CN112752839A - 源自腺病毒五邻体基座的果冻卷折叠结构域的多聚多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新型多肽支架的设计和生产，用于优化呈现由两个、几个或多个亚基组成的寡肽、多肽序列、蛋白质结构域、蛋白质和/或蛋白质复合体。本发明的多肽支架呈现的这些寡肽、多肽序列、蛋白质结构域和/或蛋白质可以包括刺激免疫系统以触发免疫反应的抗原实体，例如用于疫苗接种目的，或用于在细胞培养中制备抗体或其他结合分子，或体外试管中。在优选的实施方式中，将本发明的多肽组装成病毒样颗粒(VLP)，其被优化用于呈递对在针对感染因子或肿瘤的疫苗接种的背景下有用的抗原。
Description
本发明涉及新型多肽支架的设计和生产，用于优化呈现由两个、几个或多个亚基组成的寡肽、多肽序列、蛋白质结构域、蛋白质和/或蛋白质复合体。本发明的多肽支架提供的这些寡肽、多肽序列、蛋白质结构域和/或蛋白质可以包括刺激免疫系统以触发免疫反应的抗原实体，例如用于疫苗接种目的，或用于在细胞培养中制备抗体或其他结合分子，或体内或体外试管中。在优选的实施方式中，将本发明的多肽组装成病毒样颗粒(VLP)，其被优化用于呈递在针对感染因子或肿瘤的疫苗接种的背景下有用的抗原。
成功设计用于表达寡肽、多肽序列、蛋白质结构域、蛋白质和/或蛋白质复合体的蛋白质支架的先决条件是紧凑、稳定的多聚结构域，该结构域可容纳代表可容纳此类寡肽、多肽序列、蛋白质结构域、蛋白质和/或蛋白质复合体的裸露且灵活的环结构的形态。优选地，这些展示的实体可以代表呈现给免疫系统的免疫原性抗原。来自许多腺病毒(Ad)血清型的五邻体基座蛋白(原体)组装成五聚体，然后形成十二面体，其类似于病毒样颗粒。与活病毒相反，它们不携带遗传物质，因此从安全角度考虑，这些VLP是有益的。
腺病毒是人类最常用的基因治疗载体之一。腺病毒的外壳主要由两种不同的蛋白质组成，六邻体蛋白和五邻体基座(penton base)蛋白，后者形成五聚体组件，并在其上附着了该病毒的特征纤维。当在没有其他腺病毒组分的情况下重组表达时，某些腺病毒血清型的五邻体基座蛋白显示出自发自组装成多聚体超结构。这种超结构代表十二聚体，由总共60个腺病毒基座蛋白形成，它们以五聚体的“冠状”装配体的十二个相同副本排列(图1)。腺病毒基座蛋白本身采用两结构域结构，其中一个结构域代表与第二结构域连接的β-桶，第二结构域由α-螺旋稳定(图1B)。突变研究表明，前者介导十二面体中的多聚化，而后者则在十二面体表面上呈现出延伸至溶剂的环。在不同的腺病毒血清型中，这些环的长度和序列含量变化很大，而其余的基座蛋白在整个物种中高度保守。腺病毒十二面体代表高度通用的展示支架，例如用于可插入环中以取代天然序列的免疫原性肽。如果所有插入位点都被占据，那么数百种异源肽可以在一个十二面体上有效展示。十二面体可以大量重组生产，非常稳定，并且可以在环境温度下无限期保存。利用这些高度有利的特性，已设计出在暴露环中显示免疫原性肽的基于十二面体的合成颗粒，可潜在地用于一系列应用，包括肿瘤免疫学和新发传染病。
WO2017167988A1描述了有助于将表位插入暴露环中的合成腺病毒十二面体，并且还公开了腺病毒基座蛋白生产方案。
本发明所基于的问题是提供一种新系统，该系统用于通过可以组装成VLP结构的蛋白质支架来呈递抗原或其他物质。
上述技术问题由如权利要求书中限定的以及在本文中进一步描述并由附图示出的本发明的实施方式提供。
本发明至少部分地基于以下发现：腺病毒五邻体基座蛋白的结构代表了在基因融合进化过程中可能出现的真正的两结构域结构(图1B)。出现的两个结构域可以很容易地分为两个不同的紧凑实体：包含多聚化信息的β桶和类似于“冠”的α螺旋域。
因此，根据本发明，提供了可以与抗原或其他具有最大通用性和柔韧性的载荷实体偶联的“最小”多聚多肽。由此，本发明的工程化的多肽衍生自腺病毒五邻体基座的氨基酸序列(在本文中也称为“五邻体基座原体(penton base protomer)”)，其形成腺病毒五邻体基的β桶结构域。腺病毒五聚体基蛋白的β-桶结构域形成了一个所谓的果冻卷折叠结构域，该结构包含8个β-折叠1至8(见图2)。参见Zubieta等，(2005)Mol.Cell17，121-135。根据本发明，令人惊讶地发现，为了有效的多聚作用并由此展示偶联的载荷，例如寡肽或多肽，如抗原或其他偶联的实体(例如，药物、标记、核酸)，散布在形成果冻卷折叠结构域的氨基酸序列段之间的序列中的两个环(形成“冠状”结构域)可以完全地或在其他实施方式中部分地被如寡肽接头等所需的非腺病毒序列(可与抗原或其他载荷依次偶联)或任何所需的氨基酸序列(例如多肽、蛋白质、蛋白质结构域、蛋白质复合体等)所替代。
因此，在本发明的优选实施方式中，核酸、药物、标记和/或生物结合对的结合伴侣与L1和/或L2偶联。根据本发明的“生物结合”对分别是通常在自然界中发现的或至少源自自然界中发现的结合对的生物实体或化合物对。实例包括但不限于抗原、抗体、抗体片段、双抗体、抗体模拟物、受体及其配体、生物素、链霉亲和素等。
这样的实体可以通过本领域已知的方式偶联到L1和/或L2。如有必要，可以在L1和/或L2中的某个位置将任何类型的接头连接至合适的基团，然后将该接头偶联至所需的实体。存在于L1和/或L2中的可被化学偶联的典型基团包括存在于L1和/或L2中的氨基酸残基的NH2和SH基团。但是，载荷与L1和/或L2的偶联不仅限于化学键，还包括任何其他相互作用，例如离子相互作用、氢键和范德华相互作用。
根据本发明的果冻卷折叠结构域由三段氨基酸序列段(stretch)(也可以称为例如“链段(segment)”或“区域”)形成：N-端序列段、中间序列段和C-端序列段。在天然腺病毒五邻体基座原体中，在N端氨基酸序列段和中间序列段之间(大环)以及在中间氨基酸序列段和C端氨基酸序列段之间(小环)存在环链段。如上所述，本发明的多肽的典型的非腺病毒序列在本文中可被称为“接头”，其取代了天然腺病毒五邻体基座原体的环链段。在本发明的其他实施方式中，天然五邻体基座的大环和小环之一可存在于本发明的多肽中并形成L1或L2。
因此，根据本发明的多肽通常具有由以下通式(I)表示的结构
A-L1-B-L2-C (I)
其中，
A是腺病毒五邻体基座蛋白的N端氨基酸序列段(stretch)；
B是腺病毒五邻体基座蛋白的氨基酸序列段；
C是腺病毒五邻体基座的C端氨基酸序列段；
其中，B是在所述腺病毒五邻体基座的序列中位于A和C之间的氨基酸序列段；
其中，A、B和C形成所述腺病毒五邻体基座蛋白的果冻卷折叠结构域。
L1和L2是如上所述的连接子。因此，L1和L2可以选自几乎任何氨基酸序列(只要它们不干扰多肽的多聚化)。因此。L1和L2可以相同或不同，并且彼此独立地选自寡肽、多肽、蛋白质和蛋白质复合体。L1和L2的序列通常是非腺病毒的(non-adenoviral)，即，具有至少5、6、7、8、9个10个以上氨基酸的氨基酸序列，该序列在任何腺病毒血清型的已知五邻体基座原体序列中、更优选在任何腺病毒蛋白中不存在或不出现。
在本发明的另一实施方式中，接头L1和L2可以选自腺病毒五邻体基座的环序列(即，包括WO 2017/167988 A1中定义的第一和第二RGD环和/或可变环的区域)。然而，在该实施方式中，环链段的序列衍生自与衍生出所述氨基酸序列段A、B和C的腺病毒的血清型相比具有不同血清型的腺病毒。因此，本发明的该实施方式提供了五邻体基座原体的嵌合体，其中β-桶状、果冻卷折叠结构域衍生自一种腺病毒亚型，而L1和L2是包含衍生自与衍生出果冻卷折叠结构域的腺病毒亚型不同的亚型的腺病毒的RGD环链段和/或VL可变环链段的多肽(形成“冠状”结构域)。
在本发明的优选的实施方式中，参见图2，氨基酸序列段A包括腺病毒五邻体基座原体的果冻卷折叠结构域的β-折叠1、2和3，氨基酸序列段B包括所述腺病毒五邻体基座原体的果冻卷折叠结构域β-折叠4和5，氨基酸序列段C包含所述腺病毒五邻体基座原体的果冻卷折叠结构域的β折叠6、7和8。应当理解的是，每个链段A、B和C可以独立地衍生自相同或不同的腺病毒。
优选地，氨基酸序列段A、B和C具有各自独立地选自由以下病毒的五邻体基座组成的组的五邻体基座序列：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd37)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。
在一般可访问的数据库(如UniProt和UniProtE)中，列出上述腺病毒五邻体基座的优选氨基酸序列，对于上述腺病毒亚型在以下序列中列出本文中所指的特别优选序列：UniProt Acc.No.Q2Y0H9(人腺病毒血清型3；SEQ ID NO:1)、UniProt Acc.No.P03276(人腺病毒血清型2；SEQ ID NO:2)、UniProt Acc.No.Q2KSF3(人腺病毒血清型4；SEQ ID NO:3)、UniProt Acc.No.P12538(人腺病毒血清型5；SEQ ID NO:4)、UniProt Acc.No.Q9JFT6(人腺病毒血清型7；SEQ ID NO:5)、UniProt Acc.No.D2DM93(人腺病毒血清型11；SEQ ID NO:6)、UniProt Acc.No.P36716(人腺病毒血清型12；SEQ ID NO:7)、UniProt Acc.No.F1DT65(人腺病毒血清型17；SEQ ID NO:8)、UniProt Acc.No.M0QUK0(人腺病毒血清型25；SEQ ID NO:9)、UniProt Acc.No.Q7T941(人腺病毒血清型35；SEQ ID NO:10)、UniProt Acc.No.Q912J1(人腺病毒血清型37；SEQ ID NO:11)、UniProt Acc.No.F8WQN4(人腺病毒血清型41；SEQ IDNO:12)、UniProt Acc.No.E5L3Q9(大猩猩腺病毒；SEQ ID NO:13)、UniProt Acc.No.G9G849(黑猩猩腺病毒；SEQ ID NO:14)、UniProt Acc.No.H8PFZ9(猿猴腺病毒血清型18；SEQ IDNO:15)、UniProt Acc.No.F6KSU4(猿猴腺病毒血清型20；SEQ ID NO:16)、UniProtAcc.No.F2WTK5(猿猴腺病毒血清型49；SEQ ID NO:17)、UniProt Acc.No.A0A0A1EWW1(恒河猴腺病毒血清型51；SEQ ID NO:18)、UniProt Acc.No.A0A0A1EWX7(恒河猴腺病毒血清型52；SEQ ID NO:19)、和UniProt Acc.No.A0A0A1EWZ7(恒河猴腺病毒血清型53；SEQ ID NO:20)。
上述五邻体基座的氨基酸序列如下(相应的UniProt Acc.No.在括号中指出)：
人腺病毒血清型3五邻体基座hAd3(Q2Y0H9)；SEQ ID NO:1：
MRRRAVLGGA VVYPEGPPPS YESVMQQQAA MIQPPLEAPF VPPRYLAPTE GRNSIRYSELSPLYDTTKLY LVDNKSADIA SLNYQNDHSN FLTTVVQNND FTPTEASTQT INFDERSRWG GQLKTIMHTNMPNVNEYMFS NKFKARVMVS RKAPEGVTVN DTYDHKEDIL KYEWFEFILP EGNFSATMTI DLMNNAIIDNYLEIGRQNGV LESDIGVKFD TRNFRLGWDP ETKLIMPGVY TYEAFHPDIV LLPGCGVDFT ESRLSNLLGIRKRHPFQEGF KIMYEDLEGG NIPALLDVTA YEESKKDTTT ETTTLAVAEE TSEDDDITRG DTYITEKQKREAAAAEVKKE LKIQPLEKDS KSRSYNVLED KINTAYRSWY LSYNYGNPEK GIRSWTLLTT SDVTCGAEQVYWSLPDMMQD PVTFRSTRQV NNYPVVGAEL MPVFSKSFYN EQAVYSQQLR QATSLTHVFN RFPENQILIRPPAPTITTVS ENVPALTDHG TLPLRSSIRG VQRVTVTDAR RRTCPYVYKA LGIVAPRVLS SRTF
hAd2(P03276)；SEQ ID NO:2：
MQRAAMYEEG PPPSYESVVS AAPVAAALGS PFDAPLDPPF VPPRYLRPTG GRNSIRYSELAPLFDTTRVY LVDNKSTDVA SLNYQNDHSN FLTTVIQNND YSPGEASTQT INLDDRSHWG GDLKTILHTNMPNVNEFMFT NKFKARVMVS RSLTKDKQVE LKYEWVEFTL PEGNYSETMT IDLMNNAIVE HYLKVGRQNGVLESDIGVKF DTRNFRLGFD PVTGLVMPGV YTNEAFHPDI ILLPGCGVDF THSRLSNLLG IRKRQPFQEGFRITYDDLEG GNIPALLDVD AYQASLKDDT EQGGDGAGGG NNSGSGAEEN SNAAAAAMQP VEDMNDHAIRGDTFATRAEE KRAEAEAAAE AAAPAAQPEV EKPQKKPVIK PLTEDSKKRS YNLISNDSTF TQYRSWYLAYNYGDPQTGIR SWTLLCTPDV TCGSEQVYWS LPDMMQDPVT FRSTSQISNF PVVGAELLPV HSKSFYNDQAVYSQLIRQFT SLTHVFNRFP ENQILARPPA PTITTVSENV PALTDHGTLP LRNSIGGVQR VTITDARRRTCPYVYKALGI VSPRVLSSRT F
hAd4(Q2KSF3)；SEQ ID NO:3：
