,866 号、並びにBurke 及びOlson,(1991)、Capecchi，(1989)、Da viesら，(1992)、Dickinson ら，(1993)、Huxleyら，(1991)、Jakobovitsら，(1 993)、Lambら，(1993)、Rothstein，(1991)、Schedlら，(1993)、Strauss ら，( 1993)に記載されているような通常の方法を使用して構築される。更にまた、特許出願WO 94/23049、WO 93/14200、WO 94/06908、WO 94/28123 が情報を与える。また、一般にHogan ら“Manipulating the Mouse Embryo”Cold Spring Ha-rb or Laboratory Press,第２編（1994）を参照のこと。本発明によれば、A-T を生じる原因の欠損遺伝子のキャリヤーを診断し、検出する方法が提供される（実施例４を参照のこと）。更に、本発明はATM 遺伝子の正常なコピー及びその遺伝子産物の検出方法を提供する。キャリヤー検出が特に重要である。何となれば、A-T 突然変異が一般の集団中の癌素因の或る種の症例の基礎となるからである。キャリヤーをそれらの欠損遺伝子により、またはそれによりコードされたそれらの欠けており、または欠損の一種以上のタンパク質により同定することは、A-T 遺伝子キャリヤーの早期かつ一致した診断をもたらす。こうして、その疾患のキャリヤーはおそらく癌にかかりやすく、かつ／または放射線の治療適用に感受性であるので、良好な監視及び治療プロトコルがそれらについて開始し得る。逆に、放射線療法を受けている患者からのA-T ヘテロ接合体の排除はその他の癌患者に対する高投薬量スケジュールをルーチンで確立し、それによりそれらの治療の効力を改良することを可能にし得る。簡単に言えば、これらの方法はサンプルを試験被験者から得る工程、適当な試験物質をサンプルから単離する工程及び標的核酸配列または遺伝子産物について分析する工程を含む。サンプルは、遺伝子物質及び／またはタンパク質が当業界で通常の方法を使用して単離される組織及び／または体液であってもよい。例えば、ＤＮＡがリンパ球、羊水中の細胞及び漿膜柔毛から単離し得る(Llerenaら， 1989)。更に詳しくは、キャリヤー検出方法は最初に被験者から細胞または体液のサンプルを得ることにより行われる。細胞サンプルを得るのに好都合な方法として、口洗浄液または毛根の回収が挙げられる。細胞サンプルは出生前診断の場合には羊膜細胞もしくは胎盤細胞または組織であってもよい。粗ＤＮＡは当業界で公知の技術により細胞（または単離されたタンパク質）からつくられる。次いでこの単離された標的ＤＮＡが当業界で公知の技術により遺伝子配列から誘導された適当なプライマーによるPCR 分析（または被験者から確かめられた細胞系からのタンパク質に関するウェスタンブロット分析）に使用される。次いで被験者の遺伝子型のA-T 状態を評価するために、PCR 産物が適当な配列変化の存在について試験されるであろう。その標本は免疫組織化学染色及び免疫細胞化学染色（一般にStites及びTerr， Basic and Clinical Immunology，Appleton 及びLange，1994を参照のこと）、E LISA、RIA、免疫ブロット、ウェスタンブロッティング、免疫沈殿、機能分析及びタンパク質トランケーション試験によりポリペプチド／タンパク質について分析し得る。好ましい実施態様において、ウェスタンブロッティング、機能分析及びタンパク質トランケーション試験(Hogervorst ら，1995)が使用されるであろう。標的核酸配列に相補性のｍＲＮＡがin situ ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング及び逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応により分析し得る。核酸配列はin situ ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、一本鎖コンホメーションの多形性、PCR 増幅及び特定のプライマーを使用するＤＮＡチップ分析により同定し得る(Kawasaki，1990; Sambrook，1992; Lichterら，1990; Orita ら，1989; Fodor ら，1993; Pease ら，1994)。 ELISA アッセイは当業者に公知である。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方がアッセイに使用し得る。適当な場合、ラジオイムノアッセイ(RIA ) の如きその他のイムノアッセイが当業者に知られているように使用し得る。利用可能なイムノアッセイが特許及び科学文献に広範に記載されている。例えば、米国特許第3,791,932 号、同第3,839,153 号、同第3,850,752 号、同第3,850,578 号、同第3,853,987 号、同第3,867,517 号、同第3,879,262 号、同第3,901,654 号、同第3,935,074 号、同第3,984,533 号、同第3,996,345 号、同第4,034,074 号、同第4,098,876 号、同第4,879,219 号、同第5,011,771 号及び同第5,281,52 1 号並びにSambrookら，1992を参照のこと。現在の突然変異データ（表２及び３に示されているような）は、A-T がかなりの対立遺伝子不均一性を特徴とする疾患であることを示す。表３に示されるような数百（または数千）のATM 突然変異（膵嚢胞性繊維炎及びBRCA1 の場合のように）があることは驚くべきことではない。こうして、成功裏の突然変異スクリーンが、制限されたサブセットに集中されるのではなく、ATM 遺伝子中の全ての可能なヌクレオチド変化を検出することができることは重要であろう（実施例４を参照のこと）。PCR 増幅されたＤＮＡもしくはＲＮＡの直接配列決定またはＤＮＡチップハイブリダイゼーション(Fodorら，1993; Pease ら，1994)を含む方法が、当業者に知られているその他の好適な方法とともに適用し得る。本発明の方法を診断用途に使用するために、標的ポリヌクレオチド配列（またはタンパク質）の存在または不在を同定するためのメカニズムを含むことが有利である。診断操作または実験操作に基く多くのハイブリダイゼーションにおいて、標識が特別なポリヌクレオチド配列の存在または不在について検出または視覚化するのに使用される。典型的には、オリゴマープローブがオートラジオグラフィーの如き当業界で公知の方法により検出し得る放射性同位元素、例えば、³²P または³⁵S(Sambrook，1992)で標識される。また、オリゴマープローブはオートラジオグラフィー(Sambrook，1992)により検出し得るケミルミネセント物質の如き非放射能方法により標識し得る。また、酵素−基質をベースとする標識方法及び検出方法が使用し得る。