JPWO2018110471A1 - 転写調節融合ポリペプチド - Google Patents

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Abstract

【課題】 標的遺伝子の転写を調節する融合ポリペプチドを提供することにある。【解決手段】 本発明者らは、細胞膜透過性ペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチド及び転写調節因子を含む融合ポリペプチドを提供した。【選択図】 なし

Description

本発明は、転写調節融合ポリペプチドに関する。
ゲノム編集技術として、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ蛋白質（ＺＦＰ）にヌクレアーゼを融合させたＺｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ(ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、ＰｅｎｔａｔｒｉｃｏＰｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｐｅａｔ（ＰＰＲ）蛋白質、及びＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ９(ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９）が報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６、Ｖｏｌ．９３、ｐ．１１５６−１１６０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１０、Ｖｏｌ．１８６、ｐ．７５７−７６１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３、Ｖｏｌ．３３９、ｐ．８１９−８２６、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.、２０１６、Ｖｏｌ．１４６９、ｐ．１４７−１５５）。ＺＦＰ、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）及びＰＰＲ蛋白質は任意の遺伝子に結合することができるため、当該蛋白質に転写調節因子を結合させた融合ポリペプチドが標的の遺伝子の塩基配列に結合することによって、遺伝子の発現を調節できることが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６、Ｖｏｌ．９３、ｐ．１１５６−１１６０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１０、Ｖｏｌ．１８６、ｐ．７５７−７６１、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.、２０１６、Ｖｏｌ．１４６９、ｐ．１４７−１５５）。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムで使用されるｇＲＮＡは任意の遺伝子に結合でき、かつ、Ｃａｓ９はｇＲＮＡに結合できることから（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.、２０１６、Ｖｏｌ．１４６９、ｐ．１４７−１５５）、ＣＡＳ９のヌクレアーゼ活性が欠失した変異体（ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｓ９（ｄＣＡＳ９とも称する）に転写誘導活性を有する蛋白質を結合させた融合蛋白質（ｄＣＡＳ９−転写誘導因子とも称する）をｇＲＮＡとともに使用することによって、標的遺伝子の発現を亢進させることが報告されている（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１３、Ｖｏｌ．１０、ｐ．９７７−９７９）。
ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＰＰＲ蛋白質及びｄＣａｓ９に結合させる転写調節因子として、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ｐ３００及びＶＰＲなどの転写活性化因子並びにＫｒｕｐｐｅｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘ（ＫＲＡＢ）などの転写抑制因子が報告されている（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、２０１３、Ｖｏｌ．２、ｐ．ｅ８７、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１５、Ｖｏｌ．３３、ｐ．５１０−５１７、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１５、Ｖｏｌ．１２、ｐ．３２６−３２８、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２０１０、Ｖｏｌ．８、ｐ．２４６−２５３）。
細胞膜透過性ペプチドは細胞膜を透過して細胞内部に移動する機能を持つポリペプチドである。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のＴＡＴをはじめ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｏｌｉｇｏａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅなど、多数の配列が知られている（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１５、Ｖｏｌ．１５４、ｐ．７８−８６）。また、ＨＩＶ−１のＶｉｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒ蛋白質に含まれるペプチド配列から見出された新規細胞膜透過性ペプチドが報告されている（国際公開第２００８／１０８５０５号）。
細胞膜透過性ペプチドは、ゲノム編集蛋白質（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９)を細胞内に届けるためのツールとして利用できることが報告されている（非特許文献１）。例えば、ヒトＣＣＲ５遺伝子に結合するＴＡＬＥＮ及びＴＡＴを含む融合ポリペプチド（非特許文献２、非特許文献３）、並びに、ＶＥＧＦのプロモーター領域に結合するＺＦＰ、ＴＡＴ及びＶＰ１６を含む融合ポリペプチド（非特許文献４）が報告されている。
ヒトＴｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴＥＲＴ）遺伝子を標的として報告された融合ポリペプチドとしては、ヒトＴＥＲＴのプロモーター領域又はエキソンに結合するＺＦＰ及びＶＰ１６を含む融合ポリペプチドが報告されている（非特許文献５）。ヒトＴＥＲＴのプロモーター領域に結合するＺＦＰ及びＫＲＡＢを含む融合ポリペプチドも報告されている（非特許文献６）。
「ザ ジャーナル オブ コントロールド リリース（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ）」、(オランダ)、２０１６、Ｖｏｌ．２２６、ｐ．１２４−１３７ 「プロス ワン（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．）」（米国）、２０１４、Ｖｏｌ．９、ｅ８５７５５ 「セル リジェネレーション（Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｅｎ．（Ｌｏｎｄ））」（英国）、２０１３、Ｖｏｌ．２、ｐ．５−１２ 「プロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）」（米国）、２００４、Ｖｏｌ．１０１、ｐ．１５２２５−１５２３０ 「モレキュラー セラピー ヌクレイック アシッズ（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）」（オランダ）、２０１３、Ｖｏｌ．２、ｅ８７ 「モレキュラー キャンサー リサーチ（Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）」（米国）、２０１０、Ｖｏｌ．８、ｐ．２４６−２５３
本発明の課題は、細胞の培地に添加するだけで、当該細胞における標的遺伝子の転写を調節する、新規の融合ポリペプチドを提供することにある。
本発明者らは、標的遺伝子の転写を調節する新規ポリペプチドの作製において相当の創意検討を重ねた結果、細胞膜透過性ペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチドを作製し（実施例１）、当該融合ポリペプチドが標的遺伝子の転写を活性化できること（実施例２−４）を見出した。これらの結果、前記融合ポリペプチドを提供し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含んでもよい。
［１］細胞膜透過性ペプチド、配列番号４９に示される塩基配列に結合するＤＮＡ結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
［２］転写活性化因子がＶＰ６４、ＶＰＲ（ＶＰ６４、ｐ６５及びＲｔａを含む融合転写活性化因子）、ｐ３００又はＧＣＮ５である、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［３］細胞膜透過性ペプチドが、配列番号５３、５４、５５、５６、５７又は６０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［４］細胞膜透過性ペプチドが配列番号５６又は６０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［５］ＤＮＡ結合ポリペプチドが転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）である、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［６］ＤＮＡ結合ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸番号７〜７８４からなるアミノ酸配列を含むＴＡＬＥである、［５］に記載の融合ポリペプチド。
［７］ＤＮＡ結合ポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［８］細胞膜透過性ペプチドが配列番号５６又は６０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、ＤＮＡ結合ポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、転写活性化因子がＶＰＲである、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［９］配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［１１］［１０］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１２］［１１］に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［１３］［１２］に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する融合ポリペプチドを製造する方法。
［１４］［１］〜［９］のいずれかに記載の融合ポリペプチドを含む培地でヒト体細胞を培養する工程を包含する、ヒト体細胞におけるヒトＴｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴＥＲＴ）遺伝子の発現を亢進する方法。
［１５］［１］〜［９］のいずれかに記載の融合ポリペプチドを含む培地でヒト体細胞を培養する工程を包含する、ヒト体細胞を増殖させる方法。
本発明の融合ポリペプチドは、細胞を培養する培地に添加するだけで、当該細胞における標的遺伝子の転写を調節するために使用できる。
ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＡｃｔｉｖａｔｏｒによるヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現上昇効果を示す。縦軸は緩衝液のみを添加したコントロールのヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を１としたときの、ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を示す。誤差線は重複する３被験試料の測定値の標準偏差を示す。 ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ｐ３００ＣＤ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−２−ｐ３００ＣＤ及びＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−３−ｐ３００ＣＤによるヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現上昇効果を示す。縦軸はＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒを添加していないコントロールのヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を１としたときの、ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を示す。誤差線は重複する３被験試料の測定値の標準偏差を示す。 ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｍｉＲ−３４６−１−ＶＰ６４によるヒトｍｉＲ−３４６ ＲＮＡ発現上昇効果を示す。縦軸はＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｍｉＲ−３４６−１−ＶＰ６４を添加していないコントロールのヒトｍｉＲ−３４６ ＲＮＡ相対発現量を１としたときの、ヒトｍｉＲ−３４６ ＲＮＡ相対発現量を示す。誤差線は重複する３被験試料の測定値の標準偏差を示す。 ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒによる細胞増殖促進効果を示す。縦軸は発光強度の測定値を示す。誤差線は重複する３被験試料の測定値の標準偏差を示す。 ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲによる細胞増殖促進効果を示す。縦軸は細胞数を示す。 ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲによるヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現上昇効果を示す。縦軸はコントロールのヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を１としたときの、ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を示す。誤差線は重複する３被験試料の測定値の標準偏差を示す ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲによる細胞増殖促進効果を示す。縦軸は細胞数を示す。
以下に、本発明について詳述する。本明細書は、本願優先権主張の基礎となる２０１６年１２月１２日に出願された日本国特許出願（特願２０１６−２４００９７号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．本発明の融合ポリペプチド
本発明の融合ポリペプチドには、以下の特徴を有するポリペプチドが含まれる。
細胞膜透過性ペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチド及び転写調節因子を含む、融合ポリペプチド。
本発明の融合ポリペプチドに含まれる転写調節因子として、転写活性化因子又は転写抑制因子を使用することができる。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