MMRRAYPEGP PPSYESVMQQ AMAAAAAIQP PLEAPYVPPR YLAPTEGRNS IRYSELTPLYDTTRLYLVDN KSADIASLNY QNDHSNFLTT VVQNNDFTPT EASTQTINFD ERSRWGGQLK TIMHTNMPNVNQFMYSNKFK ARVMVSRKTP NGVTVGDNYD GSQDELKYEW VEFELPEGNF SVTMTIDLMN NAIIDNYLAVGRQNGVLESD IGVKFDTRNF RLGWDPVTEL VMPGVYTNEA FHPDIVLLPG CGVDFTESRL SNLLGIRKRQPFQEGFQIMY EDLDGGNIPA LLDVEAYEKS KEESVAAATT AVATASTEVR DDNFASAAAV AAVKADETKSKIVIQPVEKD SKERSYNVLS DKKNTAYRSW YLAYNYGDRD KGVRSWTLLT TSDVTCGVEQ VYWSLPDMMQDPVTFRSTHQ VSNYPVVGAE LLPVYSKSFF NEQAVYSQQL RAFTSLTHVF NRFPENQILV RPPAPTITTVSENVPALTDH GTLPLRSSIR GVQRVTVTDA RRRTCPYVYK ALGIVAPRVL SSRTF
hAd5(P12538)；SEQ ID NO:4：
MRRAAMYEEG PPPSYESVVS AAPVAAALGS PFDAPLDPPF VPPRYLRPTG GRNSIRYSELAPLFDTTRVY LVDNKSTDVA SLNYQNDHSN FLTTVIQNND YSPGEASTQT INLDDRSHWG GDLKTILHTNMPNVNEFMFT NKFKARVMVS RLPTKDNQVE LKYEWVEFTL PEGNYSETMT IDLMNNAIVE HYLKVGRQNGVLESDIGVKF DTRNFRLGFD PVTGLVMPGV YTNEAFHPDI ILLPGCGVDF THSRLSNLLG IRKRQPFQEGFRITYDDLEG GNIPALLDVD AYQASLKDDT EQGGGGAGGS NSSGSGAEEN SNAAAAAMQP VEDMNDHAIRGDTFATRAEE KRAEAEAAAE AAAPAAQPEV EKPQKKPVIK PLTEDSKKRS YNLISNDSTF TQYRSWYLAYNYGDPQTGIR SWTLLCTPDV TCGSEQVYWS LPDMMQDPVT FRSTRQISNF PVVGAELLPV HSKSFYNDQAVYSQLIRQFT SLTHVFNRFP ENQILARPPA PTITTVSENV PALTDHGTLP LRNSIGGVQR VTITDARRRTCPYVYKALGI VSPRVLSSRT F
hAd7(Q9JFT6)；SEQ ID NO:5：
MRRRAVLGGAMVYPEGPPPS YESVMQQQAA MIQPPLEAPF VPPRYLAPTE GRNSIRYSELSPLYDTTKLY LVDNKSADIA SLNYQNDHSN FLTTVVQNND FTPTEASTQT INFDERSRWG GQLKTIMHTNMPNVNEYMFS NKFKARVMVS RKAPEGVIVN DTYDHKEDIL KYEWFEFTLP EGNFSATMTI DLMNNAIIDNYLEIGRQNGV LESDIGVKFD TRNFRLGWDP ETKLIMPGVY TYEAFHPDIV LLPGCGVDFT ESRLSNLLGIRKRHPFQEGF KIMYEDLEGG NIPALLDVTA YEESKKDTTT ETTTLAVAEE TSEDDNITRG DTYITEKQKREAAAAEVKKE LKIQPLEKDS KSRSYNVLED KINTAYRSWY LSYNYGNPEK GIRSWTLLTT SDVTCGAEQVYWSLPDMMQD PVTFRSTRQV NNYPVVGAEL MPVFSKSFYN EQAVYSQQLR QATSLTHVFN RFPENQILIRPPAPTITTVS ENVPALTDHG TLPLRSSIRG VQRVTVTDAR RRTCPYVYKA LGIVAPRVLS SRTF
hAd11(D2DM93)；SEQ ID NO:6：
MRRVVLGGAV VYPEGPPPSY ESVMQQQATA VMQSPLEAPF VPPRYLAPTE GRNSIRYSELAPQYDTTRLY LVDNKSADIA SLNYQNDHSN FLTTVVQNND FTPTEASTQT INFDERSRWG GQLKTIMHTNMPNVNEYMFS NNFKARVMVS RKPPEGAAVG DTYDHKQDIL EYEWFEFTLP EGNFSVTMTI DLMNNAIIDNYLKVGRQNGV LESDIGVKFD TRNFKLGWDP ETKLIMPGVY TYEAFHPDIV LLPGCGVDFT ESRLSNLLGIRKKQPFQEGF KILYEDLEGG NIPALLDVDA YENSKKEQKA KIEAAAEAKA NIVASDSTRV ANAGEVRGDNFAPTPVPTAE SLLADVSGGT DVKLTIQPVE KDSKNRSYNV LEDKINTAYR SWYLSYNYGD PEKGVRSWTLLTTSDVTCGA EQVYWSLPDM MQDPVTFRST RQVSNYPVVG AELMPVFSKS FYNEQAVYSQ QLRQSTSLTHVFNRFPENQI LIRPPAPTIT TVSENVPALT DHGTLPLRSS IRGVQRVTVT DARRRTCPYV YKALGIVAPRVLSSRTF
hAd12(P36716)；SEQ ID NO:7：
MRRAVELQTV AFPETPPPSY ETVMAAAPPY VPPRYLGPTE GRNSIRYSEL SPLYDTTRVYLVDNKSSDIA SLNYQNDHSN FLTTVVQNND YSPIEAGTQT INFDERSRWG GDLKTILHTN MPNVNDFMFTTKFKARVMVA RKTNNEGQTI LEYEWAEFVL PEGNYSETMT IDLMNNAIIE HYLRVGRQHG VLESDIGVKFDTRNFRLGWD PETQLVTPGV YTNEAFHPDI VLLPGCGVDF TESRLSNILG IRKRQPFQEG FVIMYEHLEGGNIPALLDVK KYENSLQDQN TVRGDNFIAL NKAARIEPVE TDPKGRSYNL LPDKKNTKYR SWYLAYNYGDPEKGVRSWTL LTTPDVTGGS EQVYWSLPDM MQDPVTFRSS RQVSNYPVVA AELLPVHAKS FYNEQAVYSQLIRQSTALTR VFNRFPENQI LVRPPAATIT TVSENVPALT DHGTLPLRSS ISGVQRVTIT DARRRTCPYVYKALGIVSPR VLSSRTF
hAd17(F1DT65)；SEQ ID NO:8：
MRRAVVSSSP PPSYESVMAQ ATLEVPFVPP RYMAPTEGRN SIRYSELAPL YDTTRVYLVDNKSADIASLN YQNDHSNFLT TVVQNNDFTP AEASTQTINF DERSRWGGDL KTILHTNMPN VNEYMFTSKFKARVMVARKH PQGVEATDLS KDILEYEWFE FTLPEGNFSE TMTIDLMNNA ILENYLQVGR QNGVLESDIGVKFDSRNFKL GWDPVTKLVM PGVYTYEAFH PDVVLLPGCG VDFTESRLSN LLGIRKKQPF QEGFRIMYEDLEGGNIPALL DVPKYLESKK KLEEALENAA KANGPARGDS SVSREVEKAA EKELVIEPIK QDDSKRSYNLIEGTMDTLYR SWYLSYTYGD PEKGVQSWTL LTTPDVTCGA EQVYWSLPDL MQDPVTFRST QQVSNYPVVGAELMPFRAKS FYNDLAVYSQ LIRSYTSLTH VFNRFPDNQI LCRPPAPTIT TVSENVPALT DHGTLPLRSSIRGVQRVTVT DARRRTCPYV YKALGIVAPR VLSSRTF
hAd25(M0QUK0)；SEQ ID NO:9：
MRRAVVSSSP PPSYESVMAQ ATLEVPFVPP RYMAPTEGRN SIRYSELAPQ YDTTRVYLVDNKSADIASLN YQNDHSNFLT TVVQNNDFTP AEASTQTINF DERSRWGGDL KTILHTNMPN VNEYMFTSKFKARVMVARKH PENVDKTDLS QDKLEYEWFE FTLPEGNFSE TMTIDLMNNA ILENYLQVGR QNGVLESDIGVKFDSRNFKL GWDPVTKLVM PGVYTYEAFH PDVVLLPGCG VDFTESRLSN LLGIRKKQPF QEGFRIMYEDLEGGNIPALL DTKKYLDSKK ELEDAAKEAA KQQGDGAVTR GDTHLTVAQE KAAEKELVIV PIEKDESNRSYNLIKDTHDT MYRSWYLSYT YGDPEKGVQS WTLLTTPDVT CGAEQVYWSL PDLMQDPVTF RSTQQVSNYPVVGAELMPFR AKSFYNDLAV YSQLIRSYTS LTHVFNRFPD NQILCRPPAP TITTVSENVP ALTDHGTLPLRSSIRGVQRV TVTDARRRTC PYVYKALGIV APRVLSSRTF
hAd35(Q7T941)；SEQ ID NO:10：
MRRVVLGGAV VYPEGPPPSY ESVMQQQQAT AVMQSPLEAP FVPPRYLAPT EGRNSIRYSELAPQYDTTRL YLVDNKSADI ASLNYQNDHS NFLTTVVQNN DFTPTEASTQ TINFDERSRW GGQLKTIMHTNMPNVNEYMF SNKFKARVMV SRKPPDGAAV GDTYDHKQDI LEYEWFEFTL PEGNFSVTMT IDLMNNAIIDNYLKVGRQNG VLESDIGVKF DTRNFKLGWD PETKLIMPGV YTYEAFHPDI VLLPGCGVDF TESRLSNLLGIRKKQPFQEG FKILYEDLEG GNIPALLDVD AYENSKKEQK AKIEAATAAA EAKANIVASD STRVANAGEVRGDNFAPTPV PTAESLLADV SEGTDVKLTI QPVEKDSKNR SYNVLEDKIN TAYRSWYLSY NYGDPEKGVRSWTLLTTSDV TCGAEQVYWS LPDMMKDPVT FRSTRQVSNY PVVGAELMPV FSKSFYNEQA VYSQQLRQSTSLTHVFNRFP ENQILIRPPA PTITTVSENV PALTDHGTLP LRSSIRGVQR VTVTDARRRT CPYVYKALGIVAPRVLSSRT F
hAd37(Q912J1)；SEQ ID NO:11
MRRAVVSSSP PPSYESVMAQ ATLEVPFVPP RYMAPTEGRN SIRYSELAPL YDTTRVYLVDNKSADIASLN YQNDHSNFLT TVVQNNDFTP AEASTQTINF DERSRWGGDL KTILHTNMPN VNEYMFTSKFKARVMVARKK AEGADANDRS KDILEYQWFE FTLPEGNFSE TMTIDLMNNA ILENYLQVGR QNGVLESDIGVKFDSRNFKL GWDPVTKLVM PGVYTYEAFH PDVVLLPGCG VDFTESRLSN LLGIRKKQPF QEGFRIMYEDLVGGNIPALL NVKEYLKDKE EAGKADANTI KAQNDAVPRG DNYASAAEAK AAGKEIELKA ILKDDSDRSYNVIEGTTDTL YRSWYLSYTY GDPEKGVQSW TLLTTPDVTC GAEQVYWSLP DLMQDPVTFR STQQVSNYPVVGAELMPFRA KSFYNDLAVY SQLIRSYTSL THVFNRFPDN QILCRPPAPT ITTVSENVPA LTDHGTLPLRSSIRGVQRVT VTDARRRTCP YVYKALGIVA PRVLSSRTF
hAd41(F8WQN4)；SEQ ID NO:12：
MRRAVGVPPV MAYAEGPPPS YESVMGSADS PATLEALYVP PRYLGPTEGR NSIRYSELAPLYDTTRVYLV DNKSADIASL NYQNDHSNFQ TTVVQNNDFT PAEAGTQTIN FDERSRWGAD LKTILRTNMPNINEFMSTNK FKARLMVEKK NKETGLPRYE WFEFTLPEGN YSETMTIDLM NNAIVDNYLE VGRQNGVLESDIGVKFDTRN FRLGWDPVTK LVMPGVYTNE AFHPDIVLLP GCGVDFTQSR LSNLLGIRKR LPFQEGFQIMYEDLEGGNIP ALLDVTKYEA SIQKAKEEGK EIGDDTFATR PQDLVIEPVA KDSKNRSYNL LPNDQNNTAYRSWFLAYNYG DPNKGVQSWT LLTTADVTCG SQQVYWSLPD MMQDPVTFRP STQVSNYPVV GVELLPVHAKSFYNEQAVYS QLIRQSTALT HVFNRFPENQ ILVRPPAPTI TTVSENVPAL TDHGTLPLRS SISGVQRVTITDARRRTCPY VHKALGIVAP KVLSSRTF
