MX2012004283A - Induccion de celulas pluripotentes. - Google Patents

Induccion de celulas pluripotentes.

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Abstract

La lenta cinética y baja eficiencia de métodos de reprogramación para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) humanas imponen mayores limitaciones en su utilidad en las aplicaciones biomédicas. En la presente describimos una aproximación química que mejora dramáticamente (>200 repliegues) la eficiencia de generación de iPSC a partir de fibroblastos humanos, dentro de siete días de tratamiento. Esto mejorará una base para el desarrollo de métodos no virales más eficientes y más seguros para reprogramar células somáticas humanas.

Description

INDUCCION DE CELULAS PLURIPOTENTES Referencias a solicitudes relacionadas Está solicitud reclama el beneficio bajo el 35 U.S.C. § 1.119(e) de la solicitud provisional de E.U.A. No. 61/252,548, presentada el 16 de Octubre de 2009, 1 cuyos contenidos se incorporan como referencia en su totalidad.
Antecedentes de la invención Los avances recientes en la generación de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007); Yue, J. et al., Science 318, Í917-20 (2007); uller, L.U.W., et al., Mol. Ther. 17, 947-53 (2009)) han creado esperanzas por su utilidad en la investigación biomédica y aplicaciones médicas. Sin embargo la generación iPSC es aún un proceso muy lenta (~4 semanas) e ineficiente (<0.01% (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007'); Yu, J. et al., Science 318, 1917-20(2007)) que resulta en una población heterogénea de células. Identificar iPSC completamente reprogramadas a partir de esa mezcla es j tedioso, y requiere experiencia especifica en los cultivos de i células pluripotentes humanas.
Aunque los peligros de la inserción genómica de los factores de reprogramación exógenos se están superando, la baja eficiencia y lenta cinética de la reprogramación continua presenta un problema formidable para las últimas I aplicaciones de iPSC humanas. Por ejemplo, un incremento en las anormalidades genéticas o epigenéticas podría ocurrir durante el proceso de reprogramación, en donde los supresores de tumor pueden ser inhibidos y las rutas oncogénicas pueden ser activadas. Aunque los recientes estudios han reportado una eficiencia mejorada de reprogramación por manipulaciones genéticas (Feng, B. et al., Cell Stem Cell 4, 301-12 ^2009) ) además de los cuatro factores originales, esas manipulaciones normalmente hacen el proceso inclusive más complejo e incrementan el riesgo de las alteraciones genéticas y de la tumorigenicidad. Por ello, aún existe una tremenda necesidad de un procedimiento más seguro, más fácil y más eficiente para la generación de iPSC humanas y facilita la identificación y caracterización de mecanismos fundamentales de reprogramación. i Breve sumario de la invención La presente invención proporciona mezclas (por ejemplo, útiles para inducir las iPSCs). En algunas modalidades, la mezcla comprende: células mamíferas, un receptor TGFß/inhibidor ALK5; un inhibidor MEK; y un inhibidor de ruta Rho GTPase/ROCK.
En algunas modalidades, al menos 99% de las células son células no pluripotentes. En algunas modalidades, todas o esencialmente todas las células son células no pluripotentes. i En algunas modalidades, las células son células humanas.
En algunas modalidades, el receptor GFß/inhibidor ALK5 I es SB431542.
En algunas modalidades, el inhibidor MEK es PD0325901.
En algunas modalidades, el inhibidor ROCK 'es un compuesto que tiene la fórmula: , anillo A es un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, 1 arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; anillo B es un heterocicloalquilo sustituido o no I sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; L1 es -C(0)-NR2- o -C(0)-NR2-; L2 es un enlace, alquileno sustituido o no sustituido o heteroalquileno sustituido o no sustituido; y ¦ 1 Ri y son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o sustituido .
En algunas modalidades inhibidor ROCK fórmula : (II) en donde, y es un entero de 0 a 3; z es un entero de 0 a 5; X es -N=, -CH= o -CR5=; R3, R4 y R5 son independientemente CN, S(0)nR6, NR7R8, C(0)R9, NR10-C (0) R11, NR12-C (0) -0R13, C(0)NR14R15, -NR16S (0) 2R17, -0R18, -S(0)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un I entero de 0 a 2, en donde si z es mayor a 1, dos porciones R3 son opcionalmente unidas para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido _o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido; y R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12 , R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido i o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
En algunas modalidades, el inhibidor ROCK tiene la fórmula: , En algunas modalidades, el inhibidor ROCK es En algunas modalidades, la concentración de los inhibidores es suficiente para mejorar por al menos 10% la eficiencia de inducción de células no pluripotentes en la mezcla en las células madre pluripotentes inducidas cuando la mezcla es sometida a condiciones suficientes para inducir la conversión de las células en células madre pluripotentes inducidas .
En algunas modalidades, la mezcla además comprende un inhibidor GSK3 y/o inhibidor HDAC. i En algunas modalidades, los polipéptidos se seleccionan de Oct-3/4, Sox2, KLF4 y c-Myc. En algunas modalidades, las i células se seleccionan de células humanas, células animales no humanas, células de ratón, células de primates no humanos, u otras células animales. 1 La presente invención también proporciona métodos para inducir células mamiferas no pluripotentes en células madre pluripotentes inducidas. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto las células no pluripotentes con: un receptor TGFß/inhibidor ALK5; un inhibidor MEK; y un inhibidor ROCK, bajo condiciones suficientes para inducir al menos algunas células para que se vuelvan células madre pluripotentes. 1 En algunas modalidades, las condiciones comprenden introducir al menos un factor de transcripción exógena en las células no pluripotentes. En algunas células, el al menos un factor de transcripción exógeno es un polipéptido Oct' y las células además se ponen en contacto con un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) .
En algunas modalidades, el factor de transcripción se selecciona del grupo que consiste de un polipéptido Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido Myc, y un polipéptido Sbx.
En algunas modalidades, el método comprende introducir al menos dos, tres o cuatro factores de transcripción exógena i en las células no pluripotenes , en donde los factores de transcripción se seleccionan del grupo que consiste de un polipéptido Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido Myc, y un i polipéptido Sox. En algunas modalidades, los polipéptidos se l seleccionan de Oct-3/4, Sox2, KLF4 y c-Myc. En algunas modalidades, las células se seleccionan de células humanas, células animales no humanas, células de ratón, célu'las de primates no humanos, u otras células animales. ¡ En algunas modalidades, el al menos un factor de transcripción se introduce al introducir un polinucleótido en las células no pluripotentes, en donde el polinucleótido codifica el al menos un factor de transcripción exógerto, asi expresando el factor de transcripción en las células.
En algunas modalidades, el al menos un factor de transcripción se introduce al poner en contacto un polipéptido exógeno a las células no pluripotentes, en donde el polipéptido comprende la secuencia aminoácida del ¡factor de transcripción, en donde la introducción se efectúa bajo condiciones para introducir el polipéptido en las células. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia aminoácida que mejora el transporte a través de las membranas celulares. , En algunas modalidades, las células son células humanas. i En algunas modalidades, el receptor TGF /inhibidor ALK5 es SB431542. : En algunas modalidades, el inhibidor MEK es PD0325901. i En algunas modalidades, el inhibidor ROCK compuesto que tiene la fórmula: anillo A es un cicloalquilo sustituido o no sustituido, i heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no t sustituido; anillo B es un heterocicloalquilo sustituido ¦ o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; L1 es -C(0)-NR2- o -C(0)-NR2-; L2 es un enlace, alquileno sustituido o no sustituido o ? heteroalquileno sustituido o no sustituido; y R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociloalquilo sustituido o no sustituido, arilo i sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido. ; En algunas modalidades el inhibidor ROCK tiene la fórmula: I en donde, y es un entero de 0 a 3; z es un entero de 0 a 5; X es -N=, -CH= o -CR5=; R3, R4 y R5 son independientemente CN, S(0)nR6, NR7R8, C(0)R9, NR10-C (O) R11, NR12-C (O) -OR13, C(0)NR14R15, -NR16S (0) 2R17, -OR18, -S(0)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocxcloálquilo i sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un entero de 0 a 2, en donde si z es mayor a 1, dos porciones R3 son opcionalmente unidas para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido; y R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido. : En algunas modalidades, el inhibidor ROCK tiene lgunas modalidades, el inhibidor ROCK al inhibidores es suficiente para mejorar por al menos 10% la eficiencia de inducción de las células no pluripotentes en la mezcla en las células madre pluripotentes inducidas, cuando la mezcla es sometida a condiciones suficientes para inducir la conversión de las células en células madre pluripotentes inducidas .
En algunas modalidades, la mezcla además comprende un inhibidor GSK3.
La presente invención también proporciona kits para inducir la pluripotencia en células mamiferas no pluripotentes. En algunas modalidades, el kit comprende1, un receptor TGFß/inhibidor AL 5; un inhibidor MEK; y un inhibidor ROCK.
En algunas modalidades, el receptor TGF /inhibidor ALK5 es SB431542.
En algunas modalidades, el inhibidor MEK es PD0325901. En algunas modalidades, el inhibidor ROCK es un compuesto que tiene la fórmula: (I) anillo A es un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; anillo B es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; L1 es -C(0)-NR2- o -C(0)-NR2-; L2 es un enlace, alquileno sustituido o no sustituido o heteroalquileno sustituido o no sustituido; y i R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido .
En algunas modalidades el inhibidor ROCK tiene la fórmula : en 0 a 5; X es -N=, -CH= o -CR5=; R3, R4 y R5 son independientemente CN, S(0)nR6, NR7R8, C(0)R9, NR10-C (0) R11, NR12-C (0) -0R13, -C(0)NR14R15, -NR16S (O) 2R17, -OR18, -S(0)2NR19, alquilo sustituido o no · sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloálquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un entero de 0 a 2, en donde si z es mayor a 1, dos porciones R3 son opcionalmente unidas para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloálquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido; y Rs, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloálquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido .
En algunas modalidades, el inhibidor ROCK tiene la fórmula : En algunas modalidades, el inhibidor ROCK es En algunas modalidades, el kit además comprende un inhibidor GSK3 y/o un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) .
Otras modalidades serán claras a partir del resto de esta descripción.
Definiciones Un "polipéptido Oct" se refiere a cualquiera |de los I miembros naturalmente ocurrentes de la familiar octámero de factores de transcripción, o variantes del mismo que mantienen la actividad del factor de transcripción, similar (dentro de al menos 50%, 80%, ó 90% de actividad) en comparación con el miembro de la familia naturalmente ocurrente que más se relaciona, o polipéptidos que comprenden al menos el dominio de unión de ADN del miembro de la familia naturalmente ocurrente, y además puede comprender un dominio de activación transcripcional . Ejemplos de olipéptidos Oct i i incluyen, Oct-1, Oct-2, Oct-3/4, Oct-6, Oct-7, Oct-8 , : Oct-9, y Oct-11, por ejemplo 0ct3/4 (referido en la presente como "Oct4") contiene el dominio POU, una secuencia de 150 aminoácidos conservada entre Pit-1, Oct-1, Oct-2, y ufic-86.
Vea Ryan, A.K. & Rosenfeld, M.G. Genes Dev. 11, 1207-1225 I (1997) . En algunas modalidades, las variantes tienen al menos 85%, 90%, ó 95% de identidad de secuencia aminoácida a través de su secuencia completa en comparación con un miembro de la familia de polipéptido Oct naturalmente ocurrente tal como los enlistados anteriormente o como se enlista en el número de acceso Genbank NP_002692.2 (Oct4 humano) o NP_0Í38661.1 (Oct4 ratón). Los polipéptidos Oct (por ejemplo, 0ct3/4) - puede ser de humano, ratón, rata, bovino, porcino, u otro animal. Generalmente, las mismas especias de proteínas serán usadas con las especies de células que son manipuladas; Un "polipéptido Klf" se refiere a cualquiera jde los miembros naturalmente ocurrentes de la familia de factores I I tipo Krüppel (Klfs) , proteínas de dedos de cinc que contienen secuencias aminoácidas similares a las del regulador Krüppel con patrón embrionico Drosofila, o variantes de los miembros naturalmente ocurrentes que mantienen la actividad de ¡ factor de transcripción similar (dentro de al menos 50%, 80%,> ó 90% de actividad) en comparación con el miembro de la familia naturalmente ocurrente más cercanamente relacionado, o polipéptidos que comprenden al menos un dominio de unión de ADN del miembro de la familia naturalmente ocurrente, y además puede comprender un dominio de activación transcripcional . Vea, Dang, D.T., Pevsner, J. & Yang, V.W., Cell Biol. 32, 1103-1121 (2000). Ejemplos de miembros de la familia Klf incluye, Klfl, Klf2, Klf3, Klf-4, Klf5, Klf6, Klf7, Klf8, Klf9, KlflO, Klfll, Klfl2, Klfl3, Klfl4, Klfl5, Klf16, y Klf17. Klf2 y Klf4 fueron encontrados como los factores capaces de generar células iPS en los y los genes · relacionados Klfl y Klfl5 también, aunque con eficiencia reducida. Vea, Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26:101 - 106 (2007). En algunas modalidades, las variantes tienen al menos 85%, 90%, ó 95% de identidad de j secuencia aminoácida a través de su secuencia completa en comparación con un miembro de la familia de polipéptido Klf naturalmente ocurrente tal como las enlistadas en el número de acceso Genbank CAX16088 (Klf4 de ratón) o CAX14962 (Klf4 humano) . Los polipéptidos Klf (por ejemplo, Klfl, Klf4, y Klf5) pueden ser de humano, ratón, rata, bovino, porcino, u otros animales. Generalmente, las mismas especies de proteina serán usadas con las especies de células que son manipuladas. Para la extensión un polipéptido Klf se describe i en la presente, puede ser reemplazado con un polipéptido (Essrb) i beta receptor relacionado con estrógenos. Por ello, se pretende que para cada modalidad de polipéptido Klf descrita en la presente, una modalidad correspondiente que usa Essrb en lugar de un polipéptido Klf4 es igualmente descrito.
Un "polipéptido Myc" se refiere a cualquiera de los miembros naturalmente ocurrentes de la familia Myc (vea, por ejemplo, Adhikary, S. & Eilers, . Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:635-645 (2005)), o variantes de la misma que mantienen la i actividad de factor de transcripción similar (dentro de al menos 50%, 80% ó 90% de actividad) en comparación con el miembro de la familia naturalmente ocurrente cercanamente ? relacionada, o polipéptidos que comprenden al menos un dominio de enlace ADN del miembro de la familia naturalmente ocurrente, y además puede comprender un dominio de activación transcripcional . Ejemplos de polipéptidos Myc incluyen, por ejemplo, c-Myc, N-Myc y L-Myc. En algunas modalidades, las variantes tienen al menos 85%, 90% ó 95% de identidad de secuencia aminoácida a través de su secuencia completa en comparación con el miembro de la familia polipéptida Myc naturalmente ocurrente, tal como la enlistada anteriormente o como la enlistada en el número de acceso Genbank CAA25015 (Myc humano) . Los polipéptidos Myc (por ejemplo, c-Myc) pueden ser de humano, ratón, rata, bovino, porcino ü otros animales. Generalmente, las mismas especies de proteínas I serán usadas con las especies de células que son manipuladas.
Un "polipéptido Sox" se refiere a cualquiera de los miembros naturalmente ocurrentes de los factores de transcripción SRY relacionados con HMB-box ; (Sox) , caracterizados por la presencia del dominio del grupo de alta movilidad (HMG) , o variantes del mismo que mantienen actividad de factor de transcripción similar (dentro de al menos 50%, 80%, ó 90% de actividad) en comparación con el miembro de la familia naturalmente ocurrente más cercanamente relacionado o polipéptidos que comprenden el dominio de enlace de ADN del miembro de la familia naturalmente ocurrente, y además puede comprender un dominio de activación transcripcional . Vea por ejemplo, Dang, D.T., et al., Int. J.
Biochem. Cell Biol. 32:1103-1121 (2000) . Ejemplos de polipéptidos Sox incluyen, por ejemplo, Sox 1, Sox-2,| Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, SoxlO, Soxll, Soxl2, Soxl3, Soxl4, Soxl5, Soxl7, Soxl8, Sox-21, y Sox30. Sqx 1 ha demostrado que produce células iPS con una eficiencia similar como Sox2, y los genes Sox3, Soxl5, y Soxl8 también han demostrado que generan células iPS, aunque con un tantó menos de eficiencia que Sox2. Vea, Nakagawa, et al., ¡Nature i i Biotechnology 26:101 - 106 (2007) . En algunas modalidades, j las variantes tienen al menos 85%, 90%, ó 95% de identidad de secuencia aminoácida a través de su secuencia compljeta en comparación con un miembro de la familia polipéptiba Sox naturalmente ocurrente tal como o como la enlistada en el número 35 (Sox2 humano) . El polipéptido Sox (por ejemplo, SoxlJ Sox2, i Sox3, Soxl5, o Soxl8) puede ser de humano, ratón, j rata, bovino, porcino, u otros animales. Generalmente, las ¡mismas especies de proteina serán usadas con las especies de células i que son manipuladas. j I "H3K9" se refiere a H3 lisina 9. Las modificaciones de H3K9 asociadas con la actividad de genes incluyen acetilación i H3K9 y modificaciones H3K9 asociadas con la heterocromatina, y incluyendo di-metilzación o tri-metilación H3K9. , por ejemplo, Kubicek, et al., Mol. Cell 473-481 (2007) .
El término "pluripotente" o "pluripotencia" se refiere a las células con la capacidad de dar origen a células de progenie que pueden sufrir diferenciación, bajo las I condiciones adecuadas, en los tipos de célulais que colectivamente demuestran características asociadas on los i linajes de células desde las tres capas germinales (endoderma, mesoderma, y ectoderma) . Las células ¦ madre I pluripotentes pueden contribuir a todos los tejidos embriónicos derivados de un animal prenatal, postnatal o adulto. Una prueba estándar aceptada del arte, tal como la capacidad para formar un teratoma en ratones SCID mayores de 8-12 semanas, se puede usar para establecer la pluripotencia de una población celular, no obstante la identificación de varias características de célula madre pluripotente también se pueden usar para detectar células pluripotentes. I ! I "Características de célula madre pluripotente" se refiere a características de una célula que distingue las células madre pluripotentes de otras células. La capacidad I I para dar origen a la progenia que puede j sufrir i diferenciación, bajo las condiciones adecuadas, en los tipos de células que colectivamente demuestran características asociadas con los linajes de células de las tre capas germinales (endoderma, mesoderma, y ectoderma) una característica de célula madre pluripotente . Expresión o no expresión de ciertas combinaciones de marcadores moleculares también son características de células madre pluripotentes. Por ejemplo, células madre pluripotentes humanas, al: menos algunas, y en algunas modalidades, todos los marcadores de la siguiente lista no limitante: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-cadherina, UTF-1, 0ct4, Rexl, y Nanog. Las morfologías celulares asociadas con células madre pluripotentes también son características de célula madre pluripotentes.
Como se usa en la presente, "células no pluripotentes" se refiere a células mamíferas que no son células pluripotentes. Ejemplos de esas células incluyen células diferenciadas así como células progenitoras . Ejemplos de células diferenciadas incluyen, pero no se limitan a, células de un tejido seleccionado de médula ósea, piel, músculo esquelético, tejido graso y sangre periférica. Ejemplos de tipos de células incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos, hepatocitos, mioblastos, neuronas, osteoblastos, osteoclastos, y células T.
En algunas modalidades, en donde un individuo que será tratado con las células pluripotentes resultantes, las células no pluripotentes pertenecientes a los individuos son usadas para generar células pluripotentes de acuerdo con los I métodos de la invención.
Las células puede ser de, por ejemplo, mamíferos humanos o no humanos. Ejemplos de mamíferos no humanos incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, gatos, perros, conejos, conejillos de india, hámsteres, ovejas, puercos, caballos, bovinos, y primates no humanos (por ejemplo, chimpancés, macacos, y simios) .
