CN114230675A - Rna指导的基因编辑和基因调节 - Google Patents

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C.A.格斯巴奇
I.B.希尔顿
P.佩雷兹皮内拉
A.M.卡巴迪
P.I.塔科雷
D.G.奥斯特劳特
J.B.布拉克
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Abstract

本文公开了基于成簇有规间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)9的系统相关组合物和使用所述基于CRISPR/Cas9的系统相关组合物用于改变基因表达和基因组工程改造的方法。本文还公开了使用所述组合物用于在肌肉例如骨骼肌和心肌中改变基因表达和基因组工程改造的组合物和方法。

Description

RNA指导的基因编辑和基因调节
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年6月5日提交的美国临时申请号61/831,481、2013年6月25日提交的美国临时申请号61/839,127、2013年11月15日提交的美国临时申请号61/904,911、2014年3月19日提交的美国临时申请号61/967,466和2014年4月18日提交的美国临时申请号61/981,575的优先权，其所有通过引用以其整体结合到本文中。
政府利益声明
本发明在由NIH授予的联邦资助号DP2-OD008586和R01DA036865以及美国国家科学基金会(National Science Foundation)授予的CBET-1151035的政府支持下完成。美国政府对本发明享有一定权利。
技术领域
本公开内容涉及使用基于成簇有规间隔短回文重复序列(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR)/CRISPR相关(Cas) 9系统和病毒递送系统的基因的基因表达改变、基因组工程改造和基因组改变的领域。本公开内容还涉及肌肉(例如骨骼肌和心肌)中基因的基因组工程改造和基因组改变的领域。
发明背景
已对合成转录因子进行了改造以控制基因表达用于哺乳动物系统中的许多不同的医学和科学应用，包括刺激组织再生、药物筛选、补偿遗传缺陷、激活沉默的肿瘤抑制基因、控制干细胞分化、进行遗传筛选和产生合成基因回路。这些转录因子可以靶向内源基因的启动子或增强子或有目的地设计以识别与哺乳动物基因组正交的序列用于转基因调节。用于工程改造靶向用户定义序列的新转录因子的最通用策略基于锌指蛋白和转录-激活因子样效应物(TALE)的可编程DNA结合结构域。这两种方法包括应用这些结构域的蛋白质-DNA相互作用原理以改造具有独特DNA结合特异性的新的蛋白质。虽然这些方法对于许多应用是极其成功的，但是操作蛋白质-DNA相互作用所需要的蛋白质工程改造可能是费力的，并且需要专门技术。
另外，这些新的蛋白质不总是有效的。其原因尚未知，但可能与外遗传修饰和染色质状态对蛋白质与基因组靶位点结合的作用有关。另外，在确保这些新的蛋白质以及其它成分递送到各细胞中的方面存在挑战。用于递送这些新的蛋白质及其多种成分的现有方法包括用不同的质粒或载体递送至细胞，由于拷贝数的差异，因此导致在各细胞中高度可变的表达水平。另外，在转染后的基因激活由于质粒DNA的稀释所致是瞬时的，且短暂的基因表达可能不足以诱导治疗作用。此外，该方法不适于不易转染的细胞类型。因此这些新的蛋白质的另一个限制是转录激活的效能。
位点特异性核酸酶可用于在靶定的基因组基因座上引入位点特异性双链断裂。这种DNA切割刺激天然DNA修复机器，导致两种可能的修复途径之一。在不存在供体模板时，断裂可通过非同源末端连接(NHEJ) (一种导致DNA的少量插入或缺失的易错修复途径)修复。该方法可用来有意破坏、缺失或改变靶定基因序列的读框。然而，如果供体模板连同核酸酶一起提供，则细胞机器将通过同源重组修复断裂，在DNA切割存在时，这被提高几个数量级。可采用该方法将特定变化引入DNA序列的靶位点上。工程改造的核酸酶已被用于在多种人干细胞和细胞系中的基因编辑和用于小鼠肝中的基因编辑。然而，实施这些技术的主要障碍是以有效、高效并促进成功的基因组修饰的方式体内递送至特定组织。