大猩猩腺病毒五邻体基座gorAd(E5L3Q9)；SEQ ID NO:13：
MMRRAVLGGA VVYPEGPPPS YESVMQQQAA AVMQPSLEAP FVPPRYLAPT EGRNSIRYSELAPQYDTTRL YLVDNKSADI ASLNYQNDHS NFLTTVVQNN DFTPTEASTQ TINFDERSRW GGQLKTIMHTNMPNVNEYMF SNKFKARVMV SREASKIDSE KNDRSKDTLK YEWFEFTLPE GNFSATMTID LMNNAIIDNYLAVGRQNGVL QSDIGVKFDT RNFRLGWDPV TKLVMPGVYT YEAFHPDIVL LPDCGVDFTE SRLSNLLGIRKRHPFQEGFK IMYEDLEGGN IPALLDVAEY EKSKKEIASS TTTTAVTTVA RNVADTSVEA VAVAVVDTIKAENDSAVRGD NFQSKNDMKA SEEVTVVPVS PPTVTETETK EPTIKPLEKD TKDRSYNVIS GTNDTAYRSWYLAYNYGDPE KGVRSWTLLT TSDVTCGAEQ VYWSLPDMMQ DPVTFRSTRQ VSNYPVVGAE LMPVFSKSFYNEQAVYSQQL RQTTSLTHIF DRFPENQILI RPPAPTITTV SENVPALTDH GTLPLRSSIR GVQRVTVTDARRRTCPYVYK ALGIVAPRVL SSRTF
黑猩猩腺病毒五邻体基座chimpAd(G9G849)；SEQ ID NO:14：
MMRRAYPEGP PPSYESVMQQ AMAAAAAMQP PLEAPYVPPR YLAPTEGRNS IRYSELAPLYDTTRLYLVDN KSADIASLNY QNDHSNFLTT VVQNNDFTPT EASTQTINFD ERSRWGGQLK TIMHTNMPNVNEFMYSNKFK ARVMVSRKTP NGVTVTDGSQ DILEYEWVEF ELPEGNFSVT MTIDLMNNAI IDNYLAVGRQNGVLESDIGV KFDTRNFRLG WDPVTELVMP GVYTNEAFHP DIVLLPGCGV DFTESRLSNL LGIRKRQPFQEGFQIMYEDL EGGNIPALLD VDAYEKSKEE SAAAATAAVA TASTEVRGDN FASPAAVAAA EAAETESKIVIQPVEKDSKD RSYNVLPDKI NTAYRSWYLA YNYGDPEKGV RSWTLLTTSD VTCGVEQVYW SLPDMMQDPVTFRSTRQVSN YPVVGAELLP VYSKSFFNEQ AVYSQQLRAF TSLTHVFNRF PENQILVRPP APTITTVSENVPALTDHGTL PLRSSIRGVQ RVTVTDARRR TCPYVYKALG IVAPRVLSSR TF
猿猴腺病毒血清型18五邻体基座，sAd18(H8PFZ9)；SEQ ID NO:15：
MRRAVGVPPV MAYAEGPPPS YETVMGAADS PATLEALYVP PRYLGPTEGR NSIRYSELAPLYDTTRVYLV DNKSADIASL NYQNDHSNFL TTVVQNNDFT PVEAGTQTIN FDERSRWGGD LKTILRTNMPNINEFMSTNK FRARLMVEKV NKETNAPRYE WFEFTLPEGN YSETMTIDLM NNAIVDNYLE VGRQNGVLESDIGVKFDTRN FRLGWDPVTK LVMPGVYTNE AFHPDIVLLP GCGVDFTQSR LSNLLGIRKR MPFQAGFQIMYEDLEGGNIP ALLDVAKYEA SIQKAREQGQ EIRGDNFTVI PRDVEIVPVE KDSKDRSYNL LPGDQTNTAYRSWFLAYNYG DPEKGVRSWT LLTTTDVTCG SQQVYWSLPD MMQDPVTFRP SSQVSNYPVV GVELLPVHAKSFYNEQAVYS QLIRQSTALT HVFNRFPENQ ILVRPPAPTI TTVSENVPAL TDHGTLPLRS SISGVQRVTITDARRRTCPY VHKALGIVAP KVLSSRTF
sAd20(F6KSU4)；SEQ ID NO:16：
MRRAVAIPSA AVALGPPPSY ESVMASANLQ APLENPYVPP RYLEPTGGRN SIRYSELTPLYDTTRLYLVD NKSADIATLN YQNDHSNFLT SVVQNSDYTP AEASTQTINL DDRSRWGGDL KTILHTNMPNVNEFMFTNSF RAKLMVAHET NKDPVYKWVE LTLPEGNFSE TMTIDLMNNA IVDHYLAVGR QNGVKESEIGVKFDTRNFRL GWDPQTELVM PGVYTNEAFH PDVVLLPGCG VDFTYSRLSN LLGIRKRMPF QEGFQIMYEDLVGGNIPALL DVPAYEASIT TVAAKEVRGD NFEAAAAAAA TGAQPQAAPV VRPVTQDSKG RSYNIITGTNNTAYRSWYLA YNYGDPEKGV RSWTLLTTPD VTCGSEQVYW SMPDMYVDPV TFRSSQQVSS YPVVGAELLPIHSKSFYNEQ AVYSQLIRQQ TALTHVFNRF PENQILVRPP APTITTVSEN VPALTDHGTL PLQNSIRGVQRVTITDARRR TCPYVYKALG IVAPRVLSSR TF
sAd49(F2WTK5)；SEQ ID NO:17：
MRRAVPAAAI PATVAYADPP PSYESVMAGV PATLEAPYVP PRYLGPTEGR NSIRYSELAPLYDTTRVYLV DNKSADIASL NYQNDHSNFL TTVVQNNDFT PVEAGTQTIN FDERSRWGGQ LKTILHTNMPNVNEFMFTNS FRAKVMVSRK QNEEGQTELE YEWVEFVLPE GNYSETMTLD LMNNAIVDHY LLVGRQNGVLESDIGVKFDT RNFRLGWDPV TKLVMPGVYT NEAFHPDVVL LPGCGVDFTQ SRLSNLLGIR KRQPFQEGFRIMYEDLEGGN IPALLNVKAY EDSIAAAMRK HNLPLRGDVF AVQPQEIVIQ PVEKDGKERS YNLLPDDKNNTAYRSWYLAY NYGDPLKGVR SWTLLTTPDV TCGSEQVYWS LPDLMQDPVT FRPSSQVSNY PVVGAELLPLQAKSFYNEQA VYSQLIRQST ALTHVFNRFP ENQILVRPPA ATITTVSENV PALTDHGTLP LRSSISGVQRVTITDARRRT CPYVYKALGI VAPRVLSSRT F
恒河猴腺病毒血清型51五邻体基座，rhAd51(A0A0A1EWW1)；SEQ ID NO:18：
MRRAVRVTPA AYEGPPPSYE SVMGSANVPA TLEAPYVPPR YLGPTEGRNS IRYSELAPLYDTTKVYLVDN KSADIASLNY QNDHSNFLTT VVQNNDFTPT EAGTQTINFD ERSRWGGQLK TILHTNMPNINEFMSTNKFR AKLMVEKSNA ETRQPRYEWF EFTIPEGNYS ETMTIDLMNN AIVDNYLQVG RQNGVLESDIGVKFDTRNFR LGWDPVTKLV MPGVYTNEAF HPDIVLLPGC GVDFTQSRLS NLLGIRKRRP FQEGFQIMYEDLEGGNIPALLDVSKYEASI QRAKAEGREI RGDTFAVAPQ DLEIVPLTKD SKDRSYNIIN NTTDTLYRSWFLAYNYGDPE KGVRSWTILT TTDVTCGSQQ VYWSLPDMMQ DPVTFRPSTQ VSNFPVVGTE LLPVHAKSFYNEQAVYSQLI RQSTALTHVF NRFPENQILV RPPAPTITTV SENVPALTDH GTLPLRSSISGVQRVTITDARRRTCPYVYKALGVVAPKVL SSRTF
rhAd52(A0A0A1EWX7)；SEQ ID NO:19：
MRRAVRVTPAAYEGPPPSYE SVMGSANVPATLEAPYVPPR YLGPTEGRNS IRYSELAPLYDTTKVYLVDN KSADIASLNY QNDHSNFLTT VVQNNDFTPT EAGTQTINFD ERSRWGGQLK TILHTNMPNINEFMSTNKFR ARLMVKKVEN QPPEYEWFEF TIPEGNYSET MTIDLMNNAI VDNYLQVGRQ NGVLESDIGVKFDTRNFRLG WDPVTKLVMP GVYTNEAFHP DIVLLPGCGV DFTQSRLSNL LGIRKRRPFQ EGFQIMYEDLEGGNIPALLD VTKYEQSVQR AKAEGREIRG DTFAVSPQDLVIEPLEHDSK NRSYNLLPNK TDTAYRSWFLAYNYGDPEKG VRSWTILTTT DVTCGSQQVY WSLPDMMQDP VTFRPSTQVS NFPVVGTELL PVHAKSFYNEQAVYSQLIRQ STALTHVFNR FPENQILVRP PAPTITTVSE NVPALTDHGT LPLRSSISGV QRVTITDARRRTCPYVYKAL GVVAPKVLSS RTF
rhAd53(A0A0A1EWZ7)；SEQ ID NO:NO 20：
MRRAVRVTPAVYAEGPPPSY ESVMGSANVP ATLEAPYVPP RYLGPTEGRN SIRYSELAPLYDTTKVYLVD NKSADIASLN YQNDHSNFLT TVVQNNDFTP TEAGTQTINF DERSRWGGQLKTILHTNMPNINEFMSTNKF RARLMVEKTS GQPPKYEWFE FTIPEGNYSE TMTIDLMNNAIVDNYLQVGR QNGVLESDIGVKFDTRNFRL GWDPVTKLVM PGVYTNEAFH PDIVLLPGCG VDFTQSRLSN LLGIRKRRPF QEGFQIMYEDLEGGNIPGLL DVPAYEQSLQ QAQEEGRVTR GDTFATAPNE VVIKPLLKDS KDRSYNIITD TTDTLYRSWFLAYNYGDPEN GVRSWTILTT TDVTCGSQQV YWSLPDMMQD PVTFRPSTQV SNFPVVGTEL LPVHAKSFYNEQAVYSQLIR QSTALTHVFN RFPENQILVR PPAPTITTVS ENVPALTDHG TLPLRSSISG VQRVTITDARRRTCPYVYKALGVVAPKVLS SRTF
本发明的多肽不限于分别形成上述腺病毒亚型和血清型的多聚体果冻卷折叠结构域的氨基酸序列段A、B和C的那些已知的特定序列。氨基酸链段A、B和C也可以具有与已知腺病毒五邻体基座原体相似的氨基酸序列，只要A、B和C的序列能够使所得多肽采用果冻卷折叠并组装成五聚体复合物(也称为“五邻体蛋白(penton protein)”)，其十二个复合体依次在合适的条件下自组装形成十二聚体超复合物(本发明的VLP)，如下所述。通常，链段A、B和C的此类相似序列与已知腺病毒五邻体基座的相应氨基酸序列(优选SEQ ID NO:1至20的氨基酸序列，更优选如下表1至3中提供的氨基酸链段A、B和C)具有至少85％、更优选至少90％、甚至更优选95％、特别优选至少98％、最优选至少99％的氨基酸序列同一性。
如本文所用，如果没有另外特别说明，氨基酸序列使用IUPAC的单字母代码从N端至C端叙述。
根据本发明的一个优选实施方式，氨基酸序列段A具有以下共有序列(SEQ ID NO:21)：
(U)1-47PTX1GRNSIRY SX2X3x4PX5X6DTT X7X8YLVDNKSA DIASLNYQND
HSNFX5TTVX9Q NNDX10X11PX12EAX13 TQTINX14DX15RS RWGX16X17LKTIX18X19TZ1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8 Z9Z10Z11Z12Z13Z14Z15
其中，氨基酸序列段A在C端终止于在Z1之前的残基T或Z1至Z15的氨基酸
U是任何氨基酸或没有氨基酸
X1是E或G
X2是E或S
X3是L或V
X4是A或S
X5是L或Q
X6是Y或E
X7是R或K
X8是V或L
X9是V或I
X10是F或Y
X11是T或S
X12是A或T或I或G
X13是S或G
X14是F或L
X15是E或D
X16是A或G
X17是D或Q
X18是L或M
X19是H或R
Z1如果存在，则是N
Z2如果存在，则是M
Z3如果存在，则是P
Z4如果存在，则是N
Z5如果存在，则是V或I
Z6如果存在，则是N
Z7如果存在，则是E或D
Z8如果存在，则是Y或F
Z9如果存在，则是M
Z10如果存在，则是F或S或Y
Z11如果存在，则是T或S
Z12如果存在，则是S或N
Z13如果存在，则是K
Z14如果存在，则是F
Z16如果存在，则是K。
在下表1中概述了根据本发明的多肽的链段A的更优选的氨基酸序列：
表1：通式(I)的链段A的优选序列
根据本发明的另一个优选的实施方式，上述通式(I)的氨基酸序列段B具有以下序列(SEQ ID NO:22)：
Z17Z18Z19Z20Z21Z22Z23Z24Z25Z26 Z27QVYWSLPDX20 MX21DPVTFRST