本発明の融合ポリペプチドが標的遺伝子の転写を活性化できる限り、使用される転写活性化因子は特に限定されず、例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰＲ（ＶＰ６４、ｐ６５及びＲｔａを含む融合転写活性化因子）、ｐ３００、ＧＣＮ５、ヒストンメチル化酵素及びＴＦＩＩＤ結合蛋白質などの公知の転写活性化因子を使用することができる（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、２０１３、Ｖｏｌ．２、ｐ．ｅ８７、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０１４、Ｖｏｌ．４２、ｐ．４３７５−４３９０、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１５、Ｖｏｌ．１２、ｐ．３２６−３２８、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９７、Ｖｏｌ．１６、ｐ．５５５−５６５、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、Ｖｏｌ．４０６、ｐ．５９３−５９９、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、Ｖｏｌ．４０５、ｐ．７０１−７０４）。１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドに含まれる転写活性化因子は、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００又はＧＣＮ５であり、好ましくは、ＶＰＲである。
本発明において、転写活性化因子には、転写活性化能を有している限り、野生型だけでなく、改変体も含まれる。
例えば、本発明の融合ポリペプチドに含まれる転写活性化因子として、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性（ＨＡＴ活性）を有する転写活性化因子を使用することができる。ｐ３００及びＧＣＮ５のようにＨＡＴ活性を有する転写活性化因子を使用する際には、当該転写活性化因子のＨＡＴ活性を示すコア領域を含むポリペプチドを使用することもできる。本発明において、ｐ３００には、ｐ３００のコア領域を含むポリペプチドも含まれる。１つの実施形態において、ｐ３００のコア領域はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１４２０．２のアミノ酸番号１０４８から１６６４までのアミノ酸配列からなるポリペプチドである。本発明において、ＧＣＮ５には、ＧＣＮ５のコア領域を含むポリペプチドも含まれる。１つの実施形態において、ＧＣＮ５のコア領域はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０６６５６４．２のアミノ酸番号４９７から８３７までのアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本明細書において、ＤＮＡ結合ポリペプチドについて使用される「結合する」とは、標的の塩基配列に直接結合することだけでなく、標的の塩基配列に結合するポリヌクレオチドに結合することで間接的に標的の塩基配列に結合することも意味する。したがって、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドには、標的の塩基配列に直接結合するポリペプチドだけでなく、標的の塩基配列に結合するポリヌクレオチドに結合することで間接的に標的の塩基配列に結合するポリペプチドも含まれる。
さらに、本明細書において、ＤＮＡ結合ポリペプチドについて使用される「結合する」とは、実際に標的の塩基配列に結合することだけでなく、標的の塩基配列に結合するように設計されたことも意味する。したがって、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドには、実際に標的の塩基配列に結合するＤＮＡ結合ポリペプチドだけでなく、標的の塩基配列に結合するように設計されたＤＮＡ結合ポリペプチドも含まれる。
被験ポリペプチドが標的の塩基配列又は標的の塩基配列に結合するポリヌクレオチドに結合することができるか否かは、ゲルシフトアッセイやＣｈＩＰ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）−ｓｅｑアッセイなどの公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。
被験ポリペプチドが標的の塩基配列に結合するように設計されたか否かは、例えば、標的の塩基配列に結合することが報告されているアミノ酸配列を被験ポリペプチドが含むかどうかで確認することができる。標的の塩基配列に結合することが報告されているアミノ酸配列として、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９、Ｖｏｌ．３２６、ｐ．１５０９−１５１２、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１１、Ｖｏｌ．２９、ｐ．１４３−１４８、日本公開公報２０１５／３３３６５号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６、Ｖｏｌ．９３、ｐ．１１５６−１１６０、及び、ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ.、２０１６、Ｖｏｌ．１４６９、ｐ．１４７−１５５に記載のアミノ酸配列が挙げられる。また、被験ポリペプチドが標的の塩基配列に結合するように設計されたか否かは、ゲルシフトアッセイやＣｈＩＰ−ｓｅｑアッセイなどの公知の結合活性測定方法を用いて被験ポリペプチドが標的の塩基配列に実際に結合するかどうかを調べることで確認してもよい。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドは、標的遺伝子の転写調節領域に結合するＤＮＡ結合ポリペプチドである。
転写調節領域としては、標的遺伝子の発現調節に関与する領域である限り特に限定されないが、例えば、プロモーター領域及びエンハンサー領域が挙げられる。
標的遺伝子は特に限定されないが、例えば、ヒトＴＥＲＴ、及びヒトｍｉＲ−３４６が挙げられる。
１つの実施形態において、標的遺伝子がヒトＴＥＲＴである場合、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドは、以下の特徴を有するＤＮＡ結合ポリペプチドである：
配列番号４９に示される塩基配列に結合する、ＤＮＡ結合ポリペプチド。
１つの実施形態において、標的遺伝子がヒトｍｉＲ−３４６である場合、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドは、以下の特徴を有するＤＮＡ結合ポリペプチドである：
配列番号５２に示される塩基配列の相補鎖配列に結合する、ＤＮＡ結合ポリペプチド。
標的の塩基配列に結合するように設計されたＤＮＡ結合ポリペプチドとしては、例えば、ＴＡＬＥ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９、Ｖｏｌ．３２６、ｐ．１５０９−１５１２）、ＺＦＰ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６、Ｖｏｌ．９３、ｐ．１１５６−１１６０）又はＰＰＲ蛋白質（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.、２０１６、Ｖｏｌ．１４６９、ｐ．１４７−１５５）を使用することができる。ＴＡＬＥ、ＺＦＰ及びＰＰＲ蛋白質を作製する技術は公知であるため、当業者であれば、当該技術に基づいて、目的の塩基配列に結合するように設計されたポリペプチドを作製することができる（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１１、Ｖｏｌ．２９、ｐ．１４３−１４８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９７、Ｖｏｌ．９４、ｐ．５５２５−５５３０、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.、２０１６、Ｖｏｌ．１４６９、ｐ．１４７−１５５）。また、塩基配列に対する高い結合活性を有するＴＡＬＥを作製する方法を使用することができる（日本公開公報２０１５／３３３６５号。Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｌａｂ）Ｖｅｒ．１．０ ［２０１６年１１月１５日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｍｓ／ｆｉｌｅｒ＿ｐｕｂｌｉｃ／ｂ０／５２／ｂ０５２７９００−３２０４−４７１ａ−９９２ｄ−１８９６７９ｅ２ｅｄｅ０／ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｇａｔｅ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｐｄｆ＞）。
標的の塩基配列に結合するポリヌクレオチドに結合することで間接的に標的の塩基配列に結合するＤＮＡ結合ポリペプチドとしては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３、Ｖｏｌ．３３９、ｐ．８１９−８２３）を使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を作製する技術は公知であるため、当業者であれば、当該技術に基づいて、標的の塩基配列に結合するように設計されたポリヌクレオチド、及び、当該ポリヌクレオチドに結合するポリペプチドを作製することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３、Ｖｏｌ．３３９、ｐ．８１９−８２３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３、Ｖｏｌ．３３９、ｐ．８２３−８２６）。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドは、標的遺伝子がヒトＴＥＲＴである場合、以下の特徴を有するＤＮＡ結合ポリペプチドである：
配列番号４９に示される塩基配列に結合するＴＡＬＥである、ＤＮＡ結合ポリペプチド。
１つの実施形態において、標的遺伝子がヒトｍｉＲ−３４６である場合、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドは、以下の特徴を有するＤＮＡ結合ポリペプチドである：
配列番号５２に示される塩基配列の相補鎖配列に結合するＴＡＬＥである、ＤＮＡ結合ポリペプチド。
本明細書で使用される「ＴＡＬＥ」とは、３４アミノ酸からなる構造単位（モジュール）を１０〜３０個の繰り返し数で連結させて、目的とするゲノム上の標的塩基配列に結合するように設計されたＤＮＡ結合リピート部分及びチミン結合部分を含むアミノ末端領域を含むポリペプチドを意味する（ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、 Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｎｔｈ、２０１４、Ｎｏ．１８０、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１１、Ｖｏｌ．２９、ｐ．１４３−１４８）。標的塩基配列に結合するように設計されたＤＮＡ結合リピート部分及びチミン結合部分を含むアミノ末端領域は、例えば、公知のアミノ酸配列を使用することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９、Ｖｏｌ．３２６、ｐ．１５０９−１５１２、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１１、Ｖｏｌ．２９、ｐ．１４３−１４８、日本公開公報２０１５／３３３６５号）。
また、融合ポリペプチドが標的塩基配列に結合できる限り、ＤＮＡ結合リピート部分及びチミン結合部分以外の部分を短く改変したＴＡＬＥ（短縮型ＴＡＬＥとも称する）も本発明の融合ポリペプチドに使用することができる。当業者であれば、公知の技術に基づいて、短縮型ＴＡＬＥを作製することができる（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．、２０１３、Ｖｏｌ．３、ｐ．３３７９）。
１つの実施形態において、標的遺伝子がヒトＴＥＲＴである場合、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸番号７〜７８４に示されるアミノ酸配列を含むＴＡＬＥである。ここで、配列番号２のアミノ酸番号７〜７８４に示されるアミノ酸配列は、配列番号４９に示される塩基配列に結合するように設計されたＴＡＬＥのＤＮＡ結合リピート部分及びチミン結合部分からなるポリペプチドを示す。
１つの実施形態において、標的遺伝子がヒトｍｉＲ−３４６である場合、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸番号７〜７８４に示されるアミノ酸配列を含むＴＡＬＥである。ここで、配列番号８のアミノ酸番号７〜７８４に示されるアミノ酸配列は、配列番号５２に示される塩基配列の相補鎖に結合するように設計されたＴＡＬＥのＤＮＡ結合リピート部分及びチミン結合部分からなるポリペプチドを示す。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドは、標的遺伝子がヒトＴＥＲＴである場合、以下の特徴を有するＤＮＡ結合ポリペプチドである：
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド。
１つの実施形態において、標的遺伝子がヒトｍｉＲ−３４６である場合、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドは、以下の特徴を有するＤＮＡ結合ポリペプチドである：
配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド。
本発明の融合ポリペプチドに含まれる細胞膜透過性ペプチドとしては、細胞膜を通過できる限り、特にアミノ酸配列は限定されない。被験ペプチドが細胞膜を通過できるか否かは、公知の細胞膜通過評価系を用いて確認することができる（国際公開第２００８／１０８５０５号）。
本発明の融合ポリペプチドに含まれる細胞膜透過性ペプチドは、公知の細胞膜透過性ペプチドを使用することができる（国際公開第２００８／１０８５０５号。Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１５、Ｖｏｌ．１５４、ｐ．７８−８６、Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｏｘｆｏｒｄ）、２０１２、ｂａｓ０１５）。例えば、本発明の融合ポリペプチドに含まれる細胞膜透過性ペプチドとして、アミノ酸配列ＲＩ、ＦＩ及びＲＩＧＣを含み、アミノ酸残基数が２５以下であるポリペプチドを使用することができる。１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドに含まれる細胞膜透過性ペプチドとしては、配列番号５３に示されるアミノ酸配列（ＲＩＬＱＱＬＬＦＩＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩ）からなるペプチド、配列番号５４に示されるアミノ酸配列（ＲＩＬＱＱＬＬＦＩＨＦＲＩＧＣＲＨ）からなるペプチド、配列番号５５に示されるアミノ酸配列（ＲＩＬＱＱＬＬＦＩＨＦＲＩＧＣ）からなるペプチド、配列番号５６に示されるアミノ酸配列（ＲＩＦＩＨＦＲＩＧＣ）からなるペプチド、又は、配列番号５７に示されるアミノ酸配列（ＲＩＦＩＲＩＧＣ）からなるペプチドが挙げられる。好ましくは、配列番号５６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
本発明の融合ポリペプチドに含まれる細胞膜透過性ペプチドとして、配列番号６０に示されるアミノ酸配列（ＲＩＦＩＨＦＲＱＧＱ）を使用することができる。