在美国，遗传性遗传疾病对儿童具有毁灭性作用。这些疾病目前无法治愈，并且只能通过试图减轻症状来控制。几十年来，基因疗法领域有希望治愈这些疾病。然而有关将治疗性基因安全和有效地递送给细胞和患者的技术障碍限制了这种方法。杜兴型肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)是最普遍的遗传性单基因病，3500名男性中发生1例。DMD是肌养蛋白基因的遗传突变或自发突变的结果。肌养蛋白是负责调节肌细胞完整性和功能的蛋白质复合体的关键成分。DMD患者通常在儿童时代丧失身体上自我支持的能力，在十几岁时变得日益衰弱，在其二十岁左右死亡。对于DMD现有的实验性基因疗法策略需要重复给予瞬时基因递送载体或依赖外来遗传物质永久融合至基因组DNA中。这两种方法有着严重的安全顾虑。此外，这些策略受限于不能递送大和复杂的肌养蛋白基因序列。
发明概述
本发明涉及包含2个异源多肽结构域的融合蛋白。第一多肽结构域包含成簇有规间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，第二多肽结构域具有选自以下的活性：转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸酶活性、核酸缔合活性、甲基化酶活性和脱甲基酶活性。Cas蛋白可包含Cas9。Cas9可包含敲除Cas9的核酸酶活性的至少一个氨基酸突变。至少一个氨基酸突变可以是D10A和H840A的至少一个。Cas蛋白可包含iCas9 (SEQ ID NO: 1的氨基酸36-1403)。第二多肽结构域可具有转录激活活性。第二多肽结构域可包含至少一个VP16转录激活结构域重复序列。第二多肽结构域可包含VP16四聚体(“VP64”)或p65激活结构域。融合蛋白还可包含使第一多肽结构域与第二多肽结构域连接的接头。融合蛋白可包含iCas9-VP64。
本发明涉及包含所述融合蛋白和至少一种指导RNA (gRNA)的DNA打靶系统。至少一个gRNA可包含靶DNA序列的12-22个碱基对互补多核苷酸序列接着前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif)。至少一个gRNA可靶向基因的启动子区、基因的增强子区或基因的转录区。至少一个gRNA可靶向基因的内含子。至少一个gRNA可靶向基因的外显子。至少一个gRNA可靶向选自以下基因的启动子区：ASCL1、BRN2、MYT1L、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2和MYOD1。至少一个gRNA可包含SEQ ID NO: 5-40、65-144、492-515、540-563和585-625的至少一个。
本发明涉及与肌养蛋白基因结合的包含Cas9和至少一种指导RNA (gRNA)的DNA打靶系统。至少一种gRNA可靶向肌养蛋白基因的内含子。至少一种gRNA可靶向肌养蛋白基因的外显子。至少一种指导RNA可包含SEQ ID NO: 5-40、65-144、492-515、540-563和585-625的至少一个。DNA打靶系统可包含介于1种和10种之间的不同gRNA。
本发明涉及编码所述融合蛋白或所述DNA打靶系统的分离多核苷酸。
本发明涉及包含所述分离的多核苷酸的载体。
本发明涉及包含所述分离的多核苷酸或所述载体的细胞。
本发明涉及调节细胞中的哺乳动物基因表达的方法。所述方法包括使细胞与所述融合蛋白、所述DNA打靶系统、所述分离的多核苷酸或所述载体接触。基因表达可以是诱导的。
