CN110734895A - 带有荧光标记的pd-l1膜表面表达细胞模型及其应用 - Google Patents

Abstract

带有荧光标记的PD‑L1膜表面表达细胞模型及其应用，细胞模型是可表达PD‑L1成熟蛋白全长序列的真核宿主细胞，所述真核宿主细胞由构建完成的真核荧光表达载体转染至293T细胞形成，所述真核荧光表达载体在293T细胞中瞬时表达PD‑L1蛋白，并将PD‑L1蛋白展示在293T细胞表面，细胞模型在筛选能与PD‑L1结合的多肽和抗体中的应用。本发明是将牛Fc γ受体信号肽序列代替原来PD‑L1基因上的信号肽，能将PD‑L1更高效的锚定在细胞膜上，以便将犬的PD‑L1成熟蛋白大量展示在真核细胞膜表面。

Description

带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体属于带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型及其应用。

背景技术

程序性死亡受体1（Programmed death 1，PD-L1，CD279）属于CD28家族成员，在B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞和单核细胞均有表达，其配体PD-L1（Programmeddeath ligand 1，CD274）属于B7家族成员，作为PD-L1的主要配体，PD-L1主要表达于肿瘤细胞、淋巴细胞、上皮细胞中。癌症是致犬死亡的常见病之一，目前治疗犬癌症的方法有手术、化疗和放疗。除此之外，免疫治疗也备受关注，一些针对免疫检查点分子的药物的研制取得了成功。在许多临床试验中，抗PD-L1抗体显示出了良好的抗肿瘤活性，特别是针对黑色素瘤、非小细胞肺癌和其他癌症的临床治疗中显示了极其显著的疗效。同样在人体中，抗 PD-1 和抗 PD-L1 抗体已被用于晚期黑色素瘤的治疗，并且显示出良好的疗效果。目前日益增多的相关研究结果表明，犬类部分肿瘤的发生机制与人类有着很高的相似性，PD-1及PD-L1这一类免疫检查点分子阻断多肽和抗体在治疗犬类黑色素瘤、骨肉瘤、血管瘤等方面同样表现出了极大的应用潜力和价值。

在传统的阻断PD-1/PD-L1通路的多肽开发中多利用计算机辅助设计，通过大量计算得出理论上最佳的多肽序列，但在实际操作中却不尽如人意。在验证设计多肽与PD-1或PD-L1的结合能力时，多使用PBMC；原核或者真核表达的蛋白作为底物。PBMC细胞膜表面蛋白质分子复杂，即使有结合能力，也无法判断是否和PD-1或PD-L1蛋白结合。设计的药物最终还是要应用到动物体内，原核表达的蛋白没有天然的空间三维结构，真核表达的蛋白虽然有空间三位结构，但是真核细胞表达蛋白的成本高，表达量低。本发明制备了一种高表达PD-L1蛋白的细胞模型用于筛选能和PD-L1蛋白结合的多肽或者抗体。

发明内容

本发明的目的是提供带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型及其应用，要解决现有技术中不能快速、高效的筛选与PD-L1蛋白结合多肽或抗体的技术问题。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型，其特征在于：所述细胞模型是可表达PD-L1成熟蛋白全长序列的真核宿主细胞，所述真核宿主细胞由构建完成的真核荧光表达载体转染至293T细胞形成，所述真核荧光表达载体在293T细胞中瞬时表达PD-L1蛋白，并将PD-L1蛋白展示在293T细胞表面。

进一步优选地，所述真核荧光表达载体为pECFP-Fc-PD-L1重组载体，先由添加Kozak序列和酶切位点的牛Fc γ受体信号肽序列，插入到真核表达载体pECFP-N1的多克隆位点中形成pECFP-Fc重组载体，之后构建T-PD-L1重组载体，将pECFP-Fc重组载体和T-PD-L1重组载体进行酶切酶连形成pECFP-Fc-PD-L1重组载体。

进一步地，所述PD-L1成熟蛋白全长序列位于牛Fc γ受体信号肽序列的下游，并与真核表达载体pECFP-N1中的EYFP蛋白融合表达。

进一步地，所述PD-L1成熟蛋白全长序列是犬PD-L1成熟蛋白全长序列，其DNA序列是如SEQ ID No:1所示序列。

此外，所述pECFP-Fc-PD-L1重组载体DNA完整序列是如SEQ ID No:2所示序列。

更加优选地，所述牛Fc γ受体信号肽序列添加Kozak序列、酶切位点Nhe Ⅰ和XhoⅠ后其序列以及保护碱基后的DNA序列如SEQ ID No:3所示序列。

带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型的应用方法，其特征在于：所述细胞模型在筛选能与PD-L1结合的生物大分子中的的应用。

带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型的应用方法，其特征在于：所述细胞模型在筛选能与PD-L1结合的多肽中的应用，以该细胞模型为底物加入随机十二肽库，经过三轮淘洗并测序，得到能与PD-L1结合的多肽。

