JP2018520688A - Ｐｄ−ｌ１発現造血幹細胞およびその使用 - Google Patents

Ｐｄ−ｌ１発現造血幹細胞およびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2018520688A
JP2018520688A JP2018502807A JP2018502807A JP2018520688A JP 2018520688 A JP2018520688 A JP 2018520688A JP 2018502807 A JP2018502807 A JP 2018502807A JP 2018502807 A JP2018502807 A JP 2018502807A JP 2018520688 A JP2018520688 A JP 2018520688A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hsc
cells
population
modified
hscs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2018502807A
Other languages
English (en)
Inventor
パウロ フィオリーナ
パウロ フィオリーナ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Childrens Medical Center Corp
Original Assignee
Childrens Medical Center Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Childrens Medical Center Corp filed Critical Childrens Medical Center Corp
Publication of JP2018520688A publication Critical patent/JP2018520688A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/113—Acidic fibroblast growth factor (aFGF, FGF-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/17—Angiopoietin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/91—Heparin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本明細書に開示される態様は、人工改変造血幹細胞（HSC）、人為的にプロスタグランジンE2（PGE2）で刺激されたHSC、これらのHSCを含む組成物、自己免疫疾患および障害の処置のためならびに免疫系を抑制するためにこれらの改変HSCを使用する方法を提供する。特に、人工改変HSCまたはPEG2刺激HSCは、表面マーカーであるプログラム細胞死1リガンド1（PD-L1）を発現する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、2015年7月21日に出願された米国仮出願第62/194,969号の恩典を主張し、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。
配列表
本願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含んでおり、その全体を参照により本明細書に組み入れる。2016年7月15日に作成されたこのASCIIコピーは、701039-082611-PCT_SL.txtという名前が付けられ、2,286バイトのサイズである。
背景
免疫学的アプローチは、これまでのところ、自己免疫疾患の処置において成功していない。例えば、自己免疫性1型糖尿病（T1D）の長期的処置において。T1Dにおけるベータ細胞の破壊を停止または遅延させるために相当な努力がなされているが、依然として成功に至っていない。歴史的に、T1Dの処置を目的とするアプローチは、わずかな数の対象をインスリン非依存的にしたにすぎない。Diabetes Control and Complications Trial（DCCT）は、T1D個体におけるグルコース制御の改善およびβ細胞機能の保護が糖尿病の合併症の発症率を低下させることを実証している。
自己免疫性糖尿病の処置に幹細胞が使用されている。間葉系幹細胞（MSC）は、脂質生成、軟骨形成および骨形成分化の能力を有する線維芽細胞様非造血系前駆細胞である。MSCは、それらの免疫調整特性およびそれらのインスリン産生細胞への分化能から、自己免疫性糖尿病にとって有望な治療上の選択肢である。研究は、BALB/c-MSC処置高血糖NODマウスの88％において糖尿病の短期的好転を示した。しかし、NOD-MSCで処置したNODマウスは、高血糖のままであった。さらなる報告は、遺伝子背景同一のNOR-MSCによる処置が、処置されたNODマウスにおいてより強力かつ長期的に高血糖症を好転させることを示し（それぞれ、88％および62％の短期的および長期的好転）、これにより自己免疫性糖尿病におけるハプロ同一MSCの利用可能性が示唆された。このデータに基づき、米国においてJDRFによりおよびOsiris Corporationにより臨床試験が開始されたが、1年間の追跡に関する暫定未公開結果は期待外れであった。さらに、主としてMSCの潜在的発癌性形質転換に関連する安全性の懸念が、臨床状況下でのそれらの使用を制限し得る（Moufida Ben Nasr et al., (2015), "The rise, fall and resurgence of immunotherapy in type 1 diabetes. Pharmacological Research", 98:31-38（非特許文献1））。
造血幹細胞（HSC）移植は、T1Dの長期的処置において見込みのある結果をもたらすことが報告されている。しかし、蓄積されている臨床データは、成功が、長期的なインスリン非依存性およびその状態を有する限定的な集団に限定的であることを示している。HSCは、免疫調節特性を有し、それ自体が中枢および末梢免疫寛容を誘導することができるため、処置ソリューションを提供すると考えられる。2003年、Voltarelli et al. 2007(JAMA, 297:1568-76)（非特許文献2）は、サイモグロブリンおよびシクロホスファミドの併用計画を用いた自己HSC移植（AHSCT）の安全性および効果を評価するため、（T1D）に関するフェーズI/II試験を開始した。最新の分析は、平均追跡期間30ヶ月の23名の処置患者のうちの20名が、1年を超えてインスリンフリーとなったことを報告した。しかし、上記研究において、同時投与された免疫抑制剤の効果とHSCを通じた免疫調節のメカニズムの間を区別することは困難である。
以前に報告されたものと同様のプロトコルを用いてAHSCTで処置された65名の新たに診断されたT1D個体における多角的分析からの報告は、処置された対象のほぼ60％においてインスリン非依存性が達成されたことを示した。しかし、様々な副作用が記録され、このことはこれが選択されたT1D個体のみに対する治療法であることを示唆している。
さらに、これらの研究で使用されたAHSCTプロトコルは、成人向けに設計され、T1Dを患った小児対象向けではなく、したがってAHSCTは、この処置から利益を享受し得る十分に定義された個体群に対してのみ検討され得るものである。
HSCは、免疫調節特性を有する。前臨床研究は、T細胞除去骨髄由来CD34+幹細胞が、亜致死的に照射されたマウスにおいてMHC障壁を突破すること、およびマウスHSCが、エフェクター細胞を除去し得ることを実証した。この効果は、カスパーゼ阻害剤の添加によって打ち消され、このことは除去に基づくメカニズムを示唆している。ヒトHSCに関して、ヒトCD34+集団が、強力な拒否活性（veto activity）を有し、それらの抗原に対する細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の前駆体を中和することが示された。
その原理に基づき、T1Dが新たに診断された対象においてβ細胞の喪失を防ぐためのさらなる免疫学的ストラテジーを発見することを目的とする研究が開始された。それ以来、膵島自己抗体に対する寛容を再成立させる（そしてβ細胞の機能を保護する）ための現実的かつ安全な免疫学的アプローチに関する研究が続けられている。
Moufida Ben Nasr et al., (2015), "The rise, fall and resurgence of immunotherapy in type 1 diabetes. Pharmacological Research", 98:31-38 Voltarelli et al. 2007, JAMA, 297:1568-76
概要
本開示の態様は、プログラム細胞死1リガンド1（PD-L1）発現造血幹細胞（HSC）、これらの細胞を作製する方法ならびに自己免疫疾患、例えば1型糖尿病（T1D）の処置のためおよび対象における免疫系の抑制のためにこれらの細胞を使用する治療法を提供する。例えば、治療法は、臓器または骨髄移植後に、および対象が、例えば1型糖尿病（T1D）において、PD-L1+発現HSCの生成に関して欠陥を有する場合に、有用である。本開示は、プロスタグランジンE2（PGE2）処置によってまたは核酸の形質導入後に細胞においてPD-L1発現を促進するためにPD-L1タンパク質をコードする核酸の外因性コピーを用いた形質導入によって刺激されたPD-L1+発現HSCを提供する。
1型糖尿病（T1D）マウスモデルおよびヒトT1D患者は、PD-L1を発現するHSCを少数しか有さず、これらのHSCは少量のPD-L1しか発現しない。失われたPD-L1の補充は、T1DのマウスモデルにおいておよびT1D対象において、移植された膵島移植片の生存性を延ばす免疫寛容を促進する。
本開示は、PGE2刺激HSCが免疫寛容を促進し、T1Dのマウスモデルにおいて移植された膵島移植片の生存性を延ばすことを提供する。PGE2刺激HSCは、ここで、PGE2刺激の前にPD-L1を発現するよう再プログラムされる。PGE2刺激HSCはまた、ここで、PGE2刺激の前により多くのPD-L1を発現するよう再プログラムされる。このHSCを通じた免疫寛容は、プログラム細胞死1（PD-1）経路を通じて起こる。プログラム細胞死1受容体（PD-1）は、活性化されたT細胞において見出され、プログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1、B7-H1としても公知）は、他の細胞、例えばHSCにおいて発現される。受容体／リガンドであるPD-L1/PD-1の相互作用は、T細胞の細胞傷害活性を不活性化し、免疫系の阻害および寛容をもたらす。
さらに、本開示は、NODマウスにおける抗PD-1 mAbであるPIM2のインビボ投与が糖尿病の発症を遅らせ、かつ膵島同種移植片拒絶反応も遅らせることを提供する。NODマウスは、ヒトT1Dのマウスモデルである。ヒトがT1Dを発症する高い危険を有する場合、PD-L1+細胞の投与はまたT1Dの発症を遅らせることができる。さらに、本開示は、HSCにおけるPD-L1発現が、（a）例えばレンチウイルスシステムまたは鳥ウイルスシステムまたはアデノ随伴ウイルスシステムを通じた、PD-L1 cDNAの過剰発現、および（b）PGE2中でのHSCのエクスビボ培養、すなわち、PGE2との接触によって増加させることができることを提供する。
したがって、一態様において、HSCにおけるPD-L1 cDNAの外因性コピーの過剰発現によって生成される改変PD-L1+発現HSCを提供することが、本開示の目的である。cDNAの外因性コピーは、HSCに導入またはトランスフェクトされる。
一態様において、PGE2との接触またはPGE2による刺激によってPD-L1+発現HSC集団を生成するエクスビボ方法を提供することが、本開示の目的である。本発明者らは、特定の条件下で、PGE2が、PD-L1を低発現するT1D由来の不良HSCにおいてさえも、HSCにおけるPD-L1の内因的発現を刺激することを見出した。
一態様において、PD-L1 cDNAの外因性コピーの過剰発現によってPD-L1+発現HSC集団を生成するエクスビボ方法を提供することが、本開示の目的である。
一態様において、本明細書に記載されるPD-L1+発現HSCを使用することによって自己免疫疾患を処置するまたは免疫系を抑制する方法を提供することが、本開示の目的である。
したがって、一態様において、その細胞がPD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するまたはHSCがその細胞におけるPD-L1発現を刺激するよう本明細書に記載されるPGE2によってエクスビボ刺激されている改変HSC集団が、本明細書に提供される。
一態様において、対象において自己免疫疾患または障害の予防および処置に使用するため、対象において免疫応答を抑制するのに使用するため、T1Dを発症する危険を有する対象においてT1Dの発症を遅らせるのに使用するため、対象において同種組織／臓器の拒絶反応を予防するまたは遅らせるのに使用するため、ならびに対象（成人および小児T1D患者）においてT1Dを処置するのに使用するための改変HSC集団が、本明細書に提供される。一態様において、改変HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する。改変HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有さない非改変細胞と比較してより多くのPD-L1を発現する。別の態様において、改変HSCは、その細胞におけるPD-L1発現を刺激するよう、本明細書に記載される方法を通じてPGE2によってエクスビボ刺激される。一態様において、PGE2刺激後には、その細胞集団内により多くのPD-L1発現細胞が存在する。別の態様において、PGE2刺激細胞は、刺激前と比較して、刺激後により多くのPD-L1を発現する。
一態様において、対象において自己免疫疾患または障害の予防および処置のため、対象において免疫応答を抑制するため、T1Dを発症する危険を有する対象においてT1Dの発症を遅らせるため、対象において同種組織／臓器の拒絶反応を予防するまたは遅らせるのに使用するため、ならびに対象（成人および小児T1D患者）においてT1Dを処置するための医薬の製造に使用するための改変HSC集団が、本明細書に提供される。一態様において、改変HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する。別の態様において、改変HSCは、その細胞におけるPD-L1発現を刺激するよう、本明細書に記載される方法を通じてPGE2によってエクスビボ刺激される。
一態様において、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する、本明細書に記載される改変HSCの集団を含む組成物が、本明細書に提供される。
一態様において、本明細書に記載される改変HSCを含む、対象に移植するため、自己免疫疾患または障害を予防および処置するため、対象において免疫応答を抑制する／減少させるため、T1Dを発症する危険を有する対象においてT1Dの発症を遅らせるのに使用するため、対象において同種組織／臓器の拒絶反応を予防するまたは遅らせるのに使用するため、ならびに成人および小児対象においてT1Dを処置するのに使用するための組成物であって、HSCが改変され、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するかまたはHSCがその細胞におけるPD-L1発現を刺激するよう本明細書に記載される方法を通じてPGE2によってエクスビボ刺激される組成物が、本明細書に提供される。いくつかの態様において、HSCは、PGE2およびステロイド、例えばデキサメタゾンの両方でエクスビボ刺激される。
一態様において、対象への移植に使用するため、自己免疫疾患または障害を予防および処置するため、対象において免疫応答を抑制する／減少させるため、T1Dを発症する危険を有する対象においてT1Dの発症を遅らせるのに使用するため、対象において同種組織／臓器の拒絶反応を予防するまたは遅らせるのに使用するため、ならびに成人および小児対象においてT1Dを処置するのに使用するための医薬の製造における本明細書に記載される改変HSCを含む組成物であって、HSCが改変され、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するかまたはHSCがその細胞におけるPD-L1発現を刺激するよう本明細書に記載される方法を通じてPGE2によってエクスビボ刺激される組成物が、本明細書に提供される。いくつかの態様において、HSCは、PGE2およびステロイド、例えばデキサメタゾンの両方でエクスビボ刺激される。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、HSCは、PD-L1を発現する。別の態様において、HSCは、PD-L1発現の増加を示す。さらに別の態様において、HSCの集団は、PD-L1+発現細胞の比率の増加、例えば少なくとも1倍の増加を示す。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、核酸は、コピーDNA（cDNA）である。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、核酸は、ゲノムDNAである。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、核酸は、細胞のゲノムに組み込まれる。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、核酸は、ベクターを通じてHSCに導入される。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、鳥ウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスである。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、HSCは、哺乳動物細胞である。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、本明細書に記載されるベクターによる改変または記載されるPGE2による刺激の前に、HSCが、骨髄、臍帯、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯血、胎盤血または末梢血から取得される。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、HSCは、動員末梢血から取得される。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、HSCは、健常な個体に由来する。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、HSCは、診断された疾患もしくは障害を有する個体または臓器もしくは骨髄移植レシピエントである個体に由来する。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、HSCは、新たにT1Dを患っていると診断された個体に由来する。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、HSCは、新たにT1Dに関連する自家自己抗体、例えばGAD65自己抗体および膵島抗原2自己抗体を有することが検出された個体に由来する。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、診断された疾患または障害は、自己免疫疾患または障害である。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、自己免疫疾患または障害は、T1Dである。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、細胞は、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入前に、またはPD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入後に、またはPD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入前および後の両方で、エクスビボ培養される。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、細胞は、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入前に、またはPD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入後に、またはPD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入前および後の両方で、凍結保存される。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、細胞は、使用、例えば自己免疫疾患の処置における使用または対象における免疫応答もしくは免疫系の計画的／意図的な抑制のための使用の前に、凍結保存される。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、改変HSC集団は、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成するようHSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルを接触させる工程を含む方法によって生成される。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、この方法は、ベクターとの接触によって得られた改変細胞を拡大させるためにエクスビボ培養する工程をさらに含む。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、この方法は、改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立する工程をさらに含む。
HSC集団またはHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、この方法は、非改変細胞と比較してPD-L1+発現細胞の数が少なくとも1倍増加していることを確立する工程をさらに含む。
記載されるHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、この組成物は、少なくとも1つの追加の免疫抑制療法剤または薬物をさらに含む。
記載されるHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、この組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。担体は、好ましくは細胞または組織培養培地ではない。
記載されるHSC集団を含む組成物のいずれか1つの一態様において、この組成物は、血清または血漿をさらに含む。
一態様において、HSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルを接触させ、それによって核酸の外因性コピーをHSCに導入し、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程を含む、改変PD-L1+発現HSC集団を生成するエクスビボ方法が、本明細書に提供される。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、この方法は、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとの接触によって得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程をさらに含む。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、この方法は、改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立する工程をさらに含む。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、この方法は、非改変細胞と比較してPD-L1+発現細胞の数が少なくとも1倍増加していることを確立する工程をさらに含む。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、HSCのサンプルは、骨髄、臍帯、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯血、胎盤血または末梢血から取得される。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、HSCのサンプルは、動員末梢血、例えば顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）によって動員された動員末梢血から取得される。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、HSCのサンプルは、健常な個体から取得される。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、HSCのサンプルは、診断された疾患もしくは障害を有する個体から取得される。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、診断された疾患または障害は、自己免疫疾患または障害である。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、自己免疫疾患または障害は、T1Dである。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、HSCのサンプルは、T1Dを患っていると新たに診断された個体から取得される。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、HSCのサンプルは、T1Dに関連する自家自己抗体、例えばGAD65自己抗体および膵島抗原2自己抗体を有することが新たに検出された個体から取得される。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、鳥ウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスである。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、核酸はcDNAである。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、核酸はゲノムDNAである。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、核酸は、細胞のゲノムに組み込まれる。
一態様において、本明細書に記載される造血幹細胞を含む組成物を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。
一態様において、HSC集団を提供する工程、HSCのサンプルを10μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で約60分間エクスビボ接触させる工程、60分後にPGE2を除去し、それによってPD-L1+発現HSC集団を生成する工程、PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象における免疫応答を調節する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を予防もしくは処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。
一態様において、HSC集団を提供する工程、HSCのサンプルを10μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で約60分間エクスビボ接触させる工程、60分後にPGE2を除去し、それによってPD-L1+発現HSC集団を生成する工程、PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象における免疫応答を調節する工程を含む、その必要がある対象においてT1Dの発症を遅らせる方法が、本明細書に提供される。一態様において、対象は、T1Dを発症する危険を有する。一態様において、対象は、T1Dに関して無症状であり、高血糖症ではない。例えば、対象の血糖レベルは、11.1 mmol/l（200 mg/dl）を超えない。一態様において、対象は、T1Dに関連する自家自己抗体、例えばICA、IAAおよび1A-2Aを有することが最近検出された者である。
一態様において、HSC集団を提供する工程、HSCのサンプルを10μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で約60分間エクスビボ接触させる工程、60分後にPGE2を除去し、それによってPD-L1+発現HSC集団を生成する工程、PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象における免疫応答を調節する工程を含む、その必要がある対象において同種組織／臓器拒絶反応を予防するまたは遅らせる方法が、本明細書に提供される。一態様において、対象は、臓器または組織移植レシピエントである。
一態様において、HSC集団を提供する工程、HSCのサンプルを0.1μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で少なくとも24時間エクスビボ接触させる工程、PGE2を除去し、それによってPD-L1+発現HSC集団を生成する工程、PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象において免疫応答を調節する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を予防もしくは処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。
一態様において、HSC集団を提供する工程、HSCのサンプルを0.1μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で少なくとも24時間エクスビボ接触させる工程、PGE2を除去し、それによってPD-L1+発現HSC集団を生成する工程、PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象において免疫応答を調節する工程を含む、その必要がある対象においてT1Dの発症を遅らせる方法が、本明細書に提供される。一態様において、対象は、T1Dを発症する危険を有する。一態様において、対象は、T1Dに関して無症状であり、高血糖症ではない。例えば、対象の血糖レベルは、11.1 mmol/l（200 mg/dl）を超えない。一態様において、対象は、T1Dに関連する自家自己抗体、例えばICA、IAAおよび1A-2Aを有することが最近検出された者である。
一態様において、HSC集団を提供する工程、HSCのサンプルを0.1μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で少なくとも24時間エクスビボ接触させる工程、PGE2を除去し、それによってPD-L1+発現HSC集団を生成する工程、PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象において免疫応答を調節する工程を含む、その必要がある対象において同種組織／臓器拒絶反応を予防するまたは遅らせる方法が、本明細書に提供される。一態様において、対象は、臓器または組織移植レシピエントである。
一態様において、HSC集団を提供する工程、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルをエクスビボ接触させる工程、接触により得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程、PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象において免疫応答を調節する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を予防もしくは処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。
一態様において、HSC集団を提供する工程、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルをエクスビボ接触させる工程、接触により得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程、PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象において免疫応答を調節する工程を含む、その必要がある対象においてT1Dの発症を遅らせる方法が、本明細書に提供される。
一態様において、HSC集団を提供する工程、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルをエクスビボ接触させる工程、接触により得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程、PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象において免疫応答を調節する工程を含む、その必要がある対象において同種組織／臓器拒絶反応を予防するまたは遅らせる方法が、本明細書に提供される。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、自己免疫障害は、T1Dである。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、提供されるHSCの集団は、レシピエント対象にとって自己である。一態様において、対象は、T1Dを患っていると新たに診断された者である。別の態様において、対象は、T1Dに関連する自家自己抗体、例えばGAD65自己抗体および膵島抗原2自己抗体を有することが新たに検出された者である。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、提供されるHSC集団は、レシピエント対象にとって非自己かつ同種である。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、提供されるHSC集団は、レシピエント対象にとって非自己かつ異種である。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、提供されるHSC集団は、骨髄、臍帯、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯血、胎盤血または末梢血から取得される。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、提供されるHSC集団は、動員末梢血から取得される。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、提供されるHSC集団は、健常な個体から取得される。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、提供されるHSC集団は、診断された疾患もしくは障害を有する個体から取得される。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、診断された疾患または障害は、自己免疫疾患または障害である。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、自己免疫疾患または障害は、T1Dである。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、提供されるHSC集団は、T1Dを患っていると新たに診断された個体から取得される。
記載されるエクスビボ方法のいずれか1つの一態様において、提供されるHSC集団は、T1Dに関連する自家自己抗体、例えばGAD65自己抗体および膵島抗原2自己抗体を有することが新たに検出された個体から取得される。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、提供されるHSC集団は、少なくともCD34+である。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、提供されるHSC集団は、少なくともCD34+およびLin-である。
記載される方法のいずれか1つの別の態様において、提供されるHSC集団は、CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-およびC-kit/CD117+である。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、提供されるHSCの集団は、CD34+で選択されたHSCである。別の態様において、HSCは、CD38に対して負の選択をされたものである。すなわち、CD38lo/-細胞のみが選択される。別の態様において、HSCは、CD34+およびCD38lo/-について選択される。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、PGE2刺激HSCはまた、レシピエントへの移植に使用する前に、ステロイド、例えばデキサメタゾンでエクスビボ処置される。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、レシピエント対象への移植の前に、HSC集団は、過剰なPGE2を除去した後に凍結保存されるまたはPD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターを用いたトランスフェクションの後のHSC集団の拡大のためのエクスビボ培養の後に凍結保存される。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、レシピエント対象への移植の前に、HSCの集団は、過剰なPGE2を除去した後またはPD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターを用いたトランスフェクションの後に、エクスビボで培養により拡大させられる。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、この方法は、自己免疫疾患もしくは障害を有するレシピエント対象または臓器もしくは骨髄移植レシピエントである個体を特定する工程をさらに含む。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、この方法は、自己免疫疾患もしくは障害を有するレシピエント対象または臓器もしくは骨髄移植レシピエントである個体を選択する工程をさらに含む。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、この方法は、免疫応答もしくは免疫系の抑制の必要のあるレシピエント対象または臓器もしくは骨髄移植レシピエントである個体を特定する工程をさらに含む。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、この方法は、免疫応答もしくは免疫系の抑制の必要のあるレシピエント対象を選択する工程をさらに含む。例えば、臓器もしくは骨髄移植レシピエントである個体。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、この方法は、T1Dを発症する危険を有する対象を特定する工程をさらに含む。例えば、T1Dに関連する自家自己抗体、例えばGAD65自己抗体および膵島抗原2自己抗体を有することが新たに検出された対象。
本明細書に記載されるHSC集団、エクスビボ方法、組成物または処置方法の一態様において、HSCにおいてPD-L1発現を刺激するPGE2は、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2（dmPGE2）である。
定義
本明細書で使用される場合、PD-L1をコードすることに関連して使用される「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド（DNA）またはリボヌクレオチド（RNA）およびそれらのポリマー（「ポリヌクレオチド」）を表す。特に限定されていない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。それ以外のことが示されていない限り、個々の核酸分子／ポリヌクレオチドはまた、黙示的に、それらの保存的に改変された変種（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列ならびに明示的に示されている配列を包含する。詳細に、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第3の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)）。ヌクレオチドは、以下の標準的な省略表示によって、それらの塩基により示される：アデニン（A)、シトシン（C)、チミン（T)およびグアニン（G)。
