ES2638464T3 - Inducción de células pluripotentes - Google Patents

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ES2638464T3 ES10824189.4T ES10824189T ES2638464T3 ES 2638464 T3 ES2638464 T3 ES 2638464T3 ES 10824189 T ES10824189 T ES 10824189T ES 2638464 T3 ES2638464 T3 ES 2638464T3
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Abstract

Una composición que comprende: (a) un inhibidor de quinasa de tipo receptor de activina 5 (ALK5); (b) un inhibidor de MAP/ERK quinasa (MEK); y (c) un inhibidor de Rho quinasa (ROCK), teniendo el inhibidor de ROCK la estructura: en la que L2 es alquileno C1-C10 sustituido o no sustituido; y es un número entero de 0 a 3; z es un número entero de 0 a 5; X es -N>=, -CH>= o -CR5>=; R1 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; R3, R4 y R5 son independientemente -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15 -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en los que n es un número entero de 0 a 2, en los que si z es superior a 1, dos fracciones R3 se unen opcionalmente entre sí para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; y R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; o uno de sus racematos, diastereómeros, tautómeros o isómeros geométricos, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Description

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DESCRIPCION
Induccion de celulas pluripotentes Antecedentes de la invencion
Los recientes avances en la generacion de celulas madre pluripotentes inducidas artificialmente (iPSC) (Takahashi, K. et al, Cell 131, 861-72 (2007); Yu, J. et al., Science 318, 1917-20 (2007); Muller, L. U. W., et al, Mol. Ther. 17, 947-53 (2009)) han aumentado las esperanzas para su utilidad en la investigacion biomedica y en las aplicaciones clfnicas. Sin embargo, la generacion de iPSC sigue siendo un proceso muy lento (~4 semanas) e ineficaz (<0,01 % Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007); Yu, J. et al., Science 318, 1917-20 (2007)) que produce una poblacion heterogenea de celulas. La identificacion de iPSC completamente reprogramadas a partir de dicha mezcla es tediosa y requiere la experiencia especffica en el cultivo de celulas humanas pluripotentes.
Aunque los peligros de la insercion genomica de factores de reprogramacion exogenos se estan superando, la baja eficiencia y la cinetica lenta de la reprogramacion siguen presentando un enrome problema para las aplicaciones finales de las iPSC humanas. Por ejemplo, se podrfa producir un aumento en las anomalfas geneticas o epigeneticas durante el proceso de reprogramacion, en el que se pueden inhibir los supresores tumorales y activarse las vfas oncogenicas. Aunque estudios recientes han informado de una mayor eficiencia de la reprogramacion mediante manipulaciones geneticas (Feng, B. et al., Cell Stem Cell 4, 301-12 (2009)), ademas de los cuatro factores originales, dichas manipulaciones normalmente dificultan aun mas el proceso y aumentan el riesgo de alteraciones geneticas y tumorigenicidad. Por lo tanto, todavfa existe una tremenda necesidad de un procedimiento mas seguro, mas facil y mas eficiente para la generacion de iPSC humanas, y facilitar la identificacion y la caracterizacion de mecanismos fundamentales de reprogramacion.
Breve sumario
La presente invencion proporciona mezclas (por ejemplo, utiles para inducir iPSC). En particular, la invencion proporciona una composicion que comprende:
(a) un inhibidor de quinasa de tipo receptor de activina 5 (ALK5);
(b) un inhibidor de MaP/ERK quinasa (MEK); y
(c) un inhibidor de Rho quinasa (ROCK), teniendo el inhibidor de ROCK la estructura:
imagen1
en la que
L2 es alquileno C1-C10 sustituido o no sustituido; y es un numero entero de 0 a 3; z es un numero entero de 0 a 5;
X es -N=, -CH= o -CR5=;R1 es hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
R3, R4 y R5 son independientemente -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13,
-C(O)NR14R15 -NR16S(o)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en los que n es un numero entero de 0 a 2, en los que si z es superior a 1, dos fracciones R3 se unen opcionalmente entre si para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; y
R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son independientemente hidrogeno, alquilo
sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo
sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
o uno de sus racematos, diastereomeros, tautomeros o isomeros geometricos, o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.
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En algunos aspectos de la divulgacion, una mezcla comprende: celulas de mairnfero; un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de la via de Rho GTPasa/ROCK.
En algunos aspectos de la divulgacion, al menos el 99 % de las celulas son celulas no pluripotentes. En algunos aspectos de la divulgacion, todas o esencialmente todas las celulas son celulas no pluripotentes. En algunos aspectos de la divulgacion, las celulas son celulas humanas.
En algunas realizaciones, el inhibidor del receptor de TGFp/ALK5 es SB431542.
En algunas realizaciones, el inhibidor de MEK es PD0325901.
En el presente documento, se desvela un inhibidor de ROCK que es un compuesto que tiene la formula:
imagen2
en la que:
el anillo A es un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; el anillo B es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
L1 es -C(O)-NR2- o -C(O)-NR2-;
L2 es un enlace, alquileno sustituido o no sustituido, o heteroalquileno sustituido o no sustituido; y R1 y R2 son independientemente hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
Tambien se desvela un inhibidor de ROCK que tiene la formula:
imagen3
en la que y es un numero entero de 0 a 3; z es un numero entero de 0 a 5; X es -N=, -CH= o -CR5=; R3, R4 y R5 son independientemente CN, S(O)nR6, NR7R8, C(O)R9, NR10-C(O)R11, NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, - OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en los que n es un numero entero de 0 a 2, en los que si z es superior a 1, dos fracciones R3 se unen opcionalmente entre sf para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; yR, R, R, R, R , R , R , R , R , R , R , R , R y R son independientemente hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no
sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
Tambien se desvelan inhibidores de ROCK que tienen la formula:
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En algunas realizaciones, el inhibidor de ROCK es
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En algunos aspectos de la divulgacion, la concentracion de los inhibidores es suficiente para mejorar en al menos un 10 % la eficacia de la induccion de celulas no pluripotentes en la mezcla en celulas madre pluripotentes inducidas cuando la mezcla se somete a condiciones suficientes para inducir la conversion de las celulas en celulas madre pluripotentes inducidas.
En algunas realizaciones, la composicion de la invencion comprende ademas un inhibidor de GSK3 y/o un inhibidor de HDAC.
La invencion tambien proporciona un metodo in vitro o ex vivo de induccion de celulas de mamffero no pluripotentes en celulas madre pluripotentes inducidas, que comprende: introducir al menos un factor de transcripcion seleccionado del grupo que consiste en Oct-3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc en celulas no pluripotentes; y poner en contacto las celulas no pluripotentes con la composicion de la invencion; en condiciones suficientes para inducir las celulas madre pluripotentes.
Las celulas se seleccionan de celulas humanas, celulas animales no humanos, celulas de raton, celulas de primates no humanos y celulas de otros animales.
En algunas realizaciones, las celulas se ponen en contacto ademas con un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC).
En algunos aspectos de la divulgacion, el metodo comprende introducir al menos dos, tres o cuatro factores de transcripcion exogenos en las celulas no pluripotentes, en el que los factores de transcripcion se seleccionan del grupo que consiste en Oct-3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc.
En algunas realizaciones, el al menos un factor de transcripcion se introduce introduciendo un polinucleotido en las celulas no pluripotentes, en el que el polinucleotido codifica al menos un factor de transcripcion exogeno, expresando de ese modo el/los factor/es de transcripcion en las celulas.
En algunas realizaciones, el al menos un factor de transcripcion se introduce poniendo en contacto un polipeptido exogeno con las celulas no pluripotentes, en las que el polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos del factor de transcripcion, en las que la introduccion se realiza en condiciones para introducir el polipeptido en las celulas. En algunos aspectos de la divulgacion, el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos que mejora el transporte a traves de las membranas celulares.
La presente divulgacion tambien proporciona kits de induccion de la pluripotencia en celulas de mamffero no pluripotentes. En algunos aspectos de la divulgacion, el kit comprende un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de ROCK.
Definiciones
Un "polipeptido Oct" se refiere a cualquiera de los miembros naturales de la familia de octameros de factores de transcripcion, o variantes de los mismos, que mantienen la actividad del factor de transcripcion similar (en al menos un 50 %, 80 % o 90 % de actividad) en comparacion con el miembro natural mas cercano de la familia, o polipeptidos que comprenden al menos el dominio de union al ADN del miembro natural de la familia, y pueden comprender ademas un dominio de activacion de la transcripcion. Los polipeptidos Oct ilustrativos incluyen Oct-1, Oct-2, Oct-3/4, Oct-6, Oct-7, Oct-8, Oct-9 y Oct-11, por ejemplo, Oct3/4 (denominado en el presente documento "Oct4") contiene el dominio POU, una secuencia de 150 aminoacidos conservada entre Pit-1, Oct-1, Oct-2 y uric-86. Vease, Ryan, A. K. y Rosenfeld, M. G. Genes Dev. 11, 1207-1225 (1997). En algunos aspectos, las variantes tienen una identidad de secuencia de aminoacidos de al menos el 85 %, 90 % o 95 % en toda su secuencia en comparacion con un miembro natural de la familia de polipeptidos Oct tal como los enumerados anteriormente o tal como se enumeran en el numero de registro del Genbank NP_002692.2 (Oct4 humano) o NP_038661.1 (Oct4 de raton). Los polipeptidos Oct (por ejemplo, Oct3/4) pueden ser humanos, de raton, de rata, bovinos, porcinos o de otros animales. En general, se usara la misma especie de protefna con las especies de celulas que se manipulen.
Un "polipeptido Klf' se refiere a cualquiera de los miembros naturales de la familia de factores de tipo Kruppel (Klfs), protefnas de dedo de cinc que contienen secuencias de aminoacidos similares a las del regulador del patron
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embrionario de Drosophila Kruppel, o variantes de la miembros naturales que mantienen la actividad del factor de transcripcion similar (en al menos el 50 %, 80 % o 90 % de actividad) en comparacion con el miembro natural mas cercano de la familia, o polipeptidos que comprenden al menos el dominio de union al ADN del miembro natural de la familia, y puede comprender ademas un dominio de activacion de la transcripcion. Vease, Dang, D. T., Pevsner, J. y Yang, V. W. Cell Biol. 32, 1103-1121 (2000). Los miembros ilustrativos de la familia Klf incluyen, Klf1, Klf2, Klf3, Klf-4, Klf5, Klf6, Klf7, Klf8, Klf9, Klf10, Klf11, Klf12, Klf13, Klf14, Klf15, Klf16 y Klf17. Klf2 y Klf-4 resultaron ser factores capaces de generar celulas iPS en ratones, y los genes Klf1 y Klf5 relacionados tambien, aunque con una eficiencia reducida. Vease Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26:101 - 106 (2007). En algunos aspectos, las variantes tienen una identidad de secuencia de aminoacidos del al menos un 85 %, 90 % o 95 % a lo largo de toda su secuencia en comparacion con un miembro natural de la familia del polipeptidos Klf, tal como los enumerados anteriormente o tal como los enumerados en el numero de acceso del Genbank CAX16088 (Klf4 de raton) o CAX14962 (Klf4 humano). Los polipeptidos Klf (por ejemplo, Klf1, Klf4 y Klf5) pueden ser humanos, de raton, de rata, bovinos, porcinos o de otros animales. En general, se usara la misma especie de protefna con las especies de celulas que se manipulen. En la medida en que se describe en el presente documento un polipeptido Klf, este puede ser reemplazado por un polipeptido receptor de estrogeno beta (Essrb). Asf pues, se pretende que para cada aspecto de polipeptido Klf descrito en el presente documento, se describa igualmente un aspecto correspondiente que use un Essrb en lugar de un polipeptido Klf4.
Un "polipeptido Myc" se refiere a cualquiera de los miembros naturales de la familia Myc (vease, por ejemplo, Adhikary, S. y Eilers, M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:635-645 (2005)), o variantes de los mismos, que mantienen la actividad del factor de transcripcion similar (en al menos un 50 %, 80 % o 90 % de actividad) en comparacion con el miembro natural mas cercano de la familia, o polipeptidos que comprenden al menos el dominio de union al ADN del miembro natural de la familia, y pueden comprender ademas un dominio de activacion de la transcripcion. Los polipeptidos Myc ilustrativos incluyen, por ejemplo, c-Myc, N-Myc y L-Myc. En algunos aspectos, las variantes tienen una identidad de secuencia de aminoacidos del al menos un 85 %, 90 % o 95 % a lo largo de toda su secuencia en comparacion con un miembro natural de la familia del polipeptidos Myc, tal como los enumerados anteriormente o tal como los enumerados en el numero de acceso del Genbank CAA25015 (Myc humano). Los polipeptidos Myc (por ejemplo, c-Myc) pueden ser humanos, de raton, de rata, bovinos, porcinos o de otros animales. En general, se usara la misma especie de protefna con las especies de celulas que se esten manipulando.
Un "polipeptido Sox" se refiere a cualquiera de los miembros naturales de los factores de transcripcion de la caja de HMG relacionados con SRY (Sox), caracterizados por la presencia del dominio del grupo de alta movilidad (HMG), o variantes de los mismos, que mantienen la actividad del factor de transcripcion similar (en al menos un 50 %, 80 % o 90 % de actividad) en comparacion con el miembro natural mas cercano de la familia, o polipeptidos que comprenden al menos el dominio de union al ADN del miembro natural de la familia, y pueden comprender ademas un dominio de activacion de la transcripcion. Vease, por ejemplo, Dang, D. T., et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 32:1103-1121 (2000). Los polipeptidos Sox ilustrativos incluyen, por ejemplo, Sox1, Sox-2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, Sox10, Sox11, Sox12, Sox13, Sox14, Sox15, Sox17, Sox18, Sox-21 y Sox30. Sox1 ha mostrado producir celulas iPS con una eficiencia similar a Sox2, y los genes Sox3, So15 y Sox18 tambien han mostrado generar celulas iPS, aunque con algo de menos eficiencia que Sox2. Vease Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26:101-106 (2007). En algunos aspectos, las variantes tienen una identidad de secuencia de aminoacidos del al menos un 85 %, 90 % o 95 % a lo largo de toda su secuencia en comparacion con un miembro natural de la familia del polipeptidos Sox, tal como los enumerados anteriormente o tal como los enumerados en el numero de acceso del Genbank CAA83435 (Sox2 humano). Los polipeptidos Sox (por ejemplo, Sox1, Sox2, Sox3, Sox15 o Sox18) pueden ser humanos, de raton, de rata, bovinos, porcinos o de otros animales. En general, se usara la misma especie de protefna con las especies de celulas que se esten manipulando.
"H3K9" se refiere a la histona H3 lisina 9. Las modificaciones de H3K9 asociadas con la actividad genica incluyen la acetilacion de H3K9, y las modificaciones de H3K9 asociadas con la heterocromatina incluyen la dimetilacion o la trimetilacion de H3k9. Vease, por ejemplo, Kubicek, et al., Mol. Cell 473-481 (2007).
El termino “pluripotente” o “pluripotencia” se refiere a celulas con la capacidad de dar lugar a celulas de la progenie que pueden experimentar diferenciacion, en las condiciones apropiadas, en tipos de celulas que muestran colectivamente caracterfsticas asociadas con los linajes celulares del total de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las celulas madre pluripotentes pueden contribuir a todos los tejidos derivados del embrion de un animal prenatal, postnatal o adulto. Para establecer la pluripotencia de una poblacion celular, se puede usar un ensayo convencional aceptado por la tecnica, tal como la capacidad de formar un teratoma en ratones SCID de 8-12 semanas de vida; sin embargo, la identificacion de diversas caracterfsticas de celulas madre pluripotentes tambien se puede usar para detectar celulas pluripotentes.
"Caracterfsticas de las celulas madre pluripotentes" se refiere a las caracterfsticas de una celula que distinguen las celulas madre pluripotentes de otras celulas. La capacidad de dar lugar a una progenie que pueda experimentar diferenciacion, en las condiciones apropiadas, en tipos de celulas que demuestren colectivamente caracterfsticas asociadas con los linajes celulares de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo) es una caracterfstica de las celulas madre pluripotentes. La expresion o la no expresion de ciertas combinaciones de marcadores moleculares son tambien caracterfsticas de las celulas madre pluripotentes. Por ejemplo, las celulas
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madre pluripotentes humanas expresan al menos algunos, y en algunos aspectos, todos los marcadores de la siguiente lista no limitante: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-cadherina, UTF-1, Oct4, Rex1 y Nanog. Las morfologfas de las celulas asociadas con las celulas madre pluripotentes tambien son caracterfsticas de las celulas madre pluripotentes.
Como se usa en el presente documento, "celulas no pluripotentes" se refiere a celulas de mamffero que no son celulas pluripotentes. Los ejemplos de dichas celulas incluyen celulas diferenciadas, asf como celulas progenitoras. Los ejemplos de celulas diferenciadas incluyen, pero sin limitacion, celulas de un tejido seleccionado de medula osea, piel, musculo esqueletico, tejido graso y sangre periferica. Los ejemplos de tipos de celulas incluyen, pero sin limitacion, fibroblastos, hepatocitos, mioblastos, neuronas, osteoblastos, osteoclastos y linfocitos T.
En algunos aspectos de la divulgacion en los que un individuo se va a tratar con las celulas pluripotentes resultantes, se usan las propias celulas no pluripotentes del individuo para generar celulas pluripotentes de acuerdo con los metodos de la divulgacion.
Las celulas pueden ser de, por ejemplo, seres humanos o mamfferos no humanos. Los ejemplos de mamfferos no humanos incluyen, pero sin limitacion, ratones, ratas, gatos, perros, conejos, cobayas, hamsteres, ovejas, cerdos, caballos, bovinos y primates no humanos (por ejemplo, chimpances, macacos y simios).
Un polinucleotido "recombinante" es un polinucleotido que no esta en su estado nativo, por ejemplo, el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos no encontrada en la naturaleza, o el polinucleotido esta en un contexto distinto de aquel en el que se encuentra de forma natural, por ejemplo, separado de las secuencias de nucleotidos con las que normalmente esta en la proximidad de la naturaleza, o secuencias de nucleotidos adyacentes (o contiguos) con las que normalmente no esta en proximidad. Por ejemplo, la secuencia en cuestion puede clonarse en un vector, o recombinarse de otro modo con uno o mas acidos nucleicos adicionales.
"Casete de expresion" se refiere a un polinucleotido que comprende un promotor u otra secuencia reguladora unida operativamente a una secuencia que codifica una protefna.
El termino “promotor” y la expresion “secuencia de control de la expresion” se usan en el presente documento para referirse a una serie de secuencias de control de acidos nucleicos que dirigen la transcripcion de un acido nucleico. Como se usa en el presente documento, un promotor incluye secuencias de acido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripcion, tal como, en el caso de un promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor tambien incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distales, que pueden ubicarse tanto como varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripcion. Los promotores incluyen promotores constitutivos e inducibles. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayorfa de las condiciones ambientales y evolutivas. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo bajo regulacion ambiental o evolutiva. La expresion "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de la expresion de acido nucleico (tal como un promotor o seleccion de sitios de union a factores de transcripcion) y una segunda secuencia de acido nucleico, en la que la secuencia de control de la expresion dirige la transcripcion del acido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
Una "secuencia heterologa" o un "acido nucleico heterologo", como se usan en el presente documento, es aquella o aquel que se origina a partir de una fuente foranea a la celula hospedadora en particular o, si procede de la misma fuente, se modifica con respecto a su forma original. De este modo, un casete de expresion heterologo de una celula es un casete de expresion que no es endogeno a la celula hospedadora en particular, por ejemplo, por estar enlazado a secuencias de nucleotidos de un vector de expresion en lugar de ADN cromosomico, por estar unido a un promotor heterologo, por estar unido a un gen indicador, etc.
La expresion "acido nucleico" y el termino "polinucleotido" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos y sus polfmeros en forma monocatenaria o bicatenaria. El termino engloba acidos nucleicos que contienen analogos de nucleotidos conocidos, o restos o enlaces de cadena principal modificados, que son sinteticos, naturales y no naturales, que tienen propiedades de union similares a las del acido nucleico de referencia, y que se metabolizan de una manera similar a los nucleotidos de referencia. Los ejemplos de dichos analogos incluyen, sin limitacion, fosforotioatos, fosforamidatos, metil-fosfonatos, metil- fosfonatos quirales, 2-O-metil-ribonucleotidos, acidos peptido-nucleicos (PNA).