带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型的应用方法，其特征在于：所述细胞模型在筛选能与PD-L1结合的抗体中的应用，以该细胞模型为底物加入待筛选的抗体，再加入荧光标记的二抗显色，进行抗体的筛选。

与现有技术相比本发明具有以下特点和有益效果：

本发明是将牛Fc γ受体信号肽序列代替原来PD-L1基因上的信号肽，能将PD-L1更高效的锚定在细胞膜上，以便将犬的PD-L1成熟蛋白大量展示在真核细胞膜表面，Kozak序列增强真核细胞内的翻译效率，本发明中细胞模型在快速简便高通量筛选能与PD-L1结合的多肽和抗体有其他方式无法比拟的优势，同时利用随机肽库可在短时间内获得能与犬PD-L1结合的随机多肽，也可筛选能与PD-L1结合的抗体，进而针对靶向PD-L1的药物筛选具有重要意义。

附图说明

图1为pECFP-Fc-PD-L1真核重组表达载体PCR鉴定图示；（M，DL2000 DNA marker；1，pECFP-Fc-PD-1 PCR产物）。

图2为pECFP-Fc-PD-L1重组载体的双酶切鉴定图谱；（M，DL2000 DNA marker；1，pECFP-Fc-PD-1双酶切后PCR产物）。

图3为pECFP-Fc-PD-L1重组载体质粒图谱。

图4 为pECFP-Fc-PD-L1重组载体转染293T细胞后48 h荧光显微镜观察荧光蛋白表达情况（100×）；（A：DAPI染细胞核荧光；B：重组蛋白表达荧光；C：合并A、B两通道荧光）。

图5为激光扫描共聚焦显微镜对pECFP-N1载体和pECFP-Fc-PD-L1重组载体表达的荧光鉴定图示(1000×)；（A、B、C：pECFP-N1空载体对照组；D、E、F：pECFP-Fc-PD-L1重组载体实验组；A、D：DAPI染细胞核荧光；B、E：CFP蛋白荧光；C、F：分别合并A、B和D、E通道荧光）。

图6为pECFP-Fc-PD-L1重组载体表达的蛋白免疫荧光共定位图示(1000×)；（A：DAPI染细胞核荧光；B：CFP蛋白荧光；C：犬PD-L1抗体做一抗，CY3标记二抗显色；D：合并A、B、C荧光通道）。

图7为利用表达PD-L1蛋白的细胞模型筛选能与犬PD-L1蛋白结合的抗体荧光图示（100×）；（A：DAPI染细胞核荧光；B：CFP蛋白荧光；C：待筛选抗体做一抗，CY3荧光标记二抗显色）。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创新特征、达成目的与功效易于明白了解，下面对本发明进一步说明。

在此记载的实施例为本发明的特定的具体实施方式，用于说明本发明的构思，均是解释性和示例性的，不应解释为对本发明实施方式及本发明范围的限制。除在此记载的实施例外，本领域技术人员还能够基于本申请权利要求书和说明书所公开的内容采用显而易见的其它技术方案，这些技术方案包括采用对在此记载的实施例的做出任何显而易见的替换和修改的技术方案。

带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型，细胞模型是可表达PD-L1成熟蛋白全长序列的真核宿主细胞，真核宿主细胞由构建完成的真核荧光表达载体转染至293T细胞形成，真核荧光表达载体在293T细胞中瞬时表达PD-L1蛋白，并将PD-L1蛋白展示在293T细胞表面。真核荧光表达载体为pECFP-Fc-PD-L1重组载体，先由添加Kozak序列和酶切位点的牛Fc γ受体信号肽序列，插入到真核表达载体pECFP-N1的多克隆位点中形成pECFP-Fc重组载体，之后构建T-PD-L1重组载体，将pECFP-Fc重组载体和T-PD-L1重组载体进行酶切酶连形成pECFP-Fc-PD-L1重组载体，PD-L1成熟蛋白全长序列为位于牛Fc γ受体信号肽序列的下游，并与真核表达载体pECFP-N1中的ECFP蛋白融合表达，PD-L1成熟蛋白全长序列是犬PD-L1成熟蛋白全长序列，是SEQ ID No:1所示序列，pECFP-Fc-PD-L1重组载体完整序列是SEQ ID No:2所示序列，牛Fc γ受体信号肽序列添加Kozak序列、酶切位点Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ后其序列以及保护碱基后的序列如SEQ ID No:3所示序列。

带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型的应用方法，细胞模型在筛选能与PD-L1结合的多肽中的应用，以该细胞模型为底物加入随机十二肽库，经过三轮淘洗并测序，得到能与PD-L1结合的多肽。

带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型的应用方法，细胞模型在筛选能与PD-L1结合的抗体中的应用，以该细胞模型为底物加入待筛选的抗体，再加入荧光标记的二抗显色，进行抗体筛选。

