JP2016002018A - フォワードプライマー - Google Patents
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Abstract
Description
(1)プロモータ活性を有する配列を目的遺伝子配列の上流に連結するためのフォワードプライマーであって、配列番号1に示される塩基配列を含む長さ30〜150塩基からなるプロモータ活性を有する配列を備えたフォワードプライマー。
(2)プロモータ活性を有する配列が、ヒトサイトメガロウィルス(CMV)プロモータ由来の配列であることを特徴とする上記(1)記載のフォワードプライマー。
(3)プロモータ活性を有する配列が、以下の(a)〜(c)のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする上記(1)記載のフォワードプライマー。
(a)配列番号2〜8のいずれかに示される塩基配列;
(b)配列番号2〜8のいずれかに示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列;
(c)配列番号2〜8のいずれかに示される塩基配列との同一性が90%以上の塩基配列;
(4)プロモータ活性を有する配列が目的遺伝子配列の上流に連結した線状二本鎖DNAであって、前記プロモータ活性を有する配列が、配列番号1に示される塩基配列を含む長さが30〜150塩基からなるプロモータ活性を有する配列であることを特徴とする線状二本鎖DNA。
(a)配列番号2〜8のいずれかに示される塩基配列;
(b)配列番号2〜8のいずれかに示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列;
(c)配列番号2〜8のいずれかに示される塩基配列との同一性が90%以上の塩基配列;
図2に示すpKM138をテンプレート(最終濃度100pg/μl)として、配列番号10(EF1α-1100)に示されるフォワードプライマーと、配列番号11(pEGFP+1018c)に示されるリバースプライマーを用いてPCRを行い、EF1αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子とSV40ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖DNA(EF1α(-1100〜-1)-hgluc-SVter)を作製した。次に、作製したEF1α(-1100〜-1)-hgluc-SVterをテンプレート(最終濃度5pg/μl)として、表1に示すフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてそれぞれ図3に示すようにPCRを行い、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子の開始コドン(ATG)のAを+1とし、EF1αプロモータ配列の3’末端を−1とした場合の上流側−1020〜−1番目の配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子と、SV40ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖DNA(EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter)の上流に、CMVプロモータ配列(配列番号9)の3’末端を−1とした場合の、上流側−500〜−426番目の配列(配列番号2)を備えた線状二本鎖DNA(eCMV(-500〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter)、同上流側−495〜−426番目の配列(配列番号3)を備えた線状二本鎖DNA(eCMV(-495〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter)、同上流側−475〜−426番目の配列(配列番号4)を備えた線状二本鎖DNA(eCMV(-475〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter)、同上流側−453〜−414番目の配列(配列番号5)を備えた線状二本鎖DNA(eCMV(-453〜-414)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter)、同上流側−130〜−71番目の配列(配列番号6)を備えた線状二本鎖DNA(eCMV(-130〜-71)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter)、同上流側−130〜−61番目の配列(配列番号7)を備えた線状二本鎖DNA(eCMV(-130〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter)、同上流側−120〜−61番目の配列(配列番号8)を備えた線状二本鎖DNA(eCMV(-120〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter)、同上流側−490〜−461番目の配列(配列番号23)を備えた線状二本鎖DNA(eCMV(-490〜-461)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter)、同上流側−430〜−391番目の配列(配列番号24)を備えた線状二本鎖DNA(eCMV(-430〜-391)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter)、同上流側−90〜−61番目の配列(配列番号25)を備えた線状二本鎖DNA(eCMV(-90〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter)、又はEF1αプロモータ配列の3’末端を−1とした場合の上流側−1020〜−1番目の配列を備えた線状二本鎖DNA(EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter)をそれぞれ作製した。
HEK293細胞を4000細胞/wellになるように96wellプレートにそれぞれ播種して18時間培養後、上記で得られたそれぞれの線状二本鎖DNAを、FuGENE(登録商標)HD Transfection Reagentキット(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)により細胞に導入した。そして、24時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼの発光量をBioLux Gaussia Luciferase assay kit(New England Biolabs社製)とCentro LB960(ベルトールド社製)を用いて測定することでプロモータ活性を評価した。結果を図4に示す。図中、横軸の数字は導入した線状二本鎖DNAの種類を表し、縦軸はルシフェラーゼの相対発光量RLU(counts/sec/μl)を表す。
