JP6566536B2

JP6566536B2 - フォワードプライマー

Info

Publication number: JP6566536B2
Application number: JP2014123214A
Authority: JP
Inventors: 美紀子中村; 赤田　倫治; 倫治赤田; 尚司星田
Original assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION YAMAGUCHI UNIVERSITY
Current assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION YAMAGUCHI UNIVERSITY
Priority date: 2014-06-16
Filing date: 2014-06-16
Publication date: 2019-08-28
Anticipated expiration: 2034-06-16
Also published as: JP2016002018A

Description

本発明は、プロモータ活性を有する配列が目的遺伝子配列の上流に連結した線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのフォワードプライマーに関する。

様々なタンパク質を細胞に発現させる技術は、細胞内におけるタンパク質の機能解析や有用タンパク質の生産などにおいて広く用いられており、今日では欠かせない技術である。細胞内で目的遺伝子などを発現させるには、プロモータ配列と目的遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製し、かかるＤＮＡコンストラクトを細胞に導入する方法が一般的である。この方法を用いる場合には、プロモータ配列を目的遺伝子配列の上流に連結する必要がある。

現在、ＤＮＡを連結するために最も一般的に用いられている方法は、ＤＮＡリガーゼを用いて、平滑末端を有するＤＮＡ分子同士又は相補的な突出末端を有するＤＮＡ分子同士を結合させるものである。しかし、かかる方法は、制限酵素処理とＤＮＡリガーゼによるＤＮＡの連結という複雑なｉｎｖｉｔｒｏ操作を必要としていた。

特許文献１には、目的遺伝子配列、発現マーカー配列及びポリアデニレーションシグナル配列から構成されるＤＮＡ断片をＰＣＲにより作製する方法が提案されている。この特許文献１記載の方法を用いれば、プロモータ配列の下流に目的遺伝子配列を連結することが可能となるが、プロモータ配列の３’末端及び目的遺伝子配列の５’末端に制限酵素サイト或いはアニーリング配列をそれぞれ組み込む必要があった。

また、特許文献２には、特定のターミネータ配列を含む（ターミネータ能力を有する）高発現用リバースプライマーを用いて、プロモータ配列、目的遺伝子配列、特定のターミネータ配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡをＰＣＲにより作製する方法が提案されている。この特許文献２の方法を用いれば、制限酵素処理やライゲーションをすることなく、ターミネータ能力を有するリバースプライマーを用いることによって、ターミネータ能力を有する配列を目的遺伝子配列の下流に連結することが可能となるが、あくまで、ターミネータ能力を有する配列を目的遺伝子配列の下流に連結する方法であり、プロモータ活性を有する配列と目的遺伝子配列とをＰＣＲのみで連結する方法の開発には至っていなかった。

さらに、特許文献３には、２種類の標的ＤＮＡ断片を融合させるために用いられる１組のプライマーを用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲを行うことにより、複数のＤＮＡ断片を融合させる方法が提案されている。この特許文献３の方法を用いれば、複数のＤＮＡ断片をＰＣＲのみによって融合することが可能であるが、かかる方法に用いるプライマーはＤＮＡ断片を融合するためのプライマーであって、プロモータ配列を融合するためのものではなく、また、プロモータ活性を有するものでもなく、プロモータ配列を連結するにはプロモータ配列を含むＤＮＡ断片を調製する必要があった。

特開２００４−１４１０２５号公報国際公開第２０１２／１４７３７０号パンフレット特開２００９−２６８３６０号公報

本発明の課題は、制限酵素処理やライゲーションという煩雑な操作や、プロモータ配列を含むＤＮＡ断片の調製が不要であって、ＰＣＲによって、プロモータ活性を有する配列を目的遺伝子配列の上流に連結することが可能なフォワードプライマーを提供することにある。