X22QX23X24NX25PVVGX26 ELZ28Z29Z30
其中：氨基酸序列段B在N端起始于Z17至Z27的氨基酸或在Z27之后的氨基酸Q；
氨基酸序列段B在C端终止于在Z28之前的氨基酸L或Z28至Z30的氨基酸；
Z17如果存在，则是L或S
Z18如果存在，则是T或P或C
Z19如果存在，则是T或P
Z20如果存在，则是P或S或A或R
Z21如果存在，则是N或D
Z22如果存在，则是G或V
Z23如果存在，则是H或T
Z24如果存在，则是C
Z25如果存在，则是G
Z26如果存在，则是A或V或S
Z27如果存在，则是E或Q
X20是L或M
X21是Q或K
X22是Q或R或S
X23是V或I
X24是S或N
X25是Y或F
X26是A或V
Z28如果存在，则是M或L
Z29如果存在，则是P
Z30如果存在，则是V或F。
下表2概述了根据本发明的多肽的链段B的更优选的氨基酸序列：
表2：通式(I)的链段B的优选序列
根据本发明的另一个优选实施方式，上述通式(I)的链段C具有以下序列(SEQ IDNO:23)：
Z31Z32Z33ALTDHGT LPLRSSIX27GV QRVTX28TDARR RTCPYVYKA
LGIVX30PX31VLS SRTF
其中，氨基酸序列段C在N端起始于Z31至Z33的氨基酸或在Z33之后的氨基酸A；
Z31如果存在，则是N
Z32如果存在，则是V
Z33如果存在，则是P
X27是R或S或G
X28是V或I
X29是Y或H
X30是A或S
X31是R或K。
下表3概述了根据本发明的多肽的链段C的更优选的氨基酸序列：
表3：通式(I)的链段C的优选序列
本发明特别优选的多肽基于hAd3的五邻体基座原体的果冻卷折叠结构域。特别是，优选如下多肽：其中氨基酸序列段A的氨基酸序列从选自氨基酸1至48位的位置、最优选氨基酸1位开始，直至选自129至144位的氨基酸位置、最优选氨基酸132位；氨基酸序列段B的氨基酸序列从选自398至409位的位置、最优选氨基酸407位开始，直至选自440至443位的位置、最优选氨基酸442位；氨基酸序列段C的氨基酸序列从选自492至495位的位置、最优选氨基酸493位开始，直至氨基酸544位；其中，氨基酸位置参照UniProt Acc.No.QY0H9(SEQID NO:1)列出的序列。
根据本发明的多肽的连接链段L1和L2可以选自寡肽接头，如具有4至10个氨基酸、优选地具有氨基酸G和S的寡肽。优选的实例是GGGS(SEQ ID 24)。另一个实例是由G和S组成并具有多个GGS重复(如2、3、4、5个以上GGS重复)的接头。这种类型的特别优选的接头为GGSGGS(SEQ ID NO:25)。
在其他优选的实施方式中，L1是多肽序列，其包含与衍生出所述氨基酸序列段A、B和C的腺病毒的血清型相比具有不同血清型的腺病毒五邻体基座的RGD环，和/或L2是多肽序列，其包含与衍生出所述氨基酸序列段A、B和C的腺病毒的血清型相比具有不同的血清型腺病毒五邻体基座的可变环。
在本发明的其他实施方式中，L1是RDG环，并且L2是优选为4至20个氨基酸、更优选为4至10个氨基酸、特别优选由如上定义的G和S组成的寡肽接头的非腺病毒寡肽。在类似的实施方式中，L2是可变环或包含，且L1为如前文所定义的寡肽接头。根据本发明，还涵盖L2是RGD环或包含RGD环并且L1是寡肽接头，并且还涵盖L1是可变环并且L2是寡肽接头。
在其他优选的实施方式中，如前所述，L1和L2分别可以选自与衍生多聚化结构域的腺病毒不同的腺病毒的五邻体基座蛋白的冠状结构域序列。通常，冠状多聚化结构域嵌合体的组合不受限制。优选的嵌合体选自如上所述的冠状多聚化结构域的组合。可选地(且优选)包括插入对应的冠状结构域的RGD环和/或可变环中的非腺病毒序列的冠状结构域更优选为如WO 2017/167988 A1中所公开。
由此可以理解的是，腺病毒五邻体基座的冠状结构域通常由两个氨基酸序列段组成：所谓的大片段和小片段。冠状结构域的大片段在各腺病毒五邻体基座蛋白的氨基酸序列中更处于N端，而冠状结构域的小片段更处于C端。根据本发明，优选的是大片段(含有如上所述的RGD环)对应于通式(I)的L1，进一步优选的是小片段(含有可变环)对应于通式(I)的L2。根据本发明的某些实施方式，大片段和小片段源自相同的腺病毒五邻体基座。根据本发明的其他实施方式，大片段和小片段源自不同的腺病毒五邻体基座，或者大片段和小片段中仅一个源自不同于衍生自多聚化结构域(即氨基酸序列段A、B和C)的腺病毒的腺病毒五邻体基座蛋白。
用于本发明的嵌合构建体的优选冠状结构域包括选自由下述五邻体基座组成的组的冠状结构域：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd37)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。
用于冠状结构域的上述腺病毒五邻体基座的优选氨基酸序列列在诸如UniProt和UniProtE等通常可访问的数据库中，并且本文中针对上述腺病毒亚型提及的特别优选的序列如下列出：UniProt Acc.No.Q2Y0H9(人腺病毒血清型3；SEQ ID NO:1)、UniProtAcc.No.P03276(人腺病毒血清型2；SEQ ID NO:2)、UniProt Acc.No.Q2KSF3(人腺病毒血清型4；SEQ ID NO:3)、UniProt Acc.No.P12538(人腺病毒血清型5；SEQ ID NO:4)、UniProtAcc.No.Q9JFT6(人腺病毒血清型7；SEQ ID NO:5)、UniProt Acc.No.D2DM93(人腺病毒血清型11；SEQ ID NO:6)、UniProt Acc.No.P36716(人腺病毒血清型12；SEQ ID NO:7)、UniProtAcc.No.F1DT65(人腺病毒血清型17；SEQ ID NO:8)、UniProt Acc.No.M0QUK0(人腺病毒血清型25；SEQ ID NO:9)、UniProt Acc.No.Q7T941(人腺病毒血清型35；SEQ ID NO:10)、UniProt Acc.No.Q912J1(人腺病毒血清型37；SEQ ID NO:11)、UniProt Acc.No.F8WQN4(人腺病毒血清型41；SEQ ID NO:12)、UniProt Acc.No.E5L3Q9(大猩猩腺病毒；SEQ ID NO:13)、UniProt Acc.No.G9G849(黑猩猩腺病毒；SEQ ID NO:14)、UniProt Acc.No.H8PFZ9(猿猴腺病毒血清型18；SEQ ID NO:15)、UniProt Acc.No.F6KSU4(猿猴腺病毒血清型20；SEQID NO:16)、UniProt Acc.No.F2WTK5(猿猴腺病毒血清型49；SEQ ID NO:17)、UniProtAcc.No.A0A0A1EWW1(恒河猴腺病毒血清型51；SEQ ID NO:18)、UniProtAcc.No.A0A0A1EWX7(恒河猴腺病毒血清型52；SEQ ID NO:19)、和UniProtAcc.No.A0A0A1EWZ7(恒河猴腺病毒血清型53；SEQ ID NO:20)。
下表4概述了用于本发明的嵌合构建体的冠状结构域的最优选的大片段序列：
表4：用于嵌合构建体的冠状结构域大片段的优选序列
下表5概述了用于本发明的嵌合构建体的冠状结构域大片段的最优选的序列：
表5：用于嵌合构建体的冠状结构域大片段的优选序列
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中人腺病毒血清型2(hAd2)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd37)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中人腺病毒血清型3(hAd3)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd37)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中人腺病毒血清型4(hAd4)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)，人腺病毒血清型3(hAd3)，人腺病毒血清型5(hAd5)，人腺病毒血清型7(hAd7)，人腺病毒血清型11(hAd11)，人腺病毒血清型12(hAd12)，人腺病毒血清型17(hAd17)，人腺病毒血清型25(hAd25)，人腺病毒血清型35(hAd35)，人腺病毒血清型37(hAd37)，人腺病毒血清型41(hAd41)，大猩猩腺病毒(gorAd)，黑猩猩腺病毒(ChimpAd)，猿猴腺病毒血清型18(sAd18)，猿猴腺病毒血清型20(sAd20)，猿猴腺病毒血清型49(sAd49)，恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)，恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)，和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中人腺病毒血清型5(hAd5)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)，人腺病毒血清型3(hAd3)，人腺病毒血清型4(hAd4)，人腺病毒血清型7(hAd7)，人腺病毒血清型11(hAd11)，人腺病毒血清型12(hAd12)，人腺病毒血清型17(hAd17)，人腺病毒血清型25(hAd25)，人腺病毒血清型35(hAd35)，人腺病毒血清型37(hAd37)，人腺病毒血清型41(hAd41)，大猩猩腺病毒(gorAd)，黑猩猩腺病毒(ChimpAd)，猿猴腺病毒血清型18(sAd18)，猿猴腺病毒血清型20(sAd20)，猿猴腺病毒血清型49(sAd49)，恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)，恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)，和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中人腺病毒血清型7(hAd7)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd37)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中人腺病毒血清型11(hAd11)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd37)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中人腺病毒血清型12(hAd12)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd37)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中人腺病毒血清型17(hAd17)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd37)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中人腺病毒血清型25(hAd25)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd37)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中人腺病毒血清型35(hAd35)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型37(hAd37)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中人腺病毒血清型37(hAd37)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中人腺病毒血清型41(hAd41)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中大猩猩腺病毒(gorAd)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd41)、人腺病毒血清型41(hAd41)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中黑猩猩腺病毒(ChimpAd)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd41)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中猿猴腺病毒血清型18(sAd18)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd41)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中猿猴腺病毒血清型20(sAd20)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd41)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中猿猴腺病毒血清型49(sAd49)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd41)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd41)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd41)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