Un polinucléotido "recombinante" es un polinucleótido que no está en su estado nativo, por ejemplo, el polinucleótido comprende una secuencia nucleótida no i encontrada en la naturaleza, o el polinucleótido está en un contexto diferente el cual se encuentra naturalmente, por i ejemplo, separado de las secuencias nucleótidas con el cual normalmente está en la proximidad de la naturaleza, o adyacente (o contiguo con) secuencias nucleótidas con el que normalmente no está en la proximidad. Por ejemplo, la secuencia en el tejido puede ser clonada en un vector', o de lo contrario recombinada con uno o más ácidos nucléicos I adicionales .
"Expresión cásete" se refiere a un polinucléotido que comprende un promotor u otra secuencia regulatoria unida operativamente a una secuencia que codifica una proteíha.
Los términos "promotor" y "secuencia de control de expresión" usados en la presente se refieren a un arreglo de secuencias de control de ácido nucléico que dirigen la transcripción de un ácido nucléico. Como se usa en la presente, un promotor incluye secuencias de ácido nucléico necesarias cerca del sitio de inicio de transcripción, tal como, en el caso de un promotor tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor también puede incluir opcionalmente un mejorador distal o elementos represores, que pueden ser ubicados como varios miles de pares base desde el sitio inicial de transcripción. Los promotores incluyen promotores constitutivos e inducibles. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo bajo muchas condiciones ambientales y en desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está activo bajo regulación ambiental o en desarrollo. El término "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre la secuencia de control de expresión del ácido nucléico (tal como un promotor, o arreglo de sitios de unión de factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucléico, en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucléico correspondiente a la ¡segunda secuencia . i Una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucléico heterologo", usado eh la presente, es uno que se órigxna desde un recurso foráneo a la célula huésped particular, o, si es desde el mismo recurso, se modifica de su forma i original. Por ello, un cásete de expresión heterologo en una célula es un cásete de expresión que no es endógeno a la célula huésped particular, por ejemplo por estar unido a las secuencias nucleótidas desde un vector de expresión en lugar de un ADN cromosomal, que está unido a un promotor heterologo, que está unido a un gen reportador, etc.
Los términos "ácido nucleótido" y "polinucleótido" se usan en forma intercambiable en la presente para referirse a desoxiribonucleotidos o ribonucleotidos y polímeros jde los mismos en cualquiera de una forma simple o doble cadena. El i término abarca ácidos nucleótidos que contienen análogos nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de estructura modificada, que son sintéticos, naturalmente ocurrentes, y no naturalmente ocurrentes, que tienen propiedades de enlace similares como el ácido nucléico de referencia, y que son metabolizados en una forma similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de esos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de quiral-metilo, ribonucleotidos de 2-0-metilo, ácidos' péptido-nucléicos (PNAs) .
A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucléico particular también abarca variantes modificadas en forma conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones de codón degenerado) y secuencias í complementarias, asi como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las sustituciones de codón degenerado pueden lograrse al generar secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) es sustituida con base mezclada y/o residuos desoxinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 i(1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
"Inhibidores", "activadores", y "moduladores" de expresión o de actividad son usados para referirse a moléculas inhibitorias, de activación, o modulación, respectivamente, identificadas usando ensayos in vi tro e in vivo para expresión o actividad de una proteína objetivo descrita (o polinucleótido de codificación) , por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas, y sus homólogos y miméticos. El término "modulador" incluye inhibidores y activadores. Los inhibidores son agentes que, por ejemplo, inhiben la expresión o unión para, bloquear par¡cial o totalmente la estimulación o actividad del inhibidor proteasa, reducir, disminuir, prevenir, retrasar la i activación, inactivación, insensibilización, o disminución de la actividad de la proteina objetivo, descrita, por ejemplo, antagonistas. Los activadores son agentes que, por ejemplo, inducen o activan la expresión de una proteina objetivo descrita o unirse a, estimular, incrementar, abrir, activar, i facilitar, mejorar la activación o actividad del inhibidor proteasa, sensibilizar o aumentar la actividad de la proteina objetivo descrita (o polinucleótido de codificación¡) , por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen ligandos I sintéticos y naturalmente ocurrentes, antagonistas y agonistas {por ejemplo, moléculas químicas pequeñas, anticuerpos, y similares que funcionan como agonistas o antagonistas) . Esos ensayos para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, aplicar compuestos moduladores putativos a células que expresan la proteína objetivo, descrita y enseguida determinan los efectos funcionales en la actividad de proteína objetivo, descrita, como se describió anteriormente. Las muestras o ensayos comprenden proteínas objetivo, descritas, que son tratadas con un activador i potencial, inhibidor, o modulador que se comparan para controlar muestras sin el inhibidor, activador o mddulador para examinar la extensión de efecto. Las muestras de control (no tratadas con moduladores) son asignadas a un valor de actividad relativa de 100%. La inhibición de una proteina objetivo descrita se logra cuando el valor de actividad en relación al control es aproximadamente 80%, opcionalmente 50% ó 25, 10%, 5%, ó 1%. La activación de la proteína objetivo descrita se logra cuando el valor de actividad en relación al control es 110%, opcionalmente 150%, opcionalmente 200%, 300%, 400%, 500%, ó 1000-3000% ó mayor.
En donde los grupos sustituyentes químicos son especificados por sus fórmulas químicas convencionales, ? escritas de izquierda a derecha, igualmente comprenden los sustituyentes químicamente idénticos que resultarían de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, - CH2O- es equivalente a -OCH2-.
El término "alquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que de lo contrario se cite, un cadena recta (es decir, no ramificada) o ramificada, o combinaciones de las mismas, que pueden estar completamente saturadas, mono- o poli-insaturadas y pueden incluir radicales di- y multivalentes , que tienen el número de; átomos de carbonos designados (es decir, C1-C10 significa de uno a diez carbonos) . Ejemplos de radicales de hidrocarburos I saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (cxclohexil ) metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n- pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Urt grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más enlaces 1 dobles o enlaces triples. Ejemplos de grupos alquilo insaturados i incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2- (butadienilo) , 2 , 4-pentadienilo, 3- (1,4- pentadienilo) , etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo,j y los homólogos e isómeros mayores. i El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado, de un alquilo, como se ejemplifica, pero no se limita, por - CH2CH2CH2CH2 - . Normalmente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, con aquellos grupos que tienen 10 o menos átomos de carbono que se ejemplifican en la presente invención. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo de alquilo o alquileno de cadena más corta, que generalmente tiene ocho o menos átomos de carbono.
El término "heteroalquilo" , por sí mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que de lo contrario se cite, una cadena recta o ramificada estable, o radical de hidrocarburo cíclico, o combinaciones de los mismos, que consisten de al menos un átomo de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de O, N, P, Si y S, y en donde el átomo de nitrógeno y azufre pueden ser opcionalmente oxidizados y el heteroátomo de hidrógeno opcionalmente puede ser cuaternizado. Los heteroátomos 0, N, P y S y Si pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la cual el grupo alquilo está unido al resto de la molécula. i Ejemplos incluyen, pero no se limitan a -CH2-CH2-0-CH3^ -CH2- CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N (CH3) -CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2 -S (O) - CH3, -CH2-CH2-S (0) 2-CH3, -CH=CH-0-CH3, -Si(CH3)3 -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N (CH3) -CH3, 0-CH3, -0-CH2-CH3, y -CN. Más de dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tal como, por ejemplo, CH2-NH-OCH3 and -CH2-0-Si (CH3) 3. Igualmente, el término "heteroalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado del heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no se limita por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2- . Para los grupos heteroalquilenos, los heteroátomos también pueden ¡ ocupar cualquiera o ambos de la terminal de cadena (por egemplo, oxialquileno, dioxialquileno, aminoalquileno, diaminoalquileno, y similares) . Aún más, para los grupos de i enlace alquileno y heteroalquileno, ninguna orientación de los. grupos de enlace está implicada por la dirección en la cual se escribe la fórmula del grupo de enlace. Por ejemplo, la fórmula -C(0)2R'- representa tanto -C(0)2R'- como R'C(0)2-. Como se describió anteriormente, los grupos heteroalquilo, usados en la presente, incluyen aquellos grupos que son unidos al resto de la molécula a través de un heteroátomo, tal como -C(0)R', -C(0)NR', -NR'R", -0R', -SR', y/o -S02R' . En donde "heteroalquilo" se recita, seguido por las recitaciones de los grupos heteroalquilo específicos, tal como -NR'R1' o similares, será entendido que los términos heteroalquilo y -NR'R'' no son redundantes o mutuamente i exclusivos. En su lugar, los grupos heteroalquilo específicos son recitados para agregar claridad. Por ello, el itérmino "heteroalquilo" no debe interpretarse en la presente como grupos heteroalquilo específicos, tal como -NR'R" O similares .
Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo" , por si mismos o en combinación con otros términos, representan, a menos que de lo contrario se cite, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la cual el heterociclo es unido al resto de la molécula. Ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3- ciclohexenilo, cicloheptilo, y similares. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1- I (1, 2, 5, 6-tetrahidropiridilo) , 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien- í 2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo, y similares. Un "cicloalquileno" y "heterocicloalquileno" se refiere a un radical divalente derivado del cicloalquilo y ' heterocicloalquilo, respectivamente.
Los términos "halo" o "halógeno", por si mismos ' o como parte de otro sustituy'ente, significan, a menos que se cite lo contrario, un átomo de flúor, cloro, bromuro, o yoduro. Adicionalmente, los términos tales como "haloalquilo" se refieren a incluir monohaloalquilo y polihaloalquilo . Por ejemplo, el término "halo (C1-C4 ) alquilo" se refiere a incluir, pero no limitado a, trifluorometilo, 2 , 2 , 2-trifluoroetilo, 4- colorobutilo, 3-bromopropilo, y similares. ', El término "arilo" se refiere, a menos que se cite lo contrario, a un sustituyente de hidrocarburo, aromático, poli-insaturado que puede ser un anillo simple o múltiples anillos (preferiblemente de 1 a 3 anillos) que se fusionan o unen de forma covalente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen de uno a ¡cuatro heteroátomos seleccionados de N, 0, y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre son opcionalmente oxidizados, y los átomos de nitrógeno son cuaternizados . Un grupo heteroarilo puede ser unido al resto de la molécula a través de un carbono o heteroátomo. Ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftiío, 4- bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo!, 3- pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3- isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4- tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3- tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4- pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-benzimidazolílo, 5- indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5- quinoxalinilo, 3-quinolilo, y 6-quinolilo. Los sustitüyentes para cada uno de los sistemas de anillo arilo y heteroarilo notados anteriormente se seleccionan del grupo de sustitüyentes descritos a continuación. "Arileno" y I "heteroarileno" se refiere a radicales divalentes de un arilo I y heteroarilo, respectivamente.
Por brevedad, el término "arilo" cuando se 'usa en i i combinación con otros términos (por ejemplo, aiiloxi, ariltioxi, alrilaquilo) incluye tanto anillos ariló como heteroarilo como se definió anteriormente. Por ello, el término "arilalquilo" se refiere a incluir aquellos radicales en los cuales un grupo arilo está unido a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y similares) i incluyendo aquellos grupos alquilo en los cuales un átomo de carbono (por ejemplo, un grupo de metileno) há sido reemplazado con, por ejemplo, un átomo de oxigeno (por ejemplo, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, i 3-(l-naftiloxi ) propilo , y similares) .
El término "oxo" usado en la presente se refiere a un i oxigeno que es de doble enlace para un átomo de carbono.
El término "alquilsulfonilo" usado en la presente se refiere a una porción que tiene la fórmula S(02)-R', en donde R' es un grupo alquilo como se definió anteriormente. R' puede tener un número especifico de carbonos (por ejemplo, "C1-C4 alquilsulfonilo") .
Cada uno de los términos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo") se refiere a incluir tanto formas sustituidas como no sustituidas del radical indicado. Ejemplos de sustituyentes para cada tipo de radical se proporcionan a continuación .
Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo los grupos que a menudo son referidos como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, y heterocicloalquenilo) pueden ser de una o más de una variedad de grupos seleccionados de, pero no limitado a: -0R', =0, =NR ' , =N-0R' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SiR'-VR"' , -OC(0)R', -C(0)R', -C02R', -CONR'R", -OC (O) NR' R" , -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R'" , -NR"C(0)2R', ' -NR-C(NR,R"R"')=NR"", -NR-C (NR ' R" ) =NR "\ -S(0)R\ -S(0)2R', i S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02 en un número que está en el I intervalo de cero a (2m' + 1), en donde m' es el número total de átomos de carbono en ese radical. R' , R", R" ' y R" " cada uno es preferiblemente referido en forma independiente a I hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido (por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halógenos), alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R es independientemente seleccionado como lo son cada grupo R', R", R1" y R"" cuando más de uno de estosj grupos está presente. Cuando R' y R" son unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden ser combinados con el átomo de nitrógeno para formar un anillo con 4, 5, 6 ó 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" se refiere a incluir, pero no limitado a, 1- pirrolidinilo y 4-morfolinilo . De la discusión anterior de sustituyentes un experto en el arte entenderá que el término "alquilo" se refiere a incluir grupos que incluyen átomos de carbono enlazados a grupos diferentes a los grupos de hidrógeno, tal como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -ÍCH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C(0)CH2OCH3 y similares ) .
Igual que los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y j heteroarilo son variados y se selecciona de, por ejemplo: halógeno, -0R' , -NR'R", -SR\ -halógeno, -SiR 1 R"R" ' , -0C(0)R', -C(0)R', -C02R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR ' -C (O) NR"R" ' , -NR"C(0)2R', -NR-C (NR ' R"R 1 "') =NR" " , -NR-C( R,R·,)= R,,,, -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R', - 1 CN y -N02, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoro (Ci-C4 ) alcoxi , y fluoro (C1-C4 ) alquilo, en un número en el intervalo de pero al número total de valencias abiertas en el sistema de anillo 1 aromático; y en donde R1, R", R" ' y R"" son preferiblemente seleccionados de forma independiente del hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. Cuando un compuesto de la invención incluye más í de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R es independientemente seleccionado como lo es cada grupo R' , R", R ' " y R"" cuando más de uno dé estos grupos está presente.
Dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del ¡anillo I arilo o heteroarilo opcionalmente pueden formar un anillo de la fórmula -T-C (O) - (CRR' ) q-U-, en donde T y |U son independientemente -NR-, -0-, -CRR'- o un enlace simple, y q es un entero de 0 a 3. Alternativamente, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden ser opcionalmente reemplazados pon un sustituyente de la fórmula -A- (CH2) r_B-, en donde A y B son independientemente -CRR'-, -0-, -NR-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, - í S(0)2 R'- o un enlace simple, y r es un entero de 1 a 4. Uno de los enlaces simples del nuevo anillo formado puede ser opcionalmente reemplazado con un enlace doble. Alternativamente, dos de los sustituyentes en j átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden ser reemplazados opcionalmente con un sustituyente de la fórmula - (CRR1 ) S-X 1 - (C ' ' R1 1 ' ) d~ , en donde s y d son independientemente enteros de 0 a 3, y X es -0-, -NR' -, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, o -S(0)2NR'-. Los sustituyentes R, R', R" y R'" son preferiblemente seleccionados independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, y heteroarilo sustituido o no sustituido.
Como se usa en la presente, el término "heteroátomo" o "anillo heteroátomo" se refiere a incluir oxigenó (0) , nitrógeno (N) , azufre (S), fósforo (P), y silicio (Si) .
Un "grupo sustituyente", usado en la presente, se refiere a un grupo seleccionado de las siguientes porciones: ? (A) OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -N02, oxo, halógeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido, y ; i (B) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de: (i) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -N02, halógeno, alquilos no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, i heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido, y (ii) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, y heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de: (a) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -N02, halógeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo ¡ i no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido, y j (b) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halógeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, 1 cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, y heteroarilo no sustituido . "sustituyente de tamaño limitado" o "grupo ?I sustituyente de tamaño limitado", usado en la presente se refiere a un grupo seleccionado de todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en donde cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo i C1-C20 sustituido o no sustituido, cada heteroálquilo sustituido o no sustituido es un heteroálquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C4-C8 sustituido o no sustituido, y cada heterocicloalquilo sustituido o no 1 sustituido es un heterocicloalquilo de 4 a 8 miembros sustituido o no sustituido. j Un "sustituyente inferior" o "grupo sustituyente inferior" usado en la presente se refiere a un grupo seleccionado de todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en donde cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo Ci~C8 Í sustituido o no sustituido, cada heteroálquilo sustituido o no sustituido es un heteroálquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C5-C7 sustituido o no sustituido, y cada heterocicloalquilo sustituido ! o no i sustituido es un heterocicloalquilo con 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido.
El término "sales farmacéuticamente aceptables" se i refiere a incluir sales de los compuestos activos que son preparados con ácidos o bases relativamente no tóxicas, dependiendo de los sustituyentes particulares encontrados en los compuestos descritos en la presente. Cuando los compuestos de la presente invención incluyen funcionalidades relativamente ácidas, se pueden obtener sales de adición base al poner en contacto la forma neutral de esos compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, ya sea en un solvente nítido o inerte adecuado. Ejemplos de sales de adición base farmacéu icamente aceptables incluyen jsal de sodio, potasio, calcio, amonio, amino orgánico, o de magnesio, o una sal similar. Cuando los compuestos j de la. presente invención contienen funcionalidades relativamente básicas, se pueden obtener sales de adición ácida al ppner en I contacto la forma neutral de esos compuestos con una cantidad suficiente del ácido deseado, cualquiera de un solvente nítido o en un solvente inerte adecuado. Ejemplos de sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables incluyen' las derivadas de ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, bromhídrico, nítrico, carbónico, monohidrogencarbónico, fosfórico, monohidrogenfosfórico, dihidrogenfosfórico, sulfúrico, monohidrogensulfúrico, hidriódico, o fosforoso y similares, asi como las sales derivadas de los ácidos orgánicos relativamente no tóxicos como acético, propiónico, isobutirico, maléico, malónico, benzoico, succinico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, bencenosulfónico, p-tolilsulfónico, cítrico, tartárico, metanosulfónico, y similares. También se incluyen sales de aminoácidos tales como arginatos y similares, y sales de ácidos orgánicos tipo ácido glucurónico o galactunórico y similares {vea por ejemplo, Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19).
Ciertos compuestos específicos de la presente invención contienen tanto funcionalidades ácidas como básicas que permiten a los compuestos ser convertidos a cualquiera de una sal de adición base o ácida.
Por ello, los compuestos de la presente invención, pueden existir como sales con ácidos farmacéuticamente aceptables. La presente invención incluye esas sales. Ejemplos de esas sales incluyen hidrocloruros , hidrobromuros , sulfatos, metanosulfonatos, nitratos, maleatos, acetatos, citratos, fumaratos, tartratos (por ejemplo (+ ) -tartratos,, (-)-tartratos o mezclas de los mismos, incluyendo mezclas racémicas, succinatos, benzoatos y sales con aminoácidos tales como ácido glutámico. Estas sales pueden ser preparadas por los métodos conocidos por los expertos en el arte.
Las formas neutrales de los compuestos son preferiblemente regeneradas al poner en contacto la sal con una base o ácido y aislar el compuesto padre en la forma convencional. La forma padre del compuesto difiere de las varias formas de sal en ciertas propiedades físicas, tal como solubilidad en los solventes polares.
Además de las formas de sal, la presente invención proporciona compuestos, que están en forma de profármabo. Los profármacos de los compuestos descritos en la presente son i aquellos compuestos que fácilmente experimentan cambios i químicos bajo condiciones fisiológicas para proporcionar los compuestos de la presente invención. Adicionalmentje, los profármacos pueden convertirse a los compuestos de la presente invención por métodos químicos o bioquímicos en un ambiente ex vivo. Por ejemplo, los profármacos pueden ser convertidos lentamente a los compuestos de la presente i invención cuando se colocan en un depósito de parche transdérmico con una enzima o reactivo químico adecuadb.
Ciertos compuesto de la presente invención ^ pueden existir en formas no solvatadas así como formas solvatadas, i incluyendo formas hidratadas. En general, la formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y están comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Ciertos compuestos de la presente invención pueden existir en múltiples formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas físicas son equivalentes para los usos contemplados por la presente invención y se pretenden para estar dentro del alcance de la presente invención.