本発明の融合ポリペプチドが標的遺伝子の転写を活性化できる限り、細胞膜透過性ペプチド、ＤＮＡ結合ペプチド及び転写活性化因子の位置は限定されない。好ましくは、細胞膜透過性ペプチドは本発明の融合ポリペプチドのＮ末端側又はＣ末端側に位置する。より好ましくは、細胞膜透過性ペプチドは本発明の融合ポリペプチドのＮ末端側に位置する。１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、Ｎ末端側から、細胞膜透過性ペプチド、ＤＮＡ結合ペプチド及び転写活性化因子の順に構成される。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、標的遺伝子の転写調節領域に結合するＤＮＡ結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、ＴＥＲＴ又はｍｉＲ−３４６の転写調節領域に結合するＤＮＡ結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、標的遺伝子のプロモーター領域又はエンハンサー領域に結合するＤＮＡ結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、ＴＥＲＴ又はｍｉＲ−３４６のプロモーター領域又はエンハンサー領域に結合するＤＮＡ結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号４９に示される塩基配列に結合するＤＮＡ結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号５２に示される塩基配列の相補鎖配列に結合するＤＮＡ結合ポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号４９に示される塩基配列に結合するＴＡＬＥ、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号５２に示される塩基配列の相補鎖配列に結合するＴＡＬＥ、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号２のアミノ酸番号７〜７８４からなるアミノ酸配列を含むＴＡＬＥ、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号８のアミノ酸番号７〜７８４からなるアミノ酸配列を含むＴＡＬＥ、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号４９に示される塩基配列に結合するＤＮＡ結合ポリペプチド、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号５２に示される塩基配列の相補鎖配列に結合するＤＮＡ結合ポリペプチド、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号４９に示される塩基配列に結合するＴＡＬＥ、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号５２に示される塩基配列の相補鎖配列に結合するＴＡＬＥ、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号２のアミノ酸番号７〜７８４からなるアミノ酸配列を含むＴＡＬＥ、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号８のアミノ酸番号７〜７８４からなるアミノ酸配列を含むＴＡＬＥ、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５３、５４、５５、５６、５７又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号４９に示される塩基配列に結合するＴＡＬＥ、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５３、５４、５５、５６、５７又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号５２に示される塩基配列の相補鎖配列に結合するＴＡＬＥ、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５３、５４、５５、５６、５７又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号２のアミノ酸番号７〜７８４からなるアミノ酸配列を含むＴＡＬＥ、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５３、５４、５５、５６、５７又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号８のアミノ酸番号７〜７８４からなるアミノ酸配列を含むＴＡＬＥ、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは配列番号５３、５４、５５、５６、５７又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５３、５４、５５、５６、５７又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５３、５４、５５、５６、５７又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド及びＶＰＲを含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５３、５４、５５、５６、５７又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド及びＶＰ６４を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５６又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号４９に示される塩基配列に結合するＴＡＬＥ、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５６又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号５２に示される塩基配列の相補鎖配列に結合するＴＡＬＥ、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５６又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号２のアミノ酸番号７〜７８４からなるアミノ酸配列を含むＴＡＬＥ、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５６又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号８のアミノ酸番号７〜７８４からなるアミノ酸配列を含むＴＡＬＥ、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５６又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５６又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド、並びに、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００及びＧＣＮ５からなる群から選択される転写活性化因子を含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５６又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド及びＶＰＲを含む、融合ポリペプチドである。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号５６又は６０に示されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過性ペプチド、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド及びＶＰ６４を含む、融合ポリペプチドである。
本発明の融合ポリペプチドが標的遺伝子の転写を活性化できる限り、細胞膜透過性ペプチド、ＤＮＡ結合ペプチド及び転写活性化因子のそれぞれの間にペプチドリンカー等のペプチドを含んでもよい。
また、本発明の融合ポリペプチドが標的遺伝子の転写を活性化できる限り、本発明の融合ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端にＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）タグ又はポリヒスチジンタグなどのペプチドタグを含んでもよい。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
また、本発明の融合ポリペプチドには、配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号６２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつＴＥＲＴ遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号６２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
（ｉ）配列番号６２に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号６２に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号６２に示されるアミノ酸配列中に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号６２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
本発明において、「ＴＥＲＴ遺伝子の転写を活性化する作用」とは、細胞においてＴＥＲＴ遺伝子の発現量を増加させる作用を意味する。「ＴＥＲＴ遺伝子の転写を活性化する作用を有する」とは、被験融合ポリペプチドを添加していない培地で培養された細胞のＴＥＲＴ遺伝子の発現量と比較して、被験融合ポリペプチドが１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、好ましくは、５０％以上ＴＥＲＴ遺伝子の発現量を増加させる作用を有することを意味する。ＴＥＲＴ遺伝子の転写を活性化する作用は、例えば本発明の融合ペプチドを添加した培地で培養した細胞におけるＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡ量を、公知の方法、例えばリアルタイムＰＣＲを用いて測定することにより、確認することができる。具体的な方法としては、例えば、後記実施例２に記載されるような方法を用いることができる。
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号６２に示されるアミノ酸配列と約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＴＥＲＴ遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
本明細書における「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.、１９７０、Ｖｏｌ．４８、ｐ．４４３−４５３）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝１０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５
Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２
上記の変異を有するポリペプチドを調製するために、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ）等を用いて行うことができる。また、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２０１２））等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
１つの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
また、本発明の融合ポリペプチドには、配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号２２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつｍｉＲ−３４６遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号２２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
（ｉ）配列番号２２に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２２に示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号２２に示されるアミノ酸配列中に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号２２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
本発明において、「ｍｉＲ−３４６遺伝子の転写を活性化する作用」とは、細胞においてｍｉＲ−３４６遺伝子の発現量を増加させる作用を意味する。「ｍｉＲ−３４６遺伝子の転写を活性化する作用を有する」とは、被験融合ポリペプチドを添加していない培地で培養された細胞のｍｉＲ−３４６の発現量と比較して、被験融合ポリペプチドが１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、好ましくは、５０％以上ｍｉＲ−３４６遺伝子の発現量を増加させる作用を有することを意味する。ｍｉＲ−３４６遺伝子の転写を活性化する作用は、例えば本発明の融合ペプチドを添加した培地で培養した細胞におけるｍｉＲ−３４６のＲＮＡ量を、公知の方法、例えばリアルタイムＰＣＲを用いて測定することにより、確認することができる。具体的な方法としては、例えば、後記実施例４に記載されるような方法を用いることができる。
また、本発明の融合ペプチドには、配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつｍｉＲ−３４６遺伝子の転写を活性化する作用を有するポリペプチドが含まれる。
同一性の検索方法及び変異の導入法は上記配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの場合と同様である。
本発明の融合ポリペプチドは、本明細書に開示される、細胞膜透過性ペプチド、ＤＮＡ結合ペプチド及び転写調節因子の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の融合ポリペプチドは、特に限定されるものではないが、例えば、後述の「５．本発明の融合ポリペプチドを生産する方法」に記載の方法に従い製造することができる。
２．本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。
３．本発明の発現ベクター
本発明の発現ベクターには、本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いる発現ベクターとしては、ＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中で本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、コムギ胚芽抽出液中でこれらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、又は、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／若しくは原核細胞（例えば、大腸菌）の各種の宿主細胞中で本発明の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、センダイウイルス）等が挙げられ、好ましくは、ｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳ（セルフリーサイエンス）、ｐＥＴ２０ｂ（＋）（ノバジェン）、ｐＣｏｌｄ ｖｅｃｔｏｒ−Ｉ（タカラバイオ ３３６１）を使用することができる。