具体内容包括以下三点：

1、带有融合膜锚定信号肽的pEYFP- Fc-PD-L1真核荧光表达载体的构建：从犬外周血中提取淋巴细胞，提取淋巴细胞总RNA，反转录为cDNA，设计不含犬PD-L1信号肽序列的成熟区片段引物，加入双酶切位点，以cDNA为模板，利用PCR技术获得犬PD-L1蛋白成熟区DNA片段并插入到pMD19-T载体中。人工设计合成含有双酶切位点的牛Fc γ受体（Bos taurus Fcgamma 2 receptor）膜表面锚定信号肽序列，将犬PD-L1的成熟区序列和Fc信号肽插入到带有荧光标记的pEYFP-N1载体中，构建pEYFP- Fc-PD-L1真核荧光表达载体。

2、犬PD-L1蛋白展示在哺乳动物细胞膜表面的细胞模型制备：将pEYFP- Fc-PD-L1真核荧光表达载体转染到293T细胞中，转染48h后使用4 %多聚甲醛固定后备用。

3、利用犬PD-L1蛋白展示在哺乳动物细胞膜表面的细胞模型筛选能和PD-L1结合的多肽和抗体：以该细胞模型为底物加入随机十二肽库，经过三轮淘洗并测序，得到能与PD-L1结合的多肽；以该细胞模型为底物加入待筛选的抗体，再加入荧光标记的二抗显色，在荧光显微镜下观察结果。

上述内容具体包括以下步骤：

带有牛Fc γ受体膜锚定信号肽的荧光表达载体构建：

登录NCBI检索Bos taurus Fc gamma 2 receptor信号肽，添加Kozak序列、酶切位点Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ后其序列如SEQ ID No:3所示序列；

pEYFP-N1为实验室保留载体，含有牛Fc γ受体信号肽pMD19-T载体菌液（命名为T-Fcγ）由Takara公司合成。复苏菌种于37℃、LB培养基中180 r/min过夜培养。。收集菌液2 ml，12000 r/min，离心2 min，弃上清。加入250 μL solution Ⅰ（含有RNase A）充分重悬。加入250 μL solution Ⅱ上下翻转5-6次，使溶液透明，静置2 min。加入350 μL 4 ℃预冷的solution Ⅲ，轻轻上下翻转5-6次，静置2 min。12000 r/min，离心10 min取上清，将上清加入吸附柱中12000 r/min 离心1 min，弃滤液。加入500 μL Buffer WA，12000 r/min，离心1min，弃滤液。加入500 μL Buffer WB，12000 r/min， 离心1 min，弃滤液，重复一次。继续离心2 min。加Elution Buffer 50 μL静置1 min，12000 r/min，离心1 min，洗脱备用（质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，下同）。

配置双酶切反应溶液（内切酶均购自Takara公司，下同）：1 μL Nhe Ⅰ、1 μL XhoⅠ、3 μL 10×Buffer、25μL pEYFP-N1，震荡混匀；1μL NheⅠ、1 μL Xho Ⅰ、3 μL 10×Buffer、25μL T-Fc γ，震荡混匀。37 ℃酶切3h后电泳切下T-Fc γ泳道100 bp左右处条带和pEYFP-N1泳道5000 bp左右处条带，按重量比体积1:1加入Binding Buffer溶液，60 ℃溶解7 min，溶解期间上下翻转使其充分溶解。将全部溶液加入吸附柱中8000 r/min，离心1min，弃滤液。加入700 μL Spw Wash Buffer，12000 r/min，离心1 min，重复2次洗涤，加入30 μL Elution Buffer，静置1 min，12000 r/min，离心1 min洗脱备用（胶回收试剂盒购自OMEGA公司，下同）。各取4 μL 上述pEYFP-N1和T-Fc γ回收片段混匀加入1 μL T4连接酶和1 μL 10×Buffer（购自Takara公司，下同）混匀离心，16 ℃水浴过夜。全量反应液加入DH5α感受态细胞（购自Takara公司，下同）中，冰浴30 min后42 ℃热激90 s，切勿摇晃，冰中冷却1 min。加入900μL SOC培养基，37℃，180r/min，复苏1 h。取200 μL菌液铺到含有卡那抗生素的LB固体培养基平板上，倒置培养过夜。挑取单菌落于含有相应抗性的LB培养基中180r/min培养12h。按上述方法提取质粒后双酶切并测序筛选正确的重组载体菌液并保存命名为pEYFP-Fc。