標識は当業界で公知のメカニズム、例えば、末端標識 (Sambrook，1992)、化学標識により、または別の標識されたオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションにより行い得る。これらの標識方法及び検出方法が単に例として提供され、当業界で知られている全ての方法の完全かつ排他的リストを提供することを意味しない。検出目的の標識の導入は、標識をハイブリダイゼーションの前にプローブに付着することにより行い得る。本発明の方法を実施するための別法は標的ＤＮＡをプローブの適用の前に固体担体に結合する工程を含む。固体担体は標的ＤＮＡを結合することができるあらゆる材料、例えば、ビーズまたは膜材料、例えば、ニトロセルロースもしくはナイロンであってもよい。標的ＤＮＡが固体担体に結合された後、プローブオリゴマーが適用される。機能アッセイがA-T キャリヤーまたは冒された個体の検出に使用し得る。例えば、ATM タンパク質産物が入手可能な生物学的物質、例えば、血清、末梢白血球等中で分析し得るPI 3- キナーゼまたはタンパク質キナーゼ生化学的活性を有することが示される場合、ホモ接合性正常個体はほぼ正常な生物活性を有し、陽性対照として利用できるであろう。A-T キャリヤーは正常よりもかなり小さい生物活性を有し、冒された（即ち、ホモ接合性の）個体は更に小さい生物活性を有し、陰性対照として利用できるであろう。このような生化学的アッセイがTay-Sach s キャリヤー検出の基礎として現在利用できる。本発明は少量のＲＮＡ、例えば、100 μl 程度に少ない末梢血から得られるＲＮＡ中の突然変異を同定する迅速かつ有効な方法を提供する。ＲＮＡはトリ−リージェント系（モレキュラー・リサーチ・センター、シンシナチー、OH）またはその他の均等な方法を使用してサンプルから抽出され、それがGilad ら(1996)により記載されたようにして逆転写にかけられる。次いで選択された読み取り枠が以下に記載されるようにしてRT-PCTを使用して増幅され、得られる生成物が巣状 (nested)PCR プライマーを使用して更に増幅される。次いでこれらの反応の生成物が以下に記載されるような制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング (REF)にかけられる。この方法は一つのPCR のみのためにＲＮＡから得られたｃＤＮＡを使用し、その産物がその後に更なる分析に利用できる。それ故、最小量のＲＮＡのみが抽出される必要があり、コストを節減する。この方法を使用して、ＲＮＡがサンプルから抽出され、逆転写(Giladら，1996 ) にかけられる。次いで全ATM 読み取り枠（配列番号２）が以下に記載されるようにRT-PCRを使用して増幅され、得られる産物が巣状PCR プライマー（配列番号82 〜91；以下を参照のこと）を使用して更に増幅される。次いでこれらの反応の生成物が以下に記載されるような制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング(REF)にかけられる。しかしながら、ゲノムＤＮＡ（例えば、古い腫瘍標本）のみが入手し得る場合、突然変異分析を行うのに好ましい実施態様はエクソンまたはエクソンのグループの個々の増幅を必要とする。この分析を行うために、プライマー対が表１及び表５（これは表１の更なる増幅である）中に示された情報に基いて開発された。プライマーは当業界で知られているような通常のコンピューターアルゴリズムを使用して隣接配列から選択される。分析に使用し得るプライマー対の５つの例が以下に示される。プライマーエクソン４及び５プライマーエクソン17 プライマーエクソン25 プライマーエクソン34 プライマーエクソン46 また、本発明は集団中の欠損A-T 遺伝子の診断及び検出のためのキットを提供する。一般に、その集団はATM 突然変異について特性決定された集団であろう。例えば、唯一の突然変異が知られているモロッコのユヤダ教徒、または一つの突然変異がまた知られているアンマン派が挙げられる。夫々のキットはスクリーニングされる集団について受注生産されるであろう。そのキットはその集団中で血管拡張性運動失調症(A-T)を引き起こす欠損遺伝子の遺伝子配列に相補性の一種以上の分子プローブと、その分子プローブ及び欠損遺伝子のハイブリダイゼーションを検出し、それにより欠損遺伝子の存在を示すのに適した標識とを含む。分子プローブは突然変異体配列に相補性のＤＮＡ配列を有する。また、キットは突然変異体タンパク質の検出のための試薬及び抗体を含むことができる。上記説明は血管拡張性運動失調症遺伝子及び遺伝子産物の使用及び同定並びにキャリヤーの同定だけでなく、トランスジェニック生物の構築のための実際の基礎を与える。本発明において使用される方法が、以下の非限定実施例及び添付図面により示される。実施例物質及び方法分子生物学における一般的な方法：当業界で知られており、また詳しく記載されない通常の分子生物学技術は一般にSambrookら，Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1989，1992)及びA usubel ら，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons， Baltimore，Maryland(1989)に従った。タンパク質分析技術はColigan ら，Cur-r ent Protocols in Immunology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(19 92，1994)に記載されたとおりである。 RT-PCR 逆転写(Giladら，1996)後に、RT-PCRを25μl の反応混合物中で行う。1/10の逆転写産物(１μl)を反応混合物に添加する。反応混合物は1.75mMのMgCl₂、1.5 μg のアンチタクmAb(チメルク)、0.2 mMのdNTP（ファーマシア）及び１mMの下記のプライマー：の夫々を含む適当な緩衝液中にエキスパンド・ロング・テンプレートPCR 系（ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、ドイツ）2Uを含む。 PCR 条件 94℃で３分間の変性後に、増幅の５サイクルを以下のようにして行う。93℃で 20秒、64℃で１分間そして68℃で８分間、続いて93℃で20秒、60℃で１分間及び 68℃で7.5 分間の30サイクル。次いで最後の延長を68℃で10分間にわたって行う。制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング(REF) ATM 転写産物の読み取り枠を８の部分オーバーラップPCR フラグメントに分けた。夫々のフラグメントは1.0-1.6 kbをスパンし、以下のように２種のPCR プライマーにより形成される。患者及びファミリー源：モロッコ系ユダヤ教徒、パレスチナのアラブ人、及びドルーズ派のファミリーの230 の患者細胞系及び健康なメンバーからの143 の細胞系を含む細胞系のレポジトリー(repository)を樹立した。これらの家系図は高度に近交であり、異常に大きい(Zivら，1991; Ziv，1992)。