A menos que se indique lo contrario, una determinada secuencia de acido nucleico tambien engloba variantes modificadas conservativamente de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, asf como la secuencia indicada explfcitamente. En concreto, se pueden realizar sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posicion de uno o mas codones seleccionados (o todos) esta sustituida con restos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
Los terminos "inhibidores", "activadores" y "moduladores" de la expresion o de la actividad se usan para referirse a moleculas inhibidoras, activadoras o moduladoras, respectivamente, identificadas usando ensayos in vitro e in vivo
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para la expresion o la actividad de una protefna diana descrita (o polinucleotido codificante), por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas, y sus homologos y mimeticos. El termino “modulador” incluye inhibidores y activadores. Los inhibidores son agentes que, por ejemplo, inhiben la expresion o se unen a, bloquean parcial o totalmente la estimulacion o la actividad inhibidora de la proteasa, reducen, disminuyen, previenen, retrasan la activacion, inactivan, desensibilizan o regulan negativamente la actividad de la protefna diana descrita, por ejemplo, antagonistas. Los activadores son agentes que, por ejemplo, inducen o activan la expresion de una protefna diana descrita o se unen a, estimulan, aumentan, abren, activan, facilitan, potencian la activacion o actividad inhibidora de proteasa, sensibilizan o regulan positivamente la actividad de la protefna diana descrita (o polinucleotido codificante), por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen ligandos, antagonistas y agonistas de origen natural y sinteticos (por ejemplo, moleculas qufmicas pequenas, anticuerpos y similares que funcionan como agonistas o antagonistas). Dichos ensayos para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, la aplicacion de compuestos moduladores putativos a celulas que expresan la protefna diana descrita y luego la determinacion de los efectos funcionales sobre la actividad de la protefna diana descrita, como se ha descrito anteriormente. Las muestras o ensayos que comprenden la protefna diana descrita que se tratan con un activador, inhibidor o modulador potencial se comparan con muestras de control sin el inhibidor, activador o modulador para examinar el grado del efecto. A las muestras de control (no tratadas con moduladores) se les asigna un valor relativo de actividad del 100 %. La inhibicion de una protefna diana descrita se logra cuando el valor de actividad relativo al control es del aproximadamente 80 %, opcionalmente del 50 % o 25, 10 %, 5 % o 1 %. La activacion de la protefna diana descrita se consigue cuando el valor de actividad relativo al control es del 110 %, opcionalmente del 150 %, opcionalmente del 200, 300 %, 400 %, 500 % o 1.000-3.000 %) o superior.
Cuando los grupos sustituyentes qufmicos estan especificados por sus formulas qufmicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, abarcan igualmente los sustituyentes qufmicamente identicos que resultarfan de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, -CH2O- es equivalente a -OCH2-
El termino "alquilo", por sf mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena lineal (es decir, no ramificada) o ramificada, o combinacion de las mismas, que puede estar completamente saturada, mono- o poliinsaturada, y que puede incluir radicales di- y multivalentes que tienen el numero de atomos de carbono designado (es decir C1-C10 significa de uno a diez atomos de carbonos). Los ejemplos de radicales de hidrocarburo saturados incluyen, pero sin limitacion, grupos tales como metilo, etilo, n- propilo, isopropilo, n-butilo, f-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homologos e isomeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Un grupo alquilo insaturado es aquel que tiene uno o mas enlaces dobles o triples. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero sin limitacion, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- y 3- propinilo, 3-butinilo y los homologos e isomeros superiores.
El termino "alquileno", por sf mismo o como parte de otro sustituyente, significa un radical divalente derivado de un alquilo, como el ilustrado, pero sin limitacion, por -CH2CH2CH2CH2-. Por lo general, un grupo alquilo (o alquileno) tendra de 1 a 24 atomos de carbono, ilustrandose en la presente divulgacion aquellos grupos que tienen 10 o menos atomos de carbono. Un "alquilo inferior' o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena mas corta que, en general, tiene ocho o menos atomos de carbono.
El termino "heteroalquilo", por sf mismo o en combinacion con otro termino, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena lineal o ramificada estable, o radical de hidrocarburo cfclico, o combinaciones de los mismos, que consiste en al menos un atomo de carbono y al menos un heteroatomo seleccionados del grupo que consiste en O, N, P, Si y S, y en el que los atomos de nitrogeno y de azufre pueden estar opcionalmente oxidados y el heteroatomo de nitrogeno puede estar opcionalmente cuaternizado. El/los heteroatomo/s de O, N, P y S y Si pueden estar situados en cualquier posicion interior del grupo heteroalquilo o en la posicion en la que el grupo alquilo esta unido al resto de la molecula. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, - CH2-CH2-N(CHa)-CHa, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2,-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CHO- CH3, -Si(CH3)a, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, O-CH3, -O-CH2-CH3 y -CN. Puede haber hasta dos heteroatomos consecutivos tales como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-O-Si(CH3)3. De igual manera, el termino "heteroalquileno", por sf mismo o como parte de otro sustituyente, significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, como los ilustrados, pero sin limitacion, por -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para los grupos heteroalquileno, los heteroatomos tambien pueden ocupar uno o ambos de los extremos de la cadena (por ejemplo, alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino y similares). Aun mas, para los grupos enlazadores de alquileno y heteroalquileno, no hay ninguna orientacion del grupo enlazador implfcita en la direccion en la que se escribe la formula del grupo enlazador. Por ejemplo, la formula -C(O)2R'- representa tanto - C(O)2R'- como -R'C(O)2-. Como se ha descrito anteriormente, los grupos heteroalquilo, como se usan en el presente documento, incluyen aquellos grupos que estan unidos al resto de la molecula a traves de un heteroatomo, tal como -C(O)R', -C(O)NR', -NR'R", -OR', -SR' y/o - SO2R'. Cuando se cita "heteroalquilo", seguido de la mencion de grupos heteroalquilo especfficos, tales como -NR'R'' o similares, se entendera que los terminos heteroalquilo y -NR'R" no son redundantes ni excluyentes entre sf. Mas bien, los grupos heteroalquilo especfficos se citan para anadir claridad. Por lo tanto, el termino "heteroalquilo" no debe ser interpretado en el presente documento como excluyente de grupos heteroalquilo especfficos, tales como -NR'R” o similares.
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Los terminos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por si mismos o en combinacion con otros terminos, representan, a menos que se indique lo contrario, versiones cfclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Ademas, para heterocicloalquilo, un heteroatomo puede ocupar la posicion en la que el heterociclo esta unido al resto de la molecula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero sin limitacion, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3- ciclohexenilo, cicloheptilo y similares. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero sin limitacion, 1-(1,2,5,6- tetrahidropiridilo), 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo y similares. Un "cicloalquileno" y "heterocicloalquileno" se refieren a un radical divalente derivado de cicloalquilo y heterocicloalquilo, respectivamente.
Los terminos "halo" o "halogeno", por si mismos o como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se indique lo contrario, un atomo de fluor, cloro, bromo o yodo. Ademas, los terminos tales como "haloalquilo", pretenden incluir monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, la expresion "haloalquilo (C1-C4)" pretende incluir, pero sin limitacion, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo y similares.
El termino "arilo" significa, a menos que se indique lo contrario, un sustituyente hidrocarbonado poliinsaturado, aromatico, que puede ser un solo anillo o multiples anillos (preferentemente, de 1 a 3 anillos) que estan condensados entre si o enlazados covalentemente. El termino "heteroarilo" se refiere a grupos (o anillos) arilo que contienen de uno a cuatro heteroatomos seleccionados entre N, O y S, en los que los atomos de nitrogeno y de azufre estan opcionalmente oxidados, y el/los atomo/s de nitrogeno esta/n opcionalmente cuaternizado/s. Un grupo heteroarilo puede estar unido al resto de la molecula a traves de un atomo de carbono o heteroatomo. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1 -naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3- pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3- isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1 -isoquinolilo, 5- isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillos arilo y heteroarilo anteriormente indicados se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables descritos a continuacion. “Arileno” y “heteroarileno” se refieren a un radical divalente derivado de un arilo y heteroarilo, respectivamente.
Por razones de brevedad, el termino "arilo" cuando se usa en combinacion con otros terminos (por ejemplo, ariloxilo, ariltioxilo, arilalquilo) incluye anillos tanto de arilo como de heteroarilo segun lo definido anteriormente. Asf pues, el termino "arilalquilo" pretende incluir aquellos radicales en los que un grupo arilo esta unido a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y similares) incluyendo aquellos grupos alquilo en los que se ha reemplazado un atomo de carbono (por ejemplo, un grupo metileno), por ejemplo, por un atomo de oxfgeno (por ejemplo, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3-(1-naftiloxi)propilo) y similares).
El termino "oxo", como se usa en el presente documento, significa un oxfgeno que esta doblemente unido a un atomo de carbono.
El termino "alquilsulfonilo", como se usa en el presente documento, significa una fraccion que tiene la formula -S(O2)-R', en la que R' es un grupo alquilo como se ha definido anteriormente. R' puede tener un numero especificado de atomos de carbonos (por ejemplo, alquil (C1-C4)-sulfonilo").
Se pretende que cada uno de los terminos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo") incluya tanto formas sustituidas como no sustituidas del radical indicado. A continuacion, se proporcionan sustituyentes ilustrativos para cada tipo de radical.
Los sustituyentes de los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo aquellos grupos a los que se suele hacer referencia como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o mas de una variedad de grupos seleccionados entre, pero sin limitacion: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halogeno, - SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", - OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NRC(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', - S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y -NO2 en un numero que varfa de cero a (2m' + 1), donde m' es el numero total de atomos de carbono en dicho radical. R', R", R'" y R"" se refieren cada uno independientemente a hidrogeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido (por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halogenos), grupos alquilo, alcoxi o tioalcoxi sustituidos o no sustituidos, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la divulgacion incluye mas de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada uno de los grupos R', R”, R'” y R”” cuando estan presentes mas de uno de estos grupos. Cuando R' y R'' estan unidos al mismo atomo de nitrogeno, pueden combinarse con el atomo de nitrogeno para formar un anillo de 4, 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, se pretende que -NR'R'' incluya, pero sin limitacion, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. De la descripcion anterior de sustituyentes, un experto en la materia comprendera que el termino "alquilo" pretende incluir grupos que incluyen atomos de carbono unidos a grupos distintos de grupos hidrogeno, tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, y similares).
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Similares a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo son variados y se seleccionan de, por ejemplo: halogeno,-OR’, -NR’R", -SR', -halogeno, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', - CO2R', -CONR’R", -OC(O)NR’R", -NR"C(O)R’, -NR’-C(O)NR"R"’, -NR"C(O)2R’, -NR-C(NR’R"R"’)=NR"", -NR- C(NR’R")=NR"’, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R", -NRSO2R’, -CN y -NO2, -R’, -N3, -CH(Ph)2, fluoroalcoxi (C1-C4) y fluoroalquilo (C1-C4), en un numero que varfa de cero al numero total de valencias abiertas en el sistema de anillos aromaticos y donde R’, R", R’’’ y R"" se seleccionan independientemente preferentemente de hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. Cuando un compuesto de la divulgacion incluye mas de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada uno de los grupos R', R’’, R’’’ y R’’’’ cuando estan presentes mas de uno de estos grupos.
Dos de los sustituyentes en atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden formar opcionalmente un anillo de la formula -T-C(O)-(CRR’)q-U-, en la que T y U son independientemente, -NR-, -O-, -CRR'- o un enlace simple, y q es un numero entero de 0 a 3. Como alternativa, dos de los sustituyentes en atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos con un sustituyente de formula -A-(CH2)r-B-, en la que A y B son independientemente -CRR’-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR’- o un enlace simple, y r es un numero entero de 1 a 4. Uno de los enlaces simples del nuevo anillo asf formado puede estar reemplazado opcionalmente por un doble enlace. Como alternativa, dos de los sustituyentes en atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos con un sustituyente de formula -(CRR’)s-X’-(C"R"’)d-, en la que s y d son independientemente numeros enteros de 0 a 3, y X' es -O-, -NR’-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- o -S(O)2NR’-. Los sustituyentes R, R', R" y R’’’ se seleccionan preferentemente independientemente entre hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido.
Como se usa en el presente documento, el termino “heteroatomo” o “heteroatomo anular” pretende incluir oxfgeno (O), nitrogeno (N), azufre (S), fosforo (P) y silicio (Si).
Un "grupo sustituyente", como se usa en el presente documento, significa un grupo seleccionado entre las siguientes fracciones:
(A) -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, oxo, halogeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y
(B) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado entre:
(i) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halogeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y
(ii) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado entre:
(a) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halogeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y
(b) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, o heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halogeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido y heteroarilo no sustituido.
Un "sustituyente de tamano limitado" o "grupo sustituyente de tamano limitado", como se usan en el presente documento, significa un grupo seleccionado entre todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en el que cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C20 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C4-C8 sustituido o no sustituido y cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 4 a 8 miembros sustituido o no sustituido.
Un "sustituyente inferior" o "grupo sustituyente inferior", como se usan en el presente documento, significa un grupo seleccionado entre todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en el que cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C8 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C5-C7 sustituido o no sustituido y cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido.
La expresion "sales farmaceuticamente aceptables" pretende incluir sales de los compuestos activos que se
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preparan con acidos o bases relativamente no toxicos, dependiendo de los sustituyentes particulares encontrados en los compuestos descritos en el presente documento. Cuando los compuestos de la presente divulgacion contienen funcionalidades relativamente acidas, se pueden obtener sales de adicion de bases poniendo en contacto la forma neutra de dichos compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, bien pura o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adicion de bases farmaceuticamente aceptables incluyen sales de sodio, potasio, calcio, amonio, amino organico o magnesio, o una sal similar. Cuando los compuestos de la presente divulgacion contienen funcionalidades relativamente basicas, se pueden obtener sales de adicion de acido poniendo en contacto la forma neutra de dichos compuestos con una cantidad suficiente del acido deseado, bien puro o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables incluyen aquellas derivadas de acidos inorganicos como acido clorhfdrico, bromhfdrico, nftrico, carbonico, monohidrogenocarbonico, fosforico, monohidrogenofosforico, dihidrogenofosforico, sulfurico, monohidrogenosulfurico, hidriodico o fosforoso y similares, asf como las sales derivadas de acidos organicos relativamente no toxicos como los acidos acetico, propionico, isobutfrico, maleico, malonico, benzoico, succfnico, suberico, fumarico, lactico, mandelico, ftalico, bencenosulfonico, p-tolilsulfonico, cftrico, tartarico, metanosulfonico y similares. Tambien se incluyen sales de aminoacidos tales como arginato y similares, y sales de acidos organicos como acidos glucuronicos o galacturonicos y similares (vease, por ejemplo, Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Ciertos compuestos especfficos de la presente divulgacion contienen funcionalidades basicas y acidas que permiten que los compuestos se conviertan bien en sales de adicion de base o de acido.
Asf pues, los compuestos pueden existir en forma de sales con acidos farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos de dichas sales incluyen clorhidratos, bromhidratos, sulfatos, metanosulfonatos, nitratos, maleatos, acetatos, citratos, fumaratos, tartratos (por ejemplo, (+)-tartratos, (-)-tartratos o mezclas de los mismos incluyendo mezclas racemicas, succinatos, benzoatos y sales con aminoacidos tales como acido glutamico. Estas sales se pueden preparar mediante metodos conocidos por los expertos en la materia.
Las formas neutras de los compuestos se regeneran preferentemente poniendo en contacto la sal con una base o un acido, y aislando el compuesto precursor de la manera convencional. La forma precursora del compuesto difiere de las diversas formas de sal en ciertas propiedades ffsicas, tales como la solubilidad en disolventes polares.
Ademas de las formas de sal, la presente divulgacion proporciona compuestos que estan en una forma de profarmaco. Los profarmacos de los compuestos descritos en el presente documento son aquellos compuestos que experimentan facilmente cambios qufmicos en condiciones fisiologicas para proporcionar los compuestos de la presente divulgacion. Ademas, los profarmacos pueden convertirse en los compuestos de la presente divulgacion mediante metodos qufmicos o bioqufmicos en un entorno ex vivo. Por ejemplo, los profarmacos se pueden convertir lentamente en los compuestos de la presente divulgacion cuando se colocan en un deposito de parche transdermico con una enzima o un reactivo qufmico adecuado.
Ciertos compuestos de la presente divulgacion pueden existir en formas no solvatadas, asf como en formas solvatadas, incluyendo formas hidratadas. En general, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas, y estan incluidas dentro del alcance de la presente divulgacion. Ciertos compuestos de la presente divulgacion pueden existir en multiples formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas ffsicas son equivalentes para los usos contemplados por la presente divulgacion y pretenden estar dentro del alcance de la presente divulgacion.
Ciertos compuestos de la presente divulgacion poseen atomos de carbono asimetricos (centros opticos) o dobles enlaces; los racematos, diastereomeros, tautomeros, isomeros geometricos e isomeros individuales estan englobados dentro del alcance de la presente divulgacion. Los compuestos de la presente divulgacion no incluyen aquellos que son conocidos en la tecnica como demasiado inestables para sintetizarse y/o aislarse.
Los compuestos de la presente divulgacion tambien pueden contener proporciones no naturales de isotopos atomicos en uno o mas de los atomos que constituyen dichos compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden radiomarcarse con isotopos radiactivos, tales como, por ejemplo, tritio (3H), yodo-125 (125I) o carbono-14 (14C). Todas las variaciones isotopicas de los compuestos de la presente divulgacion, ya sean radiactivas o no, estan englobadas dentro del alcance de la presente divulgacion.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1. El tratamiento con los compuestos durante siete dfas es suficiente para inducir celulas madre pluripotentes a partir de fibroblastos humanos transducidos con los cuatro factores de reprogramacion. (a) Lfnea temporal para la induccion de iPSC humanas usando el tratamiento combinado con SB431542 y PD0325901 junto con los 4 FT. El tratamiento comenzo con la resiembra celular el dfa 7 despues de la transduccion de 4 FT y se mantuvo durante 7 dfas. (b) tincion para las colonias ALP+ que emergieron en los cultivos no tratados (izquierda) o cultivos tratados con 2 compuestos (derecha) en siete dfas. (c) RT-PCR que muestra una expresion de ARNm endogeno elevada de los marcadores de pluripotencia OCT4 y NANOG en cultivos tratados con 2 compuestos. (d) tincion con TRA-1-81 el dfa 14 sin (izquierda) o con (derecha) tratamiento con 2 compuestos. (e)
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Se representan los numeros de colonias NANOG+ del dfa 14 en diferentes condiciones de tratamiento. (f) Tincion tfpica para marcadores especfficos de hESC (NANOG y SSEA4) presentada por iPSC de D14. Barras de escala, 50 pm en (d y f).
Figura 2. El tratamiento prolongado con los compuestos y el paso de las celulas aumentaron espectacularmente el numero de colonias reprogramadas. (a) Lfnea temporal de la induccion de iPSC humanas usando SB431542, PD0325901 y tiazovivina. (b) Las iPSC del Dfa 30 expresaron marcadores de pluripotencia NANOG, SSEA4 y TRA-1-81. Barras de escala, 50 pm. (c) Tincion con ALP de los cultivos del dfa 30 con (paneles superiores) o sin (paneles inferiores) el tratamiento con 3 compuestos. Las zonas con recuadros de los paneles de la izquierda se amplfan en los paneles de la derecha. Barras de escala, 200 pm. (d) Numero de colonias NANOG+ del dfa 30 en diferentes condiciones de tratamiento, sin division. (e) Numero de colonias NANOG+ del dfa 30 de cultivos tratados con 3 compuestos sometidos a tripsinizacion como se indica. f) La RT-PCR en las colonias de iPSC obtenidas con el tratamiento de 3 compuestos muestra una expresion reactiva de marcadores endogenos de pluripotencia. HDF: Fibroblasto dermico humano.
Figura 3. Diferenciacion in vitro e in vivo de iPSC generadas con el tratamiento de 3 compuestos. (a) Las micrograffas muestran los cuerpos embrioides (EB) generados a partir de iPSC y la diferenciacion in vitro en tipos de celulas ectodermicas (pill TUBULINA), mesodermicas (bRaCHYURY) y endodermicas (PDX1). Barras graduadas, EB: 100 pm; otros 10 pm. (b) RT-PCR que muestra la expresion de los marcadores de linaje representativos y la ausencia de la expresion del ARN m de OCT4 en celulas diferenciadoras. U-indiferenciado, D-diferenciado. (c) Los teratomas generados en ratones desnudos de iPSC (3 colonias independientes ensayadas) consisten en tejidos de las tres capas germinales. Panel izquierdo: 1 - musculo, 2 -epitelio neuronal; panel central: 1 - piel, 2 - epitelio intestinal; panel derecho: 1 - hueso, 2 - cartflago. Barras graduadas, 20 pm.
Figura 4. El tratamiento con compuestos mejoro la generacion de celulas iPS de una manera dependiente de la dosis.
Figura 5. Estructura qufmica de Tiazovivina.
Figura 6. La expresion transgenica y el silenciamiento son independientes del tratamiento con los compuestos.