犬PD-L1 蛋白成熟区DNA的扩增：

取犬的外周血，等体积PBS稀释。新的离心管中加入淋巴细胞分离液（购自索莱宝公司）分离液，沿管壁轻轻倒入稀释抗凝血，不要混匀（小于3 ml抗凝血加3 ml分离液大于3 ml抗凝血等体积加入）。1000×g，室温，离心20 min。取中间层白色细胞于新的离心管中。10 mlPBS洗涤，1000×g离心10 min，重复一次。弃上清，加入1 mL PBS，8000×g，4 ℃离心2 min，弃上清，加入500 μL Buffer RL反复吹打无明显沉淀，室温裂解2 min。转移上述液体到gDNA Eraser spin column中，12000 r/min 离心1 min。保留滤液加入等体积70 %乙醇（DEPC水现配现用）小心吹匀。立即转移至RNA spin column中，可分批次加入，12000 r/min离心30 s弃液体。加入600 μL RWB，12000 r/min离心30 s，弃滤液。再12000 r/min离心2min。将RNA spin column安置于1.5 ml的RNA Free collection tube上，在中央加入50 μL0.1 % DEPC水静止5 min，12000 r/min 离心2 min，洗脱。-80 ℃保存（mRNA提取试剂盒购自Takara公司7）。

配置反转录溶液体系：1 μL oligo dT primer(50μm)、1 μL dNTP Mixture (10mmeach)、8 μL Total RNA、4.5 μL RNase free dH2O振荡混匀。65 ℃ 水浴5 min，冰上迅速冷却。反应完成后继续配置反应液：10 μL 上述反应液、4 μL 5×primescript Ⅱ buffer、0.5 μL RNA inhibitor(40 U/μL)、1 μL prime script Ⅱ Rtase、4.5 μL RNase freeH2O，振荡混匀，42℃，水浴60 min；95℃，5 min，冰上冷却；-20℃保存（反转录试剂盒购自Takara公司）。

登录NCBI官网检索犬的PD-L1 mRNA，下载mRNA序列，其登录号为：AB898677并设计引物如下（酶切位点为Xho Ⅰ和EcoRⅠ；引物委托英潍捷基公司合成）：

D-F-L1-F：5’-CCGCTCGAGTTTACGATCACAGTTTCTAAGGACC-3’；

D-F-L1-R：5’-CGGAATTCTTGTCTCTTCAAATTGTATATCATTTC-3’

配置PCR反应溶液并设定反应程序：19μL ddH2O、2 μL引物1、2 μL 引物2、2 μL 模板、25 μL premix Taq，震荡混匀。98 ℃ 1 min、98 ℃ 10 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s、72 ℃4 min、14 ℃结束，扩增30个循环（PCR反应酶购自Takara公司A）。按上述方法胶回收PCR产物片段，将上述回收PCR产物配置Ta克隆反应溶液：5 μL 10×A-Tailing Buffer、4 μLdATP Mixture、0.5 μL A-Tailing Enzyne、40.5 μL PCR产物，震荡混匀72℃水浴20 min；冰中2 min。（Ta克隆试剂盒购自Takara公司）。取上述Ta克隆产物4 μL和0.5 μL pMD-19-T质粒混匀，再加入5 μL冰上溶解的Solution Ⅰ（pMD-19-T试剂盒由Takara公司生产，货号6013），16 ℃反应90 min。全量反应液加入DH5α感受态细胞中，冰浴30 min后42 ℃热激90s，切勿摇晃，冰中冷却1 min。加入900 μL SOC培养基，37 ℃，180 r/min，复苏1 h。取200 μL菌液铺到含有氨苄抗生素（100 μg/mL）的LB固体培养基平板上，37 ℃倒置培养过夜。挑取单菌落培养后按上述方法提取质粒备用，测序后挑选正确的重组载体保存命名为：T-PD-L1。

pEYFP-Fc-PD-L1重组真核表达载体的构建：

配置双酶切反应溶液：1 μL EcoR Ⅰ、1 μL Xho Ⅰ、3 μL 10×Buffer、25μL pEYFP-Fc，震荡混匀；1 μL EcoR Ⅰ、1 μL Xho Ⅰ、3 μL 10×Buffer、25 μL T-PD-L1，震荡混匀。37℃，反应3h后电泳。切下pEYFP-Fc泳道5000 bp左右的条带和T-PD-L1泳道810 bp处条带按上述胶回收方法回收目的DNA片段备用。

各取4 μL 上述pEYFP-Fc和T-PD-L1回收片段混匀加入1 μL T4连接酶和1 μL 10×Buffer混匀离心，16 ℃水浴过夜。全量反应液加入DH5α感受态细胞中，冰浴30 min后42℃热激90 s，切勿摇晃，冰中冷却1 min。加入900 μL SOC培养基，37℃，180 r/min，复苏1h。取200 μL菌液铺到含有卡那抗生素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落于含有相应抗性卡那抗生素的LB培养基中180 r/min震荡培养12- h。按上述方法提取质粒后利用PCR和双酶切筛选正确的重组载体菌液并保存命名为pEYFP-Fc-PD-L1，质粒提取方法同上述质粒提取方法，提取质粒进行凝胶电泳结果如图1所示，pECFP-Fc-PD- L1真核重组表达载体的PCR产物位置大小与预期相同；pEYFP-Fc-PD-L1进行双酶切后结果如图2所示，泳道双酶切产物位置大小与预期相同表明载体构建成功，pECFP-Fc-PD-L1重组载体的质粒图谱如图3所示。