高分解能のリンケージ分析に必要とされる多数の成熟分裂イベントに鑑みて、本件出願人はA-T ファミリーの広範なレポジトリーをまた樹立したCarmel McConville 博士（バーミンガム大学、英国）及びRichard Gatti 博士(UCLA、Los Angeles，CA)と共同研究した。リンケージ分析を176 ファミリーのプールについて行った。実施例１遺伝子分析によるA-T 間隔の特定：イスラエルのA-T ファミリーの分析のみに基いた研究は11q22-23におけるA-T( C)遺伝子の局在化を可能にし(Ziv，1991)、同領域へのパレスチナ人中のA-T(A) 突然変異の局在化を確認した(Zivら，1992)。更に、バーミンガムグループによる研究はD11S611 とD11S1897の間で主要A-T 間隔を４センチモルガンに狭くし、続いてGRIA4 とD11S1897の間で３センチモルガンに狭くした(Ambroseら，1994a; McConville ら，1994)(またShiloh，1995、及び図１を参照のこと)。全てのこれらの研究を２対立遺伝子マーカーで行い、そのパワーをそれらの低い多形性情報含量(PIC)により制限する。可変数のタンデム単純リピートに基いて最近発見されたミクロサテライトマーカー(Litt 及びLuty，1989; Weber 及び May，1989)はそれらの高度の多形性のために極めて強力である。ミクロサテライトマーカーを使用して、二つのアプローチを使用してA-T 領域を飽和した。第一のアプローチは染色体11q にゆるく結合された他のマーカーにより生じたミクロサテライトマーカーの物理マッピングに基いた。染色体11のこの領域中のＤＮＡ配列の正確な高分解能局在化を可能にするYAC コンティグ及びコスミドコンティグを使用して、マッピング実験を行った。これらの実験は12のミクロサテライトをA-T 領域で局在化した(Vanagaiteら，1994a; Vanagaite ら，1995)。第二のアプローチは新しいミクロサテライトをYAC コンティグ内に生じることに基いていた。YAC クローン中の多形性CA- リピートの同定に迅速な方法が提案され(Rotman，1995)、A-T 遺伝子座内の12の新しいマーカーの生成をもたらした (Vanagaiteら，1995; Rotman，1995; Rotmanら，1994b)。それ故、この方法で構築された高密度ミクロサテライトマップは合計24の新しいミクロサテライトマーカーを含み、合計６メガベースにわたってA-T 遺伝子座及び隣接配列をスパンする(Vanagaiteら，1995)。 A-T ファミリーの全コホートに関する反復リンケージ分析は、A-T(A)遺伝子座がD11S535（Langeら，1994）の下の累積ロッドスコアの明らかなピークとともに図１及びShiloh（1995）に示されたようなD11S1819とD11S1818(Gatti ら，1994) の間の1.5 メガベースの領域内に明らかに配置されることを示した。これらの研究と同時に、モロッコのユダヤ教徒のA-T 患者のリンケージ平衡異常(LD)分析を行った。LDは二つ以上の多形性遺伝子座にある対立遺伝子の間の非ランダム会合を表す(Chakravartiら，1984)。疾患遺伝子座と結合マーカーの間のLDは疾患遺伝子の微細な局在化に有益な手段である(Chakravartiら，1984; K- eremら，1989; Ozelius ら，1992; Sirugoら，1992; Hastbacka ら，1992; Mit- chisonら，1993)。LDは単離された民族学的グループ中で特に強力であり、この場合、疾患遺伝子座にある異なる突然変異の数はおそらく低い(Hastbackaら，19 92; Lehesjoki ら，1993; Aksentijevitchら，1993)。早期に、本件出願人はイスラエルで同定された16のモロッコのユダヤ教徒のA-T ファミリーの患者でD11S 1817-D11S927領域に沿ってA-T とマーカーの間で非常に有意なLD(p< 0.02-p<0.0 01)を観察した(Oskato ら，1993)。新しいマーカーによる更なる分析はリンケージ平衡異常のピークを図１に示されたようなD11S384-D11S1818領域に狭くした。単相型分析は、突然変異染色体の全てが同じD11S384-D11S1818単相型を有することを示し、このコミュニティにおけるA-T に関する創立者効果を示唆し、一つの突然変異が優勢である。実施例２ ATM 遺伝子の配列決定コンティグ（オーバーラップクローンの組）中の疾患遺伝子座のクローニングはA-T 疾患遺伝子を単離するのに必須であった。酵母人口染色体(YAC)のコンティグ中の全A-T 遺伝子座及び隣接領域を当業界で公知の方法(Rotman ら，1994c; Rotmanら，1994d)によりクローン化した。このコンティグはその領域のミクロサテライトマップの構築に役立ち(Vanagaiteら，1995)、続いて間隔D11S384-D11S1 818の殆どにわたって延びるコスミドコンティグの構築を可能にした。YAC クローンに相当するコスミドをL.Deaven博士(Los Alamos National Laboratory)により供給された染色体11特異性コスミドライブラリー中で同定し、図１に示されたようなオーバーラップを同定することによりコンティグ中に配置した。 A-T 遺伝子の単離：転写された配列を二つの相補性方法に基いて系統的に同定した。 1.ゲノムクローンに相当するｃＤＮＡの磁気ビード捕獲(MBC)に基く改良された直接選択方法の使用(Morgan ら，1992; Tagle ら，1993)。幾つかの大規模実験において、YAC またはコスミドＤＮＡをビオチニル化し、胸腺、脳及び胎盤からのPCR 増幅ｃＤＮＡにハイブリッドを形成した。ストレプトアビジン被覆磁気ビードを使用して、ゲノムＤＮＡ−ｃＤＮＡ複合体を捕獲し、これに続いてその後の溶離、増幅、及び捕獲されたｃＤＮＡのクローニングを行った。ｃＤＮＡインサートをゲルから切除し、自己結合してコンカテマーを生成し、音波処理してランダムフラグメントを得た。これらのフラグメントをゲル電気泳動によりサイズ分別し、1.0-1.5 Kbフラクションをゲルから抽出し、プラスミドベクター中でサブクローン化した。ベクター特異性プライマーを自動化配列決定装置（モデル 373A、Applied Biosystems）中で使用して、個々のクローンの末端部分を配列決定し、オートアッセンブラー・プログラム(Applied Biosystems Division，Per- kin-Elmer Corporation)を使用して配列を配列した。最終の配列中で、夫々のヌクレオチド位置は少なくとも３の独立のオーバーラップ読み取りを表す。また、YAC を使用し、これらはMBC に関する出発物質としてコスミドよりも有効ではないことはなく、生産物の50％より多くがゲノムクローンに逆にマッピングした。しかしながら、A-T 領域をスパンする放射線ハイブリッドの小さいパネルを使用してｃＤＮＡフラグメントを試験した場合、YAC 及びコスミドに逆にハイブリッドを形成した幾つかのクローンはこの領域に由来しないことがわかった。