本発明者らは、プロモータ活性を有する配列をプライマーに含有させることができれば、プロモータ配列を含むＤＮＡ断片を調製することなく、ＰＣＲのみで、プロモータ配列を目的遺伝子配列の上流に連結することが可能と考えた。しかしながら、通常、プロモータ配列は数百から数千塩基もの長さを有するため、プライマーに含有させることはできない。そこで、本発明者らは、プライマーに含有可能な短い配列で、かつプロモータ活性を有する配列があれば、プライマーにプロモータ活性を有する配列を含有させることができると考え、ＣＭＶプロモータの一部の配列を含有する様々なプライマーを作製してプロモータ活性を検討した。その結果、４０〜７５塩基という非常に短く、かつ哺乳動物細胞実験において広く用いられているヒト翻訳伸長因子１−アルファ（ＥＦ１α）プロモータと同等の高いプロモータ活性を有する配列を見いだした。さらに、かかる４０〜７５塩基のプロモータ活性を有する配列を解析したところ、共通の配列を有していることを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下に開示されるとおりのものである。
（１）プロモータ活性を有する配列を目的遺伝子配列の上流に連結するためのフォワードプライマーであって、配列番号１に示される塩基配列を含む長さ３０〜１５０塩基からなるプロモータ活性を有する配列を備えたフォワードプライマー。
（２）プロモータ活性を有する配列が、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ由来の配列であることを特徴とする上記（１）記載のフォワードプライマー。
（３）プロモータ活性を有する配列が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする上記（１）記載のフォワードプライマー。
（ａ）配列番号２〜８のいずれかに示される塩基配列；
（ｂ）配列番号２〜８のいずれかに示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｃ）配列番号２〜８のいずれかに示される塩基配列との同一性が９０％以上の塩基配列；
（４）プロモータ活性を有する配列が目的遺伝子配列の上流に連結した線状二本鎖ＤＮＡであって、前記プロモータ活性を有する配列が、配列番号１に示される塩基配列を含む長さが３０〜１５０塩基からなるプロモータ活性を有する配列であることを特徴とする線状二本鎖ＤＮＡ。

本発明のフォワードプライマーによると、制限酵素処理やライゲーションという煩雑な操作やプロモータ配列を含むＤＮＡ断片の調製が不要で、ＰＣＲのみによって、プロモータ活性を有する配列を目的遺伝子配列の上流に連結することが可能となる。かかるプライマーを用いれば、プロモータ配列を有さず、目的遺伝子配列を有する線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行うことにより、プロモータ活性を有する配列を目的遺伝子配列の上流に備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製することが容易となる。さらに、目的遺伝子配列の上流に既にプロモータ配列が連結している線状二本鎖ＤＮＡでも、目的遺伝子の発現が低い場合には、本発明のプライマーを用いて、目的遺伝子配列又は既存のプロモータ配列の上流に本発明のプライマーを用いてプロモータ活性を有する配列を連結させることで、目的遺伝子の発現をより向上させることが可能となる。

本発明のフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、プロモータ活性を有する配列を目的遺伝子配列の上流に連結する例を示す図である。ｐＫＭ１３８のマップを示す図である。実施例１におけるＰＣＲの概念を示す図である。実施例１において、ＨＥＫ２９３細胞に線状二本鎖ＤＮＡを導入し、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼの発光量を調べた結果を示す図である。 CMV(-80〜-1)-hgluc-SVterのマップを示す図である。実施例２において、ＨＥＫ２９３細胞に線状二本鎖ＤＮＡを導入し、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼの発光量を調べた結果を示す図である。実施例３において、ＨＥＫ２９３細胞に線状二本鎖ＤＮＡを導入し、２４時間後に蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。

本発明のフォワードプライマーとしては、プロモータ活性を有する配列を目的遺伝子配列の上流に連結するためのフォワードプライマーであって、配列番号１に示される塩基配列を含む長さ３０〜１５０塩基からなるプロモータ活性を有する配列を備えたフォワードプライマーであれば特に制限されず、ここでプロモータ活性を有する配列とは、遺伝子の発現を目的とする配列（目的遺伝子配列）の上流に配置され、ＲＮＡポリメラーゼが結合することにより、下流に配置された遺伝子の発現を制御することができる塩基配列を意味する。