pEYFP-Fc-PD-L1转染293T细胞制备细胞膜表面展示PD-L1蛋白细胞，具体步骤如下：

复苏真核表达载体pEYFP-Fc-PD-L1和pEYFP-N1菌种，在含有卡那抗生素的LB培养基中180 r/min、37℃过夜培养，按下列方法提取无内毒素质粒（无内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司）：收集5ml过夜菌液室温10000×g离心2 min，弃上清液体。加入250µL solutionⅠ/RNase A，旋涡充分混合，添加250µLsolution II，倒置并轻轻旋转几次，静置2-3 min使裂解液澄清，加125µL N3 Buffer，轻轻倒转几次直到形成白色沉淀，13000×g离心10 min，将上清转移到一个新的1.5 ml离心管中，加入0.1倍体积的ETR溶液，将离心管倒置10次，混匀，冰上静置10 min后在42 ℃水浴中静置5 min，12000 × g离心3 min，ETR溶液在管子底部形成蓝色层，将顶部水相转移到一个新的1.5 ml的离心管中，加入0.5体积的无水乙醇，轻轻倒转6-7次，室温静置1-2 min，将混合液分批转移至吸附柱中，12000×g离心1 min，弃滤液，向吸附柱中加入500µL HBC Buffer，12000×g离心1 min，弃滤液。加入700µLDNAWash Buffer，12000×g离心1 min，弃滤液，重复一次后最大转速离心2 min，晾干后将100μL洗脱液直接加入柱膜的中心静置1 min后，12000×g离心1 min收集洗脱液，-20℃保存，备用。

复苏293T细胞于含有细胞爬片的12孔板中，在含有10 % FBS的DMEM完全培养基中，37 ℃，5 % CO₂ 条件下培养（下同），待12孔板中细胞丰度达到60 %-70 %之间时将pEYFP-Fc-PD-L1和pEYFP-N1分别转染293T细胞，步骤如下（转染试剂盒购自TAKARA公司）；

每孔加入完全培养基500μL。每孔用Xfect Reaction Buffer稀释2μg质粒，稀释后终体积为50 μL，高速涡旋振荡混匀。加入0.6 μL Xfect Polymer, 高速涡旋振荡混匀10 s。室温静置10 min，一滴一滴的加入到细胞中慢慢混匀，放入细胞培养箱中培养4h，更换新的完全培养基。48h后将细胞用4 %多聚甲醛室温固定10 min，用PBS洗涤三次，加入DAPI染色10min，PBS洗涤三次，加入一滴抗荧光淬灭剂（含DAPI）（购自索莱宝公司，下同），取出细胞爬片倒扣在载玻片上并固定，利用荧光显微镜观察荧光蛋白表达情况，结果如图4所示，由图可以表明pEYFP-Fc-PD-L1重组载体成功转染并表达成功，转染表达效率在85%以上；利用激光扫面共聚焦显微镜观察荧光蛋白表达情况，结果如图5所示，由图中荧光蛋白表达位置可以确定pEYFP-N1载体表达荧光蛋白充斥整个细胞中，而pEYFP-Fc-PD-L1重组载体表达的融合蛋白在牛Fc γ受体信号肽的牵引下定位于细胞膜上。

再取上述用多聚甲醛固定的细胞爬片，37 ℃封闭1 h，PBS洗涤三次，加入犬PD-L1抗体37 ℃孵育1 h，PBS洗涤三次，加入CY3标记的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1h，PBS洗涤三次。加入一滴抗荧光淬灭剂（含DAPI）I染色10 min，PBS洗涤三次，取出细胞爬片倒扣在载玻片上并固定，利用激光扫面共聚焦显微镜对pEYFP-Fc-PD-L1重组载体表达蛋白共定位，结果如图6所示，由图中可知pEYFP-Fc-PD-L1重组载体表达融合蛋白可以和PD-L1抗体识别并结合，没有表达该融合蛋白的细胞没有结合PD-L1抗体，表明PD-L1蛋白成功锚定于细胞膜上并有被抗体识别和结合的能力。

利用犬PD-L1蛋白展示在哺乳动物细胞膜表面的细胞模型制备方法制备的细胞模型筛选能与犬PD-L1蛋白结合的随机多肽，具体步骤如下

按实施例1中制作细胞模型的方法制作的约10⁶个模型细胞铺到12孔板中，待细胞贴壁后使用4 % 的多聚甲醛固定10 min，使用TBS清洗三次。孔中加入封阻液，4 ℃ 封闭1h后使用0.1% TBST 快速清洗6次。每孔用0.1% TBST（含吐温80，下同）稀释4×10¹⁰ 的噬菌体随机十二肽库（噬菌体随机十二肽库购自NEB公司）并加入到上述12孔板中，室温温和摇动60min。