Figura 7. Las colonias de celulas iPS expandidas establemente generadas a traves del tratamiento con los compuestos presentaron un cariotipo normal.
Figura 8. Generacion de celulas madre pluripotentes inducidas por seres humanos a partir de queratinocitos primarios por un solo gen, OCT4 y moleculas pequenas. (a) El tratamiento con PD0325901 (PD) 0,5 pM y A-83-01 (A83) 0,5 pM mejoro significativamente la generacion de iPSC a partir de queratinocitos humanos primarios transducidos con los 4 FT (4F, OKSM) o 3TF (3F, OKS). Se sembraron NHEK a una densidad de 100.000 celulas transducidas por placa de 10 cm. (b) Exploraciones qufmicas adicionales identificaron PS48, NaB y su combinacion que pueden mejorar esencialmente la reprogramacion de queratinocitos humanos primarios transducidos con 2TF (OK). Se sembraron NHEK a una densidad de 100.000 celulas transducidas por placa de 10 cm. (c) Esquema experimental para la generacion de iPSC humanas a partir de queratinocitos humanos primarios transducidos por un unico gen de reprogramacion, OCT4. KCM, medio de cultivo de queratinocitos; hESCM, medios de cultivo de ESC humanas. (d) Inmunotincion viva con TRA-1-81 de colonias de iPSC que se generaron a partir de queratinocitos humanos primarios transducidos con 2TF/OK o 1TF/OCT4 antes de la recogida de las colonias. (e) Las celulas iPSC-OK e iPSC-O humanas establecidas expresan marcadores de pluripotencia tfpicos, incluyendo ALP (fosfatasa alcalina), OCT4, SOX2, NANOG, sSeA-4 y TRA-1-81. Los nucleos se tineron con DAPI.
Figura 9. Caracterizaciones en profundidad de celulas iPSC-OK e iPSC-O humanas. (a) Analisis de la expresion mediante RT-PCR de los genes de pluripotencia endogenos, y OCT4 y KLF4 exogenos. Se uso GAPDH como un control de entrada. (b) Analisis de la metilacion de promotores de OCT4 y NANOG mediante secuenciacion genomica con bisulfato. Los cfrculos abiertos y los cfrculos cerrados indican CpG no metilados y metilados en las regiones promotoras, respectivamente. (c) diagramas de dispersion que comparan patrones de expresion genica global entre celulas iPSC-O y NHEK, y hESC. Las posiciones de los genes de pluripotencia OCT4, NANOG y SOX2 se muestran mediante flechas. Las lfneas negras indican el equivalente lineal y cambios del doble en los niveles de expresion genica entre las muestras. (d) Las iPSC-OK e iPSC-O humanas se pudieron diferenciar eficazmente in vitro en celulas en las tres capas germinales, incluyendo celulas ectodermicas neuronales (pill tubulina), celulas mesodermicas (SMA) y celulas endodermicas (AFP) usando el metodo EB. (e) Ensayo de PCR cuantitativa de los marcadores de las tres capas germinales de iPSC humanas diferenciadas usando el metodo EB: ectodermo (PAX6, pIII TUBULINA), mesodermo (FOXF1, HAND1) y endodermo (AFP, GATA6). Los datos denotan cambios normalizados de GAPDH en relacion con iPSC humanas parentales indiferenciadas. (f) iPSC-OK e iPSC-O humanos pudieron producir eficazmente el teratoma completo, que contiene celulas diferenciadas en las tres capas germinales, en ratones SCID.
Figura 10. Generacion y caracterizaciones de celulas madre pluripotentes inducidas por seres humanos a
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partir de celulas endoteliales de vena umbilical por un solo gen, OCT4 y moleculas pequenas. (a)
Esquema experimental para la generacion de iPSC humanas a partir de HUVEC transducidas por OCT4. HCM, medio de cultivo de HUVEC; hESCM, medios de cultivo de ESC humanas. (b) Las celulas hiPSC-O establecidas a partir de HUVEC expresan marcadores de pluripotencia tfpicos, incluyendo NANOG y SSEA-4. Los nucleos se tineron con DAPI. (c) Analisis de la expresion mediante RT-PCR de los genes de pluripotencia endogenos. Se uso GAPDH como un control de entrada. (d) Analisis de la metilacion de promotores de OCT4 y NANOG mediante secuenciacion genomica con bisulfato. Los cfrculos abiertos y los cfrculos cerrados indican CpG no metilados y metilados en las regiones promotoras, respectivamente. (e) las celulas hiPSC-O de HUVEC pudieron diferenciarse eficazmente in vitro en celulas en las tres capas germinales, incluyendo celulas ectodermicas neuronales (pill tubulina), celulas mesodermicas (SMA) y celulas endodermicas (AFP) usando el metodo EB. (f) las celulas hiPSC-O pudieron producir con eficacia el teratoma completo, que contiene celulas diferenciadas en las tres capas germinales en ratones SCID.
Figura 11. Caracterizacion de celulas iPSC-OK humanas a partir de AHEK. (a) Las celulas hiPSC-O establecidas a partir de queratinocitos adultos expresan marcadores de pluripotencia tfpicos, incluyendo NANOG, SOX2 y SSEA-4. Los nucleos se tineron con DAPI. (b) Estas celulas hiPSC-O pudieron diferenciarse eficazmente in vitro en celulas en las tres capas germinales, incluyendo celulas ectodermicas neuronales (pill tubulina), celulas mesodermicas (SMA) y celulas endodermicas (AFP) usando el metodo EB.
Figura 12. Caracterizacion de celulas iPSC-O humanas a partir de AFDC. (a) Las celulas hiPSC-O establecidas a partir de celulas derivadas de lfquido amniotico expresan marcadores de pluripotencia tfpicos, incluyendo NANOG, SOX2 y SSEA-4. Los nucleos se tineron con DAPI. (b) Estas celulas hiPSC-O pudieron diferenciarse eficazmente in vitro en celulas en las tres capas germinales, incluyendo celulas ectodermicas neuronales (pill tubulina), celulas mesodermicas (SMA) y celulas endodermicas (AFP) usando el metodo EB.
Figura 13. Estirpes celulares de hiPSC adicionales expresan marcadores de pluripotencia tfpicos. El resto de estirpes celulares hiPSC-O establecidos expresan marcadores de pluripotencia tfpicos, incluyendo NANOG y SSEA-4. Los nucleos se tineron con DAPI.
Figura 14. Cultivo sin alimentacion de estirpes celulares hiPSC. Se dividieron hiPSC sobre placas recubiertas con Matrigel/ECM en medio de hESC qufmicamente definido como se informo anteriormente. Estas hiPSCa pudieron mantenerse y ampliarse en un entorno sin alimentacion. ICC mostro la expresion de los marcadores de pluripotencia, OCT4 y SSEA4. Los nucleos se tineron con DAPI.
Figura 15. Genotipificacion de las hiPSC. El analisis mediante RT-PCR usando ADN genomico muestra que solo el transgen OCT4 se integro en el genoma de las estirpes de hiPSC-O (hiPSC-O n.° 1, hiPSC-O n.° 3, hiPSC-O n.° 21, hiPSC-O n.° 26 y hiPSC-O n.° 31). Las NHEK (a) y las HUVEC (b) se usaron como controles negativos, mientras que los vectores se usaron como controles positivos.
Figura 16. Integracion del transgen OCT4 en las hiPSC. Se digirio el ADN genomico (10 pg) con EcoRI y se hibrido con la sonda de ADNc de OCT4 (un fragmento EcoRI/Spel de pSin-EF2-OCT4-Pur). Se detectaron multiples integraciones transgenicas.
Figura 17. Cariotipificacion para estirpes celulares hiPSC. La propagacion en metafase de hiPSC-O n.° 1 (a) y hiPSC-O n.° 21 (b) muestran el cariotipo normal despues del paso 15.
Descripcion detallada
I. Introduccion
La presente invencion se basa en el sorprendente descubrimiento de que una combinacion de un inhibidor de ALK5, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK mejoran enormemente la eficacia de induccion de la pluripotencia en celulas de mamffero no pluripotentes transformadas con cuatro factores de transcripcion. Por consiguiente, la presente invencion proporciona metodos segun lo expuesto en las reivindicaciones de induccion de la pluripotencia en celulas de mamffero no pluripotentes, metodo que comprende poner en contacto las celulas no pluripotentes con al menos un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, en combinacion con un inhibidor de la via MEK/ERK y un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK.
II. Inhibidores del receptor de TGFp/ALK5
La quinase de tipo receptor de activina 5 (ALK-5) es el principal receptor de TGFp que media en las respuestas celulares a los TGF-p (Massague J. Annu Rev Biochem 67:753-791 (1998); Massague J., Chen Y. G. Genes Dev 14:627-644 (2000); Franzen P, et al., Cell 75:681-692 (1993)). Tras la union del ligando, la TpRII quinasa constitutivamente activa fosforila ALK-5 que, a su vez, activa las cascadas de transduccion de senalase cadena abajo. La fosforilacion de Smad2 y Smad3 activada por ALK-5 es la via mas destacada (Massague J., Chen Y. G. Genes Dev 14:627-644 (2000)). Una vez activado, Smad2/3 se asocia con Smad4 y se translocaliza hasta el nucleo, donde el complejo regula a nivel de la transcripcion la expresion del gen diana.
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Los inhibidores del receptor de TGFp (es dedr, ALK5) pueden incluir anticuerpos contra, variantes negativas dominantes de y ARNip, microARN, acidos nucleicos antisentido y otros polinucleotidos que suprimen la expresion de los receptores de TGFp (por ejemplo, ALK5). Los ejemplos de inhibidores del receptor de TGFp/ALK5 incluyen, pero sin limitacion, SB431542 (vease, por ejemplo, Inman, et al., Molecular Pharmacology 62(1):65-74 (2002)), A-83- 01, tambien conocido como 3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1-carbotioamida (vease, por ejemplo, Tojo, et al., Cancer Science 96(11):791-800 (2005), y disponible en el mercado, por ejemplo, en eToicris Bioscience); 2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina, Wnt3a/BIO (vease, por ejemplo, Dalton, et al., WO2008/094597), BMP4 (vease Dalton, supra), GW788388 (-{4-3-(piridin-2-il)-1H-pirazol-4-il]piridin-2-il}-N- (tetrahidro-2H-piran-4-il)benzamida) (vease, por ejemplo, Gellibert, et al., Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210- 2221 (2006)), SM16 (vease, por ejemplo, Suzuki, et al., Cancer Research 67(5):2351-2359 (2007)), IN-1130 (3-((5- (6-metilpiridin-2-il)-4-(quinoxalin-6-il)-1H-imidazol-2-il)metil)benzamida) (vease, por ejemplo, Kim, et al., Xenobiotica 38(3):325-339 (2008)), GW6604 (2-fenil-4-(3-piridin-2-il-1H-pirazol-4-il)piridina) (vease, por ejemplo, de Gouville, et al., Drug News Perspective 19(2):85-90 (2006)), SB-505124 (clorhidrato de 2-(5-benzo-1,3]dioxol-5-il-2-terc-butil-3H- imidazol-4-il)-6-metilpiridina) (vease, por ejemplo, DaCosta, et al., Molecular Pharmacology 65(3):744-752 (2004)) y derivados de pirimidina (veanse, por ejemplo, los enumerados en Stiefl, et al., WO2008/006583). Ademas, aunque no se pretende que un "inhibidor de ALK5" abarque inhibidores de quinasa no especfficos, se ha de entender que un "inhibidor de ALK5" abarca inhibidores que inhiben ALK4 y/o ALK7, ademas de ALK5, tales como, por ejemplo, SB- 431542 (vease, por ejemplo, Inman, et al., J. Mol. Phamacol. 62(1): 65-74 (2002).
En vista de los datos que, en el presente documento, muestran el efecto de la inhibicion de ALK5, se cree que la inhibicion de la via TGFp/activina tendra efectos similares. Por lo tanto, cualquier inhibidor (por ejemplo, cadena arriba o cadena abajo) de la via de TGFp/activina puede usarse en combinacion con, o en lugar de, inhibidores de ALK5 descritos en cada parrafo del presente documento. Los inhibidores de la via de TGFp/activina ilustrativos incluyen, pero sin limitacion: inhibidores del receptor de TGFp, inhibidores de la fosforilacion de SMAD 2/3, inhibidores de la interaccion de SMAD 2/3 y SMAD4 y activadores/agonistas de SMAD6 y SMAD7. Ademas, las categorizaciones descritas a continuacion son meramente con fines organizativos, y un experto en la materia sabrfa que los compuestos pueden afectar a uno o mas puntos dentro de una via y, por tanto, los compuestos pueden funcionar en mas de una de las categorfas definidas.
Los inhibidores del receptor de TGFp pueden incluir anticuerpos frente, variantes negativas dominantes de y ARNip o acidos nucleicos antisentido que se dirigen a receptores de TGFBp. Los ejemplos especfficos de inhibidores incluyen, pero sin limitacion, SU5416; clorhidrato de 2-(5-benzo-1,3]dioxol-5-il-2-terc-butil-3H-imidazol-4-il)-6- metilpiridina (SB-505124); lerdelimumb (CAT-152); metelimumab (CAT-192); GC-1008; ID11; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; Ki26894; SB- 203580; SD-093; Gleevec; 3,5,7,2',4'-pentahidroxiflavona (Morin); activina-M108A; P144; TBR2-Fc soluble; y celulas tumorales transfectadas antisentido que se dirigen a receptores de TGFp. (Vease, por ejemplo, Wrzesinski, et al., Clinical Cancer Research 13(18):5262-5270 (2007); Kaminska, et al., Acta Biochimica Polonica 52(2):329-337 (2005); y Chang, et al., Frontiers in Bioscience 12:4393-4401 (2007). Ademas, los inventores han encontrado que los inhibidores de TGFp BMP-4 y BMP-7 tienen efectos similares de reprogramacion celular a los del inhibidor de ALK5 descrito en los ejemplos, proporcionando asf evidencias adicionales de que los inhibidores de TGFp pueden usarse para la reprogramacion (por ejemplo, en combinacion con un inhibidor de la via de MEK/ERK y un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK). Los ejemplos de secuencias de protefnas BMP-4 y BMP-7 humanas se exponen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 7.405.192.
Los inhibidores de la fosforilacion de SMAD 2/3 pueden incluir anticuerpos frente, variantes negativas dominantes de y acidos nucleicos antisentido dirigidos a SMAD2 o SMAD3. Los ejemplos especfficos de inhibidores incluyen PD169316; SB203580; SB-431542; LY364947; A77-01; y 3,5,7,2',4'-pentahidroxiflavona (Morin). (Vease, por ejemplo, Wrzesinski, supra; Shimanuki, et al., Oncogene 26:3311-3320 (2007); y Kataoka, et al., EP1992360.)
Los inhibidores de la interaccion de SMAD 2/3 y smad4 pueden incluir anticuerpos frente, variantes negativas dominantes de y acidos nucleicos antisentido dirigidos a SMAD2, SMAD3 y/o smad4. Los ejemplos especfficos de inhibidores de la interaccion de SMAD 2/3 y SMAD4 incluyen, pero sin limitacion, Trx-SARA, Trx-xFoxH1b and Trx- Lef1. (vease, por ejemplo, Cui, et al., Oncogene 24:3864-3874 (2005) y Zhao, et al., Molecular Biology of the Cell, 17:3819-3831 (2006).)
Los activadores/agonistas de SMAD 6 y SMAD 7 incluyen, pero sin limitacion, anticuerpos contra, variantes negativas dominantes de y acidos nucleicos antisentido dirigidos a SMAD 6 o SMAD 7. Los ejemplos especfficos de inhibidores incluyen, pero sin limitacion, oligonucleotidos de PTO como smad7. Vease, por ejemplo, Miyazono, et al., US6534476, y Steinbrecher, et al., US2005119203.
Los expertos en la materia apreciaran que la concentracion del inhibidor del receptor de TGFp/ALK5 dependera de que inhibidor espedfico se use. En general, la concentracion de un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5 en un cultivo celular estara en el intervalo de CI20-CI100 (es decir, concentraciones en las que se alcanza una inhibicion del 20 % al 100 % de inhibicion en las celulas). Por ejemplo, SB432542 se usarfa a 0,5-10 pM, optimamente a aproximadamente 1-5 pM. En ciertos aspectos, se puede usar una combinacion de dos o mas inhibidores diferentes del receptor de TGFp/ALK5.
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III. Inhibidores de la via de MEK/ERK
La via de MEK/ERK se refiere a las serina/treonina quinasas MEK y ERK que forman parte de una via de transduccion de senales. En general, Ras activado activa la actividad de la protefna quinasa de la RAF quinasa. La RAF quinasa fosforila y activa MEK que, a su vez, fosforila y activa una protefna quinasa activada por mitogenos (MAPK). La MAPK fue originalmente denominada "quinasas reguladas por senales extracelulares" (ERK) y la protefna quinasa asociada a los microtubulos (MAPK). Por lo tanto, "ERK" y "MAPK" se usan como sinonimos.
Los inhibidores de la via de MEK/ERK se refieren a inhibidores bien de MEK o de ERK que forman parte de la via de Raf/MEK/ERK. Debido a que los inventores han encontrado que los inhibidores de MEK son eficaces para mejorar la induccion de las iPSC, y dado que MEK controla directamente la actividad de ERK, se cree que los inhibidores de MEK descritos para la presente divulgacion se pueden reemplazar por un inhibidor de ERK como se desee.
[0110] Los inhibidores de MEK (es decir, MEK1 (tambien conocido como protefna quinasa quinasa 1 activada por mitogenos) y/o MEK2 (tambien conocida como protefna quinasa quinasa 2 activada por mitogenos) pueden incluir anticuerpos contra, variantes negativas dominantes de, y ARNip y ARNip, microARN, acidos nucleicos antisentido y otros polinucleotidos que suprimen la expresion de MEK. Los ejemplos especfficos de inhibidores de MEK incluyen, pero sin limitacion, PD0325901, (vease, por ejemplo, Rinehart, et al., Journal of Clinical Oncology 22: 4456-4462 (2004)), PD98059 (disponible, por ejemplo, en Cell Signaling Technology), U0126 (disponible, por ejemplo, en Cell Signaling Technology), SL 327 (disponible, por ejemplo, en Sigma-Aldrich), ARRY-162 (disponible, por ejemplo, en Array Biopharma), PD184161 (vease, por ejemplo, Klein, et al., Neoplasia 8:1-8 (2006)), PD184352 (CI-1040) (vease, por ejemplo, Mattingly, et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316:456-465 (2006)), sunitinib (vease, por ejemplo, Voss, et al., US2008004287), sorafenib (vease, Voss supra), Vandetanib (vease, Voss supra), pazopanib (vease, por ejemplo, Voss supra), Axitinib (vease, Voss supra) y PTK787 (vease, Voss supra).
En la actualidad, varios inhibidores de MEK estan siendo sometidos a evaluaciones de ensayos clfnicos. CI-1040 se ha evaluado en ensayos clfnicos de fase 1 y II para el cancer (vease, por ejemplo, Rinehart, et al., Journal of Clinical Oncology 22(22):4456-4462 (2004)). Otros inhibidores de MEK que se estan evaluando en ensayos clfnicos incluyen PD184352 (vease, por ejemplo, English, et al., Trends in Pharmaceutical Sciences 23(1):40-45 (2002)), BAY 439006 (vease, por ejemplo, Chow, et al., “Cytometry” (Communications in Clinical Cytometry) 46:72-78 (2001)), PD- 325901 (tambien PD0325901), GSK1120212, ARRY-438162, RDEA119, AZD6244 (tambien ARRY-142886 o ARRY- 886), RO5126766, XL518 y AZD8330 (tambien ARRY-704). (Vease, por ejemplo, la informacion de los Institutos Nacionales de Salud ubicada en la World Wide Web en clinicaltrials.gov, asf como la informacion del Instituto Nacional del Cancer ubicada en la World Wide Web en cancer.gov/clinicaltrials.
Los inhibidores ilustrativos de ERK (es decir, ERK1 (tambien conocido como MAPK3) y/o ERK2 (tambien conocido como MAPK1)) incluyen PD98059 (vease, por ejemplo, Zhu, et al., Oncogene 23:4984-4992 (2004)), U0126 (vease, Zhu, supra), FR180204 (vease, por ejemplo, Ohori, Drug News Perspective 21(5):245-250 (2008)), sunitinib (vease, por ejemplo, el documento US2008004287), sorafenib, Vandetanib, pazopanib, Axitinib y PTK787.
Los expertos en la materia apreciaran que la concentracion del inhibidor de la via de MEK/ERK dependera de que inhibidor especffico se use. En aspectos particulares, se puede usar una combinacion de dos o mas inhibidores de la via de MEK/ERK diferentes.