いくつかの態様において、本明細書で使用される場合、「遺伝子操作（された）」「遺伝子改変（された）」または「改変（された）」という用語は、細胞内での遺伝物質の付加、欠失または改変を表す。いくつかの態様において、「遺伝子改変（された）細胞」および「改変（された）細胞」という用語は、言い換え可能に使用される。他の態様において、「改変（された）細胞」は、刺激前と比較してPD-L1を発現する薬理学的にPGE2により刺激されたHSCまたは薬理学的にPGE2により改変されたHSCを表す。
一態様において、「非改変HSC」という用語は、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有さないHSCを表す。別の態様において、「非改変HSC」という用語は、エクスビボでPGE2によって薬理学的に刺激されていないHSCを表す。
本明細書で使用される場合、コード核酸との関係で言う「外因性コピー」は、HSCのゲノムで見出される遺伝子のオリジナルコピーではないコード核酸の追加コピーを表す。コード核酸の追加コピーは、典型的に、細胞に導入される。例えば、追加コピーは、ベクターで保有される。追加コピーは、細胞のゲノムに組み込まれ得る。
本明細書で使用される場合、PD-L1をコードする核酸との関係で言う「コードする（coding）」または「コードする（encoding）」という用語は、その核酸が、タンパク質、例えば細胞表面タンパク質PD-L1についての遺伝子暗号を指定する指令または情報をその中に含んでいることを意味する。コード核酸内の指令または情報は、コードされるタンパク質に転写および翻訳され得る。
本明細書で使用される場合、「cDNA」という用語は、逆転写酵素によって触媒される反応においてメッセンジャーRNA（mRNA）鋳型から合成される二本鎖DNAである相補的DNAを表す。cDNAは、イントロンを欠いている。
本明細書で使用される場合、PD-L1をコードするゲノムDNAは、細胞のゲノムで見出される遺伝子のコピーを意味する。PD-L1をコードするゲノムDNAは、コードエクソンに加えて、イントロンおよび他の調節配列を含むであろう。
本明細書で使用される場合、PD-L1をコードする核酸との関係で使用される「組み込まれる」という用語は、その核酸が細胞のゲノムまたはゲノム配列に挿入されることを意味する。組み込まれると、組み込まれた核酸は、細胞の元のゲノムと同じ様式で複製され、娘の分裂細胞に分割される。
本明細書で使用される場合、PD-L1ベクターをコードする核酸の外因性コピーを有することに関連して使用される「ベクター」という用語は、広義的に、宿主細胞への外因性核酸の送達または異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸コンストラクトを表す。一態様において、ベクターは、ウイルスまたは非ウイルスであり得る。他の態様において、ベクターは、外因性核酸をコードする任意のプラスミド、ファージミドまたはウイルスを表す。他の態様において、この用語はまた、ビリオンまたは細胞への核酸の移動を容易にする非プラスミド、非ファージミドおよび非ウイルス化合物、例えばポリリジン化合物等を含むものとみなされる。ベクターは、細胞への核酸またはその変異体の送達のための送達手段として適切なウイルスベクターであり得、またはベクターは、同じ目的に適した非ウイルスベクターであり得る。細胞および組織へのDNAの送達のためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は、当技術分野で周知であり、例えばMa et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12744-12746)に記載されている。ウイルスベクターの例は、組み換えワクシニアウイルス、組み換えアデノウイルス、組み換えレトロウイルス、組み換えアデノ随伴ウイルス、組み換え鳥ポックスウイルス等を含むがこれらに限定されない（Cranage et al., 1986, EMBO J. 5: 3057-3063;1994年8月18日公開の国際特許出願第WO94/17810号；1994年10月27日公開の国際特許出願第WO94/23744号）。非ウイルスベクターの例は、リポソーム、DNAのポリアミン誘導体等を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、当技術分野で認識されているその意味にしたがって使用される。それは、ウイルス起源の少なくとも1つの要素を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージされ得る核酸ベクターコンストラクトを表す。ベクターは、インビトロまたはインビボのいずれかでDNA、RNAまたは他の核酸を細胞に移動させる目的で使用され得る。多くの形態のウイルスベクターが、当技術分野で公知である。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、緩やかに進行する疾患を引き起こすレトロウイルスの一群（または属）を表す。この群に含まれるウイルスは、ヒト後天性免疫不全症候群（AIDS）の病因物質であるHIV（ヒト免疫不全ウイルス；1型HIVおよび2型HIVを含む）；ヒツジにおいて脳炎（ビスナ）または肺炎（マエディ）を引き起こすビスナ・マエディ、ヤギにおいて免疫不全、関節炎および脳症を引き起こすヤギ関節炎脳炎ウイルス；ウマにおいて自己免疫性溶血性貧血および脳症を引き起こすウマ感染性貧血ウイルス；ネコにおいて免疫不全を引き起こすネコ免疫不全ウイルス（FIV）；ウシにおいてリンパ節症、リンパ球増加症およびおそらく中枢神経系感染を引き起こすウシ免疫不全ウイルス（BIV）；ならびに類人霊長類において免疫不全および脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス（SIV）を含む。これらのウイルスによって引き起こされる疾患は、長い潜伏期間および長期化する経過により特徴付けられる。通常、ウイルスは単球およびマクロファージに潜伏感染し、そこから他の細胞に伝播する。HIV、FIVおよびSIVはまた、Tリンパ球、すなわちT細胞に容易に感染する。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルス起源の少なくとも1つの要素を含む核酸ベクターコンストラクトを有するベクターを表す。本開示のレンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1、HIV-2）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）およびウマ感染性貧血ウイルス（EIAV）を含むがこれらに限定されない。これらのベクターは、治療における使用に関するそれらの安全性を向上させるようならびに適切な発現エレメントおよび治療遺伝子を含むよう、当技術分野で認識されている技術を用いて構築および操作され得る。
本明細書で使用される場合、本明細書における「自己免疫疾患」または「自己免疫疾患または障害」という用語は、個体自身の組織もしくは共分離体（co-segregate）に起因しかつそれらに向けられた疾患もしくは障害またはその兆候もしくはそこから生じる状態である。
自己免疫関連疾患および障害は、そうでなければ自家または自己物質として知られている、通常体内に存在する物質（自己抗原）および組織に対する過剰および／または異常な身体の免疫応答により引き起こされる。この調節異常の炎症反応は、マクロファージ、顆粒球および／またはTリンパ球による過剰反応を引き起こし、その過剰反応は異常な組織損傷および細胞死をもたらす。その後の機能喪失が、炎症による組織損傷に付随する。
自己抗原は、本明細書で使用される場合、この病的な免疫応答を誘起する内因性タンパク質またはそのフラグメントである。自己抗原は、自己免疫疾患において免疫系による主な（または主な）攻撃対象となる、通常哺乳動物内で見出される任意の物質またはその一部であり得る。この用語はまた、哺乳動物に投与されたときに自己免疫疾患の特徴を有する状態を誘導する抗原性物質を含む。加えて、この用語は、免疫優勢エピトープまたは自己抗原の免疫優勢エピトープ領域から本質的になるペプシンサブクラスを含む。誘導された自己免疫状態における免疫優勢エピトープまたは領域は、その疾患を誘導する自己抗原全体の代わりに使用できる自己抗原のフラグメントである。自己免疫疾患を患ったヒトにおいて、免疫優勢エピトープまたは領域は、自己免疫攻撃下で組織または臓器に特異的であり、相当な比率の（例えば、絶対多数とは限らないが、多数の）自己免疫攻撃性T細胞によって認識される抗原のフラグメントである。
自己免疫疾患に関連することが知られている自己抗原は、ミエリンタンパク質と脱髄疾患、例えば多発性硬化症および実験的自己免疫性骨髄炎；コラーゲンと関節リウマチ；インスリン、プロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65（GAD65）；膵島細胞抗原（ICA512；ICA12）とインスリン依存性糖尿病を含む。
多くの自己免疫関連疾患および炎症状態における共通の特徴は、炎症促進性CD4+ T細胞の関与である。これらのT細胞は、炎症性Th1型サイトカインの放出を担っている。Th1型として特徴付けられるサイトカインは、インターロイキン2（IL-2）、γ-インターフェロン、TNFαおよびIL-12を含む。そのような炎症促進性サイトカインは、自己組織を破壊する多くの症例で、免疫応答を刺激するよう作用する。T細胞応答の抑制に関連するサイトカインは、Th2型であり、IL-10、IL-4およびTGF-βを含む。Th1およびTh2型T細胞は、免疫原に対する応答において同一の抗原受容体を使用し得；前者は刺激応答を、後者は抑制応答を生じることが見出されている。
一態様において、本明細書で使用される場合、「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、赤血球、リンパおよび骨髄の3つの造血系統のすべての血液細胞型を生成する幹細胞を表す。これらの細胞型は、骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系（T細胞、B細胞、NK細胞）を含む。一態様において、「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、以下の細胞表面マーカーを有する幹細胞を表す：CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-およびC-kit/CD117+。一態様において、「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、少なくともCD34+である幹細胞を表す。一態様において、「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、少なくともCD38lo/-である幹細胞を表す。一態様において、「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、少なくともCD34+およびCD38lo/-である幹細胞を表す。一態様において、「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、少なくともlin-である幹細胞を表す。一態様において、「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、少なくともCD34+およびlin-である幹細胞を表す。一態様において、「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、少なくともCD34+、CD38lo/-およびlin-である幹細胞を表す。一態様において、「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、少なくともCD34+およびC-kit/CD117+である幹細胞を表す。一態様において、「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、少なくともCD34+、CD38lo/-およびC-kit/CD117+である幹細胞を表す。別の態様において、本明細書で使用される場合、「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、造血幹・前駆細胞（HSPC）を含む。
一態様において、本明細書で使用される場合、「前駆細胞」という用語は、後に特定の細胞型、例えば血液細胞、皮膚細胞、骨細胞または毛髪細胞に成熟（分化）する能力を有する未成熟または未分化の細胞を表す。前駆細胞はまた、同様に未成熟または未分化であるより多くの前駆細胞を生成するよう増幅することができる。
本開示の細胞は、自己（autologous/autogeneic）（「自家」）または非自己（「非自家」、例えば同種、同系または異種）であり得る。「自己」は、本明細書で使用される場合、同一対象由来の細胞を表す。
「同種」は、本明細書で使用される場合、比較するとその細胞と遺伝的に異なる同一種の細胞を表す。
「同系」は、本明細書で使用される場合、比較するとその細胞と遺伝的に同一である異なる対象の細胞を表す。
「異種」は、本明細書で使用される場合、比較するとその細胞と異なる種の細胞を表す。好ましい態様において、本開示の細胞は、同種である。
「単離された細胞」は、インビボ組織および臓器から取得され、細胞外マトリクスを実質的に伴わない細胞を表す。
「対象」は、本明細書で使用される場合、造血系、免疫系およびHSCを有する任意の動物を含む。一態様において、対象は、本明細書に記載されるHSCおよび本明細書で想定されている方法により処置することができる免疫系の疾患、障害または状態、例えば自己免疫疾患の症状を示す任意の動物を表す。適切な対象（例えば、患者）は、研究動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモット）、家畜（farm animal）および家畜（domestic animal）またはペット（例えば、ネコまたはイヌ）を含む。非ヒト霊長類および、好ましくは、ヒト患者が含まれる。典型的な対象は、本明細書に記載されるHSCおよび本明細書の他箇所で開示されている方法により調節することができる異常な量の（「正常」または「健常」対象よりも少ないまたは多い量の）1つまたは複数の生理学的活性を示す動物を含む。別の態様において、対象は、ヒトである。
一態様において、本明細書で使用される場合、「処置」または「処置する」は、疾患または病理学的状態の症状または病理に対する任意の有益または望ましい効果を含み、処置される疾患または状態の1つまたは複数の測定可能なマーカーの最小限の減少さえも含み得る。別の態様において、処置は、任意で、その疾患もしくは状態の症状の減少もしくは改善、またはその疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかに関連し得る。「処置」は、必ずしもその疾患もしくは状態またはそれらに付随する症状の完全な根絶または治癒を示すとは限らない。
本明細書で使用される場合、「T1Dに関連する自家自己抗体」は、1型糖尿病におけるベータ細胞の自己免疫のマーカーである自己抗体：膵島細胞抗体（ICA、ベータ細胞内の細胞質タンパク質に対するもの）、グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する抗体（GAD-65）、インスリン自己抗体（IAA）およびタンパク質チロシンホスファターゼに対するIA-2Aを表す。
本明細書で使用される場合、一態様において、「薬学的に許容される」という用語は、動物における、より具体的にはヒトにおける使用に関して、連邦または州政府の規制当局によって承認されていることまたは米国薬局方もしくは他の広く認知されている薬局方に列挙されていることを意味する。詳細に、それは、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／危険比に見合い、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適している化合物、物質、組成物および／または剤形を表す。
「担体」という用語は、それと共に治療剤を投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤または媒体を表す。そのような薬学的担体は、滅菌液、例えば水および石油、動物、植物または合成起源のそれらを含む油、例えばピーナツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油等であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内投与されるときに好ましい担体である。生理食塩水溶液および水性デキストロース・グリセロール溶液もまた、特に注射可能な溶液のための、液体担体として使用され得る。適当な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石灰粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。組成物は、望まれる場合、微量の湿潤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁物、乳化物、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出製剤等の形態をとり得る。組成物は、従来的な結合剤および担体、例えばトリグリセリドを用いて、坐剤として配合され得る。経口製剤は、標準的な担体、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含み得る。適切な薬学的担体の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed. (Mack Publishing Co., 1990)に記載されている。配合は、投与様式に合わせるべきである。
一態様において、「薬学的に許容される担体」は、組織培養培地を含まない。別の態様において、「薬学的に許容される担体」は、血清または血漿を含む。血清または血漿は、ヒトまたは対象レシピエントに由来し得る。
「有効量」という用語は、外因性核酸を用いた細胞の形質導入の成功を提供するまたは細胞におけるPD-L1発現の刺激の成功を提供するのに十分な、それぞれ、生物学的に活性なベクター粒子の量またはPGE2濃度を意味する。
本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、所望の部位へのHSCの少なくとも部分的な局在化を達成するまたはHSCの増幅、生着および／もしくはPD-L1発現子孫細胞への分化を達成する方法または経路による、レシピエント対象への本明細書に記載されるHSCまたは本明細書に記載されるHSCを含む組成物の投入を表す。HSCまたはHSCを含む組成物は、対象において効果的な処置をもたらす任意の適当な経路によって投与され得る。
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」または「含む（comprises）」という用語は、本開示にとって必須である方法およびその各要素を指して使用されるが、それが必須であるかどうかによらず、未指定の要素を含む余地を残している。「含む」の使用は、限定ではなく内包を示している。
図1は、PD-L1の遺伝子除去が、インビトロでHSCの免疫調節特性を打ち消すことを示している。 図2Aおよび2Bは、末梢PD-L1+ HSCの比率が、B6と比較してNODマウスにおいて低下することを示している。図2Cは、PCRによるNODマウスにおけるPD-L1発現欠陥の確認を示している。 図2Dおよび2Eは、HSCにおけるマウスPD-L1の欠陥を、インビトロで薬理学的アプローチによって好転させることができることを示している。8日間のインビトロ培養の後、PD-L1+ KLS細胞の比率の増加が顕著であった。 図3Aおよび3Bは、PD-L1+ HSCが、健常個体と比較してT1D個体において数的に少ないことを示している。図3Cは、T1Dを患った個体のHSCにおける、PCRによるPD-L1欠陥の確認を示している。 図3Dおよび3Eは、HSCにおけるヒトPD-L1欠陥を、インビトロで薬理学的アプローチによって好転させることができることを示している。7日間のインビトロ培養の後、PD-L1+ HSCの比率の増加が顕著であった。 図4Aおよび4Bは、PIM2とのPD-L1/PD-1の架橋がNODマウスにおいて糖尿病の発症を遅らせること（図4A）および（BALB/cからB6への）膵島移植後の膵島の生存性を延ばすこと（図4B）を示している。 PD-L1 cDNA保有レンチウイルスを用いて形質導入されたHSCが高度にPDL1+となること、および新たな糖尿病NODマウスに養子移植すると、血糖を正常化することを示している。NOD未処置マウスは、＞250 mg/dlの高血糖を維持した。 PD-L1 cDNA保有レンチウイルスを用いて形質導入されたHSCが高度にPDL1+となること、および新たな糖尿病NODマウスに養子移植すると、血糖を正常化することを示している。NOD未処置マウスは、＞250 mg/dlの高血糖を維持した。 図6は、HSCにおけるPDL1発現に対するPGE2の効果を示している。 図7は、マウスPD-L1形質導入KLS細胞が、NODマウスにおいて高血糖症を元通りにしたことを示している。 図8Aは、遺伝子が示差的に発現されることを示すNODおよびB6マウスの骨髄由来のSca-1+Lineage-c-kit+ HSCのマイクロアレイ分析をまとめた表である。図8Bは、正常なB6対照マウスと比較してNODの骨髄由来のSca-1+Lineage-c-kit+ HSCにおいてPD-L1の発現が減少していることを示すウェスタンブロットである。図8Cは、正常なB6対照マウスに対する、NODの骨髄由来のSca-1+Lineage-c-kit+ HSCにおけるPD-L1の相対的発現をまとめたヒストグラムであり、これらはウェスタンブロット分析および定量測定によって得られたデータである。白抜きのヒストグラムはNODマウスであり、塗りつぶしのヒストグラムはC57BL/6マウスである。図8Dは、正常なB6対照マウスに対する、NODの骨髄由来のSca-1+Lineage-c-kit+ HSCにおけるPD-L1の相対的mRNA発現をまとめたヒストグラムである。白抜きのヒストグラムはNODマウスであり、塗りつぶしのヒストグラムはC57BL/6マウスである。図8Eおよび8Fは、正常なB6対照マウスとの比較で、NODの骨髄由来のPD-L1+ KLS: Sca-1+Lineage-c-kit+細胞のFACSドットプロットおよびヒストグラムを示している。白抜きのヒストグラムはNODマウスであり、塗りつぶしのヒストグラムはC57BL/6マウスである。図8Gおよび8Hは、正常なB6対照マウスとの比較で、NODの骨髄由来のPD-L1+CD41-CD48-CD150+細胞のFACSドットプロットおよびヒストグラムを示している。白抜きのヒストグラムはNODマウスであり、塗りつぶしのヒストグラムはC57BL/6マウスである。図8Iおよび8Kは、正常なB6対照マウスとの比較で、NODの骨髄由来のPD-L1+ KL: Lineage-c-kit+細胞のFACSドットプロットおよびヒストグラムを示している。白抜きのヒストグラムはNODマウスであり、塗りつぶしのヒストグラムはC57BL/6マウスである。図8Jおよび8Lは、正常なB6対照マウスとの比較で、NODの骨髄由来のPD-L1+CD244-CD48-CD150+細胞のFACSドットプロットおよびヒストグラムを示している。白抜きのヒストグラムはNODマウスであり、塗りつぶしのヒストグラムはC57BL/6マウスである。 図9Aは、野生型（WT）KL細胞としても知られている、PD-L1レンチウイルスを用いた形質導入の前のNODマウスから抽出されたKL細胞におけるPD-L1発現のフローサイトメトリー分析を示している。図9Bは、Tg細胞と命名された、PD-L1レンチウイルスを用いた形質導入の後のNODマウス由来のKL細胞におけるPD-L1発現のフローサイトメトリー分析を示している。図9Cは、PD-L1レンチウイルスを用いた形質導入の後のNODマウス由来のKL細胞におけるPD-L1発現の増加をまとめたヒストグラムを示している。図9Dは、DCの存在下でBDC2.5ペプチドによって刺激され、KL細胞およびPD-L1.Tg KL細胞と共培養されたNOD-BDC2.5 TCRtgマウスから抽出されたCD4+ T細胞によるINFγ産生のフローサイトメトリー分析をまとめたヒストグラムを示している。図9Eは、DCの存在下でBDC2.5によって刺激され、PD-L1遮断／中和Abの存在下でKL細胞およびPD-L1.Tg KL細胞と共培養されたNOD-BDC2.5 TCRtgマウスから抽出されたCD4+ T細胞によるINFγ産生のフローサイトメトリー分析を示している。図9Fは、KL細胞およびPD-L1.Tg KL細胞と共培養されたときの、可溶性抗CD3／抗CD28によって刺激されたNODマウスから抽出されたCD4+ T細胞によるINFγ産生のフローサイトメトリー分析をまとめたヒストグラムを示している。図9Gは、PD-L1遮断／中和Abの存在下でのKL細胞およびPD-L1.Tg KL細胞との共培養の下で、可溶性抗CD3／抗CD28によって刺激されたNODマウスから抽出されたCD4+ T細胞によるINFγ産生のフローサイトメトリー分析を示している。 図9H〜9Kは、3x106個の非形質導入KL細胞またはPD-L1.Tg KL細胞の投与後の血中グルコースレベルによって示される、非形質導入KL細胞（図9K)およびPD-L1.Tg KL細胞（図9I）で処置された高血糖NODにおける糖尿病の好転のグラフ表示である。好転は、ドキシサイクリンによって達成された（図9J)；（図9H）対照として使用した未処置グループ。 図10A〜10Fは、健常対照ヒト対象（HC）との比較で、T1D患者由来のヒトHSCにおけるPD-L1欠陥を示している。図10A〜10Bは、健常対照（HC）由来（図10A）および1型糖尿病個体（T1D)由来（図10B）の選択されたCD34+ HSCにおけるPD-L1発現を示す代表的なフローサイトメトリー分析である。図10Cは、T1DにおけるPD-L1発現の欠陥を示す、図10A〜10Bのフローサイトメトリー分析に関する棒グラフを示している。図10Dは、HCとの比較でT1D個体のCD34+ HSCにおけるPD-L1発現の減少を示す代表的なウェスタンブロット分析である。図10Eは、HCとの比較でT1D個体のCD34+ HSCにおけるPD-L1発現の減少を示すウェスタンブロット分析をまとめたヒストグラムである。図10Fは、HCとの比較でT1D個体のCD34+ HSCにおけるPD-L1発現に関するRT-PCRデータをまとめたヒストグラムである。 図11は、高血糖症発症後のNODマウスにおける高血糖症の正常化に対するPGE2およびデキサメタゾンで二重刺激されたKL細胞の効果を示している。各線は、試験NODマウスの血糖を表している。KL細胞は、高血糖症の発症直後のレシピエントマウスへの移植前にエクスビボで刺激した。 図12は、PGE2刺激HSCで処置されたマウスが膵島同種移植片拒絶反応を遅らせることを示している。同様のストラテジーを、同種移植片拒絶反応を予防および処置するために広く使用することができる。
詳細な説明
それ以外の説明がなされていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって広く理解されている意味と同じ意味を有する。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬等に限定されず、したがってそれらは変更され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を説明する目的しか有さず、本開示の範囲を限定することは意図されておらず、それはもっぱら特許請求の範囲によって定義される。
分子生物学における一般用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition、Merck Sharp & Dohme Corp.刊行、2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)（merckmanuals.comの2015年度デジタルオンライン版）；Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine、Blackwell Science Ltd.刊行、1999-2012 (ISBN 9783527600908)；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.刊行、1995 (ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann、Elsevier刊行、2006；Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)；Lewin's Genes XI、Jones & Bartlett Publishers刊行、2014 (ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385)、Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005；およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)において見出すことができ、これらの内容はすべて、全体として参照により本明細書に組み入れられる。さらに、文脈によりそれ以外のことが要求されない限り、単数形の用語は複数のそれを含み、複数形の用語は単数のそれを含む。
それ以外のことが言及されていない限り、本開示は、例えば、Michael R. Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986)； Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Fred M. Ausubel et al. ed., John Wiley and Sons, Inc), Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et al., ed. John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, 発行元: Wiley-Liss; 第5版 (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol.57, Jennie P. Mather and Davis Barnes編, Academic Press, 第1版, 1998), Methods in Molecular biology, Vol. 180, Transgenesis Techniques by Alan R. Clark編, 第2版, 2002, Humana PressおよびMethods in Molecular Biology, Vo.203, 2003, Transgenic Mouse, Marten H. Hofker and Jan van Deursen編の、当業者に公知の標準的手順を用いて実施され、これらはすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬等に限定されず、したがってそれらは変更され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を説明する目的しか有さず、本開示の範囲を限定することは意図されておらず、それはもっぱら特許請求の範囲によって定義される。
実施例以外ではまたはそれ以外のことが示されていない限り、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数値は、すべての例において、「約」という用語によって修飾されることが理解されるべきである。「約」という用語は、百分率と共に使用される場合、±1％を意味し得る。
特定されているすべての特許および刊行物は、解説および開示の目的で、例えば、本開示に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を解説および開示する目的で、明示的に参照により本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、単に、本願出願日以前の開示物として提供されるにすぎない。これに関するいかなる事情も、先行開示が存在するためまたは任意の他の理由で本発明者らがそのような開示よりも前の日付を主張する資格を有さないことの承認であるとみなされるべきではない。これらの文献の日付に関する言及または内容に関する表示はすべて、出願人が入手し得た情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確性に関する承認をなすものではない。
本開示は、改変された造血幹細胞（HSC）、改変HSCを含む組成物、自己免疫疾患および障害を処置するためならびに免疫系を調節するためにこれらの改変HSCを使用する方法に関する。改変HSCは、プログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1)を、その改変前にPD-L1を発現しなかった場合に発現し、または改変HSCは今、その改変前と比較してより多くのPD-L1を発現する。改変は、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを形質導入し、形質導入細胞においてPD-L1タンパク質の発現を促進することによるかまたはPGE2による刺激を用いたHSCの薬理学的再プログラムによる。
本明細書に記載される本開示は、好ましい態様において、ヒトをクローン化するプロセス、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を改変するプロセス、産業もしくは商業目的でのヒト胚の使用またはヒトもしくは動物への医学的利益を実質的にもたらすことなくそれらを苦しめる可能性がある動物の遺伝的同一性を改変するプロセスならびにそのようなプロセスによって誕生する動物に関するものではない。
いくつかの態様において、本開示の態様は、1型糖尿病（T1D）患者のHSCにおけるPD-L1発現の増加がその患者の免疫調節の不良を軽減し得るという発見に基づいている。NODマウスおよびヒトT1D患者は、減少した数のPD-L1発現HSCを有し、そのHSCは、より少ない量のPD-L1を発現する。PD-L1の減少は、マウスおよび患者の免疫調節能力の欠陥に寄与する。このPD-L1欠乏の外部からの補充は、免疫寛容を促進することによって免疫調節不良の修復を助ける。
T1Dにおけるベータ細胞の破壊を停止または遅延させるために相当な努力がなされているが、依然として成功に至っていない。間葉系幹細胞および自己造血幹細胞移植（AHSCT）を用いた幹細胞ベースの治療は、NODマウスおよびT1Dヒトにおいて短期間のインスリン非依存性しかもたらさず、かつそれをその疾患を患った選択された集団に対してしかもたらさない。幹細胞ベースの治療はいずれも、小児患者に適用可能でなかった。さらに、特定の幹細胞ベースの治療には、特に小児患者において、潜在的な発癌の懸念がある。
したがって、本願において解決すべき課題は、成人および小児患者の両方の、より大きなT1D患者集団に適用可能である治療、ならびに患者を長期インスリン非依存性にする治療を提供することである。
これまでに、NODマウスにおけるHSCの使用に関する前臨床研究は不足しており、それらは主として同種HSCを用いている。β-galトランスジェニックドナー由来の同種HSCをNODマウスに移植すると、すべての処置マウスにおいて糖尿病の発生が首尾よく予防されるが、好転は、完全な造血系の移植であるにもかかわらず、50匹のマウスのうち1匹でしか得られなかった。ヒトがT1Dを発症する高い危険を有する場合も、おそらくPD-L1+細胞の投与はその疾患の発症を遅らせることができる。本発明者らは、HSCの免疫学的特性が免疫調節分子PD-L1（CD274またはB7-H1としても公知）の発現と結びついている可能性があることを示した。PD-L1は、主として活性化されたT細胞において発現される抑制性受容体であるプログラム死1受容体（PD-1）のリガンドである。PD-L1とPD-1の間の架橋は、T細胞の活性化を阻害し、それらの消耗／アポトーシスを促す。PD-1ノックアウトマウスは、糖尿病を促進し、PD-1/PD-L1シグナルは、T細胞アネルギーを誘導する抑制性シグナルを活性化する。
本発明者らは、健常ヒトと比較してT1D患者においてはPD-L1を発現するCD34+ HSCが少数しか存在しないことを見出した。免疫フローサイトメトリーによって得られたこの発見はさらに、RT-PCRによって確認された。健常ヒトにおける14.5％ PD-L1+/CD34+ HSCと比較して、ヒトT1D患者においては約3％ PD-L1+/CD34+ HSCである。PD-L1は、免疫系における重要な免疫調節分子である。
さらに、本発明者らは、T1D患者由来のHSCがそれらの免疫調節特性に欠陥を有していることを見出した。抗CD3/CD28 ELISPOT免疫アッセイで試験したところ、T1Dを患ったこれらの患者由来のHSCは、免疫応答を抑制する能力が低かった。
したがって、T1Dもしくは他の自己免疫障害を患った患者由来のHSCにおけるPD-L1発現の増加もしくは刺激、および／またはこれらの個体へのPD-L1発現HSCの提供は、自己免疫疾患および障害を処置する上で、ならびに免疫系を調節するために有用な治療ストラテジーとなる。本発明者らは、T1D患者由来のHSCをプロスタグランジンE2（PGE2）と共にエクスビボインキュベートすることにより、HSCにおいてPD-L1の発現が刺激されることを発見した。加えて、PD-L1をコードする外因性核酸をHSCにトランスフェクトすることにより、トランスフェクト／形質導入されたHSCにおいてPD-L1の発現が促進される。
PD-L1+を発現する造血幹細胞（HSC）およびその組成物
したがって、一態様において、プログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）をコードする核酸の外因性コピーを有する改変PD-L1+発現HSC集団を生成するエクスビボ方法であって、HSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルを接触させ、それによって核酸の外因性コピーをHSCに導入し、それによってPD-L1を発現する改変HSC細胞の集団を生成する工程を含む方法が、本明細書に提供される。一態様において、この方法は、得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立する工程をさらに含む。別の態様において、この方法は、ベクターとの接触後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、および／または、得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程をさらに含む。この培養は、治療に利用できる改変細胞の数を拡大させる。一態様において、HSCのサンプルは、記載されるベクターとの接触の前に培養により拡大させられ得る。
一態様において、（a）HSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルを接触させ、それによって核酸の外因性コピーをHSCに導入する工程、および（b）得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程を含む、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する改変PD-L1+発現HSC集団を生成するエクスビボ方法が、本明細書に提供される。一態様において、この方法は、ベクターとの接触後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、および／または、得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程をさらに含む。この培養は、治療に利用できる改変細胞の数を拡大させる。一態様において、HSCのサンプルは、記載されるベクターとの接触の前に培養により拡大させられ得る。
一態様において、（a）HSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルを接触させ、それによって核酸の外因性コピーをHSCに導入する工程、（b）ベクターとの接触によって得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、および（c）得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程を含む、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する改変PD-L1+発現HSC集団を生成するエクスビボ方法が、本明細書に提供される。この培養は、治療に利用できる改変細胞の数を拡大させる。一態様において、HSCのサンプルは、記載されるベクターとの接触の前に培養により拡大させられ得る。