本发明的一个优选实施方式是一种嵌合体，其中恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)的多聚化结构域与选自下组的腺病毒五邻体基座的冠状结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd41)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、和恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
用于提供本发明嵌合体的特别优选的冠状结构域是人腺病毒血清型3(hAd3)的五邻体基座蛋白的冠状结构域。对于SEQ ID NO:1的氨基酸位置的优选序列，参见表4(大片段)和表5(小片段)。
在本发明的甚至更优选的嵌合体中，将人腺病毒血清型3(hAd3)的五邻体基座蛋白的冠状结构域与选自下组的腺病毒的五邻体基座蛋白的多聚化结构域结合：人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd37)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、黑猩猩腺病毒(ChimpAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
用于提供本发明嵌合体的特别优选的冠状结构域是黑猩猩腺病毒(ChimpAd)的五邻体基座的冠状结构域。对于SEQ ID NO:14的氨基酸位置的优选序列，参见表4(大片段)和表5(小片段)。
在本发明的甚至更优选的嵌合体中，将黑猩猩腺病毒(ChimpAd)的五邻体基座蛋白的冠状结构域与选自下组的腺病毒的五邻体基座蛋白的多聚化结构域结合：人腺病毒血清型3(hAd3)、人腺病毒血清型2(hAd2)、人腺病毒血清型4(hAd4)、人腺病毒血清型5(hAd5)、人腺病毒血清型7(hAd7)、人腺病毒血清型11(hAd11)、人腺病毒血清型12(hAd12)、人腺病毒血清型17(hAd17)、人腺病毒血清型25(hAd25)、人腺病毒血清型35(hAd35)、人腺病毒血清型37(hAd37)、人腺病毒血清型41(hAd41)、大猩猩腺病毒(gorAd)、猿猴腺病毒血清型18(sAd18)、猿猴腺病毒血清型20(sAd20)、猿猴腺病毒血清型49(sAd49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhAd51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhAd52)、和恒河猴腺病毒血清型53(rhAd53)。对于用于多聚化的具体序列和为此组合选择的冠状结构域，参考表1至表5的具体实例。
如上所述，本发明的一个主要实施方式是将抗原，更具体地感染原(例如病毒、细菌或其他病原体)的抗原或者肿瘤或癌症抗原包括在L1和L2的一个或两个中。关于在腺病毒冠状结构域的RGD环和/或可变环中包含抗原的优选位点，其特别参见WO2017/167988A1。如本文所用，术语“抗原”是指被免疫响应的分子(例如，抗体、T细胞受体(TCR)等)识别的结构。
感染原的抗原包括但不限于，例如，病毒感染原(如HIV)、肝炎病毒(如甲肝病毒、乙肝病毒或丙肝病毒)、疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、风疹病毒、黄热病病毒、登革热病毒、黄病毒(例如寨卡病毒)、流感病毒、马尔堡病病毒、埃博拉病毒和虫媒病毒(如基孔肯雅病毒)。细菌感染原的抗原包括但不限于下组的抗原，例如，军团菌、螺杆菌、弧菌、传染性大肠杆菌菌株、葡萄球菌、沙门氏菌和链球菌。传染性原生动物病原体的抗原包括但不限于疟原虫、锥虫、利什曼原虫和弓形虫的抗原。病原体抗原的其他实例包括真菌病原体的抗原，如新生隐球菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌和白色念珠菌的抗原。
可根据本发明使用的肿瘤抗原的具体实例包括但不限于707-AP、AFP、ART-4、BAGE、β-连环蛋白/m、Bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/neu、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HAST-2、hTERT(or hTRT)、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、-2、-3、NA88-A、NY-ESO-1、p190 minor bcr-abl、Pml/RAR.α.、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2和WT1。
特别是在包括在本发明多肽(如L1和/或L2)中的抗原的上下文中，而且就任何蛋白质-蛋白质相互作用如受体-配体结合而言，可能包括用于提供靶标的选择和/或进化过程结合优化的序列，如优化的抗原，以对其进行改善的免疫应答。一种优选的过程是核糖体展示，如Schaffitzel等(2001)详细概述：Protein-Protein Interactions，AMolecularCloning Manual:In vitro selection and evolution of protein-ligand interactionby ribosome display(Golemis E.编)，第535-567页，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York。核糖体展示方案的优点是可以在选择过程的所有步骤中完全在体外进行。其他可能的选择过程在本领域中也是已知的，并且包括噬菌体展示(Smith(1985)Science 228，1315-1317；Winter等(1994)Annu.Rev.Immunol.12，433-455)、酵母双杂交系统(Fields和Song(1989)Nature 340，245-246；Chien等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88，9578-9582)、和细胞表面展示方法(Georgiu等(1993)Trends Biotechnol.11，6-10；Boder和Wittrup(1997)Nat.Biotechnol.15，553-557)。
核糖体展示过程基本上可以以两种方式用于通过使用本发明的多肽来优化涉及靶向特定分子的抗原或其他氨基酸序列。可以首先从一个多肽序列的初始文库中选择一个抗原(或其他结合物)序列，该文库可以大至1014个不同序列、更典型地109至1010个序列，可选地采用上述Schaffitzel等(2001)中详细描述的进化程序。在选择优化的抗原序列之后，将编码其的核苷酸序列克隆到本发明的合适载体中，使得多肽表达，其中优化的抗原包括在根据以上式(I)的L1和/或L2中或代表式(I)的L1和/或L2。
根据本发明该方面的另一实施方式，将潜在抗原编码序列的文库直接克隆到本发明的核酸中，使得每个序列各自编码作为如上式(I)所定义的L1和L2中的一个或两个的或其一部分的多肽。然后，在体外表达包含抗原序列(或在其他实施方式中，其他结合物序列)的初始文库的本发明多肽，并根据上述Schaffitzel等(2001)详细概述的核糖体展示方法进行优化的抗原(或其他结合物)序列的选择。
本发明的多肽的另一个实施方式涉及其中L1和/或L2分别是或与抗体序列或抗体部分(如抗体片段)偶联的多肽。在本发明的上下文中，术语“抗体”是特异性结合抗原的免疫球蛋白。
术语“抗体片段”是指保留完整抗体特异性结合抗原的能力的抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段，Fab'片段、F(ab')2片段、重链抗体、单结构域抗体(sdAb)、scFv片段、可变区片段(Fv)、VH结构域、VL结构域、纳米抗体、IgNAR(免疫球蛋白新抗原受体)、di-scFv、双特异性T细胞衔接子(BITE)、双亲和力重新靶向(DART)分子、三抗体、双抗体、单链双抗体等。
“双抗体”是可以结合不同抗原的融合蛋白或二价抗体。双抗体由两条单条蛋白链(通常为两条scFv片段)组成，每条蛋白链均包含抗体的可变片段。因此，双抗体包含两个抗原结合位点，因此可以靶向相同(单特异性双抗体)或不同的抗原(双特异性双抗体)。
在本发明的上下文中使用的术语“单结构域抗体”是指由抗体的单个单体可变结构域组成的抗体片段。简单地说，它们仅包含骆驼科动物或软骨鱼类产生的重链抗体的单体重链可变区。由于它们的起源不同，它们也被称为VHH或VNAR(可变的新抗原受体)片段。或者，可以通过使用遗传工程使常规小鼠或人抗体的可变结构域单体化来获得单结构域抗体。它们的分子量约为12至15kDa，因此是能够识别抗原的最小抗体片段。其他实例包括纳米抗体。
在本发明的上下文中有用的抗原结合实体还包括“抗体模拟物”，本文所用的这种表达是指与抗体相似地特异性结合抗原的化合物，但是该化合物在结构上与抗体无关。通常，抗体模拟物是摩尔质量为约3至20kDa的人工肽或蛋白质，其包含一个、两个或多个与抗原特异性结合的暴露结构域。实例尤其包括LACI-D1(脂蛋白相关的凝血抑制剂)；亲和素，例如人-γB晶体或人泛素；胱抑素；来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的Sac7D；脂质运载蛋白和衍生自脂质运载蛋白的anticalin；DARPin(设计的锚蛋白重复域)；Fyn的SH3结构域；蛋白酶抑制剂的Kunits结构域；单克隆抗体，例如纤连蛋白的第10个III型结构域；adnectin；knottin(半胱氨酸结小蛋白)；atrimers；evibodies，例如基于CTLA4的结合体，亲和体，例如金黄色葡萄球菌A蛋白Z结构域的三螺旋束；转移体(trans-body)，例如人转铁蛋白；四连蛋白，例如单体或三聚体人C型凝集素结构域；微抗体，胰例如蛋白酶抑制剂II；affilin；犰狳重复蛋白。核酸和小分子有时也被视为抗体模拟物(适体)，但不是人工抗体、抗体片段和由它们组成的融合蛋白。与抗体相比的共同优势是更好的溶解度、组织渗透性、对热和酶的稳定性以及相对较低的生产成本。
如同天然的五邻体基座蛋白一样，本发明的多肽组装成五聚体复合体，而12个该五聚体复合体又在优选pH约5.0至约8.0的缓冲溶液中组装成病毒样颗粒(VLP)。优选的实例是在生理条件或接近生理条件下的缓冲条件，如pH 7.4的PBS，或pH 7.2至7.6的TBS或TBS-T。在这样的条件下，本发明的多肽在约20℃至约42℃的温度下形成VLP。本发明还涉及这样的五聚体复合体和VLP。
本发明的另一主题是编码如本文定义的多肽的核酸。
根据本发明，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且是指DNA、RNA或含有一种或多种核苷酸类似物的物质。根据本发明的优选的核酸或多核苷酸是DNA，最优选为双链(ds)DNA。本公开的核苷酸序列显示为5'至3'，并且如果没有另外说明，则使用碱基的IUPAC单字母代码。
另一个实施方式涉及制备用于插入通式(1)所定义的通用链段L1和L2的核酸。即，该实施方式的核酸编码链段A、B和C，但是在编码A和B的链段之间以及在编码B和C的链段之间具有插入位点。
因此，该实施方式可以由以下通式(II)表示：
5’-a-is1-l1-is2-b-is3-l2-is4-c-3’ (II)
其中，
a是编码通式(I)的A的核苷酸序列；
b是编码通式(I)的B的核苷酸序列；
c是编码通式(I)的C的核苷酸序列；并且
L1、L2分别是核苷酸序列；
is1至is4各自独立地是包含至少一个插入位点的核苷酸序列。
在本发明的该实施方式的上下文中，插入位点优选是限制性内切酶或归巢核酸内切酶的识别序列。更优选地，is1至is4各自是不同的插入位点，更特别地，每个is1至is4是不同限制酶的识别序列。制备用于插入编码L1和L2的核苷酸序列的核酸的优选实施方式具有以下核苷酸序列，其中is1包含EcoRI位点，is2包含RsrII位点，is3包含SacI位点，is4包含XbaI位点。
限制性酶位点通常是技术人员众所周知的。优选的实例如上所述，但是限制性位点可以选自多种，并且可以在限制性酶的各种生产商中找到指导，如New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA(美国)。
这种归巢核酸内切酶(HE)位点的实例包括但不限于下组的识别序列：PI-SceI、I-CeuI、I-PpoI、I-HmuI、I-CreI、I-DmoI、PI-PfuI和I-MsoI、PI-PspI、I-SceI、其他LAGLIDAG组成员及其变体、SegH和Hef或其他GIY-YIG归巢核酸内切酶、I-ApeII、I-AniI、细胞色素bmRNA成熟酶bl3、PI-TliI和PI-TfuII、PI-ThyI，等等；参见Stoddard B.L.(2005)Q.Rev.Biophys.38，49-95。相应的酶是可商购的，例如购自New England Biolabs Inc.，Ipswich，MA(美国)。
在本发明的优选实施方式中，上述核酸另外包含至少一个位点以便将核酸整合到载体或宿主细胞中。整合位点可允许瞬时或基因组整合。