IV. Inhibidores de Rho GTPasa/ROCK
La presente divulgacion proporciona usos y composiciones que comprenden inhibidores de la via de Rho- GTPasa/ROCK. La via incluye la protefna cadena abajo Miosina II, que esta mas abajo de ROCK (Rho-ROCK- Miosina II forma la vfa/el eje). Por lo tanto, se puede usar cualquiera o todos los inhibidores de Rho GTPasa, un inhibidor de ROCK o un inhibidor de miosina II para conseguir los efectos descritos en el presente documento. Los expertos en la materia apreciaran que la concentracion del inhibidor de la via de Rho-GTPasa/ROCK dependera de que inhibidor especffico se use. En aspectos adicionales, se puede usar una combinacion de dos o mas inhibidores de la via de Rho-GTPasa/ROCK diferentes.
Cualquier Rho GTPasa debe ser eficaz en los metodos y en las composiciones de la divulgacion. Los inhibidores de Rho GTPasa pueden incluir anticuerpos que se unen a, variantes negativas dominantes de y ARNip, microARN, acidos nucleicos antisentido y otros polinucleotidos que se dirigen a Rho GTPasa. Un ejemplo de inhibidor de la Rho GTPasa es la toxina C3 de Clostridium botulinum.
Cualquier inhibidor de miosina II debe ser eficaz en los metodos y en las composiciones de la divulgacion. Los inhibidores de la miosina II pueden incluir anticuerpos que se unen a, variantes negativas dominantes de y ARNip, microARN, acidos nucleicos antisentido y otros polinucleotidos que se dirigen a la miosina II. Un ejemplo de inhibidor de la miosina II es la blebbistatina. Los inventores han encontrado que la blebbistatina puede sustituirse por SB431542 (un inhibidor de ALK5), aunque con un efecto reducido, en las mezclas y en los metodos descritos en el apartado de ejemplos. Otros inhibidores incluyen, pero sin limitacion, los descritos en la patente de EE.UU. n.°
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"ROCK" usado en el presente documento se refiere a una serina/treonina quinasa que actua cadena abajo de Rho. ROCK I (tambien denominada ROK p o p160ROCK) y ROCK II (tambien denominada ROK a o Rho quinasa) estan ambas reguladas por RhoA. Vease, por ejemplo, Riento, K. y Ridley, A. J., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 4, 446-456 (2003). Un " inhibidor de ROCK" se refiere a agentes que inhiben a ambas o a cualquiera de las ROCK. Los inhibidores de ROCK pueden incluir anticuerpos que se unen a, variantes negativas dominantes de, y ARNip, microARN, acidos nucleicos antisentido y otros polinucleotidos que se dirigen a ROCK. Algunos ejemplos de inhibidores de ROCK incluyen, pero sin limitacion, los descritos en las publicaciones internacionales n.°: WO98/06433, WO00/78351, WO01/17562, WO02/076976, WO02/076977, WO2003/062227, WO2003/059913, WO2003/062225, WO2002/076976, WO2004/039796, WO03/082808, WO05/035506, WO05/074643; y las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 2005/0209261, 2005/0192304, 2004/0014755, 2004/0002508, 2004/0002507, 2003/0125344 y 2003/0087919. Los inhibidores de ROCK incluyen, por ejemplo, diclorhidrato de (+)-(R)-trans-4-(1- aminoetil)-N-(4-piridil)ciclohexanocarboxamida o Wf536; monoclorhidrato de 4-(1R)-1-aminoetil]-N-(4-
piridil)benzamida o Fasudil; clorhidrato de 5-(hexahidro-1H-1,4-diazepin-1-ilsulfonil)isoquinolina o Compuesto 1; 4- (trans-4-aminociclohexil)amino]-2,5-difluorobenzamida o Compuesto 2; 4-(trans-4-aminociclohexil)amino]-5-cloro-2- fluorobenzamida o Compuesto 3; diclorhidrato de 2-4-(1H-indazol-5-il)fenil]-2-propanamina o Compuesto 4; N-(3- metoxibencil)-4-(4-piridil)benzamida, Y-27632 (vease, por ejemplo, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)), Fasudil (tambien denominado HA1077) (vease, por ejemplo, Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)), sc-3536 (vease, por ejemplo, Darenfed, H., et al. Cell Motil. Cytoskeleton. 64: 97-109, 2007), H-1152 (vease, por ejemplo, Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)), Wf-536 (vease, por ejemplo, Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)), Y-30141 (descrito en la patente de EE.UU. n.° 5.478.838) y sus derivados, y acido nucleico antisentido para ROCK, acido nucleico inductor de interferencia de ARN (por ejemplo, ARNip), peptidos competitivos, peptidos antagonistas, anticuerpos inhibidores, fragmentos de anticuerpo-ScFV, variantes negativas dominantes y vectores de expresion de los mismos.
Los compuestos anteriores se pueden preparar en forma de sales de adicion de acidos con acidos inorganicos o acidos organicos farmaceuticamente aceptables, segun se requiera. Los ejemplos de las sales de adicion de acido incluyen sales con acidos minerales tales como acido clorhfdrico, acido bromhfdrico, acido sulfurico, acido fosforico y similares; sales con acidos carboxflicos organicos tales como acido formico, acido acetico, acido fumarico, acido maleico, acido oxalico, acido cftrico, acido malico, acido tartarico, acido aspartico y acido glutamico; y sales con acidos sulfonicos tales como acido metanosulfonico, acido bencenosulfonico, acido p-toluenosulfonico, acido hidroxibencenosulfonico, acido dihidroxibencenosulfonico y similares.
Los compuestos y las sales de adicion de acido de los mismos pueden ser un anhfdrido, hidrato o solvato de los mismos.
Para poner en practica la presente divulgacion, los inhibidores de ROCK, en general, son adecuados sin limitacion, siempre que un inhibidor pueda inhibir la funcion de la Rho-quinasa (ROCK), y los inhibidores adecuados incluyen Y- 27632 (por ejemplo, vease Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)), sc-3536 (vease, por ejemplo, Darenfed, H., et al. Cell Motil. Cytoskeleton. 64: 97-109, 2007), Fasudil (tambien denominado HA1077) (vease, por ejemplo, Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)), H-1152 (vease, por ejemplo, Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)), Wf-536 (vease, por ejemplo, Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)), Y-30141 (descrito en la patente de EE.UU. n.° 5.478.838) y sus derivados, y acidos nucleicos antisentido para ROCK, acido nucleico inductor de interferencia de ARN (por ejemplo, ARNip), peptidos competitivos, peptidos antagonistas, anticuerpos inhibidores, fragmentos de anticuerpo- ScFV, variantes negativas dominantes y vectores de expresion de los mismos. Ademas, dado que se conocen otros compuestos de bajo peso molecular como inhibidores de ROCK, dichos compuestos o derivados de los mismos tambien pueden usarse en la presente divulgacion (veanse, por ejemplo, las solicitudes de patentes de EE.UU. n.° 20050209261, 20050192304, 20040014755, 20040002508, 20040002507, 20030125344 y 20030087919, y las publicaciones de patente internacional n.° 2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976 y 2004/039796). En la presente divulgacion, tambien se puede usar una combinacion de uno o dos o mas de los inhibidores de ROCK.
Otros inhibidores de ROCK adicionales incluyen, por ejemplo, HA1100, 3-(4-piridil)-1H-indol y N-(4-piridil)-N’-(2,4,6- triclorofenil)urea, cada una de las cuales se encuentra disponible en el mercado (por ejemplo, en Alexis Biochemicals (Plymouth Meeting, PA).
En algunos aspectos, los inhibidores de ROCK tienen la formula:
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En la formula (I), el anillo A es un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido. El anillo B es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
1 2 2 2
L es -C(O)-NR - o -NR -C(O)-. L es un enlace, alquileno sustituido o no sustituido, o heteroalquileno sustituido o no sustituido.
R1 y R2 son independientemente hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
En algunos aspectos, el anillo A es un arilo sustituido o no sustituido. El anillo A tambien puede ser un fenilo sustituido o no sustituido.
En otros aspectos el anillo B es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido. El anillo B puede ser un heteroarilo sustituido o no sustituido. En otros aspectos mas, el anillo B es un pirazolilo sustituido o no sustituido, furanilo sustituido o no sustituido, imidazolilo sustituido o no sustituido, isoxazolilo sustituido o no sustituido, oxadiazolilo sustituido o no sustituido, oxazolilo sustituido o no sustituido, pirrolilo sustituido o no sustituido, piridilo sustituido o no sustituido, pirimidilo sustituido o no sustituido, piridazinilo sustituido o no sustituido, tiazolilo sustituido o no sustituido, triazolilo sustituido o no sustituido, tienilo sustituido o no sustituido, dihidrotienopirazolilo sustituido o no sustituido, tianaftenilo sustituido o no sustituido, carbazolilo sustituido o no sustituido, benzotienilo sustituido o no sustituido, benzofuranilo sustituido o no sustituido, indolilo sustituido o no sustituido, quinolinilo sustituido o no sustituido, benzotriazolilo sustituido o no sustituido, benzotiazolilo sustituido o no sustituido, benzooxazolilo sustituido o no sustituido, bencimidazolilo sustituido o no sustituido, isoquinolinilo sustituido o no sustituido, isoindolilo sustituido o no sustituido, acridinilo sustituido o no sustituido, benzoisazolilo sustituido o no sustituido, o dimetilhidantofna sustituida o no sustituida.
L2 puede ser alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. En algunos aspectos, L2 es alquilo C1-C10 no sustituido. L2 tambien puede ser metileno sustituido o no sustituido (por ejemplo, metileno no sustituido).
R2 puede ser hidrogeno. R1 puede ser hidrogeno o alquilo C1-C10 no sustituido. En algunos aspectos, R1 es simplemente hidrogeno.
En algunos aspectos de la Formula (I), el anillo A es arilo sustituido o no sustituido, el anillo B es heteroarilo sustituido o no sustituido, R1 es hidrogeno y L2 es alquilo C1-C10 no sustituido.
En otro aspecto de la divulgacion, el inhibidorde ROCKtiene la formula:
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En la Formula (II), y es un numero entero de 0 a 3 y z es un numero entero de 0 a 5. X es -N=, -CH= o -CR4=. R1 y L2 son como se han definido anteriormente en las definiciones de la Formula (I).
R3, R4 y R5 son independientemente -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13,
-C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no
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sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en los que n es un numero entero de 0 a 2, en los que si z es superior a 1, dos fracciones R3 se unen opcionalmente entre sf para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
R6, R7, R8, R9
R18 y R19 son independientemente hidrogeno, alquilo sustituido o
. . . . R10, R, R12, R13, R, R15, R16, R
no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
En algunos aspectos, L2 es alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. L2 tambien puede ser alquilo C1-C10 no sustituido. Como alternativa, L2 es metileno sustituido o no sustituido (por ejemplo, metileno no sustituido).
En otros aspectos, X es -N= o -CH=. El sfmbolo z puede ser 2. En otros aspectos mas, dos fracciones R3 en vertices adyacentes estan unidas entre sf a partir de un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido. El sfmbolo z tambien puede ser 1. El sfmbolo y puede ser 0 o 1. R3 puede ser -OR18. R18 puede ser hidrogeno o alquilo C1-C10 no sustituido.
En algunos aspectos, L2 es metileno sustituido o no sustituido (por ejemplo, metileno sustituido), X es -N= o -CH=, R1 es hidrogeno, y y z son 0.
En otros aspectos, los compuestos tienen la formula:
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V. Inhibidores de GSK3
En diversos aspectos de la divulgacion, uno o mas inhibidores de GSK3 pueden incluirse en los metodos, en las mezclas y en los kits de la divulgacion. Los inventores proporcionan la inclusion de inhibidores de GSK3 con al menos un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, en combinacion con un inhibidor de via de MEK/ERK y un inhibidor Rho GTPasa/ROCK. Los inhibidores de GSK3 pueden incluir anticuerpos que se unen a, variantes negativas dominantes de y ARNip, microARN, acidos nucleicos antisentido y otros polinucleotidos que se dirigen a GSK3. Los ejemplos especfficos de inhibidores de GSK3 incluyen, pero sin limitacion, Kenpaullone, 1-azakenpaullone, CHIR99021, CHIR98014, AR-A014418 (vease, por ejemplo, Gould, et al., The International Journal of Neuropsychopharmacology 7:387-390 (2004)), CT 99021 (vease, por ejemplo, Wagman, Current Pharmaceutical Design 10:1105-1137 (2004)), CT 20026 (vease, Wagman, supra), SB216763 (vease, por ejemplo, Martin, et al., Nature Immunology 6:777-784 (2005)), AR-A014418 (vease, por ejemplo, Noble, et al., PnAS 102:6990-6995 (2005)), litio (vease, por ejemplo, Gould, et al., Pharmacological Research 48: 49-53 (2003)), SB 415286 (vease, por ejemplo, Frame, et al., Biochemical Journal 359:1-16 (2001)) y TDZD-8 (vease, por ejemplo, Chin, et al., Molecular Brain Research, 137(1-2):193-201 (2005)). Otros inhibidores de GsK3 ilustrativos adicionales disponibles en Calbiochem (vease, por ejemplo, Dalton, et al., WO2008/094597), incluyen, pero sin limitacion, BIO (2'Z,3'£)-6- Bromoindirubin-3'-oxima (inhibidor de GSK3 IX); BIO-Acetoxima (2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetoxima (inhibidor de GSK3 X); (5-Metil-1H-pirazol-3-il)-(2-fenilquinazolin-4-il)amina (inhibidor de GSK3 XIII); Complejo de piridocarbazol-ciclopenadienilrutenio (inhibidor de GSK3 XV); TDZD-8 4-bencil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidin-3,5-diona (inhibidor de GSK3beta I); 2-tio(3-yodobencil)-5-(1-piridil)-1,3,4]-oxadiazol (inhibidor de GSK3beta II); OTDZT 2,4- dibencil-5-oxotiadiazolidin-3-tiona (inhibidor de GSK3beta III); alfa-4-Dibromoacetofenona (inhibidor de GSK3beta VII); AR-AO 14418 N-(4-metoxibencil)-N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)urea (inhibidor de GSK-3beta VIII); 3-(1-(3- hidroxipropil)-1H-pirrolo-2,3-b]piridin-3-il]-4-pirazin-2-il-pirrol-2,5-diona (inhibidor de GSK-3beta XI); TWS1 19 compuesto de pirrolopirimidina (inhibidor de GSK3beta XII); L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 o su forma miristoilada (inhibidor de GSK3beta XIII); 2-cloro-1-(4,5-dibromo-tiofen-2-il)-etanona (inhibidor de GSK3beta VI); AR-AO144-18; SB216763; y SB415286. Se han identificado restos de GSK3b que interaccionan con inhibidores. Vease, por ejemplo, Bertrand et al., J. Mol Biol. 333(2): 393-407 (2003). Los inhibidores de GSK3 pueden activar, por ejemplo, la via de Wnt/p-catenina. Muchos de los genes p-catenina cadena abajo regulan conjuntamente las redes de genes de la pluripotencia. Por ejemplo, un inhibidor de GSK activa la expresion de cMyc, asf como aumenta su estabilidad proteica y actividad a nivel de la transcripcion. Asf pues, en algunos aspectos, los inhibidores de GSK3 se pueden usar para estimular la expresion del polipeptido MYC endogeno en una celula, eliminando de este modo la necesidad de la expresion de MYC para inducir la pluripotencia.
Los expertos en la materia apreciaran que la concentracion del inhibidor de GSK3 dependera de que inhibidor especffico se use. En ciertos aspectos, se puede usar una combinacion de dos o mas inhibidores de GSK3 diferentes.
VI. Metodos de induccion de la pluripotencia
Hasta la fecha, se ha establecido un gran numero de diferentes metodos y protocolos para inducir celulas de mamffero no pluripotentes en celulas madre pluripotentes inducidas (iPSC). Se cree que los agentes descritos en el presente documento pueden usarse en combinacion con esencialmente cualquier protocolo para generar iPSC y, de este modo, mejorar la eficacia del protocolo. Por lo tanto, la presente divulgacion proporciona la incubacion de celulas no pluripotentes con al menos un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, en combinacion con un inhibidor de la via de MEK/ERK y un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK en combinacion con cualquier protocolo para generar iPSC. Se describe a continuacion una seleccion de protocolos, y se cree que cada uno es combinable con los agentes de la divulgacion para mejorar la eficacia del protocolo.
La mejora en la eficacia de un protocolo de generacion de iPSC dependera del protocolo y de los agentes de la divulgacion que se usen. En algunos aspectos, la eficiencia se mejora en al menos un 10 %, 20 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 % o mas en comparacion con el mismo protocolo sin la inclusion de los agentes de la divulgacion (es decir, inhibidor del receptor de TGFBp/ALK5, inhibidor de la via de MEK/ERK e inhibidor de Rho GTPasa/ROCK). La eficiencia se mide con respecto a la mejora del numero de iPSC generadas en un marco de tiempo particular o la velocidad a la que se generan las iPSC.
Los estudios han mostrado que la transduccion retrovfrica de fibroblastos de raton con cuatro factores de
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transcripcion que estan altamente expresados en ESC (Oct-3/4, Sox2, KLF4 y c-Myc) generan celulas madre pluripotentes inducidas (iPS). Vease Takahashi, K. y Yamanaka, S. Cell 126, 663-676 (2006); Okita, K., Ichisaka, T. y Yamanaka, S. Nature 448, 313-317 (2007); Wernig, M. et al. Nature 448, 318-324 (2007); Maherali, N. et al. Cell Stem Cell 1, 55-70 (2007); Meissner, A., Wernig, M. y Jaenisch, R. Nature Biotechnol. 25, 1177-1181 (2007); Takahashi, K. et al. Cell 131, 861-872 (2007); Yu, J. et al. Science 318, 1917-1920 (2007); Nakagawa, M. et al. Nature Biotechnol. 26, 101-106 (2007); Wernig, M., Meissner, A., Cassady, J. P. y Jaenisch, R. Cell Stem Cell. 2, 1012 (2008). Las celulas iPS son similares a las ESC en morfologfa, proliferacion y pluripotencia, evaluadas por la formacion de teratomas y la contribucion de quimeras.
Como se ha indicado anteriormente, mientras que el protocolo original implico la introduccion de cuatro factores de transcripcion en celulas no pluripotentes, se ha descubierto mas recientemente que se pueden omitir algunos factores de transcripcion. Por lo tanto, en algunos aspectos, los protocolos implican la introduccion de uno, dos o tres de un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc y un polipeptido Sox a celulas no pluripotentes en condiciones que permiten que las celulas no pluripotentes se conviertan en iPSC. Por ejemplo, cada uno de Maherali y Konrad Hochedlinger, "TGFp Signal Inhibition Cooperates in the Induction of iPSC and Replaces Sox2 and cMyc" Current Biology (2009) y el documento WO/2009/117439 describen protocolos que no requieren los cuatro factores de transcripcion para inducir la pluripotencia. Ademas, los inventores han encontrado que las iPSC se pueden generar introduciendo Oct4 solo en las celulas e incubando las celulas con un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, un inhibidor de la via de MEK/ERK, un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK y un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC). Por ejemplo, la introduccion de Oct4 exogeno en celulas de mamffero, en presencia de una cantidad suficiente de SB431542, PD0325901, Tzv y acido valproico o butirato de sodio, genero con exito celulas iPSC.
Los inhibidores de HDAC ilustrativos pueden incluir anticuerpos que se unen a, variantes negativas dominantes de, y ARNip y acidos nucleicos antisentido que se dirigen a una o mas HDAC. Los inhibidores de HDAC incluyen, pero sin limitacion, TSA (tricostatina A) (vease, por ejemplo, Adcock, British Journal of pharmacology 150:829-831 (2007)), VPA (acido valproico) (vease, por ejemplo, Munster, et al., Journal of Clinical Oncology 25:18S (2007): 1065), butirato de sodio (NaBu) (vease, por ejemplo, Han, et al., Immunology Letters 108:143-150 (2007)), SAHA (acido suberoilanilida-hidroxamico o vorinostat) (vease, por ejemplo, Kelly, et al., Nature Clinical Practice Oncology 2:150157 (2005)), fenilbutirato de sodio (vease, por ejemplo, Gore, et al., Cancer Research 66:6361-6369 (2006)), depsipeptido (FR901228, FK228) (vease, por ejemplo, Zhu, et al., Current Medicinal Chemistry 3(3):187-199 (2003)), trapoxina (TPX) (vease, por ejemplo, Furumai, et al., PNAS 98(1):87-92 (2001)), peptido que contiene acido hidroxamico cfclico 1(CHAP1) (vease, Furumai supra), MS-275 (vease, por ejemplo, Carninci, et al., WO2008/126932)), LBH589 (vease, por ejemplo, Goh, et al., WO2008/108741) y PXD101 (vease, Goh, supra). En general, a nivel global, las celulas pluripotentes tienen mas acetilacion de la histona, y las celulas diferenciadas tienen menos acetilacion de la histona. La acetilacion de la histona tambien participa en la regulacion de la metilacion de la histona y del ADN. En algunos aspectos, los inhibidores de HDAC facilitan la activacion de los genes de la pluripotencia silenciados.