本发明涉及使细胞转分化或诱导细胞分化的方法。所述方法包括使细胞与所述融合蛋白、所述DNA打靶系统、所述分离的多核苷酸或所述载体接触。细胞可以是成纤维细胞或诱导多能干细胞。成纤维细胞可被转分化成为神经元细胞或肌源细胞。可使DNA打靶系统与细胞接触，且至少一种gRNA靶向选自以下的至少一个基因的启动子区：ASCL1、BRN2、MYOD1和MYT1L。DNA打靶系统可包含靶向ASCL1基因的启动子区的至少一种gRNA和靶向BRN2基因的启动子区的至少一种gRNA。DNA打靶系统可包含介于1种和20种之间的不同的gRNA。DNA打靶系统可包含8或16种不同的gRNA。DNA打靶系统可包含dCas9-VP64。DNA打靶系统可以病毒或非病毒的方法递送到细胞中。
本发明涉及纠正细胞中的突变基因的方法。所述方法包括将所述DNA打靶系统、所述分离的多核苷酸或所述载体给予细胞。突变基因的纠正可包括同源指导修复。所述方法还可包括将供体DNA给予细胞。突变基因可包含引起提前终止密码子和截短基因产物的移码突变。突变基因的纠正可包括核酸酶介导的非同源末端连接。突变基因的纠正可包括提前终止密码子的缺失、剪接受体位点的破坏、一个或多个外显子的缺失或剪接供体序列的破坏。一个或多个外显子的缺失可导致读框的纠正。
本发明涉及治疗具有突变型肌养蛋白基因的有需要的受试者的方法。所述方法包括将所述DNA打靶系统、所述分离的多核苷酸或所述载体给予受试者。受试者可能患有杜兴型肌营养不良。
本发明涉及纠正细胞的突变型肌养蛋白基因的方法。所述方法包括将所述DNA打靶系统、所述分离的多核苷酸、所述载体或所述细胞给予含有突变型肌养蛋白基因的细胞。突变型肌养蛋白基因可包含提前终止密码子、通过基因缺失的受损读框、异常剪接受体位点或异常剪接供体位点，且其中靶区为提前终止密码子、受损读框、异常剪接受体位点或异常剪接供体位点的上游或下游。突变型肌养蛋白基因的纠正可包括同源指导修复(homology-directed repair)。所述方法还包括将供体DNA给予细胞。突变型肌养蛋白基因可包含引起提前终止密码子和截短基因产物的移码突变。突变型肌养蛋白基因的纠正可包括核酸酶介导的非同源末端连接。突变型肌养蛋白基因的纠正可包括提前终止密码子的缺失、受破坏读框的纠正或通过破坏剪接受体位点或破坏剪接供体序列的剪接调节。突变型肌养蛋白基因的纠正可包括外显子45-55或外显子51的缺失。
本发明涉及包含所述融合蛋白、所述DNA打靶系统、所述分离的多核苷酸、所述载体或所述细胞的药盒。
本发明涉及调节细胞中的哺乳动物基因表达的方法。所述方法包括使细胞与编码DNA打靶系统的多核苷酸接触。DNA打靶系统包含所述融合蛋白和至少一种指导RNA(gRNA)。DNA打靶系统可包含介于1种和10种之间的不同gRNA。不同的gRNA可与靶基因内的不同靶区结合。靶区可被至少一个核苷酸分隔。靶区可被约15-约700个碱基对分隔。不同的gRNA各自可与至少一个不同的靶基因结合。不同的靶基因可位于同一染色体上。不同的靶基因可位于不同的染色体上。至少一个靶区可在非开放染色质区、开放染色质区、靶基因的启动子区、靶基因的增强子区、靶基因的转录区或靶基因的转录起始位点的上游区域内。至少一个靶区可位于靶基因的转录起始位点上游约1-约1000个碱基对之间。至少一个靶区可位于靶基因的转录起始位点上游约1-约600个碱基对之间。基因表达可以是诱导的。DNA打靶系统可包含2种不同的gRNA、3种不同的gRNA、4种不同的gRNA、5种不同的gRNA、6种不同的gRNA、7种不同的gRNA、8种不同的gRNA、9种不同的gRNA或10种不同的gRNA。至少一种指导RNA可靶向选自以下基因的启动子区：ASCL1、BRN2、MYT1L、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2和MYOD1。至少一种指导RNA可包含SEQ ID NO: 5-40、65-144、492-515、540-563和585-625的至少一个。至少一个靶区可在靶基因的内含子或外显子内。
本发明涉及用于诱导细胞中哺乳动物基因表达的组合物。组合物包含所述融合蛋白和至少一种指导RNA (gRNA)。