このピットフォールはおそらく異なる遺伝子の或る部分間の制限された相同性に由来し、捕獲された配列の真正を試験する場合に放射線ハイブリッドマッピングを使用する必要性を指摘し、この目的のためにクローン化されたＤＮＡのみに頼らないことを指摘する。配列データベースにおける相同性研究はA-T 領域にマッピングされた最初の10 5 ｃＤＮＡフラグメントの一つのみが発現された配列標識(EST)としてのデータベースの一つに既に寄託された配列に相同であることを示した。 2.“エクソントラッピング”とも称されるエクソン増幅(Duyk ら，1990; Buc- klerら，1991)はゲノムフラグメントをベクターにクローン化することに基くものであり、そのベクター中で、エクソンスプライス部位がベクター中のそれらのカウンターパート部位にスプライシングによりフラッジングされる(flagged)。この遺伝子同定方法はMBC 戦略を補完するものと予想された。何となれば、それはｃＤＮＡライブラリーの構成または転写産物の相対的な多さに依存せず、しかもゲノムクローン中の反復配列の存在により影響されないからである。擬陽性の高比率（％）及び潜在スプライス部位の効果を含む、早期バージョンにおいて同定された問題を排除するこの系の改良バージョン(Church ら，1993)を使用した。夫々の実験はコスミド当たり同定された平均２〜５のエクソンを有する３〜５種のコスミドのプールについて行った。合計45のエクソンを同定した。配列分析及び物理マッピングは、MBC 及びエクソン増幅が転写された配列を同定するのに相補性であることを示した。深部コスミドコンティグの利用可能性はｃＤＮＡフラグメント及び捕獲されたエクソンの迅速かつ正確な物理的局在化を可能にし、A-T 領域の詳細な転写マップをもたらした。 MBC 及びエクソン増幅の両方が短い(100-1000 bp)転写された配列を生じた。これらの配列を現在本件出願人の裁量にある28のｃＤＮＡライブラリー（これらは種々の組織及び細胞系に相当する）から完全長クローンを単離する際のアンカー点として使用した。個々のｃＤＮＡフラグメントまたはエクソンに由来するプライマー組を使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるｃＤＮＡライブラリーの初期スクリーニングはライブラリーの同定を助けて、おそらく相当するｃＤＮＡクローンを生じた。大規模スクリーニング実験を行い、この場合、ｃＤＮＡフラグメント及びエクソンの殆どを大きいプール中で使用した。ハイブリダイゼーションによる物質スクリーニングの他に、PCR をベースとするスクリーニング方法及びRACE(ｃＤＮＡ末端の迅速増幅)(Frohman ら，1988; Frohman ら，1994)を使用して完全長ｃＤＮＡを同定した。上記実験は7-9 と称されるｃＤＮＡクローン(Savitsky ら，1995a)の初期の同定及び単離をもたらし、その完全配列が配列番号１に示され、これは図１に示されたようなリンケージ分析により得られた累積位置スコアのピークの下に配置された遺伝子に由来する。その遺伝子はゲノムＤＮＡのほぼ300 キロベース(kb)にわたって延び、かつ長さが12 kb 及び10.5 kb の二つの主要なｍＲＮＡ種をコードする。その7-9 クローンは長さが5.9 kbであり、それ故、完全長クローンではない。このｃＤＮＡ内の5124 bp の読み取り枠はホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI 3-キナーゼ)として知られているシグナル変換タンパク質のグループの典型的なサインモチーフ(signature motif)を有するタンパク質をコードする。P I 3- キナーゼはシグナルを細胞の外部環境から細胞に伝達することを担う複雑な系に加わる。相当する遺伝子のタンパク質産物が脂質キナーゼまたはタンパク質キナーゼをコードするか否かは未だ明らかではない。 7-9 ｃＤＮＡクローンをコードする遺伝子は強力なA-T 候補と考えられ、突然変異が患者中で探究された。サザンブロッティング分析は、特定の相補性グループに指定されなかった拡大されたパレスチナアラブA-T ファミリーであるファミリーN.の冒されたメンバー中でこの遺伝子中のホモ接合性欠失を明らかにした。このファミリー中の全ての患者は単一A-T 突然変異について家系ではホモ接合性であると予想される。その欠失は転写産物7-9 によりスパンされた全ゲノム領域を殆ど含み、その疾患と一緒にファミリー中で分離することがわかった。この知見は付加的な患者、特に特定の相補性グループに既に指定された患者における7- 9 転写産物中の突然変異に関する系統的な研究をもたらした。制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング(REF)方法(Liu及びSommer 1995)をA-T 細胞系からの逆転写酵され、PCR 増幅されたＲＮＡ(RT-PCR)に適用した。異常なREF パターンの観察に続いて、転写産物の関連部分の直接配列決定及び別の独立のRT産物の反復分析を行った。複合ヘテロ接合体中で、二つの対立遺伝子をRT-PCR産物のサブクローニングにより分離し、個々に配列決定した。ゲノム配列決定を幾つかの場合に行って配列変化をゲノムレベルで確かめた。付加的なファミリーメンバーを利用可能な場合に研究した。最初に、10の配列変化（表２）を、二つの子孫対を含む13のA-T 患者中の7-9 転写産物中で同定した。これらの配列変化の殆どがタンパク質産物の早期トランケーションをもたらすものと予想され、一方、その残りがこのタンパク質中の1- 3 アミノ酸残基のイン−フレーム欠失を生じるものと予想される。イン−フレーム欠失の結果が研究されずに残っているが、それらがタンパク質機能の障害をもたらすことを推定することが妥当である。一人の患者、AT3NG では、位置1512のセリン残基の損失がPI3-キナーゼサイン配列内で起こる。この良く保存されたドメインはタンパク質キナーゼの触媒部位にかすかに関係しており、それ故、この突然変異はおそらく7-9 タンパク質に機能上影響する。この遺伝子中の突然変異がA-T の原因であるという強力な証拠に鑑みて、それをATM(A-T, M utated)と称した。これらの患者はその疾患の全ての相補性グループ及びかなりの民族的多様性に相当するので、これらの結果はATM 遺伝子単独が全てのA-T 症例の原因であることを示す。全ATM 読み取り枠のクローニングを完結するために、ストラタゲン（サンジエゴ、CA）から得られた胎児脳及び結腸ランダムプライミングしたライブラリー及び内皮細胞ランダムプライミングしたライブラリー（ミシガン大学のDavid Gin- sburg 博士の贈答品）をスクリーニングした。合計1x10⁶pfuを140mm のプレート当たり40,000 pfuの密度でスクリーニングし、レプリカを製造業者により推奨されたようにキアブレン(Qiabrane)フィルター（キアゲン）でつくった。