关于整合到载体中，特别是整合到质粒或病毒中，整合位点优选适合于将核酸整合到腺病毒、腺相关病毒(AAV)、自主细小病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、逆转录病毒、鼠李糖病毒、艾普斯登-巴尔病毒、慢病毒、塞姆利基森林病毒或杆状病毒中。
可以掺入本发明的核酸的特别优选的整合位点可以选自Tn7的转座子元件，λ-整合酶特异性附着位点和位点特异性重组酶(SSR)，特别是LoxP位点或FLP重组酶特异性重组(FRT)位点。用于整合根据本发明的核酸的进一步优选的机制是特异性同源重组序列，如lef2-603/Orf1629。
在本发明的其他优选实施方式中，本文所述的核酸另外包含一种或多种用于选择针对其他毒性物质的抗性标记。在本发明的上下文中有用的抗性标记的优选实例包括但不限于抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、壮观霉素和卡那霉素)抗性标记。
本发明的核酸还可包含一个或多个核糖体结合位点(RBS)
本发明的其他主题涉及包含如上定义的核酸的载体。
本发明优选的载体是质粒、表达载体、转移载体，更优选真核基因转移载体、瞬时或病毒载体介导的基因转移载体。根据本发明的其他载体是病毒，如腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、自主细小病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、逆转录病毒载体、鼠李糖病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒载体、慢病毒载体、塞姆利基森林病毒载体和杆状病毒载体。
适于整合根据本发明的核酸的杆状病毒载体(例如，存在于合适的质粒如转移载体上)也是本发明的主题，并且优选地包含位点特异性整合位点，如Tn7附着位点(其可以被嵌入lacZ基因中，以进行蓝色/白色的生产性整合筛选)和/或LoxP位点。根据本发明的进一步优选的杆状病毒包含(替代上述整合位点或除此以外)用于表达对侧翼具有同源重组序列的宿主有毒的物质的基因。表达有毒物质的基因的实例是白喉毒素A基因。用于同源重组的优选的序列对是例如lsf2-603/Orf1629。杆状病毒还可以包含上述其他标记基因，也包括荧光标记如GFP、YFP等。相应的杆状病毒的具体实例例如在WO 2010/100278 A1中公开。
在WO 2005/085456 A1中公开了用于本发明的其他适用载体。
除上述例示的标记基因(其一个或多个)以外，在原核宿主细胞中有用的载体优选地还包含复制起点(ori)。实例是BR322、ColE1和条件复制起点如OriV和R6Kγ，后者是优选的条件复制起点，其使得本申请的载体的繁殖依赖于原核宿主中的pir基因。OriV使本申请的载体的增殖依赖于原核宿主中的trfA基因。
此外，本发明涉及包含本发明的核酸和/或本发明的载体的宿主细胞。
宿主细胞可以是原核或真核细胞。真核宿主细胞可以是例如哺乳动物细胞，优选人细胞。人宿主细胞的实例包括但不限于HeLa、Huh7、HEK293、HepG2、KATO-III、IMR32、MT-2、胰腺β细胞、角质形成细胞、骨髓成纤维细胞、CHP212、原代神经细胞、W12、SK-N-MC、Saos-2、WI38、原代肝细胞、FLC4、143TK、DLD-1、胚胎肺成纤维细胞、原代包皮成纤维细胞、MRC5和MG63细胞。本发明进一步优选的宿主细胞是猪细胞，优选CPK、FS-13、PK-15细胞；牛细胞，优选MDB、BT细胞；牛细胞，如FLL-YFT细胞。在本发明的上下文中有用的其他真核细胞是秀丽隐杆线虫(C.elegans)细胞。其它真核细胞包括酵母细胞，如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌和巴斯德毕赤酵母。此外，本发明涉及昆虫细胞作为宿主细胞，其包括来自草地夜蛾的细胞，更优选Sf9、Sf21、Express Sf+、High Five H5细胞，以及来自黑腹果蝇的细胞，特别是S2施耐德细胞。其他宿主细胞包括盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)细胞和来自寄生虫(如利什曼原虫)的细胞。
根据本发明的原核宿主包括细菌，特别是大肠杆菌，如可商购的菌株，如TOP10、DH5、HB101、BL21(DE3)等。
本领域技术人员能够容易地选择合适的载体构建体/宿主细胞对，以将根据本发明的核酸元件合适地繁殖和/或转移到合适的宿主中。将合适的载体元件和载体引入合适的宿主细胞的具体方法是本领域同样已知的，并且该方法可见于Ausubel等(编)CurrentProtocols In Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York(美国)的最新版中。
在本发明的优选实施方式中，如上所定义的载体还包含位点特异性重组酶(SSR)的位点，优选一个或多个用于Cre-lox特异性重组的LoxP位点。在其他优选的实施方式中，根据本发明的载体包含转座子元件，优选Tn7附着位点。
进一步优选的是，如上定义的附着位点位于标记基因内。这种布置使得能够通过转座选择成功整合到附着位点中的序列。根据优选的实施方式，这样的标记基因选自荧光素酶、β-GAL、CAT、荧光编码蛋白基因，优选GFP、BFP、YFP、CFP及其变体、以及lacZα基因。
此外，本发明涉及包含本发明的核酸和/或本发明的载体的宿主细胞。
宿主细胞可以是原核的或真核的。真核宿主细胞可以是例如哺乳动物细胞，优选人细胞。人宿主细胞的例子包括但不限于HeLa、Huh7、HEK293、HepG2、KATO-III、IMR32、MT-2、胰腺β细胞、角质形成细胞、骨髓成纤维细胞、CHP212、原代神经细胞、W12、SK-N-MC、Saos-2、WI38、原代肝细胞、FLC4、143TK、DLD-1、胚胎肺成纤维细胞、原代包皮成纤维细胞、MRC5和MG63细胞。本发明进一步优选的宿主细胞是猪细胞，优选CPK、FS-13、PK-15细胞，牛细胞，优选MDB、BT细胞，牛细胞，如FLL-YFT细胞。在本发明的上下文中有用的其他真核细胞是秀丽隐杆线虫细胞。另外的真核细胞包括酵母细胞，如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌和巴斯德毕赤酵母。此外，本发明涉及昆虫细胞作为宿主细胞，其包括来自草地夜蛾的细胞，更优选Sf9、Sf21、Express Sf+，High Five H5细胞，以及来自黑腹果蝇的细胞，特别是S2施耐德细胞。其他宿主细胞包括盘基网柄菌细胞和来自寄生虫(如利什曼原虫)的细胞。
根据本发明的原核宿主包括细菌，特别是大肠杆菌，如可商购的菌株，如TOP10、DH5、HB101、BL21(DE3)等。
本领域技术人员能够容易地选择合适的载体构建体/宿主细胞对，以将根据本发明的核酸元件合适地繁殖和/或转移到合适的宿主中。将合适的载体元件和载体引入合适的宿主细胞的具体方法是本领域同样已知的，并且该方法可见于Ausubel等(编)CurrentProtocols In Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York(美国)的最新版中。
本发明还提供了多肽、编码该多肽的核酸、含有编码多肽的核酸的载体、包含该载体的宿主细胞以及如上定义的VLP，其用作药物，特别是用于治疗和/或预防传染病、免疫疾病、肿瘤或癌症。
因此，本发明还涉及药物组合物，其包含本文所定义的多肽、编码该多肽的核酸、包含编码多肽的核酸的载体、包含如上所述的此类载体或VLP的宿主细胞以及至少一种药学上可接受的载剂、赋形剂和/或稀释剂。
通常，本发明上下文中的药物组合物的制备，其剂量和施用途径是技术人员已知的，并且指南可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Eastern，PA，美国)最新版中。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的如上所述的活性成分。治疗有效量取决于活性成分，尤其取决于施用途径。根据本发明的药物组合物将优选通过肠胃外施用，特别是通过诸如静脉内、动脉内或骨内输注的输注，或通过例如静脉内、动脉内、腹腔内、肌内、皮内、皮下或鞘内注射等注射方式施加。在抗肿瘤治疗的情况下，药物组合物(诸如包含根据本发明的VLP的药物组合物)也可以通过肿瘤内注射施用。
用于注射或输注的本发明溶液通常包含在水或水性缓冲溶液中(优选在生理pH下的等渗缓冲液中)的本发明的VLP。本发明的液体药物组合物可以包含其他成分，如药学上可接受的稳定剂、助悬剂、乳化剂等。本发明药物组合物的其他成分是佐剂，特别是在将本发明的构建体用于疫苗接种目的的背景下。
本发明的另一主题是利用本发明的多肽、核酸、宿主细胞、载体和/或VLP的有益特性的治疗方法。在优选的实施方式中，本发明提供了一种预防和/或治疗传染病的方法，该方法包括以下步骤：向受试者(优选人)施用治疗有效量的如上定义的药物组合物，其中，所述药物组合物包含本发明的VLP，其包含引起感染性疾病的感染原的抗原(特别是包含在如上所定义的本发明多肽的L1和/或L2中的抗原)。另一个实施方式是一种用于预防和/或治疗肿瘤或癌症疾病的方法，该方法是将治疗有效量的如上所定义的药物组合物施用于受试者，优选人，其中所述药物组合物包含本发明的VLP，所述VLP包含一种或多种肿瘤抗原(特别地包含在如上所定义的本发明多肽的L1和/或L2中的肿瘤抗原)。
本发明进一步涉及产生如本文所述的多肽的方法，其包括在允许所述多肽表达的条件下在合适的培养基中培养重组宿主细胞的步骤，其中，所述宿主细胞包含载体，所述载体包含编码所述多肽的核酸。
优选地，用于产生本发明的多肽的方法进一步包括从宿主细胞和/或培养基中回收表达的多肽的步骤。甚至更优选地，所述方法还包括通过本领域已知的纯化手段如离心、凝胶色谱、亲和色谱等来纯化回收的多肽的步骤。
本发明还提供了一种用于产生如本文所定义的VLP的方法，该方法包括在允许多肽如前所述组装成VLP的条件下温育多肽溶液的步骤。可以通过用电子显微镜检查样品溶液来测试VLP的正确形成。
附图说明
图1：(A)由某些腺病毒血清型基座蛋白形成的十二面体代表了一种多功能支架。(B)它们包含60个拷贝的腺病毒基座蛋白，所述腺病毒基座蛋白可分为冠状结构域(橙色)和多聚化结构域(蓝色)。在多聚化结构域内，通过分裂产生的末端可以通过短寡肽接头重新连接，从而产生连续的多肽链。基座蛋白的N端和C端都包含在多聚化结构域中。
图2：显示了基于hAd3的五邻体基座原体的本发明多肽的优选实施方式的果冻卷折叠结构域的示意图。
图3：腺病毒基座蛋白在最左侧示意性显示。冠状结构域(参见图1)显示为黄色，多聚结构域显示为蓝色。基座蛋白的N和C端包含在多聚化结构域中，该结构域介导五邻体和十二面体的形成。去除冠状结构域产生了自主的多聚化结构域，该结构域在之前的冠状结构域的位置现在包含寡肽、多肽、蛋白质或蛋白质复合体，如从中至右示意性所示。现在，多聚化结构域产生在其表面上呈现这些实体的病毒样颗粒。自然地，也可以将衍生自一系列腺病毒血清型的冠状结构域和工程化的冠状结构域装配到多聚化结构域支架上，包括含有异源肽和多肽序列的工程化的冠状结构域。
图4：以示意图方式显示了腺病毒衍生的十二面体展示平台(ADDomer)。原始颗粒显示在左侧。基座蛋白由多聚化结构域(蓝色)和冠状结构域(黄色)形成。60个基座蛋白形成病毒样颗粒(VLP)。展示寡肽、多肽和蛋白质结构域、蛋白质或蛋白质复合体的多个拷贝(而不是冠状结构域)的ADDomers显示在右侧。颜色标识如图3。
图5：载体pACEBac_VAJB-CHIK的示意图。
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明：
实施例
由商业供应商合成了具有表示为DNAsegVAJB-CHIK(SEQ ID NO:26；在5'端为BamHI位点，在3'端为HindIII位点；见下面带下划线的序列)的核酸：
ggatccatgaggagacgagccgtgctaggcggagcggtggtgtatccggagggtcctcctccttcttacgagagcgtgatgcagcaacaggcggcgatgatacagcccccactggaggctcccttcgtacccccacggtacctggcgcctacggaagggagaaacagcattcgttactcggagctgtcgcccctgtacgataccaccaagttgtatctggtggacaacaagtcggcggacatcgcctccctgaactatcagaacgaccacagcaacttcctgaccacggtggtgcagaacaatgactttacccccacggaggctagcacccagaccatcaactttgacgagcggtcgcgatggggcggtcagctgaagaccatcatgcacaccaacatgcccggaggtgaaaacctgtattttcagagcaccaaagataactttaacgtgtataaagcgacccgcccgtatctggcgcatggaggtgcagagcaggtctactggtcgctccctgacatgatgcaagacccagtcaccttccgctccacaagacaagtcaacaactacccagtggtgggtgcagagcttatgcccggtggaagcggaggtagcgttcctgctctcacagatcacgggaccctgccgttacgcagcagtatccggggagtccagcgcgtgaccgttactgacgccagacgccgcacctgtccctacgtttacaaggccctgggcatagtcgcgccgcgcgttctttcaagccgcactttctgataagctt