本发明涉及用于诱导细胞中哺乳动物基因表达的组合物。组合物包含编码所述融合蛋白和至少一种指导RNA (gRNA)的分离的多核苷酸序列。至少一种指导RNA可靶向选自以下基因的启动子区：ASCL1、BRN2、MYT1L、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2和MYOD1。至少一种指导RNA可包含SEQ ID NO 5-40、65-144、492-515、540-563和585-625的至少一个。
本发明涉及包含用于诱导细胞中哺乳动物基因表达的所述组合物的细胞。
本发明涉及包含用于诱导细胞中哺乳动物基因表达的所述组合物或包含用于诱导细胞中哺乳动物基因表达的所述组合物的所述细胞的药盒。
本发明涉及用于在细胞中诱导哺乳动物基因表达的药盒。药盒包含用于诱导细胞中哺乳动物基因表达的所述组合物或包含用于诱导细胞中哺乳动物基因表达的所述组合物的所述细胞。
本发明涉及用于在受试者肌肉中进行基因组编辑的组合物。组合物包含修饰的腺伴随病毒(AAV)载体和编码位点特异性核酸酶的核苷酸序列。所述肌肉是骨骼肌或心肌。修饰的AAV载体可具有改进的心肌和骨骼肌组织嗜性。位点特异性核酸酶可包括锌指核酸酶、TAL效应核酸酶或CRISPR/Cas9系统。位点特异性核酸酶可结合肌肉细胞中的基因或基因座。基因或基因座可以是肌养蛋白基因。组合物还可包含供体DNA或转基因。
本发明涉及包含用于在受试者肌肉中进行基因组编辑的所述组合物的药盒。
本发明涉及在受试者肌肉中进行基因组编辑的方法。所述方法包括将用于在受试者肌肉中进行基因组编辑的所述组合物给予肌肉，其中所述肌肉是骨骼肌或心肌。基因组编辑可包括纠正突变基因或插入转基因。纠正突变基因可包括缺失、重排或置换突变基因。纠正突变基因可包括核酸酶介导的非同源末端连接或同源指导修复。
本发明涉及治疗受试者的方法。所述方法包括将用于在受试者肌肉中进行基因组编辑的所述组合物给予受试者的肌肉，其中所述肌肉是骨骼肌或心肌。受试者可患有骨骼肌病况或遗传疾病。受试者可患有杜兴型肌营养不良。
本发明涉及纠正受试者的突变基因的方法，所述方法包括给予用于在受试者肌肉中进行基因组编辑的所述组合物。所述肌肉是骨骼肌或心肌。可将组合物注射入受试者的骨骼肌中。可将组合物经系统注射到受试者。骨骼肌可以是胫骨前肌。
本发明涉及用于在受试者中进行基因组编辑的修饰的慢病毒载体，所述载体包含编码所述融合蛋白的第一多核苷酸序列和编码至少一种sgRNA的第二多核苷酸序列。第一多核苷酸序列可与第一启动子有效连接。第一启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子或可调节启动子。第二多核苷酸序列可编码介于1种和10种之间的不同sgRNA。第二多核苷酸序列可编码2种不同的sgRNA、3种不同的sgRNA、4种不同的sgRNA、5种不同的sgRNA、6种不同的sgRNA、7种不同的sgRNA、8种不同的sgRNA、9种不同的sgRNA或10种不同的sgRNA。编码不同sgRNA的多核苷酸序列各自可与启动子有效连接。与不同sgRNA有效连接的启动子各自可以是相同的启动子。与不同sgRNA有效连接的启动子各自可以是不同的启动子。启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子或可调节启动子。sgRNA可与靶基因结合。sgRNA各自可与一个靶基因座内的不同靶区结合。sgRNA各自可与不同基因座内的不同靶区结合。融合蛋白可包含Cas9蛋白或iCas9-VP64蛋白。融合蛋白可包含VP64结构域、p300结构域或KRAB结构域。两个或更多个内源基因在转录上可被激活。两个或更多个内源基因可被阻遏。
本发明涉及激活细胞中的内源基因的方法。所述方法包括使细胞与所述修饰的慢病毒载体接触。内源基因可被瞬时激活。内源基因可被稳定激活。内源基因可被瞬时阻抑。内源基因可被稳定阻抑。融合蛋白可以与sgRNA相似的水平表达。融合蛋白可以与sgRNA不同的水平表达。细胞可以是原代人细胞。