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。ＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中で発現させるためのプロモーターとしては、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどが挙げられる。動物細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）、Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０（ＳＶ４０）などのウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどが挙げられる。また、酵母で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。
ＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液並びにコムギ胚芽抽出液を用いる場合、又は、宿主細胞として動物細胞、昆虫細胞、若しくは酵母を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列、本発明の融合ポリペプチドをコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、あるいは複製可能単位などを含んでいてもよい。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
４．本発明の形質転換された宿主細胞
本発明の形質転換された宿主細胞には、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
形質転換する宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、蛋白質を発現することができるものである限り、特に限定されるものではない。形質転換する宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、細菌（エシェリキア属菌など）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）など）が挙げられ、好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ０細胞等の動物細胞及びエシェリキア属菌を使用することができる。
宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、電気穿孔法等を用いることができる。
５．本発明の融合ポリペプチドを生産する方法
本発明の融合ポリペプチドを生産する方法には、本発明の発現ベクターを用いて、ＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中で合成したｍＲＮＡをコムギ胚芽抽出液と反応させて、融合ポリペプチドを発現させる工程、又は、本発明の宿主細胞を培養し、融合ポリペプチドを発現させる工程を包含する、融合ポリペプチドを生産する方法が含まれる。
本発明の融合ポリペプチドを生産する方法は、本発明の発現ベクターを用いて、ＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中でｍＲＮＡを合成し、合成したｍＲＮＡをコムギ胚芽抽出液と反応させて、融合ポリペプチドを発現させる工程、又は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、融合ポリペプチドを発現させる工程を包含している限り、特に限定されるものではない。該方法で使用されるＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液並びにコムギ胚芽抽出液としては、例えば、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（セルフリーサイエンス）に含まれる試薬が挙げられる。また、該方法で使用される好ましい宿主細胞としては、前述の好ましい本発明の形質転換された宿主細胞が挙げられる。
形質転換された宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。宿主細胞を培養することにより、本発明の融合ポリペプチドを生産することができる。
本発明の融合ポリペプチドを生産する方法は、本発明の発現ベクターを用いて、ＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中でｍＲＮＡを合成する工程、並びに合成したｍＲＮＡをコムギ胚芽抽出液と反応させて、融合ポリペプチドを発現させる工程に加えて、さらには、融合ポリペプチドを回収、好ましくは単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、ＧＳＴタグ又はポリヒスチジンタグと融合した本発明の融合ポリペプチドをグルタチオンセファロースビーズに結合させた後、過剰な還元型グルタチオンで溶出することによるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本発明の融合ポリペプチドを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、融合ポリペプチドを発現させる工程に加えて、さらには、該形質転換された宿主細胞から融合ポリペプチドを回収、好ましくは単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、特定のタグや蛋白質分子内の内在構造を認識する抗体の特異的親和性を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。好ましくは、培養上清中に蓄積された融合ポリペプチドは、各種クロマトグラフィーより精製することができる。
本発明の融合ポリペプチドには、本発明の融合ポリペプチドを生産する方法で生産された融合ポリペプチドも含まれる。
６．本発明の融合ポリペプチドを用いた標的遺伝子の転写を調節する方法
本発明の融合ポリペプチドを用いた標的遺伝子の転写を調節する方法には、本発明の融合ポリペプチドを含む培地で細胞を培養する工程を包含する、該細胞における標的遺伝子の転写を調節させる方法が含まれる。
本発明の方法によって転写が調節される標的遺伝子は、特に限定されないが、例えば細胞増殖に関する遺伝子（ＴＥＲＴ及びｍｉＲ−３４６。好ましくはヒトＴＥＲＴ及びヒトｍｉＲ−３４６）が挙げられる。
本発明の方法で使用される融合ポリペプチドは、「１．本発明の融合ポリペプチド」に記載された融合ポリペプチドが挙げられる。
本発明の方法に使用される細胞は、特に限定されないが、例えば、体細胞（好ましくはヒト体細胞）が挙げられる。本明細書において、「体細胞」とは、生殖細胞以外の生体内に存在する細胞を意味する。本発明の方法に使用される体細胞としては、特に限定されないが、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（好ましくはヒトＭＳＣ）などの幹細胞（好ましくはヒト幹細胞）、線維芽細胞（好ましくはヒト線維芽細胞）が挙げられる。
本発明の方法で使用される培地は、細胞培養の分野において通常使用される培地であれば特に限定されない。また、細胞の種類に応じて、血清を培地に添加することができる。
本発明の方法で使用される培養条件は、細胞の種類に応じて当業者が適宜選択することができる。
培地に添加される本発明の融合ポリペプチドの濃度は、細胞の種類や細胞数、融合ポリペプチドの転写調節活性等により異なるが、例えば、０．０１ｎＭ〜１０μＭ程度、好ましくは０．５ｎＭ〜５μＭ程度を用いることができる。
本発明の融合ポリペプチドを添加するタイミング及び回数は特に限定されない。本発明の融合ポリペプチドを培地に添加するタイミングは、例えば、培養開始時に添加してもよく、又は、培養開始後に添加してもよい。培養開始後に本発明の融合ポリペプチドを培地に添加する場合、培養開始から例えば1時間後、５時間後、１０時間後、１５時間後、２４時間後（１日後）、３６時間後、４８時間後（２日後）、３日後、４日後、５日後に添加してもよい。
本発明の融合ポリペプチドが標的遺伝子の転写を調節することができるか否かは、公知の遺伝子発現量測定方法を用いて確認することができる。遺伝子発現量を測定する方法としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ等の方法が挙げられる。リアルタイムＰＣＲを用いる場合、例示的な方法において、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （サーモフィシャーサイエンティフィック）を使用することによって、被験融合ポリペプチドが標的遺伝子の転写を調節することができるか否かを確認することができる。遺伝子発現量の具体的な評価方法としては、例えば、後記実施例２から４に記載されるような方法を用いることができる。
７．本発明の融合ポリペプチドを用いた細胞を増殖させる方法
本発明の融合ポリペプチドを用いた細胞を増殖させる方法には、細胞増殖に関与する遺伝子の転写を促進できる本発明の融合ポリペプチドを含む培地で細胞を培養する工程を包含する、細胞を増殖させる方法が含まれる。
細胞増殖に関与する遺伝子としては、例えば、ＴＥＲＴ、ｍｉＲ−３４６などの公知の遺伝子が挙げられる。
本発明の方法で使用される融合ポリペプチドは、「１．本発明の融合ポリペプチド」に記載された融合ポリペプチドが挙げられる。
本発明の方法に使用される細胞は、特に限定されないが、例えば、体細胞（好ましくはヒト体細胞）が挙げられる。本発明の方法に使用される体細胞としては、特に限定されないが、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（好ましくはヒトＭＳＣ）などの幹細胞（好ましくはヒト幹細胞）、線維芽細胞（好ましくはヒト線維芽細胞）が挙げられる。
本発明の方法で使用される培地、培養条件、本発明の融合ポリペプチドの濃度、並びに、添加タイミング及び回数は、上記の「６．本発明の融合ポリペプチドを用いた標的遺伝子の転写を調節する方法」で説明したとおりである。
本発明の融合ポリペプチドが細胞を増殖させることができるか否かは、公知の細胞増殖測定方法を用いて確認することができる。細胞増殖を測定する方法としては、例えば、細胞内ＡＴＰ定量試薬ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ）を用いた細胞増殖アッセイや細胞数カウントが挙げられる。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｒｅａｇｅｎｔを使用することや細胞数をセルカウンターＳｃｅｐｔｅｒ（メルクミリポア）で測定することによって、被験融合ポリペプチドが細胞を増殖させることができるか否かを確認することができる。細胞増殖の具体的な評価方法としては、例えば、後記実施例５、６及び８に記載されるような方法を用いることができる。
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
［実施例］
市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。また、便宜上、濃度ｍｏｌ／ＬをＭとして表す。例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液は１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液であることを意味する。
ＣＰＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒの作製
ヒトＴＥＲＴ及びヒトｍｉＲ−３４６の各遺伝子のプロモーター又はエンハンサーに特異的に結合するように設計された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を作製した。各ＴＡＬＥ、配列番号２３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされる細胞膜透過性ペプチド（ＮＴＰとも称する）（国際公開第２００８／１０８５０５号）及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチド（以下、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒとも称する）、並びに、ＴＡＬＥ、配列番号６７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされる細胞膜透過性ペプチド（ＩＣＱ２とも称する）及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチド（以下、ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒとも称する）を作製した（ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ及びＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒを合わせて、ＣＰＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒとも称する）。
（１）発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶの作製
発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳ(セルフリーサイエンス)のマルチクローニングサイトにＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号２４）、ＮＴＰ（アミノ酸配列ＲＩＦＩＨＦＲＩＧＣ（配列番号５６）からなる）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号２３）、及び、ＴＥＶプロテアーゼの標的ペプチド（以下ＴＥＶと表記する）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号２５）を５’側から順に挿入した。
配列番号２４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＶサイトを、３’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイトをそれぞれ付加したポリヌクレオチドを合成した。ＥｃｏＲＶ（タカラバイオ）及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ）を用いて発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳに上記ポリヌクレオチドを挿入することにより、発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴを作製した。次に、５’末端側から順にＢａｍＨＩサイト配列、ＮＴＰをコードする塩基配列、ＴＥＶをコードする塩基配列、制限酵素ＸｈｏＩサイト配列、制限酵素ＳｇｆＩサイト配列、制限酵素ＰｍｅＩサイト配列、制限酵素ＮｏｔＩサイト配列、及び制限酵素ＳａｌＩサイト配列を含むポリヌクレオチド（但し、ＸｈｏＩサイトとＳｇｆＩサイトの間にはコードするアミノ酸配列のフレームを合わせるためにシトシンを挿入した）を作製した。ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ（タカラバイオ）を用いて、前記ポリヌクレオチドを発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴに挿入した。その後、配列番号２６及び２７に示される塩基配列からなるプライマーを用いてインバースＰＣＲ（環状ポリヌクレオチドの一領域から外に向かってプライマーを設計し、環状化したポリヌクレオチド全体を増幅するＰＣＲ法）を行い、発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶを作製した。
（２）プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ΔＴＡＬＥ−ＶＰ６４Ｖの作製