また、本発明の線状二本鎖ＤＮＡとしては、プロモータ活性を有する配列が目的遺伝子配列の上流に連結した線状二本鎖ＤＮＡであって、前記プロモータ活性を有する配列が、配列番号１に示される塩基配列を含む長さが３０〜１５０塩基からなるプロモータ活性を有する配列であれば特に制限されず、かかる線状二本鎖ＤＮＡは本発明のフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行うことで容易に作製することが可能である。

本発明において、プロモータ活性を有する配列とは、上述のように目的遺伝子の上流に配置した際に、目的遺伝子を発現させる機能を有する配列であれば特に制限されないが、例えば分泌型ルシフェラーゼの上流に配置した際に、ＥＦ１αプロモータを用いた場合と比較して５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは１００％以上の分泌型ルシフェラーゼを発現させる能力を有する配列を挙げることができる。なお、ＥＦ１αプロモータは哺乳動物細胞実験において広く用いられているプロモータであり、ＥＦ１αプロモータと比較して少なくとも５０％のプロモータ活性を有していれば、タンパク質を高発現させることが可能となる。

上記プロモータ活性を有する配列としては、配列番号９に示されるヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ配列由来の配列であることが好ましく、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示される塩基配列であることであることがより好ましい。
（ａ）配列番号２〜８のいずれかに示される塩基配列；
（ｂ）配列番号２〜８のいずれかに示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｃ）配列番号２〜８のいずれかに示される塩基配列との同一性が９０％以上の塩基配列；

なお、配列番号１に示される塩基配列は、配列番号９に示されるＣＭＶプロモータ配列における１０４番目〜１１２番目、１５７番目〜１６５番目、４２６番目〜４３４番目、５００番目〜５０８番目に存在している。

上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」としては、１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、中でも１〜２個、最も好ましくは１個の任意の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を挙げることができる。

なお、配列番号２〜８のいずれかに示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列においては、配列番号２〜８のいずれかに示される塩基配列中の配列番号１に示す塩基配列以外が欠失、置換若しくは付加されていることとなる。

上記「配列番号２〜８のいずれかに示される塩基配列との同一性が９０％以上」としては、配列番号２〜８いずれかに示される塩基配列との同一性が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上を挙げることができる。

なお、配列番号２〜８のいずれかに示される塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列においては、配列番号２〜８のいずれかに示される塩基配列中に配列番号１に示す塩基配列と１００％同一性を有する塩基配列が含まれていることとなる。

上記プロモータ活性を有する配列の長さとしては、３０〜１５０塩基、好ましくは３５〜１００塩基、より好ましくは３５〜８０塩基、さらに好ましくは４０〜７５塩基を挙げることができる。

上記目的遺伝子としては、用途に合わせて全長の遺伝子でも、その一部でもよい。また、その由来はいかなる生物から単離された遺伝子でも、遺伝子工学的に作製された人工的な遺伝子でもよく、遺伝子における５’末端の開始コドン及び３’末端に停止コドンは、適宜、含んでも含まなくてもよい。

本発明において、目的遺伝子配列の上流には、プロモータ配列や、シグナルペプチド又はタグペプチドをコードする配列や、ＴＡＴＡボックス等、いかなる配列を含んでもよく、目的遺伝子配列の下流には、ターミネータ配列や、タグペプチドをコードする配列等、いかなる配列を含んでもよい。

上記シグナルペプチドとしては、ゴルジ体移行シグナルペプチド、細胞膜移行シグナルペプチド、ミトコンドリア移行シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、シナプス移行シグナルペプチド、核小体移行シグナルペプチド、核膜移行シグナルペプチド、ペルオキシソーム移行シグナルペプチド等を挙げることができ、タグペプチドとしては、ＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグ、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、Ｖ５タグ等を挙げることができる。