Para abordar los problemas de seguridad que surgen de los genomas de celulas diana que albergan secuencias exogenas integradas, se han desarrollado varios protocolos geneticos modificados. Estos protocolos producen celulas iPS con riesgos potencialmente reducidos, e incluyen adenovirus no integrantes para administrar genes de reprogramacion (Stadtfeld, M., et al. (2008) Science 322, 945-949), transfeccion transitoria de plasmidos de reprogramacion (Okita, K., et al. (2008) Science 322, 949-953), sistemas de transposicion piggyBac (Woltjen, K., et al. (2009). Nature 458, 766-770, Kaji, K., et al. (2009) Nature 458, 771-775), virus escindibles por Cre (Soldner, F., et al. (2009) Cell 136, 964-977) y el sistema de expresion episomica basado en oriP/EBNA1 (Yu, J., et al. (2009) Science DOI: 10.1126). ). Ademas, las estrategias de explotacion de la expresion de genes endogenos en ciertos tipos de celulas tambien permitio una reprogramacion mas facil y/o con menos genes exogenos necesarios (Shi, Y., et al. (2008b). Cell Stem Cell 2, 525-528; Aasen, T., et al. (2008) Nat Biotechnol 26, 1276-1284; Kim, J. B., et al. (2008). Nature 454, 646-650). Ademas, se han identificado moleculas pequenas que mejoran la eficiencia de la reprogramacion y reemplazan ciertos factores de reprogramacion (Shi, Y., et al. (2008) Cell Stem Cell 2, 525-528, Shi, Y., et al. (2008) Cell Stem Cell 3, 568-574, Li, W., et al. (2009) Cell Stem Cell 4, 16-19; Huangfu, D., et al. (2008) Nat Biotechnol 26, 1269-1275, Huangfu, D., et al. (2008) Nat Biotechnol 26, 795-797).
Ademas, recientemente, se ha demostrado que los factores de transcripcion se pueden suministrar como protefna exogena a celulas no pluripotentes, para generar iPSs. Vease, por ejemplo, el documento WO/2009/117439; Zhou et al., Cell Stem Cell 4:381-384 (2009). Se puede introducir un polipeptido exogeno (es decir, una protefna proporcionada desde fuera de la celula y/o que no sea producida por la celula) en la celula mediante una serie de diferentes metodos que no implican la introduccion de un polinucleotido que codifique el polipeptido. Por lo tanto, en algunos aspectos de la divulgacion, las celulas no pluripotentes se ponen en contacto con un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, en combinacion con un inhibidor de la via de MEK/ERK y un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK y una o mas protefnas exogenas de factor de transcripcion, por ejemplo, uno, dos, tres o los cuatro de entre un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc y un polipeptido Sox.
Se ha descrito una variedad de formas de introducir los factores proteicos relevantes en las celulas diana. En una realizacion, la introduccion de un polipeptido en una celula puede comprender la introduccion de un polinucleotido que comprende uno o mas casetes de expresion en una celula y la induccion de la expresion, introduciendo de ese
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modo los polipeptidos en la celula mediante la transcripcion y la traduccion desde el casete de expresion.
Como alternativa, se pueden cultivar simplemente una o mas protefnas en presencia de celulas diana en condiciones que permitan la introduccion de las protefnas en la celula. Vease, por ejemplo, Zhou H. et al., “Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins”. Cell Stem Cell. 8 de mayo de 2009;4(5):381-4. En algunos aspectos, las protefnas exogenas comprenden el polipeptido de factor de transcripcion de interes unido (por ejemplo, enlazado como una protefna de fusion o unido mediante enlace covalente o no covalente) a un polipeptido que mejore la capacidad del factor de transcripcion para entrar en la celula (y, en algunos aspectos, el nucleo celular).
Los ejemplos de secuencias de polipeptidos que mejoran el transporte a traves de las membranas incluyen, pero sin limitacion, la protefna de transcripcion de la homeoprotefna antenopapina de Drosophila (AntHD) (Joliot et al., New Biol. 3: 1121-34,1991; Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88: 1864-8,1991; Le Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90: 9120-4,1993), la protefna estructural VP22 del virus del herpes simple (Elliott y O'Hare, Cell 88: 223-33,1997); la protefna TAT del activador de la transcripcion del VIH-1 (Green y Loewenstein, Cell 55: 1179-1188, 1988; Frankel y Pabo, Cell 55: 1 289-1193, 1988); transportadores que mejoran la administracion, tal como se describe en la patente de EE.UU. n.° 6.730.293 (incluyendo, pero sin limitacion, una secuencia peptfdica que comprende al menos 7-25 argininas contiguas); y el peptido Penetratin™ 1 disponible en el mercado, y los vectores peptfdicos Diatos ("DPV") de la plataforma Vectocell® disponible en Daitos S.A. de Paris, Francia. Veanse tambien los documentos WO/2005/084158 y WO/2007/123667, y los transportadores adicionales descritos en los mismos. No solo estas protefnas pueden pasar a traves de la membrana plasmatica, sino que la union de otras protefnas, tales como los factores de transcripcion descritos en el presente documento, es suficiente para estimular la captacion celular de estos complejos.
En algunos aspectos, los polipeptidos de factor de transcripcion descritos en el presente documento se introducen exogenamente como parte de un liposoma o coctel de lfpidos tal como Fugene6 y Lipofectamina disponibles en el mercado). En otra alternativa, las protefnas de factor de transcripcion se pueden microinyectar o introducir directamente de otra manera en la celula diana.
Como se describe en los ejemplos del documento WO/2009/117439, la incubacion de celulas con los polipeptidos de factor de transcripcion durante perfodos prolongados es toxica para las celulas. Por lo tanto, la presente divulgacion proporciona la incubacion intermitente de celulas de mamffero no pluripotentes con uno o mas de un polipeptido Klf, un polipeptido Oct, un polipeptido Myc y/o un polipeptido Sox, con perfodos intermedios de incubacion de las celulas en ausencia de uno o mas polipeptidos. En algunos aspectos, el ciclo de incubacion con y sin los polipeptidos puede repetirse durante 2, 3, 4, 5, 6 o mas veces y se realiza durante suficientes perfodos de tiempo (es decir, las incubaciones con y sin protefnas) para conseguir el desarrollo de celulas pluripotentes. Se pueden incluir diversos agentes (por ejemplo, inhibidor de la via de MEK/ERK y/o inhibidor de GSK3 y/o inhibidor de TGFBbeta/ALK5 y/o inhibidor de la via de Rho GTPasa/ROC) para mejorar la eficiencia del metodo.
Los diversos inhibidores (por ejemplo, el inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, el inhibidor de la via de MEK/ERK y el inhibidor de Rho GTPasa/ROCK y/o el inhibidor de GSK3, etc.) pueden ponerse en contacto con celulas no pluripotentes bien antes, simultaneamente con o despues del suministro de los factores de transcripcion de la programacion (por ejemplo, suministrados a traves de un casete de expresion o como protefnas). Por comodidad, el dfa en que se suministran los factores de reprogramacion se designa "dfa 1". En algunos aspectos, los inhibidores se ponen en contacto con las celulas en un agregado (es decir, como un "coctel") en aproximadamente los dfas 3-7 y se continua durante 7-14 dfas. Como alternativa, en algunos aspectos, el coctel se pone en contacto con las celulas el dfa 0 (es decir, un dfa antes de los factores de preprogramacion) y se incuban durante aproximadamente 14-30 dfas.
En otros aspectos de la divulgacion, se anaden diferentes inhibidores en distintos momentos. En algunos aspectos, entre 1 y 7 dfas despues del suministro de los factores de reprogramacion, las celulas se ponen en contacto con la combinacion de compuestos de un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5 (por ejemplo, SB431542) y un inhibidor de ROCK durante 1-8 dfas, seguido de la puesta en contacto de las celulas con el inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, inhibidor de ROCK y una via de MEK/ERK (por ejemplo, PD0325901) durante 1-8 dfas. A esto, le puede seguir opcionalmente el contacto con el inhibidor del receptor de TGFp/ALK5 y el inhibidor de la via de MEK/ERK (pero no necesariamente el inhibidor de ROCK) durante 1-4 dfas, seguido del contacto con el inhibidor de la via de mEk/ERK (pero no el inhibidor del receptor de TGFp/ALK5 o inhibidor de ROCK) y, opcionalmente, finalmente con medio ES basal (Por ejemplo, humano basal) sin inhibidores durante 1-4 dfas. Tambien se pueden emplear otras combinaciones.
IV. Transformacion
La presente invencion emplea tecnicas rutinarias en el campo de la genetica recombinante. Los textos basicos que desvelan los metodos generales de uso en la presente invencion incluyen Sambrook et al., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual” (3a ed. 2001); Kriegler, “Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual” (1990); y “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel et al., eds., 1994)).
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En algunos aspectos, la especie de celula y protefna que se va a expresar es la misma. Por ejemplo, si se usa una celula de raton, se introduce un ortologo de raton en la celula. Si se usa una celula humana, se introduce un ortologo humano en la celula.
Se apreciara que cuando se han de expresar dos o mas protefnas en una celula, pueden usarse uno o multiples casetes de expresion. Por ejemplo, cuando un casete de expresion expresa multiples polipeptidos, se puede usar un casete de expresion policistronico.
A. Vectores plasmfdicos
En ciertos aspectos de la divulgacion, se contempla un vector plasmfdico para su uso en la transformacion de una celula hospedadora. En general, se usan vectores plasmfdicos que contienen secuencias de replicon y de control que se derivan de especies compatibles con la celula hospedadora en conexion con estos hospedadores. El vector puede portar un sitio de replicacion, asf como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar la seleccion fenotfpica en celulas transformadas.
B. Vectores vfricos
La capacidad de ciertos virus para infectar las celulas o entrar en las celulas a traves de la endocitosis mediada por receptores, e integrarse en el genoma de la celula hospedadora y expresar genes vfricos de forma estable y eficiente, los han convertido en candidatos atractivos para la transferencia de acidos nucleicos foraneos a celulas (por ejemplo, celulas de mamffero). A continuacion, se describen ejemplos no limitantes de vectores vfricos que pueden usarse para suministrar un acido nucleico de la presente divulgacion.
i. Vectores adenovfricos
Un metodo particular para la administracion del acido nucleico implica el uso de un vector de expresion de adenovirus. Aunque se sabe que los vectores adenovfricos tienen una baja capacidad de integracion en el ADN genomico, esta caracterfstica se contrarresta por la alta eficiencia de la transferencia genica proporcionada por estos vectores. Se entiende que "vector de expresion adenovfrico" incluye aquellas construcciones que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) soportar el empaquetamiento de la construccion; y (b) para expresar en ultima instancia una construccion especffica del tejido o de la celula que se ha clonado en el mismo. El conocimiento de la organizacion genetica o adenovirus, un virus de ADN lineal de doble helice de ~36 kb, permite la sustitucion de grandes fragmentos de ADN adenovfrico con secuencias foraneas de hasta 7 kb (Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2):535-546, 1992)).
ii. Vectores AAV
El acido nucleico puede introducirse en la celula usando la transfeccion asistida por adenovirus. Se han descrito mayores eficiencias de transfeccion en sistemas celulares usando sistemas acoplados a adenovirus (Kelleher y Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3): 141-64, 1994.). El virus adeno-asociado (AAV) es un atractivo sistema vectorial, ya que tiene una alta frecuencia de integracion y puede infectar celulas que no se dividen, haciendolo asf util para el suministro de genes en celulas de mamffero, por ejemplo, en cultivo de tejidos (Muzyczka, Curr Top Microbial Immunol, 158:97129, 1992) o in vivo. Los detalles relativos a la generacion y al uso de vectores rAAV se describen en las patentes de EE.UU. n.° 5.139.941 y 4.797.368.
iii. Vectores retrovfricos
Los retrovirus son prometedores como vectores de suministro de genes debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma del hospedador, transferir una gran cantidad de material genetico foraneo, infectar un amplio espectro de especies y tipos de celulas, y de ser empaquetados en estirpes celulares especiales (Miller et al., Am. J Clin. Oncol., 15(3):216-221, 1992).
Para construir un vector retrovfrico, se inserta un acido nucleico (por ejemplo, un gen de codificacion de interes) en el genoma vfrico en lugar de ciertas secuencias vfricas para producir un virus que sea defectuoso en la replicacion. Para producir viriones, se construye una estirpe celular de empaquetamiento que contenga los genes gag, pol y env, pero sin la LTR ni los componentes de empaquetamiento (Mann et al., Cell, 33: 153-159, 1983). Cuando un plasmido recombinante que contiene un ADNc, junto con la LTR retrovfrica y las secuencias de empaquetamiento se introduce en una estirpe celular especial (por ejemplo, por precipitacion con fosfato calcico, por ejemplo), la secuencia de empaquetamiento permite que el producto de la transcripcion del ARN del plasmido recombinante sea empaquetado en partfculas vfricas, que luego son secretadas en los medios de cultivo (Nicolas y Rubinstein, en: “Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses”, Rodriguez y Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pag. 494-513, 1988; Temin, en: “Gene Transfer”, Kucherlapati (ed.), Nueva York: Plenum Press, pag. 149-188, 1986; Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983). A continuacion, se recogen los medios que contienen los retrovirus recombinantes, opcionalmente, se concentran y se usan para la transferencia genica. Los vectores retrovfricos son capaces de
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infectar una amplia variedad de tipos de celulas. Sin embargo, la integracion y la expresion estable normalmente implican la division de las celulas hospedadoras (Paskind et al., “Virology”, 67:242-248, 1975).
Los lentivirus son retrovirus complejos que, ademas de los genes retrovfricos comunes gag, pol y env, contienen otros genes con funcion reguladora o estructural. Los vectores lentivfricos son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; las patentes de EE.UU. n.° 6.013.516 y 5.994.136). Algunos ejemplos de lentivirus incluyen los virus de la inmunodeficiencia humana: VIH-1, VIH-2 y el virus de la inmunodeficiencia simia: VIS. Los vectores lentivfricos se han generado por atenuacion multiple de los genes de virulencia del VIH, por ejemplo, los genes env, vif, vpr, vpu y nef se eliminan haciendo que el vector sea biologicamente seguro.
Los vectores lentivfricos recombinantes son capaces de infectar celulas que no se dividen y pueden usarse tanto para la transferencia de genes in vivo como ex vivo y la expresion de secuencias de acido nucleico. Por ejemplo, el lentivirus recombinante capaz de infectar una celula que no se divide en la que se transfiere una celula hospedadora adecuada se transfecta con dos o mas vectores que portan las funciones de empaquetamiento, en concreto, gag, pol y env, asf como rev y tat se describe en la patente de EE.UU. n.° 5.994.136. Es posible dirigirse al virus recombinante mediante el enlace de la protefna de la envoltura con un anticuerpo o un determinado ligando para dirigirse a un receptor de un determinado tipo de celula. Al insertar una secuencia (que incluye una region reguladora) de interes en el vector vfrico, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una celula diana especffica, por ejemplo, el vector se vuelve especffico de la diana.
iv. Administracion usando virus modificados
Un acido nucleico que se vaya a administrar puede alojarse dentro de un virus infeccioso que haya sido modificado por ingenierfa genetica para expresar un ligando de union especffico. La partfcula del virus se unira asf especfficamente a los receptores afines de la celula diana y administrara el contenido a la celula. Se desarrollo una nueva metodologfa disenada para permitir la direccion especffica de vectores retrovfricos basandose en la modificacion qufmica de un retrovirus mediante la adicion qufmica de restos de lactosa a la envoltura vfrica. Esta modificacion puede permitir la infeccion especffica de hepatocitos a traves de receptores de sialoglicoprotefnas.
Se diseno otra metodologfa para dirigir los retrovirus recombinantes, en la que se usaron anticuerpos biotinilados contra una protefna de la envoltura retrovfrica y contra un receptor celular especffico. Los anticuerpos se acoplaron a traves de los componentes de biotina usando estreptavidina (Roux et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. EE.UU., 86:90799083, 1989). Usando anticuerpos contra antfgenos de clase I y clase II de complejo de histocompatibilidad mayor, demostraron la infeccion de una variedad de celulas humanas portadoras de esos antfgenos de superficie con un virus ecotropico in vitro (Roux et al., 1989).
C. Administracion de vectores y transformacion celular
Se cree que metodos adecuados para la administracion de acido nucleico para la transformacion de una celula, un tejido o un organismo para su uso con la presente divulgacion incluyen practicamente cualquier metodo mediante el cual se pueda introducir un acido nucleico (por ejemplo, ADN) en una celula, un tejido o un organismo, como se describe en el presente documento o como serfa conocido por un experto en la materia. Dichos metodos incluyen, pero sin limitacion, la administracion directa de ADN, tal como mediante transfeccion ex vivo (Wilson et al. Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel y Baltimore, Nature 326:711-713, 1987), opcionalmente con Fugene6 (Roche) o Lipofectamina (Invitrogen), por inyeccion (patentes de EE.UU. n.° 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), incluyendo la microinyeccion (Harland y Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; patente de EE.UU. n.° 5.789.215); por electroporacion (patente de EE.UU. n.° 5.384.253; Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. EE.UU., 81:71617165, 1984); mediante precipitacion con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, “Virology”, 52:456-467, 1973; Chen y Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990); usando DEAE- dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985); mediante carga sonica directa (Fechheimer et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. EE.UU., 84:8463-8467, 1987); mediante transfeccion mediada por liposomas (Nicolau y Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. EE.UU., 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., J. Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991) y transfeccion mediada por receptor (Wu y Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu y Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987); y cualquier combinacion de dichos metodos.
VII. Mezclas
La presente divulgacion proporciona mezclas que mejoran la eficiencia de generacion de iPSC. Por ejemplo, la divulgacion proporciona mezclas de un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, un inhibidor de la via de MEK/ERK, un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK, en aspectos particulares, con celulas de mamffero. Por ejemplo, las mezclas se pueden incluir en medios de cultivo celular, con o sin celulas. El contenido de los medios de cultivo celular, en general, se conoce en la tecnica. Los ejemplos de medios de cultivo celular se describen en detalle en los ejemplos.
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En general, los cultivos de celulas que comprenden celulas de mamffero y agentes de la divulgacion (inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, un inhibidor de la via de MEK/ERK y un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK) contendran inicialmente todas o esencialmente todas las celulas no pluripotentes. Sin embargo, con el tiempo, especialmente en las condiciones de los protocolos descritos en el presente documento, una parte de las celulas se convertira en pluripotentes (es decir, iPSC).
Las celulas que se induciran a la pluripotencia pueden cultivarse de acuerdo con cualquier metodo conocido en la tecnica. Las pautas generales para las condiciones de cultivo para generar iPSC se pueden encontrar, por ejemplo, en Maherali, et al., Cell Stem Cell 3:595-605 (2008).
En algunos aspectos de la divulgacion, las celulas se cultivan en contacto con celulas alimentadoras. Las celulas alimentadoras ilustrativas incluyen, pero sin limitacion, celulas de fibroblastos, por ejemplo, celulas de fibroblastos embrionarios de raton (MEF). Los metodos de cultivo de celulas en celulas alimentadoras son conocidos en la tecnica.
En algunos aspectos de la divulgacion, las celulas se cultivan en ausencia de celulas alimentadoras. Las celulas, por ejemplo, se pueden unir directamente a una superficie solida de cultivo (por ejemplo, una placa de cultivo), por ejemplo, a traves de un cordon molecular. Los inventores han descubierto que cultivar celulas inducidas a la pluripotencia tiene una eficiencia mucho mayor de induccion a la pluripotencia (es decir, una mayor parte de celulas alcanza la pluripotencia) cuando las celulas se unen directamente a la superficie de cultivo solido en comparacion con la eficiencia de las celulas tratadas por lo demas de forma identica que se cultivan en celulas alimentadoras. Los ejemplos de cordones moleculares incluyen, pero sin limitacion, Matrigel®, una matriz extracelular (ECM), analogos de ECM, laminina, fibronectina o colageno. Sin embargo, los expertos en la materia reconoceran que esta es una lista no limitante y que se pueden usar otras moleculas para unir celulas a una superficie solida. Los metodos para la union inicial de los cordones a la superficie solida son conocidos en la tecnica.
Como se describe en el presente documento, en algunos aspectos, las mezclas de la divulgacion pueden incluir o excluir celulas de mamffero (incluyendo celulas pluripotentes o no pluripotentes) y uno o mas de un inhibidor de HDAC, inhibidor de GSK3 o un agonista del canal de Ca de tipo L; un activador de la via de AMPc; un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMT); un ligando del receptor nuclear, por ejemplo, como se describe en el documento PCT WO/2009/117439.