一態様において、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する改変HSC集団が、本明細書に提供される。改変HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有さない非改変細胞と比較してより多くのPD-L1を発現する。
一態様において、HSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルを接触させ、それによって核酸の外因性コピーをHSCに導入し、それによってPD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程を含む方法によって作製される改変HSC集団が、本明細書に提供される。一態様において、HSCのサンプルは、非改変HSCを含む。一態様において、非改変HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有さない。一態様において、この方法は、得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立する工程をさらに含む。別の態様において、この方法は、ベクターとの接触後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、および／または、得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程をさらに含む。培養は、治療に利用できる改変細胞の数を拡大させる。一態様において、HSCのサンプルは、記載されるベクターとの接触前に培養により拡大させられ得る。
一態様において、（a）HSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルを接触させ、それによって核酸の外因性コピーをHSCに導入する工程、および（b）改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程を含む方法によって作製される改変HSC集団が、本明細書に提供される。一態様において、この方法は、ベクターとの接触後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、および／または、得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程をさらに含む。培養は、治療に利用できる改変細胞の数を拡大させる。一態様において、HSCのサンプルは、記載されるベクターとの接触前に培養により拡大させられ得る。
一態様において、（a）HSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルを接触させ、それによって核酸の外因性コピーをHSCに導入する工程、（b）接触によって得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、および（c）改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程を含む方法によって作製される改変HSC集団が、本明細書に提供される。培養は、治療に利用できる改変細胞の数を拡大させるまたは増加させる。一態様において、HSCのサンプルは、記載されるベクターとの接触前に培養により拡大させられ得る。
一態様において、改変HSCは、細胞内にPD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するよう操作された、人工改変細胞である。これらの人工HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有さないHSCと比較してPD-L1を発現する。一態様において、これらの人工HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有さないHSCと比較してより多くのPD-L1を発現する。
別の態様において、（a）HSCのサンプルを10μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で約60分間接触させる工程、（b）接触させた細胞を洗浄して過剰なPGE2を除去する工程、および（c）PGE2で刺激されたHSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成する工程を含む、HSC集団においてPD-L1の発現を刺激するエクスビボ方法が、本明細書に提供される。
一態様において、PGE2刺激HSCは、非PGE2刺激HSCと比較して増加したPD-L1発現を示す。一態様において、PGE2刺激HSCは、非PGE2刺激HSCと比較して少なくとも１％増加したPD-L1発現を示す。他の態様において、PGE2刺激HSCは、非PGE2刺激HSCと比較して少なくとも2％、少なくとも3％、少なくとも5％、少なくとも8％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍高い、少なくとも1000倍高い、またはそれ以上増加したPD-L1発現を示す。
別の態様において、（a）HSCのサンプルを0.1μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で少なくとも24時間接触させる工程、（b）接触させた細胞を洗浄して過剰なPGE2を除去する工程、および（c）PGE2で刺激されたHSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成する工程を含む、HSC集団においてPD-L1の発現を刺激するエクスビボ方法が、本明細書に提供される。
別の態様において、HSCのサンプルを0.1μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で少なくとも24時間接触させ、それによってPD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成する工程を含む、HSC集団においてPD-L1の発現を刺激するエクスビボ方法が、本明細書に提供される。
別の態様において、HSCのサンプルを10μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で約60分間接触させ、それによってPD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成する工程を含む、HSC集団においてPD-L1の発現を刺激するエクスビボ方法が、本明細書に提供される。
上記方法の一態様において、この方法は、接触させた細胞を洗浄して過剰なPGE2を除去する工程をさらに含む。一態様において、この方法は、PGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立する工程をさらに含む。別の態様において、この方法は、PGE2との接触後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程、および／または、PGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後にPGE2刺激HSC細胞をエクスビボ培養する工程をさらに含む。培養は、治療に利用できる改変細胞の数を拡大させる。一態様において、HSCのサンプルは、PGE2との接触前に培養により拡大させられ得る。
別の態様において、（a）HSCのサンプルを10μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で約60分間接触させる工程、および（b）PGE2で刺激されたHSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成する工程を含む、HSC集団においてPD-L1の発現を刺激するエクスビボ方法が、本明細書に提供される。培養は、治療に利用できる改変細胞の数を拡大させる。一態様において、HSCのサンプルは、PGE2との接触前に培養により拡大させられ得る。
別の態様において、（a）HSCのサンプルを0.1μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で少なくとも24時間接触させる工程、および（b）PGE2で刺激されたHSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成し、それによってPD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成する工程を含む、HSC集団においてPD-L1の発現を刺激するエクスビボ方法が、本明細書に提供される。
上記方法の別の態様において、この方法は、PGE2との接触後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程、および／または、PGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程をさらに含む。培養は、治療に利用できる改変細胞の数を拡大させる。一態様において、HSCのサンプルは、PGE2との接触前に培養により拡大させられ得る。
一態様において、（a）HSCのサンプルを10μM濃度のPGE2と37℃で約60分間接触させる工程、（b）接触させた細胞を洗浄して過剰なPGE2を除去する工程、および（c）接触させたHSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現するHSC細胞集団を生成する工程を含む方法によって作製される、PD-L1+発現HSC集団が、本明細書に提供される。
一態様において、（a）HSCのサンプルを0.1μM濃度のPGE2と37℃で少なくとも24時間接触させる工程、（b）接触させた細胞を洗浄して過剰なPGE2を除去する工程、および（c）接触させたHSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現するHSC細胞集団を生成する工程を含む方法によって作製される、PD-L1+発現HSC集団が、本明細書に提供される。
上記方法の別の態様において、この方法は、PGE2との接触後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程、および／または、PGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程をさらに含む。
一態様において、PGE2とのエクスビボまたはインビボまたはインビトロ接触によって内因性PD-L1の発現が増加するよう刺激されたPD-L1+発現HSC集団が、本明細書に提供される。
一態様において、PGE2によって刺激されていないまたはPGE2と接触していない非改変細胞と比較してより多くのPD-L1を発現する改変HSC集団が、本明細書に提供される。
一態様において、HSCのサンプルを10μM濃度のPGE2と37℃で約60分間接触させ、それによってPD-L1を発現するHSC細胞集団を生成する工程を含む方法によって作製される、PD-L1+発現HSC集団が、本明細書に提供される。
一態様において、HSCのサンプルを0.1μM濃度のPGE2と37℃で少なくとも24時間接触させ、それによってPD-L1を発現するHSC細胞集団を生成する工程を含む方法によって作製される、PD-L1+発現HSC集団が、本明細書に提供される。
上記方法またはPD-L1+発現HSC集団の一態様において、この方法は、接触させた細胞を洗浄して過剰なPGE2を除去する工程をさらに含む。一態様において、この方法は、PGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立する工程をさらに含む。別の態様において、この方法は、PGE2との接触後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程、および／または、PGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程をさらに含む。
一態様において、（a）HSCのサンプルを10μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で約60分間接触させる工程、および（b）PGE2で刺激されたHSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成し、それによってPD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成する工程を含む方法によって作製される、PD-L1+発現HSC集団が、本明細書に提供される。
一態様において、（a）HSCのサンプルを0.1μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で少なくとも24時間接触させる工程、および（b）PGE2で刺激されたHSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成し、それによってPD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成する工程を含む方法によって作製される、PD-L1+発現HSC集団が、本明細書に提供される。
上記方法またはPD-L1+発現HSC集団のいくつかの態様において、HSCは、ステロイド、例えばデキサメタゾンとも接触させられる。いくつかの態様において、HSCは、PGE2およびステロイド、例えばデキサメタゾンの両方とエクスビボ接触させられる、すなわち、PGE2およびデキサメタゾンの両方を用いて同時に共刺激される。例えば、0.1μM〜100μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μMまたは100μMのデキサメタゾン。
上記方法またはPD-L1+発現HSC集団の別の態様において、この方法は、PGE2との接触後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程、および／または、PGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程をさらに含む。
本明細書に記載される方法またはPD-L1+発現HSC集団の一態様において、HSCのサンプルは、PGE2の添加／接触の前にPGE2の非存在下でエクスビボ培養される。このエクスビボ培養は、PGE2との接触およびPGE2による刺激に利用できる出発HSCの数を拡大または増加させる。
本明細書に記載される方法またはPD-L1+発現HSC集団の一態様において、PGE2の非存在下でのエクスビボ培養は、PGE2の第1／最初の添加または接触の前に少なくとも48時間行われる。このエクスビボ培養は、PGE2との接触およびPGE2による刺激に利用できる出発HSCの数を拡大または増加させる。
本明細書に記載される方法またはPD-L1+発現HSC集団の一態様において、HSCは、少なくとも24時間、培養下でPGE2と接触させられる。他の態様において、HSCは、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも60時間、少なくとも72時間、少なくとも84時間、少なくとも96時間、少なくとも108時間、少なくとも120時間、少なくとも132時間、少なくとも144時間、少なくとも156時間、少なくとも168時間、少なくとも196時間および24〜196時間の間のすべての中間時間、培養下でPGE2と接触させられる。
別の態様において、HSCは、最大8日間、培養下でPGE2と接触させられる。他の態様において、HSCは、最大3日間、最大4日間、最大5日間、最大6日間および最大7日間、培養下でPGE2と接触させられる。
他の態様において、HSCは、約24時間、約36時間、約48時間、約60時間、約72時間、約84時間、約96時間、約108時間、約120時間、約132時間、約144時間、約156時間、約168時間、約196時間、および24〜196時間の間のすべての中間時間、培養下でPGE2と接触させられる。
一態様において、PD-L1+を発現する本明細書に記載される改変HSC集団を含む組成物が、本明細書に提供される。例えば、改変HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する。一態様において、この組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一態様において、薬学的に許容される担体は、組織培養培地を含まない。
一態様において、本明細書に記載される改変HSC集団および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が、本明細書に提供される。
一態様において、本明細書に記載されるPD-L1+発現HSC集団を含む組成物が本明細書に提供され、ここで該HSCが、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する改変HSCであるかまたはPGE2とのエクスビボ接触によって内因性PD-L1の発現が増加するようエクスビボ刺激される。一態様において、この組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一態様において、薬学的に許容される担体は、組織培養培地を含まない。
一態様において、移植手順と組み合わせて使用するため、または自己免疫疾患もしくは障害の処置において使用するため、または免疫応答を低下もしくは調節するのに使用するための、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有しPD-L1を発現する本明細書に記載される改変HSC集団を含む組成物が、本明細書に提供される。一態様において、この組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一態様において、薬学的に許容される担体は、組織培養培地を含まない。
一態様において、移植手順と組み合わせて使用するため、または自己免疫疾患もしくは障害の処置において使用するため、または免疫応答を低下もしくは調節するのに使用するための、本明細書に記載されるPD-L1+発現HSC集団を含む組成物が本明細書に提供され、ここで該HSCが、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する改変HSCであるかまたはPGE2とのエクスビボ接触によって内因性PD-L1の発現が増加するようエクスビボ刺激される。一態様において、この組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一態様において、薬学的に許容される担体は、組織培養培地を含まない。
一態様において、移植手順と組み合わせて使用するため、または自己免疫疾患もしくは障害の処置において使用するため、または免疫応答を低下もしくは調節するのに使用するための医薬を製造するための、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有しPD-L1を発現する本明細書に記載される改変HSC集団を含む組成物が、本明細書に提供される。一態様において、この組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一態様において、薬学的に許容される担体は、組織培養培地を含まない。
一態様において、移植手順と組み合わせて使用するため、または自己免疫疾患もしくは障害の処置において使用するため、または免疫応答を低下もしくは調節するのに使用するための医薬を製造するための、本明細書に記載されるPD-L1+発現HSC集団を含む組成物が本明細書に提供され、ここで該HSCが、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する改変HSCであるかまたはPGE2とのエクスビボ接触によって内因性PD-L1の発現が増加するようエクスビボ刺激される。一態様において、この組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一態様において、薬学的に許容される担体は、組織培養培地を含まない。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、改変HSCまたはPGE2接触HSCはさらに、各HSCにおけるPD-L1の発現を確立するために分析される。PD-L1発現を決定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば免疫フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（FACS）または当技術分野で公知の免疫アッセイによる、およびRT-PCRによる。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、改変HSCは、PD-L1を発現している。一態様において、ベクターと接触しておらず、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有さない非改変HSCである対照HSCと比較して、PD-L1+発現細胞の数は少なくとも1倍増加する。一態様において、ベクターと接触しておらず、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有さない非改変HSCである対照HSCと比較して、PD-L1+発現細胞の数は最大10倍増加する。
一態様において、改変HSCは、増加した量のPD-L1を発現する。一態様において、ベクターと接触しておらず、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有さない非改変HSCであるHSCである対照HSCと比較して、発現されるPD-L1+の量は少なくとも1倍増加する。一態様において、ベクターと接触しておらず、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有さない非改変HSCである対照HSCと比較して、発現されるPD-L1+の量は最大10倍増加する。
本明細書に記載されるPD-L1+発現HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、PD-L1+発現HSCは、増加した量のPD-L1を発現する。一態様において、PGE2とインキュベートされておらずかつ刺激されていないHSCである対照HSCと比較して、PD-L1+発現HSCの数は少なくとも1倍増加する。一態様において、PGE2と接触／インキュベートされておらず刺激されていないHSCである対照HSCと比較して、PD-L1+発現HSCの数は最大10倍増加する。
一態様において、改変HSCは、対照の非改変HSCを上回る増加したPD-L1発現を示す。
他の態様において、PD-L1+発現細胞の数の増加または発現されるPD-L1の量の増加は、相当する対照の非改変HSCまたは非PGE2刺激細胞よりも少なくとも1％高い、少なくとも3％高い、少なくとも5％高い、少なくとも8％高い、少なくとも10％高い、少なくとも20％高い、少なくとも30％高い、少なくとも40％高い、少なくとも50％高い、少なくとも60％高い、少なくとも70％高い、少なくとも80％高い、少なくとも90％高い、少なくとも1倍高い、少なくとも2倍高い、少なくとも5倍高い、少なくとも10倍高い、少なくとも100倍高い、少なくとも1000倍高い、またはそれ以上である。
プログラム細胞死タンパク質1は、PD-1および分化抗原群279（CD279）としても公知の、ヒトにおいてPDCD1遺伝子によってコードされる受容体タンパク質である。PD-1は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞表面受容体であり、活性化されたT細胞およびプロB細胞において発現される。PD-1は、PD-L1（B7ホモログ1（B7-H1）または分化抗原群274（CD274）としても公知）およびPD-L2の2つのリガンドに結合する。PD-1の2つのリガンドであるPD-L1およびPD-L2は、B7ファミリーのメンバーである。
PD-1およびそのリガンドは、T細胞の活性化を防ぐことにより免疫系の下方調節において重要な役割を果たしている。PD-L1/PD-1の相互作用は、T細胞の細胞傷害性を不活性化させ、免疫系を阻害する。これはさらに自己免疫を減少させ、自己寛容を促進する。PD-1の阻害効果は、リンパ節内の抗原特異的T細胞のアポトーシス（プログラムされた細胞死）を促進すると同時に、制御性T細胞（抑制性T細胞）のアポトーシスを減少させるという二重機構を通じて達成される。
受容体PD-1のリガンドの1つであるPD-L1は、CD274遺伝子（Gene ID: 29126）によってコードされる40 kDaの1型膜貫通タンパク質である。PD-L1の他の省略名は、B7-H、B7H1、PD-L1、PDCD1L1、PDCD1LG1およびPDL1PD-L1である。ヒトCD274遺伝子は、Genome Reference Consortium Human Build 38パッチリリース2（GRCh38.p2）のAssemblyにしたがい、2014年12月5日付けのRefSeqまたはGENBANKアッセンブリアクセッション番号GCF_000001405.28の下で、第9染色体の位置NC_000009.12（5450381..5470567）において見出すことができる。ヒトPD-L1のmRNAは、GENBANKアクセッション番号NM_001267706.1、NM_014143.3、BC113734.1、BC113736.1、BC074984.2およびBC069381.1において見出すことができる。
一態様において、ヒトPD-L1のmRNAは、
Figure 2018520688
のDNA配列を有するmRNAのアイソフォームb前駆体（変種2）である。この変種2は、短い方の転写物であり、短い方のアイソフォームbをコードしている。
一態様において、ヒトPD-L1のmRNAは、
Figure 2018520688
のDNA配列を有するmRNAのアイソフォームa前駆体（変種1）である。変種1は、最長の転写物であり、長い方のアイソフォームaをコードする。
PD-L1は、特定のイベント、例えば妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患および他の疾患状態、例えば肝炎の際に免疫系を抑制する上で重要な役割を果たしている。通常、免疫系は外来抗原に対して反応し、それがリンパ節または脾臓においてある程度蓄積されて、抗原特異的CD8+ T細胞の増殖を誘導する。PD-1受容体／PD-L1またはB7.1受容体／PD-L1リガンド複合体の形成は、リンパ節におけるこれらのCD8+ T細胞の増殖を減少させる抑制シグナルを伝達し、それに加えて、PD-1はまた、遺伝子BCL-2の下方調節によってさらに伝達されるアポトーシスを通じてリンパ節における外来抗原特異的T細胞の蓄積を制御することができる。
PD-L1タンパク質は、LPSおよびGM-CSF処置に応答してマクロファージおよび樹状細胞（DC)において、ならびにTCRおよびB細胞受容体シグナル伝達によりT細胞およびB細胞において上方調節される。PD-L1は、様々な組織および細胞、例えば心臓、肺、胸腺、脾臓、腎臓およびHSCにおいて発現される。PD-L1は、IFN-γ処置により、PA1骨髄腫、P815肥満細胞腫およびB16黒色腫を含む、ほぼすべてのマウス腫瘍細胞株において発現される。
一態様において、PD-L1をコードする核酸は、ヒトPD-L1をコードする。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、PD-L1をコードする核酸は、コピーDNA（cDNA）である。一態様において、PD-L1をコードするcDNAは、mRNAである。一態様において、mRNAは、SEQ ID NO:1または2である。他の態様において、mRNAは、GenBankアクセッション番号NM_001267706.1、NM_014143.3、BC113734.1、BC113736.1、BC074984.2またはBC069381.1由来である。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の別の態様において、PD-L1をコードする核酸は、ゲノムDNAである。一態様において、PD-L1をコードするゲノムDNAは、GenBankアセンブリアクセッション番号GCF_000001405.28由来である。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、核酸は、HSC細胞のゲノムに組み込まれる。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、核酸は、ベクターを通じて細胞に導入される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、鳥ウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスである。
任意の方法の一局面において、レンチウイルスは、1型ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）、2型ヒト免疫不全ウイルス（HIV-2）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（CAEV）、ウマ感染性貧血ウイルス（EIAV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）およびサル免疫不全ウイルス（SIV）からなる群より選択される。
特定の態様において、本明細書で想定されているベクターを用いて形質導入される細胞は、遺伝子改変される。
様々な態様において、本明細書で想定されている遺伝子改変された細胞は、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターを用いてインビトロまたはエクスビボで形質導入され、任意でエクスビボで培養により拡大させられる。形質導入された細胞は、その後、遺伝子療法を必要とする対象に投与される。あるいは、形質導入された細胞は、遺伝子療法を必要とする対象への投与前に凍結保存され得る。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、細胞は、哺乳動物細胞である。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
HSCは、生物の生涯にわたって成熟血液細胞の全レパートリーを生成することができるコミットした造血前駆細胞（HPC）を生成することが知られている。「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、概ね、骨髄系統（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系統（例えば、T細胞、B細胞、NK細胞）ならびに当技術分野で公知の他の系統を含む生物の全血液細胞型を生成する多能性幹細胞を表す（Fei, R., et al., 米国特許第5,635,387号; McGlave, et al., 米国特許第5,460,964号; Simmons, P., et al., 米国特許第5,677,136号; Tsukamoto, et al., 米国特許第5,750,397号; Schwartz, et al., 米国特許第5,759,793号; DiGuisto, et al., 米国特許第5,681,599号; Tsukamoto, et al., 米国特許第5,716,827号を参照のこと）。致死的に照射された動物またはヒトに移植された場合、造血幹・前駆細胞は、赤血球、好中球・マクロファージ、巨核球およびリンパ系造血細胞プールを再生させることができる。
成熟血液細胞は、限られた生存期間を有し、生涯を通して絶えず置き換えられなければならない。血液細胞は、自己再生によって自身を補充する能力も有する非常に少数の多能性HSC集団の増殖および分化によって生成される。HSCは、中胚葉血管芽細胞から生じる多能性、自己再生性の前駆細胞である。HSCは、は、赤血球、リンパおよび骨髄系統から分化したすべての血液細胞を含む、すべての他の血液細胞を生成する血液細胞である。HSCは、生体において、骨髄、末梢血および臍帯血中に存在する。
分化の間に、HSCの子孫は、様々な中間成熟段階を通じて進行し、成熟に達する前に多能性造血前駆細胞および系統コミットした造血前駆細胞を生成する。骨髄（BM）は、ヒトにおいて主要な造血の場であり、正常な条件下で、末梢血（PB)では少数のHSCおよび造血前駆細胞しか見出すことができない。癌の処置において使用される骨髄抑制薬であるサイトカイン（特に、顆粒球・コロニー刺激因子；G-CSF）および造血細胞とBM間質細胞の間の相互作用を妨害する化合物による処置は、多数の幹細胞および前駆細胞を循環に直ちに動員することができる。
「造血前駆細胞」は、この用語が本明細書で使用される場合、骨髄系統（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系統（T細胞、B細胞、NK細胞）を含む全血液細胞型を生成する造血幹細胞系統の細胞を表す。「赤血球系統の細胞」は、接触させる細胞が、最終分化した際に赤血球（erythrocyte）または赤血球（red blood cell; RBC）を形成するよう赤血球生成を起こす細胞であることを示す。そのような細胞は、骨髄造血前駆細胞を起源とする赤血球、リンパおよび骨髄の3つの系統のうちの1つに属する。特定の成長因子および造血微小環境の他の成分に暴露されると、造血前駆細胞は、すべて赤血球系統の中間体である一連の中間分化細胞型を通じてRBCに成熟し得る。したがって、「赤血球系統」の細胞は、この用語が本明細書で使用される場合、造血前駆細胞、原始赤芽球、前赤芽球、赤芽球、後赤血球、網状赤血球および赤血球を含む。
HSCは、造血前駆細胞と同様、増殖することができ、かつ分化したまたは分化可能な娘細胞をさらに生成することができる多数の母細胞を生成する能力を有するより多くの前駆細胞を生成することができる。娘細胞自身も、親の発生能を有する1つまたは複数の細胞を保持しつつ、増殖するようおよびその後に1つまたは複数の成熟細胞型に分化する子孫を生成するよう刺激され得る。「幹細胞」という用語は、特定の環境下で、より特化したまたは分化した表現型に分化する能力または可能性を有し、かつ特定の環境下で、実質的に分化せずに増殖する能力を有する細胞を表す。一態様において、前駆または幹細胞という用語は、胚細胞および組織の多様化が進行するにつれ、その子孫（descendants）（子孫（progeny））が分化によって、例えば完全に独立した特徴を獲得することによって、しばしば異なる方向に特化する、汎用的な母細胞を表す。細胞の分化は、典型的に多くの細胞分裂を通じて起こる複雑なプロセスである。分化した細胞は多能性細胞から生じ得、その多能性細胞自体も多能性細胞から生じる、等である。これらの多能性細胞の各々が幹細胞とみなされ得るが、各々が生じ得る細胞型の範囲は大きく異なり得る。一部の分化した細胞はまた、より高い発生能を有する細胞を生成する能力を有する。そのような能力は、生来的なものであり得、または様々な因子による処置によって人為的に誘導され得る。多くの生物学的な例において、幹細胞はまた、2つ以上の別個の細胞型の子孫を生成することができるという理由で、「多能性」であるが、それは「幹細胞性（stem-ness）」に必要なものではない。自己再生は、幹細胞の定義の別の古典的部分であり、本明細書において使用される場合必須となる。理論上、自己再生は、2つの主要機構のいずれかによって起こり得る。幹細胞は、一方の娘が幹細胞状態を維持し、他方の娘がいくつかの異なる他の特定の機能および表現型を発現するよう、非対称的に分裂し得る。あるいは、集団内の幹細胞の一部は、2つの幹細胞に対称的に分裂し得、それによってその集団全体として一定の幹細胞を維持し、同時にその集団内の他の細胞は、分化した子孫のみを生成する。一般に、「前駆細胞」は、より原始的な（すなわち、完全に分化した細胞よりも発生経路または進行におけるより早期の段階にある）細胞表現型を有する。多くの場合、前駆細胞はまた、有意なまたは非常に高い増殖能を有する。前駆細胞は、その細胞が発生および分化する発生経路および環境に依存して、複数の別個の分化した細胞型または単一の分化した細胞型を生成し得る。
末梢血前駆細胞（PBPC）は、収集の技術的容易さおよび移植に要する時間の短さから、同種および自己移植のための造血前駆細胞およびHSCの好ましい供給源となっている。伝統的に、顆粒球・コロニー刺激因子（G-CSF）は、より多くのPBPCおよび骨髄からの造血前駆細胞の放出を刺激するために使用されている。G-CSFを用いた計画は、通常、健常ドナーからの十分数のPBPCの収集に成功するが、5％〜10％は幹細胞をほとんど動員せず、複数回の多量アフェレーシスまたは骨髄収集が必要となり得る。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、改変前に、HSCのサンプルが骨髄、臍帯、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤血、臍帯血または末梢血から取得される。一態様において、HSCは、骨髄、臍帯、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤血、臍帯血または末梢血から単離される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCのサンプルは、動員された末梢血から取得される。元の場所または貯蔵場所からHSCを動員する方法は、当技術分野で公知である。例えば、サイトカイン、特に顆粒球・コロニー刺激因子（G-CSF）およびHSCと骨髄（BM）間質細胞の間の相互作用を妨害する化合物（例えば、ケモカインCXCR4アンタゴニストであるプレリキサホル）による処置は、多量の造血幹および造血前駆細胞を循環中に直ちに動員し得る。本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の別の態様において、HSCのサンプルは、骨髄、臍帯、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤血、臍帯血もしくは末梢血、または動員末梢血から取得されるCD34+選択細胞である。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCはCD34+細胞である。他の態様において、HSCはCD38lo/-細胞である。他の態様において、HSCはc-kit+細胞である。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは造血前駆細胞である。一態様において、これらの造血前駆細胞はCD34+細胞である。他の態様において、造血前駆細胞はCD38lo/-細胞である。他の態様において、造血前駆細胞はc-kit+細胞である。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは赤血球前駆細胞である。一態様において、これらの赤血球前駆細胞はCD34+細胞である。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは赤血球細胞である。一態様において、これらの赤血球細胞はCD34+細胞である。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、本明細書に記載される核酸の外因性コピーを有するベクターと接触させる前に、CD34+表面マーカーについて選択される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の他の態様において、HSCは、本明細書に記載される核酸の外因性コピーを有するベクターと接触させる前に、CD38lo/-表面マーカーについて選択される。