本发明涉及在细胞中进行多重基因编辑的方法。所述方法包括使细胞与所述修饰的慢病毒载体接触。多重基因编辑可包括纠正至少一个突变基因或插入转基因。纠正突变基因可包括缺失、重排或置换至少一个突变基因。纠正至少一个突变基因可包括核酸酶介导的非同源末端连接或同源指导修复。多重基因编辑可包括缺失至少一个基因，其中基因是内源正常基因或突变基因。多重基因编辑可包括缺失至少两个基因。多重基因编辑可包括缺失介于2个和10个之间的基因。
本发明涉及调节细胞中至少一个靶基因的基因表达的方法。所述方法包括使细胞与所述修饰的慢病毒载体接触。至少两个基因的基因表达可被调节。可调节介于2个基因和10个基因之间的基因表达。当与至少一个靶基因的正常基因表达水平相比，至少一个靶基因的基因表达水平提高或降低时，至少一个靶基因的基因表达可被调节。
附图简述
图1显示通过iCas9-VP64的人IL1RN基因的RNA指导的激活。(a、b)通过使失活Cas9(iCas9，D10A/H840A)与VP64转录激活结构域(transactivation domain)融合产生RNA指导的转录激活因子。iCas9-VP64通过指导RNA (gRNA)与20 bp靶序列杂交识别基因组靶位点。(c)将靶向IL1RN启动子中的序列的4种gRNA或crRNA/tracrRNA的表达质粒与iCas9-VP64表达质粒一起共转染到HEK293T细胞中。通过qRT-PCR评价IL1RN表达的激活。(d) 4种gRNA表达质粒分别或组合地与iCas9-VP64一起共转染。通过qRT-PCR只在响应gRNA的组合时才观察到稳健的基因激活。(e)通过经ELISA评价培养基中的IL-1ra基因产物的分泌，来证实IL1RN表达的激活。只在用gRNA的组合处理的6个样品的3个中检出IL-1ra。对于(c-e)，数据表示为均值±s.e.m. (n = 3个独立实验)。通过Tukey检验，用gRNA的组合处理与所有其它处理显著不同(*P ≤ 0.02)。(f)对用空表达载体处理(n = 2)或用iCas9-VP64的表达质粒和靶向IL1RN的4种gRNA共转染(n = 2)的样品进行RNA-seq。这些处理间，唯一的基因表达的统计显著性变化是4个IL1RN同种型的增加(错误发现率≤ 3 x 10-4)和IL32的降低(错误发现率= 0.03)。
图2显示与细胞和基因疗法、遗传重编程和再生医学有关的RNA指导的人基因激活。将HEK293T细胞用iCas9-VP64表达质粒和4种gRNA单独或组合地转染。靶基因表达通过qRT-PCR测量，并归一化至GAPDH mRNA水平。数据表示为均值±s.e.m. (n = 3个独立实验)。通过Tukey检验，用gRNA的组合处理在统计上显著不同于所有其它处理(*P< 0.05)。
图3显示iCas9-VP64的表达。转染的HEK293细胞中iCas9-VP64的表达通过针对N端Flag表位标签的蛋白质印迹证实。wt Cas9表达质粒不含表位标签。
图4显示人靶基因的gRNA靶位点和DNA酶高敏感性的位置。各基因座的4个gRNA靶位点标为各基因之上的定制轨道(custom track)，表明DNA酶高敏感性开放染色质区的DNase-seq数据显示于各基因下方。如前所述，在HEK293T细胞中进行DNase-seq以鉴定DNA酶高敏感区(Song等, Cold Spring Harbor protocols 2010, pdb prot5384 (2010)；Song等 Genome Res 21, 1757-1767 (2011))。结果表明，开放染色质不是通过gRNA与iCas9-VP64组合用于基因激活的必要条件。
图5显示通过iCas9-VP64失去核酸酶活性。将野生型Cas9或失活(D10A、H840A)iCas9-VP64表达质粒与靶向IL1RN启动子的4种不同的指导RNA的表达质粒一起共转染。通过Surveyor测定法，测定核酸酶活性(Guschin等, Methods Mol Biol 649, 247-256(2010))。表明核酸酶活性和通过非同源末端连接的DNA修复的较低分子量条带只在用野生型Cas9处理后存在，支持核酸酶活性被iCas9-VP64灭除。