VIII. Kits
La presente divulgacion tambien proporciona kits, por ejemplo, para su uso en la generacion de celulas madre pluripotentes inducidas. Dichos kits pueden comprender cualquiera o todos los reactivos descritos en el presente documento, incluyendo, pero sin limitacion: un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, un inhibidor de la via de MEK/ERK y/o un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK, como se describe en el presente documento. Estos tres agentes, o subconjuntos de los mismos, pueden estar presentes en el kit en viales separados, o juntos en forma de una mezcla. Los kits tambien pueden incluir, uno o mas de un inhibidor de HDAC, un inhibidor de GSK3 o un agonista del canal de Ca de tipo L; un activador de la via de AMPc; un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMT); y un ligando del receptor nuclear.
En un aspecto, los kits incluiran uno o mas tipos de celulas de mamffero (por ejemplo, humano, raton, rata, etc.) y/o medios de cultivo celular.
En un aspecto particular, los kits incluiran uno o mas polinucleotidos que comprenderan casetes de expresion para la expresion de uno o mas polipeptidos Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc y un polipeptido Sox. Ademas, o como alternativa, los kits pueden comprender una o mas protefnas de factor de transcripcion aisladas, por ejemplo, uno, dos, tres o los cuatro de entre un polipeptido Oct, un polipeptido Klf, un polipeptido Myc y un polipeptido Sox. En otro aspecto particular, las protefnas de factor de transcripcion pueden fusionarse con una secuencia polipeptfdica para mejorar el transporte de las protefnas de factor de transcripcion a traves de las membranas celulares.
VI. Usos para celulas pluripotentes
La presente divulgacion permite el estudio y el desarrollo adicionales de tecnologfas de celulas madre, incluyendo, pero sin limitacion, usos profilacticos o terapeuticos. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgacion, las celulas de la divulgacion (bien celulas pluripotentes o celulas inducidas para diferenciarse a lo largo de un destino celular deseado) se introducen en individuos que lo necesitan, incluyendo, pero sin limitacion, individuos que necesitan la regeneracion de un organo, tejido o tipo de celula. En algunos aspectos, las celulas se obtienen originalmente en una biopsia de un individuo; se inducen a la pluripotencia como se describe en el presente documento, opcionalmente, inducidas a diferenciarse (por ejemplo, en una determinada celula progenitora deseada) y luego se trasplantan de nuevo al individuo. En algunos aspectos, las celulas se modifican geneticamente antes de su introduccion en el individuo.
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En algunos aspectos, las celulas pluripotentes generadas de acuerdo con los metodos de la divulgacion son inducidas subsiguientemente a formar, por ejemplo, celulas hematopoyeticas (madre/progenitoras), celulas neuronales (madre/progenitoras) (y, opcionalmente, celulas mas diferenciadas, tales como neuronas de un subtipo especffico, oligodendrocitos, etc.), celulas pancreaticas (por ejemplo, celulas progenitoras endocrinas o celulas que expresan hormonas pancreaticas), hepatocitos, celulas cardiovasculares (madre/progenitoras) (por ejemplo, cardiomiocitos, celulas endoteliales, celulas de musculo liso), celulas de retina, etc.
Se conoce una variedad de metodos para inducir la diferenciacion de celulas madre pluripotentes en tipos de celulas deseados. A continuacion, se presenta una lista no limitante de publicaciones de patentes recientes que describen metodos de induccion de la diferenciacion de celulas madre en diversos destinos celulares. Publicaciones de patente de EE.UU. n.° 2007/0281355; 2007/0269412; 2007/0264709; 2007/0259423; 2007/0254359; 2007/0196919; 2007/0172946; 2007/0141703; 2007/0134215.
Se puede mejorar una variedad de enfermedades mediante la introduccion y, opcionalmente, la direccion de celulas pluripotentes de la divulgacion en un determinado tejido lesionado. Los ejemplos de enfermedades producidas por una lesion tisular incluyen, pero sin limitacion, enfermedad neurodegenerativa, infarto cerebral, enfermedad vascular obstructiva, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, enfisema pulmonar, bronquitis, enfermedad pulmonar intersticial, asma, hepatitis B (dano hepatico), hepatitis C (dano hepatico), hepatitis alcoholica (dano hepatico), cirrosis hepatica (dano hepatico), insuficiencia hepatica (dano hepatico), pancreatitis, diabetes mellitus, enfermedad de Crohn, colitis inflamatoria, glomerulonefritis IgA, glomerulonefritis, insuficiencia renal, decubito, quemadura, herida de sutura, laceracion, herida por incision, herida por mordisco, dermatitis, queloide cicatricial, queloide, ulcera diabetica, ulcera arterial y ulcera venosa.
En un aspecto, las iPSC pueden usarse en diversos ensayos y explorarlas para identificar moleculas que modulen su funcion, incluyendo, pero sin limitacion, la potenciacion de la supervivencia y/o la diferenciacion de las iPSC.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la divulgacion reivindicada.
Ejemplo 1: Plataforma qufmica para mejorar la induccion de las iPSC humanas
Los fibroblastos de tipo mesenquimal reprogramados con los "cuatro factores" (OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC; 4 FT de aquf en adelante en el presente documento) experimentaron cambios morfologicos espectaculares que dieron lugar a iPSC con distinta polaridad celular, distintos lfmites y distintas interacciones celula-celula. Las celulas reprogramadas expresaron E-cadherina, un marcador para celulas epiteliales (Hay, E. D., Acta Anat. (Basel) 154, 820 (1995)), que tambien esta expresado a un alto nivel en las celulas madre embrionarias humanas (hESC). Los presentes inventores pensaron que los factores que potencian la transicion mesenquimal a epitelial (MET), tales como los antagonistas de la via de TGFBp, tendnan un impacto directo en el proceso de reprogramacion. Ademas, anteriormente se mostro que la inhibicion de la via de MEK-ERK desempenaba un papel importante en varias etapas de la reprogramacion (Chen, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 104, 10482-87 (2007); Shi, Y. et al., Cell Stem Cell 2, 525-8 (2008)). Ademas, los factores que potencian la supervivencia celular tambien podrfan ser beneficiosos para mejorar la eficiencia de la reprogramacion. Por consiguiente, se centraron centramos en las moleculas pequenas que pueden regular estos tres procesos y vfas, ya que las moleculas pequenas tienen muchas ventajas Feng, B. et al., Cell Stem Cell 4, 301-12 (2009); Shi, Y. et al., Cell Stem Cell 2, 525-8 (2008); Xu, Y. et al., Nature 453, 338-44 (2008)) en el estudio de los procesos biologicos, y son una opcion mas segura que la manipulacion genetica. En el presente documento, se describe una plataforma qufmica sencilla que potencia sustancialmente la generacion de iPSC humanas completamente reprogramadas a partir de fibroblastos a traves de un proceso mucho mas rapido y mas eficiente.
Se ensayaron inhibidores conocidos del receptor de TGFBp y MEK sobre 1 x 104 fibroblastos primarios humanos (CRL2097 o BJ) (Feng, B. et al., Cell Stem Cell 4, 301-12 (2009)), que se transdujeron retrovfricamente con los 4 FT, por su efecto sobre la cinetica y la eficiencia de LA reprogramacion (vease la Fig. 1a para mas detalles). El dfa 7 (D7) despues de la infeccion, se anadieron los compuestos, individualmente o en combinaciones, y se examinaron los cultivos para determinar las iPSC durante las siguientes 1 a 3 semanas.
El dfa 7 despues del tratamiento (D14), se observo el efecto mas potente en los cultivos tratados con una combinacion de inhibidor de ALK5 SB431542 (2 pM) e inhibidor de MEK PD0325901 (0,5 pM), que dio lugar a ~45 colonias grandes ALP+ (Fig. 1b) con morfologfa de tipo hESC caracterfstica, de las cuales mas de 24 colonias eran TRA-1-81 + (Fig. 1d), y de aproximadamente 6 a 10 colonias se tineron positivas para SSEA4 y NANOG, un factor de pluripotencia maduro que no se introduce ectopicamente (Fig. 1e y 1f). Ademas, los cultivos tratados mostraron una expresion de alto nivel del ARNm endogeno para los genes de pluripotencia (Fig. 1c). Por el contrario, no se observaron colonias NANOG+ en los cultivos de control sin tratar (Fig. 1e y Fig. 4a) o en los cultivos que se trataron solo con PD0325901 (Fig. 4a). Sin embargo, en los cultivos tratados solo con SB431542, todavfa se observaron 1-2 colonias de tipo hESC ALP+ (Fig. 4a). Es importante destacar que el efecto combinado de ambos inhibidores (Fig. 4b y 4c), asf como el efecto individual de SB431542 fue dependiente de la dosis.
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Cuando se mantuvieron los cultivos tratados con SB43142 mas PD0325901 durante 30 dfas sin division, se obtuvieron aproximadamente 135 colonias de iPSC por pocillo (Fig. 2d), una mejora de > 100 veces en la eficiencia con respecto al metodo convencional. De acuerdo con los informes anteriores (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007)), en los controles no tratados que portaban los 4 FT, se observaron 1-2 colonias iPSC ademas de varias colonias granuladas (Fig. 2c). Se ha sugerido que estas estructuras granuladas son colonias parcialmente reprogramadas (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007)). Tambien se observaron colonias de granulados en los cultivos tratados con SB431542, que superaban en numero por varias veces las pocas colonias de tipo hESC. Curiosamente, el numero de colonias de granulado se redujo drasticamente en el tratamiento combinado de SB431542 y PD0325901, lo que dio lugar a un aumento concomitante en el numero de colonias de tipo hESC. Esto sugiere que una inhibicion combinada de ALK5 y MEK puede guiar a las colonias parcialmente reprogramadas a un estado completamente reprogramado y, de este modo, mejorar el proceso de reprogramacion global. Por otra parte, el hecho de que se observara una mejor induccion de iPSC tan temprano como 7 dfas despues del tratamiento sugiere que el tratamiento con estas moleculas pequenas no solo mejoro la eficiencia del proceso de reprogramacion, sino que tambien pudo haber acelerado su cinetica (Fig. 1a). Se requieren experimentos adicionales para determinar si las celulas reprogramadas en esta etapa de hecho se vuelven totalmente independientes de los factores de reprogramacion exogenos antes que en los cultivos sin tratar.
Aunque las colonias de iPSC se recogieron y se expandieron, como en los cultivos de hESC, los cultivos divididos por tripsinizacion dieron lugar a una baja supervivencia. A partir de un rastreo reciente realizado en el laboratorio de los presentes inventores, se identifico una nueva molecula pequena, la tiazovivina (Fig. 5), que mejoro espectacularmente la supervivencia de las hESC tras la tripsinizacion. La adicion de tiazovivina al presente coctel de SB431542 y PD0325901 tambien mejoro enormemente la supervivencia de las iPSC despues de la division mediante tripsinizacion (Fig. 2a), y se obtuvo un gran numero de colonias reprogramadas. A partir de 10.000 celulas que se sembraron originalmente, una sola separacion de 1:4 en el dfa 14 dio lugar a ~1.000 colonias de tipo hESC el dfa 30 (Fig. 2e), mientras que dos series de division (el dfa 14 y el dfa 21 (1:10)) dio lugar a ~11.000 colonias de tipo hESC (Fig. 2c y 2e) el dfa 30. Estas colonias mostraron altos niveles de ARNm endogeno (Fig. 2f) y expresion de protefnas (Fig. 2b y 2c) de los marcadores de pluripotencia, mientras que la expresion de los cuatro transgenes diffcilmente se pudo detectar (Fig. 2f). Por el contrario, no se obtuvieron colonias de iPSC a partir de muestras no tratadas o tratadas con 2 compuestos que se sometieron a tripsinizacion (Tabla 1).
Tabla 1: Comparacion del numero de colonias de iPSC observado en los cultivos sin tratamiento, tratados con 2 _____________________ compuestos y tratados con 3 compuestos el dfa 30 ______________________
Sin compuesto 2 compuestos 3 compuestos
Sin division
1 135 205
1 division (el dfa 14)
0 0 900
2 divisiones (el dfa 14 y el dfa 21)
ND ND 11.000
Para examinar si el efecto positivo de la tiazovivina se debe unicamente a la supervivencia de las colonias despues de la division o si tambien aumenta el efecto de reprogramacion del tratamiento combinado con SB431542 y PD0325901, se ensayo el coctel de 3 compuestos en celulas transducidas con los 4 FT que no se sometieron a division. En estos cultivos, el dfa 14 se observaron ~25 colonias grandes que expresaban Nanog (Fig. 1e). Hacia el dfa 30, se observaron ~205 colonias NANOG+ muy grandes (Fig. 2d), que tambien eran TRA-1-81 + y SSEA4+ (datos no mostrados), lo que se tradujo en una mejora de mas de 200 veces en la eficacia frente a ningun tratamiento con compuesto y un aumento del doble frente al tratamiento con 2 compuestos.
Los tratamientos con dos compuestos tambien dieron lugar a un mayor numero de colonias positivas en fosfatasa alcalina en comparacion con los controles no tratados cuando los factores de reprogramacion se introdujeron usando un sistema lentivfrico en lugar de un sistema retrovfrico (Fig. 6a). Ademas, el coctel de 3 compuestos no parecio influir en la expresion del factor de reprogramacion desde los vectores retrovfricos (Fig. 6b-f).
Las colonias de iPSC generadas usando el coctel de 3 compuestos se expandieron rapida y establemente a largo plazo en las condiciones convencionales de cultivo de hESC (mas de 20 pasajes) y se asemejaron mucho a las hESC en terminos de morfologfa, expresion tfpica de marcadores de la pluripotencia y potenciales de diferenciacion. Presentaban un cariotipo normal (Fig. 7) y pudieron diferenciarse en derivados de las tres capas germinales, tanto in vitro (Fig. 3a y 3b) como in vivo (Fig. 3c). Estos resultados tambien sugirieron que no hay ningun efecto adverso a corto plazo asociado con el procedimiento de tripsinizacion mucho mas conveniente.
La demostracion de que la inhibicion de la via de TGFBp y MEK-ERK mejoro la reprogramacion de los fibroblastos sugirio papeles fundamentales para estas dos vfas de senalizacion y mecanismos MET en el proceso. De manera sistematica, la adicion de TGFp tuvo un efecto inhibidor sobre la reprogramacion mediada por los 4 factores de los fibroblastos (datos no mostrados). TGFp y los miembros de su familia desempenan importantes papeles contextuales en la autorrenovacion y la diferenciacion de las ESC (Watabe, T. Y Miyazono, K., Cell Res. 19, 103-15 (2009)). Ademas, el TGFp es una citocina prototipica para la induccion de la transicion mesenquimal epitelial (EMT) y el mantenimiento del estado mesenquimal (Willis, B. C. y Borok, Z., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L525-34 (2007)). Un punto final importante de esta senalizacion, en este contexto, es la regulacion negativa de la E-
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cadherina (Thiery, J. P. y Sleeman, J. P., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 7, 131-42 (2006)). Se ha demostrado que la E- cadherina es importante para el mantenimiento de la pluripotencia de las ESC y, recientemente, se ha sugerido que es un regulador de la expresion de NANOG (Chou, Y. F. et al., Cell 135, 449-61 (2008)). Por lo tanto, la inhibicion de la senalizacion de TGFp, que produce la desrepresion del destino epitelial, podna beneficiar al proceso de reprogramacion de multiples maneras. La senalizacion de ERK tambien potencia la EMT (Thiery, J. P. y Sleeman, J. P., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 131-42 (2006)), y esta cadena abajo de TGFp en el proceso (Chou, Y. F. et al., Cell 135, 449-61 (2008)). Anteriormente los presentes inventores habfan demostrado que el efecto de la reversina, una molecula pequena que puede reprogramar los mioblastos a un estado multipotencial, esta mediado en parte por la inhibicion de MEK-ERK (Chen, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 104, 10482-87 (2007)). Esto puede explicar el efecto observado en la reprogramacion cuando se combino con la inhibicion de TGFp.
La plataforma qufmica descrita en el presente documento es unica, ya que modula las vfas de senalizacion cadena arriba y podrfa mejorar radicalmente la reprogramacion en un tipo de celula general, como los fibroblastos. Las condiciones qufmicas descritas en el presente documento proporcionan una plataforma basica para metodos de reprogramacion mas eficientes y mas seguros, no basados en virus ni en ADN (Zhou, H. et al., Cell Stem Cell 4, 381-84, (2009)), que podrfan potenciar un suministro ilimitado de iPSC humanas seguras para diversas aplicaciones.
METODOS
Cultivo celular
Los fibroblastos primarios de piel CRL2097 y BJ (prepucio neonatal) se adquirieron de la ATCC. Todos los reactivos de los medios de cultivo celular se adquirieron en Invitrogen Corporation, CA. Las celulas se mantuvieron en DMEM (10313-021) que contenfa FBS al 10 % (10439-024), 1 x aminoacido no esencial MEM (11140-050), 1 x Glutamax (35050-061), Hepes 10 mM (15630-080) y 2-mercaptoetanol 0,1 mM (21985-023). Las celulas se pasaron 1:5 usando (1 x) tripsina-EDTA al 0,05 % (25300-054).
Plasmidos
Los vectores pMXs codificantes de los ADNc humanos para OCT4, SOX2, c-MYC y KLF4, descritos anteriormente (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007)), se obtuvieron en ADDGENE. Se clono ORF de Slc7a1 de raton en pWPXLD (Addgene), como se ha descrito anteriormente (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007)).
Infeccion retrovfrica y generacion de celulas iPS
Se produjeron lentivirus portadores de OCT4, NANOG, SOX2 y LIN28 como se ha descrito anteriormente (Yu, J. et al., Science 318, 1917-20 (2007)). Para la produccion de retrovirus, se sembraron celulas de empaquetamiento PLAT-E en placas a 1 x 106 celulas/pocillo de una placa de 6 pocillos. Despues de 24 horas, se transfectaron las celulas con vectores pMXs portadores de ADNc de OCT4, SOX2, c-MYC y KLF4 usando reactivo de transfeccion Fugene 6 (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas despues de la transfeccion, se reemplazo el medio por medio recien preparado, y se transfirio la placa a 32 °C para la produccion de retrovirus. Se recogieron los virus a las 48 horas y 72 horas, y se filtraron con filtro de 0,45 pm antes de la transduccion
Se sembraron las celulas de fibroblastos humanos con expresion de S1c7a1 en 1 x 105 celulas/pocillo de una placa de 6 pocillos el dfa 1. El dfa 2, se anadieron 0,25 ml de cada sobrenadante retrovfrico a las celulas en presencia de 6 pg/ml de polibreno. Se realizo una segunda serie de transduccion el dfa 3. Se estimo la eficiencia de la infeccion mediante microscopfa de fluorescencia en celulas transducidas en paralelo con retrovirus portadores de genes de GFP o RFP. Siete dfas despues de la transduccion inicial, se cosecharon los fibroblastos por tripsinizacion y se volvieron a colocar en placas a 1 x 104 celulas/pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta con matrigel (dilucion 1:50, cat. 354234, BD Biosciences). Para el tratamiento con compuesto, se cultivaron las celulas en medio de reprogramacion humano (DMEM/F12, sustituto de suero desactivado al 20 %, 1 x aminoacido no esencial MEM, 1 x glutamax, 2-Mercaptoetanol 0,11 mM, 20 ng/ml de bFGF y 1.000 U/ml de LIF) y se trataron con SB431542 2 pM (Stemgente), PD0325901 0,5 pM (Stemgente), Tiazovivina 0,5 pM o combinaciones de los compuestos. Los medios se cambiaron cada 2-3 dfas dependiendo de la densidad celular. Siete dfas despues del tratamiento con compuesto, se fijaron las placas y se tineron para determinar la actividad de fosfatasa alcalina (ALP), o se tineron para determinar los marcadores de protefna, o se prosiguio con los cultivos con o sin division indicada por tripsinizacion hasta el dfa 30. Para los cultivos divididos, se dividieron las celulas (1:4) y se volvieron a colocar sobre una capa alimentadora de CFF-1 MEF irradiada (2,5 x 105 celulas/pocillo) en cada pocillo de la placa de 6 pocillos y se dividieron de nuevo el dfa 21. Se mantuvieron las celulas en el mismo medio y el coctel de compuestos descrito anteriormente excepto para las concentraciones de PD0325901 (0,5 pM para D14 y 1 pM para D21) y SB431542 (0,5-1 pM tras el D14). Las colonias de iPSC se mantuvieron posteriormente en medios de hESC convencionales en ausencia de los compuestos anteriores.