上記ターミネータ配列としては、遺伝子発現を行う目的、目的遺伝子の種類等によって適宜選択することができ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネータ配列等の天然に存在するターミネータ配列であっても、データベース上の配列に基づいて人工的に合成したターミネータ配列であってもよい。

本発明において、フォワードプライマーとしては、配列番号１に示される塩基配列を含む長さ３０〜１５０塩基からなるプロモータ活性を有する配列を備えていればよく、プロモータ活性を有する配列と該プロモータ活性を有する配列以外の配列とを順次有しているものが挙げられ、かかる該プロモータ活性を有する配列以外の配列にはＰＣＲのテンプレートとなる二本鎖ＤＮＡとアニールする配列が含まれる。

テンプレートとして用いる二本鎖ＤＮＡが目的遺伝子を含有している場合には、上記アニールする配列として、目的遺伝子の５’末端を含む塩基配列及び／又はかかる５’末端より上流側の塩基配列とアニールする配列とすることが好ましい。

該プロモータ活性を有する配列以外の配列には、ＴＡＴＡボックスや、目的遺伝子の全部又は一部の配列や、シグナルペプチド又はタグペプチドをコードする配列を含んでもよく、かかる配列が前記アニールする配列となってもよい。

該プロモータ活性を有する配列以外の配列の長さとしては、１２〜１５０塩基、好ましくは１５〜１００塩基、より好ましくは２０〜５０塩基を挙げることができる。

本発明のフォワードプライマーは、ホスホアミダイド法やチオホスファイト法等の公知の方法で化学合成することが可能である。

本発明のフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、プロモータ活性を有する配列を目的遺伝子配列に連結することが可能となる。ＰＣＲに用いるテンプレートとしては、環状の二本鎖ＤＮＡでも線状二本鎖ＤＮＡでもよい。

本発明のフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、プロモータ活性を有する配列を線状二本鎖ＤＮＡに連結する例を以下に示す。

たとえば、図１（ａ）に示すように、目的遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えた二本鎖ＤＮＡをテンプレートとし、プロモータ活性を有する配列と、目的遺伝子配列の５’末端を含む塩基配列とアニールする配列とを含む本発明のフォワードプライマーと、ターミネータ配列の３’末端側にアニールするリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的遺伝子配列にプロモータ活性を有する配列を連結させ、プロモータ活性を有する配列と目的遺伝子配列とターミネータ配列とを備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製することが可能となる。

また、図１（ｂ）に示すように、目的遺伝子配列の５’末端より上流側の塩基配列と、目的遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えた二本鎖ＤＮＡをテンプレートとし、プロモータ活性を有する配列と、目的遺伝子配列の５’末端より上流側の塩基配列とアニールする配列とを含む本発明のフォワードプライマーと、ターミネータ配列の３’末端側にアニールするリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的遺伝子配列にプロモータ活性を有する配列を連結させ、プロモータ活性を有する配列と目的遺伝子配列の５’末端より上流側の塩基配列と目的遺伝子配列とターミネータ配列とを備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製することが可能となる。

さらに、図１（ｃ）に示すように、目的遺伝子配列を備えた二本鎖ＤＮＡをテンプレートとし、プロモータ活性を有する配列と、目的遺伝子配列の５’末端を含む塩基配列とアニールする配列とを含む本発明のフォワードプライマーと、特許文献２に記載されたターミネータ配列を含む高発現リバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的遺伝子配列にプロモータ活性を有する配列を連結させ、プロモータ活性を有する配列と目的遺伝子配列とターミネータ配列とを備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製することが可能となる。