弃去未结合的噬菌体，使用0.1 % TBST快速洗板10次，加入0.2 M Glycine-HCl（pH 2.2）洗脱结合的噬菌体，再将洗脱溶液吸入微量离心管中，用150µL1M HCl（pH 9.1）中和上述洗脱液。

挑取ER2738菌种划线在含有四环素（20 μg/mL，下同）的LB固体平板中过夜，挑取单菌落在含有四环素的LB液体培养基中37 ℃ 剧烈震荡培养至对数生长期。将约10⁶个293T细胞铺到12孔板中，待细胞贴壁后使用4 % 的多聚甲醛固定10 min，使用TBS清洗三次。孔中加入封阻液，4 ℃ 封闭1h后使用0.1 % TBST 快速清洗6次。加入上述中和的洗脱液，室温温和摇动60 min。吸取未结合噬菌体于离心管中并加入1 mL上述对数生长期的ER2738菌液混匀后加入到20 mL LB 培养基中37 ℃剧烈震荡5 h。菌液转移一离心管中，4℃，10000 r/min 离心10 min，上清转移另一离心管中，再离心，将上部80 %转入一新的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。4 ℃沉淀过夜。4 ℃，10000 r/min 离心15 min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。沉淀物重悬于1 ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃ 离心5 min使残余菌体沉淀。上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育60 min。4 ℃ 12000 r/min离心10 min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。沉淀物重悬于200µLTBS, 0.02% NaN₃中。离心1 min，沉淀任何残余的不溶物，上清转入新鲜管中，此即为扩增后的洗脱物。

微波炉融化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45℃备用。37℃预温LB/IP TG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。在LB培养基中准备10⁸-10¹¹倍系列稀释上述筛选后的噬菌体。取上述对数培养期的ER2738菌液，菌体培养物达对数中期，分成200µL等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。每管加入10µL不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育5 min。将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IP TG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。待平板冷却5 min后，倒置于37℃培养过夜。检查平板，计数有10²个噬菌斑左右的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10µL扩增后噬菌体的单位（pfu）滴度。

使用2×10¹¹滴度的上述扩增后洗脱物再重复两次上述筛选步骤。最后一次测滴度时挑取若干蓝色单菌落于含有四环素抗性的液体LB培养基中37℃过夜培养。收集菌液10000 r/min离心10 min，取上清送往金唯智公司测序得到能与PD-L1蛋白结合多肽序列。

利用犬PD-L1蛋白展示在哺乳动物细胞膜表面的细胞模型制备方法制备的细胞模型筛选能与犬PD-L1蛋白结合的抗体。

将约10⁶个模型细胞铺到12孔板中培养，待细胞贴壁后弃去培养基，PBS清洗3次，，使用4 % 的多聚甲醛固定10 min，使用TBS清洗三次。加入封阻液，4 ℃ 封闭1h后使用0.1%TBST清洗3次。每孔加入待筛选抗体0.2 μg，37 ℃孵育1h，0.1 % TBST清洗3次.加入CY3标记的二抗0.2 μg，37 ℃孵育1h，0.1 % TBST清洗3次，加入一滴抗荧光淬灭剂（含DAPI）染料，室温孵育10 min，0.1 % TBST清洗3次后在荧光显微镜下观察荧光，结果如图7所示，由图中可以看出，待选抗体可以识别表达PD-L1蛋白的细胞模型并结合显色，说明此细胞模型具有一定的筛选和其结合抗体的能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 新乡学院

<120> 带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型及其应用

<130> 2019

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 814

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tttacgatca cagtttctaa ggacctgtat gtggtagagt atggtggcaa tgtgacaatg 60

gaatgcaaat tcccggtgga aaaacagtta aacttgtttg cactaatcgt ctactgggaa 120

atggaggata aaaaaattat acaatttgtg aatggaaagg aagacctgaa agttcagcac 180

agcagctaca gccagagggc tcagctattg aaggaccagc tcttcttggg gaaggctgcg 240

cttcagatca cagatgtgag attgcaggat gcaggggttt actgctgctt gatcggctat 300

ggcggtgctg actacaagcg gattactttg aaagttcatg ccccgtaccg caacatcagc 360

caaagaattt ctgtggatcc tgtcacctct gaacatgaac taatgtgtca ggctgagggt 420

taccctgagg ctgaagtcat ctggacaagc agtgaccacc gagtcctgag tggcaaaacc 480

accatcacta attccaatag ggaagagaag cttttcaatg tgaccagcac gctgaacatc 540

aatgcaacag ctaatgagat tttctactgc acttttcaaa gatcaggtcc tgaggaaaac 600

aatactgccg agttggtcat cccagaacga ctgcccgttc cagcaagtga gaggactcat 660

ttcatgattc tgggaccttt cctgttgctt cttggtgtag tcctggcagt cactttctgt 720

ctaaaaaaac atgggagaat gatggatgtg gaaaaatgtt gcacccgaga taggaactca 780

aagaaacgaa atgatataca atttgaagag acaa 814

<210> 2

<211> 6410

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tttacgatca cagtttctaa ggacctgtat gtggtagagt atggtggcaa tgtgacaatg 60