フィルターを２時間にわたって65℃で6xSSC、5xデンハルト、１％のＮ−ラウリルサルコシル、10％のデキストランスルフェート及び100 μg/mlのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中でプレハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションを1x10⁶cpm /ml の³²P 標識プローブを用いて同条件下で16時間行い、続いて0.25xSSC、0.1 ％のSDS 中で60℃で30分間にわたって最終洗浄を行った。通常の技術を使用して陽性クローンをプラーク精製し、配列決定した。自動化ＤＮＡ配列決定装置(Ap- plied Biosystems、モデル373A)を使用してＤＮＡ配列決定を行い、オートアッセンブラープログラム(Applied Biosystems Division，Perkin-Elmer Corporat- ion)を使用してその配列を組み立てた。最終配列中、夫々のヌクレオチドは両方向の少なくとも４つの独立の読み取りに相当する。 BLAST ネットワークサービスを使用して、配列類似性に関するデータベース研究を行った。MACAW プログラム、並びにウィスコンシン大学で遺伝学コンピューターグループにより開発された配列分析ソフトウェアパッケージ中のパイルアッププログラム及びベストフィットプログラムを使用して、タンパク質配列の配列及び対様(pairwise)比較を行った。実施例３突然変異の検出突然変異の測定：最近発見されたATM 遺伝子は、ＤＮＡ損傷監視を細胞サイクル調節に関連させる新規なシグナル変換系におそらく関係している。A-T 突然変異は種々の組織を冒し、癌素因をもたらす。この顕著な表現型は“部分A-T 表現型”の存在と一緒になってATM 突然変異の研究に特別な重要性を与える。物質及び方法 RT-PCR: トリ−リージェント系（モレキュラー・リサーチ・センター、シンシナチ、OH）を使用して全ＲＮＡを培養した繊維芽細胞またはリンパ芽球細胞から抽出した。スーパースクリプトII逆転写酵素（ギブコBRL、ガイザースブルグ、M D）を供給業者により推奨された緩衝液中で、125U/ml のRNAsin（プロメガ）及び１mMのdNTP（ファーマシア）の存在下で使用して、逆転写を10μl の最終容積中2.5 μg の全ＲＮＡについて行った。プライマーはオリゴ(dT)（ファーマシア）または特別に設計されたプライマーであった。その反応生成物を特別なプライマーで行ったPCR の鋳型として使用した。これらの反応を、２単位のTaq DNA ポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、ドイツ）、200 μM のdN TP、0.5 μM の夫々のプライマー、及び1/10のRT-PCR産物を含む50μl 中で行った。QIA-迅速回転系（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を使用して、生成物を精製した。制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング：若干改良したLiu 及び Sommer（1995）のプロトコルに従った。1.0-1.6 kbのPCR 産物を形成するプライマーを使用して、RT-PCRを上記のようにして行った。増幅したＤＮＡ100ng を0. 2単位のシュリンプアルカリ性ホスファターゼ（米国バイオケミカルズ、クレーブランド、OH）の存在下で５または６制限エンドヌクレアーゼで別々に消化した。65℃で10分間の熱不活化後に、同PCR 産物に相当する消化産物をプールし、96 ℃で５分間変性し、直ちに氷で冷却した。このフラグメント混合物10ngを６μCi の［γ-³³P］ATP 及び１単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ、バーバリィ、MA）の存在下で37℃で45分間にわたって標識した。95％のホルムアミド、20mMのEDTA、0.05％のブロモフェノールブルー、0. 05％のキシレンシアノール、及び10mMのNaOHを含む停止溶液20μl を添加し、サンプルを３分間沸騰させ、氷で迅速に冷却した。電気泳動を50mMのトリス−ホウ酸塩、pH8.3、１mMのEDTA中で5.6 ％のポリアクリルアミドゲル中で室温で３時間にわたって12W の一定電力でファンをガラスプレートに向けて、それらを22〜 24℃に保って行った。ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーにかけた。 PCR 産物の直接配列決定：PCR 産物500ng を真空下に乾燥させ、配列決定プライマーを含む反応緩衝液中で再度懸濁させ、その混合物を沸騰させ、液体窒素中でスナップ凍結した。シーケナーゼII系（米国バイオケミカルズ）を使用して一本鎖結合タンパク質(T4 遺伝子32タンパク質、米国バイオケミカルズ)0.5 μg の存在下で配列決定反応を行った。その反応生成物を65℃で15分間にわたってプロテイナーゼＫ0.1 μg で処理し、６％のポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより視覚化した。本明細書に上記された方法を使用して、ATM 転写産物を13の国からの拡大されたシリーズのA-T 患者に由来する繊維芽細胞系及びリンパ芽球細胞系中の突然変異についてスキャンし、彼らの全てが古典的A-T 表現型を特徴としていた。その分析はRT-PCR、続いて制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング(REF) に基いていた。REF は一本鎖コンホーメーション多形性(SSCP)方法の改良であり、長さ2 kbまでのＤＮＡフラグメント中の配列変化の有効な検出を可能にする(L iu及びSommer，1995)。簡単に言えば、標的領域のPCR 増幅後に、その方法の感度を増大し、分析されるフラグメント内の配列変化の正確な局在化を可能にするために、多重制限エンドヌクレアーゼ消化をSSCP分析の前に行う。こうして、9168ヌクレオチド(配列番号２)(Savitskyら，1995b)をスパンするATM 転写産物のコード配列を1.0-1.6 kbの８つの部分オーバーラップ部分に分け、夫々を別々に分析した（また、実施例４を参照のこと）。異常なREF パターンを生じる配列変化を直接配列決定により配置し、開示した。この方法で同定した突然変異を、RT-PCR及び配列決定を反復することにより、またはゲノムＤＮＡ中の同突然変異の存在を試験することにより再確認した。複合ヘテロ接合体中で、二つの対立遺伝子をサブクローニングにより分離し、個々に配列決定した。幾つかの場合に、アガロースゲル電気泳動は減少されたサイズのRT-PCR産物として発現されたATM 転写産物中に大きい欠失を示した。このような欠失の破断点をこれらの産物の直接配列決定により概説した。