Ciertos compuestos de la presente invención poseen átomos de carbono asimétricos (centros ópticos) o enlaces dobles; los racematos, diastereómeros, tuatómeros, isómeros i geométricos e isómeros individuales están comprendidos dentro del alcance de la presente invención. Los compuestos, de la presente invención no incluyen aquellos que son conocidos en el arte por ser demasiado inestables para sintetizar y/o aislar.
Los compuestos de la presente invención también , pueden contener porciones no naturales de isótopos atómicos en uno o más de los átomos que constituyen esos compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden ser radioetiquetados con isótopos radioactivos, tal como por ejemplo tritio (3H) , yodo-125 (125I) o carbono 14 (1 C) . Todas las variaciones isotópicas de los compuestos- de la presente invpnción, radiactivos o no, están comprendidos dentro del alcance de la presente invención.
Breve descripción de las figuras Figura 1 (que comprende de la figura 1A a la figura 1F) El tratamiento de compuesto por siete dias es suficiente para í inducir células madre pluripotentes de fibroblastos humanos transducidos con cuatro factores de reprogramación, (a) Linea de tiempo para la inducción iPSC humana usando tratamiento combinado SB431542 y PD0325901 junto con 4TFs. El tratamiento inició con re-inoculación de células al día 7 después de la transducción 4TF y se mantuvo por 7 dias. (b) Tinción para las colonias ALP+ que emergieron en los cultivos no tratados (izquierdo) o cultivos tratados con 2 compuestos (derecho) en siete dias. (c) RT-PCR muestra la expresión mARN endógena elevada de los marcadores de pluripotencia OCT4 y NANOG en cultivos tratados con 2 compuestos, (d) Tinción TRA-1-81 en el día 14 sin (izquierda) o con (derecha) 2 compuestos de tratamiento, (e) Los números de colonias NAN0G+ en el .día 14 bajo condiciones de tratamiento diferentes son graficados. (f) Tinción normal para los marcadores hESC específicos (NANOG y SSEA4 ) mostrados por iPSCs en el D14. Barras de escala, 50 µp? en (d & f ) .
Figura 2 (que comprende de la figura 2A a la figüra 2F) El tratamiento de compuesto prolongado y el paso o pasaje de células incrementó de forma dramática el número de colonias reprogramadas . (a) Linea de tiempo de la inducción iPSC humana usando SB431542, PD0325901 y Thiazovivin. (b) Al día 30 las iPSCs expresaron marcadores pluripotentes NANOG, SSEA4 y TRA-1-81. Barras de escala, 50 m (c) tinción ALP en el dia 30 de cultivos con (paneles superiores) o sin (paneles inferiores) 3 compuestos de tratamiento. Las áreas encerradas en cuadro en los paneles izquierdos son aumentadas en los paneles derechos. Barras de escala, 200 µp? (d) Número de colonias NANOG+ en el dia 30 bajo diferentes condiciones de tratamiento, sin separación, (e) Número de colonias NANOG+ en el dia 30 a partir de cultivos tratados con 3 compuestos, tripsinados como se indica, (f) RT-PCT en las colonias iPSC obtenidas con tratamiento de 3 compuestos muestra la i expresión reactivada de los marcadores de pluripotencia endógenos. HDF: Fibroblasto Dérmico Humano.
Figura 3 (que comprende de la figura 3A a la figura 3C) Diferenciación in vitro e in vivo de iPSCs generadas con tratamiento de 3 compuestos, (a) Micrografia muestra cuerpos embrioides (EB) generados a partir de iPSCs y diferenciación I in vitro en células tipo ectodérmicas (Biii tubulin) , mesodérmics (BRACHYURY) y endodérmicas (PDX1) . Barras de í escala, EB: 100 µ??; otros 10 µp? (b) RT-PCT muestra la expresión de marcadores de linaje representativos' y la I ausencia de la expresión 0CT4 mARN en las células de diferenciación. U-no diferenciadas, D-diferenciadas^. (c) Teratomas generados en ratones sin pelaje de iPSCs (3 colonias independientes probadas) consisten de tejidos ¡de las tres capas de germen. Panel izquierdo: 1-músculo, 2-epitelio neural; panel medio: 1-piel, 2-epitelio de intestino; panel derecho: 1-hueso, 2-cartilago. Barras de escala, 20 m.¡ Figura 4 (que comprende de la figura 4A a la figura 4C) El tratamiento de compuesto con generación celular iPS¦ en una forma dependiente de dosis. j i Figura 5. Estructura química de Thiazovivin.
Figura 6 (que comprende de la figura 6A a la figura 6F) Expresión de transgenes y el silenciamientq son I independientes del tratamiento de compuestos.
Figura 7. Colonias celulares iPS expandidas de forma estable generadas a través del tratamiento de compuestos mostró un cariotipo normal. ? Figura 8 (que comprende de la figura 8A a la figura 8E) Generación de células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de queratinocitos primarios por genes simples, 0CT4, y moléculas pequeñas. (a) Tratamiento con 0.5 µ de PD0325901 (PD) y 0.5 µ A-83-01 (A-83) de generación significativamente mejorada de iPSCs a partir de queratinocitos humanos i primarios transducidos con cualquiera de 4TFs (4F, OKSM) o 3TFs (3F, OKS) . Los NHEKs fueron inoculados a una densidad de 100,000 células transducidas por 10 cm de placa, (b) Otras detecciones sistemáticas químicos identificados PS48, NaB, y su combinación que sustancialmente puede mejorar la reprogramación de queratinocitos humanos primarios transducidos con 2TFs (OK) . Los NHEKs fueron inoculados a una densidad de 100,000 células transducidas por 10 cm de ! placa, (c) Esquema experimental para la generación de iPSCs humanos a partir de queratinocitos humanos primarios transducidos por un gen de reprogramación simple, OCT4. KCM, medio de cultivo de queratinocito; hESCM, medio de cultivo ESC humano. (d) Inmunotinción viva con TRA-1-81 de colonias iPSC que fueron generadas a partir de queratinocitos humanos primarios transducidos con 2TFs/OK o 1TF/OCT4 antes de recolectar las colonias. (e) Las células iPSC-OK e iPSC-0 humanas establecidas expresan marcadores de pluripotencia normal, incluyendo ALP (fosfatasa alcalina), OCT4. SOX2, NANOG. SSEA-4 y TRA-1-81. Los núcleos fueron teñidos con DAPI.
Figura 9 (que comprende de la figura 9A a la figura 9F) en caracterizaciones profundas de células iPSC-OK e iPSC-0 humanas, (a) Análisis de expresión por RT-PCR de los genes de pluripotencia endógena y OCT4 y KLF4 exogenos. Se uso GAPDH como un control de entrada. (b) Análisis de metilación de promotores 0CT4 y NANOG por el secuenciamiento genómico de bisulfato. Circuios abiertos y circuios cerrados indican CpGs no metilados y metilados en las regiones del promotor, respectivamente. (c) Gráficas Scatter que comparan los patrones de expresión de gen global entre las células iPSC-0 y NHEKs, y hESCs . Las posiciones de los genes de pluripotencia 0CT4, NANOG, y S0X2 se muestran con flechas. Las lineas negras indican el equivalente lineal y cambios de dos pliegues en los niveles de expresión de genes entre las muestras, (d) iPSC-OK e iPSC-0 humano podrían diferenciarse efectivamente in vitro en células en las tres capas de gérmenes, incluyendo células ectodérmicas neuraleS| (ß??? tubulin) , células mesodérmicas (SMA) , y células endodérmicas (AFP) usando el método EB. (e) Prueba PCR cuantitativa de tres marcadores de capa de germen de iPSCs humanas diferenciadas usando el método EB: ectoderma {???6, Bill TUBULIN), mesoderma {FOXF1, HAND1) y endoderma (AFP, GATA6) . Los datos denotan cambios de pliegue GAPDH normalizado en relación a las iPSCs humanas padre, no diferenciadas. (f) iPSC-OK e iPSC-0 humana podrían producir en forma efectiva el teratoma completo, que contiene células diferenciadas en las tres capas de germen, en ratones SCID.
Figura 10 (que comprende de la figura 10A a la ¡figura 10F) Generación y caracterización de células ¡ madre f pluripotentes inducidas humanas de células endoteliales de vena umbilical humana de gen simple, OCT4, y moléculas pequeñas. (a) Esquema experimental para la generación de iPSCs humanos a partir de HUVECs transducidos por OCT4. Medio de cultivo HCM, HUVEC; medios de cultivos ESC humanos, ¡hESCM. (b) Las células hiPSC-0 establecidas a partir de | HUVECs expresan marcadores de pluripotencia típicos, incluyendo NANOG y SSEA-4. Los núcleos fueron teñidos con DAPjl . (c) Análisis de expresión por RT-PCR de los genes de pluripotencia endógena. GAPDH fue usado como un contjrol de entrada, (d) Análisis de metilación de los promotores OCT4 y NANOG por secuenciamiento genomico de bisulfato. Circuios abiertos y circuios cerrados indican CpGs no metilados y i metilados en las regiones promotoras, respectivamente. (e) Células hiPSC-0 a partir de los HUVECs podría diferenciar efectivamente in vitro en células en las tres capas de germen, incluyendo células. ectodermas neurales (ß??? tubulin) , células mesodermas (SMA) , y células endódermas (AFP) usando el método EB. (f) Células hiPSC-0 podrían producir efectivamente un teratoma completo, que contiene células diferenciadas' en las tres capas de germen ¡en los ratones SCID.
Figura 11 (que comprende de la figura 11A a la figura 11B) Caracterización de células iPSC-0 humanas a partir de ? AHEKs. (a) Las células hiPSC-0 establecidas a partir de queratinocitos adultos expresan marcadores de pluripotencia típicos, incluyendo NANOG, S0X2, y SSEA-4. Los núcleos fueron teñidos con DAPI. (b) Estas células hiPSC-0 podrían diferenciar de forma efectiva in vitro en células en las tres capas de germen, incluyendo células ectodermas neurales (ß??? tubulin) , células mesodermas (SMA) , y células endódermas (AFP) usando el método EB.
Figura 12 (que comprende de la figura 12A a la figura 12B) Caracterización de células iPSC-0 humanas a partir de AFDCs. (a) Las células hiPSC-0 establecidas a partir de células derivadas de fluido amniótico expresan marcadores de pluripotencia típicos, incluyendo NANOG, S0X2 y SSEA-4. Los núcleos fueron teñidos con DAPI. (b) Estas células hiPSC-0 podrían diferenciar efectivamente in vitro células en las tres capas de germen, incluyendo células ectodermas neurales (ß??? tubulin), células mesodermas (SMA), y células i endódermas (AFP), usando el método EB. ¡ I Figura 13. Líneas celulares hiPSC adicionales expresan marcadores de pluripotencia típicos. Las otras líneas celulares hiPSC-0 establecidas expresan marcadores de pluripotencia típicos, incluyendo NANOG y SSEA-4. Los núcleos fueron teñidos con DAPI . t Figura 14. Cultivo libre de alimentador de líneas celulares hiPSC. Las hiPSCs fueron separadas en placas cubiertas Matrigel/ECM en un medio hESC químicamente définido como se reportó anteriormente. Estas hiPSCs podrían i mantenerse y expandirse en un ambiente libre de alimentador. ICC mostró la expresión de marcadores de pluripotencia1, 0CT4 y SSEA . Los núcleos fueron teñidos con DAPI. , Figura 15 (que comprende de la figura 15A a la figura 15B) Genotipo de hiPSCs. Análisis RT-PCR usando ADN génómico muestra que sólo el transgen OCT4 integrado en el genoma de líneas hiPSC-0 (hiPSC-0#l, hiPSC-0#3, hiPSC-o#21, hiPSC-0#26 y hiPSC-0#31) . NHEKs (a) y HUVECs (b) usados como controles negativos, mientras que los vectores son usados como controles positivos.
Figura 16. Integración del transgen 0CT4 en hiPSCs. ADN genómico (10 g) fue digerido con EcoRI e hibridizado ' con la sonda OCT4 cADN (un fragmento EcoRI/Spel de pSin-EF2-OCT4-Pur) . Múltiples integraciones transgénicas fueron detectadas.
Figura 17 (que comprende de la figura 17A a la' figura 17B) Cariotipado para líneas celulares hiPSC. Metafase í I propagada de hiPSC-0#l (a) y hiPSC-0#21 (b) muestra cariotipo normal después del paso 15.
Descripción detallada de la invención I. Introducción La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que una combinación de un inhibidor ALK5, un inhibidor MEK, y un inhibidor ROCK mejora enormemente la eficiencia de inducción de pluripotencia en células mamiferas no pluripotentes transformadas con cuatro factores de transcripción. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para inducir pluripotencia en células mamiferas no pluripotentes en donde el método comprende poner en contacto las células no pluripotentes con al menos un receptor TGPF/inhibidor ALK5, preferiblemente en combinación con un inhibidor de ruta EK/ERK, y en particular modalidades, un 'inhibidor Rho GTPase/ROCK.
II. Receptor TGF /inhibidores ALK5 Quinasa tipo receptor activina 5 (ALK-5) es el receptor ???Gß principal que media las respuestas celulares para las TGF- s (Massague J. Annu Rev Biochem 67:753-791 (1998); ? Massague J, Chen YG. Genes Dev 14:627-644 (2000); Franzen P. et al., Cell 75:681-692 (1993)). En el enlace ligando, los fosforilatos quinasa ?ß??? consecutivamente activos ALK-5 los cuales, a la vez, activan las cascadas de transducción de señal cadena abajo. Las fosforilación Smad-2 y Smad-3 de ALK-5 activada es la ruta más prominente ( assague J, Chen YG. Genes Dev 14:627-644 (2000)). Una vez activado, los Smad2/3 asociados con Smad4 y translocalizan el núcleo, en dónde el complejo regula en forma transcripcional la expresión del gen objetivo.
Los inhibidores del receptor TGF (es decir, ALK5) pueden incluir anticuerpos para, variantes negativas dominantes de, y siARN, microARN, ácidos nucléicos antisentido, y otros polinucleótidos que suprimen la expresión de, receptores TGF (por ejemplo, ALK5). Ejemplos de receptor TGFp/inhibidores ALK5 incluyen, pero (no se limitan a, , SB431542 {vea, por ejemplo., Inman, et al.; Molecular Pharmacology 62(1): 65-74 (2002)), A-83-01, también conocido como 3- (6- etil-2-piridinil) -N-fenil-4- (4-quinolinil ) -lH-pirazol-l-carbotioamida (vea, por ejemplo, Tojo, et al., Cáncer Science 96 (11) : 791-800 (2005), y comercialmente disponible con, por ejemplo, Toicris Bioscience) ; 2- ( 3- ( 6-Metilpiridin-2-il ) -lH-pirazol-4-il ) -1,5-naftiridina, Wnt3a/BIO (vea, por ejemplo, Dalton, ét al., WO2008/094597, incorporado a la presente como referencia), B P4 (vea, Dalton, supra) , GW788388 (- { 4- [3- (piridin-2-il) - ? lH-pirazol-4-il]piridin-2-il}-N- ( tetrahidro-2H- piran-4- il) benzamida) (vea, por ejemplo, Gellibert, et al., Journal of Medicinal Chemistry 49 (7) : 2210-2221 (2006)), SM16| (vea, por ejemplo, Suzuki, et al., Cáncer Research 67 (5) : 2351-2359 (2007)), IN-1130 ( 3- ( ( 5- ( 6-methilpiridin-2-il ) -4- (quinóxalin- 6-il) -lH-imidazol-2-il)metil)benzamida) [vea, por ejemplo, Kim, et al., Xenobiotica 38 ( 3 ) : 325-339 (2008)), GW6604 (2- fenil-4- (3-piridin-2-il-lH-pirazol-4-il) piridina) (vea, por ejemplo, de Gouville, et al., Drug News Perspective 19'(2) :85- 90 (2006)), SB-505124 (2- (5-benzo [1, 3] dioxol-5-il-2-terc- butil-3H-imidazol-4-il ) -6-metilpiridina clorhidrato) j (vea, por ejemplo, DaCosta, et al., Molecular Pharmacology i 65 (3) : 744-752 (2004)) y derivados de pirimidina (vea por ejemplo, las enlistadas en Stiefl, et al., WO2008/006583, incorporado a la presente como referencia) . Además, a la vez que "un inhibidor ALK5" no se pretende para abarcar inhibidores de quinasa no específicos, un "inhibidor ALK5" debe entenderse que abarca inhibidores que inhiben al ALK4 y/o ALK7 además del ALK5, como, por ejemplo, SB-431542 (vea or ejemplo, Inman, et al., J. Mol. Phamacol. 62(1) : 65- i 74 (2002) .
En vista de los datos que se muestran en la presente, el efecto de inhibición ALK5, se cree que la inhibición de la I ruta TGF /activina tendrá efectos similares. Por j ello, cualquier inhibidor' (por ejemplo, cadena arriba o cadena abajo) de la ruta TGF /activina puede usarse en combinación i con, o en lugar de, inhibidores ALK5 como se describe en cada párrafo en la presente. Ejemplos de inhibidores de rutas ? TGFp/activina incluyen pero no se limitan a: inhibidores receptores TGFp, inhibidores de fosforilación SMAD 2/3, inhibidores de la interacción de SMAD 2/3 y SMAD 4, y activadores/agonistas de SMAD 6 y SMAD 7. Además, las ¦ i categorizaciones descritas a continuación son simplemente para propósitos organizacionales y un experto en el arte sabrá que los compuestos pueden afectar uno o más puntos dentro de una ruta, y por ello los compuestos ; pueden funcionar en más de una de las categorías definidas.
Los inhibidores del receptor TGF pueden incluir anticuerpos para, variantes negativas dominantes de y siARN o ácidos nucléicos antisentido que tienen como objetivo receptores TGF . Ejemplos específicos de inhibidores incluyen pero no se limitan a SU5416; 2- (5-benzo [1, 3] dioxol-5-il-2- terc-butil-3H-imidazol-4-il) -6-metilpiridina clorhidrato (SB-505124); lerdelimumb (CAT-152); metelimumab (CAT-192) ; GC-1008; ID11; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; KÍ26894; SB-203580; SD-093; Gleevec; 3, 5, 7,|2 ' , 4 · - pentahidroxiflavona (Morin) ; activina-M108A; P144; TBR2-Fc soluble; y células tumorales transfectadas antisentido que tienen como objetivo los receptores TGF . (Vea, por ejemplo, Wrzesinski, et al., Clinical Cáncer Research 13 ( 18 ): 5262-5270 (2007); Kaminska, et al., Acta Biochimica Polonica 52(2): 329-337 (2005); y Chang, et al., Frontiers in Bioscience 12:4393- 4401 (2007). Además, los inventores han encontrado que los inhibidores TGF BMO-4 y BMP-7 tienen efectos de reprogramación celular similares como el inhibidor ALK5 descrito en los ejemplos, así proporcionando más evidencia de que los inhibidores GF pueden ser usados para reprogramación (por ejemplo, en combinación con el inhibidor de ruta MEK/ERK y un inhibidor Rho GTPase/ROCK) . Ejemplos de I secuencias de proteínas BMP-4 y BMP-7 humanas se establecen en, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 7,405,192. ¡ I Los inhibidores de fosforilación SMAD 2/3 pueden incluir j anticuerpos para, variantes negativas dominantes de y ¡ácidos i nucléicos antisentido que tienen como objetivo a SMAD3. Ejemplos específicos de inhibidores incluyen SB203580; SB-431542; LY364947; A77-01; y 3,5,7 ¡2', 4'- pentahidroxiflavona (Morin) . (Vea, por ejemplo, Wrzesinski, supra; Kaminska, supra; Shimanuki, et al., Oncogene 26:3311- 3320 (2007); y Kataoka, et al., EP1992360, inco a la presente como referencia) .