配列番号２８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＴＡＬＥの一部をコードする塩基配列及びＶＰ６４（配列番号２９）をコードする塩基配列を含む。ΔＴＡＬＥ−ＶＰ６４と称する。）を、（１）で作製した発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶの、ＴＥＶをコードする塩基配列の直後にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ（タカラバイオ）により組み込むことで、プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ΔＴＡＬＥ−ＶＰ６４Ｖを得た。ＶＰ６４のＣ末端にバリンが付加されているため末尾にＶを付けた名称とした。
（３）ヒトＴＥＲＴ遺伝子を標的とするＴＡＬＥの作製
テロメラーゼのサブユニットであるヒトＴＥＲＴ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＨ００７６９９．２）の周辺配列を公知のデータベースであるＥｎｓｅｍｂｌ ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒで検索し、エンハンサーとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から下流約４万ベースペア（以下ｂｐと略記する）の遺伝子領域から、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＨ００７６９９．２の塩基番号４９４４４〜４９４６１までの塩基配列（配列番号４９に示される塩基配列）をＴＡＬＥの標的塩基配列として選択した。公知の方法（Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｌａｂ）Ｖｅｒ．１．０ ［２０１６年１１月１５日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｍｓ／ｆｉｌｅｒ＿ｐｕｂｌｉｃ／ｂ０／５２／ｂ０５２７９００−３２０４−４７１ａ−９９２ｄ−１８９６７９ｅ２ｅｄｅ０／ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｇａｔｅ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｐｄｆ＞）により、配列番号４９に示される塩基配列に特異的に結合するように設計されたＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号１の塩基番号４２９〜２０６４までの塩基配列を含むポリヌクレオチド）を作製した。そして、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、（２）で作製したプラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ΔＴＡＬＥ−ＶＰ６４Ｖに含まれる配列番号２８の塩基番号４３５〜８８９までの塩基配列からなるポリヌクレオチドを、上述の配列番号１の塩基番号４２９〜２０６４までの塩基配列からなるポリヌクレオチドに置換した。これにより、配列番号２のアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド（ＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ−１とも称する）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１に示される塩基配列からなる）を含むプラスミドを取得した。なお、配列番号２のアミノ酸番号７〜７８４に示されるアミノ酸配列は、配列番号４９に示される塩基配列に結合するように設計された、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合リピート部分及びチミン結合部分を含むポリペプチド部分である。
同様に、ヒトＴＥＲＴ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＨ００７６９９．２）の周辺配列をＥｎｓｅｍｂｌ ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒで検索した。その結果、プロモーターとして作用することが予想される遺伝子領域からＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＨ００７６９９．２の塩基番号１１０２９〜１１０４６までの塩基配列（配列番号５０に示される塩基配列）を、エンハンサーとして作用することが予想される遺伝子領域からＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＨ００７６９９．２の塩基番号６５０１〜６５１８までの塩基配列（配列番号５１に示される塩基配列）をＴＡＬＥの標的塩基配列としてそれぞれ選択した。そして、配列番号５０に示される塩基配列及び配列番号５１に示される塩基配列にそれぞれ特異的に結合するように設計されたＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（それぞれ、配列番号３の塩基番号４２９〜２０６４までの塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号５の塩基番号４２９〜２０６４までの塩基配列を含むポリヌクレオチド）を作製した。次に、（２）で作製したプラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ΔＴＡＬＥ−ＶＰ６４Ｖに含まれる配列番号２８の塩基番号４３５〜８８９までの塩基配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ、上述の配列番号３、及び配列番号５の塩基番号４２９〜２０６４までの塩基配列からなるポリヌクレオチドに置換した。これにより、配列番号４及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド（それぞれＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ−２及びＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ−３とも称する）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（それぞれ配列番号３及び５に示される塩基配列からなる）を含むプラスミドを取得した。
（４）ヒトｍｉＲ−３４６遺伝子を標的とするＴＡＬＥの作製
ヒトｍｉＲ−３４６遺伝子はヒトＴＥＲＴ遺伝子の発現を促進することが知られている（Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．、２０１５、Ｖｏｌ．５、ｐ．１５７９３）。ヒトマイクロＲＮＡのｍｉＲ−３４６遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＲ＿０２９９０７．１）の周辺配列をＥｎｓｅｍｂｌ ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒで検索し、プロモーターとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から上流１０００ｂｐの遺伝子領域から、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＭＹＨ０２０２３４７５．１の塩基番号１３５２９〜１３５４６までの塩基配列（配列番号５２に示される塩基配列）からなる遺伝子領域をＴＡＬＥの標的塩基配列として選択した。上記（３）と同様の方法により、配列番号５２に示される塩基配列の相補鎖配列に結合するように設計されたＤＮＡ結合ポリペプチド（配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる（ＴＡＬＥ＿ｍｉＲ−３４６−１とも称する））をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号７に示される塩基配列からなる）を含むプラスミドを取得した。
（３）及び（４）で作製した各種ＴＡＬＥをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むプラスミドを発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４Ｖと総称する。
（５）ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒをコードする発現プラスミドの作製
以下の方法で、（３）及び（４）で作製した発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４Ｖを用いて、発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４を作製した。さらに、発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４のＶＰ６４をコードする塩基配列の代わりにＶＰＲ、ｐ３００のコア領域（以下ｐ３００ＣＤと表記する）及びＧＣＮ５のコア領域（以下ＧＣＮ５ＣＤと表記する）をそれぞれコードする塩基配列に置き換えた。
（３）及び（４）で作製した発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４Ｖを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(タカラバイオ)を用いて、配列番号３０及び３１に示される塩基配列からなるプライマーを使用したＰＣＲを行った。これにより、ＴＡＬＥ及びＶＰ６４をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの５’末端側にＳｇｆＩサイト配列が、３’末端側にＮｏｔＩサイト配列がそれぞれ付加したポリヌクレオチドを作製した。当該ポリヌクレオチドをＴＡＬＥ-ＶＰ６４と称する。このＴＡＬＥ-ＶＰ６４をＳｇｆＩ（タカラバイオ）及びＮｏｔＩ（タカラバイオ）で切断し、（１）で作製した発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶの制限酵素サイトＳｇｆＩ及びＮｏｔＩの間に挿入し、発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４を作製した。
ＳＰ−ｄＣａｓ９−ＶＰＲ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(タカラバイオ)を用いて、配列番号３２及び３３に示される塩基配列からなるプライマーを使用したＰＣＲを行った。これにより、ＶＰＲ（配列番号３４）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端側にＣＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣ（配列番号５８）を、３’末端側にＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣ（配列番号５９）をそれぞれ付加した。当該ポリヌクレオチドをＶＰＲ−ＰＣＲと称する。
次に、ｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＶＰ６４を鋳型として、配列番号３５及び３６に示される塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲを行った。これにより、ＶＰ６４をコードする塩基配列を除去し、かつ、３’側にＣＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣ（配列番号５８）を、５‘側にＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣ（配列番号５９）をそれぞれ付加したポリヌクレオチドを作製した。当該ポリヌクレオチドをｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＰＣＲと称する。
ｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＰＣＲ及びＶＰＲ−ＰＣＲを１対１０のモル比でＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔを用いて連結させた。これにより、転写活性化因子としてＶＰＲをコードする発現プラスミドを作製した。当該発現プラスミドをｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＶＰＲと称する。このうち、ＤＮＡ結合ポリペプチドがＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ−１であるｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＶＰＲを、ｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲと称する。当該発現プラスミドをアガロース電気泳動法及びシークエンス解析を行うことにより、所望のコンストラクトがクローニングされていることを確認した。
同様に、ｐ３００のコア領域（ｐ３００ＣＤ）に関しては、配列番号３７及び３８に示される塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより、１２４６ ｐＣＭＶｂ ｐ３００ＨＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１０７１８）を鋳型としてｐ３００ＣＤ（配列番号３９）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端側にＣＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣ（配列番号５８）を、３’末端側にＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣ（配列番号５９）をそれぞれ付加した。当該ポリヌクレオチドをｐ３００ＣＤ−ＰＣＲと称する。
同様に、ＧＣＮ５ＣＤのコア領域（ＧＣＮ５ＣＤ）に関しては、配列番号４０及び４１に示される塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより、Ｆｌｅｘｉ ＯＲＦ ｃｌｏｎｅ ＦＸＣ０３７６２（かずさＤＮＡ研究所）を鋳型として、ＧＣＮ５ＣＤ（配列番号４２）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端側にＣＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣ（配列番号５８）を、３’末端側にＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣ（配列番号５９）をそれぞれ付加した。当該ポリヌクレオチドをＧＣＮ５ＣＤ−ＰＣＲと称する。
これらをＶＰＲの場合と同様に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔを用いてｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＰＣＲにｐ３００ＣＤ−ＰＣＲ及びＧＣＮ５ＣＤ−ＰＣＲをそれぞれ連結させた。これにより転写活性化因子としてｐ３００ＣＤをコードする発現プラスミド、及び転写活性化因子としてＧＣＮ５ＣＤをコードする発現プラスミドをそれぞれ作製した。当該発現プラスミドをそれぞれｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ｐ３００ＣＤ及びｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＧＣＮ５ＣＤと称する。作製した２種類の転写活性化因子を含む発現プラスミドをアガロース電気泳動法及びシークエンス解析を行うことにより、所望のコンストラクトがクローニングされていることを確認した。
（６）ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ＿ｓｃｒａｍｂｌｅ−ＶＰＲ、ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰをコードする発現プラスミドの作製
実施例６及び８の陰性対照として、ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰ及びＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ＿ｓｃｒａｍｂｌｅ−ＶＰＲをそれぞれコードする発現プラスミドを作製した。