（線状二本鎖ＤＮＡの作製）
図２に示すｐＫＭ１３８をテンプレート（最終濃度１００ｐｇ／μｌ）として、配列番号１０（EF1α-1100）に示されるフォワードプライマーと、配列番号１１（pEGFP+1018c）に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＥＦ１αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子とＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（EF1α(-1100〜-1)-hgluc-SVter）を作製した。次に、作製したEF1α(-1100〜-1)-hgluc-SVterをテンプレート（最終濃度５ｐｇ／μｌ）として、表１に示すフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてそれぞれ図３に示すようにＰＣＲを行い、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）のＡを＋１とし、ＥＦ１αプロモータ配列の３’末端を−１とした場合の上流側−１０２０〜−１番目の配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter）の上流に、ＣＭＶプロモータ配列（配列番号９）の３’末端を−１とした場合の、上流側−５００〜−４２６番目の配列（配列番号２）を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-500〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter）、同上流側−４９５〜−４２６番目の配列（配列番号３）を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-495〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter）、同上流側−４７５〜−４２６番目の配列（配列番号４）を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-475〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter）、同上流側−４５３〜−４１４番目の配列（配列番号５）を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-453〜-414)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter）、同上流側−１３０〜−７１番目の配列（配列番号６）を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-130〜-71)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter）、同上流側−１３０〜−６１番目の配列（配列番号７）を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-130〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter）、同上流側−１２０〜−６１番目の配列（配列番号８）を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-120〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter）、同上流側−４９０〜−４６１番目の配列（配列番号２３）を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-490〜-461)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter）、同上流側−４３０〜−３９１番目の配列（配列番号２４）を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-430〜-391)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter）、同上流側−９０〜−６１番目の配列（配列番号２５）を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-90〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter）、又はＥＦ１αプロモータ配列の３’末端を−１とした場合の上流側−１０２０〜−１番目の配列を備えた線状二本鎖ＤＮＡ（EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter）をそれぞれ作製した。

作製した線状二本鎖ＤＮＡの長さをアガロース電気泳動処理し、得られたＰＣＲ産物は、ＥＦ１αプロモータ配列の３’末端を−１とした場合の上流側−１０２０〜−１番目の配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの上流に、配列番号２〜８、２３〜２５に示す塩基配列を備えたそれぞれの線状二本鎖ＤＮＡの長さであることを確認した。

なお、ＥＦ１αプロモータは哺乳動物細胞においてタンパク質を発現する際に用いられる高発現プロモータである。全長が１１００塩基であり、３’末端を−１とした場合の上流側−１０２０〜−１番目の配列（図３における−１０２０から−１までの１０２０塩基）はＴＡＴＡボックスを有しているが、プロモータ活性をほとんど有さない。

ＰＣＲはＧＸＬＤＮＡポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。すなわち、１×ｂｕｆｆｅｒに最終濃度がフォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭ、ｄＮＴＰ２００μＭ、ＧＸＬＤＮＡポリメラーゼ０．２５Ｕとなるように混合し、９８℃で４分反応させた後、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１．５分のサイクルを３０回行った。ＰＣＲの条件については、後述の実施例においても同様である。

（細胞への導入及びルシフェラーゼの発光量の測定）
ＨＥＫ２９３細胞を４０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートにそれぞれ播種して１８時間培養後、上記で得られたそれぞれの線状二本鎖ＤＮＡを、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により細胞に導入した。そして、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼの発光量をＢｉｏＬｕｘＧａｕｓｓｉａＬｕｃｉｆｅｒａｓｅａｓｓａｙｋｉｔ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）とＣｅｎｔｒｏＬＢ９６０（ベルトールド社製）を用いて測定することでプロモータ活性を評価した。結果を図４に示す。図中、横軸の数字は導入した線状二本鎖ＤＮＡの種類を表し、縦軸はルシフェラーゼの相対発光量ＲＬＵ（counts/sec/μｌ）を表す。

（結果）
図４に示すように、eCMV(-500〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-495〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-475〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-453〜-414)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-130〜-71)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-130〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-120〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合は、EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合と比較して顕著にルシフェラーゼ発光量が多く、EF1α(-1100〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合と比較しても発現量はいずれも少なくとも６０％以上、eCMV(-500〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合においては１００％以上であり、本発明のフォワードプライマーを用いることで、目的遺伝子配列の上流にプロモータ活性を有する配列を容易に連結することが可能であり、連結した配列は４０〜７５塩基という短い配列でも高いプロモータ活性を有することが明らかとなった。