图6显示用靶向HBG1和HBG2的gRNA处理的样品的RNA-seq。对用对照空表达载体处理(n = 3)或用iCas9-VP64的表达质粒和靶向HBG1的4种gRNA共转染(n = 2)的样品进行RNA-seq。这些gRNA中的3种还靶向HBG2。观察到HBG1和HBG2两者相对于对照的增加，但由于表达水平低而不是统计显著的。这些处理间基因表达唯一的统计显著性变化是IL32 (错误发现率= 0.0007)和TNFRS9 (错误发现率= 0.002)降低。
图7显示Ascl1和γ-珠蛋白通过iCas9-VP64增量调节。将HEK293T细胞用iCas9-VP64和靶向ASCL1或HBG1启动子的4种gRNA转染。相应的Ascl1和γ-珠蛋白蛋白质产量的水平通过蛋白质印迹评价。在2个独立实验中，在HEK293T细胞中可检出低水平的这些蛋白质，而在iCas9-VP64处理后可检出表达增加。
图8显示iCas9-VP64处理的鼠胚胎成纤维细胞中Ascl1下游靶标的激活。将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)用对照GFP表达质粒或iCas9-VP64表达质粒和靶向ASCL1的4种gRNA表达质粒的组合以50:50或75:25的比率转染。(a)人ASCL1启动子(SEQ ID NO: 3)中的gRNA靶位点在小鼠ASCL1启动子(SEQ ID NO: 4)中是保守的。靶位点用实线表示，转录区用短划线标明。(b)通过qRT-PCR测定，在iCas9-VP64/gRNA处理后2天，MEF中的ASCL1表达增加。(c-h)在神经诱导培养基中10天后，针对神经元分化的早期标志物Ascl1和Tuj1 (c-d)或更成熟的神经元分化的标志物Tuj1和MAP2 (d-f)，对细胞染色。一些Tuj1阳性细胞呈现神经元形态(f-g)，并发现单细胞对Tuj1和MAP2呈阳性(g)。(h)在iCas9-VP64/gRNA处理的培养物(约0.05%)中容易鉴定出Tuj1阳性细胞，但在对照中无。n = 3个独立样品和数据表示为均值±均值的标准误差。gRNA 75/25显著不同于gRNA 50/50和对照(*P < 0.01，Tukey检验)。
图9显示(a) iCas9-VP64蛋白序列(SEQ ID NO: 1)和(b)具有U6启动子的gRNA表达盒的序列(SEQ ID NO: 2)。
图10显示qRT-PCR的标准曲线。对于各基因，将具有最高表达水平的实验样品稀释以绘制通过qRT-PCR测定的标准曲线以确保在适当动态范围内的有效扩增。所有扩增反应的效率在90-115%内。
图11(a)-11(b)显示RNA指导的修复的验证。图11(a)显示在Cas9与空载体(阴性对照)或gRNA一起共转染至细胞中后2天自HEK 293T细胞收获的基因组DNA的Surveyor测定结果。图11(b)显示gRNA靶标的位置。图11(c)显示各gRNA的预期切割位点。
图12显示如Surveyor测定法所示DMD 8036 (del48-50)细胞中RNA指导的修复。
图13显示在整个基因座中通过PCR显示的DMD 8036 (del48-50)细胞中RNA指导的修复。野生型肌养蛋白基因的PCR产生大小为1447 bp的片段，而DMD 8036细胞系中突变基因的PCR显示缺失约817 bp。在引入基于CRISPR/Cas9的系统后的缺失条带为约630 bp。
图14显示通过用MANDYS8 (抗肌养蛋白抗体)和GAPDH抗体(阳性对照)的蛋白质印迹所显示的DMD 8036 (del48-50)细胞中RNA指导的修复。
图15显示说明靶向IL1RN启动子的iCas9-VP64的特异性结合的ChIP测序数据。将HEK 293T细胞用靶向IL1RN启动子的iCas9-VP64转染。