Tincion con fosfatasa alcalina e inmunocitoqufmica
La tincion con fosfatasa alcalina se realizo usando el kit de deteccion de ALP (cat n.° SCR004, Chemicon) de
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acuerdo con las instrucciones del producto. Para la inmunocitoqufmica, se fijaron las celulas en paraformaldehfdo al 4 % (10 min, TA), se lavaron dos veces con PBS, se bloquearon usando suero normal de burro al 5 % (Chemicon) y 0TritonX-100 al 0,1 % (15 min, TA) y luego se trataron con anticuerpos primarios durante una noche a 4 °C. Los anticuerpos primarios usados fueron anti-NANOG (cat n.° AB9220, chemicon, 1:1,000); anti-OCT4 (cat n.° sc-5279, Santa Cruz biotech, 1:200), anti-SSEA 4 (cat n.° mab4304, Chemicon, 1:500), anti-Tra-1-81 (cat n.° 560123, BD Biosciences, 1:100), anti-Tra-1-81 (mAb 4381, Chemicon, 1:500), anti-pIII TUBULINA (cat n.° MMS-435P, Covance Research Products Inc, 1:1000), anti-PDX 1 (1:500) (un obsequio del Dr. C. Wright), anti-BRACHYURY (cat n.° AF2085, R&D, concentracion final de 0,2 pg/ml). Las celulas se lavaron dos veces con PBS y despues se trataron con anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios usados fueron IgG anti-conejo o anti-raton de burro Alexa fluor 488 (Invitrogen, 1:1,000) e IgG anti-conejo o anti-raton de burro Alexa fluor 555 (Invitrogen, 1:1,000). Los nucleos se tineron con 0,5 pg/ml DAPI (Sigma). Las imagenes se capturaron usando un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U/X-cite 120 EXFO con una camara fotografica CoolSnap HQ2.
Ensayo in vitro de diferenciacion y teratomas
Se realizaron la generacion de cuerpos embrioides y la diferenciacion in vitro como se describe en otra parte (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007)). Para el ensayo de los teratomas, se inyectaron de 3 a 5 millones de celulas bajo la capsula renal de ratones SCID. Treinta y un dfas mas tarde, se extirparon los tumores y se fijaron en paraformaldehfdo al 4 %, y se analizaron histologicamente en el centro de histologfa TSRI. El uso de ratones SCID fue aprobado por el comite de investigacion animal de UCSD.
RT-PCR
Se extrajo ARN total de las celulas usando el minikit RNeasy (Qiagen). Se sintetizaron ADNc de acuerdo con las instrucciones del producto usando el kit de sfntesis de primeras cadenas superscript III (Invitrogen). Se usaron dos microlitros del producto de reaccion durante 24-28 ciclos de PCR usando los respectivos cebadores. Las secuencias de los cebadores se describen en otra parte (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007)).
Citometrfa de flujo
Para el analisis de citometrfa de flujo, se sometieron los cultivos a tripsinizacion suave y se recogieron de placas de 6 pocillos. Las celulas se lavaron y se volvieron a suspender en tampon FACS (PBS, EDTA 2 mM, HEPES 2 mM, FBS al 1 %) y se analizaron en un citometro FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) con el programa CellQuest.
Ejemplo 2: Sfntesis de N-(ciclopropilmetil)-4-(4-(6-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidin-2-ilamino) bencenosulfonamida (Tiazovivina)
Se calento el matraz de reaccion que contenfa 2,4-dicloropirimidina (372 mg, 2,5 mmol), 6-metoxi-2,3,4- tetrahidroquinolina (489 mg, 3 mmol) y diisopropiletilamina (0,52 ml, 3 mmol) en n-butanol (10 ml) a 40 °C durante una noche. Se evaporo el disolvente y se purifico el residuo por cromatograffa en columna ultrarrapida, dando 2- cloro-4-(6-metoxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidina (551 mg, 80 %). Se disolvio este producto intermedio (250 mg , 0,91 mmol)a continuacion en diclorometano y se trato con BBr3 (1 M en diclorometano) (1 ml, 1 mmol) a - 78 °C. Se calento la mezcla de reaccion lentamente hasta la temperatura ambiente y se agito durante 1 h, se vertio en agua, se extrajo con diclorometano. Se secaron los extractos organicos combinados sobre Na2SO4 anhidro y se concentraron. Se purifico el residuo por cromatograffa en columna ultrarrapida, dando 2-cloro-4-(6-hidroxi-3,4- dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidina (154 mg , 65 %). A una solucion agitada de 2-cloro-4-(6-hidroxi-3,4-dihidroquinolin- 1(2H)-il)pirimidina (29 mg , 0,11 mmol) y 4-amino-W-(ciclopropilmetil)bencenosulfonamida (27 mg , 0,12 mmol) en DMF (0,5 ml), se anadio acido p-toluenosulfonico (2 M en dioxano) (55 pm, 0,11 mmol). Se agito la mezcla de reaccion a 90 °C durante una noche, despues se purifico por HPLC, dando el compuesto del tftulo (27 mg , 56 %).
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Ejemplo 3: Reprogramacion de celulas somaticas primarias humanas por OCT4 y compuestos qufmicos
En el presente documento, se presenta un nuevo coctel de moleculas pequenas que permite la reprogramacion de
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las celulas somaticas primarias humanas a iPSC con la expresion exogena de OCT4 solamente.
Entre los varios tipos de celulas somaticas humanas primarias disponibles, los queratinocitos que se pueden aislar facilmente de la piel humana o del folfculo piloso representan una atractiva fuente celular para la reprogramacion, ya que expresan endogenamente KLF4 y cMYC, y se informo que se reprogramaron mas eficientemente usando los cuatro FT convencionales o tres FT (sin MYC) (Aasen, T. et al., Nat Biotechnol 26:1276-1284 (2008), Maherali, N. et al., Cell Stem Cell 3, 340-345(2008)). Mas recientemente, los presentes inventores informaron que la inhibicion doble de TGFp y MAPK/ERK usando moleculas pequenas (es dedr, SB431542 y PD032590l, respectivamente) proporciona una condicion drasticamente mejorada para la reprogramacion de los fibroblastos humanos con cuatro FT exogenos (es decir, OSKM) (Lin, T. et al., NatMethods 6:805-808 (2009)). Ademas, demostraron que dicha inhibicion de la via doble tambien podrfa potenciar la reprogramacion de los queratinocitos humanos mediante dos FT exogenos (es decir, OK) con dos moleculas pequenas, Parnate (un inhibidor de la desmetilasa 1 especffica de LA lisina) y CHIR99021 (un inhibidor de GSK3) (Li, W. et al., Stem Cells 27:2992-3000 (2009)). Sin embargo, este proceso de reprogramacion de 2 FT fue muy ineficiente y complejo (por ejemplo, implicando dos FT exogenos y cuatro productos qufmicos), y la reprogramacion con incluso un FT menos parecfa desalentadora. Hacia la reprogramacion solo con OCT4, los presentes inventores desarrollaron una estrategia por etapas en el perfeccionamiento de la condicion de la reprogramacion y la identificacion de nuevas entidades qufmicas de reprogramacion. En primer lugar, intentaron optimizar mas el proceso de reprogramacion bajo los cuatro o tres FT (es decir, OSKM u OSK) en los queratinocitos epidermicos humanos neonatales (NHEK) mediante el ensayo de diversos inhibidores de las vfas de TGFp y MAPK a diferentes concentraciones usando metodos de caracterizacion de iPSC humanas previamente descritos (Lin, T. et al., Nat Methods 6:805-808 (2009)). Alentadoramente, los presentes inventores encontraron que la combinacion de PD0325901 0,5 pM y A-83-01 0,5 pM (un inhibidor mas potente y selectivo del receptor de TGFp) fue mas eficaz en la potenciacion de la reprogramacion de los queratinocitos humanos transducidos con OSKM u OSK (Figura 8a). Sorprendentemente, cuando redujeron aun mas las transducciones vfricas a solo dos factores/OK, todavfa pudieron generar iPSC a partir de NHEk cuando se trataron con PD0325901 0,5 pM y A-83-01 0,5 pM, aunque con baja eficiencia. Entonces, comenzaron a rastrear pequenas moleculas adicionales de una coleccion de compuestos bioactivos conocidos a diversas concentraciones como se ha informado anteriormente. Entre docenas de compuestos ensayados hasta la fecha, sorprendentemente, los presentes inventores encontraron que un activador de molecula pequena de PDK1 (quinasa-1 dependiente del 3'-fosfoinositido), PS48 (5 pM) que nunca se ha informado en la reprogramacion, puede mejorar significativamente la eficiencia de la reprogramacion aproximadamente quince veces. Curiosamente, tambien encontraron que el butirato de sodio 0,25 mM (NaB, un inhibidor de la histona desacetilasa) resulto ser mucho mas fiable y eficiente que el VPA 0,5 mM previamente publicado para la generacion de iPSC en condiciones de OK (Figura 8b). Estudios de seguimiento posteriores demostraron que la combinacion de PS48 5 pM y NaB 0,25 mM podrfa mejorar aun mas la eficiencia de la reprogramacion en mas de veinticinco veces (Figura 8b y Tabla 4). Con dicha eficiencia sin precedentes en la reprogramacion de NHEK bajo solo dos FT, los presentes inventores exploraron aun mas la posibilidad de generar iPSC solo con OCT4 perfeccionando las combinaciones de esas moleculas pequenas durante diferentes ventanas de tratamiento. Los NHEK primarios se transdujeron con OCT4 y se trataron con productos qufmicos (Figura 8c). Entre diversas condiciones, aparecieron colonias pequenas de iPSC semejantes a las hESC (de cuatro a seis colonias de 1.000.000 de celulas sembradas) en los NHEK infectados con OCT4 que se trataron con NaB 0,25 mM, PS48 de 5 pM y A-83-01 0,5 pM durante las cuatro primeras semanas, seguido por el tratamiento con NaB 0,25 mM, PS48 5 pM, A-83-01 0,5 pM y PD0325901 0,5 pM durante otras cuatro semanas (Figura 8c). Dichas colonias de iPSC positivas en TRA-1-81 (Figura 8d) crecieron mas bajo los medios de cultivo de hESC convencionales, y se pudieron pasar en serie para producir clones de iPSC estables que se caracterizaron adicionalmente (Figura 8e y 9). De manera mas significativa, tambien se pudieron generar iPSC solo con OCT4 a partir de queratinocitos adultos humanos mediante la adicion de Parnate 2 pM y CHIR99021 3 pM (que ha demostrado mejorar la reprogramacion de los NHEK en condiciones de OK) a este coctel qufmico. Despues de la reprogramacion fiable de los queratinocitos primarios a iPSC mediante OCT4 y moleculas pequenas, los presentes inventores aplicaron las condiciones a otros tipos de celulas primarias humanas, incluyendo HUVEC (celulas mesodermicas diferenciadas) y AFDC (celulas derivadas de lfquido amniotico). De forma similar, las colonias de iPSC positivas en TRA-1-81 aparecieron en las HUVEC infectadas con OCT4 y las AFDC que se trataron con productos qufmicos. Sorprendentemente, parecfa que la reprogramacion de las HUVEC y las AFDC fue mas eficiente y mas rapida que la reprogramacion de los NHEK en condiciones de OCT4 y de moleculas pequenas (Tabla 4). Se expandieron dos clones de iPSC de cada tipo de celula a largo plazo durante mas de 20 pasajes en condiciones convencionales de cultivo de hESC y se caracterizaron adicionalmente (Tabla 5).
Estas celulas hiPSC-OK y hiPSC-O expandidas establemente no se pueden distinguir morfologicamente de las hESC, y podrfan cultivarse sobre superficie recubierta de ECM en condiciones sin alimentacion y qufmicamente definidas (Figura 8e y Figura 13). Se tineron positivas para la fosfatasa alcalina (ALP) y se expresaron marcadores tfpicos de la pluripotencia, incluyendo OCT4, SoX2, NANOG, TRA-1-81 y SSeA4, detectados por inmunocitoqufmica/ICC (Figura 8e, 10b, Figuras 11-12). Ademas, el analisis por RT-PCR confirmo la expresion de los genes endogenos humanos OCT4, SOX2, NANOG, REX1, UTF1, TDGF2, FGF4 y el silenciamiento de OCT4 y KLF4 exogenos (Figura 9a y 10c). Ademas, el analisis de secuenciacion con bisulfito revelo que los promotores de OCT4 y NANOG de las celulas hiPSC-OK y hiPSC-O estan en gran parte desmetilados (Figura 9b y 10d). Este resultado proporciona mas pruebas para la reactivacion del programa de transcripcion de la pluripotencia en las celulas hiPSC-OK y hiPSC-O. El analisis de la expresion genica global de las celulas hiPSC-O, NHEK y hESC
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mostro que las celulas hiPSC-O son distintas de los NHEK (valor de correlacion de Person: 0,87) y mas similares a las hESC (valor de correlacion de Person: 0,98) (Figura 9c). El analisis de genotipificacion demostro que las celulas hiPSC-O solo contenfan el transgen OCT4 sin la contaminacion del transgen KLF4 o SOX2 (Figura 15). El analisis de transferencia de Southern demostro que habfa multiples sitios de integracion diferentes del transgen OCT4 (Figura 16) entre los diferentes clones. Ademas, el resultado del cariotipo demostro que hiPSC-O mantuvo un cariotipo normal durante todo el proceso de reprogramacion y expansion (Figura 17). Ademas, el analisis de identificacion genetica del ADN excluyo la posibilidad de que estas hiPSC surgieran de la contaminacion de hESC en el laboratorio (Tabla 6). Para examinar el potencial evolutivo de estas celulas HiPSC-O, se diferenciaron in vitro mediante el metodo convencional de diferenciacion del cuerpo embrionario (EB). Los analisis de ICC demostraron que pudieron diferenciarse eficazmente en celulas neuronales caracterfsticas pNI-tubulina+ (ectodermo), celulas mesodermicas SMA+ y celulas endodermicas AFP+ (Figura 9d y 10e). Los analisis de PCR cuantitativa confirmaron ademas la expresion de estos y otros genes marcadores especfficos del linaje, incluyendo celulas ectodermicas (6111- tubulina y NESTIN), celulas mesodermicas (MSX1 y MLC2a) y celulas endodermicas (FOXA2 y AFP) (Figura 9e). Siguiendo el protocolo de EB, estas celulas hiPSC-OK y hiPSC-O tambien pudieron dar lugar a cardiomiocitos de latido rftmico. Para ensayar su pluripotencia in vivo, se trasplantaron en ratones SCID. De cuatro a seis semanas mas tarde, estas celulas hiPSC-O generaron eficazmente teratomas tfpicos que contenfan derivados de las tres capas germinales (Figura 9f y 10f). En conjunto, estas caracterizaciones in vitro e in vivo demostraron que un solo factor de transcripcion, OCT4, combinado con un coctel definido de moleculas pequenas es suficiente para reprogramar varias celulas somaticas primarias humanas a iPSC que son morfologica, molecular y funcionalmente similares a las hESC pluripotentes.
Los estudios presentados anteriormente tienen una serie de implicaciones importantes: (1) aunque se demostro que las NSC fetales se reprogramaron a iPSC mediante la expresion ectopica de Oct4 solo, hay un gran escepticismo en torno a si el gen Oct4 exogeno solo serfa suficiente para reprogramar otras celulas somaticas humanas mas practicas que no expresen endogenamente Sox2 (uno de los dos genes maestros de la pluripotencia en la reprogramacion), que se encuentran en estadios de desarrollo posteriores (por ejemplo, embrionario/fetal temprano frente a nacido/adulto) y que pueden obtenerse sin danos significativos en el individuo. Segun lo que se sabe, el presente estudio es la primera demostracion de que las iPSC pueden derivarse en la practica de celulas somaticas humanas primarias facilmente disponibles (por ejemplo, queratinocitos) transducidas con un solo gen de reprogramacion exogeno, Oct4. En contraste con las celulas madre neuronales del cerebro, los queratinocitos son mas accesibles y pueden obtenerse facilmente de individuos nacidos con procedimientos menos invasivos. Esto refuerza aun mas la estrategia de explotar diversas celulas somaticas humanas accesibles en la practica para la generacion de iPSC con metodologfas mas seguras y/o mejores cualidades. Por lo tanto, este nuevo metodo y su desarrollo adicional facilitarfan significativamente la produccion de celulas madre pluripotentes especfficas de pacientes para diversas aplicaciones. (2) Aunque se han identificado moleculas pequenas y sus combinaciones para reemplazar solo uno o dos FT de reprogramacion, la generacion de iPSC se convierte en un desaffo exponencial cuando se omiten mas FT de reprogramacion exogenos juntos. La identificacion de este nuevo coctel de moleculas pequenas, que repone funcionalmente tres factores maestros de transcripcion todos juntos (es decir, Sox2, Klf4 y cMyc) para permitir la generacion de iPSC con Oct4 solo, representa otra etapa importante hacia la reprogramacion final con solo moleculas pequenas, y demostro y reforzo aun mas el enfoque qufmico hacia las iPSC. (3) Esta condicion de un solo gen demostrada tambien tiene una implicacion significativa para la tecnologfa de las celulas madre pluripotentes inducidas por protefnas (piPSC). Un desaffo practico para la tecnologfa de piPSC es la produccion a gran escala y fiable de las cuatro protefnas de reprogramacion transducible, cada una de las cuales se comporta de manera diferente en la fabricacion (por ejemplo, su expresion, plegamiento, estabilidad, etc.). Como es evidente, la combinacion de este coctel de moleculas pequenas con una sola protefna transducible simplificarfa significativamente la tecnologfa de piPSC y facilitarfa sus aplicaciones. (4) Mas significativamente, los presentes inventores identificaron una nueva molecula pequena, PS48, con una nueva diana/mecanismo en la potenciacion de la reprogramacion. PS48 es un activador alosterico de molecula pequena de PDK1, que es una importante quinasa cadena arriba para varias quinasas AGC, incluyendo Akt/PKB (Alessi et al., Curr Biol 7, 261-269 (1997)). Su efecto potenciador de la reprogramacion puede atribuirse en parte a la activacion de Akt/PKB, que potencia la proliferacion celular y la supervivencia ((Manning, B. D., Cantley, L. C., Cell 129, 1261-1274 (2007)). Otras caracterizaciones en profundidad sobre como los mecanismos implicados en PDK1 se regulan con precision durante el proceso de reprogramacion deben proporcionar conocimientos adicionales subyacentes a la reprogramacion y a la pluripotencia. Ademas, debido a que podrfa haber riesgos ocultos aun mayores (por ejemplo, se podrfan generar o seleccionar anomalfas geneticas y/o epigeneticas mas sutiles durante el proceso de reprogramacion) impuestos por la baja eficiencia y la cinetica lenta de la reprogramacion, la identificacion de nuevas moleculas pequenas para potenciar la reprogramacion como se ilustra de nuevo en este estudio siempre serfa muy valiosa para un procedimiento mas seguro, mas facil y mas eficiente para la generacion de iPSC humanas. Por ultimo, este nuevo y potente coctel de moleculas pequenas para la reprogramacion valido la estrategia de seleccion y de optimizacion qufmica por etapas que se presenta en el presente documento como una metodologfa productiva hacia las celulas madre pluripotentes finales puramente inducidas por productos qufmicos. Por otra parte, el hallazgo de que diferentes moleculas pequenas que modulan la misma diana/mecanismo podrfan tener efectos significativamente diferentes sobre la reprogramacion en un contexto diferente, ilustrado por las mejores actividades potenciadoras de la reprogramacion de A-83-01 y NaB en los queratinocitos humanos, sugiere la importancia de la optimizacion y el tratamiento “individualizados" con diferentes regfmenes para un contexto de reprogramacion especffico.
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Cultivo celular
Se mantuvieron queratinocitos epidermicos humanos normales (Lonza) en medio de cultivo de queratinocitos (KCM, Lonza). Se mantuvieron celulas endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC, Millipore) en medio completo de EndoGRO-VEGF (HCM, CHEMICON). Se cultivaron ESC y hiPSC humanas en celulas de alimentacion MEF en medios de cultivo de ESC humanas convencionales (hESCM: DMEM/F12, sustitucion de suero desactivado al 15 %, Glutamax al 1 %, aminoacidos no esenciales al 1 %, penicilina/estreptomicina al 1 %, p-mercaptoetanol 0,1 mM y 10 ng/ml de bFGF). Todos los productos de cultivo celular eran de Invitrogen/Gibco BRL a menos que se mencione otra cosa.
Produccion de lentivirus
Los sobrenadantes de lentivirus se produjeron y se cosecharon como se ha descrito previamente (Yu, J. et al., Science 318:1917-1920 (2007)). Los plasmidos usados para la produccion de lentivirus incluyen pSin-EF2-Puro- hOCT4, pSin2-EF2-PurohSOX2, pLove-mKlf4, pLove-mMyc, el plasmido empaquetado psPAX2 y el plasmido pMD2.G codificante de la envoltura (Yu, J. et al., Science 318:1917-1920 (2007) y Li, W. et al., Stem Cells 27:29923000 (2009)).