Los inhibidores de la interacción de SMAD 2/3 y js AD 4 pueden incluir anticuerpos para, variantes negativas í dominantes de y ácidos nucléicos antisentido que tiene|n como I objetivo a SMAD2, SMAD3 y/o SMAD4. Ejemplos especifipos de inhibidores de la interacción de SMAD 2/3 y SMAD 4 incluyen pero no se limitan a Trx-SARA, Trx-xFox-Hlb y Trx-Lefl. (Vea oligonucleótidos . Vea por ejemplo, Miyazono, etj al., US6534476, y Steinbrecher , et al., US2005119203, | ambos ¦ incorporados a la presente como referencia. j I Los expertos en el arte apreciarán que la concentración del receptor TGF /inhibidor ALK5 dependerá de que inhibidor específico es usado. Generalmente, la concentración! de un receptor TGF /inhibidor ALK5 en un cultivo celular en el intervalo de IC20-IC100 (es decir, concentraciones jen las i cuales 20% de inhibición a 100% de inhibición en células es logrado) . Por ejemplo, SB432542 seria usado a 0.5-ÍO µ , óptimamente alrededor de 1-5 µ?. En ciertas modalidades, una I combinación de dos o más de receptor TGFp/inhibidor ALK5 diferentes puede ser usada. ¡ I III. Inhibidores de ruta MEK/ERK i ¦ I La ruta MEK/ERK se refiere a las quinasas MEK j y ERK serina/treonina que preparan parte de una ruta de transducción de señal. Generalmente, el Ras activado activa la actividad de quinasa proteina de la quinasa RAF. La quinasa RAF fosforila y activa el MEK, que a la vez fosforila I y activa una quinasa proteina de mitógeno activado (MAPK) .
MAPK fue originalmente llamado "quinasas extracelulares de señal regulada" (ERKs) y quinasa proteina asociada con í microctúbulos (MAPK) . Por ello, "ERK" y "MAPK" son usadas en i forma sinónima. ' Los inhibidores de ruta MEK/ERK se refieren a i inhibidores para cualquier de MEK o ERK que son parte, de la ruta Raf/MEK/ERK. Debido a que los inventores han encontrado que los inhibidores MEK son efectivos en mejorar la inducción i de iPSCs, y debido a que MEK controla directamente la I i actividad ERK, se cree que los inhibidores MEK descritos para la presente invención pueden ser reemplazados con un inhibidor ERK según se desee.
Inhibidores de MEK (es decir, MEK1 (también conocido como quinasa proteína activada por mitógeno quinasa 1) y/o MEK2 (también conocida como quinasa proteína activada por mitógeno quinasa 2)) pueden incluir anticuerpos para, variantes negativas dominantes de, y siARN y siARN, microARN, ácidos nucléicos antisentido y otros polinucleótidos que suprimen la expresión de, MEK. Ejemplos específicos de inhibidores MEK incluyen, pero no se limitan a, PD0325901, (vea, por ejemplo, Rinehart, et al., Journal of Clinical I Oncology 22: 4456-4462 (2004)), PD98059 (disponible, por ejemplo, con Cell Signaling Technology) , U0126 (disponible, I por ejemplo, con Cell Signaling Technology) , SL 327 (disponible, por ejemplo, con Sigma-Aldrich) , ARRY-162 (disponible, por ejemplo, con Array Biopharma) , PD184161 (vea, por ejemplo, Klein, et al., Neoplasia 8:1 - 8 (2006)), PD184352 (CI-1040) (vea, por ejemplo, Mattingly, et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316:456-465 (2006)), sunitinib (vea, por ejemplo, Voss, et al., US2008004287 incorporado a la presente como referencia), sorafenib (vea, Voss supra) , Vandetanib (vea, Voss supra) , pazopanib (vea, por ejemplo, Voss supra), Axitinib (véa , Voss supra) y PTK787 (vea, Voss supra) .
Actualmente, varios inhibidores MEK están sufriendo evaluaciones de ensayos clínicos. CI-1040 ha sido evaluado en la fase I y II de los ensayos clínicos para el cáncer (vea, por ejemplo, Rinehart, et al., Journal of Clinical Oncology 22 (22) : 4456-4462 (2004)). · Otros inhibidores MEK que son evaluados en los ensayos clínicos incluyen PD184352 (vea, por ejemplo, English, et al., Trends in Pharmaceutical Sciences 23(l):40-45 (2002)), BAY 43-9006 (vea, por ejemplo, Ch'ow, et i al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) '46:72— 78 (2001)), PD-325901 (también PD0325901), GSK1120212 , ARRY- 438162, RDEA119, AZD6244 (también ARRY-142886 o ARRY-886) , R05126766, XL518 y AZD8330 (también ARRY-704). (Vea, por ejemplo, información de los Institutos Nacionales de Salud ubicados en la WWW en clinicaltrials.gov así como información del Instituto Nacional de Cáncer en la WWW en cancer.gov/clinicaltrials) .
Ejemplos de ERK (es decir, ERK1 (también conocidos como MAPK3) y/o ERK2 (también conocido como MAPK1) ) inhibidores incluyen PD98059 (vea, por ejemplo, Zhu, et al., Oñcogene 23:4984-4992 (2004)), U0126 (vea, Zhu, supra), FR180204 (vea, por ejemplo, Ohori, Drug News Perspective 21 (5) : 245-250 (2008)), sunitinib (vea, por ejemplo, US2008004287 incorporado en la presente como referencia) , sorajfenib, Vandetanib, pazopanib, Axitinib y PTK787. j Los expertos en el arte apreciarán que la concentración del inhibidor de ruta EK/ERK dependerá que de inhjibidor especifico se usa. En modalidades particulares,! una r combinación de dos o más inhibidores de ruta diferentes se puede usar. i IV. Inhibidores Rho GTPa.se/ROCK ! La presente invención proporciona usos y composiciones que ruta es ruta/eje) . Por ello, uno puede usar cualquiera o todosj de un inhibidor Rho GTPase, un inhibidor ROCK, o un inhibidor i Myosin II para lograr los efectos descritos en la pre'sente. i Los expertos en el arte apreciarán que la concentración del inhibidor de ruta Rho-GTPase/ROCK dependerá de que inhibidor especifico sea usado. En las modalidades adicionales, una combinación de dos o más inhibidores de ruta Rho-GTPase/ROCK diferentes puede ser usada.
Cualquier Rho GTPase debe ser efectivo en los métodos y composiciones de la invención. Los inhibidores de Rho ¡GTPase pueden incluir anticuerpos que unen, variantes negativas dominantes de, y siARN, microARN, ácidos nucléicos antisentido, y otros polinucleótidos que tienen como objetivo a Rho GTPase. Un ejemplo de inhibidor Rho GTPase es la, toxina Clostridium botulinum C3.
Cualquier inhibidor .Myosin II debe ser efectivo en los métodos y composiciones de la invención. Inhibidores de Myosin II pueden incluir anticuerpos que unen, variantes negativas dominantes de, y siARN, microARN, ácidos nucléicos antisentido, y otros polinucleótidos que tienen como objetivo a Myosin II. Un ejemplo de inhibidor Myosin :II es blebbistatina . Los inventores han encontrado que la blebbistatina puede ser sustituida por SB431542 (un inhibidor ALK5) , aunque con un efecto reducido, en las- mezclas y métodos descritos en la sección de ejemplos. Otros inhibidores incluyen pero no se limitan a los en la patente de E.U.A. No. 7,585,844.
"ROCK" · usado en la presente se refiere a una quinasa serina/treonina que actúa cadena abajo de Rho. ROCK I (también referido como ROK ß o pl60ROCK) y ROCK II (también referido como ROK o Rho quinasa) ambos son regulados por RhoA. Vea por ejemplo, Riento, K. and Ridley, A.J., Nat. Rev.
Mol. Cell. Biol., 4, 446-456 (2003) . U "inhibidor ROCK" se refiere a agentes que inhiben ambos o cualquiera de los ROCKs . Los inhibidores de ROCK pueden incluir anticuerpos que unen, variantes negativas dominantes de, y siARN, microARN, ácidos nucléicos antisentido, y otros polinucleótidos que tienen como objetivo ROCK. Algunos ejemplos de inhibidores ROCK incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las publicaciones internacionales Nos.: WO98/06433, WO00/78351, WO01/17562, WO02/076976, WO02/076977, WO2003/Ó62227 , WO2003/059913, O2003/062225, WO2002/076976, WO2004/039796, WO03/082808, O05/035506, WO05/074643 y solicitudes de patente de Estados Unidos Nos.: 2005/0209261, 2005/0192304, 2004/0014755, 2004/0002508, 2004/0002507, 2003/0125344 y 2003/0087919. Los inhibidores de ROCK incluyen, por ejemplo, (+) - (R) -trans-4- ( 1-aminoetil ) -N- (4-piridil ) ciclohexanocarboxamida dihidrocloruro, o f536; 4- [ (IR) -1-aminoetil] -N- (4-piridil) enzamida monohidrocloruro o Fasudil; 5- (hexahidro-lH-1 , 4-diacepin-l-ilsulfonil) isoquinolina hidrocloruro o Compuesto ?; 4-[ (trans-4-aminociclohexil ) amino] -2, 5-difluorobenzamida 1 o Compuesto 2; 4- [ (trans-4-aminociclohexil) amino] -5-cloro-2-fluorobenzamida o Compuesto 3; 2- [ - ( lH-indazol-5-il ) fenyl ] - 2-propanamina dihidrocloruro o Compuesto 4; N-(3-metoxibencil) -4- (4-piridil) benzamida, Y-27632 (vea¡, por ejemplo, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 ¦ (2000) ; Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)), Fasudil (también referido como HA1077) (por ejemplo, se refiere a Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)), sc-3536 (vea, por ejemplo, Darenfed, H., et al. Cell Motil.
Cytoskeleton. 64: 97-109, 2007), H-1152 (por ejemplo, se refiere a Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)), Wf-536 (por ejemplo, se refiere a Nakajima et al., Cáncer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)), Y-30141 (descrito en la patente de E.U.A. No. 5,478,838) y derivados del mismo, y ácido nucléico antisentido para ROCK, interferencia de ARN que induce al ácido nucléicp (por ejemplo, siARN) , péptidos competitivos, peptidos antagonistas, anticuerpos inhibitorios, fragmentos de anticuerpo ScFV, variantes negativas dominantes y vectbres de expresión de los mismos. 1 Los compuestos anteriores pueden ser hechos como sales de adición ácidas con ácidos orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables, según se requiera. Ejemplos de las sales de adición ácidas incluyen sales con ácidos I minerales tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares; sales con ácidos carboxílicos orgánicos tal como ácido fórmico,, ácido acético, ácido fumárico, ácido maléico, ácido cítricq, ácimo mélico, ácido tartárico, ácido aspártico, y ácido glutámico; y sales con ácidos sulfónicos tal como ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido hidroxibencenosulfónico, ácido dihidroxibencenosulfónico y similares.
Los compuestos y sales de adición ácidas de los mismos pueden ser un anhídrido, hidrato o solvato de los mismos.
Para practicar la presente invención, los inhibidores ROCK generalmente son adecuados sin limitación en tanto que un inhibidor pueda inhibir la función de Rho-quinasa ¡(ROCK) , e inhibidores adecuados incluyen Y-27632 (por ejemplo, se refiere a Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)), sc-3536 (vea, por ejemplo, Darenfed, H., et al. Cell Motil. Cytoskeleton. 64: 97-109, 2007), Fasudil (también referido como HA1077) (por ejemplo, se refiere a Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)), H-1152 (por ejemplo, se refiere a Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)), Wf-536 (por ejemplo, se refiere a Nakajima et al., Cáncer Chemother Pharmacol. 52(4) : 319-324 (2003)), Y-30141 (descrito en la patente de E.U.A. No. 5,478,838) y derivados de los mismos, y ácido nucléico antisentido para ROCK, ácido nucléico de inducción de ARN de interferencia (por ejemplo, siARN) , péptidos competitivos, péptidos antagonistas, anticuerpos inhibitorios, fragmentos de anticuerpo ScFV, variantes dominantes negativas y vectores de expresión de los mismos. Además, debido a que otros compuestos moleculares bajos son conocidos como inhibidores ROCK, esos compuestos o derivados de los mismos también pueden ser usados ¡ en la presente invención (por ejemplo, haga referencia a las solicitudes de patente de Estados Unidos Nos. 20050209261, i 20050192304, 20040014755, 20040002508, 20040002507, 20030125344 y 20030087919, y la publicaciones de patentes internacionales Nos. 2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976 y 2004/039796) . En la presente invención, también se puede usar una combinación de uno o dos o más de los I inhibidores ROCK. i Inhibidores ROCK adicionales incluyen, por ejemplo, HA1100, 3- (4-Piridil) -ltf-indol y N- ( 4-Piridil ) -N' -;(2 , 4 , 6- triclorofenil ) urea, cada uno de los cuales! está comercialmente disponible (por ejemplo, con ^ Alexis Biochemicals (Plymouth Meeting, PA) ) . i En algunas modalidades, los inhibidores ROCK tienen la fórmula: <; id) i ! En la fórmula (I), el anillo A es un cicloalquilo i sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido. El anillo B es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
L1 es -C(0)-NR2- o -NR2-C(0)-. L2 es un enlace, alquileno sustituido o no sustituido, o heteroalquileno sustituido o no sustituido.
R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
En algunas modalidades, el anillo A es un arilo sustituido o no sustituido. El anillo A también puede ser un fenilo sustituido o no sustituido.
En otras modalidades, el anillo B és un i heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido. El anillo B también puede, ser un heteroarilo sustituido o no sustituido. En otras modalidades más, el anillo B es un pirazolil sustituido o no sustituido, furanilo sustituido o no sustituido, imidazolilo sustituido o no sustituido, isoxazolilo sustituido o no sustituido, oxadiazolilo sustituido o no sustituido, . oxazolilo sustituido o no sustituido, pirrolilo sustituido o no sustituido, piridilo sustituido o no sustituido, pirimidilo sustituido o no sustituido, piridazinilo sustituido o no sustituido, tiazolilo sustituido o no sustituido, triazolilo sustituido o no sustituido, tienilo sustituido o no sustituido, dihidrotieno-pirazolilo sustituido o no ' sustituido, tianaftenilo sustituido o no sustituido, carbazolilo sustituido o no sustituido, benzotienilo sustituido o no sustituido, benzofuranilo sustituido o no sustituido, indolilo sustituido o no sustituido, quinolinilo sustituido o no sustituido, benzotriazolilo sustituido o no sustituido, benzotiazolilo sustituido o no sustituido, benzooxazolilo sustituido o no sustituido, benzimidazolilo sustituido o no sustituido, isoquinolinilo sustituido o no sustituido, isoindolilo sustituido o no sustituido, acridinilo sustituido o nó sustituido, benzoisazolilo sustituido o no sustituido, o dimetilhidantoina sustituida o no sustituida.
L2 puede ser Ci-Cio alquilo sustituido o no sustituido.
En algunas modalidades, L2 es C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido. L2 también puede ser metileno sustituido o no sustituido (por ejemplo, metileno no sustituido) .
R2 puede ser hidrógeno. R1 puede ser hidrógeno C1-C10 alquilo no sustituido. En algunas modalidades, R1 es simplemente hidrógeno.
En algunas modalidades de la fórmula (I), el anillo A es arilo sustituido o no sustituido, el anillo B es heteroarilo sustituido o no sustituido, R1 es hidrógeno, y L2 es¡ C1-C10 alquilo no sustituido.
En otra modalidad, el inhibidor ROCK tiene la fórmula: En la fórmula (II), y es un entero de 0 a 3 y z es un entero de 0 a 5. X es -N=, -CH= o -CR4=. R1 y L2 están definidos anteriormente en la fórmula (I) .
R3, R4 y R5 son independientemente -CN, -S(0)nR6, -NR7R8 , -C(0)R9, -NR10-C (O) R11, -NR12-C (O) -OR13, -C (O) NR14R15, -NR16S (O) 2R17, -OR18, -S(0)2NR19, alquilo sustituido ; o no i sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalqulo i sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un entero de 0 a 2, en donde si z es mayor a 1, dos porciones R3 son opcionalmente unidas para formar un cicloálquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloálquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
En algunas modalidades, L2 es Ci-Cio alquilo sustituido o no sustituido. L2 también puede ser Ci-Cio alquilo no sustituido. Alternativamente, L2 es metileno sustituido o no sustituido (por ejemplo, metileno no sustituido) .
En otras modalidades, X es -N= o -CH=. · El símbolo z puede ser 2. En otras modalidades, dos porciones R3 en vértices adyacentes están unidas desde un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido. El símbolo z también puede ser 1.
El símbolo puede ser 0 ó 1. R3 puede ser -0R18. R18 puede ser hidrógeno o Ci-Cio alquilo no sustituido.
En algunas modalidades, L es metileno sustituido o sustituido (por ejemplo, metileno sustituido) , X es ( -N= -CH=, R1 es hidrógeno, e y y z son 0.
En otras modalidades, los compuestos tienen la fórmula as veces llamado Thiazovivin o "Tzv"), V. Inhibidores GSK3 ' En varias modalidades, uno o más inhibidores GSK3 pueden ser incluidos en los métodos, mezclas y kits de la invención. Los inventores han encontrado que la inclusión de los inhibidores GSK3 con al menos un receptor TGF /inhibidor ALK5, preferiblemente en combinación con un inhibidor de ruta i MEK/ERK y en modalidades particulares, un inhibidor Rho GTPase/ROCK. Los inhibidores de GSK3 pueden incluir anticuerpos que unen, variantes negativas dominantes de, y siARN, microARN, ácidos nucléicos antisentido, y otros polinucleótidos que tienen como objetivo al GSK3. Ejemplos específicos de inhibidores GSK3 incluyen, pero no se limitan a, Kenpaullona, 1-Azakenpaullona , CHIR99021, CHIR98014, AR-A014418 (vea por ejemplo, Gould, et al., The International Journal of Neuropsychopharmacology 7:387-390 (2004,)), CT 99021 {vea, por ejemplo, Wagman, Current Pharmaceutical i Design 10:1105-1137 (2004.)), CT 20026 (vea, Wagman, supra) , SB216763 (vea, por ejemplo, Martin, et al., Nature Immunology 6:777-784 (2005)), AR-A014418 (vea, por ejemplo, Noble, et al., PNAS 102:6990-6995 (2005)), litio (vea, por ejemplo, Gould, et al., Pharmacological Research 48: 49-53 (200:3)), SB 415286 (vea, por ejemplo, Frame, et al., Biochemical Journal 359:1-16 (2001)) y TDZD-8 (vea, por ejemplo, Chin, et al., Molecular Brain Research, 137 ( 1-2 ): 193-201 (2005)).' Otros ejemplos de inhibidores GSK3 disponibles con Calbiochem (vea, i I por ejemplo, Dalton, et al., WO2008/094597, incorporado a la presente como referencia) , incluye pero no se limita a BIO (2 ' Z, 3 ' £) -6-Bromoindirubina-3 ' -oxima (Inhibidor GSK3 IX); BIO-Acetoxima (2 ' Z, 3 ?) -6-Bromoindirubin-3 ' -acetoxima (Inhibidor GSK3 X); ( 5-Metil-lH-pirazol-3-il ) - (2- fenilquinazolin-4-il ) amina (Inhibidor GSK3 XIII); Complejo de piridocarbazol-ciclopenadienilrutenio (Inhibidor GSK3 XV) ; TDZD-8 4-Bencil-2-metil-l, 2, 4-tiadiazolidina-3 , 5-diona (Inhibidor GSK3beta I); 2-Tio ( 3-yodobencil ) -5- ( 1-piridil ) - [1, 3, ] -oxadiazol (Inhibidor GSK3beta II); OTDZT 2,4- Dibencil-5-oxotiadiazolidina-3-tiona (Inhibidor GSK3beta i III); alfa-4-Dibromoacetofenona (Inhibidor GSK3beta VII); AR- AO 14418 N- (4-Metoxibencil) - ' - (5-nitro-l, 3-tiazol-2-il ) urea (GSK-3beta Inhibidor VIII); 3- (1- (3-Hidroxipropil) -1H- pirrólo [2, 3-b] piridin-3-il ] -4-pirazin-2-il-pirrole-2 , 5÷diona (Inhibidor GSK-3beta XI); compuesto TWSl 19 pirrolopirimidina (Inhibidor GSK3beta XII); L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 (SEQ: ID NO. 47) o su forma iristoilada (Inhibidor GSK3beta XIII); 2- Cloro-1- (4, 5-dibromo-tiofen-2-il ) -etanona (Inhibidor GSK3beta VI); AR-A0144-18;- SB216763; y SB415286. Residuos de GSK3b que interactúan con los inhibidores que han sido identificados. Vea, por ejemplo, Bertrand et al., J. Mol Biol. 333(2): 393-407 (2003). Los inhibidores GSK3 ¡ pueden i activar, por ejemplo, la- ruta Wnt/ -catenina . Muchos de los genes cadena abajo de ß-catenina co-regulan las redes de genes pluripotentes . Por ejemplo, un inhibidor GSK activa la expresión cMyc asi como mejora su estabilidad de proteina y actividad transcripcional . Por ello, en algunas modalidades, i los inhibidores GSK3 pueden ser usados para estimular la expresión del polipéptido MYC endógeno .en una célula, asi eliminado la necesidad de la expresión MYC para inducir la pluripotencia.