本明細書に記載される改変HSCの集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、本明細書に記載される核酸の外因性コピーを有するベクターと接触させる前に、c-kit+表面マーカーについて選択される。記載される表面マーカーについての正および負の選択は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば実施例の節に記載される抗CD34免疫磁気ビーズを用いて行われ得る。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、単離されたCD34+ HSCは、本明細書に記載されるPGE2組成物と接触させられるまたは本明細書に記載される核酸の外因性コピーを有するベクターと接触させられる。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、HSCを特徴づける細胞表面マーカー：CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-およびC-kit/CD117+の少なくとも1つを有する。好ましくは、HSCは、これらのマーカーの複数を有する。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-およびC-kit/CD117+である。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCはCD133+である。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、造血前駆細胞はCD133+である。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、赤血球系統の造血前駆細胞は、赤血球系統を特徴づける細胞表面マーカー：CD71およびTer119を有する。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、赤血球系統を特徴づける細胞表面マーカー：CD71およびTer119を有する。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-およびC-kit/CD117+からなる群より選択される細胞表面マーカーの少なくとも1つを有する。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、CD34+、CD59+、Thy1/CD90+およびC-kit/CD117+からなる群より選択される細胞表面マーカーの少なくとも1つについて正選択される。本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の別の態様において、HSCは、CD38lo/-について負選択される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCはのサンプル、健常な個体または対象から取得される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、診断された疾患または障害を有する個体または臓器もしくは骨髄移植レシピエントである個体から取得または単離される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、新たにT1Dと診断された個体から取得または単離される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、診断された疾患または障害は、自己免疫疾患または障害である。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、自己免疫疾患または障害は、T1Dである。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、本明細書に記載される核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCの接触は、少なくとも1回繰り返される。すなわち、本明細書に記載されるウイルスまたはベクターとHSCの最初の第1回接触の後、細胞は洗浄および収集され、次いで洗浄された細胞は、本明細書に記載される核酸分子を有するウイルスまたはベクターと第2回目の接触に供される。これらの細胞はその後、2回目の洗浄に供され、そして収集される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の他の態様において、接触は、最初の第1回接触の後、少なくとも2回繰り返される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、単離または収集されたHSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入の前および／または後にエクスビボ培養される。一態様において、エクスビボ培養は、存在する細胞の集団を拡大または成長させる、すなわち、同様の細胞の数を増加させる働きをする。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、単離または収集されたHSCは、PGE2との接触、インキュベーションまたはPGE2による刺激の前にエクスビボ培養される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、単離または収集されたHSCは、PGE2との接触、インキュベーションまたはPGE2による刺激の後にエクスビボ培養される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、単離または収集されたHSCは、PGE2との接触、インキュベーションまたはPGE2による刺激の前および後にエクスビボ培養される。
別の態様において、エクスビボ培養は、使用、例えば凍結保存における使用またはレシピエント対象への移植（implantation）／移植（engraftment）における使用の前に行われる。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入前に凍結保存される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入後に凍結保存される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入前および後に凍結保存される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、HSCは、PGE2との接触、インキュベーションもしくはPGE2による刺激の前に、またはPGE2との接触、インキュベーションもしくはPGE2による刺激の後に、またはPGE2との接触、インキュベーションもしくはPGE2による刺激の前および後の両方で凍結保存される。
本明細書に記載される改変HSC集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、改変PD-L1+発現HSCは、使用前にエクスビボ培養により拡大させられ、次いで凍結保存される。例えば、エクスビボ細胞拡大および／または対象への移植（implantation）／移植（engraftment）。
本明細書に記載される細胞は、当技術分野で公知の任意の方法によって凍結保存され得る。本明細書で使用される場合、「凍結保存」は、零度以下の温度、例えば（典型的に）77Kまたは-196℃（液体窒素の沸点）への冷却による細胞の保存を表す。凍結保存はまた、4〜10℃の間の温度での細胞の保存を表す。これらの低温の下で、細胞死をもたらすであろう生化学反応を含むあらゆる生物学的活動が、効果的に停止される。保存される細胞が、低温での凍結または室温への加温により損傷するのを防ぐために、多くの場合、凍結保護剤が、零度以下の温度で使用される。
凍結は、ほとんどの生きた細胞にとって破壊的なものである。冷却の際に、外部培地が凍結するにしたがい、細胞は水分を失うことによって平衡を保ち、それによって細胞内溶質濃度を上昇させる。約10〜15℃以下で、細胞内凍結が起こるであろう。細胞内凍結および溶液効果の両方が、細胞の損傷を引き起こす（Mazur, P., 1970, Science 168:939-949）。細胞外の氷による凍結破壊は、本質的に、細胞の浸透圧脱水に起因する細胞膜の損傷であると考えられている（Meryman, H.T., et al., 1977, Cryobiology 14 287-302）。
凍結保護剤および最適な冷却速度は、細胞の損傷を保護し得る。使用され得る凍結保護剤は、ジメチルスルホキシド（DMSO）（Lovelock, J.E. and Bishop, M.W.H., 1959, Nature 183:1394-1395; Ashwood-Smith, M.J., 1961, Nature 190:1204-1205）、グリセロール、ポリビニルピロリジン（Rinfret, A.P., 1960, Ann. N.Y. Acad. Sci. 85:576）、デキストラン、トレハロース、CryoSoFree（Sigma Aldrich Co.）およびポリエチレングリコール（Soviter, H.A. and Ravdin, R.G., 1962, Nature 196:548）を含むがこれらに限定されない。好ましい冷却速度は、1〜3℃／分である。少なくとも2時間後、T細胞は、-80℃の温度に達し、そして例えば長期間低温保管用容器内での、恒久的保管のために、液体窒素（-196℃）中に直接投入され得る。
本明細書に記載される改変HSCの集団、エクスビボ方法または組成物の一態様において、PGE2は、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2（dmPGE2）である。
PD-L1発現HSCおよびこれらのHSCを含む組成物の使用
本明細書に記載される改変PD-L1発現HSCは、免疫調節の不調である自己免疫障害の根本原因となる、自己免疫障害を処置するために使用され得る。改変PD-L1発現HSCは、自己免疫障害を有する対象において免疫応答を調節または抑制するために使用される。一態様において、自己免疫障害はT1Dである。T1Dを患った対象は、PD-L1発現HSCの産生に欠陥を有する。改変PD-L1発現HSCは、この欠陥を補充し、T1Dを患った対象の膵臓のβ膵島細胞に対する免疫応答を調節または抑制するために使用される。一態様において、本明細書に記載される改変PD-L1発現HSCは、T1Dと診断された対象においてT1Dを処置するために使用される。一態様において、対象は、T1Dと新たに診断された者である。本明細書で使用される場合、「新たに診断される」という用語は、1カレンダー年未満の間にその障害について診断されることを表す。一態様において、対象は、T1Dに関連する自家自己抗体、例えばGAD65自己抗体および膵島抗原2自己抗体を有することが新たに検出された者である。本明細書で使用される場合、「新たに検出される」という用語は、直近の6カレンダー月内にT1Dに関連する自家自己抗体が検出されることを表す。
例えば、ヒト対象は、T1Dと新たに診断された者である。HSCのサンプルは、この対象から収集され得る。得られるHSCは、PD-L1発現を増加させる本明細書に記載される手順に利用可能なHSCの数を増加させるためにエクスビボ拡大させられ得る。HSCのサンプルは、トランスフェクトされたHSCにおいてPD-L1を過剰発現させるよう、外因性のPD-L1 cDNAを用いてトランスフェクトされ得る。あるいは、HSCのサンプルは、PGE2接触HSCにおけるPD-L1発現の増加を刺激するよう、本明細書に記載されるPGE2とエクスビボ接触され得る。PGE2およびステロイド、例えばデキサメタゾンの両方もまた、PD-L1発現を刺激するために一緒に使用され得る。PD-L1発現を増加させるおよびPD-L1発現HSCのプールを増加させるいずれかの方法が使用され得る。得られるHSCは、その後、非トランスフェクトHSCまたは非PGE2接触HSCのそれぞれとの比較で増加したPD-L1発現を確認するために分析される。得られるHSCはさらに、対象への戻し移植のために利用可能なHSCの数を増加させるためにエクスビボ拡大させられ得る。得られるHSCはまた、凍結保存および対象への戻し移植のために利用可能なPD-L1発現HSCの数を増加させるために、すなわち、凍結保存下で維持される一部のPD-L1発現HSCおよび対象への戻し移植のための別の一部を有するよう、エクスビボ拡大させられ得る。PD-L1発現HSCは、元のHSCが同じ対象から取得されたという理由で、レシピエント対象にとって自己である、したがってHSCは対象とHLA適合する。
例えば、ヒト対象は、T1Dに関連する自家自己抗体、例えばGAD65自己抗体および膵島抗原2自己抗体を有することが新たに検出された者である。1型糖尿病におけるベータ細胞の自己免疫のマーカーである4つの自己抗体は、膵島細胞抗体（ICA、ベータ細胞内の細胞質タンパク質に対するもの）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD-65）に対する抗体、インスリン自己抗体（IAA）およびタンパク質チロシンホスファターゼに対するIA-2Aである。GAD65に対する自己抗体は、臨床所見で、1型糖尿病の80％において見られる。1型糖尿病の診断におけるICAおよびIA-2Aの存在は、それぞれ、69〜90％および54〜75％の範囲である。IAA保有率は、糖尿病発症時の年齢に反比例し、それは通常、糖尿病の危険がある幼い子供における最初のマーカーであり、診断時に幼い子供の約70％で見られる。対象は、T1Dに関する症状（すなわち、高血糖症）を未だ示していない者である。PD-L1発現HSCを用いた治療方法は、そのような個体において高血糖症の発症を遅らせるために使用される。高血糖症（Hyperglycemia）または高血糖（high blood sugar）は、過剰な量のグルコースが血漿中に循環している状態である。これは通常、11.1 mmol/l（200 mg/dl）よりも高い血糖レベルであるが、症状は、より高い値、例えば15〜20 mmol/l（約250〜300 mg/dl）まで検知可能となり始めない場合がある。約5.6〜約7 mmol/l（100〜126 mg/dl）の間の一定範囲（American Diabetes Associationガイドライン）の対象が高血糖とみなされ、7 mmol/l（126 mg/dl）を超える者は通常、糖尿病を有するとみなされる。一態様において、対象は、11.1 mmol/l（200 mg/dl）を下回る血糖を有する。別の態様において、15 mmol/l（約250 mg/dl）を下回るまたは20 mmol/l（300 mg/dl）を下回る血糖。PD-L1+細胞の投与は、糖尿病の発症を遅らせ得る。
本明細書に記載される改変PD-L1発現HSCはまた、臓器もしくは骨髄移植レシピエントである対象または近い将来レシピエントとなる対象において免疫応答を抑制するために使用され得る。改変PD-L1発現HSCは、宿主対移植片疾患（GVHD）を予防もしくは処置または予防および処置するために使用される。GvHDは、遺伝的に異なる人から移植組織を受け取った後の医学的合併症である。GvHDは通常、幹細胞または骨髄移植に関連するものであるが、この用語は他の形態の組織移植片にも適用される。HSCのサンプルは、この対象から収集され得る。得られたHSCは、PD-L1発現を増加させるために本明細書に記載される手順に利用可能なHSCの数を増加させるようエクスビボ拡大させられ得る。HSCのサンプルは、トランスフェクトHSCにおいてPD-L1を過剰発現させるよう外因性PD-L1 cDNAを用いてトランスフェクトされ得る。あるいは、HSCのサンプルは、PGE2接触HSCにおけるPD-L1の増加を刺激するよう、本明細書に記載されるようにPGE2とエクスビボ接触され得る。PGE2およびステロイド、例えばデキサメタゾンの両方が、PD-L1発現を刺激するために一緒に使用され得る。PD-L1発現を増加させるおよびPD-L1発現HSCのプールを増加させるいずれかの方法が使用され得る。得られるHSCは、その後、非トランスフェクトHSCまたは非PGE2接触HSCのそれぞれとの比較で増加したPD-L1発現を確認するために分析される。得られるHSCはさらに、対象への戻し移植のために利用可能なHSCの数を増加させるためにエクスビボ拡大させられ得る。得られるHSCはまた、凍結保存および対象への戻し移植のために利用可能なPD-L1発現HSCの数を増加させるためにエクスビボ拡大させられ得る。
したがって、一態様において、自己免疫疾患または障害の予防または処置に使用するため、対象において免疫応答を抑制するのに使用するため、T1Dを発症する危険がある対象においてT1Dの発症を遅らせるのに使用するため、同種組織または同種臓器移植拒絶反応を予防し遅らせるのに使用するため、ならびに成人および小児対象におけるT1Dの処置のための、本明細書に記載されるPD-L1発現造血幹細胞または本明細書に記載される方法のいずれか1つによって生成されるPD-L1+ HSCを含む組成物が、本明細書に提供される。
一態様において、自己免疫疾患または障害を予防または処置する、対象において免疫応答を抑制する、T1Dを発症する危険がある対象においてT1Dの発症を遅らせる、同種組織または同種臓器移植拒絶反応を予防し遅らせるのに使用するため、ならびに成人および小児対象におけるT1Dの処置のための医薬の製造のための、本明細書に記載されるPD-L1発現HSCまたは本明細書に記載される方法のいずれか1つによって生成されるPD-L1+ HSCを含む組成物が、本明細書に提供される。
別の態様において、自己免疫疾患または障害の予防または処置に使用するため、対象において免疫応答を抑制するのに使用するため、T1Dを発症する危険がある対象においてT1Dの発症を遅らせるのに使用するため、同種組織または同種臓器移植拒絶反応を予防し遅らせるのに使用するため、ならびに成人および小児対象におけるT1Dの処置のための、本明細書に記載されるPD-L1発現HSCまたは本明細書に記載される方法のいずれか1つによって生成されるPD-L1+ HSCの集団が、本明細書に提供される。
別の態様において、自己免疫疾患または障害を予防または処置する、対象において免疫応答を抑制する、T1Dを発症する危険がある対象においてT1Dの発症を遅らせる、同種組織または同種臓器移植拒絶反応を予防し遅らせるのに使用するため、ならびに成人および小児対象におけるT1Dの処置のための医薬の製造のための、本明細書に記載されるPD-L1発現HSCまたは本明細書に記載される方法のいずれか1つによって生成されるPD-L1+ HSCの集団が、本明細書に提供される。
したがって、一態様において、本明細書に記載される改変HSC集団を含む組成物を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。一態様において、改変HSCは、PD-L1を発現する。一態様において、改変HSCは、対照の非改変HSCを上回る増加したPD-L1発現を示す。一態様において、この方法は、自己免疫疾患または障害を患った対象を特定する工程をさらに含む。別の態様において、この方法は、自己免疫疾患または障害を有する対象または臓器もしくは骨髄移植レシピエントである個体を選択する工程をさらに含む。
一態様において、本明細書に記載される改変HSC集団を含む組成物を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において宿主対移植片疾患または臓器もしくは組織移植片拒絶反応を予防する方法が、本明細書に提供される。一態様において、対象は、同種組織または同種臓器移植片を受け入れた者である。一態様において、改変HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する。一態様において、改変HSCは、PD-L1を発現する。一態様において、改変HSCは、対照の非改変HSCを上回る増加したPD-L1発現を示す。
一態様において、改変HSCは、本明細書に記載されるPGE2で刺激されたPD-L1+発現HSCである。一態様において、改変HSCは、本明細書に記載されるPGE2およびデキサメタゾンで刺激されたPD-L1+発現HSCである。
一態様において、本明細書に記載される改変HSC集団を含む組成物を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において1型糖尿病の発症を遅らせる方法が、本明細書に提供される。一態様において、対象は、検出可能な量のT1Dに関連する自家自己抗体を有すると新たに認識された者である。一態様において、対象は、臨床的な高血糖症を有さない。一態様において、対象は、20歳以下の小児患者である。他の態様において、対象は、15歳、10歳、5歳および1歳以下の小児患者である。一態様において、改変HSCは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する。一態様において、改変HSCは、PD-L1を発現する。一態様において、改変HSCは、対照の非改変HSCを上回る増加したPD-L1発現を示す。
一態様において、改変HSCは、本明細書に記載されるPGE2で刺激されたPD-L1+発現HSCである。一態様において、改変HSCは、本明細書に記載されるPGE2およびデキサメタゾンで刺激されたPD-L1+発現HSCである。
様々な自己免疫疾患または障害が、当技術分野で公知であり、例えば定義の節に記載されるものが挙げられる。当業者は、当技術分野で公知の自己免疫疾患または障害を診断することができるであろう。
別の態様において、この方法は、免疫応答の抑制を必要とする対象を選択する工程をさらに含む。一般に、意図的に誘導される免疫抑制は、身体が臓器移植もしくは同種移植を拒絶するのを防ぐため、臓器もしくは骨髄移植後のGVHDを処置するため、または自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチもしくはクローン病の処置のために行われる。いくつかの態様において、臓器移植は、肝臓、皮膚、肺移植、膵臓、腎臓、卵巣、結腸、腸および心臓移植を含む。
一態様において、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する改変HSC集団を含む組成物を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。一態様において、改変HSCは、PD-L1を発現する。一態様において、改変HSCは、対照の非改変HSCを上回る増加したPD-L1発現を示す。
一態様において、HSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルを接触させ、それによって核酸の外因性コピーをHSCに導入し、それによってPD-L1を発現する改変HSC集団を生成する工程を含むエクスビボ方法によって生成される改変PD-L1+発現HSC集団を含む組成物を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。一態様において、この方法は、得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立する工程をさらに含む。
別の態様において、この方法は、ベクターとの接触後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程をさらに含む。別の態様において、この方法は、得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後に、得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程をさらに含む。別の態様において、この方法は、ベクターとの接触後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、および得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程をさらに含む。
一態様において、本明細書に記載されるPGE2で刺激されたPD-L1+発現HSC集団を含む組成物を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。一態様において、この方法は、自己免疫疾患または障害を患っている対象を特定する工程をさらに含む。
別の態様において、この方法は、自己免疫疾患または障害を有する対象または臓器もしくは骨髄移植レシピエントである個体、または臓器もしくは骨髄移植レシピエントでありGVHDを発症する危険を有する対象を選択する工程をさらに含む。例えば、同種移植片の移植を受けた対象。別の態様において、この方法は、免疫応答の抑制を必要とする対象を選択する工程をさらに含む。例えば、臓器または骨髄移植レシピエントでありGVHDを発症する危険を有する対象。
一態様において、PGE2と接触させることによってPD-L1+を発現するよう刺激されたPD-L1+発現HSC集団を含む組成物を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。一態様において、刺激されたHSCは、対照の非PGE2刺激HSCを上回る増加したPD-L1発現を示す。
一態様において、HSCのサンプルを10μM濃度のPGE2と37℃で約60分間接触させ、それによってPD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成する工程を含むエクスビボ方法によって生成されたPD-L1+発現HSC集団を含む組成物を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。
一態様において、HSCのサンプルを0.1μM濃度のPGE2と37℃で少なくとも24時間接触させ、それによってPD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成する工程を含むエクスビボ方法によって生成されたPD-L1+発現HSC集団を含む組成物を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。
上記方法の一態様において、この方法は、接触させた細胞を洗浄して過剰なPGE2を除去する工程をさらに含む。一態様において、この方法は、PGE2で刺激されたHSCにおけるPD-L1の発現を確立する工程をさらに含む。別の態様において、この方法は、PGE2刺激の前にHSCのサンプルをエクスビボ培養する工程をさらに含む。このエクスビボ培養は、PGE2刺激に利用できる細胞数を拡大させる。別の態様において、この方法は、PGE2との接触後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程、またはPGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程、または、PGE2との接触後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程およびPGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後にPGE2刺激HSCをエクスビボ培養する工程の両方をさらに含む。このエクスビボ培養は、治療に利用可能なPD-L1発現細胞の数を拡大させる。
一態様において、HSC集団を提供する工程、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルを接触させ、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程、および改変PD-L1+発現HSCの集団をレシピエント対象に投与し、レシピエント対象において免疫調節および免疫自己寛容を促進する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。一態様において、この方法は、得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立する工程をさらに含む。別の態様において、この方法は、ベクターとの接触後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、および／または、得られた改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後に得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程をさらに含む。一態様において、この処置方法は、自己免疫疾患または障害を患っており、免疫調節および免疫自己寛容の増進を必要としているレシピエント対象を特定する工程をさらに含む。別の態様において、この処置方法は、自己免疫疾患もしくは障害を有するまたは免疫応答を抑制する必要があるレシピエント対象を選択する工程をさらに含む。別の態様において、この処置方法は、記載されるベクターとの接触またはPGE2による刺激のためのHSCのサンプルを提供するドナー対象を特定および選択する工程をさらに含む。一態様において、ドナー対象およびレシピエント対象は、同一対象である、すなわち、レシピエント対象は、自己HSCを投与され得る。別の態様において、ドナー対象およびレシピエント対象は、異なる対象である。別の態様において、ドナー対象およびレシピエント対象は、少なくともHLA型が適合している。
一態様において、HSC集団を提供する工程、HSCのサンプルを10μMの濃度のPGE2と37℃で約60分間接触させて、PD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成する工程、およびPGE2刺激PD-L1+発現HSCの集団をレシピエント対象に投与し、レシピエント対象において免疫調節および免疫自己寛容を促進する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。一態様において、この方法は、得られたPGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立する工程をさらに含む。
一態様において、HSC集団を提供する工程、HSCのサンプルを0.1μMの濃度のPGE2と37℃で少なくとも24時間接触させて、PD-L1を発現するPGE2刺激HSC細胞集団を生成する工程、およびPGE2刺激PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に投与し、レシピエント対象において免疫調節および免疫自己寛容を促進する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置するまたは免疫応答を抑制する方法が、本明細書に提供される。一態様において、この方法は、得られたPGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立する工程をさらに含む。
上記方法の別の態様において、PGE2刺激HSCは、ステロイド、例えばデキサメタゾンとも接触されられる。
上記方法の別の態様において、この方法は、PGE2との接触後に得られたPGE2刺激細胞をエクスビボ培養する工程、または得られたPGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後に得られたPGE2刺激細胞をエクスビボ培養する工程、または、PGE2との接触後に得られたPGE2刺激細胞をエクスビボ培養する工程および得られたPGE2刺激HSCにおけるPD-L1の発現を確立した後に得られたPGE2刺激細胞をエクスビボ培養する工程の両方をさらに含む。
一態様において、この方法は、自己免疫疾患または障害を患っており、免疫調節および免疫自己寛容の増進を必要としているレシピエント対象を特定する工程をさらに含む。一態様において、この方法は、臓器または骨髄移植レシピエントであり、免疫調節および免疫自己寛容の増進を必要としているレシピエント対象を特定する工程をさらに含む。別の態様において、この方法は、自己免疫疾患もしくは障害を有するまたは臓器もしくは骨髄移植レシピエントであるレシピエント対象を選択する工程をさらに含む。別の態様において、この処置方法は、PGE2との接触のためのHSCのサンプルを提供するドナー対象を特定および選択する工程をさらに含む。一態様において、ドナー対象およびレシピエント対象は、同一対象である、すなわち、レシピエント対象は、自己HSCを投与され得る。別の態様において、ドナー対象およびレシピエント対象は、異なる対象である。別の態様において、ドナー対象およびレシピエント対象は、少なくともHLA型が適合している。
一態様において、HSCは、宿主対象から単離され、ベクターを用いてトランスフェクトされ、培養され（任意）、そして同一宿主に戻し移植、すなわち自己細胞移植される。別の態様において、HSCは、自己免疫疾患もしくは障害、またはT1Dを患っていると診断された宿主（レシピエント）とHLA型が適合するドナーから単離される。ドナー・レシピエントの抗原型の適合は、当技術分野で周知である。HLA型は、HLA-A、HLA-B、HLA-CおよびHLA-Dを含む。これらは、移植に必要とされる最小数の細胞表面抗原適合を表す。すなわち、トランスフェクト細胞は、異なる宿主、すなわちレシピエント宿主対象にとって同種である宿主に移植される。ドナーまたは対象のHSCは、本明細書に記載される核酸分子を含むベクターまたは核酸を用いてトランスフェクトされ得、トランスフェクト細胞はエクスビボで培養により拡大させられ、その後に宿主対象に移植される。一態様において、トランスフェクト細胞は、宿主対象に生着する。トランスフェクトHSCはまた、トランスフェクトおよび保管の後に凍結保存され得るまたは細胞拡大および保管の後に凍結保存され得る。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、自己免疫障害は、甲状腺炎、1型糖尿病、橋本甲状腺炎、グレーブス病、セリアック病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アジソン病、およびレイノー現象、グッドパスチャー病、関節炎(関節リウマチ、例えば、急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風または痛風関節炎、急性痛風関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節炎、II型コラーゲン誘発関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、脊椎関節炎、および若年発症関節リウマチ、進行性慢性関節炎（arthritis chronica progrediente）、変形関節炎、原発性慢性多発性関節炎（polyarthritis chronica primaria）、反応性関節炎、ならびに強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、乾癬、例えば、尋常性乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬、および爪の乾癬、アトピー性疾患、例えば枯草熱およびヨブ症候群を含むアトピー、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、剥脱性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激性接触皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、x連鎖性高IgM症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、蕁麻疹、例えば、慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性アレルギー性蕁麻疹および慢性特発性蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、強皮症(全身性強皮症を含む)、硬化症、例えば、全身性硬化症、多発性硬化症(MS)、例えば、脊髄・眼MS、原発性進行性MS(PPMS)、および再発寛解型MS(RRMS)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症（sclerosis disseminata）、失調性硬化症、視神経脊髄炎(NMO)、炎症性腸疾患(IBD)(例えば、クローン病、自己免疫媒介性胃腸疾患、大腸炎、例えば、潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis)、潰瘍性大腸炎(colitis ulcerosa)、微視的大腸炎（microscopic colitis）、コラーゲン蓄積大腸炎、ポリープ性大腸炎、壊死性腸炎、および貫壁性大腸炎、ならびに自己免疫性炎症性腸疾患)、腸炎、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、成人または急性呼吸窮迫症候群(ARDS)を含む呼吸窮迫症候群、髄膜炎、ブドウ膜の全体または一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液障害、リウマチ性脊椎炎、リウマチ性滑膜炎、遺伝性血管浮腫、髄膜炎におけるような脳神経損傷、妊娠性疱疹、妊娠性類天疱瘡、陰嚢掻痒症（pruritis scroti）、自己免疫性早期卵巣機能不全、自己免疫状態に起因する突発性難聴、IgE媒介性疾患、例えば、アナフィラキシーならびにアレルギー性およびアトピー性鼻炎、脳炎、例えば、ラスムッセン脳炎ならびに辺縁系および/または脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例えば、前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎（phacoantigenic uveitis）、後部ブドウ膜炎、または自己免疫性ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を伴うまたは伴わない糸球体腎炎(GN)、例えば、慢性または急性糸球体腎炎、例えば、原発性GN、免疫媒介性GN、膜性GN(膜性腎症)、特発性膜性GNまたは特発性膜性腎症、I型およびII型を含む膜または膜性増殖性GN(MPGN)、ならびに急速進行性GN、増殖性腎炎、自己免疫性多腺性内分泌不全、形質細胞限局性亀頭炎を含む亀頭炎、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、葉状魚鱗癬、表皮剥離性角質増殖症、前悪性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー状態および応答、アレルギー反応、アレルギー性またはアトピー性湿疹、皮脂欠乏性湿疹、汗疱状湿疹、および水疱性掌蹠湿疹（vesicular palmoplantar eczema）を含む湿疹、喘息、例えば、気管支喘息(asthma bronchiale)、気管支喘息(bronchial asthma)、および自己免疫性喘息、T細胞の浸潤および慢性炎症反応を伴う状態、妊娠中の外来抗原、例えば胎児ABO血液型に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、ループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループスおよび円板状エリテマトーデス、脱毛症ループス、全身性エリテマトーデス(SLE)、例えば、皮膚SLEまたは亜急性皮膚SLE、新生児ループス症候群(NLE)、ならびに播種性エリテマトーデス（lupus erythematosus disseminatus）を含むループス、小児インスリン依存性糖尿病(IDDM)を含む若年発症(I型)糖尿病、成人発症型糖尿病(II型糖尿病)、自己免疫性糖尿病、突発性糖尿病（idiopathic diabetes insipidus）、糖尿病性網膜症、糖尿病性ネフロパシー、糖尿病性大動脈障害、サイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症と関連する免疫応答、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎、大血管血管炎(リウマチ性多発性筋痛および巨細胞性(高安)動脈炎を含む)、中型血管血管炎(川崎病および結節性多発動脈炎/結節性動脈周囲炎を含む)、微視的多発動脈炎、免疫血管炎、CNS血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、壊死性血管炎、例えば、全身性壊死性血管炎、ならびにANCA関連血管炎、例えば、チャーグ・ストラウス血管炎または症候群(CSS)およびANCA関連小血管血管炎、側頭動脈炎を含む脈管炎、自己免疫性再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンドブラックファン貧血、溶血性貧血または自己免疫性溶血性貧血(AIHA)を含む免疫性溶血性貧血、悪性貧血（pernicious anemia）（悪性貧血（anemia perniciosa））、アジソン病、赤芽球癆または形成不全症（PRCA）、第VIII因子不全、血友病A、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、CNS炎症性障害、多臓器損傷症候群、例えば、敗血症、外傷、または出血に続くもの、抗原・抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病/症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば、水疱性類天疱瘡および皮膚類天疱瘡、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡粘膜類天疱瘡（pemphigus mucus-membrane pemphigoid）、および紅斑性天疱瘡を含む)、自己免疫性多発性内分泌障害、ライター病または症候群、免疫複合体障害、例えば、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、多発ニューロパチー、慢性ニューロパチー、例えば、IgM多発ニューロパチーまたはIgM媒介性ニューロパチー、および自己免疫性または免疫媒介性血小板減少症、例えば、慢性または急性ITPを含む特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、強膜炎、例えば、特発性角強膜炎（idiopathic