次に、発現プラスミドｐＧＥＸ６ｐ−１（ＧＥヘルスケア）を制限酵素ＥｃｏＮＩ（ニューイングランドバイオラボ）で切断し、そこに配列番号６８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをリンカーとして挿入した。得られたベクターをＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩで切断し、ポリヌクレオチド断片を切り出した。切り出した断片をＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩで切断したｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳへＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを用いて挿入した。さらにそのベクターをＢａｍＨI及びＳａｌＩで切断し、ＮＴＰ及びＴＥＶ認識配列をコードする配列番号６９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを用いて挿入した。得られたベクターをＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断し、そこへ両末端にＸｈｏＩとＮｏｔＩサイトをそれぞれ付加した高感度緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号６５に示される塩基配列からなる）をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅにより挿入し、発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰを作製した。ｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰは、ＧＳＴ、ＮＴＰ及びＥＧＦＰを含む融合ポリペプチド（ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰとも称する）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。
（５）で作製したｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲを鋳型として配列番号７０及び７１に示される塩基配列からなるプライマーを用いてインバースＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片と、配列番号６３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号６４のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＴＡＬＥ＿ｓｃｒａｍｂｌｅとも称する）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド）を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔを用いて結合させた。これにより、ｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲに含まれるＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ−１をコードする配列番号１の塩基番号１〜２１３９までの塩基配列からなるポリヌクレオチドを配列番号６３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに置換した。この結果、ＴＡＬＥ＿ｓｃｒａｍｂｌｅをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＡＬＥ＿ｓｃｒａｍｂｌｅ−ＶＰＲを得た。ここで、ＴＡＬＥ＿ｓｃｒａｍｂｌｅとは、例えばＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＴのように、両端のＴを除いた配列がＡ７個、Ｔ３個、Ｇ３個、Ｃ３個の組成になる塩基配列をランダムにスクランブルさせたものを標的遺伝子としたＴＡＬＥであり、ヒトＴＥＲＴを標的としたＴＡＬＥ部分の陰性対照として使用した。
（７）発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲの作製
（５）で作製したｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲを制限酵素ＡｓｉＳＩ（ニューイングランドバイオラボ）及び制限酵素ＳｗａＩ（タカラバイオ）で処理した。
次に配列番号６６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＩＣＱ２（アミノ酸配列ＲＩＦＩＨＦＲＱＧＱ（配列番号６０））をコードするポリヌクレオチドを含む）を合成し、それぞれＡｓｉＳＩ及びＳｗａＩで処理した。アガロース電気泳動を行い、約３４０塩基のポリヌクレオチド断片を切り出し、ＦａｓｔＧｅｎｅゲル／ＰＣＲ抽出キット（日本ジェネテクス、ＦＧ９１２０２）を用いて精製した。このポリヌクレオチド断片をＡｓｉＳＩ及びＳｗａＩで切断した発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＶＰＲにＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ、タカラバイオ ６０２３）でそれぞれ連結した。連結して得られたプラスミドを熱処理でコンピテントセル（Ｓｔｂｌ、ニューイングランドバイオラボ）に導入し、１００μｇ/ｍLアンピシリン（シグマ）入りＬＢ培地寒天プレート（１０ｇ／L Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ（ベクトンディッキンソン）、５ｇ／L Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ベクトンディッキンソン）、１０ｇ／L塩化ナトリウム（和光）及び１．５％アガロース（和光）含有水溶液）（以下、ＬＡプレートと称する）にて、３０℃で一晩培養した。得られたコロニーからプラスミドを精製し、発現プラスミドｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＴＥＶ−ＴＡＬＥ−ＶＰＲのＮＴＰをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号６７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに置換したｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲを得た。シークエンス解析を行うことで、上記コンストラクトが正しく作製されていることを確認した。ｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲは、ＩＣＱ２、ＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ−１及びＶＰＲを含む融合ポリペプチド（ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲとも称する）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。
（８）ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ、ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ及びＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰの作製
（５）〜（７）で作製した各種ＣＰＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ及びＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰをそれぞれコードする発現プラスミドを鋳型として、コムギ無細胞タンパク質合成キット（セルフリーサイエンス）によりＣＰＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ及びＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰをそれぞれ合成し、精製した。
ＷＥＰＲＯ７２４０Ｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（セルフリーサイエンス）を用いて、（５）〜（７）で作製した発現プラスミド１μｇを用いて反応液量０．２９ｍＬになるスケールで各蛋白質を合成した。合成後、反応液量に対して０．１％のＥｍｐｉｇｅｎ（シグマ）を添加した。さらに、リン酸緩衝生理食塩水で飽和したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥヘルスケア）を６０μＬ加えて４℃で２時間振盪した。遠心分離によりＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを回収し、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに懸濁した。再度、遠心分離する作業を２回繰り返した。回収したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに懸濁した。再度、遠心分離によりＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを分離した。
次に、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合したＣＰＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ及びＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰを抽出するために、以下の操作を行った。すなわち、３０ｍＭの還元型グルタチオン（和光）を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）６０μＬを上述のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに添加した。室温１分間振盪した後、遠心分離により上清を回収した。同じ作業を２回繰り返した。上清を回収することにより、ＣＰＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ及びＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰを取得した。回収した上清にグリセリン（ナカライ）を終濃度２０％、及びプロテアーゼ阻害剤（Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を終濃度１％となるようにそれぞれ添加して氷上で保存した。この上清中に含まれるＣＰＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ蛋白質濃度を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法とクーマジーブリリアントブルー染色法を用いて、並行して泳動したＢＳＡ（シグマ ｆｒａｃｔｉｏｎＶ）との比較から算定した。なお、これら精製した蛋白質を溶出した３０ｍＭの還元型グルタチオン、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）に２０％グリセリン、１％プロテアーゼ阻害剤を含む水溶液を溶出緩衝液と称する。
本実施例で得られた各種ＣＰＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒの名称、塩基配列の配列番号及びそれによりコードされるアミノ酸配列の配列番号を示す。
ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ添加時の細胞内ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現量の測定（１）
ヒトＴＥＲＴを標的とするＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒによる培養細胞のヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現量を評価した。
ヒト臍帯マトリクス由来間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ Ｃ−１２９７１。以下ＵＣ−ＭＳＣと称する）を、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）及び２ｍＭ Ｌ−ＧｌｕｔａＭａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）含有ＤＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で懸濁し、９６ウェル透明培養プレート（岩城硝子）へ０．４×１０４細胞／１００μＬ／ウェルとなるように播種した。ＣＯ２濃度５％、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター内で１２時間静置した。
実施例１で作製したＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰ６４、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ｐ３００ＣＤ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＧＣＮ５ＣＤ）を、実験時のウェル内終濃度が０．３ｎＭ、１．０ｎＭ又は３．０ｎＭになるようにそれぞれ溶出緩衝液で希釈し、１μＬをウェルに添加した。コントロールとして、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒの代わりに、上記溶出緩衝液を添加した。３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で２４時間静置した。氷冷したリン酸緩衝生理食塩水１００μＬで１回洗浄した後、当該培養プレートを液体窒素で処理して細胞を凍結した。
上述の培養プレートを氷上に静置して融解すると同時に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴＴＭ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に付属の溶解液（Ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２９．７μＬ及びＤＮａｓｅＩ ０．３μＬの混合溶液）３０μＬを各ウェルに添加して細胞と混合した。室温で５分静置した後、上記キットに付属のＳｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェル３μＬ加えて室温で５分静置した。これにより細胞から抽出されたＲＮＡを含む細胞溶解液が得られた。
上記細胞溶解液を鋳型として、リアルタイムＰＣＲはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（サーモフィシャーサイエンティフィック）を使用し、７９００ＨＴＦａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）でリアルタイムＰＣＲを行い、ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量を測定した。内在性コントロール遺伝子としてヒトアクチンベータ（ＡＣＴＢ）遺伝子ｍＲＮＡ量との比で測定値を示した。ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量をヒトＡＣＴＢ ｍＲＮＡ量で除した値をヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量とした。コントロールのヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を１としたときの、各群のヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を算出した。なお同一試料について各３ウェル重複して実施した。