本発明者らの患者コホート中で現在まで同定された54の突然変異（表３、図４）は44の新しいものと10の既に同定されたもの（表２）を含む（表３中の突然変異はBeaudet ＆Tsui（1993）により提案された命名法に従って表され、ヌクレオチド番号はATM 転写産物（受理番号U33841）の配列中のそれらの位置を表し、読み取り枠の最初のヌクレオチドを+1と称した）。これらの突然変異が65のA-T ファミリー中で見られた。多くが単一ファミリーに特異であり、一方、その他が幾つかのファミリー、最も顕著には4nt 欠失、7517de14により共有され、これはサウス−セントラル・イタリアからの６のA-T ファミリーに共通である（表３）。このサンプルによれば、A-T 中に突然変異のかなりの不均一性があり、それらの殆どが“プライベート”である。このサンプル中のホモ接合体の比率は研究した集団の高度の血縁関係のために比較的高い。しかしながら、非血縁ファミリーからの明らかにホモ接合性患者は実際に発現されなかった一つの対立遺伝子を有する複合ヘテロ接合体であり得ることが注目されるべきである。 54の突然変異のこのシリーズは欠失及び挿入により支配される。12nt未満の小さいものはゲノムＤＮＡ中の同一の配列変化を反映する。ATM 転写産物の大きいセグメントをスパンする欠失は、相当するゲノム欠失ではなく、エクソンスキッピングを反映することがわかった。この現象は通常スプライス接合部またはイントロン内の配列変化、または主としてナンセンス型のスキッピングされたエクソン内の突然変異(Cooper 及びKrawczak，1993; Sommer，1995; Steingrimsdottir ら，1992; Gibsonら，1993; Dietz 及びKendzior，1994)に由来する。一つの大きい欠失は転写産物の約7.5 Kbをスパンし、ATM 遺伝子内の約85 Kb のゲノム欠失に相当する。これらの欠失及び挿入のうち、25がフレームシフトをもたらすと予想される。５ナンセンス突然変異と一緒に、トランケーション突然変異はこのサンプル中の突然変異の合計数の83％を占める。９イン−フレーム欠失はそのタンパク質の長いセグメント(30-124aa)をスパンし、トランケーション突然変異と同様に、タンパク質の構造に重大な効果を有すると予想される。二つの塩基置換は翻訳開始コドン及び終止コドンを無効にすることが注目されるべきである。後者は付加的な29アミノ酸によるATM タンパク質の延長をもたらすと予想される。この突然変異は近くのPI 3- キナーゼ様ドメインのコンホメーションに影響し得る。 ATM タンパク質に関する５の小さい(1-3aa)イン−フレーム欠失及び挿入の効果が研究されないで残っているが、一つのこのような欠失(8578de13)は位置2860 のセリン残基の損失をもたらすことが注目されるべきである。このアミノ酸は、 ATM が関係しているタンパク質ファミリーの典型的なPI 3- キナーゼ様ドメイン内に保存されたモチーフの部分であり、このファミリーの９のメンバーのうちの７のメンバー中に存在する。この研究において同定された単一ミスセンス突然変異（これはGlu2904Gly置換をもたらす）はこのドメイン内の別の極度に保存された残基の非保存変化をもたらし、これがこれらのタンパク質の全てにより共有される。この突然変異にホモ接合性の患者、AT41RMは典型的な臨床A-T 表現型を示す。その患者の細胞系中の放射線耐性ＤＮＡ合成の測定は典型的なA-T 応答を明らかにし、この患者が古典的A-T 細胞表現型を有することを実証した。本明細書中に先に説明したように、おそらく本発明のATM 遺伝子はＤＮＡ損傷監視を細胞サイクル調節に関連させる新規なシグナル変換系に関係している。A- T 突然変異は種々の組織に影響し、癌素因をもたらす。この顕著な表現型は、“ 部分A-T 表現型”の存在と一緒になってATM 突然変異の研究に特別な重要性を与える。 ATM 遺伝子は突然変異に大きな余地を残す。それは大きい転写産物をコードする。この研究において同定された突然変異の多様性は実際に豊富な突然変異レパートリーを示す。この豊富な突然変異にもかかわらず、それらの構造上の特徴は、ATM タンパク質を不活化または排除するものに対し明確なバイアスを指摘する。これらの突然変異中のゲノム欠失の性質または分布はこのような突然変異に関するATM 遺伝子、例えば、ジストロフィン(Anderson 及びKunkel，1992)またはステロイドスルファターゼ(Ballabio ら，1989)遺伝子（これらはこのような欠失を特に受けやすい）の特別な優勢を示唆しない。こうして、またミスセンス突然変異の強力な提示が予想され、これは通常多くの疾患遺伝子中の分子損傷の重要な部分を構成する(Cooper 及びKrawczak，1993; Sommer，1995)。しかしながら、唯一のこのような突然変異を本研究で同定した。このシリーズで反映されたその他の点突然変異は、おそらく多くの患者で観察されたエクソンスキッピング欠失の基礎となり、再度、重大な構造上の効果をATM タンパク質に与えるものである。欠失及び挿入に関するこのバイアスについての技術説明は塩基置換を検出する能力に対するこのような損傷を検出するREF 方法の大きな能力であり得る。しかしながら、Liu 及びSommer（1995）は、IX因子遺伝子中の42の点突然変異のサンプル中のこの方法の検出率が電気泳動条件に応じて88％〜100 ％の範囲であることを示していた。本研究においてREF 方法により直接検出された10塩基置換（表２及び３）は、このような配列変化が同様に本発明者らの手で検出されることを示す。これらの突然変異の殆どの予想結果はそのタンパク質の完全不活化であるので、この歪められた突然変異プロフィールが、それ自体を特別な突然変異メカニズムにするATM 遺伝子の構造上の特徴ではなく、研究された表現型に関係した機能バイアスに相当し得る。古典的A-T 表現型はヌル対立遺伝子についてホモ接合性または複合ヘテロ接合性により生じることが明らかであり、それ故、おそらくAT M 遺伝子中の欠陥の最も重度の発現である。この遺伝子の大きいコード領域中に予想されたミスセンス突然変異の体液過剰は、このような突然変異がそのタンパク質の完全な機能不活化をもたらさない限り、古典的A-T を有する患者中でおそらく稀に提示される。推論により、この研究で同定された唯一のミスセンス、Gl u 2940Gly(これはPI 3- キナーゼドメインにある保存されたアミノ酸を置換し、明らかに古典的A-T 表現型を生じる)は、ATM タンパク質の生物活性についてこのドメインの重要性を指摘する。このドメイン中の突然変異はS.セレビジアエ(ce- revisiae)中でTEL1タンパク質のテロメア保存機能を無効にし(Greenwellら，199 5)、そのタンパク質はATM に対し特に高い配列類似性を示す(Savitsky ら，1995 b; Zakian，1995)。ATM を含むPI 3- キナーゼ関連タンパク質のファミリーの別の員は哺乳類FRAPである。PI 3- キナーゼドメイン中の突然変異はその自己リン酸化能力及び生物活性を無効にする(Brownら，1995)。