Los expertos en el arte apreciarán que la concentración del inhibidor GSK3 dependerá de que inhibidor especifico se use. En ciertas modalidades, una combinación de dos o más inhibidores GSK diferentes puede usarse. , VI. Métodos para inducir pluripotencia A la fecha, un número grande de diferentes métodos y protocolos han sido establecidos para inducir las células mamiferas no pluripotentes en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) . Se cree que los agentes descritos en la presente se pueden usar en combinación con esencialmente cualquier protocolo para generar iPSCs y asi mejorar la eficiencia del protocolo. Por ello, la presente invención i proporciona la incubación de células no pluripotentes con al menos un receptor TGFp/inhibidor ALK5, preferiblemente en combinación con un inhibidor de ruta MEK/ERK, y en particular modalidades, un inhibidor Rho GTPase/ROCK en combinación con cualquier protocolo, para generar iPSCs. Una selección de protocolos se describe a continuación y cada uno se cree que es combinable con los agentes de la invención para mejorar la I eficiencia del protocolo La mejora en la eficiencia de un protocolo de generación iPSC dependerá del protocolo y que agentes de la invención son usados. En algunas modalidades, la eficiencia se mejora por al menos 10%, 20%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300% o más en comparación con el mismo protocolo sin inclusión de los agentes de la invención (es decir, receptor GFß/inhibidor ALK5, inhibidor de ruta MEK/ERK e inhibidor Rho GTPase/ROCK) . La eficiencia es medida con respecto a la mejora del número de iPSCs generados en una trama de tiempo particular o la velocidad mediante la cual se generan los iPSCs.
Los estudios han mostrado que la transducción retroviral de los fibroblastos de ratón con cuatro factores de transcripción que están altamente expresados en ESCs (Oct-3/4, Sox2, KLF4 y c-Myc) generan células madre pluripotentes inducidas (iPS) . Vea, Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell 126, i 663-676 (2006); Okita, K., Ichisaka, T. & Yamanaka, S .' Nature 448, 313-317 (2007); ernig, M. et al. Nature 448, 318-324 (2007); Maherali, N. et al. Cell Stem Cell 1, 55-70 (2007); Meissner, A. , Wernig, M. & Jaenisch, R. Nature Biot chnol. 25, 1177-1181 (2007); Takahashi, K. et al. Cell 131, 8¡61-872 (2007); Yu, J. et al. Science 318, 1917-1920 (2007); Nakagawa, M. et al. Nature Biotechnol. 26, 101-106 (2007); Wernig, M. , Meissner, A., Cassady, J. P. & Jaenisch, R. Cell Stem Cell. 2, 10-12 (2008) . Las células iPS son similares a las ESCs en morfología, proliferación, y pluripotencia, juzgadas por la formación de teratomas y la contribución ? quimera. > Como se notó anteriormente, mientras el protocolo original involucra la introducción de cuatro factores de transcripción en células no pluripotentes , se ha descubierto recientemente que algunos factores de transcripción pueden ser omitidos. Por ello, en algunas modalidades;, los i protocolos involucran introducir uno, dos o tres de un polipéptido Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido Myc, y un polipéptido Sox a células no pluripotentes bajo condiciones que permitan a las células no pluripotentes convertirse en iPSCs. Por ejemplo, cada uno de Maherali y Konrad Hochedlinger, "Inhibición de señal Tgfp cooperan I en la inducción de iPSCs y reemplaza Sox2 y cMyc" Current Biology (2009) y WO/2009/117439 describen protocolos que no requieren los cuatro factores de transcripción para inducir j pluripotencia . Además, los inventores han encontrado que los iPSCs pueden ser generados al introducir 0ct4 solas en células e incubar las células con un receptor TGF /inhibidor ALK5, un inhibidor de ruta MEK/ERK, un inhibidor Rho i GTPase/ROCK, y un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC) . Por ejemplo, introducción de 0ct4 exógeno en células mamiferas, en presencia de una cantidad suficiente de SB431542, PD0325901, Tzv, y ácido valpróico o butirato de sodio, células iPSC exitosamente generadas. 1 Ejemplos de inhibidores HDAC pueden incluir anticuerpos que unen, variantes negativas dominantes de, y siARN y ácidos nucléicos antisentido que tienen como objetivo uno o más HDACs, los inhibidores HDAC incluyen, pero no se limitan a, TSA ( tricostatina A) {vea, por ejemplo, Adcock, British Journal of Pharmacology 150:829-831 (2007)), VPA (ácido valpróico) (vea, por ejemplo, Munster, et al., Journal of Clinical Oncology 25:18S (2007) : 1065), butirato de sodio (NaBu) {vea, por ejemplo, Han, et al., Immunology Letters 108:143-150 (2007)), SAHA (ácido hidroxámico suberoilanilida o vorinostat) (vea, por ejemplo, Kelly, et al., 1 Nature Clinical Practice Oncology 2:150-157 (2005)), fenilb,utirato de sodio {vea, por ejemplo, Gore, et al., Cáncer Research ? ¡ 66:6361-6369 (2006)), depsipéptido (FR901228, FK228) (vea, por ejemplo, Zhu, et al., Current Medicinal Chemistry 3(3) : 187-199 (2003)), trapoxina (TPX) (vea, por ejemplo, Furumai, et al., PNAS 98(1) : 87-92 (2001)), ácido hidroxámico cíclico que contiene péptido 1 (CHAP1) (see, Furumai supra) , MS-275 (vea, por ejemplo, Carninci, et al., WO2008/126932 , incorporado a la presente como referencia)), LBH589 (vea, por ejemplo, Goh, et al., WO2008/108741 incorporado a la presente como referencia) y PXD101 (vea, Goh, supra) . En general, en el nivel global, las células pluripotentes tienen más acetilación histona, y células diferenciales que tienen menos acetilación histona. La acetilación histona también está i involucrada en la regulación de la histona y metilación de ADN. En algunas modalidades, los inhibidores HDAC facilitan la activación de genes de pluripotencia silenciados.
Para dirigir los asuntos de seguridad que surgen de los genomas celulares objetivos que albergan secuencias exógenas integradas, un número de protocolos genéticos modificados han i sido adicionalmente desarrollados. Estos protocolos producen células iPS con riesgos potencialmente reducidos, e incluyen adenovirus sin integración para inserción de genes de reprogramación (Stadtfeld, ., et al. (2008) Science 322, 945-949) , trasnfección transitoria de plásmidos de reprogramación (Okita, K. , et al. (2008) Science 322, 949- l 953), sistemas de transposición piggyBac (Woltjen, K., et al. (2009) . Nature 458, 766-770, Kaji, K . , et al. (2009) Nature 458, 771-775), Virus Cre-tasables (Soldner, F . , et al. (2009) Cell 136, 964-977), y sistema de expresión episomal a pase de i oriP/EBNAl (Yu, J. , et al. (2009) Science DOI : IO4II26) .
Además, las estrategias de explotación de la expresión de genes endógenos en ciertos tipos de células también permitió un reprogramación más fácil y/o con menos genes exógenos requeridos (Shi, Y., et al. (2008b) . Cell Stem Cell 2, 525- 528; Aasen, T., et al. (2008) Wat Biotechnol 26, 1276-1284; Kim, J.B., et al. (2008) . Nature 454, 646-650) . Además, las moléculas pequeñas han sido identificadas para mejojrar la eficiencia de reprogramación y reemplazar ciertos factores de reprogramación (Shi, Y., et al. (2008) Cell Stem Cell 2, 525- 528, Shi, Y., et al.. (2008) Cell Stem Cell 3, 568-574, Li, W., et al. (2009) Cell Stem Cell 4, 16-19; Huangfu, |D., et 1 al. (2008) Nat Biotechnol 26, 1269-1275, Huangfu, D . , et al. (2008) Nat Biotechnol 26, 795-797) .
Además, recientemente, se ha demostrado que los factores de transcripción pueden ser insertados como proteina exógena a las células no pluripotentes , para generar iPSCs. Vea, por ejemplo, O/2009/117439; Zhou et al., Cell Stem Cell 4:381-384 (2009) . Uno puede introducir un polipéptido exógeno (es decir, una proteína provista desde fuera de la célula y/o que no es producida por la célula) en la célula por un número de diferentes métodos que no involucran la introducción de un polinucleótido que codifica el polipéptido. Por ello, en algunas modalidades, las células no pluripotentes son puestas en contacto con un receptor TGFp/inhibidor ALK5, preferiblemente en combinación con un inhibidor de ruta EK/ERK, y en particular modalidades, un inhibidor Rho GTPase/ROCK y una o más proteínas de factor de transcripción exógena, por ejemplo, una, dos, tres o cuatro de un polipéptido Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido Mye, y un polipéptido Sox. j Una variedad de formas han sido descritas para introducir los factores de proteína relevantes en las células objetivo. En una modalidad, la introducción de un polipéptido en una célula puede comprender la introducción de un polinucléotido que comprende uno o más casetes de expresión en una célula e inducir la expresión, así introduciendo los polipéptidos en la célula mediante la transcripción y translación desde el cásete de expresión.
Alternativamente, una o más proteínas pueden simplemente ser cultivadas en la presencia de células objetivjo bajo condiciones que permiten la introducción de las proteínas en la célula. Vea, por ejemplo, Zhou H et al., Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins . Cell " Stem Cell. 8 de Mayo de 2009; 4 (5) : 381-4. En álgunas modalidades, las proteínas exógenas comprenden el polipéptido de factor de transcripción de interés relacionado (por ejemplo, relacionado como una proteína de fusión o de lo contrario relacionado de forma covalente o no covalente) a un polipéptido que mejora la capacidad del factor de transcripción para ingresar la célula (y en álgunas modalidades el núcleo celular) .
Ejemplos de secuencias de polipéptidos que mejoran el transporte a través de las membranas incluyen, pero no se limitan a, la proteína de transcripción antennapedia homeoproteína Drosophila (AntHD) (Joliot et al., New Biol. 3: 1121-34,1991 ; Joliot et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 1864-8,1991; Le Roux et al., Proc. Nati. Acad. Sel. USA, 90: 9120-4,1993), la proteína estructural del virus de herpes simple VP22 (Elliott and O'Hare, Cell 88: 223-33,1997); la proteína TAT de activador transcripcional del VIH-1 (Green and Loewenstein, Cell 55: 1179-1188, 1988 ; Frankel and Pabo, Cell 55: 1 289-1193, 1988); transportadores mejoradores de inserción tales como los descritos en la patente de E.U.A.
No. 6,730,293 (incluyendo pero no limitado a una secuencia de péptido que comprende al menos 7-25 argininas contiguas) ; y el péptido 1 Penetratin™ comercialmente disponible, y los i Vectores Péptidos Diatos ("DPVs") de la plataforma Vectocell® disponible con Daitos S.A. de París, Francia. Vea también, WO/2005/084158 y WO/2007/123667 y transportadores adicionales descritos en la presente. No solamente estas proteínas pueden pasar a través de la membrana de plasma sino la anexión de otras proteínas, tal como los factores de transcripción descritos en la presente, es suficiente para estimular la absorción celular de estos complejos.
En algunas modalidades, los polipéptidos de factor de transcripción descritos en la presente son introducidos en forma exógena como parte de un liposoma, un coctel de lípidos tal como los comercialmente disponibles Fugene6 y Lipofectamine . En otra alternativa, las proteínas de factor de transcripción puede ser microinyectadas o de lo contrario directamente inducidas en la célula objetivo.
Como se discutió en los ejemplos de WO/2009/117439, la incubación de células con los polipéptidos de factor de transcripción de la invención por un periodo extendido es i tóxica para las células. Por ello, la presente invención proporciona una incubación intermitente de células mamíferas no pluripotentes con una o más de un polipéptido Klf, un polipéptido Oct, un polipéptido yc, y/o un polipéptido Sox, con periodos de intervención de incubación de las células en la ausencia de los uno o más polipéptidos . En algunas modalidades, el ciclo de incubación con y sin los polipéptidos pueden ser repetidos por 2, 3, 4, 5, 6 ó más veces y se efectúa para suficientes longitudes de tiempo (es decir, las incubaciones con y sin proteínas) para lograr el desarrollo de células pluripotentes. Varios agentes (por ejemplo, el inhibidor de ruta MEK/ERK y/o inhibidor GSK3 y/o i inhibidor TGFbeta/ALK5 y/o inhibidor de ruta Rho GTPase/ROCK) pueden ser incluidos para mejorar la eficiencia del método.
Los varios inhibidores (por ejemplo, receptor TG /inhibidor ALK5, inhibidor de ruta MEK/ERK, y modalidades en particular, inhibidor Rho GTPase/ROCK, y/o inhibidor GSK3, etc.) pueden ser puestos en contacto con células no pluripotentes ya sea antes, simultáneo con, o después de la inserción de, factores de transcripción de programación (por ejemplo, inserción vía el cásete de expresión o como proteínas). Por conveniencia, el día en que los factores de reprogramación son insertados es designado como "día 1". En algunas modalidades, los inhibidores son puestos en contacto con las células en conjunto (es decir, como un "coctel") en aproximadamente 3-7 días y continúa por 7-14 días.
Alternativamente, en algunas modalidades, el coctel es puesto en contacto con las células en el dia 0 (es decir, un dia antes de los factores de pre-programación) e incubado por aproximadamente 14-30 días.
En otras modalidades, se agregan diferentes inhibidores en tiempos diferentes-. En algunas modalidades, en los días 1- 7 días después de la inserción de los factores de reprogramación, las células son puestas en contacto con la combinación de compuesto de un receptor TGFß/inhibid?r ALK5 (por ejemplo, SB431542) y un inhibidor ROCK por 1-8 dias, seguido por poner en contacto las células con el receptor TGFp/inhibidor ALK5, inhibidor ROCK y un inhibidor de ruta MEK/ERK (por ejemplo, PD0325901) por 1-8 dias. Esto puede ser opcionalmente seguido por poner en contacto con el receptor TGFp/inhibidor ALK5 e inhibidor de ruta MEK/ERK (p:ero no necesariamente el inhibidor ROCK) por 1-4 dias, seguido por poner en contacto con el inhibidor de ruta MEK/ERK (pero no el receptor TGFp/inhibidor ALK5 o inhibidor ROCK) , y opcionalmente al final con un medio ES basal (por ejemplo, i basal humano) sin inhibidores por 1-4 dias. Otras combinaciones también pueden ser usadas.
IV. Transformación Esta invención usa técnicas rutinarias en el campo de la genética recombinante . Los textos básicos que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory I Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).
En algunas modalidades, las especies de célula y proteina a ser expresadas son la misma. Por ejemplo,1 si se usa una célula de ratón, un ortólogo de ratón es intrpducido en la célula. Si se usa una célula humana, un ortólogo humano se introduce en la célula. ¡ Será apreciado que en donde se van a expresar dos o más proteínas en una célula, uno o más casetes de expresión múltiple pueden ser usados. Por ejemplo, en donde un cásete de expresión expresa múltiples polipéptidos, se puede usar un cásete de expresión policistronico. ? A. Vectores plásmidos En ciertas modalidades, un vector plásmido está contemplado para usar a fin de transformar una ¡ célula huésped. En general, los vectores plásmidos contienen replicón y secuencias de control que son derivadas 1 de las especies compatibles con las células huésped que son usadas en relación con estos huéspedes. El vector puede llevar un i sitio de replicación, asi como secuencias de marcación que son capaces de proporcionar la selección fenotipica en las células transformadas.
B. Vectores virales La capacidad de ciertos virus de infectar células o ingresar células vía endocitosis mediada por receptor, e integrar en el genoma celular, huésped y expresar genes virales en forma estable y eficiente habiéndolos1 hecho candidatos atractivos para la transferencia de > ácidos nucléicos foráneos en células (por ejemplo, células mamiferas) . Ejemplos no limitantes de vectores de virus que pueden ser usados para insertar un ácido nucléico f de la presente invención se describen a continuación. i. Vectores adenovirales i Un método particular para la inserción del ácido nucléico involucra el uso de un vector de expresión de adenovirus. Aunque los vectores de adenovirus son conocidos I por tener una menor capacidad para la integración en el ADN i genómico, esta característica está contrabalanceada por la alta eficiencia de transferencia de genes otorgados por estos vectores. "Vector de expresión de adenovirus" se refiere a que incluye esos constructos que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) soportar el empaquetado del constructo y (b) expresar al final un tejido o constructo de célula especifica que ha sido clonada en la misma. El conocimiento de la organización genética o adenovirus, un ~36 kb, virus de ADN de doble cadena lineal, permite la sustitución de enormes piezas del ADN adenoviral con secuencias foráneas mayores a 7 kb (Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200 (2) : 535-546, 1992)) . ii . Vectores AAV j El ácido nucléico puede ser introducido en la ¡ célula usando transfección asistida por adenovirus. Las eficiencias de transfección incrementadas han sido reportadas en los sistemas celulares usando sistemas acoplados de adenovirus (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17 ( 6) : 1110-7 , 199 ; . Cotten et al., Proc Nati Acad Sci USA, 8 (13) : 6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13 (2-3) : 141-64, 1994.) . Los virus asociados con adeno (AAV) es un sistema de vector atractivo mientras tienen una alta frecuencia de integración y pueden infectar células no divisoras, asi haciendo que sea útil para la inserción de genes en células mamiferas, por ejemplo, en i el cultivo de tejido ( uzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992) o in vivo. Los detalles relacionados con la generación y uso de vectores rAAV se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,139,941 y 4,797,368, cada una I incorporada a la presente como referencia. ¡ I iii . Vectores retrovirales ¡ Los retrovirus han prometido vectores de de genes debido a su capacidad para integrar sus genesj en el genoma del huésped, transfiriendo una enorme de material genético foráneo, infectando un amplio de especies y tipos de células y que son empacados en i lineas celulares especiales (Miller et al., Am. J. Clin. Oncol., 15 (3) :216-221, 1992) .
Con el objeto de construir un vector retrovirjal, un ácido nucléico (por ejemplo, un gen de codificación de interés) es insertado en el genoma viral en el lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que es de replicación defectuosa. Para producir viriones, una| linea ''celular de empacado que contiene genes gag, pol, y ehv pero sin el LTR y los componentes de empacado son construidos (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene cADN, junto con el LTR retroviral y i ! secuencias de empacado se introducen en una linea celular especial (por ejemplo, por precipitación de fosfato de calcio por ejemplo) , la secuencia de empacado muestra el transcripto de ARN del plásmido recombinante a ser empacado en partículas virales, que enseguida son secretadas en el medio de cultivo (Nicolás and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodríguez and Denhardt, eds . , Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986; Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983) . Los medios que contienen los retrovirus recombinantes enseguida se recolectan, opcionalmente concentrados, y usados para la transferencia de genes. Los vectores retrovirales son capaces de infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la expresión estable y de integración normalmente involucra la división de células huésped (Paskind ét al., Virology, 67:242-248, 1975) .
Los lentivirus son retrovirus complejos, que, además de los genes retrovirales comunes gag, pol, y env, contienen otros genes con función regulatoria o estructural. Los vectores lentiviral son bien conocidos en el arte (vea, por ejemplo, Naldini et al., Science, 272 (5259) : 263-267, 1996; Zufferey et al., Wat Biotechnol, 15 (9) : 871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71 ( 9) : 6641-6649, 1997; U.S. Patent Nos.