cerato-scleritis）、上強膜炎、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、甲状腺炎、例えば、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)、または亜急性甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、多腺性症候群、例えば、自己免疫性多腺性症候群(または多腺性内分泌障害症候群)、神経性腫瘍随伴症候群、例えば、ランバート・イートン筋無力症症候群またはイートン・ランバート症候群を含む腫瘍随伴症候群、スティッフマンまたはスティッフ・パーソン症候群、脳脊髄炎、例えば、アレルギー性脳脊髄炎(allergic encephalomyelitis)またはアレルギー性脳脊髄炎(encephalomyelitis allergica)および実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)、重症筋無力症、例えば、胸腺腫関連重症筋無力症、小脳変性症、神経性筋強直症、眼球クローヌスまたは眼球クローヌスミオクローヌス症候群(OMS)、および感覚性ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ球性間質性肺炎(LIP)、閉塞性細気管支炎(非移植)対NSIP、ギラン・バレー症候群、ベルガー病(IgA腎症)、特発性IgA腎症、線状IgA皮膚症、急性熱性好中球性皮膚症、角層下膿疱性皮膚症、一過性棘融解性皮膚症、肝硬変、例えば、原発性胆汁性肝硬変および肺硬変、自己免疫性腸疾患症候群、セリアック(Celiac)またはセリアック(Coeliac)病、セリアックスプルー(グルテン性腸症)、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症(ALS；ルー・ゲーリック病)、冠動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例えば、自己免疫性内耳疾患(AIED)、自己免疫性難聴、多発性軟骨炎、例えば、難治性または再発または再発性多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、コーガン症候群/非梅毒性角膜実質炎、ベル麻痺、スウィート病/症候群、酒さ性自己免疫、帯状疱疹関連疼痛、アミロイドーシス、非癌性リンパ球増加症、単クローン性B細胞リンパ球増加症(例えば、良性単クローン性γグロブリン血症および意義不明の単クローン性γグロブリン血症、MGUS)を含む原発性リンパ球増加症、末梢ニューロパチー、腫瘍随伴症候群、CNSのチャネロパチーを含むチャネロパチー、自閉症、炎症性ミオパチー、巣状もしくは分節状または巣状分節状糸球体硬化症(FSGS)、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓障害、線維筋痛症、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮症、初老期認認知症、脱髄疾患、例えば、自己免疫性脱髄疾患および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、ドレスラー症候群、円形脱毛症、全脱毛症、CREST症候群(石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、強指症、および毛細血管拡張症)、男性および女性の自己免疫性不妊症、例えば抗精子抗体に起因するもの、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形性紅斑、開心術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えば、アレルギー性肺胞炎および線維化性肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、サンプター症候群、カプラン症候群、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、毛様体炎、例えば、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎(急性または慢性)、またはフックス毛様体炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、SCID、敗血症、内毒素血症、予防接種後症候群、エヴァンス症候群、自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎（thromboangitis ubiterans）、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞性多発筋痛、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小変化型ネフロパチー、良性家族性・虚血再灌流障害、移植臓器再灌流、網膜自己免疫、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、精子形成欠如(aspermiogenesis)、自己免疫性溶血、ベック病、アレルギー性腸炎、癩性結節性紅斑、特発性顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマン・リッチ病、感音難聴、限局性回腸炎、白血球減少症、横断性脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、交感性眼炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、後天性脾臓萎縮（acquired spenic atrophy）、白斑症、毒素性ショック症候群、T細胞の浸潤を伴う状態、白血球接着不全症、サイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅発型過敏症と関連する免疫応答、白血球漏出を伴う疾患、多臓器損傷症候群、抗原・抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、多腺性自己免疫症候群I型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(AOIH)、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、急性または慢性副鼻腔炎、篩骨洞炎、前頭洞炎、上顎洞炎、または蝶形骨洞炎、好酸球関連障害、例えば、好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増多筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増多症、好酸球を含む肉芽腫、血清陰性
脊椎関節炎、多内分泌性自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、ブルートン症候群、乳児一過性低γグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、血管拡張症、膠原病と関連する自己免疫障害、リウマチ、アレルギー性過敏性障害、糸球体腎炎、再灌流障害、虚血性再灌流障害、リンパ腫性気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性成分を有する皮膚病、ならびに自己免疫性ブドウ膜網膜炎（AUR）からなる群より選択される。
上記方法の別の態様において、この方法は、糖尿病症状の発症を予防するまたは遅らせるために、T1Dを発症する危険がある対象を特定する工程をさらに含む。例えば、当技術分野で公知の検出可能な量のT1Dに関連する自家自己抗体を有する個体。Ping Xu and Jeffrey P. KrischerによってDiabetes Care, 2016, 39(6): 1036-1044内の「Prognostic classification factors associated with development of multiple autoantibodies, dysglycemia, and Type 1 Diabetes - A recursive partitioning analysis」に記載された危険因子およびマーカーを参照のこと。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、自己免疫障害は、1型糖尿病（T1D）である。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、対象は、新たにT1Dを患っていると診断された者である。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、対象は、T1Dに関連する自家自己抗体、例えばGAD65自己抗体および膵島抗原2自己抗体を有すると新たに検出された者である。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、HSCは、レシピエント対象にとって自己である。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、HSCは、レシピエント対象にとって非自己かつ同種である。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、HSCは、レシピエント対象にとって非自己かつ異種である。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、HSC集団は、骨髄、臍帯、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯血、胎盤血または末梢血から取得される。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、HSC集団は、動員された末梢血から取得される。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、HSC集団は、CD34+細胞を含む。別の態様において、HSC集団は、骨髄、臍帯、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯血、胎盤血もしくは末梢血または動員された末梢血から取得されるCD34+選択細胞を含む。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、HSC集団は、レシピエント対象にとって自己である。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、HSC集団は、少なくともレシピエント対象とHLA型が適合している。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、HSC集団は、過剰なPGE2を除去した後またはベクターを用いたポストトランスフェクションの後に凍結保存され、レシピエント対象に移植する前に改変HSCの集団を拡大させるようエクスビボ培養される。
本明細書に記載される組成物および方法の他の態様において、HSCは、本明細書に記載されるベクターを用いた形質導入もしくはPGE2を用いた刺激のためまたは治療に使用するための出発HSCの数を増加させるために、任意の時点でのエクスビボ培養により拡大させられ得る。例えば、エクスビボ培養細胞拡大は、ドナー対象から収集した後、本明細書に記載されるベクターを用いて形質導入した後、PGE2と接触させた後、本明細書に記載される任意の凍結保存工程の後に行われ得る。
本明細書に記載される組成物および方法の他の態様において、HSCの凍結保存は、ドナー対象から収集した後、ドナー対象からの収集後の培養拡大の後、本明細書に記載されるベクターを用いて形質導入した後、PGE2と接触させた後、過剰なPGE2を除去した後、本明細書に記載されるベクターを用いた形質導入後の培養拡大の後、またはPGE2と接触させた後の任意の時点で行われ得る。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、HSC集団は、過剰なPGE2を除去した後またはベクターを用いたポストトランスフェクションの後、レシピエント対象に移植する前にエクスビボ培養により拡大させられる。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、接触後、HSCは、使用前、例えばエクスビボ拡大および／または対象への移植の前に凍結保存される。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、接触後、HSCは、使用前、例えば凍結保存および／または対象への移植（implantation）／移植（engraftment）前に、エクスビボで培養により拡大させられる。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、この方法は、自己免疫疾患もしくは障害を患っている対象または臓器もしくは骨髄移植レシピエントである個体を特定する工程をさらに含む。
記載される方法のいずれか1つの別の態様において、この方法は、自己免疫疾患もしくは障害を患っている対象または臓器もしくは骨髄移植レシピエントである個体を選択する工程をさらに含む。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、この方法は、免疫応答の調節を必要とするレシピエント対象を選択する工程をさらに含む。例えば、同種移植片を移植された、臓器または骨髄移植レシピエントである個体。
記載される方法のいずれか1つの別の態様において、この方法は、免疫応答の抑制を必要とするレシピエント対象を特定する工程をさらに含む。例えば、同種移植片を移植された、臓器または骨髄移植レシピエントである個体。
記載される方法のいずれか1つの別の態様において、この方法は、免疫応答の抑制を必要とするレシピエント対象を選択する工程をさらに含む。例えば、同種移植片を移植された、臓器または骨髄移植レシピエントである個体。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、この方法は、PD-L1+発現HSC集団をインビボでPD-L1+発現子孫細胞に分化させる工程をさらに含む。
本明細書に記載される方法のいずれか1つの一態様において、接触後、HSCは、使用前、例えば凍結保存および／または対象への移植（implantation）／移植（engraftment）前に、エクスビボ培養物中で分化させられる。
本明細書に記載される治療法のいずれか1つの一態様において、化学療法および／または放射線療法が、内因性幹細胞を減少させ、移植細胞の生着および／または再構成を促進するために行われる。
本明細書に記載される方法のいずれか1つの一局面において、PD-L1発現HSCまたはその子孫細胞はさらに、レシピエント対象に移植された細胞のその後の生着および／または再構成を促進すうよう、エクスビボでプロスタグランジンE2および／または抗酸化物質N-アセチル-L-システイン（NAC）で処置される。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、この方法は、対象に追加の免疫抑制療法剤を投与する工程をさらに含む。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、追加の免疫療法剤は、サイモグロブリン、シクロホスファミドまたはサイモグロブリンおよびシクロホスファミドの両方を含む。
記載される方法のいずれか1つの一態様において、追加の免疫抑制剤は、抗胸腺細胞抗原（ATG）、もしくはCTLA4融合免疫グロブリン、またはその両方を含む。
いくつかの態様において、追加の免疫療法剤の非限定的な例は、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、ボクロスポリンおよびタクロリムス）；CD80/86:CD28共刺激阻害剤（CTLA4融合免疫グロブリン、例えば、アバタセプトおよびベラタセプト）；CD154:CD40共刺激阻害剤（抗CD40モノクローナル抗体、例えば、ASKP1240；アステラス）；CD20阻害剤（抗CD20抗体、例えば、リツキシマブ、オクレリズマブ、オファツムマブおよびベルツズマブ）；CD22阻害剤（抗CD22抗体、例えば、エプラツズマブ）；B細胞分化阻害剤（例えば、ベリムマブおよびアタシセプト）；抗体産生形質細胞阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）；補体プロセスの阻害剤（例えば、エクリズマブ）；TまたはB細胞との免疫応答に関与するサイトカインの阻害剤（例えば、ステロイド、例えば、デキサメタゾン、グルココルチコイドおよびコルチコステロイド；ヤヌスキナーゼ阻害剤、例えば、トファシチニブ；IL-6受容体阻害剤、例えば、バシリキシマブ；TNF阻害剤、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブおよびセルトリズマブ；IL-1阻害剤、例えば、アニキンラ、リロナセプトおよびカナキヌマブ；ならびにIL-17阻害剤、例えば、セクキヌマブ）；ケモカインおよび細胞接着の阻害剤（例えば、CCR5受容体アンタゴニストマラビロク、CXCR4アンタゴニストプレリキサホル、CCR4ヒト化mAbモガムリズマブおよびCCL2（単球走化タンパク質1としても公知）阻害剤エマプチカプ（emapticap）；数千の血漿ドナー由来のプール静脈内免疫グロブリン（IVIG）；ポリクローナル抗胸腺細胞グロブリン（ALG）および抗胸腺細胞抗原（ATG）；CD52阻害剤（抗CD25、例えば、アレムツズマブ）；mTOR阻害剤（例えば、ラパマイシン、シロリムスおよびエベロリムス）；ならびに他の代謝拮抗剤、例えば、DNA合成阻害剤、例えばアザチオプリン（AZA）、ミコフェノレート、レフルノミドおよび細胞傷害剤、例えば、シクロホスファミドである。
本開示のレンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、HIV-1、HIV-2）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）およびウマ感染性貧血ウイルス（EIAV）を含むがこれらに限定されない。これらのベクターは、治療における使用に関するそれらの安全性を向上させるようならびに適切な発現エレメントおよび治療遺伝子、例えば上記のようなもの、を含むよう、当技術分野で認識されている技術を用いて構築および操作され得る。
ウイルスベースのベクターの潜在的毒性を考慮して、ベクターは、異なる方法で、遺伝子療法利用におけるそれらの安全性を向上させるよう設計され得る。例えば、ベクターは、例えばその内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,365,150号に記載されるように、必要なレンチウイルス遺伝子（例えば、gagおよびpol）を別個のベクターに隔離することによって安全にされ得る。したがって、組み換えレトロウイルスは、レトロウイルスのコード配列（gag、pol、env）が関心対象の遺伝子で置換され、レトロウイルスが非複製性となるように構築され得る。非複製性レトロウイルスは、次いで、標準的技術により、ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株の使用を通じてビリオンにパッケージングされる。組み換えレトロウイルスを作製するおよびそのようなウイルスをインビトロまたはインビボで細胞に感染させるためのプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14および他の標準的な研究マニュアルにおいて見出すことができる。
遺伝子送達ベクターとしてのウイルスの使用に関する主な必須要件は、特に細胞集団内での野生型ウイルスの伝播の可能性に関する、それらの使用上の安全性を確保することである。非複製性レトロウイルスのみを産生するパッケージング細胞株の開発は、遺伝子療法におけるレトロウイルスの利用性を向上させ、欠陥性レトロウイルスは、遺伝子療法目的での遺伝子導入における使用に関して十分に特徴づけられている（レビューには、Miller, A.D. (1990) Blood 76:271を参照のこと）。したがって、本開示の一態様において、ベクターウイルスの力価が増加するよう本開示のベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を増殖させるために、パッケージング細胞株が使用され得る。パッケージング細胞株の使用はまた、野生型ウイルスが発生する組み換えが起こる可能性をそのシステムの使用が低下させるため、ウイルスを増殖する上で安全な方法であるとみなされている。加えて、パッケージングタンパク質の発現に起因する細胞に対する毒性を減少させるために、そのウイルスのパッケージング機能をコードするプラスミドが例えば化学的手段によって一過的にのみトランスフェクトされるパッケージングシステムが使用され得る。
別の態様において、ベクターは、特定のレンチウイルス配列を非レンチウイルス配列で置き換えることによって安全にされ得る。したがって、本開示のレンチウイルスベクターは、その機能（例えば、ウイルス価、感染性、完全性ならびに高レベルかつ長期間の治療的遺伝子発現をもたらす能力）が実質的に低下しない限り、部分的な（例えば、分割された）レンチウイルス遺伝子配列および／または非レンチウイルス配列（例えば、他のレトロウイルス由来の配列）を含み得る。ウイルスベクター中にクローン化され得る要素は、プロモーター、パッケージングシグナル、LTR、ポリプリントラクトおよび逆応答エレメント（reverse response element; RRE）を含むがこれらに限定されない。
本開示の一態様において、LTR領域は、ウイルスLTRプロモーターを異種プロモーターで置換することによって改変される。一態様において、5’LTRのプロモーターが、異種プロモーターで置換される。使用することができる異種プロモーターの例は、脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）プロモーター、テトラサイクリン誘導性（TET)プロモーター、β-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーター（LCR）、ならびにサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターを含むがこれらに限定されない。いくつかの態様において、プロモーターは、PD-L1の産生を調節するための、調節性プロモーター、誘導性プロモーターである。例えば、テトラサイクリン誘導性またはドキシサイクリン誘導性プロモーター。
いくつかの態様において、本開示のウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターまたはAAVまたは鳥ウイルスベクターはまた、遺伝子療法における遺伝子送達剤としてのベクターの使用に関する安全性を改善するよう改変されたベクターを含む。本開示の一態様において、このベクターのLTR領域、例えば3’LTRが、U3および／またはU5領域において改変され、SINベクターが作製される。そのような改変は、遺伝子送達目的におけるベクターの安全性の向上に寄与する。一態様において、ベクターは3’LTRに欠失を含み、U3領域の一部分がインシュレーターエレメントで置換される。インシュレーターは、ベクター内のエンハンサー／プロモーター配列が隣接するゲノムにおける遺伝子の発現に影響を及ぼさないようにし、かつその逆に、隣接するゲノム配列がベクター内の遺伝子の発現に影響を及ぼさないようにする。本開示のさらなる態様において、3’LTRは、U5領域が例えば理想的なポリ（A)配列で置換されるよう改変される。LTRに対する改変、例えば、3’LTR、5’LTRまたは3’および5’LTRの両方に対する改変もまた、本開示に含まれることに留意されたい。
レンチウイルスベクターのプロモーターは、特定遺伝子の5’隣接領域に本来的に付随するもの（すなわち、それはインビボで細胞とともに発生する）または本来的に付随しないものであり得る。プロモーターは、真核生物ゲノム、ウイルスゲノムまたは合成配列由来であり得る。プロモーターは、非特異的（すべての組織において活性）（例えば、SFFV）、組織特異的（例えば、（LCR）、天然調節プロセスによって調節される、外因的に適用される薬物（例えば、TET）によって調節される、または、急性期応答の間に活性化されるプロモーターもしくは複製細胞においてのみ活性化されるもののように、特定の生理学的状態によって調節されるよう選択され得る。本開示におけるプロモーターの非限定的な例は、脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、β-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーター（LCR）、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、レトロウイルスLTRプロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター、SV40プロモーターおよびジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターを含む。プロモーターはまた、選択された細胞型、例えば、HSCおよびそれらの子孫において特異的に発現することが示されているものから選択され得る。一態様において、ベクターのプロモーターは、遺伝子発現が赤血球に制限されるよう細胞特異的である。赤血球特異的発現は、ヒトβ-グロビンプロモーター領域および遺伝子座制御領域（LCR）を用いることによって達成される。
当業者は、関心対象のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターの選択が、ベクター、核酸カセット、標的化される細胞型および望まれる生物学的効果に依存することを理解するであろう。当業者はまた、プロモーターの選択において、パラメータが、生理学的効果の達成のために十分に高いレベルの遺伝子発現の達成、決定的レベルの遺伝子発現の維持、遺伝子発現の一時的調節の達成、細胞型特異的発現の達成、遺伝子発現の薬理学的、内分泌的、傍分泌的または自己分泌的調節の発生、および不十分または望ましくないレベルの発現の防止を含み得ることを理解するであろう。任意の特定の選択要件セットは、その条件に依存し得るが、個々の要件が決定されれば容易に決定することができるであろう。本開示の一態様において、プロモーターは、遺伝子発現が赤血球に制限されるよう細胞特異的である。赤血球特異的発現は、ヒトβ-グロビンプロモーター領域および遺伝子座制御領域（LCR）を用いることによって達成される。
本開示において使用するのに適した発現ベクターの構築のための標準的技術は、当業者に周知であり、Michael R. Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012)等の刊行物において見出すことができる。様々なストラテジーがDNAのフラグメントを連結するために利用可能であり、その選択はDNAフラグメントの末端の性質に依存し、その選択は当業者によって容易になされ得る。
細胞内での感染性ウイルス粒子の産生を促進する工程は、従来的な技術、例えば、標準的な細胞培養成長技術を用いて実施され得る。当業者によって望まれる場合、本開示のベクターおよび方法を用いてレンチウイルスストック溶液が調製され得る。ウイルスストック溶液を調製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633およびN. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66: 5110-5113によって説明されている。本開示においてストック溶液を作製する方法において、レンチウイルス許容細胞（本明細書でプロデューサー細胞と称される）が、本開示のベクターシステムを用いてトランスフェクトされる。次いで細胞は、適切な細胞培養条件下で成長させられ、そして上記のように、レンチウイルス粒子が細胞自体からまたは細胞培地からのいずれかから収集される。適切なプロデューサー細胞株は、ヒト胚性腎臓細胞株293、ウマ真皮細胞株NBL-6およびイヌ胎仔胸腺細胞株Cf2THを含むがこれらに限定されない。
感染性ウイルス粒子を収集する工程もまた、従来技術を用いて実施され得る。例えば、感染性粒子は、当技術分野で公知のように、細胞溶解、または細胞培養物の上清の収集によって収集され得る。任意で、収集されたウイルス粒子は、望まれるように精製され得る。適切な精製技術は、当業者に周知である。
遺伝子療法におけるウイルスベクターの使用に関する他の方法は、例えば、Kay, M. A. (1997) Chest 111 (6 Supp.): 1385-1425; Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9: 1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19: 265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11: 179-86; Thule, P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7: 1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12: 335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23: 746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716: 90-101; Strayer, D.S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8: 2159-2172; Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3: 43-49;およびLee, H. C. et al. (2000) Nature 408: 483-8において見出すことができる。
一態様において、HSCのサンプルは、エクスビボトランスフェクションまたは形質導入手順において、106個のHSC細胞あたり少なくとも103個のベクターまたはウイルスベクターもしくは粒子と接触させられる。ベクターは、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する。HSCのサンプルと接触させる本明細書に示される他のベクター用量範囲は、例示にすぎず、本願に記載の特許請求される組成物または方法の範囲または実施を制限することは意図されていない。一態様において、ベクター用量は、103〜108ウイルス粒子／106 HSC細胞の範囲である。他の態様において、ベクター用量は、103〜105ウイルス粒子／106 HSC細胞、104〜106ウイルス粒子／106 HSC細胞、105〜107ウイルス粒子／106 HSC細胞、103〜108ウイルス粒子／106 HSC細胞の範囲である。一態様において、用量は、約104ウイルス粒子／106 HSC細胞である。
レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターまたは鳥ウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターは、当技術分野で周知の標準的なトランスフェクション技術を用いて、HSCとエクスビボ接触させられる。
一態様において、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターまたは鳥ウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターは、HSC、造血前駆細胞または赤血球の前駆体に形質導入される。
本開示の別の局面は、記載されるベクターを含む組成物に関する。一態様において、この組成物は、HSCのサンプルを形質導入するのに十分な有効量のレンチウイルスベクターまたは鳥ウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。ベクター形質導入に関する「有効量」は、必要な用量でかつ必要な時間内に、外因性PD-L1コード核酸をHSCに導入する所望の結果を達成するのに効果的な量を表す。ウイルスベクターの有効量は、ドナー個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに形質導入されたHSCにおいて所望の応答を誘起するウイルスベクターの能力等の因子にしたがい変化し得る。投与計画は、最適な応答を提供するよう調節され得る。有効量はまた、ウイルスベクターのいかなる毒性または有害効果をもその有益な効果が上回るものである。本開示のウイルスベクターの潜在的毒性は、細胞ベースのアッセイまたは当技術分野で知られている動物モデルを用いてアッセイされ得、有意な毒性を示さない有効なモジュレーターが選択され得る。
滅菌溶液は、必要量のレンチウイルスベクターを、必要に応じて上記の成分の1つまたは組み合わせを含む適当な溶媒に添加し、その後にろ過滅菌することによって調製され得る。通常、分散物は、活性化合物を、基本分散媒体および上記の中から必要とされる他の成分を含む滅菌媒体に添加することによって調製される。滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、活性成分および事前に滅菌ろ過されたその溶液由来の任意の追加の所望の成分の粉末を生成する減圧乾燥および凍結乾燥である。
いくつかの態様において、PD-L1+ HSC細胞またはPD-L1+ HSC細胞を含む組成物は、滅菌性であり、対象の治療のために配合される。一態様において、対象は、哺乳動物、例えばヒトである。
いくつかの態様において、PD-L1+ HSC細胞またはPD-L1+ HSC細胞を含む組成物は、血清または血漿を含む。あるいは、組成物は、凍結保護剤、例えば、DMSOを含む。
いくつかの態様において、組成物または薬学的組成物は、全身送達用に配合される。いくつかの態様において、組成物は、特定臓器、例えば、非限定的に、肝臓、脾臓、骨髄および皮膚への送達用に配合され得る。薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
加えて、本明細書に記載される組成物または薬学的組成物は、生物学的に活性な薬剤の他の成分、例えば、薬学的に許容される界面活性剤（例えば、グリセリド）、賦形剤（例えば、ラクトース）、担体、血清、血漿、希釈剤および媒体と共に投与され得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物または薬学的組成物は、約1x106細胞〜約3x106細胞、約1.0x106細胞〜約5x106細胞、約1.0x106細胞〜約10x106細胞、約10x106細胞〜約20x106細胞、約10x106細胞〜約30x106細胞、または約20x106細胞〜約30x106のPD-L1発現細胞もしくはHSCまたはそれらの子孫を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物または薬学的組成物は、約1x106細胞〜約30x106細胞、約1.0x106細胞〜約20x106細胞、約1.0x106細胞〜約10x106細胞、約2.0x106細胞〜約30x106細胞、約2.0x106細胞〜約20x106細胞、または約2.0x106細胞〜約10x106のPD-L1発現細胞もしくはHSCまたはそれらの子孫を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物または薬学的組成物は、約1x106個の造血幹または前駆細胞、約2x106個、約5x106個、約7x106個、約10x106個、約15x106個、約17x106個、約20x106個、約25x106個、または約30x106個のPD-L1発現細胞もしくはHSCまたはそれらの子孫を含む。
レシピエント対象に投与されるPD-L1+ HSC細胞の用量は、入手可能なPD-L1+ HSCの数、HSCにおけるPD-L1の発現レベル、投与経路、レシピエントのサイズ、年齢、性別、健康状態、体重および食事、処置する疾患の症状の性質および程度、現行の処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果を含む様々な因子に依存して変化するであろう。
一態様において、PD-L1発現HSCの用量は、移植される細胞集団が、対象への移植後のインビボでの十分な生着および再構成を確実にするのに十分であるべきである。
一態様において、用量は、移植あたり少なくとも1x104細胞である。他の態様において、用量は、対象への移植あたり少なくとも5x104細胞、少なくとも1x105細胞、少なくとも5x105細胞、少なくとも1x106細胞、少なくとも5x106細胞、少なくとも1x107細胞、少なくとも5x107細胞、少なくとも1x108細胞、少なくとも5x108細胞、少なくとも1x109細胞、少なくとも5x109細胞、もしくは少なくとも1x1010細胞、またはそれ以上である。第2または後続の投与は、その個体に投与された初期または以前の用量と同じ、それ未満またはそれ以上の用量で投与され得る。
いくつかの態様において、レシピエント対象に投与されるPD-L1+ HSC細胞の量は、およそ少なくとも0.1x105細胞/対象レシピエントkg体重、少なくとも0.5x105細胞/kg体重、少なくとも1x105細胞/kg体重、少なくとも5x105細胞/kg体重、少なくとも10x105細胞/kg体重、少なくとも0.5x106細胞/kg体重、少なくとも0.75x106細胞/kg体重、少なくとも1x106細胞/kg体重、少なくとも1.25x106細胞/kg体重、少なくとも1.5x106細胞/kg体重、少なくとも1.75x106細胞/kg体重、少なくとも2x106細胞/kg体重、少なくとも2.5x106細胞/kg体重、少なくとも3x106細胞/kg体重、少なくとも4x106細胞/kg体重、少なくとも5x106細胞/kg体重、少なくとも10x106細胞/kg体重、少なくとも15x106細胞/kg体重、少なくとも20x106細胞/kg体重、少なくとも25x106細胞/kg体重、または少なくとも30x106細胞/kg体重である。
別の態様において、用量は、少なくとも2x106細胞/レシピエント対象kg体重である。他の態様において、用量は、少なくとも3x106細胞/対象レシピエントkg体重、少なくとも4x106細胞/kg体重、少なくとも5x106細胞/kg体重、少なくとも6x106細胞/kg体重、少なくとも7x106細胞/kg体重、少なくとも8x106細胞/kg体重、少なくとも9x106細胞/kg体重、少なくとも10x106細胞/kg体重、少なくとも15x106細胞/kg体重、少なくとも20x106細胞/kg体重、少なくとも25x106細胞/kg体重、または少なくとも30x106細胞/kg体重である。
別の態様において、用量は、少なくとも5x106細胞/レシピエント対象kg体重を超える。
別の態様において、用量は、少なくとも10x106細胞/レシピエント対象kg体重を超えるものである。
第2または後続投与が好ましい。例えば、第2および後続投与は、前回の投与から約1日〜30週の間に行われ得る。必要に応じて、合計2、3、4またはそれ以上の回数の投与が個体に送達され得る。
配合物において使用される正確な用量は、投与経路および疾患または障害の深刻さにも依存し、それは医師の判断および各患者の状況にしたがい決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られる用量応答曲線から推定され得る。
本明細書に記載される方法を用いた処置の中で、有効性試験が行われ得る。特定の病気に関連する多くの症状の重篤度の測定が、処置開始前およびその後に処置開始後の特定の時間間隔で記録される。例えば、食後の血中インスリンまたは血糖の量。
本開示は、番号が付された以下の項のいずれかに定義され得る。
[1] 細胞が、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有する、改変HSC集団。
[2] 前記細胞がPD-L1を発現している、項1の改変HSC集団。
[3] 前記核酸がcDNAである、項1または2の改変HSC集団。
[4] 前記核酸がゲノムDNAである、項1または2の改変HSC集団。
[5] 前記核酸が前記細胞のゲノムに組み込まれている、項4の改変HSC集団。
[6] 前記核酸がベクターを通じて前記細胞に導入される、先行する項のいずれかの改変HSC集団。
[7] 前記ベクターがウイルスベクターである、項6の改変HSC集団。
[8] 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項7の改変HSC集団。
[9] 細胞が哺乳動物細胞である、先行する項のいずれかの改変HSC集団。
[10] 哺乳動物細胞がヒト細胞である、項9の改変HSC集団。
[11] 改変前に、HSCが、骨髄、臍帯、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯血、胎盤血または末梢血から取得される、先行する項のいずれかの改変HSC集団。
[12] HSCが動員末梢血から取得される、項11の改変HSC集団。
[13] HSCが健常個体に由来する、先行する項のいずれかの改変HSC集団。
[14] HSCが、診断された疾患または障害を有する個体に由来する、先行する項のいずれかの改変HSC集団。
[15] 診断された疾患または障害が、自己免疫疾患または障害である、項14の改変HSC集団。