ヒトＴＥＲＴのプライマーのセットとしては、ＴＥＲＴ ＦＡＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、Ｈｓ００９７２６４８_ｇｌ）を使用し、ヒトＡＣＴＢのプライマーのセットとしては、ＡＣＴＢ ＶＩＣ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、Ｈｓ９９９９９９０３_ｍｌ）を使用した。
図１（１）及び（２）に示す通り、コントロール群に比較して、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰ６４、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ｐ３００ＣＤ及びＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＧＣＮ５ＣＤはヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現量を増加（ヒトＴＥＲＴ遺伝子の発現を亢進）させることが明らかとなった。
この結果から、本発明の融合ポリペプチドは、細胞を培養する培地に添加するだけで、細胞導入試薬又は電気穿孔法を用いることなく、当該細胞における標的遺伝子の発現を亢進できることが示された。
ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ添加時の細胞内ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現量の測定（２）
実施例１で作製したヒトＴＥＲＴを標的としたＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ｐ３００ＣＤ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−２−ｐ３００ＣＤ及びＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−３−ｐ３００ＣＤ）を微量透析カラム（トミー）でＯＰＴＩＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に対して４℃で３時間透析した。精製後の濃度は、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ｐ３００ＣＤが４０ｎＭ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−２−ｐ３００ＣＤが５５ｎＭ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−３−ｐ３００ＣＤが５５ｎＭであった。ヒトＴ細胞（健常人より採血した末梢単核球から分離して取得）を９６ウェルプレートに各ウェル０．５×１０４細胞をＫＢＭ５５０（コージンバイオ）１００μＬに懸濁して播種した。
なお、ヒトＴ細胞は以下の通り分離した。被験者より採血し、採血後２時間以内に１５００回転で２０分室温遠心分離した中間層（単核球層）を採集した。リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、３７℃に温めておいたＫＢＭ５５０リンパ球培養用培地(コージンバイオ、１６０２５５００）１０ｍＬに懸濁した。抗ＣＤ３抗体（ベクトンディッキンソン、５５５３３６、Ｃｌｏｎｅ ＨＩＴ３ａ）でコーティングした１０ｃｍ径培養シャーレ（コーニング）へ２ｘ１０７細胞となるように播種した後、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で静置した。なお、コーティングは、リン酸緩衝生理食塩水で１０μｇ／ｍＬに希釈した抗ＣＤ３抗体溶液を培養シャーレの表面が覆われる様に添加して、３７℃で１時間インキュベートすることで、行った。使用直前に抗体希釈液を取り除き、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄した。培養シャーレ中でコンフルエントになった細胞をピペッティングで剥がした。１０００回転で室温５分遠心分離した後、上清を除去した。ＫＢＭ５５０リンパ球培養用培地で懸濁し、上述の抗ＣＤ３抗体溶液でコーティングした６ウェル培養プレート（コーニング）へ１．５ｘ１０６細胞／ウェルとなるように播種した。３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で２４時間静置した後、Ｔリンパ球が増殖してコロニーを形成している事を確認して分離取得した。
得られたヒトＴ細胞を１２時間培養した後に、上述の透析後の各ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒを終濃度が３．０ｎＭになるようにウェルに添加した（事前に複数濃度での検討を行った結果、各ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒの最も応答性が認められた濃度が３．０ｎＭだった）。コントロールとして、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒを添加しないウェルを作製した。３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で２４時間静置した。
２４時間後の細胞内のヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現量を以下の方法で測定した。上述の培養細胞の各ウェルから培養上清を除去し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で一度洗浄した。その後、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標） Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｃｅｌｌｓ-ｔｏ-ＣＴＴＭ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に付属の溶解液（Ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２４．５μＬ及びＤＮａｓｅＩ ０．５μＬの混合溶液）２５μＬを各ウェルに添加して細胞と混合した。室温で５分静置した後、上記キットに付属のＳｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェル２．５μＬ加えて室温で２分静置した。これにより細胞から抽出されたＲＮＡを含む細胞溶解液が得られた。
上記細胞溶解液を鋳型として、上記キットに付属の逆転写酵素を用い、添付のプロトコールに従ってＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。次いで、下記のプライマー及び上記キットに付属のＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ リアルタイムＰＣＲ解析システム（バイオラッド）でリアルタイムＰＣＲを行い、ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量を測定した。内在性コントロール遺伝子として、ヒトアクチンベータ（ＡＣＴＢ）ｍＲＮＡ量を測定した。ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量をヒトＡＣＴＢ ｍＲＮＡ量で除した値をヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量とした。コントロールのヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を１としたときの、各群のヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を算出した。なお同一試料について各３ウェル重複して実施した。
ＴＥＲＴ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ及びＴＥＲＴ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして、配列番号４３及び４４に示される塩基配列からなるプライマーをそれぞれ使用した。また、ＡＣＴＢ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ及びＡＣＴＢ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして、配列番号４５及び４６に示される塩基配列からなるプライマーをそれぞれ使用した。
図２に示す通り、コントロール群に比較して、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ｐ３００ＣＤ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−２−ｐ３００ＣＤ及びＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−３−ｐ３００ＣＤはヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現量を、それぞれ約１７倍、約３．５倍、約２倍に増加させた。さらに、その活性は、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ｐ３００ＣＤ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−２−ｐ３００ＣＤ及びＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−３−ｐ３００ＣＤの順で高いことが明らかになった。
ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｍｉＲ−３４６−１−ＶＰ６４添加時の細胞内ヒトｍｉＲ−３４６ ＲＮＡ発現量の測定
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ−１２９７４。以下ＢＭ−ＭＳＣと略記する）を用いて実施例３に示した方法と同様に評価した。但し、培地として、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ Ｃ−２８０１０）を用いた。上述実施例１で作製したＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｍｉＲ−３４６−１−ＶＰ６４を、実施例３に示した方法と同様に透析し、濃度を１５０ｎＭに調整した。これをＢＭ−ＭＳＣに実験時のウェル終濃度が０．２５ｎＭ、３ｎＭ及び１０ｎＭとなるようにそれぞれ添加して２４時間後の細胞内のヒトｍｉＲ−３４６ ＲＮＡ発現量を測定した。但し、リアルタイムＰＣＲにはＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとして配列番号４７に示される塩基配列からなるプライマーを、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ミリポア）のユニバーサルプライマーを使用した。
内在性コントロール遺伝子としてＵ６ ＲＮＡ量を測定した。ヒトｍｉＲ−３４６ ＲＮＡ量をＵ６ ＲＮＡ量で除した値をヒトｍｉＲ−３４６ ＲＮＡ相対発現量とした。コントロールのヒトｍｉＲ−３４６ ＲＮＡ相対発現量を１としたときの、各群のヒトｍｉＲ−３４６ ＲＮＡ相対発現量を算出した。Ｕ６のＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとして配列番号４８に示される塩基配列からなるプライマーを、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒは上述のユニバーサルプライマーを使用した。
図３に示す通り、コントロールに比較して、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｍｉＲ−３４６−１−ＶＰ６４はヒトｍｉＲ−３４６ ＲＮＡの発現を増加（ヒトｍｉＲ−３４６遺伝子の発現を亢進）させた。
実施例２から４の結果から、本発明の融合ポリペプチドは、細胞を培養する培地に添加するだけで、細胞導入試薬又は電気穿孔法を用いることなく、当該細胞における標的遺伝子の発現を亢進できることが示された。
細胞増殖アッセイ
ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒの細胞増殖への作用を評価した。実施例２と同じ培地で培養したＵＣ−ＭＳＣを０．１×１０４ ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（岩城硝子 ３８６０−０９６）に播種して３７℃、ＣＯ２濃度５％で２４時間培養した。ここでは播種細胞量が実施例２より少ないため培養時間を長くした。なお、増殖試験においては被験蛋白質群の効果を十分に確認するため、継代数が１０から２０の範囲で、かつ増殖能が落ちている細胞を用いた。実施例１で作製したＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＧＣＮ５ＣＤ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ及びＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｍｉＲ−３４６−１−ＶＰ６４を終濃度０．５ｎＭとなるように溶出緩衝液で希釈し、それぞれ１μＬ添加した。コントロールとして、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒの代わりに、溶出緩衝液を添加した。２４時間ごとに培地を交換し、７２時間まで培養を継続した。培地交換の際には各ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒを１μＬ添加し、終濃度０．５ｎＭとした。ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒの添加開始から２４時間ごとに細胞内ＡＴＰ定量試薬ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｒｅａｇｅｎｔ １００μＬを各ウェルに添加した。１０分室温で静置した後、細胞懸濁液２００μＬを９６ウェル白色プレート（コーニング）に移した。各ウェルの発光強度をＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標） Ｍ１０００（テカン）を用いて測定することによって、細胞の増殖能を測定した。なお同一試料について各３ウェル重複して実施した。
図４に示す通り、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＧＣＮ５ＣＤ（図４中「ＴＥＲＴ−１−ＧＣＮ５ＣＤ」）、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ（図４中「ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ」）、及びＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｍｉＲ−３４６−１−ＶＰ６４（図４中「ｍｉＲ−３４６−１−ＶＰ６４」））はコントロールと比較して細胞内ＡＴＰ総量を増加させており、細胞の増殖を促進させた。
この結果から、本発明の融合ポリペプチドは、これを含む培地で細胞を培養することにより、細胞の増殖を顕著に促進することができることが示された。
細胞増殖アッセイ（ヒト線維芽細胞を用いた長期培養試験）