また、eCMV(-500〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-495〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-475〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-453〜-414)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-130〜-71)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-130〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-120〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVterは、配列番号１に示す配列を共通に有していた。さらに、配列番号１に示す配列を２か所有するeCMV(-500〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合において最もプロモータ活性が高く、ＥＦ１αプロモータの全長を備えたEF1α(-1100〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合よりも高い活性を有していた。一方、配列番号１に示す配列を有していないeCMV(-490〜-461)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-430〜-391)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-90〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合はプロモータ活性が低かった。したがって、配列番号１に示される塩基配列がプロモータ活性に大きく関与していることが明らかとなった。

図５に示す、ＣＭＶプロモータ配列（配列番号９）の３’末端を−１とした場合の上流側−８０〜−１番目の配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子とＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（CMV（-80〜-1）-hgluc-SVter）をテンプレート（最終濃度５ｐｇ／μｌ）として、配列番号２６（eCMV453-414-80-1-hGluc+1）に示されるフォワードプライマーと配列番号１１（pEGFP+1018c）に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモータ配列の３’末端を−１とした場合の上流側−４５３〜−４１４番目の配列（配列番号５）と、同上流側−８０〜−１番目の配列（配列番号２７）と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-453〜-414)-eCMV(-80〜-1)-hgluc-SVter）を作製した。同様にコントロールとして、CMV（-80〜-1）-hgluc-SVterをテンプレート（最終濃度５ｐｇ／μｌ）として、配列番号２８（eCMV-80）に示されるフォワードプライマーと配列番号１１（pEGFP+1018c）に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、eCMV(-80〜-1)-hgluc-SVterを作製した。

作製した線状二本鎖ＤＮＡの長さをアガロース電気泳動処理し、得られたＰＣＲ産物は、ＣＭＶプロモータ配列の３’末端を−１とした場合の−８０〜−１番目の配列（配列番号２７）と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの上流に、配列番号５に示す塩基配列を備えた線状二本鎖ＤＮＡの長さであることを確認した。

なお、ＣＭＶプロモータ配列の３’末端を−１とした場合の上流側−８０〜−１番目の配列はＴＡＴＡボックスを有しているが、プロモータとしての機能をほとんど有さない配列である。

（細胞への導入及びルシフェラーゼの発光量の測定）
ＨＥＫ２９３細胞を４０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートにそれぞれ播種して１８時間培養後、上記で得られたそれぞれの線状二本鎖ＤＮＡを実施例１と同様の方法で導入し、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼを測定することでプロモータ活性を評価した。結果を図６に示す。図中、横軸の数字は導入した線状二本鎖ＤＮＡの種類を表し、縦軸はルシフェラーゼの相対発光量ＲＬＵ（counts/sec/μｌ）を表す。

（結果）
図６に示すように、eCMV(-453〜-414)-eCMV(-80〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合でも、コントロールのeCMV(-80〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合と比較して顕著にルシフェラーゼ発光量が多く、本発明のフォワードプライマーを用いることで、目的遺伝子配列の上流にプロモータ活性を有する配列を容易に連結することが可能であり、連結した配列はわずか４０塩基という短い配列でも高いプロモータ活性を有することが明らかとなった。また、図４と図６の結果から、発現させる遺伝子の上流のＤＮＡ配列の種類に関わらず、本発明のフォワードプライマーを用いて連結した配列は高いプロモータ活性を有することが明らかとなった。

（線状二本鎖ＤＮＡの作製）
プラスミドpTurboGFP-mito（Evrogen JSC社製）をテンプレート（最終濃度１００ｎｇ／μｌ）として、配列番号２８に示すフォワードプライマー（eCMV-80）と配列番号１１に示すリバースプライマー（pEGFP+1018c）を用いて１ｓｔＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモータ配列の３’末端を−１とした場合の上流側−８０〜−１番目の配列と、ミトコンドリア局在配列とＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-80〜-1)-mito-TurboGFP-SVter）を作製した。