[16] 自己免疫疾患または障害が1型糖尿病（T1D）である、項15の改変HSC集団。
[17] 細胞が、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入前もしくは導入後または導入前と導入後の両方でエクスビボ培養される、先行する項のいずれかの改変HSC集団。
[18] 細胞が、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入前もしくは導入後または導入前と導入後の両方で凍結保存される、先行する項のいずれかの改変HSC集団。
[19] 細胞が使用前に凍結保存される、先行する項のいずれかの改変HSC集団。
[20] 細胞が、（a）HSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターをHSCのサンプルと接触させる工程；接触により得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程；および（c）改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程を含む方法によって生成される、先行する項のいずれかの改変HSC集団。
[21] 前記方法が、非改変細胞と比較してPD-L1+発現細胞の数が少なくとも1倍増加していることを確立する工程をさらに含む、項20の改変HSC集団。
[22] 改変PD-L1+発現HSC集団を生成するエクスビボ方法であって、
（a）HSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターをHSCのサンプルと接触させ、それによって核酸の外因性コピーをHSCに導入する工程、
（b）接触により得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、および
（c）改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程
を含む、方法。
[23] 非改変細胞と比較してPD-L1+発現細胞の数が少なくとも1倍増加していることを確立する工程をさらに含む、項22のエクスビボ方法。
[24] HSCのサンプルが、骨髄、臍帯、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯血、胎盤血または末梢血から取得される、項22または23のエクスビボ方法。
[25] HSCのサンプルが動員末梢血から取得される、項24のエクスビボ方法。
[26] HSCのサンプルが健常個体から取得される、先行する項のいずれかのエクスビボ方法。
[27] HSCのサンプルが、診断された疾患または障害を有する個体から取得される、先行する項のいずれかのエクスビボ方法。
[28] 診断された疾患または障害が、自己免疫疾患または障害である、項27のエクスビボ方法。
[29] 自己免疫疾患または障害が1型糖尿病（T1D）である、項28のエクスビボ方法。
[30] ベクターがウイルスベクターである、先行する項のいずれかのエクスビボ方法。
[31] ウイルスベクターがレンチウイルスベクター、鳥ウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスである、項30のエクスビボ方法。
[32] 核酸がcDNAである、先行する項のいずれかのエクスビボ方法。
[33] 核酸がゲノムDNAである、先行する項のいずれかのエクスビボ方法。
[34] 核酸が細胞のゲノムに組み込まれる、項33のエクスビボ方法。
[35] 先行する項のいずれかの造血幹細胞または先行する方法の項のいずれかによって生成される造血幹細胞を含む、組成物。
[36] 先行する項のいずれかの造血幹細胞または先行する項の一つの方法によって生成される造血幹細胞を含む、対象への移植のためまたは対象における免疫応答を減少させるための組成物。
[37] 先行する項のいずれかの造血幹細胞を含む組成物を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置する方法。
[38] 自己免疫障害がT1Dである、項37の方法。
[39] HSCがレシピエント対象にとって自己である、項37または38の方法。
[40] HSCがレシピエント対象にとって非自己かつ同種である、項37または38の方法。
[41] HSCがレシピエント対象にとって非自己かつ異種である、項37または38の方法。
[42] （a）HSC集団を提供する工程、
（b）HSCのサンプルを0.1M濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で少なくとも24時間接触させる工程、
（c）24時間後にPGE2を除去し、それによってPD-L1+発現HSC集団を生成する工程、
（d）PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象において免疫応答を調節する工程
を含む、対象において免疫応答を調節する方法。
[43] （a）HSC集団を提供する工程、
（b）PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルを接触させる工程、
（c）接触により得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、
（d）改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程、および
（e）PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象において免疫応答を調節する工程
を含む、対象において免疫応答を調節する方法。
[44] HSC集団が、骨髄、臍帯、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯血、胎盤血または末梢血から取得される、項42または43の方法。
[45] HSC集団が動員末梢血から取得される、項44の方法。
[46] HSC集団がレシピエント対象にとって自己である、先行する項のいずれかの方法。
[47] HSC集団がレシピエント対象にとって同種である、先行する項のいずれかの方法。
[48] HSC集団がレシピエント対象にとって異種である、先行する項のいずれかの方法。
[49] レシピエント対象への移植前の、PGE2の除去後に、またはベクターを用いたトランスフェクション後のエクスビボ培養後に、HSC集団が凍結保存される、先行する項のいずれかの方法。
[50] 、レシピエント対象への移植前の、PGE2の除去後に、またはベクターを用いたトランスフェクション後のエクスビボ培養後に、HSC集団がエクスビボで培養により拡大させられる、先行する項のいずれかの方法。
[51] 免疫応答の調節を必要とするレシピエント対象を選択する工程をさらに含む、先行する項のいずれかの方法。
[52] 自己免疫疾患または障害の予防または処置に使用するため、対象における免疫応答を抑制するのに使用するため、T1Dを発症する危険がある対象におけるT1Dの発症を遅らせるのに使用するため、同種組織または同種臓器移植拒絶反応を予防するおよび遅らせるのに使用するため、ならびに成人および小児対象におけるT1Dの処置のための、項1〜21のいずれかのPD-L1発現造血幹細胞または項22〜34のいずれかの方法によって生成される造血幹細胞を含む、組成物。
[53] 自己免疫疾患または障害の予防または処置に、対象における免疫応答を抑制するのに、T1Dを発症する危険がある対象におけるT1Dの発症を遅らせるのに、同種組織または同種臓器移植拒絶反応を予防するおよび遅らせるのに使用するための医薬の製造のための、ならびに成人および小児対象におけるT1Dの処置のための医薬の製造のための、項1〜21のいずれかのPD-L1発現造血幹細胞または項22〜34のいずれかの方法によって生成される造血幹細胞を含む、組成物。
[54] 自己免疫疾患または障害の予防または処置に使用するため、対象における免疫応答を抑制するのに使用するため、T1Dを発症する危険がある対象におけるT1Dの発症を遅らせるのに使用するため、同種組織または同種臓器移植拒絶反応を予防するおよび遅らせるのに使用するため、ならびに成人および小児対象におけるT1Dの処置のための、項1〜21のいずれかのPD-L1発現造血幹細胞または項22〜34のいずれかの方法によって生成される造血幹細胞の集団。
[55] 自己免疫疾患または障害の予防または処置に、対象における免疫応答を抑制するのに、T1Dを発症する危険がある対象におけるT1Dの発症を遅らせるのに、同種組織または同種臓器移植拒絶反応を予防するおよび遅らせるのに使用するための医薬の製造のための、ならびに成人および小児対象におけるT1Dの処置のための医薬の製造のための、項1〜21のいずれかのPD-L1発現造血幹細胞または項22〜34のいずれかの方法によって生成される造血幹細胞の集団。
当業者は、疾患または障害の重篤度、過去の処置、対象の全般的健康状態および／または年齢、ならびに他の存在する疾患を含むがこれらに限定されない特定の因子が、対象を効果的に処置するために必要とされる用量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。
本開示は、以下の実施例によってさらに説明されているが、実施例は限定をなすものとみなされるべきではない。本願を通じて引用されているすべての参考文献の内容、ならびにその図面および表は、参照により本明細書に組み入れられる。
当業者は、従来的な実験のみを用いて、本明細書に記載される本開示の特定の態様に対する多くの等価物を認識するまたは確認することができるであろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
実施例1
PD-L1発現の刺激のためにPGE2を用いる例示的なHSCエクスビボ培養プロトコル
CD34+細胞を、磁気ビーズを用いて患者（20mlの血液）から単離し、約1x106個の細胞を、200μlの示されている培地を含むU字底96ウェルプレートにプレーティングした。STFIA培地は、10μg/mlヘパリン、10ng/mlヒトSCF、20ng/mlヒトTPO、10ng/mlヒトFGF-1、100ng/ml IGFBP2および500ng/ml Angptl3を補充した無血清培地と定義した。PGE2を、0時、24時、72時および6日に培養物に添加した。10μMの濃度の希釈されたPGE2の2μlのアリコートを、96ウェルプレート上の各ウェルの200μlに添加した。各ウェルのPGE2のおおよその終濃度は、0.1μMである。したがって、細胞は、約0.1μMのPGE2に暴露される。24時、72時および6日のPGE2の定期的な添加は、培養培地中のPGE2を維持する役割を果たす。細胞を、37℃、5％CO2および正常なO2レベルの下で7日間培養した。
あるいは、細胞を、PGE2の非存在下で48時間、同一培地中で培養し、その後にPGE2を添加し、次いで最初の添加後24時間で添加する。PGE2は、同じ0.1μMのPGE2のおおよその終濃度まで添加する。我々は典型的に、8日間の培養後に、PGE2を添加しなかったことを除いて同じ対象から得られた細胞と同じ条件下で同じ時間培養された同じ培地を含む細胞培養物と比較して、CD34+PD-L1+細胞の約10倍増加を観察した。
健常対象において培養なしの第0日に得られたCD34+PD-L1+細胞の比率はほぼ24％であり、T1D個体では8〜10％である。このプロトコルは、基準と比較してPD-L1の発現増加（少なくとも5倍増加）をもたらす。
実施例2
インビトロマウス研究 - マウスHSC（Lin-c-Kit+Sca-1+, KLS）は、PD-L1を発現する。我々は、CXCR4アンタゴニストにより動員されるHSCの特徴をFACS分析によって評価した。Lin-c-Kit+Sca-1+細胞を、処置から7および14日後の膵島移植またはナイーブCXCR4アンタゴニスト処置マウスから選別した。興味深いことに、大部分の正の共刺激分子が陰性であるかまたはほとんど発現されないことが見出された中（CD40、CD80、CD86、PD-L2、ICOS、OX40、OX40L）、PD-L1は、動員されたHSCによって高度に発現されていた（58.0±7.1％）。抽出されたHSCは、CXCR4も発現していた（38.4±4.2％）。我々は次に、HSCの動員がPD-L1+ HSCの発生を増加させるかどうかを評価したところ、PD-L1+ HSCは、CXCR4アンタゴニスト処置の開始から6時間後のB6膵島移植マウス由来の骨髄において増加していなかった。PD-L1の遺伝子除去は、HSCの免疫調節特性を打ち消した。マウスHSCにおけるPD-L1の免疫調節の役割を評価するため、我々は、インビトロでの同種免疫応答に対するWTおよびPD-L1 KOマウス由来の動員HSCの効果を調査した。標準的なMLRアッセイを行い、HSC（WT B6またはPD-L1 KOマウス由来）は、応答性細胞（B6由来のCD4+細胞）と同系であるが、骨髄由来DC（BLAB/c由来）に対しては同種であった。WT B6マウス由来のHSCは、培養物に添加されたときにMLR応答を打ち消したが、PD-L1 KOマウス由来のHSCではそうならなかった（図1）。末梢PD-L1+ HSCの比率は、B6と比較してNODマウスにおいて減少する。10週齢NODおよびB6マウスにおける末梢PD-L1+ KLSの比率を、FACSによって評価した。PD-L1+ KLSの減少が、B6マウスと比較して正常血糖NOD（10週齢）において確認された（末梢PD-L1+ HSC：B6＝55.6±1.8 対 NOD＝29.5±1.54％；p＜0.001）。さらに、PCR分析は、PD-L1 mRNAが、NODマウス由来のそれと比較してB6マウスから得られたHSCにおいて上方調節されていたことを確認した（図2A〜2C）。HSCにおけるマウスPD-L1欠損は、薬理学的アプローチによってインビトロで好転させることができる。我々は、薬理学的アプローチによるインビトロでのPD-L1+ HSCの生成の実現可能性を評価するためのパイロット研究を実施した。KLS細胞を、磁気ビーズによってB6およびNODマウスの脾細胞から単離し、標準幹細胞培地プラスPGE2（2μl、10μM）を用いて培養した。8日後、PD-L1+ HSCの約30％の増加が観察された（B6およびNOD KLSにおいて、それぞれ、p＝0.002およびp＝0.001）（図2D〜2E）。
インビトロヒト細胞研究 - 末梢PD-L1+ HSCの比率は、健常対象と比較してT1D個体において減少する。CD34+細胞を、磁気ビーズによって首尾よく精製し、我々は、0.05〜0.07％の健常対照およびT1D個体の末梢血単核細胞（PBMC）由来のCD34+細胞の比率を得た。T1D個体においては、健常対象と比較してより少ないPD-L1+ CD34+細胞が検出可能であった（T1D＝9.5％ 対 対照＝23.5％；p＜0.001）（図3A〜3C）。PCR分析を、以前にPBMCから単離されたCD34+細胞から抽出したRNAにおいて実施し、PD-L1が、T1D個体から得られたそれらと比較して、健常対象から得られたHSCにおいて上方調節されていたことを確認した。HSCにおけるヒトPD-L1欠損は、薬理学的アプローチによってインビトロで好転させることができる。我々は、薬理学的アプローチによるエクスビボでのPD-L1+ HSCの生成の実現可能性を評価するためのパイロット研究を実施した。PBMCを、Ficoll-Plaqueプロトコルを用いてT1D個体（n＝10）の末梢血から単離し、CD34+細胞を、磁気ビーズによって選別した。CD34+細胞を、本明細書に記載されるようにして培養した。7日後、PD-L1+ HSCの比率の約8倍増加が観察された（p＝0.001）（図3D〜3E）。
実施例3
インビトロマウス研究 - PD-L1/PD-1架橋は、NODマウスにおける糖尿病の発症およびストレプトゾトシンン投与B6マウスにおける膵島移植片の拒絶反応を遅らせる。我々は、PD-1を刺激しそれによってPD-1に対するPD-L1の架橋を模倣する目的で最近開発された抗PD-1 mAb（ハイブリドーマPIM-2、ラットIgG2a）を使用した。PIM2 Abは、NODマウスにおける糖尿病の発症および膵島同種移植片拒絶反応（BALB/cからB6へ）を遅らせた（図4A〜4B）。PD-L1形質導入KLSの注入は、NODマウスにおいて高血糖症を元通りにした。KLSをNODマウスの骨髄から単離し、蛍光マーカーZsGreenおよびPD-L1遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを293TNプロデューサー細胞に感染させることによって以前に得られたPD-L1偽型ウイルス粒子を用いて形質導入した。高濃度のウイルスを得た後、KLSを感染させ、その後に7日間培養でPD-L1形質導入KLSとして拡大させることができる。PD-L1の発現は、ドキサプロモーターの制御下にあり、したがって形質導入細胞においてPD-L1発現を刺激するためにドキササイクリンを注射する必要がある。次いで、5x106個のPD-L1形質導入KLSを、高血糖NODマウスに静脈内注射し、5日後にドキササイクリンを注射する。PD-L1形質導入KLSの注射は、18.5±2.5日間、NODマウス（n=2）において高血糖症を元通りにした（図5A〜5B）。PD-L1+ KLSは、インビトロでCD4拘束抗BDC2.5自己免疫応答を減少させた。我々は、すでに記載されている薬理学的アプローチを用いて作製された自己HSCを添加（HSC対エフェクター細胞の比1:1、1:10、1:100）する抗BDC2.5刺激ELISPOTアッセイにおいて10週齢NODマウスの脾細胞から抽出されたCD4+ T細胞を試験した。しかし、HSCの免疫調節特性の欠陥が、NODマウスにおいて観察された。
実施例4
機能的ヒト研究
自己造血幹細胞移植（AHSCT、骨髄移植としても公知）は、免疫系の再構築を助けるための、血液幹細胞の再注入と組み合わされた免疫抑制化学療法処置である。新たに発症したT1DにおけるAHSCTは、6か月で処置された個体のほぼ60％を正常血糖にした。48か月間追跡した65名の個体のグループにおいて、非骨髄機能廃絶条件でのAHSCTは、条件付き免疫抑制（ATG+シクロホスファミド）および自己HSCの1回の注射を行った後、最初の6ヵ月でT1D個体のほぼ60％においてインスリン非依存性を達成した。処置された対象の32％は、彼らの追跡の最終時点でもインスリン非依存性を維持していた。処置された対象は、処置前と比較して、HbA1cの減少およびCペプチドレベルの増加を示した。
処置後の完全な免疫回復（すなわち、白血球数）にもかかわらず、処置された個体の52％は、副作用を体験した。T1D個体のHSCは、それらの免疫調節特性が不良であった。我々は、我々の薬理学的アプローチを用いて新たに作製した自己CD34+細胞（ヒトHSC）を添加（1:1、1:10、1:100比のHSC対エフェクター細胞）する抗CD3/CD28刺激アッセイにおいて健常な対象またはT1D個体のPBMCから抽出されたCD4+ T細胞を試験した。健常対象から得られたHSCの添加は、IFN-γ-産生CD4+T細胞の用量依存的な減少をもたらした。これに対して、T1D個体由来のHSCを添加したとき、免疫調節特性の不良が観察された。HSCは、T1D個体において動員不良を示した。HSC細胞（CD34+）の動員が絞り出されたもの（expression）でないことを確認するため、我々はT1D個体におけるHSCの動員特性を評価した。我々は試験（NCT01102699）を設計し、これをPadua University（Dr. Gianpaolo Fadini）と共に実施し、その中で我々は、6名のT1D個体において5μg/kg hrG-CSFに対する骨髄の応答を試験した。CD34+細胞は健常個体において有意に増加したのに対して、T1D個体ではCD34+の動員不良が観察された。このデータは、T1D個体におけるHSCの「動員病（mobilopathy）」の存在を確認するものである。CXCR4アンタゴニストを用いたHSCの動員は、T1D個体のPD-L1+ HSCを増加させない。動員がHSCにおけるPD-L1の発現を変化させるかどうかを評価するため、我々は、5名の健常対象および8名のT1D個体において抗CXCR4を用いた動員前後のHSCの免疫表現型を研究した。CD34+細胞におけるPD-L1発現は、健常対象において動員後に増加した（6.2±0.6対0.6±0.2、p=0.0001）のに対して、それはT1D個体のCD34+細胞においては変化せず（4.7±1.5対1.5±0.8）、このことは、CD34+細胞がPD-L1欠陥を好転させそれらの免疫調節特性を回復させるためにインビトロ操作を必要とすることを強調している。
実施例5
PGE2はマウスおよびヒトの両方のHSC細胞におけるPDL1発現を大きく増強する
マウス：我々は、標準的な幹細胞成長因子を補充した無血清培養培地中で単離されたHSC（KL細胞）を培養し、8日間の培養の間の異なる時点でプロスタグランジンE2（PGE2）由来の新規の低分子で刺激した。簡単に説明すると、末梢LinnegSca-1+Kit+細胞を、10週齢NODマウスから単離し、150〜200個を、すでに記載されているように補充された200mlのStemspan無血清培地（Stem-Cell Technologies）を含む96ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。インビトロで単離されたマウス／ヒトHSCを拡大させることが示されており、現在ヒトにおいて第II相臨床試験で試験されているPGE2を、24時間、96時間および6日に添加（2μl、10μM、Chemicon）し、新たに生成されたPD-L1+ HSCのプールを増幅した。細胞を、5％CO2下、37℃で8日間培養した。
ヒト：ヒトHSCを、以前に報告（22）されているようにヒト幹細胞成長因子を補充したStemSpanを用いて培養した。簡単に説明すると、CD34+細胞を、7日間、96ウェルプレート上の200μl/ウェルの補充されたStemSpanに5x105細胞/mlとなるようプレーティングした。HSCを、マウス実験において記載されたようにPGE2を用いて刺激した。PD-L1+ HSCを、異なる時点およびこの手順の最後に、FACS分析によって定量した。
実施例6
PD-L1+発現造血幹細胞を用いた処置プロトコル
初期評価 - 患者は、機関のガイドラインにしたがい自己骨髄移植のための標準的な準備を行い、次いで最小4週の間隔で、予備骨髄のため（最小で2x106 CD34+細胞/kg）および自己骨髄の収集のため（目標5x106 CD34+細胞/kg、最小で4x106 CD34+細胞/kg）に使用される2回の骨髄収集を行う。
予備用自己移植片の収集 -遺伝子操作された細胞の注射後6週の間、造血系の回復が観察されないまたは操作された細胞が救済基準を満たさない場合の復旧手順（「予備用移植片」）として使用するために、造血細胞を処置の前に患者から収集する。少なくとも遺伝子療法の4週前に、複数の穿孔により全身麻酔下の患者の両側の後腸骨稜から骨髄（最大20ml/kg）を収集する。予備用移植片とする自己骨髄の収集のために、標準的な臨床手順にしたがい、2x106 CD34+細胞/kgを含む骨髄の一部を、未操作のまま、液体窒素蒸気（-162℃および-180℃）中で凍結および保存する。収集物の残りを、CD34+細胞について選択し（以下に記載）、遺伝子改変のために利用する（以下に記載）。
骨髄の収集 - 必要とされる予備用骨髄を超える第1の骨髄収集物の残りを、遺伝子導入のための第2の骨髄収集物と共に使用する。第2の収集は、最初の収集（上記）から4週後よりも早くは行わない。第2の収集において、複数の穿孔により、全身麻酔下の患者の両側の後腸骨稜から再度、骨髄を収集する。収集される骨髄の量は、最大20ml/kg体重である。これは、約4x108細胞/kgを超える総有核細胞数に相当する。これはその後、CD34+細胞選択後に4x106細胞/kgを超えるCD34+細胞量をもたらし得る。
両方の収集物の推定CD34+数が＜4x106細胞/kgである対象では調整を行わない。少なくとも6週間の期間ののち、対象が研究にとどまることを望む場合、彼から再度収集を行い得る。形質導入CD34+細胞の投与前に研究から離脱した対象には、通常の臨床治療（対症療法および／または同種HSCT）を再開する。有効性および安全性の評価は、離脱の時点以降行わず、データはデータベースのために収集されない。
CD34+細胞の精製 - 調整剤の除去のために十分な時間を確保しつつ、前刺激および培養の時間を最小限に抑えるため、総骨髄を一晩維持する。この骨髄を、密度勾配遠心分離により赤血球除去する。CD34+細胞を、CliniMACS試薬および機器を用いて骨髄単核細胞から正選択する。純度および滅菌性を評価するために、品質管理（QC）サンプルを採取する。精製された細胞を、前刺激および形質導入のために直接処理する。
CD34+細胞の前刺激およびベクターを用いた形質導入 - 形質導入を、一方または両方の収集物において行う。第1の収集物由来の予備用骨髄標的の余りの細胞の形質導入を行い、将来の使用のために凍結する。第2の収集物は、その全体を遺伝子導入のために使用し、調整後に、第2の収集物の形質導入物に、第1の収集物由来の解凍された形質導入細胞を添加する。
精製されたCD34+細胞を、成長因子（IL-3、SCF、FLT3L、TPO）を補充した無血清培地中0.5〜1x106/mlの密度で、密封培養バッグ内に播種し、これを37℃、5％CO2のインキュベーター内に入れる。24〜30時間後、細胞を収集し計数する。追加のQC試験は、細胞生存度およびコロニー形成単位（CFU）アッセイを含む。細胞を新しい培養バッグに移し、レンチウイルス上清で処置する。この第1回目の形質導入のために、細胞を18〜24時間インキュベートする。次いで細胞を収集し、計数し、第2回目の形質導入のためのレンチウイルス上清を含む新しいバッグに移す。
最終収集および配合 - 第2回目の形質導入の後、細胞を収集し、plasmalyteで洗浄し、50〜100mL量のそれらの最終配合物（PLASMALYTE、1％HSA）に再懸濁する。QCサンプルの採取後に利用可能なすべての細胞を、患者に注入する。QCは、細胞数、生存度、洗浄上清における滅菌性、マイコプラズマ、上清における内毒素、表現型、CFU、RCL（採取および保管したサンプル）、挿入分析およびqPCRによる平均ベクターコピー数（培養細胞）を含む。グラム染色のためのサンプルを、患者への送達直前に生成物から採取する。
CD34+細胞のエクスビボ培養およびPGE2による刺激 - 精製されたCD34+細胞を、10μg/mlヘパリン、10 ng/mlヒトSCF、20 ng/mlヒトTPO、10 ng/mlヒトFGF-1、100 ng/ml IGFBP2および500 ng/ml Angptl3を補充した無血清培地と定義されるSTFIA培地中0.5〜1x106/mlの密度で密封培養バッグに播種し、37℃、5％CO2下のインキュベーターに入れ、48時間培養する。培地を交換し、PGE2を、0.1μMの終濃度を達成するよう細胞に添加する。さらに24時間後、PGE2を再度、細胞に添加する。細胞を、第2回目のPGE2添加から1〜8日後に収集する。第2日以降の収集のために、さらなるPGE2を、培養培地の交換と共に、第2、第4、第6日に培養培地に添加する。
対象への再注入前の試験 - 細胞数および生存度（トリパンブルー除去またはその同等法）、滅菌性、マイコプラズマ、形質導入効率（ベクターコピー数）、グラム染色、内毒素およびRCL試験のために、この手順の間および最後にサンプルを収集する。これらのうち、細胞生存度、滅菌性（プロセス内、72時間）、グラム染色および内毒素測定のみが、注入前に実施可能である。
微生物学的培養物が、72時間でグラム染色または陽性の培養によって一時的な細菌混入を示す場合、Cell Manipulation Core FacilityのスタッフがPI、アシスタントメディカルディレクターおよび担当医に、予備用収集物を注入するかまたは網羅する抗生物質を含む生成物を注入するかを決定するよう接触する。予備用収集物が注入される場合、対象は、プロトコルから除外される。細胞生存度が＜70％である、滅菌性試験が陽性である、または内毒素が＞5 EU/kg/hrである場合、細胞を戻さず、予備用収集物を注入し、対象をプロトコルから除外する。
形質導入の最終時点で収集物／形質導入物の両方の生存細胞数が4x106 CD34+細胞/kg以上である場合、細胞を注入する。形質導入の最終時点で収集物／形質導入物の両方の生存細胞数が4x106 CD34+細胞/kg未満である場合、細胞を注入せず、予備用収集物を48時間後に注入する。
CD34+細胞のサンプルを、PD-L1発現について試験してもよい。
形質導入CD34+細胞の投与前に本研究から除外された対象には、通常の臨床治療（対症療法および／または同種HSCT）を再開する。有効性および安全性の評価は、除外の時点以降行わず、データは症状報告文書（CRF）に記録されない。
対象の調整計画 - 対象は、ブスルファン（毎日約4 mg/kg静脈内、体重で調節（一日一回、3時間かけて投与））を形質導入細胞の注入前の第-4〜-2日に投与することにより、骨髄破壊調整を受ける。調整は、骨髄細胞の精製および形質導入と同時に行う。ブスルファンレベルを全3投与日で測定し、第1および2日のレベルを体重による調節に使用する。
形質導入細胞の注入 - 従来通りの病院の造血幹細胞移植室の標準ガイドラインにしたがう標準的な事前水分補給および事前投薬の後に30〜45分かけて細胞を静脈内注入する。この標準法は、注入の間およびその後30分間、患者が継続的な心臓、呼吸および酸素飽和度の監視下にあることを必要とする。生命兆候を、輸液前、輸液までの15分間、注入中1時間毎、および注入の最後に測定し記録する。RNは、輸液の最初の5分間、患者のもとにとどまる。2つの形質導入物を投与する場合、第2の形質導入物は、第1から遅らせずに投与する。
実施例7
Fate Therapeutics, Inc.のプログラムされたCD34+/PD-L1+免疫調節細胞製品であるToleraCyte（商標）は、T1Dマウスを治療することが示されている。ToleraCyte（商標）は、自己免疫および炎症障害の治療に関して前臨床調査が行われているプログラムされたCD34+細胞免疫療法である。この免疫調節細胞療法は、独自の薬理学的調整剤の組み合わせによってエクスビボでプログラムされたCD34+細胞から構成される。ToleraCyteは、炎症部位に効率的に移動し、PD-L1およびIDO1を含む強力なT細胞調節因子を発現するようCD34+細胞の能力を最適化するよう設計されている。
ヒト1型糖尿病（T1D）のマウスモデルである、十分に確立された非肥満糖尿病（NOD）マウスにおける前臨床実験において、プログラムされた細胞ToleraCyte（商標）の単回投与は、NODマウスモデルにおいてT1D糖尿病の持続的修正をもたらした。高血糖NODマウスは、新たに発症する1型糖尿病を模倣するよう設計されている。加えて、前高血糖NODマウスにおいて、プログラムされた細胞ToleraCyte（商標）の単回投与は、NODマウスにおいてT1Dの発症を統計的にかつ有意に遅らせることも示され、発症までの時間の中央値が、未処置マウス（発症までの時間の中央値＝第115日；p=0.0004）と比較して第140日に達しなかった。
さらに、1型糖尿病のヒト化モデルにおいて、プログラムされたCD34+細胞は、膵臓への高い輸送性およびT細胞活性化の調節を示した。まとめると、これらの前臨床結果は、ToleraCyte（商標）が1型糖尿病患者に対する疾患修飾免疫療法として機能し得るという前提を支持している（SAN DIEGO, June 11, 2016 (GLOBE NEWSWIRE)）。
実施例8
実験デザインおよび方法
ヒト研究のデザインおよび方法
患者の特徴づけ - The San Raffaele Scientific Research Instituteにおいて、Institutional Review Board委員会の承認の下、新たに糖尿病を発症した個体（新規発症T1D）、長期間糖尿病を患っている個体（T1D）および健常個体（対照）から血液サンプルを採取した。細胞培養実験のために、末梢血単核細胞（PBMC）画分を、Ficoll密度勾配遠心分離により単離した。Institution Review Board Commitee of Padova (2996P)にしたがい、処置前の基準時および0.24 mg/kg体重の用量のCXCR4アンタゴニスト（Mozobil; Sanofi）処置6時間後に、追加の血液サンプルをT1D対象および対照から採取し、これをヘルシンキ宣言にしたがい実施した（clinicaltrials.govに登録された臨床試験（NCT02056210））。University Hospital of Padovaの糖尿病外来医院に登録されている中から18〜65歳の1型糖尿病患者を勧誘した。他の代謝疾患のスクリーニングのために、18〜65歳の糖尿病を患っていない個体を同じ外来医院に登録されている中から勧誘した。全員が書面上のインフォームドコンセントを提供した。除外基準は、妊娠または授乳；最近（研究開始から2ヵ月以内）の手術、外傷または急性疾患；免疫疾患（1型糖尿病および自己免疫性甲状腺炎を除く）；慢性感染疾患；過去または現在のいずれかの血液悪性腫瘍；判明しているまたは強く疑われる固形腫瘍；白血球増加症、白血球減少症または血小板減少症；固形臓器移植または免疫抑制；肝機能の変化（トランスアミナーゼが正常値の上限より＞2）；重度の慢性糖尿病性微小または大血管障害；HbA1c＞11％；腎機能の不良（推定糸球体ろ過率＜50 mL/min/1.73m2）；末梢リンパ球免疫表現型の有意な異常；プレリキサホルまたはその賦形剤に対する既知の過敏症；およびインフォームドコンセントの提供の拒否または能力欠如、であった。出産能力を有する女性は、経口避妊および陰性妊娠試験を研究開始前に要求された場合、研究に参加可能とした。女性はまた、プレリキサホル投与後3ヵ月の間、経口避妊の継続を求められた。糖尿病の処置および他の医学的状態のためのすべての医薬が、本研究において許可された。
ヒト抗体 - 以下の抗体を、報告する研究においてフローサイトメトリー分析のために使用した：フィコエリトリン（PE）結合抗ヒトPD-L1（CD274）またはアロフィコシアニン（APC）標識抗ヒトPD-L1（CD274）、PE結合抗ヒトPD-１（CD279）、PE結合抗ヒトPD-L2（CD273）、PE結合またはR-フィコエリトリンシアニン5.1（PC5）結合抗ヒトCD34、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗ヒトCD45、PE結合抗ヒトCD19、ぺリジン・クロロフィル・タンパク質複合体（PerCP）結合抗ヒトCD11ｃおよびパシフィックブルー（PB）結合抗ヒトCD16を、BD Biosciences、BiolegendまたはBeckman Coulterから購入した。以下の抗体は、上記のヒト抗体の異なるアイソタイプ対照に対応するものであった：PE結合マウスIgG1κ、マウスPC5結合IgG1、APC標識マウスIgG2bκ。
ヒトフローサイトメトリー分析 - ヒトHSCにおけるPD-L1、PD-L2およびPD-1の発現を評価するため、健常個体、T1Dおよび新規発症T1D個体から収集された新鮮な血液を、PE-Cy5.5抗ヒトCD34、PE抗ヒトPD-L1もしくはPD-L2またはPD-1（BD Biosciences）を用いて染色した。B細胞、樹状細胞または単球におけるPD-L1発現を評価するため、新鮮な血液をまた、それぞれ、PECy7抗ヒトCD19、APC抗ヒトCD11cまたはパシフィックブルー抗ヒトCD16（すべてBD Biosciences）と共に、PE抗ヒトPD-L1を用いて染色した。BD LSRFortessaフローサイトメーター（BD Biosciences）を使用して、幹細胞またはリンパ球の光散乱特性により細胞を分析した。バックグラウンド染色を、非反応性アイソタイプ一致対照mAbを用いて決定し、ゲートを非反応性細胞の99％を除去する位置に設定した。FlowJoソフトウェアバージョン8.7.3（Treestar, Ashland, OR）を分析に使用した。アポトーシスを、以前に単離されたCD34+細胞を透過化によって評価し、次いでこれをAPC Annexin A（BD Biosciences）で染色し、死細胞を、Fixable Viability Dye Staining（Amcyan, eBiosciences）を用いて検出した。
ヒトCD34+細胞のインビトロ増殖アッセイおよびグルコースチャレンジ - CD34+細胞を最初に磁気ビーズ（Miltenyキット）を用いて参加した対象の血液サンプルから得られたPBMCから単離した。次に、CD34+細胞をCFSE（FITC, Invitrogen C1157）で染色し、37℃、5％CO2の下、StemSpam SFEM II培地（StemCell Technologies）中で72時間培養した。増殖を、フローサイトメトリーによって、24時間、48時間および72時間での色素希釈にしたがい可視化した。グルコース暴露がCD34+細胞におけるPDL-1発現に影響するかどうかを評価するため、我々は、対照およびT1Dから得られたPBMCから以前に単離されたCD34+細胞を、異なるグルコース濃度（5 mM、20 mMおよび35 mM）の無血清DMEM中で72時間培養した。PDL-1発現を、以前に記載されたようにしてFACSによりアッセイした。
ヒトHSC CD34+ HSCの薬理学的調整 - 1x106個の単離されたヒトCD34+ HSC細胞を、37℃、5％CO2の下、U字底96ウェルプレートにおいて、組み換えヒトSCF（50 ng/ml）、組み換えヒトTPO（50 ng/ml）、組み換えヒトFLT3-L（50 ng/ml）、ヒトIFN-β（1000 U/ml）、ヒトIFN-γ（5 ng/ml）およびヒトポリイノシン酸・ポリシチジル酸（Poly I:C）（1μg/ml）を補充した200μlのStemSpan SFEM II培地中で培養した。24時間の培養前後に、PD-L1発現を、抗ヒトCD34および抗ヒトPD-L1ならびにそれらの対応するアイソタイプ対照を用いたフローサイトメトリーによって評価した。
ヒトELISpotアッセイ - 我々のグループによって以前に示されたように（16）、ELISPOTアッセイを製造元のプロトコル（BD Biosciences, San Jose, CA）にしたがい使用して、IFN-γ産生細胞の数を測定した。T1D患者から単離された1x106個のPBMCを、10％ FBSを補充したRPMI培地中、IA-2（100μg/ml）ペプチドの存在下で48時間培養した。刺激後第1日に、500μlの培地を培養物に添加した。細胞を第2日に収集し、未補充RPMI培地中1:1、1:2、1:4または1:8の比のトリフェクタ調整CD34+ HSCであるCD34+ HSCを含むまたは含まないヒトIFN-γ ELISpotアッセイにプレーティングした。スポットを、A.EI.VIS Elispot Reader（A.EL.VIS GmbH, Hannover, Germany）を用いてまたはImmunospot Readerにおいて計数した。
ウェスタンブロット - 腸生検サンプルの総タンパク質を、Laemmli緩衝液（Tris-HCl 62.5 mmol/l、pH 6.8、20％グリセロール、2％SDS、5％β-メルカプトエタノール）中で抽出し、それらの濃度を測定した（Lowry et al., 1951）。35μgの総タンパク質を7％ SDS-PAGEゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース（Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）上にブロットした。次いでブロットをPonceau Sを用いて染色した。メンブレンをTBS（Tris [10mmol/l]、NaCl[150mmol/l]）、0.1％Tween-20、5％脱脂粉乳、pH7.4中、25℃で1時間ブロックし、TBS-5％ミルクで1:200希釈されたポリクローナルヤギ抗ヒトPdcd-1L1抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）または1:1000希釈されたモノクローナルマウス抗βアクチン抗体（Santa Cruz Biotechnology）と共に4℃で12時間インキュベートし、TBS-0.1％TWEEN（登録商標）-20で4回洗浄し、次いでTBS-5％ミルクで1:1000希釈されたペルオキシダーゼ標識マウス抗ヤギIgG二次抗体（またはβアクチンに対するウサギ抗マウス）（Santa Cruz Biotechnology）と共にインキュベートし、最後にTBS-0.1％Tween-20で洗浄した。得られたバンドを、高感度化学発光（SuperSignal；Pierce, Rockford, IL, USA）を用いて可視化した。
qRT-PCR - Trizol（登録商標）Reagent（Invitrogen）を用いて単離されたCD34+細胞からRNAを抽出し、TaqManアッセイ（Life Technologies, Grand Island, NY）を製造元の指示にしたがい用いてqRT-PCR分析を行った。標準化された発現値を、ΔCt法を用いて決定した。定量逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）データを、ACTBの発現をもとに標準化し、ΔCt値を計算した。統計分析は、関心対称の集団とすべての他の集団の間の多重比較のために、一元配置分散分析およびその後のボンフェローニ事後検定を通じて各患者のすべての細胞集団にわたり遺伝子発現を比較した。統計分析は、利用可能なソフトウェアRT2プロファイラーPCR Array Data Analysis（Qiagen）を用いることによっても実施した。2つのグループの比較のために、スチューデントt検定を使用した。分析は、新鮮なCD34+細胞の単離後に三連で行った。使用したプライマーの主な特徴が以下に報告されている。