I 6,013,516 and 5, 994, 136) . Algunos ejemplos de lenjtivirus incluyen los virus de inmunodeficiencia humana: VIH-l!, VIH-2 y el virus de inmunodeficiencia en simios: SIV. Los vectores i lentivirales han sido generados por multiplicidad que atenúa los genes de virulencia VIH, por ejemplo, los genes eny, vif, vpr, vpu y nef son eliminados haciendo seguro biológicamente el vector.
Los vectores lentivirales recombinantes son capaces de infectar células no divisoras y pueden ser usados para ambos de la transferencia y expresión de genes in vivo y ex vivo de secuencias de ácido nucléico. Por ejemplo, los lentivirus recombinantes capaces de infectar una célula no divisora en donde una célula huésped adecuada es transfectada con dos o más vectores que llevan las funciones de empacado, a saber gag, pol, y env, asi como rev y tat que se describen n la patente de E.U.A. No. 5,994,136, incorporada a la presente como referencia. Uno puede tener como objetivo el virus recombinante mediante el enlace de la proteina de la envoltura con un anticuerpo o un ligando particular para tener como objetivo un receptor de un tipo celular particular. Al insertar una secuencia (incluyendo una( región regulatoria) de interés en el vector viral, junto con otros genes que codifican el ligando para un receptor en una célula objetivo especifica, por ejemplo, el vector ahora es de objetivo especifico.
IV. Inserción usando virus modificados 1 I Un ácido nucléico a ser insertado puede ser alojado dentro de un virus infectante que ha sido diseñado para expresar un ligando de unión especifico. La partícula del virus por ello se unirá específicamente a los receptores análogos de las células objetivo e inserta los contenidos a la célula. Una aproximación novedosa diseñada para permitir el objetivo específico de los vectores de retrovirus fue desarrollado con base en la modificación química de un i retrovirus mediante la adición química de residuos de lactosa I a la envoltura viral. Esta modificación puede permitir la infección especifica de los hepatocitos vía los receptores de-sialoglicoproteína .
Otra aproximación para tener como objetivo a los I retrovirus recombinantes fue diseñada en la que se usaron los anticuerpos biotinilados contra una proteína de envoltura retroviral y en contra de un receptor de célula específica. Los anticuerpos fueron acoplados vía los componentes de biotina al usar estreptavidina (Roux et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86:9079-9083, 1989). Usando anticuerpos contra los antígenos clase I y clase II con mayor complejo de histocompatibilidad, demostraron la infección de una variedad de células humanas que abren paso a los antígenos de superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux et ai., 1989) . i C . Inserción de vector y transformación de células Métodos adecuados para la inserción de ácido nucléico para la transformación de una célula, un tejido' o un organismo para usar con la invención actual se creen incluyen virtualmente cualquier método mediante el cual um ácido nucléico (por ejemplo, ADN) puede ser introducido en una célula, un tejido o un organismo, como se describe en la presente o como seria conocido por un experto en el arte. Esos métodos incluyen, pero no se limitan a, inserción directa de ADN como por transfección ex vivo (Wilson ét al., Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel and Baltimore, ¡ Nature 326:711-713, 1987), opcionalmente con Fugene6 (Roche) o Lipofectamine ( Invitrogen) , por inyección (Patentes de E.U.A. Nos. 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 y 5,580,859, cada una incorporada la presente como referencia) , incluyendo microinyección (Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; U.S. Pat . No. 5,789,215, incorporada a la presente como referencia); por electroporacion (U.S. Pat. No. 5,384,253, incorporada a la presente como referencia; Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Pótter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci . USA, 81:7161-7165, 1984); por precipitación de fosfato de calcio (Graham and Van Per Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7 (8) :2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell' Biol., 10:689-695, 1990); usando dextrano DEAE seguido por i polietilenglicol (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer et al., Proel Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987); por transfección mediada por liposoma (Nicolau and Sene, Biochim. Biophys . Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc . Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods En'zymol., 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980;( Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., J Biol. i Chem. , 266:3361-3364, 1991) y transfección mediada por receptor (Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; ; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987); y cualquier combinación de esos métodos, cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia.
VII. Mezclas La presente invención proporciona mezclas que mejoran la eficiencia de generación de iPSCs. Por ejemplo, la invención proporciona mezclas para un receptor TGF /inhibidor ÁLK5, un inhibidor de ruta MEK/ERK, un inhibidor Rho GTPase/ROCK, en modalidades particulares, con células mamíferas. Por ejemplo, I las mezclas pueden ser incluidas en medios de cultivo de células, con o sin células. Los contenidos de medios de cultivos de células generalmente son conocidos en el arte.
Ejemplos de medios de cultivos de células son descritos con detalle en los Ejemplos. Generalmente, los cultivos de células comprenden células de mamíferos y agentes de la invención (receptor TGFp/inhibidor ALK5, un inhibidor de ruta MEK/ERK, y un inhibidor Rho GTPase/ROCK) inicialmente contendrá todas o sustancialmente todas las células no pluripotentes . Sin embargo, con el tiempo, especialmente bajo las condiciones de los protocolos descritos en la presente, una porción de las células se volverán pluripotentes (es i decir, iPSCs) .
Las células que serán inducidas a pluripotencia pueden ser cultivadas de acuerdo con cualquier método conocido en el arte. Las directrices generales para las condiciones de cultivo para generar iPSCs pueden ser encontradas en, por ejemplo, Maherali, et al., Cejl Stem Cell 3:595-605 (2008).
En algunas modalidades, las células son cultivadas en contacto con células alimentadoras . Ejemplos de células i alimentadoras incluyen, pero no se limitan a células de ? fibroblastos, por ejemplo, células de fibroblasto embriónico de ratón (MEF) . Métodos para cultivar células en células alimentadoras son conocidos en el arte.
En algunas modalidades las células son cultivadas en la ausencia de células alimentadoras. Las células, por ejemplo, pueden ser anexadas directamente a una superficie de cultivo sólido (por ejemplo, una placa de cultivo) , por ejemplo, un i enlace molecular. Los inventores han encontrado que cultivar células inducidas para la pluripotencia tienen una mucho mayor eficiencia de inducción de pluripotencia (es decir, una mayor porción de células logran pluripotencia) cuando las células son anexadas directamente a la superficie de cultivo sólido en comparación a la eficiencia de células de lo contrario tratadas de forma idéntica que son cultivadas en células alimentadoras. Ejemplos de enlaces moleculares ? incluyen, pero no se limitan a, Matrigel®, una matriz extracelular (ECM) , análogos ECM, laminina, fibronectina, o colágeno. Los expertos en el arte, sin embargo, reconocerán que esto es una lista no limitante y que otras moléculas pueden ser usadas para unir células a una superficie sólida. Métodos para anexión inicial de los enlaces a la superficie sólida son conocidos en el arte. ¡ Como se describe en la presente, en algunas modalidades, las mezclas de la invención pueden incluir o excluir : células de mamíferos. (incluyendo células pluripotentes o no I pluripotentes ) , y uno o más inhibidores HDAC, inhibidor GSK3, o un agonista de canal Ca tipo L; un activador de la ruta ? cAMP; un inhibidor metiltransferasa (DNMT) de ADN; un ligando de receptor nuclear, por ejemplo, como se describió en PCT WO/2009/117439. ! VIII. Kits ¡ La presente invención también proporciona kits, por ejemplo, para usar en la generación de células madre pluripotentes inducidas. Esos kits pueden comprender cualquiera o todos los reactivos descritos en la presente, incluyendo pero no limitado a: receptor TGFß/inhibidor ALK5, inhibidor de ruta EK/ERK, y/o un inhibidor Rho GTPase/ROCK, como se describe en la presente. Estos tres agentes, o sub- I conjuntos del mismo, pueden estar presentes en frascos separados, o juntos como una mezcla. Los kits de la invención también pueden incluir, uno o más de un inhibidor HDAC, un inhibidor GSK3, o un agonista de canal Ca tipo , L; un activador de la ruta cAMP; un inhibidor de metiltransferasa de ADN (DNMT) ; y un ligando receptor nuclear.
En una modalidad, los kits de la invención incluirán uno o más tipos de células de mamíferos (por ejemplo, 'humano, ratón, rata, etc.) y/o medios de cultivo de células.
En una modalidad particular, los kits de la invención I incluirán uno o más polinucléotidos que comprenden casétes de expresión de uno o más de polipéptido Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido Myc, y un polipéptido Sox. Además, o alternativamente, los kits pueden comprender una 1 o más proteínas de factor de transcripción aisladas, por ejemplo, una, dos, tres o las cuatro de un polipéptido Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido Myc, y un polipéptido Sox. En otra modalidad particular, las proteínas de factor de transcripción pueden ser fusionadas a una secuencia de polipéptido para mejorar el transporte de las proteínas de factor de transcripción a través de las membranas de célula.
VI. Usos de células pluripotentes La presente invención permite el estudio adicional y desarrollo de tecnologías de células madre, incluyendo pero no limitado a, usos profilácticos o terapéuticos. Por ejemplo, en algunas modalidades, las células de la invención (cualquiera de las células pluripotentes o células inducidas para diferenciar a lo largo de una predestinación celular deseada) son introducidas en individuos que las necesiten, incluyendo pero no limitado a, individuos en necesidad de la I i regeneración de un órgano, tejido, o tipo de célula. En algunas modalidades, las células son originalmente obtenidas en una biopsia a partir de un individuo; inducidas en pluripotencia como se describe en la presente, opcionálmente inducidos para diferenciar (por ejemplo, en una célula i progenitora deseada, particular) y enseguida transplantada de nuevo al individuo. En algunas modalidades, las células son generalmente modificadas antes de su introducción en el individuo .
En algunas modalidades, las células pluripjotentes generadas de acuerdo con los métodos de la invención son subsecuentemente inducidas para formar, por ejemplo, células hematopoyéticas (madre/progenitor) células neurales i (madre/progenitor) (y opcionálmente, células más diferenciadas, tales como neuronas de subtipo específico, oligodendrocitos, etc) , células pancreáticas (por ejemplo, célula progenitora endocrina o células pancreáticas de expresión de hormonas) , hepatocitos, células cardiovasculares i (madre/progenitor) (por ejemplo, cardiomiocitos, células endoteliales , células de músculo suave) , células retínales, etc.
Una variedad de métodos son conocidos para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en tipos de células deseadas. Una lista no limitante de recientes publicaciones de patente describe métodos para inducir la diferenciación de células madre en varias predestinaciones i celulares como las siguientes: 2007/0281355; 2007/0269412; 2007/0264709; 2007/0259423; 2007/0254359; 2007/0196919; 2007/0172946; 2007/0141703; 2007/0134215.
Una variedad de enfermedades pueden ser mejoradas por introducción, u opcionalmente pretendidas para, células pluripotentes de la invención para un tejido dañado en particular. Ejemplos de enfermedades que resultan del daño de tejido incluyen, pero no se limitan a, enfermedades por neurodegeneración, infarto cerebral, enfermedad vascular i obstructiva, infarto del miocardio, falla cardiaca, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfisema pulmonar, bronquitis, enfermedad pulmonar intersticial, asma, hepatitis í B (daño del hígado) , hepatitis C (daño del hígado) , hepatitis alcohólica (daño del hígado) , cirrosis hepática (daño del hígado) , insuficiencia hepática (daño del hígado) , pancreatitis, diabetes mellitus, enfermedad de Crohn, colitis inflamatoria, glomerulonefritis IgA, glomerulonefritis , insuficiencia renal, decúbito, quemaduras, herida sutural, laceración, herida por incisión, heridas por mordidas, dermatitis, queloide cicatrizal, queloide, úlcera diabética, úlcera arterial, y úlcera venosa.
En una modalidad, las iPSCs pueden usarse en varios ensayos y seleccionarse para identificar moléculas que median • su función, incluyendo pero no limitado a promover la supervivencia y/o diferenciación de iPSC.
Ejemplos Los siguientes ejemplos son ofrecidos para ilustrar, pero no limitar la invención reclamada.
Ejemplo 1: Una plataforma química para mejorada de iPSCs humanos Fibroblastos de tipo mesenquimal reprogramados con los "cuatro factores" (de ahora en adelante (OCT4, SOX2, KLF4 & c-MYC; 4TFs) experimentaron cambios morfológicos dramáticos que resultaron en iPSCs con polaridad celular distinta, limites e interacciones de célula a célula. Las células reprogramadas expresaron E-caderina, un marcador para células epiteliales (Hay, E.D., Acta Anat. (Basel) 154, 8-20 (1995)), que también está altamente expresado en las células madre embriónicas humanas (hESCs) . Argumentamos que los factores que promueven la transición mesenquimal a epitelial (MET) , tal como los antagonistas de ruta.TGFp, tendrían un impacto directo en el proceso de reprogramación. Además, la inhibición de ruta ER-ERK fue previamente mostrada para jugar un papel importante en varios pasos de la reprogramación (Chen, S. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 104, 10482-87 (2007); Shi, Y. et al., Cell Stem Cell 2, 525-8 (2008) ). Además, los factores que promueven la supervivencia i celular también podrían ser benéficos en mejorar la eficiencia de la reprogramación. En consecuencia, nos enfocamos en las pequeñas moléculas que pueden regular estos tres procesos y rutas, ya que las pequeñas moléculas; tienen muchas ventajas (Feng, B. et al., Cell Stem Cell 4, 301-12 (2009) ; Shi, Y. et al., Cell Stem Cell 2, 525-8 (2008); Xu, Y. et al., Nature 453, 338-44 (2008)) al estudiar los procesos biológicos y son una alternativa más segura ' que la manipulación genética. En la presente describimos una plataforma química simple que sustancialmente mejora la I generación de iPSCs humanas completamente reprogramadas a partir de los fibroblastos a través de un proceso mucho más rápido y más eficiente.
Probamos inhibidores conocidos del receptor TGF(3 y MEK i en fibroblastos primarios humanos de lxlO4 (Feng, B. et al., Cell Stem Cell 4, 301-12 (2009)) (CRL2097 o BJ) que, fueron transducidos retroviralmente con los 4TFs, para su efecto en la cinética de reprogramación y en la eficiencia ,(vea la figura la para detalles) . En el día 7 (D7) de la posinfección, los compuestos fueron agregados, individualmente o i en combinación, y los cultivos fueron examinados para los iPSC en las siguientes 1-3 semanas.
En el día 7 de pos-tratamiento (D14), observamos el efecto más fuerte en los cultivos tratados con una combinación de inhibidor ALK5 SB431542 (2 µ?) e inhibidor EK PD0325901 (0.5 µ?) , que resultó en ~45 colonias grandes de ALP+ (Figura Ib) con morfología característica tipo hÉSC, en I la cual más de 24 colonias fueron TRA-1-81+ (figura Id), y aproximadamente 6-10 colonias tiñieron positivas para SSEA4 y i NANOG, un factor de pluripotencia madura que no es introducida ectópicamente (Figura le y lf ) . Además, los i i cultivos tratados mostraron una expresión de alto nivel de mARN endógeno para los genes de pluripotencia (Figura le) . En contraste, ninguna de las colonas NANOG+ fueron observadas en los cultivos de control no tratados (Figura le & Figura 4a) o i en los cultivos que fueron tratados sólo con PD0325901 (figura 4a) . Sin embargo, en los cultivos tratados únicamente con SB431542, aún observamos colonias 1-2 ALP+ tipo hESC (figura 4a) . Es importante, que el efecto combinado de ambos inhibidores (Fig. 4b & 4c), así como el efecto individual del SB431542 fue dependiente de la dosis. , Cuando mantuvimos los cultivos tratados SB431542 más PD0325901 por 30 días sin separación, obtuvimos aproximadamente 135 colonias iPSC por pozo (figura 3d) , a > 100 pliegues con mejora en la eficiencia sobre el método j i convencional. Consistente con los reportes previos (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007)), en controles no tratados que portan 4TFs, observamos 1-2 colonias iPSCs además de varias colonias granuladas (Figura 2c) . Estas estructuras granuladas han sido sugeridas para ser cplonias parcialmente reprogramadas ¦ (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007)). También observamos colonias granuladas en los cultivos tratados SB431542, que excedieron en número por varios pliegues a las pocas colonias tipo hESC. Interesantemente, el número de colonias granuladas, fue dramáticamente reducido en el tratamiento con SB431542 y PD0325901 combinado, que resultó en un incremento concomitante en el número de colonias tipo hESC. Esto 'sugirió que una inhibición combinada de ALK5 y MEK puede guiar colonias parcialmente recombinadas a un estado completamente i reprogramado y asi mejorar el proceso de reprogramación total. Además, el hecho que observamos mejoró la inducción de los iPSCs tan pronto como a los 7 días del pos-tratamiento sugieren el tratamiento con estas pequeñas moléculas no sólo mejoró l eficiencia del proceso de reprogramación sino también puede tener una cinética acelerada (Figura la) . Se requieren experimentos adicionales para determinar si las células reprogramadas en esta fase de hecho se ¡vuelven completamente independientes de los factores de reprogramación exógena antes que los cultivos no tratados.
Aunque las colonias iPSC fueron recolectadas y expandidas, como en los cultivos hESC, los cultivos se dividen por tripsinización que resultó en una supervivencia pobre. A partir de una selección reciente efectuada en nuestro laboratorio, identificamos una pequeña molécula novedosa, Thiazovivin (figura 5) , que mejoró dramáticamente la supervivencia de los hESCs en la tripsinización. La adición de Thiazovivin para nuestro coctel de SB431542 y PD0325901 también mejoró inmensamente la supervivencia de las iPSCs después de separar mediante tripsinización (figura 2a), y un gran número de colonias reprogramadas fue obtenido. De las 10,000 células que fueron originalmente inoculadas, una separación simple 1:4 en el dia 14 resultó en -1,000 colonias tipo hESC en el dia 30 (figura 2e) , mientras dos rondas de separación (en el dia 14 y en el dia 21 (1:10)) resultó en ~11,000 colonias tipo hESC (Figura 2c & 2e) en el dia 30.
Estas colonias mostraron altos niveles de mARN endógeno (figura 2f) y la expresión de proteina (figura 2b & 2c) de los marcadores de pluripotencia, a la vez que la expresión de ? los cuatro transgenes podría ser difícilmente detectada (figura 2f ) . En contraste, ninguna de las colonias iPSC fue obtenida de las muestras no tratadas o de 2 compuestos tratados que fueron tripsinizados (tabla 1) .
Tabla 1: Una comparación del número de colonias iPSC fueron observadas en cultivos no tratados, cultivos tratados con 2 compuestos y 3 compuestos en el día 30. de la separación o si también aumenta el efecto de reprogramación de SB431542 y PD0325901 combinado, probamos el coctel de 3 compuestos en las células 4TF transducidas que no fueron sometidas a separación. En estos cultivos, en el día 14 observamos ~25 colonias grandes que fueron' todas expresadas como Nanog (figura le) . Al dia 30 observamos -205 colonias NANOG+ muy grandes (figura 2d) , que también fueron TRA-1-81+ y SSEA4+ (datos no mostrados) , que se tradujeron a más de 200 pliegues para mejorar en eficiencia sóbre un tratamiento sin compuesto, y un incremento de dos pJliegues con un tratamiento de 2 compuestos. 1 El tratamiento de dos compuestos también resultó en un 1 número más grande de colonias de fosfatase positiva alcalina en comparación con controles no tratados cuando los factores de reprogramación fueron introducidos usando un lent.iviral, en lugar de un sistema retroviral (figura 6a) . Además, el coctel de 3 compuestos no pareció influenciar en la expresión del factor de reprogramación desde los vectores retro¡virales I (figura 6b-f ) .
Las colonias iPSC generadas usando el coctel de 3 compuestos fueron fácilmente y establemente largo plazo bajo las condiciones de convencionales (sobre 20 pasajes) y se asemejaron dé forma muy cercana a los hESC en términos de morfología, expresión del marcador de pluripotencia típica y potenciales de diferenciación. Mostraron un cariotipo normal (figura 7) y podría ser diferenciado en derivativos de las tres capas de germen, ambos in vitro (Figura 3a & 3b) e in vivo (figura 3c) . Estos resultados también sugirieron que no hay efecto adverso de corto plazo asociado con el procedimiento de tripsinización mucho más conveniente.