Reprogramacion de NHEK
Se cultivaron NHEK en una placa de cultivo tisular de 100 mm y se transdujeron 3 veces (3-4 horas cada transduccion) con sobrenadantes de lentivirus recien producidos. Se sembraron 1.000.000 NHEK transducidos en las celulas alimentadoras CF1 MEF inactivadas por rayos X irradiadas en una placa de 100 mm, y se cultivaron en KCM y se trataron con PS48 5 pM, NaB 0,25 mM (Stemgent) y A-83-01 0,5 pM (Stemgent) durante 2 semanas, seguido del cambio de la mitad del volumen de medio a hESCM y la suplementacion con PS48 5 pM, NaB 0,25 mM y A-83-01 0,5 pM durante otras 2 semanas. A continuacion, se cambiaron los medios de cultivo de celulas a hESCM y se suplementaron con PS48 5 pM, NaB 0,25 mM, A-83-01 0,5 pM y PD0325901 0,5 pM (Stemgent) durante cuatro semanas mas. Los mismos queratinocitos infectados con OCT4 cultivados en medio sin productos qufmicos se usaron como control. El cultivo se dividio mediante Accutase (Millipore) y se trato con tiazovivina 1 pM (Stemgent) el primer dfa despues de la division. Las colonias de iPSC tenidas positivamente con anticuerpo anti-TRA-1-81 humano de raton Alexa Fluor 555 (BD Pharmingen) se recogieron para la expansion en celulas alimentadoras en hESCM y se cultivaron rutinariamente.
Reprogramacion de celulas HUVEC
Se cultivaron HUVEC en una placa de cultivo tisular de 100 mm y se transdujeron 2 veces (4-6 horas cada transduccion) con sobrenadantes de lentivirus recien producidos. Se sembraron 200.000 HUVEC transducidas en una placa de 100 mm recubierta con gelatina, se cultivaron en HCM y se trataron con PS48 5 pM, NaB 0,25 mM y A- 83-01 0,5 pM durante 2 semanas, seguido del cambio de la mitad de volumen de medio a hESCM y la suplementacion PS48 5 pM, NaB 0,25 mM y A-83-01 0,5 pM durante otras 2 semanas. A continuacion, se cambiaron los medios de cultivo de celulas a hESCM y se suplementaron con PS48 5 pM, NaB 0,25 mM, A-83-01 0,5 pM y PD0325901 0,5 pM durante 1-2 semanas mas. Los mismos queratinocitos infectados con OCT4 cultivados en medio sin productos qufmicos se usaron como control. Las colonias de iPSC tenidas positivamente con anticuerpo anti- TRA-1-81 humano de raton Alexa Fluor 555 se recogieron para la expansion en celulas alimentadoras en hESCM y se cultivaron rutinariamente. El cultivo se dividio mediante Accutase y se trato con tiazovivina 1 pM el primer dfa despues de la division.
Diferenciacion in vitro
La diferenciacion in vitro de las hiPSC se llevo a cabo mediante el metodo del cuerpo embrionario (EB) convencional. En resumen, se disociaron las celulas hiPSC mediante Accutase (Millipore), se cultivaron en placa de 6 pocillos de union ultrabaja durante ocho dfas y despues se transfirieron a una placa de 6 pocillos recubierta con Matrigel en medio de diferenciacion. Las celulas se fijaron para el analisis inmunocitoqufmico o se recogieron para ensayos de RT-PCR ocho dfas despues. Medio de diferenciacion: DMEM/F12, FBS al 10 %, Glutamax al 1 %, aminoacidos no esenciales al 1 %, penicilina/estreptomicina al 1 %, p-mercaptoetanol 0,1 mM.
Ensayo de tincion con fosfatasa alcalina e inmunocitoqufmica
La tincion con fosfatasa alcalina se realizo de acuerdo con el protocolo del fabricante usando el kit de deteccion de fosfatasa alcalina (Stemgent). Se llevo a cabo un ensayo de inmunocitoqufmica convencional como se ha informado anteriormente (Li, W. et al., Stem Cells 27:2992-3000 (2009)). Los anticuerpos primarios usados se pueden encontrar en la Tabla 3. Los anticuerpos secundarios fueron IgG anti-raton o anti-conejo de mono Alexa Fluor 488 (1:1000) (Invitrogen). Los nucleos se visualizaron mediante tincion con DAPI (Sigma-Aldrich). Las imagenes fueron capturadas usando un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U.
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Analisis de expresion de genes mediante RT-PCR y qRT-PCR
Para los analisis de RT-PCR y de qRT-PCR, se extrajo el ARN total de iPSC humanas usando el minikit RNeasy Plus en combinacion con QIAshredder (Qiagen). La transcripcion inversa de la primera cadena se realizo con 2 pg de ARN usando el kit de sfntesis de ADNc iScript™ (BioRad). La expresion de los marcadores de pluripotencia se analizo mediante RT-PCR usando Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). La expresion de los marcadores especfficos del linaje despues de la diferenciacion se analizo mediante qRT-PCR usando iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Los cebadores se pueden encontrar en la Tabla 2.
Analisis de micromatrices
Se uso el BeadChip de expresion de Ref-8_v3 humanas (Illumina, CA, EE.UU.) para las hibridaciones de micromatrices para examinar la expresion genica global de celulas NHEK, hiPSC y hES. Se sintetizo ARNc marcado con biotina-16-UTP a partir de 500 ng de ARN total con el Kit de amplificacion de ARN TotalPrep de Illumina (Ambion AMIL1791, Foster City, CA, EE.UU.). La mezcla de hibridacion que contenfa 750 ng de ARNc amplificado marcado se preparo de acuerdo con el manual del sistema BeadStation 500x de Illumina (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.) usando los reactivos suministrados y la solucion de tincion de etreptavidin-Cy3 de GE Healthcare. La hibridacion al BeadChip de expresion de Ref-8_v3 humanas de Illumina se produjo durante 8 h a 55 °C en un BeadChip Hyb Wheel. Se exploro la matriz con el lector BeadArray de Illumina. Todas las muestras se prepararon en dos duplicados biologicos. El procesamiento y analisis de los datos de las micromatrices se realizaron con el software BeadStudio de Illumina. Se sustrajeron los datos del fondo y se normalizaron usando la opcion de rango invariante.
Secuenciacion genomica con bisulfato
Se aislaron ADN genomicos usando el kit de aislamiento de ADN Non Organic (Millipore) y luego se trataron con el kit de metilacion de ADN Methylation-Gold de EZ (Zymo Research Corp., Orange, CA). Los ADN tratados se usaron entonces como moldes para amplificar secuencias de interes. Los cebadores usados para la amplificacion de fragmentos promotores de OCT4 y NANOG se indican en la Tabla 2. Se clonaron los fragmentos resultantes usando el kit de clonacion TOPO TA para la secuenciacion (Invitrogen) y se secuenciaron.
Genotipificacion de hiPSC
La genotipificacion de las estirpes de hiPSC se realizo usando RT-PCR de ADN genomico con cebadores especfficos (Tabla 2; Yu, J. et al., Science 318:1917-1920 (2007) y Li, W. et al, Stem Cells 27:2992-3000 (2009)).
Formacion de teratomas
Se cosecharon las estirpes de hiPSC usando tripsina-EDTA al 0,05 %. Se inyectaron cinco millones de celulas bajo la capsula renal de ratones SCID (n = 3). Tras 4-6 semanas, se recogieron teratomas bien desarrollados, se fijaron y luego se analizaron histologicamente en el centro de histologfa del TSRI.
Tabla 2. Cebadores usados
Gen
Directos Inversos
Para RT-PCR
Endo-OCT4
AGTTT GTGC CAGGGTTTTT G ACTTCACCTTCCCTCCAACC
Endo-SOX2
CAAAAAT GGCCAT GCAGGTT AGTTGGGATCGAACAAAAGCT ATT
Endo- NANOG
TTT GGAAGCT GCT GGGGAAG GAT GGGAGGAGGGGAGAGGA
Endo-KLF4
ACGATCGTGGCCCCGGAAAAGGACC GATTGTAGT GCTTTCT GGCT GGGCTCC
Endo-cMYC
GCGTCCTGGGAAGGGAGATCCGGAGC TTGAGGGGCATCGTCGCGGGAGGCTG
REX1
CAGATCCT AAACAGCTC GCAGAAT GCGTACGCAAATTAAAGTCCAGA
UTF1
CCGTCGCT GAACACCGCCCT GCT G CGCGCTGCCCAGAATGAAGCCCAC
TDGF2
CT GCT GCCT GAAT GGGGGAACCT GC GCCACGAGGTGCTCATCCATCACAAGG
FGF4
CTACAACGCCTACGAGTCCTACA GTT GCACCAGAAAAGT CAGAGTT G
Exo-OCT4
TGTCTCCGTCACCACTCTGG ATGCATGCGGATCCTTCG
PAX6
TGTCCAACGGATGT GAGT TTTCCCAAGCAAAGATGGAC
pm TUBULINA
CAACAGCACGGCCATCCAGG CTTGGGGCCCTGGGCCTCCGA
FOXF1
AAAGGAGCCACGAAGCAAGC AGGCT GAAGCGAAGGAAGAGG
HAND1
TCCCTTTTCCGCTTGCTCTC CATCGCCTACCTGATGGACG
AFP
AGCAGCTT GGTGGT GGAT GA CCT GAGCTT GGCACAGAT CCT
GATA6
TGT GC GTT CAT GGAGAAGAT CA TTT GATAAGAGACCT CAT GAACCGACT
GAPDH
GT GGACCT GACCTGCCGT CT GGAGGAGT GGGT GTCGCT GT
Para la secuen
ciacion con bisulfato
OCT4-1
TTAGGAAAAT GGGT AGTAGGGATTT TACC CAAAAAACAAATAAATT AT AAAAC C T
OCT4-2
GGAT GTT ATTAAGAT GAAGATAGTTGG CCTAAACTCCCCTTCAAAATCTATT
NANOG
GAGTT AAAGAGTTTT GTTTTTAAAAATT A T TCC CAAATCTAATAATTTATCATATCTTTC
Para la genoti|
)ificacion
OCT4-Int
CAGT GCCCGAAACCCACAC AGAGGAACTGCTTCCTT CACGACA
SOX2-Int
TACCTCTTCCTCCCACTCCA AGAGGAACTGCTTCCTT CACGACA
KLF4-Int
CACCTT GCCTTACACAT GAAGAGG CGTAGAATCGAGACCGAGGAGA
Tabla 3. Anticuerpos primarios aplicados
Anticuerpo
Especie Dilucio n Vendedor
Anti-OCT4 (1)
Raton 1:500 Santa Cruz Biotechnology
Anti-OCT4 (2)
Conejo 1:500 Stemgent
Anti-SOX2
Conejo 1:1000 Chemicon
Anti-NANOG
Conejo 1:500 Abcam
Anti-SSEA4
Raton 1:500 Stemgent
Anti-TRA-1-81
Raton 1:500 Stemgent
TUT1 (Anti-pMI TUBULINA)
Raton 1:3.000 Covance Research Products
Anti-SMA
Raton 1:500 Sigma
Anti-AFP
Raton 1:500 Sigma
5
Tabla 4. Sumario de los experimentos de reprogramacion
Celulas donantes
Factores de induccion Compuestos qufmicos Experimentos Colonias positivas en TRA-1-81
n.° 1 17
DMSO n.° 2 20
OCT4+KLF4+SOX2+MYC n.° 3 23
n.° 1 72
A83+PD n.° 2 104
n.° 3 91
n.° 1 2
DMSO n.° 2 3
OCT4+KLF4+SOX2 n.° 3 8
n.° 1 26
A83+PD n.° 2 35
n.° 3 44
NHEK (numero de lote: 0000087940)
n.° 1 1
A83+PD n.° 2 2
n.° 3 0
n.° 1 15
Celulas donantes
Factores de induccion Compuestos qufmicos Experimentos Colonias positivas en TRA-1-81
A83+PS48+PD n.° 2 18
n.° 3 5
OCT4+KLF4 n.° 1 6
A83+VPA+PD n.° 2 0
n.° 3 3
n.° 1 20
A83+NaB+PD n.° 2 17
n.° 3 18
A83+PS48+NaB+PD n.° 1 21
n.° 2 30
n.° 3 27
n.° 1 4
OCT4 A83+PS48+NaB+PD n.° 2 0
n.° 3 3
NHEK (numero
n.° 1 2
OCT4
A83+PS48+NaB+PD n.° 2 3
de lote: 2F0661)
n.° 3 0
AHEK
OCT4 A83+PS48+NaB+PD n.° 1 3
+ Par+CHIR
n.° 2 2
n.° 1 4
HUVEC
OCT4 A83+PS48+NaB+PD n.° 2 7
n.° 3 4
HUVEC
OCT4 A83+PS48+NaB+PD n.° 1 23
+ Par+CHIR
n.° 2 17
AFDC
OCT4 A83+PS48+NaB+PD n.° 1 5
+Par+CHIR
n.° 2 11
NHEK, queratinocitos epidermicos humanos neonatales; HUVEC, celulas endoteliales de vena Umbilical humana; AHEK, queratinocitos epidermicos humanos adultos; AFDC, celulas derivadas de lfquido amniotico. Concentracion qmmica usada: PD, PD0325901 0,5 pM; A83, A-83-01 0,5 pM; PS48, PS48 5 pM; VPA, acido valproico 0,5 mM;
5 NaB, butirato de sodio 0,25 mM; Par, Parnate 2 pM; CHIR, CHIR99021 3 pM. Para la reprogramacion inducida por cuatro factores o por tres factores, se sembraron NHEK a una densidad de 100.000 celulas transducidas por placa de 10 cm y se contaron las colonias positivas cuatro semanas mas tarde; para la reprogramacion inducida por dos factores, se sembraron NHEK a una densidad de 100.000 celulas transducidas por placa de 10 cm y se contaron las colonias positivas seis semanas mas tarde; para la reprogramacion inducida por un factor, se sembraron NHEK y 10 AHEK a una densidad de 1.000.000 de celulas transducidas por placa de 10 cm y se contaron las colonias positivas ocho semanas mas tarde; se sembraron HUVEC y AFDC a una densidad de 200.000 celulas transducidas por placa de 10 cm y se contaron las colonias positivas seis semanas mas tarde.
Tabla 5. Caracterizacion de las estirpes celulares iPSC humanas establecidas
Clon de hiPSC
Factores de induccion Fuente celular Expresion del marcador Ensayo de RT-PCR Diferenciacion de EB Ensayo de teratomas
hiPSC-OK n.° 1
OCT4+KLF4 NHEK V V V V
hiPSC-OK n.° 3
V V V
hiPSC-O n.° 1
V V V V
Clon de hiPSC
Factores de induccion Fuente celular Expresion del marcador Ensayo de RT-PCR Diferenciacion de EB Ensayo de teratomas
hiPSC-O n.° 3
OCT4 NHEK V V V
hiPSC-O n.° 4
V
hiPSC-O n.° 5
V
3 estirpes mas
hiPSC-O n.° 21
OCT4 HUVEC V V V V
hiPSC-O n.° 22
V
hiPSC-O n.° 26
V V V
hiPSC-O n.° 31
V V V V
7 estirpes mas
hiPSC-O n.° 52
OCT4 AHEK V V
hiPSC-O n.° 57
V
hiPSC-O n.° 63
OCT4 AFDC V V
hiPSC-O n.° 65
V
Se expandieron a largo plazo las estirpes celulares caracterizadas durante mas de 20 pasajes en condiciones de cultivo de hESC convencionales y se caracterizaron ademas para la expresion de marcadores y la pluripotencia, mientras que otras estirpes celulares establecidas se almacenaron en el pasaje 5 o 6. Las entradas en blanco 5 indican sin determinar.
Tabla 6. Analisis de identificacion genetica del ADN en iPSC inducidas con Oct4 y estirpes celulares
parentales
Locus genomicos
NHEK (combinados) hiPSC-O n.° 1 HUVEC hiPSC-O n.° 21
Amelogenina
X, Y X, Y X X
vWA
11; 15; 17; 18; 19 15; 18 15; 16 15; 16
D8S1179
10; 13; 16 13, 10; 13 10; 13
TPOX
8; 9; 11; 12 8 8 8
FGA
19; 22; 23; 24 19; 22 24; 27 24; 27
D3S1358
13; 14; 15; 17 17 14; 16 14; 16
THO1
6; 7; 9; 9,3 7,9 6 6
D21S11
24,2; 29; 30,2; 35 24,2; 29 28; 30,2 28; 30,2
D18S51
13; 14; 16; 17; 18; 19 13; 17 13; 18 13; 18
Penta E
5; 8; 13; 14; 19 13; 19 12 12
D5S818
8; 11; 12; 13 11; 13 12; 13 12; 13
D13S317
8; 9; 11; 12; 13 9; 12 11; 14 11; 14
D7S820
8; 9; 10; 11 9; 10 11 11
D16S539
9; 10; 11; 12; 13 9; 13 9; 11 9; 11
CSF1PO
10; 11; 12 11; 12 11; 12 11; 12
Penta D
2,2; 10; 12 10 12; 13 12; 13
10 Se investigaron quince locus de ADN polimorficos de secuencias cortas repetidas en tandem (STR) y el marcador de
cromosoma sexual amelogenina.

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que comprende:
    (a) un inhibidor de quinasa de tipo receptor de activina 5 (ALK5);
    (b) un inhibidor de MaP/ERK quinasa (MEK); y
    (c) un inhibidor de Rho quinasa (ROCK), teniendo el inhibidor de ROCK la estructura:
    imagen1
    en la que
    L2 es alquileno C1-C10 sustituido o no sustituido; y es un numero entero de 0 a 3; z es un numero entero de 0 a 5;
    X es -N=, -CH= o -CR5=;
    R1 es hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido,
    R3, R4 y R5 son independientemente -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13,
    -C(O)NR14R15 -NR16S(o)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en los que n es un numero entero de 0 a 2, en los que si z es superior a 1, dos fracciones R3 se unen opcionalmente entre si para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; y
    R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son independientemente hidrogeno, alquilo
    sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo
    sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
    o uno de sus racematos, diastereomeros, tautomeros o isomeros geometricos, o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.
  2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, que comprende ademas un inhibidor de la glicogeno sintasa quinasa 3 (GSK3).
  3. 3. La composicion de la reivindicacion 1, que comprende ademas un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC).
  4. 4. La composicion de la reivindicacion 1, en la que el inhibidor de ALK5 es 3-(6-metil-2-piridinil)-W-fenil-4-(4-
    quinolinil)-1 H-pirazol-1 -carbotioamida (A-83-01) o 4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-5-(piridin-2-il)-1 H-imidazol-2-
    il)benzamida (SB431542).
  5. 5. La composicion de la reivindicacion 1, en la que el inhibidor de MEK es A/-(2,3-dihidroxi-propoxi)-3,4-difluoro-2-(2- fluoro-4-yodofenilamino)-benzamida (PD0325901).
  6. 6. La composicion de la reivindicacion 1, en la que, en el inhibidor de ROCK,
    L2 es metileno;
    X es N= o CH=;
    R1 es hidrogeno; y/o y y z son 0.
  7. 7. La composicion de la reivindicacion 1, en la que el inhibidor de ROCK tiene la estructura:
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    imagen2
    o
    imagen3
  8. 8. La composicion de la reivindicacion 1, que comprende ademas celulas de mamffero.
  9. 9. Un metodo in vitro o ex vivo de induccion de celulas de mamffero no pluripotentes a celulas madre pluripotentes inducidas, que comprende:
    introducir al menos un factor de transcripcion seleccionado del grupo que consiste en: Oct-3/4, Klf4, Sox2 y c- Myc en las celulas no pluripotentes; y
    poner en contacto las celulas no pluripotentes con la composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; en condiciones suficientes para inducir celulas madre pluripotentes.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que la introduccion de los factores de transcripcion en las celulas no pluripotentes comprende la introduccion de uno o mas polinucleotidos codificantes de los factores de transcripcion en las celulas no pluripotentes.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 9, en el que la introduccion de los factores de transcripcion en las celulas no pluripotentes comprende poner en contacto las celulas no pluripotentes con un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de cada uno de los polipeptidos de factor de transcripcion.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 9, que comprende ademas poner en contacto las celulas no pluripotentes con un inhibidor de GSK3.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 9, que comprende ademas poner en contacto las celulas no pluripotentes con un inhibidor de HDAC.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 9, en el que dos factores de transcripcion seleccionados del grupo que consiste en Oct-3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc se introducen en las celulas no pluripotentes.
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