Figure 2018520688
共焦点顕微鏡 - 1型糖尿病個体由来および健常対照対象由来の骨髄切片を、対応する抗体で染色した。Zeiss LSM 510 Meta共焦点顕微鏡（Carl Zeiss SpA）において写真を撮影した。染色手順の詳細は、補足手順において見出すことができる。
マウス研究のためのデザインおよび方法
動物 - メスNOD/ShiLtJ（NOD）およびオスC57BL/6Jマウスは、The Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から購入した。すべてのマウスを、機関のガイドラインにしたがい使用し、動物プロトコルは、Boston Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認された。
糖尿病の監視 - 顕性糖尿病を、2連続日にわたる250 mg/dLを超える血糖レベルと定義した。血糖は、Breeze2（Bayer S.p.A., Viale Certosa, Milano, Italy）血糖メーターを用いて測定した。
リバース研究 - メスNODマウスを、10週齢から監視し、高血糖症（＞250mg/dl）の第2日に、3x106細胞として尾静脈を通じて投与したKL-PD-L1.Tg細胞またはHSC未調整細胞、HSCモック形質導入細胞またはトリフェクタ調整HSC（上記参照）を注射した。マウスを、屠殺の時点まで血糖を測定することによって毎日監視し（250 mg/dlを下回る正常血糖が処置翌日に観察された）、測定を、National Institutes of Healthのガイドラインにしたがい尾からの採血によって行った。骨髄細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗い流すことによって、NODおよびC57BL/6Jマウスの大腿骨および脛骨から取得した。骨髄細胞を、Lineage Negative Depletion Kit（Miltenyi Biotec）を用いることによってlineage除去した。除去の際、lineage陰性c-kit+細胞を、CD117 Microbeads（Miltenyi Biotec）を製造元の指示にしたがい用いて単離した。
マウスフローサイトメトリー抗体 - 以下の抗体を、骨髄および脾臓から抽出したKLの表現型特徴を評価するためのフローサイトメトリー分析に使用した：フィコエリトリン（PE）結合抗ヒトPD-L1（CD274）またはアロフィコシアニン（APC）結合ラット抗マウスPD-L1（CD274）、フィコエリトリン（PE）結合抗ラット抗マウスPD-１（CD279）、フィコエリトリン（PE）結合ラット抗マウスPD-L2（CD273）を、それぞれBD BiosciencesまたはBiolegendから購入した。以下の抗体は、上記のマウス抗体の異なるアイソタイプ対照に対応するものであった：PEマウスIgG1、κアイソタイプCtrl；およびAPCマウスIgG2b、κアイソタイプCtrl。
マウスKLの特徴の免疫表現型特徴づけ - 以前に骨髄から抽出したマウスKL細胞を200μLの緩衝液に懸濁し、次いで以下の抗体を用いて染色し、製造元の指示にしたがい4℃で30分間インキュベートした。細胞を緩衝液で洗浄し、300gで10分間遠心分離し、300μlの緩衝液に懸濁した。以下の抗体を染色に使用した：ラット抗マウスCD274もしくはCD273または抗マウスCD279。KL細胞におけるPD-L1、PD-L2およびPD-1発現を、ヒストグラムで表した。
8週齢のNODおよびB6マウスから抽出された骨髄を、ACK溶解緩衝液（BD溶解緩衝液）による赤血球溶解、およびその後のFlow緩衝液（BD染色緩衝液）中での洗浄工程に供した。骨髄細胞を、以下の抗体のカクテルで染色した：
抗Lineage陰性カクテル-APC、抗C-kit-PerCP、抗Sca1-FITC、抗CD150-PE、抗CD41FITC、抗CD48-PerCP、抗CD244 PerCP、抗PD-L1-PEおよび抗PD-L1-APC。すべての抗体を、eBioscienceおよびBD Pharmingenから購入した。サンプルを、4℃の暗所で30分間インキュベートし、Flow Mediumを用いて再度洗浄し、最後にホルマリン1％で固定する。サンプルを、FACS Caliburにおいて試験し、結果を、Flowjoソフトウェアを用いて分析する。
フローサイトメトリー分析 - 非造血幹細胞の特徴づけ - B細胞を評価するためにサンプルあたり1x106細胞を、抗マウスB220-PEを用いて染色し、樹状細胞を、抗CD11c-PerCPを用いて、単球を、抗マウスF4/80 APCを用いて決定する。B220+細胞、CD11c+細胞およびCD16+細胞におけるPD-L1発現を、抗マウスCD274-PEを用いることによって評価した。簡単に説明すると、単離された骨髄細胞および脾細胞を、Flow Medium（2％のFCSおよび0.05％のアジ化ナトリウムを含むPBS）中で洗浄し、flow抗体の適当な希釈物で染色した。サンプルを、4℃の暗所で30分間インキュベートし、Flow Mediumを用いて再度洗浄し、最後にホルマリン1％で固定する。サンプルを、FACS Caliburにおいて試験し、結果を、Flowjoソフトウェアを用いて分析する。抗マウスCD11c-PerCPはBiolegendから購入し、抗マウスF4/80 APCはeBioscienceから、使用する抗マウスPD-L1はBD Pharmingenから購入する。
アポトーシスアッセイ - 単離されたKL細胞を冷PBSで二度洗浄し、次いで1x106細胞/mlの濃度となるよう1X Binding Buffer（商品番号51-66121E；BD Pharmingen）中に再懸濁した。次に、100μlの溶液（1x105 HSC含有）を5ml培養試験管に移し、続いて5μlのPE Annexin Vおよび5μl 7-AADを用いた染色を行い、その後に細胞をボルテックスし、RT（25℃）、暗所で15分間インキュベートすることによって処理した。インキュベート後、フローサイトメトリーによるそれらの取得の前に、各試験官に400μlの1X Binding Bufferを添加した。以下の対照を使用して補償および四部構成を設計した：非染色細胞、PE Annexin Vで染色した細胞（7-AADなし）および7-AADで染色した細胞（PE Annexin Vなし）。PE Annexin Vについて染色陽性でありかつ7-AADについて陰性である細胞は、アポトーシスを起こしているものであった。PE Annexin Vおよび7-AADの両方について染色陽性である細胞は、壊死の最終段階にあるか、壊死を起こしているかまたはすでに死んでいるかのいずれかであった。PE Annexin Vおよび7-AADの両方について染色陰性である細胞は生きておりかつ測定可能なアポトーシスを起こしていないものであった。
インビトロ増殖アッセイ - 単離されたKL細胞を、FCSを含まない冷PBS緩衝液で二度洗浄し、次いで3x107細胞/mlとなるよう最終量の半分の緩衝液に再懸濁し、残りの半分量に10uMの終濃度に達するようCFSEを添加した。希釈したCFSEを細胞懸濁物に添加し、その後にボルテックスし、37℃で15分間インキュベートする。インキュベート後、残存する遊離CFSEを失活させるために、FCSを細胞懸濁物に添加し、その試験官を、PBS緩衝液で完全に満たす。2回目の洗浄の後、細胞を培地中に再懸濁し、5％CO2下、37℃で3日間培養した。72時間の増殖後、KL細胞を、色素の希釈にしたがいフローサイトメトリーにおいて可視化することができる。
マウスELISpotアッセイ - 我々のグループによって以前に示されたように（16）、ELISPOTアッセイを製造元のプロトコル（BD Biosciences, San Jose, CA）にしたがい使用して、IFN-γ産生細胞の数を測定した。NOD処置マウス（NOD-PD-L1.Tg処置、NOD-トリフェクタ処置、NOD-KL処置）およびNOD未処置マウスから単離された1x106個の脾細胞を、以下のマウス膵島ペプチド（150μg/ml）の存在下で24時間培養した：300μg/mlのBDC2.5、IGRP、GAD65およびインスリン。スポットを、A.EI.VIS Elispot Reader（A.EL.VIS GmbH, Hannover, Germany）を用いて計数した。
細胞株および細胞培養物 - この研究で使用したLenti-XTM 293T細胞株は、推奨されているようにClontechから購入した。ヒト細胞株HEK293Tを用いるすべての手順およびレンチウイルス法は、Boston Children's Hospital Committee, Harvard Medical SchoolのInstitutional Biosafty Committee（IBC）による承認を得た。
レンチウイルスの産生および形質導入 - マウスPD-L1をコードする全長cDNAを、運搬プラスミドpHAGE-fullEF1a-MCS-IZsGreenにクローニングした。VSV-G偽型レンチウイルスは、Trans-IT 293トランスフェクション試薬（Mirus）を用いてマウスPD-L1運搬プラスミドと共にパッケージング発現プラスミド（Gag/Pol、Tat、Rev）およびVSV-Gをコードするエンベロープ発現プラスミドを293T細胞に共トランスフェクトすることによって作製した。トランスフェクションから24または48時間後、ウイルス粒子を含む上清を収集し、1800rpmで5分間遠心分離して死細胞および残骸を除去し、Lenti-X濃縮試薬を製造元のプロトコル（Takara Clontech）にしたがい用いて濃縮した。ウイルスストックは、形質導入実験を実施するまで-80℃で保存した。新たに単離したマウスKL細胞を、2μg/mLポリブレン（Sigma）、10 ng/mlのSCFおよび100 ng/mlのTPOの存在下でStem SFEMII（Stem cell Technology）中で組み換えPD-L1レンチウイルス粒子を用いて形質導入した。形質導入の24時間後、細胞をFACS分析のために収集し、リバース研究のために使用した。
ルシフェラーゼアッセイ - NOD.FVB-Tg(CAG-luc,-GFP)L2G85Chco/FathJ由来のKL細胞を、Jackson Laboratoryから購入し、その後にPD-L1レンチウイルスを用いて形質導入し、高血糖NODに注射した。24時間後、処置したマウスにルシフェリンを注射した。ルシフェリン注射後、ルシフェラーゼ発現を、IVIS Spectrumによって評価する。全手順の詳細は、補足方法において見出すことができる。
マウスKL細胞HSCの調整 - マウス骨髄KL細胞を、磁気ビーズおよびMACS（登録商標）分離カラム（Miltenyi）を用いて単離し、約2X105個の細胞を、200μlの以下の培地を含むU字底96ウェルプレート（3799；Corning）にプレーティングした。異なる成長因子のカクテルを補充したStemspan-SFEMII（StemCell Technologies）。細胞を、5％CO2下、37℃で24時間培養した。培養前に、PD-L1発現を、ラット抗マウスPD-L1（BD Pharmingen）および対応するアイソタイプ対照ラットIgG2a,λ（BD Pharmingen）を用いるFACSによって評価した。
トリフェクタ調整 - 単離されたKL細胞を、50 ng/mlの組み換えヒトSCF（StemCell Technology）、50 ng/mlのマウスTPO（StemCell Technology）、50 ng/mlの組み換えマウスIL-3（R&D SYSTEMS）、組み換えマウスIFN-β（1000 U/ml）（R&D SYSTEMS）、マウスIFN-γ（5 ng/ml）（R&D SYSTEMS）および1μg/mlのヒトPloy（I:C）（ポリイノシン酸・ポリシチジル酸）（InvivoGen）を補充したSFEMII（StemCell Technologies）中に再懸濁した。
ウェスタンブロット - マウスKL細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含むRIPA緩衝液（20mM Tris pH8.0、150mM NaCl、0.1％SDS、0.5％DOC、0.5％トリトンX-100）中に均質化させた。50μgの総タンパク質に相当する細胞溶解産物を、4％〜20％ SDSポリアクリルアミド勾配ゲル（Bio-Rad）上で分画し、ニトロセルロースメンブレン（0.2μm、Bio-Rad）に転写した。メンブレンを、室温で1時間、5％BSAでブロックし、次いで抗PD-L1（Santa Cruz Biotechnology）、抗ウサギGAPDH（Cell Signaling TECHNOLOGY）と共に一晩インキュベートした。検出は、抗ウサギIgG、HRP結合抗体を用いて行った。
qRT-PCR - KL細胞におけるPD-L1遺伝子の発現レベルを測定するため。総RNAをKL細胞から抽出し、42℃で30分間、100μlの抽出緩衝液（Arcturus Picopure, Applied Biosystems）で処理し、次いで異なる洗浄工程に供し、製造元の指示にしたがい15ulの溶出緩衝液に溶出させた。RNAを、ナノドロップ分光光度計によって定量し、その後にABI Reverse Transcription and Taqman PreAmp Kit（Applied Biosystems）を製造元の指示にしたがい用いて逆転写および予備増幅を行った。TaqMan遺伝子発現アッセイ（Applied Biosystems）を、7900HT高速リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）を用いて三連サンプルにおいて行った。データを、GAPDHハウスキーピング遺伝子をもとに標準化した。
HSCの共焦点顕微鏡および免疫蛍光 - 8週齢のNODおよびB6マウスの大腿骨および脛骨から抽出した骨髄を、OCTで包埋し、エタノールおよびドライアイスのスラリー中で冷却した-80℃のN-メチルブタン中で瞬間凍結させた。Microtomeを用いて切片（7μm）を調製し、風乾させ、その後に対応する抗体で染色した。Zeiss LSM 510 Meta共焦点顕微鏡（Carl Zeiss SpA）で写真を撮影した。染色手順の詳細は、補足手順において見出すことができる。
マウスGWASアッセイ - MTA 1.0およびHTA 2.0 Affymetrix Microarray法。ゲノムワイド発現分析を、Affymetrix GeneChip WT Picoプロトコルにしたがい実施した。RNAの単離を、Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit（Applied Biosystems）を用いて行い、その後におよそ1.0 ngになるよう希釈した。すべてのRNAサンプルにおいてRNAの完全性を評価し、終濃度を、RNA Pico Chips（Agilent Technologies）を用いてBioanalyzerにおいて測定した。RINスコアが7またはそれより高いRNAのみを使用した。1〜2ngの間をテンプレートとして使用し、cDNA合成、アダプター合成および16時間増幅工程（Affymetrix）を含む一連の反応を通じてcRNAを構築した。cRNAの精製および定量の後、ss-cDNAを合成し、断片化し、そして標識した（Affymetrix）。MTA 1.0またはHTA 2.0 GeneChipの各々を、45℃で17時間ハイブリダイズさせた。次いでアレイをFS450 Fluidicステーション（Affymetrix）上で染色し、Gene Chip 7G Scanner（Affymetrix）でスキャンした。プローブ強度を、対数スケールロバストマルチアレイ分析（Expression Console - RMA, Affymetrix）法にしたがい標準化し、標準化された強度をSpotfire 6.0（Perkin-Elmer）を用いてプロットした。
統計分析 - それ以外のことが示されていない限り、すべてのデータは平均±SEMとして示されている。統計分析は、対応のないスチューデントt検定を用いて実施した。P≦0.05の両側値を統計的に有意とみなした。ウィルコクソン検定を用いたカプラン・マイヤー曲線を使用して、マウスにおける糖尿病の発症を分析した。統計分析は、GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA）を用いて実施した。
結果
PD-L1はNODマウス由来のHSCにおいて欠損している - 自己免疫性糖尿病を発症する傾向があるマウスの造血幹細胞（HSC）において潜在的な免疫調節不良を特定するため、我々は最初に、NODマウス由来のマウスHSCの免疫調節、抗炎症および共刺激分子に関する広範なトランスクリプトームプロファイリングを実施し、それをC57BL/6マウスから得られたものと比較した。NODから得られたSca-1+Lineage-c-kit+ HSC（KLS）は、トランスクリプトームプロファイリングにおいて、C57BL/6マウスから得られたHSC由来のそれとの比較で減少したPD-L1転写物の発現を示した（図8A）。我々は次に、NOD HSCにおけるPD-L1欠損を確認するために広範囲の技術を使用した。最初に、我々は、NOD由来のKLS細胞におけるPD-L1の発現を決定しそれをC57BL/6マウスと比較するためにウェスタンブロットアッセイを実施し、我々はGAPDHを内部対照として使用した（図8B)。ウェスタンブロットアッセイの定量後、C57BL/6マウスとの比較でNODにおいて相対的PDL-1発現の減少が観察された（図8C)。KLS細胞においてRT-PCRによって測定されたPD-L1 mRNA発現ASは、NOD HSCにおけるPD-L1 mRNA発現の減少を確認した（図8D)。少ないPD-L1+細胞および全体的な減少したPD-L1発現が、C57BL/6マウスとの比較で、正常血糖NODマウスにおいて異なる骨髄前駆体で、列挙するとSca-1+Lineage-c-kit+ HSC（KLS）細胞、Lineage-c-kit+（KL）細胞、長期再増殖HSC（CD41-CD48-CD150+細胞）および（CD244-CD48-CD150+）で観察された（図8F〜8L）。興味深いことに、PD-L1欠損は、NODマウスにおいて主にHSC集団に限定され、他の骨髄由来免疫関連細胞（例えば、B220+ Bリンパ球細胞、CD11c+樹状細胞およびF4/80+マクロファージ）は、PD-L1を欠損していなかった（データ示さず）。他の共刺激分子（例えば、PD-L2、PD-1、CD40、CD80およびCD80）も評価し、我々は、骨髄または脾臓から得られたNODとC57BL/6のHSC間で大きな差を確認し（データ示さず）、これによりPD-L1欠損の単一性が示唆された。我々は、その後、PD-L1欠損と年齢または疾患状態の関連性を調査しようとし、したがって我々は、NODおよびC57BL/6マウスの骨髄および脾臓から抽出したKL細胞に関するフローサイトメトリー分析を、それぞれ4週で、10週で、および16週超で実施した。我々は、両株においてPD-L1+細胞数のわずかな減少を確認した。我々は次に、HSCニッチ内でのPD-L1の関連性を理解することを目的とし、したがってNODおよびC57BL/6由来の骨髄組織の共焦点画像化による分析を行い、PD-L1がNODマウスのHSCにおいて欠損していることを決定した（データ示さず）。高血糖症がこの欠損において役割を果たし得るかどうかまたはアポトーシスが増加した高いHSCターンオーバーがNODマウスにおいて未成熟なHSCを生成し得るかどうかを評価するため、我々は、NODおよびC57BL/6マウス由来のHSCにおけるPD-L1発現に対する高グルコースの影響を試験し、それらのターンオーバーおよびアポトーシス率を定量した。NODおよびC57BL/6マウス由来の単離されたKL細胞を、高グルコース（20および35 mM）の下で3日間培養した。いくつかの変化が観察される一方、PD-L1発現に対する潜在的な高グルコースによる影響の存在を示唆する特定のパターンは見られなかった（データ示さず）。次に、我々は、基準時、SFEMII培地中で24時間培養したときおよび72時間培養したときのNODおよびC57BL/6マウス由来のCFSE標識HSCにおいて増幅アッセイを行った。NODまたはC57BL/6由来のHSCの間で増幅速度の差は確認されなかった（データ示さず）。我々はさらに、基準時、24時間培養後および72時間培養後のNODおよびC57BL/6マウス由来のHSCのアポトーシス率を研究した。基準時において、NOD由来のHSCは、C57BL/6由来のHSCと比較して高い比率のAnnexinV+/7-AAD-アポトーシス細胞を示したが、24時間および72時間後には、NOD由来のHSCとの比較でC57BL/6においてアポトーシス性のHSCがより多いという反対のシナリオが確認された（データ示さず）。我々のデータは、主に造血幹細胞集団に制限される、NODマウスにおけるPD-L1発現のHSC特異的欠損の存在を確認した。
遺伝子操作されたNOD HSCはインビトロで自己免疫応答を打ち消す - 我々は、NOD HSCにおけるPD-L1欠損を克服するための遺伝子操作アプローチの効果を試験した。我々は、エクスビボでマウスKL細胞を遺伝子操作し、その高い効率および遺伝毒性の低い危険性からインビボで高い潜在的利用性を有する（Kevin D. Bunting and Cheng-Kui Qu, 2014, Methods in Molecular Biology, 1185, DOI 10.1007/978-1-4939-1133-2_21）第三世代自己不活性化レンチウイルスベクター（LV）によりNODマウスからPD-L1+.Tg HSCを作製し、NODマウスにおける実験的自己免疫性糖尿病の発症に対するそれらの効果を調査した。その発現がドキシサイクリンプロモーターの制御下にあるPD-L1遺伝子およびZsGreenと呼ばれる蛍光マーカーを含むレンチウイルスベクターをHEK293TNプロデューサー細胞に感染させることによって以前に得られたPD-L1偽型ウイルス粒子を、単離されたマウスHSC（KL）に形質導入した。それによって我々は、形質導入前のほぼ7％に対して60％陽性のPD-L1+細胞の効率で、PD-L1+.Tg HSCを作製することに成功した（図9A〜9C）。MFIの増加も観察された（形質導入前＝5.6±1.9；形質導入後＝47.8±4.8）。免疫蛍光は、PD-L1 LVによる形質導入後の増加した表面PD-L1発現を適切に示した（データ示さず）。新しく作製したPD-L1+.Tg HSCのゲノムワイド分析は、Mock-LV形質導入HSCと比較してほぼ327倍増加したPD-L1のPD-L1上方調節を確認した（データ示さず）。我々は次に、インビトロでの自己免疫状況下での新しく作製したPD-L1+.Tg HSCの免疫調節特性を調査した。正常血糖NODマウスから作製されたPD-L1+ Tg. HSCを、膵島ミモトープペプチドBDC2.5の存在下、CD4+ CD25- T細胞に対する3つの異なる比率（1：1、1：5および1：10）でCD11c+ DCおよびBDC2.5トランスジェニックCD4+CD25- T細胞と共培養した。フローサイトメトリーによって定量されたように、IFN-γ+CD4+CD25- T細胞は、非形質導入HSC（KL細胞）と比較して、PD-L1+.Tg HSCと高い比率で共培養された場合に有意な減少を示した（p＜0.005）（図9Dおよび9E）。PD-L1+.Tg HSCを抗PD-L1ブロッキングmAbと共に事前培養した場合、上記の免疫調節効果は、著しく損なわれた（データ示さず）。このPD-L1依存的免疫調節特性は、PD-L1+.Tg HSCを、膵島ミモトープペプチドIGRPの存在下、3つの異なる比率（1：1、1：5および1：10）でCD11c+ DCおよび8.3 NODトランスジェニックCD8+ T細胞と共培養するCD8依存的アッセイを使用することによって確認された（データ示さず）。我々は次に、非自己免疫特異的アッセイにおいてPD-L1+.Tg HSCの免疫調節効果を試験した。正常血糖NODから抽出されたCD4+CD25- T細胞を、可溶性抗CD3/抗CD28により刺激し、CD4+CD25- T細胞に対する3つの異なる比率（1：1、1：5および1：10）でPD-L1+.Tg HSCと共培養した。免疫調節効果は、PD-L1+.Tg HSCを添加した場合にIFN-γ+CD4+CD25- T細胞の存在下で有意に減少することによって確認されたが、それは、ここでもPD-L1依存的であったが、自己免疫アッセイと比較すると明白でなかった（図9Fおよび9G）
遺伝子操作されたNOD HSCは高血糖症を元通りにした - 新しく作製したPD-L1+.Tg HSCのインビボでの免疫調節特性を評価するため、新たな高血糖NODマウスに、3x106個のPD-L1+.Tg HSC（図9I）または3x106個の非形質導入（非操作）HSC（図9K)をそれぞれ養子導入した。PD-L1+.Tg HSCは、処置した高血糖NODマウスの100％で高血糖症症を元通りにすることに成功し、処置したマウスの20％は研究終了まで正常血糖を維持したのに対して、未処置の高血糖NODマウス（図9H）またはドキシサイクリンで処置した高血糖NODマウス（図9J）はいずれも正常血糖に戻らなかった。非形質導入HSCを使用した場合、1体の高血糖NODマウスが正常血糖に戻り、1体が軽度の一過的な血糖レベルの改善を示した（データ示さず）。PD-L1+.Tg HSC処置した高血糖NODマウスの膵臓免疫組織病理は、膵島の浸潤の証拠なしまたは軽度のリンパ球浸潤を明らかにし（データ示さず）、高血糖未処置NODとの比較でインスリン染色が維持され、これはより低下した膵島炎スコアを示している。PD-L1+.Tg HSC処置高血糖NODマウスの免疫表現型は、処置後第14日に、未処置マウスとの比較でFoxP3+制御性CD4+ T細胞の比率の2倍増加を示した一方、IFN-γ+およびIL-17+ CD4+/CD8+ T細胞の比率に関しては変化が観察されなかった（データ示さず）。第40日に膵島ペプチド（BDC2.5、IGRP、GAD-65およびインスリン）でチャレンジした脾細胞のエクスビボアッセイにおけるIFN-γ-産生細胞の定量は、未処置との比較でPD-L1+.Tg HSC処置高血糖NODマウスにおけるIFN-γ+細胞の減少を明らかにした（データ示さず）。
遺伝子操作されたHSCは高血糖NODマウスにおいて膵臓に輸送される - NODマウスにおける注入されたPD-L1+.Tg HSCの運命を調査するため、我々は、PD-L1+.Tg HSC内でZsGreenと呼ばれるGFPトレーサーを使用することにより、膵臓、脾臓、膵臓流入領域リンパ節（PLN）および骨髄において追跡実験セットを実施した。PD-L1+.Tg HSCを正常血糖および高血糖NODマウスに養子導入し、注入から1日、7日および14日後に組織を収集した。GFP+細胞およびGFP（ZsGreen mRNA）を、それぞれフローサイトメトリーおよびRT-PCRによってすべての組織において定量した。高血糖NODに注入されたPD-L1+.Tg HSCは、膵臓に優先的に輸送され（データ示さず）、それより低い割合が脾臓およびPLNに誘導される（データ示さず）。一方、PD-L1+.Tg HSCは正常血糖NODにおいて骨髄に優先的に誘導される（データ示さず）、GFP+細胞は、共焦点画像により、処置した高血糖PD-L1+.Tg HSCの膵臓において可視化されたが、正常血糖NODマウスNODにおいてはそうならなかった（データ示さず）。処置から24時間以内のルシフェラーゼ+PD-L1.Tg KL細胞を養子導入した高血糖NODの発光画像はさらに、我々のデータを追認した。結論として、我々はここで、高血糖NODにおけるPD-L1+ HSCの膵臓への実質的誘導を確認した。我々は今、PD-L1+.Tg HSCが膵臓に輸送され、PD-L1依存的機構を通じてエフェクター自己免疫T細胞を除去するという現実的な仮説を提案することができる。
薬理学的に調整されたHSCはインビトロで自己免疫応答を打ち消す - T1Dを治療するための遺伝子アプローチの使用は、容易な作業ではないかもしれないが、我々は、低分子によるPD-L1の薬理学的調整の実現性を追求している。我々は、PD-L1を上方調節する単一の薬剤および薬剤のカクテルの能力を試験した。我々は、3つの薬剤のカクテル（我々はこれをトリフェクタと命名した：IFN-γ、IFN-β、PolyI:C）がPD-L1を強く上方調節し（HSC集団におけるほぼ6％のPD-L1+細胞からトリフェクタ処置後の集団における65％のPD-L1+細胞）、プログラムされたHSC（pHSC）を生成することができることを見出した。免疫蛍光は、低分子、成長因子の組み合わせ（SCF、TPO、IL-3、IL-6、IFN-B、IFN-gおよびポリI:C）を用いた調整後に増加するPD-L1表面発現を明確に示した（データ示さず）。ゲノムワイド分析は、非調節HSCとの比較でほぼ13倍増加した、pHSCにおけるPD-L1の上方調節を確認した（データ示さず）。我々は次に、自己免疫状況下でのpHSCの免疫調節特性を調査した。正常血糖NODマウスから生成されたpHSCを、BDC2.5ペプチドの存在下、CD4+ CD25- T細胞に対する3つの異なる比率（1：1、1：5および1：10）でCD11c+ DCおよびBDC2.5トランスジェニックCD4+CD25- T細胞と共培養した。IFN-γ+CD4+CD25- T細胞のフローサイトメトリーによる定量は、対照との比較で、pHSCが添加されたときの強くかつ有意な減少（p＜0.005）を明らかにした（データ示さず）。pHSCを抗PD-L1ブロッキングmAbと共に事前培養した場合、免疫調節効果は妨げられた（データ示さず）。このPD-L1依存的免疫調節特性は、pHSCを、膵島ミモトープペプチドIGRPの存在下、3つの異なる比率（1：1、1：5および1：10）でCD11c+ DCおよび8.3 NODトランスジェニックCD8+ T細胞と共培養するCD8依存的アッセイを使用することによって確認された。我々は次に、非自己免疫特異的アッセイにおいてpHSCの免疫調節効果を試験した。正常血糖NODから抽出されたCD4+CD25- T細胞を、可溶性抗CD3/抗CD28により刺激し、CD4+CD25- T細胞に対する3つの異なる比率（1：1、1：5および1：10）でpHSCと共培養した。免疫調節効果は、pHSCを添加した場合にIFN-γ+CD4+CD25- T細胞の存在下で有意に減少することによって確認されたが、それは、ここでもPD-L1依存的であったが、自己免疫アッセイと比較すると明白でなかった（データ示さず）。このことは、pHSCがエクスビボでPD-L1依存的調節特性を有することを強く確認するものである。
薬理学的に調整されたHSCは高血糖症を元通りにする - pHSCのインビボでの免疫調節特性を評価するため、新たな高血糖NODマウスに3x106個のpHSCを養子導入した。注入されたpHSCは、NODマウスの40％で糖尿病を元通りにするのに成功し、処置された高血糖NODマウスの30％が第40日の研究終了まで正常血糖を維持した。カプラン・マイヤー曲線は、NODマウスにおいて高血糖症を元通りにする上でPD-L1+.Tg HSCの効果がより強く、pHSCはそれよりやや弱い性能であることを示した。pHSCで処置した高血糖NODマウスの膵臓の免疫組織病理分析は、未処置の高血糖NODマウスとの比較で維持されたインスリン染色および低下した膵炎スコアと共に、膵島の浸潤の証拠なしまたは軽度のリンパ球浸潤を明らかにした。処置されたNODマウスの免疫表現型は、処置後第40日に、IFN-γ+CD4+ならびにIL-17およびIFN-γ+ CD8+ T細胞の比率の減少を示し（データ示さず）、一方、Treg（FoxP3+制御性CD4+ T細胞）に対する効果は検出されなかった。第40日に膵島ペプチド（BDC2.5、IGRP、GAD-65およびインスリン）でチャレンジした脾細胞のエクスビボアッセイにおけるIFN-γ産生細胞の定量は、pHSC処置した高血糖NODマウスにおけるIFN-γ+細胞の減少を明らかにした（データ示さず）。
T1D個体由来のヒトHSCにおいてPD-L1欠損が観察される - T1Dを患った個体が前臨床モデルと同様の造血幹細胞における免疫調節不良を示すかどうかを評価するため、PD-L1発現を、T1D個体および健常対照の末梢血から抽出されたHSCにおいて分析した。NODマウスにおける我々の知見と同様、健常対照と比較してT1D個体においてより少数のPD-L1+CD34+細胞が検出可能であった（T1D＝9.5％ 対 対照＝23.5％；p＜0.001）（図10A〜10C）。PBMCから以前に単離されたCD34+細胞から抽出されたRNAにおいて実施されたウェスタンブロット分析およびPCR分析は、T1D個体から得られたものと比較して健常対象から得られたHSCにおいてPD-L1の発現が減少することを確認した（図10D〜10F）。しかし、他の免疫関連細胞（例えば、CD19+ Bリンパ球細胞、CD11c+樹状細胞およびCD16+細胞）はPD-L1を欠損しておらず（データ示さず）、これによりPD-L1欠損が主としてT1D個体の造血幹細胞集団に限定されることが確認された。我々は、HSCの共焦点画像を、それらの主要部位およびニッチ（骨髄）においてPD-L1およびCD34の組み合わせを決定することにより観察し、PD-L1欠損がそれら自身のニッチにおいても見られることを決定した（データ示さず）。我々はさらに、T1D個体および健常対照由来の末梢HSCにおける他の共刺激分子（例えば、PD-L2およびPD-1）の頻度を観察したが、これらはT1D個体において減少しているようではなかった（データ示さず）。次に、我々は、HSCにおけるPD-L1発現に対する高グルコースの効果を決定することを望んだ。PBMCを、T1D個体の末梢血から単離し、CD34+細胞を、磁気ビーズによって選別した。CD34+細胞（HSC）を、異なる条件下（正常グルコース、20 mM高グルコースおよび35 mM高グルコース）で3日間培養した。NODマウスにおける我々の知見と同様いくつかの変化が観察されたが、PD-L1発現に対する潜在的な高グルコース関連効果の存在を示唆する特定のパターンは見られなかった（データ示さず）。次に、我々は、SFEMII培地中で24および72時間培養された、T1D個体および対照由来のCFSE標識HSCにおいて増殖アッセイを実施した。これは、我々の発現分析におけるアポトーシスまたは生存のバイアスを評価することを目的とするものであった。我々のデータは、T1D個体および対照由来のHSCの増殖率に差がないことを示した（データ示さず）。我々はさらに、HSCアポトーシス率を研究した。基準時に、T1D由来のHSCは、HC由来のHSCと比較して有意に高い比率のAnnexinV+/7-AAD-アポトーシス細胞を示したが、これは24および72時間の培養後には観察されず、T1DおよびHC個体由来の両HSCが同様のアポトーシス率を示した（データ示さず）。HSC細胞（CD34+）の動員がPD-L1発現の明白な回復が見られない状況下では治療上の選択肢とならないことを確認するため、我々は、T1D個体におけるHSCの動員特性を評価した。我々は臨床試験（NCT01102699)においてPD-L1発現を分析し、6名のT1D個体がhrG-CSF（5μg/kg）によってHSCの動員を示した。CD34+細胞は健常対照において有意に増加したのに対して、T1D個体ではCD34+の動員不良が観察された。このデータは、T1D個体におけるHSCの「動員病」の存在を確認するものである。5名の対照および8名のT1D個体における抗CXCR4（プレリキサホル）を用いた動員前後のHSCの免疫表現型。CD34+PD-L1+細胞の比率は、T1Dおよび対照の両方において減少し、このことはCD34+細胞がPD-L1欠陥を好転させそれらの免疫調節特性を回復させるインビトロ操作を必要とすることを強調している（データ示さず）。
薬理学的に調整されたHSCはインビトロで自己免疫応答を打ち消す - ヒトHSCにおけるPD-L1欠損を克服するため、我々は、我々がNODマウスにおいて開発したのと同じ低分子カクテルの効果を試験した。最初に、我々は、低分子カクテルによる調整前後にT1D個体から単離されたHSCにおけるPD-L1発現を評価した。新しいヒトのプログラムされたHSC（pHSC）は、非調整HSCとの比較でPD-L1発現の上方調節を示した。免疫蛍光は、低分子、成長因子の組み合わせ（SCF、TPO、IL-3、IL-6、IFN-B、IFN-ｇおよびポリI:C）を用いた調整後に増加した表面PD-L1発現を明確に示した（データ示さず）。pHSCのゲノムワイド分析は、非調整HSCとの比較でほぼ26倍増加した、PD-L1の上方調節を確認した（データ示さず）。T1D個体から単離されたHSC細胞またはhpHSCがエクスビボで免疫調節機能を有するかどうかを研究するため、HSCを除去したPBMCを、インスリン関連自己抗原2（I-A2）の存在下で、PBMCに対する3つの異なる比率（1：1、1：5および1：10）のHSCまたはpHSCと共培養し、I-A2刺激PBMCによるIFN-γ産生をELISPOTアッセイにおいて評価した。興味深いことに、PBMC-IA-2刺激と比較して、HSCの添加は、IFN-γ産生の有意な（P≦0.05）減少をもたらした。この抑制は、hpHSCが添加されたときにより強く（データ示さず）、これによりHSCおよびpHSCが免疫調節活性を有することが示唆された。HSCによって発揮される主な免疫抑制効果が主としてPD-L1に起因するものであったことをさらに確認するため、我々は、別のElispotアッセイを行い、抗PD-L1ブロッキングAbまたは対照Abの存在下でIA-2ペプチドおよびpHSCで刺激されたPBMCによるIFN-γ産生を評価した。Abを通じたPD-L-1のブロックは、IFN-γ+ PBMCの比率における明白な減少の非存在により明らなように、pHSCによってすでに発揮されている免疫調節効果を妨げた（データ示さず）。我々は次に、非特異的抗CD3/CD28アッセイにおいてpHSCの免疫調節効果を試験した。HC個体から抽出され、可溶性抗CD3／抗CD28によって刺激されたCD4+ T細胞を、CD4+ T細胞に対して3つの異なる比率（1：1、1：5および1：10）のHSCまたはpHSCと共培養した。IFN-γ+CD4+ T細胞の比率における明白かつ有意な減少が、pHSCを添加したときに明確に観察された（データ示さず）。抗PD-L1ブロッキングAbの添加は、主としてPD-L1により付与されるpHSCの免疫抑制効果を明確に打ち消した（データ示さず）。このことは、HSCおよびpHSCがエクスビボでPD-L1依存的な調節特性を有することを強く確認するものである。新しく作製したpHSCのインビボでの免疫調節特性を評価するため、NRG-Akita高血糖マウスに最初にヒトPBMC（約10x106細胞）を与え、その後にヒト膵島を用いた膵島移植（約2000IEQ）を行い、次いで1x106個のpHSCを養子導入した（データ示さず）。注入されたpHSCは、本研究終了まで、NRG-AkitaマウスにおいてNRG-Akitaマウスを正常血糖で維持するのに成功した。異なる処置グループにおける血糖の好転を示すカプラン・マイヤー曲線（データ示さず）。pHSCで処置されたマウスの膵臓の免疫組織病理分析は、高血糖未処置NODとの比較で保存されたインスリン染色および膵島炎スコアの低下と共に膵島の浸潤の証拠なしまたは軽度のリンパ球浸潤（データ示さず）を明らかにした。
ここでおよび本明細書を通して引用されている参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
Figure 2018520688
Figure 2018520688

Claims (55)

  1. 細胞が、プログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）をコードする核酸の外因性コピーを有する、改変造血幹細胞（HSC）集団。
  2. 前記細胞がPD-L1を発現している、請求項1記載の改変HSC集団。
  3. 前記核酸がコピーDNA（cDNA）である、請求項1または2記載の改変HSC集団。
  4. 前記核酸がゲノムDNAである、請求項1または2記載の改変HSC集団。
  5. 前記核酸が前記細胞のゲノムに組み込まれている、請求項4記載の改変HSC集団。
  6. 前記核酸がベクターを通じて前記細胞に導入される、請求項1記載の改変HSC集団。
  7. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項6記載の改変HSC集団。
  8. 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項7記載の改変HSC集団。
  9. HSC細胞が哺乳動物細胞である、請求項1記載の改変HSC集団。
  10. HSC哺乳動物細胞がHSCヒト細胞である、請求項9記載の改変HSC集団。
  11. 改変前に、HSCが、骨髄、臍帯、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯血、胎盤血または末梢血から取得される、請求項1記載の改変HSC集団。
  12. HSCが動員末梢血から取得される、請求項11記載の改変HSC集団。
  13. HSCが健常個体に由来する、請求項1記載の改変HSC集団。
  14. HSCが、診断された疾患または障害を有する個体に由来する、請求項1記載の改変HSC集団。
  15. 診断された疾患または障害が、自己免疫疾患または障害である、請求項14記載の改変HSC集団。
  16. 自己免疫疾患または障害が1型糖尿病（T1D）である、請求項15記載の改変HSC集団。