これらの観察は、ここに示された突然変異と一緒になって、ATM 中のこのドメインがまたおそらく触媒部位を含み、それがタンパク質キナーゼとして機能し得ることを示唆する。それ故、ATM 遺伝子と関連する遺伝子型−表現型の関係は古典的A-T を越えて広がることが明らかである。異なる突然変異が関連するが、臨床上異なる表現型をもたらす遺伝子の幾つかの例がある。例えば、ERCC2 遺伝子の欠損対立遺伝子の異なる組み合わせは色素性乾皮症（グループＤ）、コカイン症候群またはトリコチオジストロフィー(trichothiodystrophy)を生じ得る。三つの疾患はUV感受性を含む異なる臨床上の特徴を有する(Broughtonら，1994，1995)。 CFTR遺伝子中の異なる突然変異は完全成熟(full-fledged)嚢胞性線維症、またはこの疾患の一つの特徴である輸精管の先天性左右不在のみをもたらし得る(Ch- illon ら，1995; Jarvi ら，1995)。特に重要な例は免疫不全、湿疹及び血小板減少を特徴とするウィスコット・アルドリッチ症候群(WAS)の原因のＸ連鎖WASP 遺伝子である。この表現型の原因の突然変異の殆どがタンパク質トランケーションを生じる。しかしながら、或る種のミスセンス突然変異はＸ連鎖血小板減少を生じることがあり、これは部分WAS 表現型に相当し、一方、重度及び軽度の突然変異に関する複合ヘテロ接合性は女性で中間表現型を生じる(Kolluriら，1995; Derry ら，1995)。同様に、異なる重度を有する突然変異の遺伝子型の組み合わせは多くの代謝性疾患で表現型の変化の連続スペクトルを生じる。どの表現型が軽度のATM 突然変異に最も関連しそうであるのか？小脳損傷がA- T の早期かつ重度の発現であるので、小脳はまた軽度のATM 突然変異と関連する表現型で或る程度まで冒されるかもしれないと推定することが妥当である。このような表現型として、単離された小脳運動失調(Harding，1993)または種々の程度の免疫不全と対にされた小脳運動失調が挙げられる。この組み合わせが実際に時折染色体不安定性とともに記載されており、しばしば“末梢血管拡張のない運動失調”と称される(Ying 及びDecoteau，1983; Byrne ら，1984; Aicardi ら，1988; Maserati，1988; Friedman及びWeitberg，1993)。Friedman及びWeitber g(1993)は、A-T を含むだけでなく、免疫不全を伴う小脳変性のその他の症例を含む“免疫不全を伴う運動失調”の新しい臨床カテゴリーを最近示唆した。本発明による小脳疾患を有する患者の評価は従来推定されたのよりも高いこのような症例の頻度を明らかにし得る。しかしながら、ATM 遺伝子の多面発現性に鑑みて、種々のATM 遺伝子型と関連する表現型の範囲は更に広いかもしれず、また明らかな臨床実体として常に特定されるとは限らない軽度の進行性症状を含むかもしれない。このような症例におけるこの遺伝子中の突然変異に関するスクリーニングはATM 遺伝子と関連する分子病理学について広い境界を明らかにし得る。実施例４ゲノム構成の決定長い距離のPCR(Barnes，1994; Cheng ら，1994; Foord 及びRose，1994)を使用して、エクソン／イントロン境界及びイントロンサイズを測定した。プライマーを200-300 bp間隔でATM cDNA配列(Savitsky ら，1995a,b)に基いて設計した。これらの反応の鋳型はコスミド及びYAC クローン、並びにヒトゲノムＤＮＡであった。11 kb の最大のイントロンをスパンするものを含む、PCR 産物を全ての場合に得た。大半の場合、同じサイズのPCR を全ての鋳型で得、ゲノムＤＮＡから得られたものをエクソン−イントロン接合の配列決定に使用した。初期反応後に、新しいプライマーを遺伝子構造の導かれる知識に基いて必要に応じて設計した。エクソン−イントロン境界を、ゲノム配列及びｃＤＮＡ配列が分岐する部位で測定した。典型的なスプライスアクセプター配列及びドナー配列が全ての場合にこれらの部位のまわりで見られた。A-T 遺伝子に関する研究中に、ベクターpSPL 3(Church ら，1994)及びeGET(Nehls ら，1994a,b)を使用して６種のエクソンをエクソントラッピング(Shiloh ら，1994b)により単離した。それらの境界は長い距離のPCR により得られたものと一致した。 ATM 遺伝子は66のエクソンを含む（図３並びに表１及び５）。最初の二つのエクソンをオルタナチブスプライシングし、1a（配列番号10）及び1b（配列番号９）と称する。3'エクソンを除いて、ATM エクソン（配列番号11〜63）はサイズが 64〜372 bpの範囲であり、平均で149 bpである。イントロンはサイズが100 bpから約11kbまでかなり変化し、大半が1-3 kbの範囲である。コンセンサスジヌクレオチドGT及びAGは、イントロン3'中でエクソン51まで存在するGCジヌクレオチド（Jackson，1991 に概説される）を有する可変ドナー部位を除いて、全てのイントロンのドナー及びアクセプタースプライス部位で見られた。読み取り枠の最初のメチオニンがエクソン３中に配置され、一方、終止コドンが3.6 kbの3'の最大のエクソン中に配置される。このエクソンは約3800ヌクレオチドの3'未翻訳領域 (UTR)(配列番号８)を含む。 ATM 遺伝子はヒト遺伝子について現在までに報告された最大数のエクソンの一つを含む。しかしながら、これらのエクソンは約150 kbの比較的コンパクトなゲノム領域にわたって広がる。例えば、ジストロフィン遺伝子はゲノムＤＮＡの2. 4 Mbをスパンする79のエクソンからなり(Robertsら，1993)、一方、ハンチントン病遺伝子は180 kbにわたって広がる67のエクソンからなる(Ambroseら,1994b) 。この出願中、種々の刊行物及び特許が夫々引用または番号により参考にされる。参考にした刊行物の完全な引用が以下にリストされる。本発明が関係する技術水準を更に充分に説明するために、これらの刊行物のそのままの開示がこの出願の参考として本明細書に含まれる。本発明が例示様式で説明され、また使用した用語は限定ではなく説明の用語の性質であることが意図されていることが理解されるべきである。明らかに、本発明の多くの改良及び変化が上記教示に鑑みて可能である。それ故、請求の範囲内で、本発明は明記された以外に実施し得ることが理解されるべきである。表２はA-T 患者中で見られた幾つかの突然変異を示す