使用切割位点BamHI和HindIII将构建体克隆到转移质粒pACEBac(GenevaBiotech，Geneva，瑞士)中，产生构建体pACEBac_VAJB-CHIK(SEQ ID NO:27)：
accggttgacttgggtcaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattgacttgggtcgctcttcctgtggatgcgcagatgccctgcgtaagcgggtgtgggcggacaataaagtcttaaactgaacaaaatagatctaaactatgacaataaagtcttaaactagacagaatagttgtaaactgaaatcagtccagttatgctgtgaaaaagcatactggacttttgttatggctaaagcaaactcttcattttctgaagtgcaaattgcccgtcgtattaaagaggggcgtggccaagggcatgtaaagactatattcgcggcgttgtgacaatttaccgaacaactccgcggccgggaagccgatctcggcttgaacgaattgttaggtggcggtacttgggtcgatatcaaagtgcatcacttcttcccgtatgcccaactttgtatagagagccactgcgggatcgtcaccgtaatctgcttgcacgtagatcacataagcaccaagcgcgttggcctcatgcttgaggagattgatgagcgcggtggcaatgccctgcctccggtgctcgccggagactgcgagatcatagatatagatctcactacgcggctgctcaaacttgggcagaacgtaagccgcgagagcgccaacaaccgcttcttggtcgaaggcagcaagcgcgatgaatgtcttactacggagcaagttcccgaggtaatcggagtccggctgatgttgggagtaggtggctacgtctccgaactcacgaccgaaaagatcaagagcagcccgcatggatttgacttggtcagggccgagcctacatgtgcgaatgatgcccatacttgagccacctaactttgttttagggcgactgccctgctgcgtaacatcgttgctgctgcgtaacatcgttgctgctccataacatcaaacatcgacccacggcgtaacgcgcttgctgcttggatgcccgaggcatagactgtacaaaaaaacagtcataacaagccatgaaaaccgccactgcgccgttaccaccgctgcgttcggtcaaggttctggaccagttgcgtgagcgcatacgctacttgcattacagtttacgaaccgaacaggcttatgtcaactgggttcgtgccttcatccgtttccacggtgtgcgtcacccggcaaccttgggcagcagcgaagtcgccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatctgtaactataacggtcctaaggtagcgagtttaaacactagtatcgattcgcgacctactccggaatattaatagatcatggagataattaaaatgataaccatctcgcaaataaataagtattttactgttttcgtaacagttttgtaataaaaaaacctataaatattccggattattcataccgtcccaccatcgggcgcggatccAtgaggagacgagccgtgctaggcggagcggtggtgtatccggagggtcctcctccttcttacgagagcgtgatgcagcaacaggcggcgatgatacagcccccactggaggctcccttcgtacccccacggtacctggcgcctacggaagggagaaacagcattcgttactcggagctgtcgcccctgtacgataccaccaagttgtatctggtggacaacaagtcggcggacatcgcctccctgaactatcagaacgaccacagcaacttcctgaccacggtggtgcagaacaatgactttacccccacggaggctagcacccagaccatcaactttgacgagcggtcgcgatggggcggtcagctgaagaccatcatgcacaccaacatgcccGGAGGTgaaaacctgtattttcagagcaccaaagataactttaacgtgtataaagcgacccgcccgTatctggcgcatGGAGGTGcagagcaggtctactggtcgctccctgacatgatgcaagacccagtcaccttccgctccacaagacaagtcaacaactacccagtggtgggtgcagagcttatgcccGGTGGAagcggAggtagcgttcctgctctcacagatcacgggaccctgccgttacgcagcagtatccggggagtccagcgcgtgaccgttactgacgccagacgccgcacctgtccctacgtttacaaggccctgggcatagtcgcgccgcgcgttctttcaagccgcactttctgataagcttccatcaactttgacgagcggtcgcgatggggcggtcagctgaagaccatcatgcacaccaacatgcccaacgtgaacgagtacatgttcagcaacaagttcaaggcgagggagcttgtcgagaagtactagaggatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatctgatcactgcttgagcctagaagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactatcataacccctagggtatacccatctaattggaaccagataagtgaaatctagttccaaactattttgtcatttttaattttcgtattagcttacgacgctacacccagttcccatctattttgtcactcttccctaaataatccttaaaaactccatttccacccctcccagttcccaactattttgtccgcccaca
DNA测序用于验证正确的插入。开放阅读框编码蛋白质VAJB-CHIK(SEQ ID NO:28)，其在环L1中含有来自基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)的主要中和表位STKDNFNVYKATRPYLAH(SEQ ID NO:29)。
VAJB-CHIK(SEQ ID NO:28)：
MRRRAVLGGAVVYPEGPPPS YESVMQQQAA MIQPPLEAPF VPPRYLAPTE GRNSIRYSELSPLYDTTKLY LVDNKSADIA SLNYQNDHSN FLTTVVQNND FTPTEASTQT INFDERSRWG GQLKTIMHTNMPGGENLYFQ STKDNFNVYK ATRPYLAHGG AEQVYWSLPD MMQDPVTFRS TRQVNNYPVV GAELMPGGSGGSVPALTDHG TLPLRSSIRG VQRVTVTDAR RRTCPYVYKA LGIVAPRVLS SRTF
然后使用pACEBac_VAJB-CHIK转化带有杆状病毒基因组EMBacY作为人工染色体的DH10EMBacY细胞(Geneva Biotech，Geneva，瑞士)(描述于Fitzgerald DJ等NatMethods.2006年12月；3(12):1021-32PMID:17117155)。然后通过蓝/白筛选鉴定具有通过Tn7转位整合到DH10EMBacY细胞中的VAJB1表达盒的复合杆状病毒，并按上述方法生成重组杆状病毒(同上)。如Fitzgerald等((2006)Nat Methods，同上)所述，用如此产生的杆状病毒感染草地贪夜蛾系21(Sf21)昆虫细胞培养物。
在摇瓶中的粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)Hi5细胞中进行大规模(100ml至500ml)表达，并进行重组蛋白表达，然后如(Fitzgerald DJ等，Nat Methods.2006年12月；3(12):1021-32PMID:17117155)中所述测量黄色荧光蛋白(YFP)荧光。当YFP荧光达到平稳状态时(通常在细胞培养物中停止增殖后72小时后，参见Fitzgerald等，Nat Methods 2006)，收获昆虫细胞培养物并通过离心(4000g，10min)沉淀细胞。将细胞在液氮中冷冻并储存在-80摄氏度。
对于蛋白质制备，通过在含有完整蛋白酶抑制剂混合物(Roche Ltd)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冻融来裂解细胞。通过加载15％至40％w/v蔗糖的蔗糖梯度并以100.000g超速离心过夜来纯化蛋白质。收集梯度，并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和随后的考马斯亮蓝染色来鉴定蛋白质含量。合并含有VAJB1的级分，并用PBS(或HEPES 10mM，pH7.4，50mM NaCl)透析。使用50mM至500mM NaCl的线性梯度，在5ml HiQ色谱柱(BioRAD)上进行第二纯化步骤。通过负染色(乙酸铀酰)电子显微镜检查证实五聚体和十二聚体的形成。
Claims (36)
1.一种具有式(I)结构的多肽
A-L1-B-L2-C (I)
其中，
A是腺病毒五邻体基座蛋白的N端氨基酸序列段；
B是腺病毒五邻体基座蛋白的氨基酸序列段；
C是腺病毒五邻体基座的C端氨基酸序列段；
其中，B是在所述腺病毒五邻体基座的序列中位于A和C之间的氨基酸序列段；
其中，A、B和C形成所述腺病毒五邻体基座蛋白的果冻卷折叠结构域；
L1和L2各自独立地选自寡肽、多肽、蛋白质和蛋白质复合体；
其中，所述寡肽、多肽、蛋白质和蛋白质复合体分别是基本上非腺病毒的，或者如果是腺病毒的，则来自与衍生出所述氨基酸序列段A、B和C的腺病毒的血清型相比具有不同血清型的腺病毒。
2.如权利要求1所述的多肽，其中，氨基酸序列段A包含所述腺病毒的果冻卷折叠结构域的β折叠1、2和3。
3.如权利要求1或2所述的多肽，其中，氨基酸序列段B包含所述腺病毒的果冻卷折叠结构域的β折叠4和5。
4.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，氨基酸序列段C包含腺病毒果冻卷折叠结构域的β折叠6、7和8。
5.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，氨基酸序列段A、B和C具有各自独立地选自下组的五邻体基座的氨基酸序列：人腺病毒血清型2、人腺病毒血清型3、人腺病毒血清型4、人腺病毒血清型5、人腺病毒血清型7、人腺病毒血清型11、人腺病毒血清型12、人腺病毒血清型17、人腺病毒血清型25、人腺病毒血清型35、人腺病毒血清型37、人腺病毒血清型41、大猩猩腺病毒、黑猩猩腺病毒、猿猴腺病毒血清型18、猿猴腺病毒血清型20、猿猴腺病毒血清型49、恒河猴腺病毒血清型51、恒河猴腺病毒血清型52、和恒河猴腺病毒血清型53。
6.如权利要求5所述的多肽，其中，氨基酸序列段A具有以下共有序列(SEQ ID NO:21):
(U)1-47PTX1GRNSIRY SX2X3x4PX5X6DTT X7X3YLVDNKSA DIASLNYQND HSNFX5TTVX9Q NNDX1 0X11PX12EAX13TQTINX14DX15RSRWGX16X17LKTIX18X19TZ1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8 Z9Z10Z11Z12Z13Z14Z15
其中，氨基酸序列段A在C端侧终止于Z1之前的残基T或终止于Z1至Z15的氨基酸
U是任何氨基酸或没有氨基酸
X1是E或G
X2是E或S
X3是L或V
X4是A或S
X5是L或Q
X6是Y或E
X7是R或K
X8是V或L
X9是V或I
X10是F或Y
X11是T或S
X12是A或T或I或G
X13是S或G
X14是F或L
X15是E或D
X16是A或G
X17是D或Q
X18是L或M
X19是H或R
Z1如果存在，则是N
Z2如果存在，则是M
Z3如果存在，则是P
Z4如果存在，则是N
Z5如果存在，则是V或I
Z6如果存在，则是N
Z7如果存在，则是E或D
Z8如果存在，则是Y或F
Z9如果存在，则是M
Z10如果存在，则是F或S或Y
Z11如果存在，则是T或S
Z12如果存在，则是S或N
Z13如果存在，则是K
Z14如果存在，则是F
Z16如果存在，则是K。
7.如权利要求6所述的多肽，其中，氨基酸序列段A选自以下序列：
UniProt Acc.No.Q2Y0H9的选自1至48位的氨基酸至选自129至144位的氨基酸；
UniProt Acc.No.P03276的选自1至48位的氨基酸至选自129至144位的氨基酸；
UniProt Acc.No.Q2KSF3的选自1至44位的氨基酸至选自125至140位的氨基酸；
UniProt Acc.No.P12538的选自1至48位的氨基酸至选自129至144位的氨基酸；
UniProt Acc.No.Q9JFT6的选自1至48位的氨基酸至选自129至144位的氨基酸；
UniProt Acc.No.D2DM93的选自1至48位的氨基酸至选自129至144位的氨基酸；
UniProt Acc.No.P36716的选自1至38位的氨基酸至选自119至134位的氨基酸；