得られた１ｓｔＰＣＲ産物のeCMV(-80〜-1)-mito-TurboGFP-SVterをテンプレート（最終濃度５ｐｇ／μｌ）として、配列番号２９に示すフォワードプライマー（eCMV453-414-eCMV-80）と配列番号１１に示すリバースプライマー（pEGFP+1018c）を用いて２ｎｄＰＣＲを行い、配列番号５に示すプロモータ活性を有する配列と、ＣＭＶプロモータ配列の３’末端を−１とした場合の上流側−８０〜−１番目の配列と、ミトコンドリア局在配列とＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた二本鎖ＤＮＡ（eCMV(-453〜-414)-eCMV(-80〜-1)-mito-TurboGFP-SVter）を作製した。

また、プラスミドpTurboGFP-mito（Evrogen JSC社製）をテンプレート（最終濃度１００ｎｇ／μｌ）として、配列番号３０に示すフォワードプライマー（pEGFP-600）と配列番号１１に示すリバースプライマー（pEGFP+1018c）を用いてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモータ全長の配列とミトコンドリア局在配列とＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子とＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えた二本鎖ＤＮＡ（CMVp full length-mito-TurboGFP-SVter）を作製した。

作製した線状二本鎖ＤＮＡの長さをアガロース電気泳動処理し、得られたＰＣＲ産物は、配列番号５に示すプロモータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列の３’末端を−１とした場合の上流側−８０〜−１番目の配列と、ミトコンドリア局在配列とＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた二本鎖ＤＮＡや、ＣＭＶプロモータ全長の配列とミトコンドリア局在配列とＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子とＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えた二本鎖ＤＮＡの長さであることを確認した。

（細胞への導入及びＧＦＰの蛍光観察）
ＨＥＫ２９３細胞を４０００細胞／ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌプレートに播種し、eCMV(-453〜-414)-eCMV-80-mito-TurboGFP-SVter及びCMVp full length-mito-TurboGFP-SVterをそれぞれ４０ｎｇ／ｗｅｌｌとなるように導入して、２４時間培養後に蛍光顕微鏡で観察した。結果を図７に示す。図中、ＧＦＰはＧＦＰの蛍光観察結果、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒはミトコンドリアの観察結果、ＭａｒｇｅはＧＦＰとＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒを合成した結果、ＢＦ（ｐｈａｓｅ）は明視野である。また、上段に示すCMVp Full lengthはCMVp full length-mito-TurboGFP-SVterを導入した場合、下段に示すeCMV453-414-TurboGFPはeCMV(-453〜-414)-eCMV-80-mito-TurboGFP-SVterを導入した場合を示す。

（結果）
図７に示すように、eCMV(-453〜-414)-eCMV-80-mito-TurboGFP-SVterを導入した細胞ではCMVp full length-mito-TurboGFP-SVterを導入した細胞と同様にミトコンドリアにおいてＧＦＰの蛍光が観察された。上記結果から、本発明のフォワードプライマーを用いることで、目的遺伝子配列の上流にプロモータ活性を有する配列を容易に連結することが可能であること、また、本発明のフォワードプライマーを用いて連結した配列は高いプロモータ活性を有することが明らかとなった。

Claims

目的遺伝子の発現を向上させる配列をＴＡＴＡボックス配列及び前記目的遺伝子配列の上流に連結するためのフォワードプライマーであって、以下の（ａ）に示される塩基配列、及び前記ＴＡＴＡボックス配列の５’末端より上流側の塩基配列とアニールする配列からなり、長さ４０〜１００塩基の前記フォワードプライマー。
（ａ）配列番号２〜８のいずれかに示される塩基配列
（ａ）に示される塩基配列が、配列番号２〜６、８のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする請求項１記載のフォワードプライマー。