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．突然変異が血管拡張性運動失調症及びその多形性を生じ、かつ表１及び５に示されたゲノム構成を有する、ATM と称される、遺伝子をコードする精製され、単離され、クローン化された核酸配列。２．配列番号２、８、９に示されたｃＤＮＡ配列を有する請求の範囲第１項に記載の核酸配列。３．核酸がｍＲＮＡである請求の範囲第１項に記載の精製され、単離され、クローン化された核酸配列。４．点突然変異、欠失及び挿入からなる群から選ばれた突然変異イベントが起こり、その結果、得られる配列が変化されて、血管拡張性運動失調症を生じる請求の範囲第１項に記載の核酸配列。５．突然変異イベントが表３に示されたものである請求の範囲第４項に記載の核酸配列。６．点突然変異、欠失及び挿入からなる群から選ばれた突然変異イベントが起こり、その結果、得られるアミノ酸配列が変化されて、血管拡張性運動失調症を生じる請求の範囲第１項に記載の核酸配列。７．点突然変異、欠失、挿入及び再配列からなる群から選ばれた突然変異イベントがATM の隣接配列内で起こり、その結果、ATM の調節が変化されて、血管拡張性運動失調症を生じる請求の範囲第１項に記載の核酸配列。８．点突然変異、欠失、挿入及び再配列からなる群から選ばれた突然変異イベントがATM の調節配列内で起こり、その結果、ATM の調節が変化されて、血管拡張性運動失調症を生じる請求の範囲第１項に記載の核酸配列。９．請求の範囲第１項に記載の核酸配列に操作により結合された発現調節配列を含むベクター。 10．宿主細胞が請求の範囲第９項に記載のベクターで形質転換される、好適な真核細胞及び原核細胞の群から選ばれることを特徴とする宿主細胞。 11．宿主細胞がE.coliである請求の範囲第10項に記載の宿主細胞。 12．タンパク質生成物の生成を可能にし、前記タンパク質生成物が血管拡張性運動失調症を生じる請求の範囲第４項に記載の変化された核酸配列によりコードされた精製タンパク質。 13．請求の範囲第12項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。 14．血管拡張性運動失調症を生じる欠損遺伝子のキャリヤーの検出方法であって、前記方法が a)試験患者から単離された細胞サンプルから遺伝子物質を単離する工程、 b)制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング(REF)または配列分析を行う工程、及び d)血管拡張性運動失調症を生じる欠損遺伝子の存在を検出する工程を含むことを特徴とする検出方法。 15．細胞がリンパ球である請求の範囲第14項に記載の方法。 16．サンプルが羊水である請求の範囲第14項に記載の方法。 17．細胞サンプルが漿膜柔毛である請求の範囲第14項に記載の方法。 18．単離された標本を免疫組織化学染色及び免疫細胞化学染色、ELISA、RIA、イムノブロット、免疫沈殿、ウェスタンブロッティング、機能アッセイ及びタンパク質トランケーション試験からなる群から選ばれたアッセイでタンパク質について分析する工程を含むことを特徴とする血管拡張性運動失調症を生じる請求の範囲第12項に記載のタンパク質の検出方法。 19．核酸を含む標本を単離する工程、及びその標本をin situ ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング及び逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応からなる群から選ばれたアッセイで相補性ｍＲＮＡについて分析する工程を含むことを特徴とする請求の範囲第３項に記載のｍＲＮＡ並びにその多形性及び突然変異の検出方法。 20．核酸を含む標本を単離する工程、及び請求の範囲第１項に記載の核酸配列並びにその多形性及び突然変異に特異性のプライマーを使用して、in situ ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、一本鎖コンホメーション多形性、制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング(REF)、PCR 増幅及びＤＮＡチップ分析からなる群から選ばれたアッセイで標本を分析する工程を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸配列並びにその多形性及び突然変異の検出方法。 21．潜在的キャリヤーから単離された標本をATM 遺伝子の突然変異について分析する工程を含むことを特徴とする遺伝子カウンセリングのための請求の範囲第４項に記載のATM 突然変異体遺伝子のホモ接合性またはヘテロ接合性キャリヤーに関するスクリーニング方法。 22．血管拡張性運動失調症を生じる集団中の請求の範囲第１項に記載の核酸配列、ATM 遺伝子並びにその多形性及び突然変異の検出用キットであって、前記キットが非突然変異体ATM 遺伝子のPCR プライマーを含む分子プローブ、集団中で血管拡張性運動失調症を生じる欠損ATM 遺伝子の遺伝子配列のPCR プライマーを含む少なくとも一種の分子プローブ、及び欠損対立遺伝子の存在を示すための検出装置を含むことを特徴とする検出用キット。 23．請求の範囲第12項に記載の集団中の血管拡張性運動失調症の突然変異と関連する欠損遺伝子産物の検出用キットであって、前記キットが集団中の血管拡張性運動失調症と関連する突然変異遺伝子配列によりコードされたATM 遺伝子産物の突然変異体エピトープを認識する抗体と、サンプル中の遺伝子産物への抗体の結合を検出し、それにより欠損遺伝子産物の存在を示すための検出装置を含むことを特徴とする検出用キット。 24．“部分A-T 表現型”を示す集団中の被験者から単離された標本をATM 遺伝子の突然変異について分析し、請求の範囲第１項に記載の核酸配列並びにその多形性及び突然変異を制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング(REF)により同定する工程を含むことを特徴とする遺伝子カウンセリングのためのATM 突然変異体遺伝子について“部分A-T 表現型”を示す被験者のスクリーニング方法。 25．単離された標本からｍＲＮＡを抽出する工程、ｍＲＮＡについて逆転写を行う工程、 RT-PCRにより得られた産物を使用してｍＲＮＡから選択された読み取り枠を増幅する工程、巣状PCR プライマーを使用して得られる産物を増幅し、第二産物を得る工程、第二産物を制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング(REF)にかける工程を含むことを特徴とするｍＲＮＡ配列並びにその多形性及び突然変異の検出方法。 26．単離された標本からｍＲＮＡを抽出する工程、ｍＲＮＡについて逆転写を行う工程、 RT-PCRを使用してｍＲＮＡからATM 読み取り枠（配列番号２）を増幅して産物を得る工程、配列番号64〜65の巣状PCR プライマーを使用して得られる産物を増幅して第二産物を得る工程、第二産物を配列番号66〜81のプライマーで制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング(REF)にかける工程を含むことを特徴とする請求の範囲第３項に記載の核酸配列並びにその多形性及び突然変異の検出方法。 27．ゲノムＤＮＡをサンプルから単離する工程、表１及び５に示されたATM 遺伝子のエクソン−イントロンゲノム構造に基いて設計されたプライマーによるPCR を使用してゲノムＤＮＡを増幅する工程を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のゲノムＤＮＡ核酸配列並びにその多形性及び突然変異の検出方法。