UniProt Acc.No.F1DT65的选自1至35位的氨基酸至选自116至131位的氨基酸；
UniProt Acc.No.M0QUK0的选自1至43位的氨基酸至选自124至139位的氨基酸；
UniProt Acc.No.Q7T941的选自1至49位的氨基酸至选自130至145位的氨基酸；
UniProt Acc.No.Q912J1的选自1至35位的氨基酸至选自116至131位的氨基酸；
UniProt Acc.No.F8WQN4的选自1至46位的氨基酸至选自127至142位的氨基酸；
UniProt Acc.No.E5L3Q9的选自1至49位的氨基酸至选自130至145位的氨基酸；
UniProt Acc.No.G9G849的选自1至44位的氨基酸至选自125至140位的氨基酸；
UniProt Acc.No.H8PFZ9的选自1至46位的氨基酸至选自127至142位的氨基酸；
UniProt Acc.No.F6KSU4的选自1至45位的氨基酸至选自126至141位的氨基酸；
UniProt Acc.No.F2WTK5的选自1至46位的氨基酸至选自127至142位的氨基酸；
UniProt Acc.No.A0A0A1EWW1的选自1至43位的氨基酸至选自124至139位的氨基酸；
UniProt Acc.No.A0A0A1EWX7的选自1至43位的氨基酸至选自124至139位的氨基酸；和
UniProt Acc.No.A0A0A1EWZ7的选自1至44位的氨基酸至选自125至140位的氨基酸。
8.如权利要求5至7中任一项所述的多肽，其中，上述通式(I)的氨基酸序列段B具有以下序列(SEQ ID NO:22)：
Z17Z18Z19Z20Z21Z22Z23Z24Z25Z26Z27QVYWSLPDX20MX21DPVTFRST X22QX23X24NX25PVVGX26ELZ28Z2 9Z30
其中，氨基酸序列段B在N端侧起始于Z17至Z27的氨基酸或起始于Z27之后的氨基酸Q；
氨基酸序列段B在C端侧终止于Z28之前的氨基酸L或终止于Z28至Z30的氨基酸；
Z17如果存在，则是L或S
Z18如果存在，则是T或P或C
Z19如果存在，则是T或P
Z20如果存在，则是P或S或A或R
Z21如果存在，则是N或D
Z22如果存在，则是G或V
Z23如果存在，则是H或T
Z24如果存在，则是C
Z25如果存在，则是G
Z26如果存在，则是A或V或S
Z27如果存在，则是E或Q
X20是L或M
X21是Q或K
X22是Q或R或S
X23是V或I
X24是S或N
X25是Y或F
X26是A或V
Z28如果存在，则是M或L
Z29如果存在，则是P
Z30如果存在，则是V或F。
9.如权利要求8所述的多肽，其中，氨基酸序列段B选自以下序列：
UniProt Acc.No.Q2Y0H9的选自398至409位的氨基酸至选自440至443位的氨基酸；
UniProt Acc.No.P03276的选自425至436位的氨基酸至选自467至470位的氨基酸；
UniProt Acc.No.Q2KSF3的选自379至390位的氨基酸至选自421至444位的氨基酸；
UniProt Acc.No.P12538的选自425至436位的氨基酸至选自467至470位的氨基酸；
UniProt Acc.No.Q9JFT6的选自398至409位的氨基酸至选自440至443位的氨基酸；
UniProt Acc.No.D2DM93的选自415至426位的氨基酸至选自457至460位的氨基酸；
UniProt Acc.No.P36716的选自351至362位的氨基酸至选自393至397位的氨基酸；
UniProt Acc.No.F1DT65的选自370至381位的氨基酸至选自413至416位的氨基酸；
UniProt Acc.No.M0QUK0的选自388至399位的氨基酸至选自440至443位的氨基酸；
UniProt Acc.No.Q7T941的选自445至456位的氨基酸至选自497至500位的氨基酸；
UniProt Acc.No.Q912J1的选自372至383位的氨基酸至选自414至417位的氨基酸；
UniProt Acc.No.F8WQN4的选自362至373位的氨基酸至选自404至407位的氨基酸；
UniProt Acc.No.E5L3Q9的选自416至427位的氨基酸至选自458至461位的氨基酸；
UniProt Acc.No.G9G849的选自372至383位的氨基酸至选自420至423位的氨基酸；
UniProt Acc.No.H8PFZ9的选自353至364位的氨基酸至选自395至398位的氨基酸；
UniProt Acc.No.F6KSU4的选自358至369位的氨基酸至选自400至403位的氨基酸；
UniProt Acc.No.F2WTK5的选自356至367位的氨基酸至选自398至401位的氨基酸；
UniProt Acc.No.A0A0A1EWW1的选自352至363位的氨基酸至选自394至397位的氨基酸；
UniProt Acc.No.A0A0A1EWX7的选自350至361位的氨基酸至选自392至395的氨基酸；和
UniProt Acc.No.A0A0A1EWZ7的选自351至362位的氨基酸至选自393至396位的氨基酸。
10.如权利要求5至9中任一项所述的多肽，其中，上述通式(I)的氨基酸序列段C具有以下序列(SEQ ID NO:23)：
Z31Z32Z33ALTDHGT LPLRSSIX27GV QRVTX28TDARR RTCPYVYKA
LGIVX30PX31VLS SRTF
其中，氨基酸序列段C在N端起始于Z31至Z33的氨基酸或起始于Z33之后的氨基酸A；
Z31如果存在，则是N
Z32如果存在，则是V
Z33如果存在，则是P
X27是R或S或G
X28是V或I
X29是Y或H
X30是A或S
X31是R或K。
11.如权利要求10所述的多肽，其中，氨基酸序列段C选自以下序列：
UniProt Acc.No.Q2Y0H9的选自492至495位的氨基酸至C末端氨基酸；
UniProt Acc.No.P03276的选自519至522位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.Q2KSF3的选自466至469位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.P12538的选自492至495位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.Q9JFT6的选自465至468位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.D2DM93的选自482至485位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.P36716的选自419至422位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.F1DT65的选自438至441位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.M0QUK0的选自455至458位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.Q7T941的选自522至525位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.Q912J1的选自439至442位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.F8WQN4的选自429至432位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.E5L3Q9的选自483至486位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.G9G849的选自445至448位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.H8PFZ9的选自420至423位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.F6KSU4的选自425至428位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.F2WTK5的选自423至426位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.A0A0A1EWW1的选自419至422位的氨基酸至C端氨基酸；
UniProt Acc.No.A0A0A1EWX7的选自417至420位的氨基酸至C端氨基酸；和
UniProt Acc.No.A0A0A1EWZ7的选自418至421位的氨基酸至C端氨基酸。
12.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，氨基酸序列段A具有UniProtAcc.No.Q2Y0H9的1至132位的序列，氨基酸序列段B具有UniProt Acc.No.Q2Y0H9的407至442位的序列，且氨基酸序列段C具有UniProt Acc.No.Q2Y0H9的493至544位的序列。
13.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，L1和/或L2是具有4至40个选自氨基酸G和S的氨基酸的序列的寡肽。
14.如权利要求13所述的多肽，其中，L1和/或L2独立地选自GGGS(SEQ ID NO:24)和GGSGGS(SEQ ID NO:25)。
15.如权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中，L1是腺病毒序列，其包含与衍生出所述氨基酸序列段A、B和C的腺病毒的血清型相比具有不同的血清型的腺病毒五邻体基座的RGD环，并且/或者L2是腺病毒序列，其包含与衍生出所述氨基酸序列段A、B和C的腺病毒的血清型相比具有不同的血清型的腺病毒五邻体基座的可变环。
16.如权利要求15所述的多肽，其中，L1是与衍生出所述氨基酸片段A、B和C的腺病毒的血清型相比具有不同的血清型的腺病毒五邻体基座的冠状结构域的大片段，并且L2是与衍生出所述氨基酸片段A、B和C的腺病毒的血清型相比具有不同的血清型的腺病毒五邻体基座的冠状结构域的小片段。
17.如权利要求16所述的多肽，其中，所述大片段和所述小片段衍生自相同腺病毒的五邻体基座蛋白。
18.如权利要求16所述的多肽，其中，所述大片段和所述小片段衍生自不同腺病毒的五邻体基座蛋白。
19.如权利要求15至18中任一项所述的多肽，其中，将一个或多个非腺病毒序列插入到所述RGD环和/或可变环中。
20.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，L1和/或L2包含抗原。
21.如权利要求20所述的多肽，其中，所述抗原选自传染原的抗原和肿瘤抗原。
22.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，核酸、药物、标记和/或生物结合对中的结合伴侣与L1和/或L2偶联。
23.一种编码前述权利要求中任一项所述的多肽的核酸。
24.一种包含具有以下通式(II)的序列的核酸
5’-a-is1-l1-is2-b-is3-l2-is4-c-3’ (II)
其中，
a是编码通式(I)的A的核苷酸序列；
b是编码通式(I)的B的核苷酸序列；
c是编码通式(I)的C的核苷酸序列；
l1、l2各是核苷酸序列；并且
is1至is4各自独立地是包含至少一个插入位点的核苷酸序列。
25.如权利要求24所述的核酸，其中，is1至is4选自限制酶的识别序列和归巢核酸内切酶的识别序列。
26.如权利要求25所述的核酸，其中，is1包含EcoRI位点，is2包含RsrII位点，is3包含SacI位点，并且is4包含XbaI位点。
27.一种包含权利要求23至26中任一项所述的核酸的载体。
28.如权利要求27所述的载体，其在表达盒中包含权利要求23至26中任一项所述的核酸。
29.一种重组宿主细胞，其包含权利要求23至26中任一项所述的核酸或权利要求27或28所述的载体。
30.权利要求1至22中任一项所述的多肽的五聚体复合体。
31.一种包含12个权利要求30所述的五聚体复合体的病毒样颗粒(VLP)。
32.权利要求1至22中任一项所述的多肽、权利要求23所述的核酸、权利要求27或28所述的载体、权利要求29所述的宿主细胞或权利要求31所述的VLP，其用作药物。
33.一种药物组合物，其包含权利要求1至22中任一项所述的多肽、权利要求23所述的核酸、权利要求27或28所述的载体、权利要求29所述的宿主细胞或权利要求31所述的VLP以及至少一种药学上可接受的载剂、赋形剂和/或稀释剂。
34.一种制备权利要求1至22中任一项所述的多肽的方法，该方法包括以下步骤：在允许所述多肽表达的条件下培养权利要求29所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含权利要求28所述的载体，所述载体包含权利要求23所述的核酸。
35.一种产生权利要求31所述的VLP的方法，其包括在允许多肽组装成VLP的条件下温育权利要求1至22中任一项所述的多肽的溶液的步骤。
36.权利要求1至22中任一项所述的多肽、权利要求23所述的核酸、权利要求27或28所述的载体、权利要求29所述的宿主细胞或权利要求31所述的VLP，其用于治疗和/或预防传染性疾病、免疫性疾病、肿瘤或癌症。
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