La demostración que la inhibición de ruta MER-ERK y TGF mejoró la reprogramación de fibroblastos sugirió críticos para estas dos rutas de señalización mecanismos MET en el proceso. Consistentemente, la adición de TGF tuvo un efecto inhibitorio en la reprogramación del factor mediado de fibroblastos (datos no mostrados) . GF y sus miembros de familia juegan papeles contextúales importantes en auto-renovación y diferenciación dé ESCs ( atabe, T. and Miyazono, K., Cell Res. 19, 103-15 (2009)) .
Además, el TGF es una citocina prototipica para inducción de transición mesenquimal epitelial (EMT) y para el mantenimiento del estado mesenquimal (Willis, B.C. and Borok, Z., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.293, L525-34 (2007)) . Un punto final mayor de esta señalización, en este j contexto, es de regulación descendente de E-caderina (Thiery, J.P. and Sleeman, J.P., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 7,1 131-42 (2006) ) . La E-caderina ha demostrado que es importante para el mantenimiento de la pluripotencia de ESCs y ha sugerido recientemente que es un regulador de la expresión NANOG i (Chou, Y.F. et al.., Cell 135, 449-61 (2008)) . Por ello la inhibición de la señalización TGFP, que resulta en ' la de¬ represión del destino epitelial, podría beneficiar el proceso i de reprogramación en múltiples formas. La señalización ERK también promueve el EMT (Thiery, J.P. and Sleeman, J.P., Nat.
Rev. Mol. Cell Biol. 7, 131-42 (2006)), y está cadena abajo del TGF en el proceso (Chou, Y.F. et al., Cell 135, 449-61 (2008)) . Hemos mostrado anteriormente que el efecto de la reversina, una molécula pequeña que puede reprogramar los mioblastos a un estado multipotente, es mediado en parte a través de la inhibición de MEK-ERK (Chen, S. et al., Proc.
Nati. Acad. Sci. U S A 104, 10482-87 (2007)). Esto puede explicar el efecto observado en la reprogramación cuando fue combinado con inhibición TGF .
La plataforma química descrita en la presente es única, en que modula las rutas de señalización cadena arriba y podría mejorar radicalmente la reprogramación en un tipo de célula general, como los fibroblastos. Las condiciones químicas descritas en la presente proporcionan una plataforma básica para ADN sin ADN y no viral (Zhou, H. et ali. , Cell Stem Cell 4, 381-84, (2009)), más eficiente y métodos de i reprogramación más seguros, que podrían producir un suministro ilimitado de iPSCs humanos seguros para varias aplicaciones .
Métodos Cultivo celular Fibroblastos primarios de piel CRL2097 y BJ (prepucio neonatal) fueron comprados del ATCC. Todos los reactivos de medios de cultivo celular fueron comprados de Invitrogen I Corporation, CA. Las células fueron mantenidas en DMEM (10313-021) con un contenido de 10% de FBS (10439-024), IX EM aminoácidos no esenciales (11140-050), IX Glutamax (35050-061), 10 mM Hepes (15630-080) y O.llm ¡de 2- Mercaptoetanol (21985-023) . Las células fueron pasadas 1:5 usando 0.05% (IX) tripsin-EDTA (25300-054) .
Plasmidos El vector pMXs que codifica los cADNs humanos para OCT4, I SOX2, c-MYC y KLF4, descritos antes, (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007)), fueron obtenidos de ADDGENE. El ratón Slc7al ORF fue clonado en pWPXLD (Addgene) , como se describió anteriormente (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007) ) . i Infección retroviral y generación de células iPS Los lentivirus que llevan OCT4, NANOG, SOX2 & LIN28 fueron producidos como se describió antes (Yu, J. et al., Science 318, 1917-20 (2007)) . Para la producción de retrovirus, las células de paquete PLAT-F fueron puestas en placas de lxlO6 células/pozo de una placa de 6 pozos. Después de 24 horas, las células fueron transíectadas con vectores pMXs que llevan cDNSs OCT4, SOX2, c-MYC y KLF4 usando un reactivo de transfección Fugene 6 (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, el medio fue reemplazado con un medió fresco y la placa fue transfectada a 32 °C para la producción de retrovirus. Los virus fueron recolectados en 48 horas y 72 horas, y detectados sistemáticamente con 0.45 µp? de filtro antes de la tranducción.
Las células de fibroblastos de expresión humana Slc7al fueron seleccionadas a lxlO5 células/pozo de una placa de 6 pozos en el día 1. En el día 2, 0.25 mi de cada sobrenadante retroviral fue agregado a las células en presencia de 6 µg/ml de polibreno (polybrene) . Una segunda ronda de transduccion fue hecha en el día 3. La eficiencia de la infección fue estimada por el microscopio de fluorescencia en las células transducidas en paralelo con retrovirus que portan genes GFP i o RFP. Siete días después de la transduccion inicial, los fibroblastos fueron cosechados por tripsinización , y re- placados en lxlO4 células/pozo de una placa con 6 pozos cubierta con matrigel (dilución de 1:50, cat 354234, BD i Biosciences) . Por el tratamiento del compuesto, las células fueron cultivadas en un medio de reprogramación , humana (D EM/F12, 20% de sustituto de suero reemplazador Knockout, lx MEM aminoácido no esencial, lx glutamax, 0.11 mM 2- ercaptoetanol, 20 ng/ml bFGF y 1,000 U/ml LIF) y fueron tratadas con 2 µ? de SB431542 (Stemgent), 0.5 µ? de PD0325901 (Stemgent) , 0.5 µ? de Thiazovivin, o combinaciones de los compuestos. Los medios fueron cambiados cada 2-3 días dependiendo de la densidad celular. Siete dias después del tratamiento de compuesto, cualquiera de las placas fue fijada y teñida para una actividad de fosfatase alcalina (ALP) , o teñida para marcadores de proteina, o los cultivos fueron continuados con o sin una separación indicada por tripsinización cultivada el día 30. Para los cultivos separados, las células fueron separadas (1:4) y re-placadas en una capa alimentadora CF-1 MEF irradiada (2.5 x 105 células/pozo) en cada pozo de 6 placas por pozo y fueron separadas (1:10) de nuevo en el día 21. Las células fueron mantenidas en el mismo medio y el coctel de compuesto descrito anteriormente excepto por las concentraciones de PD0325901 (0.5 µ? para D14 y 1 µ? para D21) y SB431542i (0.5-1 í µ después del D14) . Las colonias iPSC fueron subsecuentemente mantenidas en medios hESC convencionales en ausencia de los compuestos anteriores.
Tinción de fosfa'kasa alcalina e inmunocitoquimica La tinción de fosfatasa alcalina fue efectuada usando un kit de detección ALP (cat no: SCR004, Chemicon) de acuerdo con las instrucciones del producto. Para la inmunocitoquimica, las células fueron fijadas en j 4% de paraformaldehido (10 min, RT) , lavada dos veces con PBS, bloqueada usando 5% de suero de burro normal (Chemicon) y 0.1% de TritonX-100 (15 min, RT) y enseguida tratado con anticuerpos primarios durante la noche a 4°C. Los anticuerpos primarios usados fueron anti-NANOG NANOG (cat no: AB9220, Chemicon, 1:1,000); anti-OCT4 (cat no: sc-5279, Santa Cruz biotech, 1:200), anti-SSEA 4 (cat no: mab4304, Chemicon, 1:500), anti-Tra-1-81 (cat 560123, BD Biosciences, 1:100), anti-Tra-1-81 (mAb 4381, Chemicon, 1:500), anti-ß??? TUBULIN (cat no: MMS-435P, Covance Research Products Inc, 1 1000), anti-PDX 1 (1:500) (una clase de regalo del Dr. C. Wright) , anti-BRACHYURY (cat No: AF2085, R&D, concentración final de 0.2 pg/ml) . Las células fueron lavadas dos veces con PBS y í enseguida tratadas con anticuerpos secundarios por 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios ; usados fueron Alexa flúor 488 burro anti-conejo o anti-ratón IgG (Invitrogen, 1:1,000) y Alexa flúor 555 burro anti-conejo o anti-ratón IgG (Invitrogen, 1:1,000). Los núcleos fueron teñidos con 0.5 g/ml DAPI (Sigma) . Las imágenes fueron capturadas usando un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U/X-cite 120 EXFO con una cámara fotométrica CoolSnap HQ2.
Diferenciación in vitro y ensayo teratoma La generación de cuerpos embrioides y diferenciación in vitro fueron efectuadas como se describe en otro lugar (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007)). Para el ensayo de teratoma, 3-5 millones de células fueron inyectadas bajo la cápsula para riñon de ratones SCID. Treinta y uno dias después los tumores fueron extirpados y fijados en 4% de paraformaldehido y analizados histológicamente en el centro de investigación de histología TSRI . El uso de ratones SCID fue aprobado por el comité de investigación animal UCSD.
RT-PCR El ARN total fue extraído de las células usando una minikit RNeasy (Qiagen) . Los cADNs fueron sintetizados de acuerdo con las instrucciones del- producto usando el kit de síntesis de primer filamento de superscript III (Invitrogen) .
Dos microlitros de producto de reacción fueron usados para 24-28 ciclos PCR usando los respectivos iniciadores. Las secuencias de los iniciadores se describen en otro lugar (Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007)).
Citometria de flujo Para el análisis de citometria de flujo, los cultivos fueron tripsinizados ligeramente y cosechados a partir de 6 placas de pozo. Las células fueron lavadas y re-suspendidas en un tampón FACS (PBS, 2 mM EDTA, 2 mM HEPES, 1% FBS) , y fueron analizados en un citometro FACS Calibur ; (Becton Dickinson, San José, CA) con el programa CellQuest.
Ejemplo 2: Síntesis del N- (ciclopropilmetil) -4- (4- (6-hidroxi-3 , 4-dihidroquinolin-l (2H) -il) pirimidin-2- ilamino) bencenosulfonamida (Thiazovivin) El matraz de reacción que contiene 2 , 4-dicloropir(imidina i (372 mg, 2.25 mmol) , 6-metoxi-l , 2 , 3 , 4-tetrahidroquinolina (489 mg, 3 mmol) y di-isopropiletilamina 0.52 mL, 3 mmol) en n-butanol (10 mL) fue calentado a 40 °C durante la nophe . El i solvente fue evaporado, y el residuo fue purificado por una cromatografía en columna flash para resultar en 2-cloro-4- ( 6- metoxi-3, 4-dihidroquinolin-l (2H) -il) pirimidina (551 mg,, 80%) .
? Este intermedio (250 mg, 0.91 mmol) enseguida fue disuelto en diclorometano y tratado con BBr3 ( 1M en diclorometano ) (1 mL, 1 mmol) a -78°C. La mezcla de reacción fue lentamente calentada a temperatura ambiente y agitada por 1 hora, vertida en agua, extraída con dicloromentano . Los orgánicos combinados fueron secados sobre Na2S04 anhidro y concentrados. El residuo fue purificado por cromatografía de columna flash para resultar en 2-cloro-4- ( 6-hidroxi-3 , 4-dihidroquinolin- 2 (2H) . il) pirimidina (154 mg, 65%) . Para una solución ¡agitada de 2-cloro-4- ( 6-hidroxi-3, 4-dihidroquinolin-l (2fí) - il) pirimidina (29 mg, 0.11 mmol) y 4-amino-N- (ciclopropilmetil ) bencenosulfonamida (27 mg, 0.12 mmol) en i DMF (0.5 mL) se agregó a ácido p-toluensulfónico (2 M en dioxano) (55 L, 0.11 mmol) . La mezcla de reacción fue ? agitada a 90 °C durante la noche, enseguida se purificó por HPLC para resultar en el compuesto del titulo (27 mg, 56%) .
Ejemplo 3: Reprogramación de células somáticas primarias humanas por OCT4 y compuestos químicos En la presente reportamos un coctel de pequeñas moléculas novedosas que permite la reprogramación |de las ? células somáticas primarias humanas a iPSCs con expresión exógena de únicamente OCT .
Entre los diversos tipos de células somáticas primarias fácilmente disponibles, los queratinocitos que pueden ser fácilmente aislados de la piel o folículo de cabello humano representan una fuente de célula atractiva para reprogramación, debido a que expresan en forma endógena al KLF4 y cMYC, y fueron reportados para ser reprogramados más eficientemente usando los cuatro TFs convencionales o tres TFs (sin MYC) (Aasen, T. et al., Wat Biotechnol 26:1276-1284 (2008); aherali, N. et al., Cell Stem Cell 3, 340- 345(2008)) . Más recientemente, reportamos que la inhibición doble de rutas TGFp y MAPK/ERK que usan pequeñas moléculas (es decir SB431542 and PD0325901, respectivamente) proporcionan una condición drásticamente mejorada para reprogramación de los fibroblastos humanos con cuatro TFs exógenos (es decir OSKM) (Lin, T. et al., Nat Methods 6:805-808 (2009) ) . Además, hemos mostrado que esa inhibición de ruta doble también podría mejorar la reprogramación de queratinocitos humanos mediante dos TFs exógenos (es decir, I OK) con dos moléculas pequeñas, Parnate (un inhibidor de desmetilasa de lisinia específica 1) y CHIR99021 (un inhibidor GSK3) (Li, w. et al., Stem Cells 27:29:92-3000 í (2009) ) . Sin embargo, ese proceso de reprogramación 2-TFs fue i muy ineficiente y complejo (por ejemplo, involucra dos TFs exógenos y cuatro químicos) , y la reprogramación con inclusive un TF menos pareció desalentador. Hacia el OCT4 únicamente la reprogramación, desarrollamos una estrategia paso a paso en perfeccionar la condición de programación e identificación de las nuevas entidades químicas de reprogramación. Primero intentamos optimizar adicionalmente el proceso de reprogramación bajo las cuatro b tres condiciones TFs (es decir, OS o OSK) en los queratinocitos epidérmicos humanos neonatales (NHEKs) al probar diversos inhibidores de rutas TGFP y MAPK a diferentes concentraciones usando los métodos de caracterización iPSC humanos reportados previamente (Lin, T. et al., Nat Methods 6:805-808 (2009)).
Alentadoramente, encontramos que la combinación de 0.5 µ? de PD0325901 y 0.5 de µ? A-83-01 (un inhibidor receptor TGF$ selectivo y más potente) fue más efectivo en mejorar la reprogramación de los queratinocitos humanos transducidos con OSKM u OSK (figura 8a). Notablemente, cuando además redujimos las transducciones virales a únicamente dos factores/ÓK, aún pudimos generar iPSCs a partir de los NHEKs cuando : fueron tratados con 0.5 µ? de PD0325901 y 0.5 µ? de A-83-01, aunque con eficiencia baja. Enseguida iniciamos a seleccionar i moléculas pequeñas adicionales a partir de una recolección de compuestos bioactivos conocidos a varias concentraciones como se reportó previamente. Entre las docenas de compuestos probados hasta ahora, sorprendentemente encontramos, que un activado de pequeña molécula de PDKl (2' -fosfoinositida- quinasa dependiente 1), PS48 (5 µ?) que nunca había sido reportada en la reprogramación, puede mejorar significativamente la eficiencia de reprogramación alrededor de quince pliegues. Es interesante, que también encontramos de 0.25 mM de butirato de sodio (NaB, un de desacilasa histona) resultó ser mucho más y eficiente que el previamente reportado de 0.5 mM VPA para la generación de iPSCs bajo una condición OK (figura 8b) . Los subsecuentes estudios demostraron que la combinación de 5 µ? de PS48 y 0.25 mM de NaB además podría mejorar la eficiencia de reprogramación sobre veinticinco pliegues (Figura 8b y tabla 4). Con esa eficiencia sin precedentes en la reprogramación de NHEKs bajo solamente dos TFS, además exploramos la posibilidad de generar iPSCs con OCT4 ¡sólo al refinar las combinaciones de esas moléculas pequeñas durante las diferentes ventanas de tratamiento. Los NHEKs primarios fueron transducidos con OCT4 y tratados con químicos ( Figura 8c) . Entre varias condiciones, las pequeñas moléculas iPSC que se asemejan a los hESCs (cuatro a seis colonias de 1,000,0000 de células inoculadas) pareció en los NHEks infectados OCT4 que fueron tratados con 0.25 mM de NaB, 5 µ? de PS48 y 0.5 µ? de A-83-01 durante las primeras cuatro semanas, seguido por el tratamiento con 0.25 mM de NaB, 5 µ? I de PS48, 0.5 µ? de A-83-01 y 0.5 µ? de PD0325901 por otras cuatro semanas (figura 8c). Esas colonias iPSC positivas de TRA-1-81 (figura 8d) crecieron más por debajo del medio de cultivo hESC convencional y podría ser pasado serialmente para producir clones iPSC estables que fueron además caracterizados (figura 8e y 9). Más significativamente, los iPSCs únicamente de 0CT4 también podrían generarse a partir de queratinocitos adultos humanos por la adición de 2 µ? de Parnate y 3 µ? de CHIR99021 (que ha demostrado mejorar la reprogramación de NHEKs bajo . condición OK) a este i coctel químico. Después de la reprogramación confiable de queratinocitos primarios para iPSCs por OCT4 y pequeñas moléculas, además aplicamos las condiciones a otros tjipos de células primarias humanas, incluyendo HUVECs (¡células mesodermas diferenciadas) y AFDCs (células derivajdas de fluido amniótico) . Igualmente, las colonias iPSC positivas TRA-1-81 aparecieron en HUVECs infectadas por OCT4¡ y las AFDCs fueron tratadas con químicos. Notablemente, paríece que la reprogramación de HUVECs y AFDCs fue más eficiente y más rápida en la reprogramación de NHEKs bajo el |OCT4 y condiciones de pequeña molécula (tabla 4) . Dos clones de iPSCs de cada tipo de célula fueron expandidos a largo plazo por más de 20 pasajes bajo la condición de cultivo hESC convencional y además caracterizados (tabla 5) .
Esta células hiPSC-OK y hiPSC-0 expandidas dé forma estable son morfológicamente no distinguibles para los hESCs, y podrían ser cultivadas en la superficie cubierta on ECM bajo condiciones químicamente definidas y libres de alimentadores (figura 8e y figura 13) . Tiñeron la fosfatasa alcalina (ALP) y marcadores de típicos expresados, incluyendo OCT4, S0X2, NANOG, TRA-1-81 y SSEA4, detectados por inmunocistoquimica/ICC (figura 8e, 10b, figuras 11-12). Además, el análisis RT-PCR confirmó la expresión de los genes OCT4 , SOX2, NANOG, REX1, UTF1 , | TDGF2, FGF4 endógenos humanos, y silenciar al 0CT4 y KLF4 xógeno (figura 9a y 10c) . Además, el análisis de secuenciamiento de bisulfito reveló que los promotores OCT4 y NANOG de las células hiPSC-OK y hiPSC-00 están en gran parte desmetiladas (figura 9b y lOd) . Este resultado proporciona más evidencia para la reactivación del programa de transcripción de pluripotencia en las células hiPSC-OK y hiPSC-0. El análisis de expresión de gen global de las células hiPSC-O, NHEKs y hESCs mostraron que las células hiPSC-0 son distintita de los NHEKs (valor de correlación Pearson: 0.87) y más similares a hESCs (valor de correlación Pearson: 0.98) (figura 9c). Los análisis de genotipado mostraron que las células hiPSC-0 únicamente contuvieron el transgen OCT4 sin la contaminación del transgen KLF4 o SOX2 (Figura 15) . El análisis de Southern blot mostró que hubo múltiples sitios de integración diferentes del transgen OCT4 (figura 16) entre los diferentes clones. Además, el resultado del cariotipado demostró que las hiPSC-P mantuvieron un cariotipado normal durante la reprogramación completa y en el proceso de expansión (figura 17) . Además, la prueba de huella digital de ADN excluyó la posibilidad de que estas hiPSCs surgieran de la contaminación hESC en el laboratorio (tabla 6) . Para examinar el desarrollo potencial de estas células hiPSC-O, fueron diferenciadas in vitro por el método de diferenciación de cuerpo de embrioide estándar (EB) . Los análisis ICC demostraron que podrían diferenciarse efectivamente en las células neuronales características pill-tubulin+ (ectoderma) , células mespdermas SMA+, y células endodermas AFP+ (figura 9d y lOe) . Los análisis PCR cuantitativos además confirmaron la expresión de estos y genes marcadores específicos de linaje adicional, I incluyendo células ectodermas (ß???-tubulin y ESTIN) , células mesodermas [MSX1 y MLC2a) , y células endodermas ( FOXA2 y AFP) (figura 9e) . Siguiendo el protocolo EB/ estas células hiPSC-OK y hiPSC-0 también podrían dar origen a los cardiomiocitos rítmicamente palpitantes. Para probar su pluripotencia in vitro, fueron trasplantados en ratones SCID. Cuatro-seis semanas después, estas células hiPSC-0 generaron efectivamente teratomas típicas que contienen derivados de las tres capas de germen (figura 9f y lOf ) . Colectivamente, estas caracterizaciones in vitro e in vivo demostraron · que un factor de transcripción simple, OCT4, combinado con un coctel de moléculas pequeñas definidas es suficienté para reprogramar varias células somáticas primarias a iPSCs que son morfológicamente, molecularmente y funcionalmente similares a las hESCs pluripotentes .