図4に示すように、eCMV(-500〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-495〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-475〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-453〜-414)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-130〜-71)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-130〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVter、eCMV(-120〜-61)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合は、EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合と比較して顕著にルシフェラーゼ発光量が多く、EF1α(-1100〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合と比較しても発現量はいずれも少なくとも60%以上、eCMV(-500〜-426)-EF1α(-1020〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合においては100%以上であり、本発明のフォワードプライマーを用いることで、目的遺伝子配列の上流にプロモータ活性を有する配列を容易に連結することが可能であり、連結した配列は40〜75塩基という短い配列でも高いプロモータ活性を有することが明らかとなった。
HEK293細胞を4000細胞/wellになるように96wellプレートにそれぞれ播種して18時間培養後、上記で得られたそれぞれの線状二本鎖DNAを実施例1と同様の方法で導入し、24時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼを測定することでプロモータ活性を評価した。結果を図6に示す。図中、横軸の数字は導入した線状二本鎖DNAの種類を表し、縦軸はルシフェラーゼの相対発光量RLU(counts/sec/μl)を表す。
図6に示すように、eCMV(-453〜-414)-eCMV(-80〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合でも、コントロールのeCMV(-80〜-1)-hgluc-SVterを導入した場合と比較して顕著にルシフェラーゼ発光量が多く、本発明のフォワードプライマーを用いることで、目的遺伝子配列の上流にプロモータ活性を有する配列を容易に連結することが可能であり、連結した配列はわずか40塩基という短い配列でも高いプロモータ活性を有することが明らかとなった。また、図4と図6の結果から、発現させる遺伝子の上流のDNA配列の種類に関わらず、本発明のフォワードプライマーを用いて連結した配列は高いプロモータ活性を有することが明らかとなった。
プラスミドpTurboGFP-mito(Evrogen JSC社製)をテンプレート(最終濃度100ng/μl)として、配列番号28に示すフォワードプライマー(eCMV-80)と配列番号11に示すリバースプライマー(pEGFP+1018c)を用いて1stPCRを行い、CMVプロモータ配列の3’末端を−1とした場合の上流側−80〜−1番目の配列と、ミトコンドリア局在配列とGFPタンパク質をコードする遺伝子と、SV40ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖DNA(eCMV(-80〜-1)-mito-TurboGFP-SVter)を作製した。
HEK293細胞を4000細胞/wellとなるように96wellプレートに播種し、eCMV(-453〜-414)-eCMV-80-mito-TurboGFP-SVter及びCMVp full length-mito-TurboGFP-SVterをそれぞれ40ng/wellとなるように導入して、24時間培養後に蛍光顕微鏡で観察した。結果を図7に示す。図中、GFPはGFPの蛍光観察結果、Mitotrackerはミトコンドリアの観察結果、MargeはGFPとMitotrackerを合成した結果、BF(phase)は明視野である。また、上段に示すCMVp Full lengthはCMVp full length-mito-TurboGFP-SVterを導入した場合、下段に示すeCMV453-414-TurboGFPはeCMV(-453〜-414)-eCMV-80-mito-TurboGFP-SVterを導入した場合を示す。
図7に示すように、eCMV(-453〜-414)-eCMV-80-mito-TurboGFP-SVterを導入した細胞ではCMVp full length-mito-TurboGFP-SVterを導入した細胞と同様にミトコンドリアにおいてGFPの蛍光が観察された。上記結果から、本発明のフォワードプライマーを用いることで、目的遺伝子配列の上流にプロモータ活性を有する配列を容易に連結することが可能であること、また、本発明のフォワードプライマーを用いて連結した配列は高いプロモータ活性を有することが明らかとなった。
Claims (4)
- プロモータ活性を有する配列を目的遺伝子配列の上流に連結するためのフォワードプライマーであって、配列番号1に示される塩基配列を含む長さ30〜150塩基からなるプロモータ活性を有する配列を備えたフォワードプライマー。
- プロモータ活性を有する配列が、ヒトサイトメガロウィルス(CMV)プロモータ由来の配列であることを特徴とする請求項1記載のフォワードプライマー。
- プロモータ活性を有する配列が、以下の(a)〜(c)のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする請求項1記載のフォワードプライマー。
(a)配列番号2〜8のいずれかに示される塩基配列;
(b)配列番号2〜8のいずれかに示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列;
(c)配列番号2〜8のいずれかに示される塩基配列との同一性が90%以上の塩基配列; - プロモータ活性を有する配列が目的遺伝子配列の上流に連結した線状二本鎖DNAであって、前記プロモータ活性を有する配列が、配列番号1に示される塩基配列を含む長さが30〜150塩基からなるプロモータ活性を有する配列であることを特徴とする線状二本鎖DNA。
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