gaatgcaaat tcccggtgga aaaacagtta aacttgtttg cactaatcgt ctactgggaa 120

atggaggata aaaaaattat acaatttgtg aatggaaagg aagacctgaa agttcagcac 180

agcagctaca gccagagggc tcagctattg aaggaccagc tcttcttggg gaaggctgcg 240

cttcagatca cagatgtgag attgcaggat gcaggggttt actgctgctt gatcggctat 300

ggcggtgctg actacaagcg gattactttg aaagttcatg ccccgtaccg caacatcagc 360

caaagaattt ctgtggatcc tgtcacctct gaacatgaac taatgtgtca ggctgagggt 420

taccctgagg ctgaagtcat ctggacaagc agtgaccacc gagtcctgag tggcaaaacc 480

accatcacta attccaatag ggaagagaag cttttcaatg tgaccagcac gctgaacatc 540

aatgcaacag ctaatgagat tttctactgc acttttcaaa gatcaggtcc tgaggaaaac 600

aatactgccg agttggtcat cccagaacga ctgcccgttc cagcaagtga gaggactcat 660

ttcatgattc tgggaccttt cctgttgctt cttggtgtag tcctggcagt cactttctgt 720

ctaaaaaaac atgggagaat gatggatgtg gaaaaatgtt gcacccgaga taggaactca 780

aagaaacgaa atgatataca atttgaagag acaatagtta ttaatagtaa tcaattacgg 840

ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc 900

cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca 960

tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg 1020

cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg 1080

acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt 1140

ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca 1200

tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg 1260

tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact 1320

ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag 1380

ctggtttagt gaaccgtcag atccgctagc gccaccatgg cccccaccct ccctgccttg 1440

ctctgccttg ggctgagtgt gggcctaagg acccaggtgc aggccctcga gtttacgatc 1500

acagtttcta aggacctgta tgtggtagag tatggtggca atgtgacaat ggaatgcaaa 1560

ttcccggtgg aaaaacagtt aaacttgttt gcactaatcg tctactggga aatggaggat 1620

aaaaaaatta tacaatttgt gaatggaaag gaagacctga aagttcagca cagcagctac 1680

agccagaggg ctcagctatt gaaggaccag ctcttcttgg ggaaggctgc gcttcagatc 1740

acagatgtga gattgcagga tgcaggggtt tactgctgct tgatcggcta tggcggtgct 1800

gactacaagc ggattacttt gaaagttcat gccccgtacc gcaacatcag ccaaagaatt 1860

tctgtggatc ctgtcacctc tgaacatgaa ctaatgtgtc aggctgaggg ttaccctgag 1920

gctgaagtca tctggacaag cagtgaccac cgagtcctga gtggcaaaac caccatcact 1980

aattccaata gggaagagaa gcttttcaat gtgaccagca cgctgaacat caatgcaaca 2040

gctaatgaga ttttctactg cacttttcaa agatcaggtc ctgaggaaaa caatactgcc 2100

gagttggtca tcccagaacg actgcccgtt ccagcaagtg agaggactca tttcatgatt 2160

ctgggacctt tcctgttgct tcttggtgta gtcctggcag tcactttctg tctaaaaaaa 2220

catgggagaa tgatggatgt ggaaaaatgt tgcacccgag ataggaactc aaagaaacga 2280

aatgatatac aatttgaaga gacaagaatt ctgcagtcga cggtaccgcg ggcccgggat 2340

ccaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 2400

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 2460

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 2520

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccttc ggctacggcc tgcagtgctt cgcccgctac 2580

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 2640

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 2700

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 2760

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 2820

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 2880

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 2940

ctgcccgaca accactacct gagctaccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 3000

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 3060

gagctgtaca agtaaagcgg ccgcgactct agatcataat cagccatacc acatttgtag 3120

aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga 3180

atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 3240

gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 3300

aactcatcaa tgtatcttaa ggcgtaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg 3360

ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct 3420

tataaatcaa aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt 3480

ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat 3540

ggcccactac gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca 3600

ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac 3660

gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta 3720

gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg 3780

tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata 3840

cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 3900

aaaaggaaga gtcctgaggc ggaaagaacc agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg 3960

gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 4020

caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 4080

tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc 4140

ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg 4200

aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 4260

gcttttgcaa agatcgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat 4320

ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 4380

caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 4440

gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg 4500

cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact 4560

gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct 4620

caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 4680

cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 4740

actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 4800

gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc 4860

gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 4920

ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc 4980

cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt 5040

atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 5100

gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt 5160

tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg 5220

gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cctaggggga 5280

ggctaactga aacacggaag gagacaatac cggaaggaac ccgcgctatg acggcaataa 5340

aaagacagaa taaaacgcac ggtgttgggt cgtttgttca taaacgcggg gttcggtccc 5400

agggctggca ctctgtcgat accccaccga gaccccattg gggccaatac gcccgcgttt 5460

cttccttttc cccaccccac cccccaagtt cgggtgaagg cccagggctc gcagccaacg 5520

tcggggcggc aggccctgcc atagcctcag gttactcata tatactttag attgatttaa 5580

aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 5640

aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 5700

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 5760

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 5820

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 5880

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 5940

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 6000

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 6060

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 6120

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 6180

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 6240

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 6300

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 6360

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgccatgcat 6410

<210> 3

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cggctagcgc caccatggcc cccaccctcc ctgccttgct ctgccttggg ctgagtgtgg 60

gcctaaggac ccaggtgcag gccctcgagc gg 92

SEQUENCE LISTING

<110> 新乡学院

<120> 带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型及其应用

<130> 2019

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 814

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tttacgatca cagtttctaa ggacctgtat gtggtagagt atggtggcaa tgtgacaatg 60

gaatgcaaat tcccggtgga aaaacagtta aacttgtttg cactaatcgt ctactgggaa 120

atggaggata aaaaaattat acaatttgtg aatggaaagg aagacctgaa agttcagcac 180

agcagctaca gccagagggc tcagctattg aaggaccagc tcttcttggg gaaggctgcg 240

cttcagatca cagatgtgag attgcaggat gcaggggttt actgctgctt gatcggctat 300

ggcggtgctg actacaagcg gattactttg aaagttcatg ccccgtaccg caacatcagc 360

caaagaattt ctgtggatcc tgtcacctct gaacatgaac taatgtgtca ggctgagggt 420

taccctgagg ctgaagtcat ctggacaagc agtgaccacc gagtcctgag tggcaaaacc 480

accatcacta attccaatag ggaagagaag cttttcaatg tgaccagcac gctgaacatc 540

aatgcaacag ctaatgagat tttctactgc acttttcaaa gatcaggtcc tgaggaaaac 600

aatactgccg agttggtcat cccagaacga ctgcccgttc cagcaagtga gaggactcat 660

ttcatgattc tgggaccttt cctgttgctt cttggtgtag tcctggcagt cactttctgt 720

ctaaaaaaac atgggagaat gatggatgtg gaaaaatgtt gcacccgaga taggaactca 780

aagaaacgaa atgatataca atttgaagag acaa 814

Claims (9)

1.带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型，其特征在于：所述细胞模型是可表达PD-L1成熟蛋白全长序列的真核宿主细胞，所述真核宿主细胞由构建完成的真核荧光表达载体转染至293T细胞形成，所述真核荧光表达载体在293T细胞中瞬时表达PD-L1蛋白，并将PD-L1蛋白展示在293T细胞表面。

2.如权利要求1所述的带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型，其特征在于：所述真核荧光表达载体为pECFP-Fc-PD-L1重组载体，先由添加Kozak序列和酶切位点的牛Fc γ受体信号肽序列，插入到真核表达载体pECFP-N1的多克隆位点中形成pECFP-Fc重组载体，之后构建T-PD-L1重组载体，将pECFP-Fc重组载体和T-PD-L1重组载体进行酶切酶连形成pECFP-Fc-PD-L1重组载体。

3.如权利要求2所述的带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型，其特征在于：所述PD-L1成熟蛋白全长序列位于牛Fc γ受体信号肽序列的下游，并与真核表达载体pECFP-N1中的EYFP蛋白融合表达。

4.如权利要求3所述的带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型，其特征在于：所述PD-L1成熟蛋白全长序列是犬PD-L1成熟蛋白全长序列，其编码的DNA序列是如SEQ ID No:1所示序列。

5.如权利要求4所述的带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型，其特征在于：所述pECFP-Fc-PD-L1重组载体完整DNA序列是如SEQ ID No:2所示序列。

6.如权利要求2所述的带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型，其特征在于：所述牛Fc γ受体信号肽序列添加Kozak序列、酶切位点Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ后其序列以及保护碱基后的DNA序列如SEQ ID No:3所示序列。

7.如权利要求7所述的带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型的应用方法，其特征在于：所述细胞模型在筛选能与PD-L1结合的生物大分子中的应用。

8.如权利要求7所述的带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型的应用方法，其特征在于：所述细胞模型在筛选能与PD-L1结合的多肽中的应用，以该细胞模型为底物加入随机十二肽库，经过三轮淘洗并测序，得到能与PD-L1结合的多肽。

9.如权利要求7所述的带有荧光标记的PD-L1膜表面表达细胞模型的应用方法，其特征在于：所述细胞模型在筛选能与PD-L1结合的抗体中的应用，以该细胞模型为底物加入待筛选的抗体，再加入荧光标记的二抗显色，进行抗体的筛选。

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