Los estudios presentados anteriormente tienen un número de implicaciones importantes: (1) Aunque los NSCs fetales fueron mostrados para ser reprogramados a iPSCs por la expresión ectópica del 0ct4 sólo, ha habido escepticismos significativos sobre si el gen 0ct4 exógeno por si sólo seria suficiente para reprogramar otras células somáticas humanas prácticas que no expresan endógenamente Sox2 (uno de los dos genes de pluripotencia maestra en la reprogramación) , son de fases de desarrollo posteriores (por ejemplo, embriónicas al inicio/fetal vs . nacida/adulta), y pueden obtenerse sin daños significativos para el individuo. Para nuestro conocimiento, nuestro estudio es la primera demostración que los iPSCs pueden ser prácticamente derivados de las célula somáticas humanas primarias fácilmente disponibles (por ejemplo, queratinocitos ) transducidos con un gen de reprogramación exógeno simple, Oct4. En contraste con las células madre neurales desde el cerebro, los queratinocitos son más accesibles y pueden ser fácilmente obtenidos de individuos nacidos con menos procedimiento invasivos. Esto además fortalece la estrategia de explotar varias células somáticas humanas prácticamente accesibles para la generación de iPSC con aproximaciones más seguras y/o mejores cualidades. Por ello, este nuevo método y su desarrollo adicional facilitarían significativamente la producción de células madre pluripotentes de pacientes específicos para varias aplicaciones. (2) Aunque las moléculas pequeñas y sus combinaciones han sido identificadas para únicamente reemplazar una o dos TFs de reprogramación, se vuelve exponencialmente un reto para generar iPSCs cuando más TFs de reprogramación exógena son omitidas en conjunto. La I identificación de este nuevo coctel de pequeña molécula, que funcionalmente reemplaza tres factores de transcripción maestro todos juntos (es decir, Sox2, Klf4 y c yc) que permitan la generación de iPSCs con sólo 0ct4, representa otro paso principal hacia la última reprogramación con únicamente pequeñas moléculas, y además demostró y solidificó la aproximación química a iPSCs. (3) Esta condición , de gen simple demostrada también tiene una implicación significativa para la tecnología de células madre pluripotentes inducidas por proteína (piPSC) . Un reto práctico para tecnología piPSC es de escala grande y de producción confiable en las cuatro proteínas de reprogramación transducibles , cada uno ¡de los cuales se comporta de forma diferente en la producción (por ejemplo, su expresión, pliegue, estabilidad, etc.).
Claramente, combinado este coctel de pequeña molécula con una proteina transducible simple simplificaría significativamente la tecnología piPSC y facilitaría sus aplicaciones. (4) Más específicamente, identificamos una nueva pequeña molécula, PS48, con un nuevo objetivo/mecanismo en la reprogramación mejorada. PS48 es un activador de pequeña molécula alostérica de PDK1, que es una quinasa cadena arriba importante para I varias quinasas AGC, incluyendo Akt/PKB (Alessi et al. , Curr Biol 7, 261-269 (1997)). Su efecto de mejoramiento de reprogramación puede ser atribuido en parte a la activación del Akt/PKB, que promueve la proliferación y supervivencia de células (Manning, B. D. , Cantley, L. C, Cell 129, 1261-1274 I (2007)). Además, en caracterizaciones profundas de cbmo los mecanismos de PDK1 involucrados son precisamente regulados durante el proceso de reprogramación deben proporcionar nuevas percepciones adicionales de reprogramación fundamental y pluripotencia . Además, debido a que pueden existir inclusive mayores riesgos ocultos (por ejemplo, genética sutil y/o anormalidades epigenéticas podrían ser generados o seleccionados durante el proceso de reprogramación) impuesto por la baja eficiencia y baja cinética de reprogramación, identificación de nuevas moléculas pequeñas para mejorar la reprogramación ilustrada nuevamente en este estudio siempre será de un alto valor hacia un procedimiento más seguro, más fácil y más eficiente para la generación iPSC humana. (5) Finalmente, este coctel nuevo y de molécula pequeña más potente para la reprogramación validó la optimización química paso a paso y selección de estrategia presentada 1 en la presente como una aproximación productiva hacia las :células madre pluripotentes puramente inducidas de forma !química finales. Además, el hallazgo de que las diferentes moléculas pequeñas que modulan el mismo objetivo/mecanismos podrían tener efectos significativamente diferentes en la reprogramación en un contexto diferente, ej emplificado¡ por A-83-01 's y NaB's con actividades de mejoramiento de reprogramación mejor en los queratinocitos humanos, ¡sugiere la importancia de la optimización "individualizada" y en el tratamiento con diferentes regímenes para el contéxto de reprogramación específico.
Cultivo de células Los queratinocitos epidermales humanos normales j (Lonza) fueron mantenidos en el medio de cultivo de queratinocito (KCM, Lonza) . Las células endoteliales de vena umbilical' humano (HUVECs, Millipore) fueron mantenidos en un medio completo EndoGRO-VEGF (HCM, CHEMICON) . Los ESCs e¡ hiPSCs humanos fueron cultivados en células alxmentadoras ; MEF en medios de cultivos ESC humanos convencionales (hESCM: DMEM/F12, 15% reemplazo del suero Knockout, 1% Glutamax, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% penicilina/estreptomicina, ,0.1 mM de ß-mercaptoetanol y 10 ng/ml bFGF) . Todos los productos de cultivos de células fueron de Invitrogen/Gibco BRL excepto en donde se menciona.
Producción de lentivirus Los sobrenadantes de lentivirus fueron producidos y í cultivados como se describió previamente (Yu, J.
Science 318:1917-1920 (2007)) . Los plásmidos usados producción de lentivirus incluye pSin-EF2-Puro-hOCT , pSin2- EF2-Puro-hSOX2 , pLove-mKlf4 , pLove-m yc, el plásmido de empacado psPAX2 y el plásmido de codificación de envoltura pMD2.G (Yu, J. et al., Science 318:1917-1920 (2007) y Li, W. et al., Stem Cells 27:2992-3000 (2009)) .
Reprogramación de NHEKs Los NHEKs fueron cultivados en una placa de cultivo de tejido y transducidas 3 veces (3-4 horas cada transducción) con sobrenadantes de lentivirus recientemente producidos. 1,000,000 de NHEKs transducidas fueron inoculadas ten los i rayos x irradiados de células alimentadoras CF1 MEF j en una I I placa de 100 mm y cultivado en KC y tratado con 5 µ? de PS48, 0.25 mM de NaB (Stemgent) y 0.5 µ? PS48, 0.25 mM; de NaB y 0.5 µ de A-83-01 por otras dos semanas.
Enseguida los medios de cultivo de células fueron cambiados para hESCM y se adicionó con 5 µ? de PS48, 0.25 mM de NaB, 0.5 µ de A-83-01 y 0.5 µ? de PD0325901 (Stemgent) por cuatro semanas adicionales. Los mismos queratinocitos infectados OCT cultivados en los medios sin químicos fueron usados como un control. El cultivo fue separado por Accustase (Millipore) y tratados con 1 µ? de Thiazovivin (Stemgent) en el primer día después de la separación. Las colonias iPSC I tiñieron positivas por el anticuerpo Alexa Fluor 555 Ratón anti-humano TRA-1-81 (BD Pharmingen) fueron recolectadas para la expansión en células alimentadoras en hESCM y cultivadas rutinariamente .
Reprogramación de HUVECs Los HUVECs fueron cultivados en una placa de cultivo de tejido y tranducido 2 veces (4-6 horas cada transducción) con sobrenadantes lentivirus producidos recientemente. 200,000 HUVECs tranducidos fueron inoculados en una placa de 100 mm cubierta con gelatina, cultivada en HCM, y tratada con 5 µ? de PS48, 0.25 mM de NaB y 0.5 µ? de A-83-01 por 2 semanas, seguido por el cambio de volumen medio de los hESCM y suplementando con 5 µ? de PS48, 0.25 mM de µ? de A-83-01 y 0.5 µ? de PD0325901 por 1-2 adicionales. Las colonias iPSC teñidas positivas por el anticuerpo Alexa Fluor 555 Ratón anti-Humano TRA-1-81 fueron recolectadas para la expansión en células alimentadoras en hESCM y cultivadas I rutinariamente. El cultivo fue separado por Accutase y tratado con µ? Thiazovivin en el primer día después de la separación .
Diferenciación in vitro La diferenciación in vitro de los hiPSCs fueron efectuados por el método (EB) del cuerpo embrioide estándar.
En resumen, las hiPSCs fueron disociadas por Accutase (Millipore ) , cultivado en placas de 6 pozos de anexión ultra- bajos por 8 días y enseguida transferidos a placas de 6 pozos cubiertas con Matrigel en un medio de diferenciación. Las células fueron fijadas para los análisis inmunocitoquimicos o cultivadas para pruebas de RT-PCR ocho días después. Medio de diferenciación: DMEM/F12, 10% FBS, 1% Glutamax, í% de aminoácidos no esenciales, 1% penicilina/estreptomicina, 0.1 mM ß-mercaptoetanol .
Tinción de fosfatasa alcalina y ensayo de Inmunocitoquimica Se efectúo tinción de fosfatasa alcalina de acuerdo con el protocolo del fabricante usando el kit de detección de fosfatasa alcalina (Stemgent) . El ensayo de inmunocitoquimica estándar fue efectuado como se reportó previamente (Li, W. et al., Stem Cells 27:2992-3000 (2009)) . Los anticuerpos primarios usados pueden encontrarse en la tabla 3. Los anticuerpos secundarios fueron Alexa Fluor 488 burro anti-ratón o anti-conejo IgG (1:1000) ( Invitrogen) . Los núcleos fueron visualizados por tinción DAPI (Sigma-Aldrich) , Las imágenes fueron capturadas usando un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U.
Análisis de expresión de genes por RT-PCR y qRT-PCR Para el análisis RT-PCR y qRT-PCR, el ARN total fue extraído a partir de los iPSCs humanos usando el RNeasy Plus ini Kit en combinación con QIAshredder (Qiagen) . El primer filamento de transcripción inversa fue efectuado con 2 µg de ARN usando iScript™ cDNA Synthesis Kit (BioRad) . La expresión de los marcadores de pluripotencia fue analizado por RT-PCR usando Platinum PCR SuperMix (Invitrogen) . La expresión de los marcadores específicos de linaje después de la diferenciación fue analizada por qRT-PCR usando iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) . Los iniciadores pueden encontrarse en la tabla 2. ; i Análisis de microarreglo | La expresión Beadchip Ref-8_v3 humana (Illumiria, CA, USA) fue usada para hibridizaciones de microarreglo para examinar la expresión de genes global de células NHEKsj, hiPSC y hES. El cARN etiquetado con Botina-16-UTP fue sintetjizado a partir de 500 ng de ARN total con el kit de amplificación ARN Illumina TotalPrep (Ambion AMIL1791, Foster City, CA; USA) .
La mezcla de hibridización que contiene 750 ng de cARN amplificado etiquetado fue preparado de acuerdo con Illumina BeadStation 500* System Manual (Illumina, San Diego, CA, USA) usando los reactivos suministrados y solución de tinción GE Healthcare Streptavidin-Cy3. La hibridización a la expresión Beadchip Ref-8_v3 humana fue por 18 h a 55 °C en un BeadChip Hyb Wheel. El arreglo fue escaneado usando el illumina i BeadArray Reader. Todas las muestras fueron preparadas en dos i réplicas biológicas. El procesamiento y análisis de lós datos ? de microarreglo fueron efectuados con el software Illumina i BeadStudio. Los datos fueron substraídos para el fondo y normalizados usando la opción de rango invariante.
Secuenciamiento genómico de bisulfato | Los ADNs genómicos fueron aislados usando el ' Kit de Aislamiento de ADN no Orgánico (Millipore) y tratados con el Kit de Metilacion Dorada EZ Research Corp., Orange, CA) . Los ADNs tratados enseguida fueron usados como plantillas para amplificar las secuencias i de interés. Los iniciadores usados para la amplificación del fragmento promotor 0CT4 y NANOG se indican en la tablaj 2. Los fragmentos resultantes fueron clonados usando el TOPO TA Cloning Kit para secuenciamiento ( Invitrogen) y secuenciádos . i Genotipado de hiPSCs El genotipado de las lineas hiPSC fue efectuado; usando RT-PCR de ADN genómico con incitadores específicos (T¡abla 2; Yu, J. et al., Science 318:1917-1920 (2007) y Li, . ¡et al., Stem Cells 27:2992-3000 (2009)).
I Formación tera oma Las líneas hiPSC fueron cosechadas al usar 0:05% de Tripsina-EDTA. Cinco millones de células fueron inyectadas bajo las cápsulas de riñon de ratones SCID (n=3) . Después de 4-6 semanas, los teratomas bien desarrollados | fueron cosechados, fijados y enseguida histológicamente analizados en las instalaciones centrales de histología TSRI.
Tabla 2 Iniciadores usados Tabla 3 Anticuerpos primarios aplicados Tabla 4 Sumario de los experimentos de reprogramación NHEKs, Queratinocitos ; HUVECs, células endoteliales , queratinocitos epidermales humanos adultos; AFDCs, células derivadas del fluido amniótico. Concentración química í usada : PD, 0.5 µ? de PD0325901; A83, 0.5 µ? de A-83-01; PS48, 5 µ? de PS48; VPA, 0.5mM de ácido valpróico; NaB, 0.25 | mM de butirato de sodio; Par, 2 µ? de Parnate; CHIR, 3 ? µ? de CHIR99021. reprogramación inducida por cuatro factores j o tres í facrtores, NHEKs fueron inoculados a una densidad de 100,000 células transducidas por 10 cm de de plato y las colonias positivas fueron contadas cuatro semanas después; para reprogramación inducida por dos factores, los NHEKs fueron i I inoculados a una densidad de 100,000 células transducidas por 10 cm de placa y las colonias positivas fueron contadis seis semanas después; para una reprogramación inducida ¡por un i factor, los NHEKs y AHEKs fueron inoculados a una densidad de 1, 000, 000 de células transducidas por 10 cm de cajaj y las Tabla 5 Caracterización de lineas de células humanas establecidas .
Aquellas líneas de células caracterizadas j fueron expandidas a largo plazo por más de 20 pasajes kjajo la condición de cultivo hESC convencional y ! además i caracterizadas para - la expresión marcadora j y la pluripotencia; mientras que otras líneas de ¡células establecidas fueron almacenadas en los pasajes 5 ó 6. Las entradas en blando indican no determinado.
Tabla 6 Análisis de huella digital de ADN en iPSCs inducidos por OCT4 y lineas de células parentales Quince repeticiones de tándem polimórfico (STR) loci ADN y la amelogenina del marcador cromosoma sexo fueron investigados.
Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos anteriormente en la presente son únicamente para propósitos ilustrativos y que las varias modificaciones o cambios en vista de lo mismo serán sugeridas por los expertos en \ el arte y serán incluidas dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes-, y solicitudes de patente : citadas en la presente se incorporan en la presente como referencia j en su totalidad para todos los propósitos. j Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a cabo la citada invención es el que resulta claro de la pjresente descripción de la invención. j

Claims (16)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Una composición, caracterizada porque comprende: un inhibidor quinasa tipo receptor activina 5 (ALK5); un inhibidor quinasa MAP/ERK ( EK) ; y un inhibidor quinasa Rho (ROCK) .
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un inhibidor glucógeno sintasa quiansa 3 (GSK3) .
3. La composición de conformidad con la i i reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un inhibidor de histona deacetilasa (HDAC) .
4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el inhibidor ALK3 es un A-83-01 ó SB431542.
5. La composición de conformidad con la reivindicación i 1, caracterizada porque el inhibidor MEK es PD0325901.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el inhibidor ROCK tiene la estructura: en donde, L2 es alquileno Ci-C10 sustituido o no sustituido; y es un entero de 0 a 3; z es un entero de 0 a 5; X es -N=, -CH= o -CR5=; R1 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido; R3, R4 y R5 son independientemente -CN, -S(0)nR6, -NR7R8, -C(0)R9, -NR10-C (0) R11, -NR12-C(0)-OR13, -C (0) NR14R15, -NR16S (0) 2R17, -0R18, -S(0)2NR19, alquilo sustituido! o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un entero de 0 a 2, en donde si z es mayor a 1, dos porciones R3 son opcionalmente unidas para formar un cicloalquilo 142 sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido; y R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 R15 R16 R17 R18 w R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido; : i i o un racemato, diastereómero, tautómero, o un Isómero geométrico de los mismos o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
7. El inhibidor ROCK de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque L2 es metileno; | X es N= o CH=; R1 es hidrógeno; o y y z son 0.
8. El inhibidor ROCK de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque L2 es metileno; X es N= o CH=; R1 es hidrógeno; y y y z son 0.
9. El inhibidor ROCK de conformidad con la reivindicación . 6, caracterizado porque el ' inhibidor ROCK tiene la estructura:
10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque. comprende una o más ¡células mamiferas .
11. Un método in vitro o ex vivo para inducir células mamiferas no pluripotentes a células madre pluripotentes inducidas, caracterizado porque comprende: introducir al menos un factor de transcripción seleccionado del grupo que consiste de: Oct-3/4, Klf4, Sox2, y c-Myc en las células no pluripotentes; y poner en contacto las células no pluripotentes con un inhibidor ALK5, un inhibidor MEK, y un inhibidor ROCK; bajo condiciones suficientes para inducir las ¡células madre pluripotentes . !
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, i caracterizado porque introducir al menos un factor de transcripción en las células no pluripotentes comprende i I introducir un polinucleótido que codifica el al menos un factor de transcripción en las células no pluripotentes. i
13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque introducir al menos un factor de I transcripción en las células no pluripotentes en contacto las células no pluripotentes con que comprende la secuencia aminoácida del al me'nos un I polipéptido de factor de transcripción. I
14. El método de conformidad con la reivindicacjión 11, caracterizado porque además comprende poner en contacto las células no pluripotentes con un inhibidor GSK3. ¡ j
15. El método de conformidad con la reivindicación 11, i caracterizado porque además comprende poner en contabto las i células no pluripotentes con un inhibidor HDAC. j
16. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el inhibidor ROCK tiene la estructura: (II) en donde, L2 es alquileno C1-C10 sustituido o no sustituido; y es un entero de 0 a 3; z es un entero de 0 a 5; X es -N=, -CH= o -CR5=; R1 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; J i R3, R4 y R5 son independientemente -CN, -S(0)nR6, -NR7R8, -C(0)R9, -NR10-C (0) R11, -NR12-C(0) -0R13, -C (0) NR14R15, -NR16S (0) 2R17, -0R18, -S(0)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un entero de 0 a 2, en donde si z es mayor a 1, dos porciones R3 son opcionalmente unidas para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo j sustituido o no sustituido; y < Rs, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o j no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo no sustituido; o un racemato, diastereómero, tautómero, o un isómero geométrico de los mismos o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
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