ヒト線維芽細胞ＭＲＣ−５（理研 細胞バンク）を１０％ウシ胎児血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）含有アルファＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、で培養した。継代数が８回目の時に、細胞をトリプシン（和光）で遊離し、血球計算版で細胞数を計測した。コラーゲンＩ コート６ウェルプレート（コーニング）に各ウェル１×１０５個の細胞を上記培地０．５ｍＬで懸濁して播種した。３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で２４時間静置した後、実施例１で作製したＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ及び陰性対照としてＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰをそれぞれ１００ｎＭになるように培地で希釈し（それぞれ、希釈ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ及び希釈ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰと称する）、各ウェルに５μＬ添加した。対照群として培地のみを添加した。３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で静置し、２４時間ごとに上述の希釈ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ及び希釈ＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰを各ウェルに５μＬ添加した。３日目にリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬで２回洗浄した後、トリプシンを１００μＬ添加して、細胞をプレートから遊離させた。各ウェルに培地を４００μＬ添加して懸濁した後、血球計測版で各ウェルの細胞数を４回独立して計測した。その後、上記細胞懸濁液を培地で希釈して１ウェルあたり１×１０５個の細胞を６ウェルプレートに再播種した。この作業を累積継代数が２１回に達するまで繰り返し行い、測定した細胞数を継代時に希釈した倍率を累積継代数分掛け合わせて実験開始時の細胞数と比較した数値（４回計測値の平均）を図５に表示した。図５グラフ横軸の８から２２は細胞の継代数を示している。
図５に示される通り、培地のみを添加した細胞群（コントロールと表示）及びＧＳＴ−ＮＴＰ−ＥＧＦＰを添加した細胞群（ＮＴＰ−ＥＧＦＰと表示）に比較して、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲを添加した細胞群では細胞数が増加していることが認められた。以上より、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲが細胞増殖を促進する作用を有することが示された。
この結果から、本発明の融合ポリペプチドは、これを含む培地で体細胞を培養することにより、体細胞を増殖させる（体細胞の増殖を促進する）ことができることが示された。また、本実施例の結果より、本発明の融合ポリペプチドは、体細胞を培養する培地に添加するだけで、体細胞を増殖させることができることが示された。さらに、実施例２の結果を考慮すると、本発明の融合ポリペプチドは、体細胞の標的遺伝子（ＴＥＲＴ）の転写を調節することにより、体細胞を増殖させることができることが示唆された。
ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ添加時の細胞内ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現量の測定
ウェル内の終濃度以外は実施例３と同様の方法により、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ及びＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ添加時の細胞内ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現量を測定した。ただし、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ及びＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲのウェル内終濃度は、それぞれ０．２５ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ及び３０ｎＭで評価した。
その結果、図６に示される通り、ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲは、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲと同等又はそれ以上のレベルで、標的遺伝子であるヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現を増加させることが示された。
細胞増殖アッセイ（ヒトＭＳＣを用いた長期培養試験）
ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲの細胞増殖への作用を評価した。実施例２と同じ細胞種及び培地を使用した。継代数１６回目の細胞をコラーゲンＩコート６ウェルプレート（コーニング）に１ウェル当たり１×１０５個となるように０．５ｍＬの培地に懸濁して播種した。実施例１で作製したＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ及びＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｓｃｒａｍｂｌｅ−ＶＰＲが１００ｎＭになるようにそれぞれ培地で希釈し（それぞれ、希釈ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ及び希釈ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｓｃｒａｍｂｌｅ−ＶＰＲと称する）、それぞれ５μＬ添加した（ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｓｃｒａｍｂｌｅ−ＶＰＲを添加した細胞群をコントロールと称する）。２４時間ごとに上述の希釈ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ及び希釈ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｓｃｒａｍｂｌｅ−ＶＰＲを各ウェルに５μＬ添加した。３日目にリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬで２回洗浄した後、トリプシンを１００μＬ添加して、細胞をプレートから遊離させた。各ウェルに培地を４００μＬ添加して懸濁した後、血球計測版で各ウェルの細胞数を４回独立して計測した。その後、上記細胞懸濁液を培地で希釈して懸濁して１ウェル当たり１×１０５個の細胞を６ウェルプレートに再播種した。この作業を累積継代数が１９になるまで繰り返し行い、測定した細胞数を継代時に希釈した倍率を累積継代数分掛け合わせて実験開始時の細胞数と比較した数値（４回計測値の平均）を図７に表示した。図７グラフ横軸の１６から１９は細胞の継代数を示している。
その結果、図７に示す通り、ＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲを添加した培地で培養した細胞は、コントロールと比較してその増殖が促進された。
本発明の融合ポリペプチドは、標的遺伝子の発現を調節するのに有用であると期待される。また、本発明の融合ポリペプチドは、細胞の増殖を促進させるのに有用であると期待される。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換された宿主細胞及び蛋白質を生産する方法は、前記融合ポリペプチドを生産するのに有用であると期待される。
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１、３、５及び７に示される塩基配列は、それぞれＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ−１、ＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ−２、ＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ−３及びＴＡＬＥ＿ｍｉＲ−３４６−１の塩基配列であり、配列番号２、４、６及び８で示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１に示される塩基配列によりコードされるＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ−１、配列番号３に示される塩基配列によりコードされるＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ−２、配列番号５に示される塩基配列によりコードされるＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ−３及び配列番号７に示される塩基配列によりコードされるＴＡＬＥ＿ｍｉＲ−３４６−１のアミノ酸配列である。配列表の配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び６１に示される塩基配列は、それぞれＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰ６４、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ｐ３００ＣＤ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＧＣＮ５ＣＤ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−２−ｐ３００ＣＤ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−３−ｐ３００ＣＤ、ＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｍｉＲ−３４６−１−ＶＰ６４、及びＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲの塩基配列であり、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び６２で示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号９に示される塩基配列によりコードされるＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰ６４、配列番号１１に示される塩基配列によりコードされるＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲ、配列番号１３に示される塩基配列によりコードされるＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ｐ３００ＣＤ、配列番号１５に示される塩基配列によりコードされるＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＧＣＮ５ＣＤ、配列番号１７に示される塩基配列によりコードされるＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−２−ｐ３００ＣＤ、配列番号１９に示される塩基配列によりコードされるＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−３−ｐ３００ＣＤ、配列番号２１に示される塩基配列によりコードされるＮＴＰ−ＴＡＬＥ−ｍｉＲ−３４６−１−ＶＰ６４、及び、配列番号６１に示される塩基配列によりコードされるＩＣＱ２−ＴＡＬＥ−ＴＥＲＴ−１−ＶＰＲのアミノ酸配列である。配列番号２３に示される塩基配列は、ＮＴＰ（ＲＩＦＩＨＦＲＩＧＣ）をコードする塩基配列である。配列番号２５に示される塩基配列は、ＴＥＶをコードする塩基配列である。配列番号２６、２７、３０〜３３、３５〜３８、４０、４１、４３〜４８、７０及び７１に示される塩基配列は、各プライマーの塩基配列である。配列番号２８に示される塩基配列は、ΔＴＡＬＥ−ＶＰ６４の塩基配列である。配列番号２９に示されるアミノ酸配列は、ＶＰ６４のアミノ酸配列である。配列番号３４に示されるアミノ酸配列は、ＶＰＲのアミノ酸配列である。配列番号５３〜５７及び６０に示されるアミノ酸配列は、各細胞膜透過性ペプチドのアミノ酸配列である。配列番号５８及び５９に示される塩基配列は、それぞれＶＰＲ−ＰＣＲの５’末端側及び３’末端側の塩基配列である。配列番号６３に示される塩基配列はＴＡＬＥ＿ｓｃｒａｍｂｌｅの塩基配列であり、配列番号６４に示されるアミノ酸配列は配列番号６３に示される塩基配列によりコードされるＴＡＬＥ＿ｓｃｒａｍｂｌｅのアミノ酸配列である。配列番号６５に示される塩基配列は、ＸｈｏＩサイト及びＮｏｔＩサイトをそれぞれ付加したＥＧＦＰをコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号６６に示される塩基配列はＩＣＱ２（アミノ酸配列ＲＩＦＩＨＦＲＱＧＱ）をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号６７に示される塩基配列は、ＩＣＱ２をコードする塩基配列である。配列番号６８に示される塩基配列はリンカーをコードする塩基配列である。配列番号６９に示される塩基配列は、ポリヌクレオチドの塩基配列である。

Claims (15)

  1. 細胞膜透過性ペプチド、配列番号４９に示される塩基配列に結合するＤＮＡ結合ポリペプチド及び転写活性化因子を含む、融合ポリペプチド。
  2. 転写活性化因子がＶＰ６４、ＶＰＲ、ｐ３００又はＧＣＮ５である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  3. 細胞膜透過性ペプチドが、配列番号５３、５４、５５、５６、５７又は６０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  4. 細胞膜透過性ペプチドが配列番号５６又は６０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  5. ＤＮＡ結合ポリペプチドが転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  6. ＤＮＡ結合ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸番号７〜７８４からなるアミノ酸配列を含むＴＡＬＥである、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
  7. ＤＮＡ結合ポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  8. 細胞膜透過性ペプチドが配列番号５６又は６０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、ＤＮＡ結合ポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、転写活性化因子がＶＰＲである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  9. 配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  10. 請求項１〜９のいずれかに記載の融合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
  11. 請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  12. 請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  13. 請求項１２に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、融合ポリペプチドを製造する方法。
  14. 請求項１〜９のいずれかに記載の融合ポリペプチドを含む培地でヒト体細胞を培養する工程を包含する、ヒト体細胞におけるヒトＴｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴＥＲＴ）遺伝子の発現を亢進する方法。
  15. 請求項１〜９のいずれかに記載の融合ポリペプチドを含む培地でヒト体細胞を培養する工程を包含する、ヒト体細胞を増殖させる方法。
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