  17. HSC細胞が、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入前もしくは導入後または導入前と導入後の両方でエクスビボ培養される、請求項1記載の改変HSC集団。
  18. HSC細胞が、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーの導入前もしくは導入後または導入前と導入後の両方で凍結保存される、請求項1記載の改変HSC集団。
  19. 改変HSC細胞が使用前に凍結保存される、請求項1記載の改変HSC集団。
  20. HSC細胞が、
    （a）HSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターをHSCのサンプルと接触させる工程、
    （b）接触により得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、および
    （c）改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程
    を含む方法によって生成される、請求項1記載の改変HSC集団。
  21. 前記方法が、非改変細胞と比較してPD-L1+発現細胞の数が少なくとも1倍増加していることを確立する工程をさらに含む、請求項20記載の改変HSC集団。
  22. 改変PD-L1+発現造血幹細胞（HSC）集団を生成するエクスビボ方法であって、
    （a）HSCを改変するために、PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターをHSCのサンプルと接触させ、それによって核酸の外因性コピーをHSCに導入する工程、
    （b）接触により得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、および
    （c）改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程
    を含む、方法。
  23. 非改変細胞と比較してPD-L1+発現細胞の数が少なくとも1倍増加していることを確立する工程をさらに含む、請求項22記載のエクスビボ方法。
  24. HSCのサンプルが、骨髄、臍帯、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯血、胎盤血または末梢血から取得される、請求項22または23記載のエクスビボ方法。
  25. HSCのサンプルが動員末梢血から取得される、請求項24記載のエクスビボ方法。
  26. HSCのサンプルが健常個体から取得される、請求項22記載のエクスビボ方法。
  27. HSCのサンプルが、診断された疾患または障害を有する個体から取得される、請求項22記載のエクスビボ方法。
  28. 診断された疾患または障害が、自己免疫疾患または障害である、請求項27記載のエクスビボ方法。
  29. 自己免疫疾患または障害が1型糖尿病（T1D）である、請求項28記載のエクスビボ方法。
  30. ベクターがウイルスベクターである、請求項22〜29のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
  31. ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項30記載のエクスビボ方法。
  32. 核酸がコピーDNA（cDNA）である、請求項22記載のエクスビボ方法。
  33. 核酸がゲノムDNAである、請求項22記載のエクスビボ方法。
  34. 核酸が細胞のゲノムに組み込まれる、請求項33記載のエクスビボ方法。
  35. 請求項1〜21のいずれか一項記載の造血幹細胞または請求項22〜34のいずれか一項記載の方法によって生成される造血幹細胞を含む、組成物。
  36. 請求項1〜21のいずれか一項記載の造血幹細胞または請求項22〜34のいずれか一項記載の方法によって生成される造血幹細胞を含む、対象への移植のためまたは対象における免疫応答を減少させるための組成物。
  37. 請求項35記載の造血幹細胞を含む組成物を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において自己免疫障害を処置する方法。
  38. 自己免疫障害が1型糖尿病（T1D）である、請求項37記載の方法。
  39. HSCがレシピエント対象にとって自己である、請求項37または38記載の方法。
  40. HSCがレシピエント対象にとって非自己かつ同種である、請求項37または38記載の方法。
  41. HSCがレシピエント対象にとって非自己かつ異種である、請求項37または38記載の方法。
  42. （a）造血幹細胞（HSC）集団を提供する工程、
    （b）HSCのサンプルを0.1μM濃度のプロスタグランジンE2（PGE2）と37℃で少なくとも24時間接触させる工程、
    （c）24時間後にPGE2を除去し、それによってPD-L1+発現HSC集団を生成する工程、
    （d）PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象において免疫応答を調節する工程
    を含む、対象において免疫応答を調節する方法。
  43. （a）造血幹細胞（HSC）集団を提供する工程、
    （b）PD-L1をコードする核酸の外因性コピーを有するベクターとHSCのサンプルを接触させる工程、
    （c）接触により得られた改変細胞をエクスビボ培養する工程、
    （d）改変HSCにおけるPD-L1の発現を確立し、それによって、PD-L1を発現する改変HSC細胞集団を生成する工程、および
    （e）PD-L1+発現HSC集団をレシピエント対象に移植し、それによってレシピエント対象において免疫応答を調節する工程
    を含む、対象において免疫応答を調節する方法。
  44. HSC集団が、骨髄、臍帯、羊水、絨毛膜絨毛、臍帯血、胎盤血または末梢血から取得される、請求項42または43記載の方法。
  45. HSC集団が動員末梢血から取得される、請求項44記載の方法。
  46. HSC集団がレシピエント対象にとって自己である、請求項42または43記載の方法。
  47. HSC集団がレシピエント対象にとって同種である、請求項42または43記載の方法。
  48. HSC集団がレシピエント対象にとって異種である、請求項42または43記載の方法。
  49. レシピエント対象への移植前の、PGE2の除去後に、またはベクターを用いたトランスフェクション後のエクスビボ培養後に、HSC集団が凍結保存される、請求項42または43記載の方法。
  50. 、レシピエント対象への移植前の、PGE2の除去後に、またはベクターを用いたトランスフェクション後のエクスビボ培養後に、HSC集団がエクスビボで培養により拡大させられる、請求項42または43記載の方法。
  51. 免疫応答の調節を必要とするレシピエント対象を選択する工程をさらに含む、請求項42または43記載の方法。
  52. 自己免疫疾患または障害の予防または処置に使用するため、対象における免疫応答を抑制するのに使用するため、T1Dを発症する危険がある対象におけるT1Dの発症を遅らせるのに使用するため、同種組織または同種臓器移植拒絶反応を予防するおよび遅らせるのに使用するため、ならびに成人および小児対象におけるT1Dの処置のための、請求項1〜21のいずれか一項記載のPD-L1発現造血幹細胞または請求項22〜34のいずれか一項記載の方法によって生成される造血幹細胞を含む、組成物。
  53. 自己免疫疾患または障害の予防または処置に、対象における免疫応答を抑制するのに、T1Dを発症する危険がある対象におけるT1Dの発症を遅らせるのに、同種組織または同種臓器移植拒絶反応を予防するおよび遅らせるのに使用するための医薬の製造のための、ならびに成人および小児対象におけるT1Dの処置のための医薬の製造のための、請求項1〜21のいずれか一項記載のPD-L1発現造血幹細胞または請求項22〜34のいずれか一項記載の方法によって生成される造血幹細胞を含む、組成物。
  54. 自己免疫疾患または障害の予防または処置に使用するため、対象における免疫応答を抑制するのに使用するため、T1Dを発症する危険がある対象におけるT1Dの発症を遅らせるのに使用するため、同種組織または同種臓器移植拒絶反応を予防するおよび遅らせるのに使用するため、ならびに成人および小児対象におけるT1Dの処置のための、請求項1〜21のいずれか一項記載のPD-L1発現造血幹細胞または請求項22〜34のいずれか一項記載の方法によって生成される造血幹細胞の集団。
  55. 自己免疫疾患または障害の予防または処置に、対象における免疫応答を抑制するのに、T1Dを発症する危険がある対象におけるT1Dの発症を遅らせるのに、同種組織または同種臓器移植拒絶反応を予防するおよび遅らせるのに使用するための医薬の製造のための、ならびに成人および小児対象におけるT1Dの処置のための医薬の製造のための、請求項1〜21のいずれか一項記載のPD-L1発現造血幹細胞または請求項22〜34のいずれか一項記載の方法によって生成される造血幹細胞の集団。
JP2018502807A 2015-07-21 2016-07-20 Ｐｄ−ｌ１発現造血幹細胞およびその使用 Pending JP2018520688A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562194969P 2015-07-21 2015-07-21
US62/194,969 2015-07-21
PCT/US2016/043053 WO2017015320A1 (en) 2015-07-21 2016-07-20 Pd-l1 expressing hematopoietic stem cells and uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2018520688A true JP2018520688A (ja) 2018-08-02

Family

ID=57835220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018502807A Pending JP2018520688A (ja) 2015-07-21 2016-07-20 Ｐｄ−ｌ１発現造血幹細胞およびその使用

Country Status (14)

Country Link
US (5) US20180214487A1 (ja)
EP (1) EP3324982A4 (ja)
JP (1) JP2018520688A (ja)
KR (1) KR20180033537A (ja)
CN (1) CN108135935A (ja)
AU (1) AU2016296741A1 (ja)
BR (1) BR112018001232A2 (ja)
CA (1) CA2993201A1 (ja)
HK (1) HK1249029A1 (ja)
IL (1) IL257046A (ja)
MX (1) MX2018000897A (ja)
RU (1) RU2018106515A (ja)
WO (1) WO2017015320A1 (ja)
ZA (1) ZA201800798B (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022512658A (ja) * 2018-10-10 2022-02-07 ノース カロライナ ステート ユニバーシティ Ｐｄ－ｌ１提示血小板は、新たに発症する１型糖尿病を逆転させる

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10201602423TA (en) * 2011-09-30 2016-05-30 Bluebird Bio Inc Compounds For Improved Viral Transduction
US9644179B2 (en) * 2011-11-23 2017-05-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of PDL1 expressing cells to convert T cells into regulatory T cells
EP3770252A1 (en) * 2015-01-26 2021-01-27 Fate Therapeutics, Inc. Cells with increased immuno-regulatory properties and methods for their use and manufacture
WO2017015320A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Children's Medical Center Corporation Pd-l1 expressing hematopoietic stem cells and uses
AU2017356350B2 (en) * 2016-11-09 2024-02-29 Engene, Inc. Intestinal expression of programmed death ligand 1
WO2019060708A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 The Children's Medical Center Corporation TREATMENT OF TYPE 1 DIABETES AND AUTOIMMUNE DISEASES OR DISORDERS
CN112135639B (zh) * 2018-04-06 2023-10-20 北卡罗莱纳州立大学 细胞组装介导的癌症免疫治疗检查点抑制剂的递送
US11697799B2 (en) * 2019-04-15 2023-07-11 Ossium Health, Inc. System and method for extraction and cryopreservation of bone marrow
CN110734895A (zh) * 2019-11-06 2020-01-31 新乡学院 带有荧光标记的pd-l1膜表面表达细胞模型及其应用
JP2023510308A (ja) * 2020-01-10 2023-03-13 モデルナティエックス インコーポレイテッド 寛容原性樹状細胞を作る方法
US20240024361A1 (en) * 2020-06-26 2024-01-25 The Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for treating multiple sclerosis
CN113413464A (zh) * 2021-08-09 2021-09-21 中国人民解放军海军军医大学第一附属医院 抗pd-l1抗体在急性呼吸窘迫综合征治疗药物中的应用

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5061620A (en) 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5635387A (en) 1990-04-23 1997-06-03 Cellpro, Inc. Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors
US5460964A (en) 1992-04-03 1995-10-24 Regents Of The University Of Minnesota Method for culturing hematopoietic cells
US5409813A (en) 1993-09-30 1995-04-25 Systemix, Inc. Method for mammalian cell separation from a mixture of cell populations
US5677136A (en) 1994-11-14 1997-10-14 Systemix, Inc. Methods of obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells, compositions derived therefrom and methods of use thereof
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
AU2183900A (en) 1998-12-24 2000-07-31 Alcon Laboratories, Inc. Ep4 receptor agonists for treatment of dry eye
US6822112B1 (en) 1999-08-13 2004-11-23 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Prostaglandin derivatives
ATE327751T1 (de) 2000-01-31 2006-06-15 Pfizer Prod Inc Verwendung von aktivatoren des prostaglandinrezeptores 4 zur behandlung von akuter oder chronischer niereninsuffizienz
US20020013294A1 (en) 2000-03-31 2002-01-31 Delong Mitchell Anthony Cosmetic and pharmaceutical compositions and methods using 2-decarboxy-2-phosphinico derivatives
US20060292618A1 (en) 2002-04-12 2006-12-28 Mellor Andrew L Antigen-presenting cell populations and their use as reagents for enhancing or reducing immune tolerance
AU2002307243B2 (en) 2002-04-12 2008-01-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Antigen-presenting cell populations and their use as reagents for enhancing or reducing immune tolerance
CA2490021A1 (en) 2002-06-17 2003-12-24 Wyeth Inhibition of t cell activation by butyrophilin 4 or b7-l1
AU2002952834A0 (en) * 2002-09-16 2002-12-05 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research A method of treating an autoimmune disease
US6747037B1 (en) 2003-06-06 2004-06-08 Allergan, Inc. Piperidinyl prostaglandin E analogs
GB0324523D0 (en) 2003-10-21 2003-11-26 Medical Res Council Compositions and methods of treatment
WO2005040391A1 (en) 2003-10-27 2005-05-06 Murdoch Childrens Research Institute Compositions and methods for differentiating stem cells
EP1682150B1 (en) 2003-11-10 2012-12-26 The Scripps Research Institute Compositions and methods for inducing cell dedifferentiation
US7682828B2 (en) 2003-11-26 2010-03-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for reprogramming somatic cells
US20060003452A1 (en) * 2004-07-01 2006-01-05 Virxsys Corporation Vector packaging cell line
US7850960B2 (en) 2004-12-30 2010-12-14 University Of Washington Methods for regulation of stem cells
WO2006133022A2 (en) 2005-06-03 2006-12-14 The Johns Hopkins University Compositions and methods for decreasing microrna expression for the treatment of neoplasia
IL286053B2 (en) * 2005-10-18 2023-03-01 Nat Jewish Health A process for making red blood cells using immortal hematopoietic stem cells and erythropoietin
DE102005062741A1 (de) 2005-12-22 2007-06-28 Bayer Schering Pharma Ag Fluorene und Carbazole als Liganden des EP2 Rezeptors
CN101495623B (zh) 2006-03-24 2013-09-11 儿童医疗中心有限公司 调节造血干细胞生长的方法
US9402852B2 (en) 2006-10-20 2016-08-02 Children's Medical Center Corporation Method to enhance tissue regeneration
AU2007314299B2 (en) 2006-11-03 2013-07-25 Aastrom Biosciences, Inc. Mixed cell populations for tissue repair and separation technique for cell processing
WO2008073748A1 (en) 2006-12-08 2008-06-19 University Of Rochester Expansion of hematopoietic stem cells
EP2626416A3 (en) 2007-04-07 2013-12-18 The Whitehead Institute for Biomedical Research Reprogramming of somatic cells
CN101072380B (zh) 2007-06-08 2010-12-08 华为技术有限公司 内容下发方法及系统、网络设备、移动数据业务管理平台
CA2697265A1 (en) 2007-08-09 2009-02-19 Genzyme Corporation Method of treating autoimmune disease with mesenchymal stem cells
EP3078738B1 (en) 2007-08-31 2020-05-20 Whitehead Institute for Biomedical Research Wnt pathway stimulation in reprogramming somatic cells
WO2009086425A1 (en) 2007-12-28 2009-07-09 Fate Therapeutics, Inc. Methods for reprogramming cells to a pluripotent state and therapeutic applications related thereto
AU2009225665B9 (en) 2008-03-17 2015-01-15 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
US20110206781A1 (en) 2008-05-28 2011-08-25 Zon Leonard I Method to modulate hematopoietic stem cell growth
CN102245758A (zh) 2008-11-06 2011-11-16 印第安纳大学研究与技术公司 增强造血干细胞植入过程的材料和方法
TWI686405B (zh) 2008-12-09 2020-03-01 建南德克公司 抗ｐｄ-ｌ１抗體及其於增進ｔ細胞功能之用途
EP3312269A1 (en) 2008-12-17 2018-04-25 The Scripps Research Institute Generation and maintenance of stem cells
US9056085B2 (en) 2009-02-03 2015-06-16 Children's Medical Center Corporation Methods for enhancing hematopoietic stem/progenitor cell engraftment
JP5836262B2 (ja) 2009-03-19 2015-12-24 フェイト セラピューティクス， インコーポレイテッド サイクリックａｍｐエンハンサーおよび／またはｅｐリガンドを含む組成物、ならびにこれを調製および使用する方法
WO2010108126A2 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Fate Therapeutics, Inc. Reprogramming compositions and methods of using the same
WO2011031875A2 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Fate Therapeutics, Inc. Cell-based compositions and uses thereof
EP3235901B1 (en) 2009-10-16 2022-12-21 The Scripps Research Institute Induction of pluripotent cells
CA2780572A1 (en) * 2009-11-13 2011-05-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Departmen T Of Health And Human Services Modulated programmed death ligand-1
ES2727787T3 (es) 2009-11-15 2019-10-18 Univ Indiana Res & Tech Corp Métodos para mejorar el suministro y el injerto de células madre incluida la identificación de receptores específicos de prostaglandina E2
US20120263692A1 (en) * 2009-11-16 2012-10-18 Bertone Alicia L Engineered Xenogeneic Cells for Repair of Biological Tissue
AU2010341703B2 (en) 2009-12-08 2016-01-21 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Stem cell immune modulation methods of use and apparatus
CN102188446A (zh) * 2010-03-11 2011-09-21 中国医学科学院肿瘤研究所 人成体干细胞在治疗恶性实体瘤中的用途
EP2555778A4 (en) 2010-04-06 2014-05-21 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING CD274 / PD-L1 GENE EXPRESSION
ES2654994T3 (es) 2010-08-12 2018-02-15 Fate Therapeutics, Inc. Terapia mejorada con células madre y precursoras hematopoyéticas
WO2012065027A2 (en) 2010-11-11 2012-05-18 University Of Miami Compositions, kits and methods for treatment of cardiovascular, immunological, and inflammatory diseases
US20140234373A1 (en) 2011-09-16 2014-08-21 Georfia Regents University Methods of Promoting Immune Tolerance
US9644179B2 (en) 2011-11-23 2017-05-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of PDL1 expressing cells to convert T cells into regulatory T cells
JP6220791B2 (ja) 2011-12-02 2017-10-25 フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド 増強された幹細胞組成物
WO2013082241A2 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Fate Therapeutics, Inc. Improved methods of treating ischemia
US20150366914A1 (en) 2013-01-15 2015-12-24 Ohio State Innovation Foundation Methods for Mobilizing Hematopoietic Stem Cells
US9943545B2 (en) 2013-03-15 2018-04-17 Fate Therapeutics, Inc. Stem cell culture media and methods of enhancing cell survival
US20150139994A1 (en) * 2013-11-12 2015-05-21 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for preventing allogeneic immune rejection
EP3805369A1 (en) 2014-03-04 2021-04-14 Fate Therapeutics, Inc. Improved reprogramming methods and cell culture platforms
US10023879B2 (en) 2014-06-04 2018-07-17 Fate Therapeutics, Inc. Minimal volume reprogramming of mononuclear cells
MX2017005344A (es) 2014-10-27 2017-08-15 Hutchinson Fred Cancer Res Composiciones y metodos para reforzar la eficacia de inmunoterapia celular adoptiva.
US20180291374A1 (en) 2014-11-12 2018-10-11 The General Hospital Corporation INHIBITORS OF MICRORNAs miR-155, miR-103, miR-105 and miR-107 THAT REGULATE PRODUCTION OF ATRIAL NATRIURETIC PEPTIDE (ANP) AS THERAPEUTICS AND USES THEREOF
AU2016211671B2 (en) 2015-01-26 2022-05-26 Fate Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
EP3770252A1 (en) 2015-01-26 2021-01-27 Fate Therapeutics, Inc. Cells with increased immuno-regulatory properties and methods for their use and manufacture
JP2018509148A (ja) 2015-03-11 2018-04-05 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 患者における持続性および／または生着を増加させるために同種ｔ細胞を改変する方法
WO2016161196A1 (en) 2015-04-03 2016-10-06 Mirna Therapeutics, Inc. Microrna-34 immunotherapy
WO2017015320A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Children's Medical Center Corporation Pd-l1 expressing hematopoietic stem cells and uses
EA201890619A1 (ru) 2015-09-02 2018-09-28 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИИ iRNA ЛИГАНДА 1 БЕЛКА ЗАПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК 1 (PD-L1) И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
US20190255107A1 (en) 2015-10-09 2019-08-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
CN108473961B (zh) 2015-11-04 2022-11-29 菲特治疗公司 用于诱导造血细胞分化的方法和组合物
EP3387131A4 (en) 2015-12-09 2019-08-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. POLYNUCLEOTIDE AGENTS TARGETING LIGAND 1 OF PROGRAMMED CELL DEATH 1 (PD-L1) AND THEIR METHODS OF USE
CR20180432A (es) 2016-03-14 2018-11-21 Hoffmann La Roche Oligonucleótidos para reducir la expresión de pd-l1
US11873511B2 (en) 2016-10-19 2024-01-16 Cellectis Targeted gene insertion for improved immune cells therapy

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022512658A (ja) * 2018-10-10 2022-02-07 ノース カロライナ ステート ユニバーシティ Ｐｄ－ｌ１提示血小板は、新たに発症する１型糖尿病を逆転させる

Also Published As

Publication number Publication date
US10517899B2 (en) 2019-12-31
US20230321150A1 (en) 2023-10-12
US20180214487A1 (en) 2018-08-02
US20200129559A1 (en) 2020-04-30
US11642378B2 (en) 2023-05-09
IL257046A (en) 2018-03-29
WO2017015320A1 (en) 2017-01-26
RU2018106515A (ru) 2019-08-21
EP3324982A4 (en) 2019-01-09
ZA201800798B (en) 2020-05-27
EP3324982A1 (en) 2018-05-30
CN108135935A (zh) 2018-06-08
BR112018001232A2 (pt) 2018-09-25
HK1249029A1 (zh) 2018-10-26
US20200085878A1 (en) 2020-03-19
MX2018000897A (es) 2018-11-09
KR20180033537A (ko) 2018-04-03
RU2018106515A3 (ja) 2019-12-09
AU2016296741A1 (en) 2018-02-22
US20190099450A1 (en) 2019-04-04
US10751373B2 (en) 2020-08-25
CA2993201A1 (en) 2017-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10751373B2 (en) PD-L1 expressing hematopoietic stem cells and uses
US10611999B2 (en) Methods of expanding and assessing B cells and using expanded B cells to treat disease
KR102489954B1 (ko) 인간 백혈구 항원 제한된 감마 델타 t 세포 수용체 및 이의 사용 방법
US10059923B2 (en) Methods for off-the-shelf tumor immunotherapy using allogeneic T-cell precursors
Li et al. Separating graft-versus-leukemia from graft-versus-host disease in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
JP2019501956A (ja) 免疫療法に使用するための組成物
US20220273712A1 (en) Foxp3 engineered cd4+ t cells for use in treg-based immunotherapy
US20190307800A1 (en) Methods for off-the-shelf-tumor immunotherapy using allogeneic t-cell precursors
Sanders et al. Foxp3+ regulatory T cell therapy for tolerance in autoimmunity and solid organ transplantation
US20150110738A1 (en) Methods and compositions for generating and using allogeneic suppressor cells
WO2010129770A1 (en) Methods for expanding human t regulatory cells and uses of same
TWI841576B (zh) 用於治療傳染病之共受體系統
Milward Investigation of the cell biology of human regulatory T cells in the context of transplantation
Semple Generation and Application of Antigen-Specific Induced Regulatory T cells in Allogeneic Bone Marrow Transplantation
Kang et al. Reciprocal Distribution of Vd1+ gd T Cells and FOXP3+ Regulatory T Cells During Early Period of Adult Liver Transplantation.: Abstract# D2784
Brodeur Regulation of Type II Responses in Lung Fibrosis and Systemic Autoimmunity: A Dissertation
Sintov et al. Whole Genome CRISPR Screening of Stem Cell Derived Islets Reveals Gene Targets for Hypo-Immunogenicity

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180305