图16显示肌养蛋白基因的CRISPR/Cas9打靶。(A)设计sgRNA序列以结合肌养蛋白基因的外显子45-55突变热区中的序列，使得基因编辑可恢复多个患者特异性突变的肌养蛋白表达。内含子的箭头表明经设计从基因组中缺失整个外显子的sgRNA靶标。外显子的箭头表明经设计产生肌养蛋白基因中的靶定移码(targeted frameshift)的sgRNA靶标。(B)在使用CR3 sgRNA通过外显子51的NHEJ DNA修复引入少量插入或缺失后读框纠正的实例。(C)经设计在具有外显子48-50缺失的患者突变中缺失外显子51并恢复肌养蛋白读框的多个sgRNA靶标的示意图。(D)经设计缺失整个外显子45-55区以克服多个DMD患者突变的多个sgRNA靶标的示意图。
图17显示用于量化Surveyor测定结果以测量表7中的第3天基因修饰的TBE-PAGE凝胶的图像。星号标出说明核酸酶活性的预期的条带大小。
图18显示用于量化Surveyor测定结果以测量表7中的第10天基因修饰的TBE-PAGE凝胶的图像。星号标出说明核酸酶活性的预期的条带大小。
图19显示富集遗传修饰的DMD成肌细胞的荧光激活流式分选法。(A)使用T2A核糖体跳跃肽(ribosomal skipping peptide)序列，将表达与GFP标志物连接的人密码子优化SpCas9蛋白的质粒与携带sgRNA表达盒的一种或两种质粒一起共同电穿孔至人DMD成肌细胞中。(B)在有(底部)或没有(顶部)与SpCas9连接的GFP标志物的情况下通过T2A核糖体跳跃肽序列将所示sgRNA表达盒与表达SpCas9的各个质粒一起独立地共转染至HEK293T中。在转染后3天通过Surveyor测定法对基因修饰频率进行了评价。(C)将肌养蛋白基因中缺失外显子48-50的DMD成肌细胞用纠正这些患者细胞中的肌养蛋白读框的sgRNA处理。在电穿孔后20天对未分选(整批)或GFP+分选细胞中的基因修饰进行了评价。(D)在用指定的表达质粒电穿孔后3天DMD成肌细胞中的GFP表达。转染效率和分选细胞群由选通区表明。
图20显示使用CRISPR/Cas9恢复肌养蛋白读框的靶定移码。(A)使用结合第一读框外终止密码子(out-of-frame stop codon)的紧接上游的sgRNA即CR3靶向外显子51的5’区。PAM：前间区序列邻近基序。(B)从用SpCas9和CR3表达盒处理的HEK293T细胞PCR扩增外显子51基因座。各个克隆的序列通过Sanger测序测定。顶部序列(粗体，外显子用红色)是天然未修饰序列。圆括号中表示各序列的克隆数。(C)产生于(B)中所示基因修饰的总基因编辑效率和读框转换(frame conversion)的概述。(D)用SpCas9和CR3 sgRNA表达盒(图19C)处理以产生恢复肌养蛋白读框的靶定移码的人DMD成肌细胞中肌养蛋白表达的蛋白质印迹。分化6天后使用针对肌养蛋白的rod结构域的抗体探测肌养蛋白表达。
图21显示采用多重CRISPR/Cas9基因编辑从人基因组缺失外显子51。(A)在具有外显子48-50缺失的人DMD成肌细胞中跨越外显子51基因座的终点基因组PCR。顶部箭头表明全长PCR扩增子的预期位置，2个较低的箭头表明具有因指定sgRNA组合引起的缺失的PCR扩增子的预期位置。(B)使(A)的PCR产物克隆，对各克隆测序以确定靶定基因座上存在的插入和缺失。顶行显示野生型未修饰序列，三角形表明SpCas9切割位点。在右边是显示预期缺失连接处的序列的代表性层析图。(C)用指定sgRNA处理的CRISPR/Cas9修饰的人Δ48-50 DMD成肌细胞中肌养蛋白mRNA转录物的终点RT-PCR分析。右边显示预期缺失PCR产物的代表性层析图。星号：产生于缺失产物链与未修饰链杂交的条带。(D)通过针对用GAPDH作为加载对照的肌养蛋白的蛋白质印迹，对通过CRISPR/Cas9基因组编辑拯救肌养蛋白表达进行了评价。箭头表明预期恢复的肌养蛋白条带。
图22显示人DMD成肌细胞中通过多重CRISPR/Cas9基因编辑缺失整个外显子45-55区。(A)在HEK293T或DMD成肌细胞用指定sgRNA处理后检测内含子44和内含子55之间缺失区域的基因组DNA的终点基因组PCR。(B)通过Sanger测序以测定存在于靶定基因座上的基因组缺失的序列，来分析来自(A)中DMD成肌细胞的缺失的预期大小PCR产物的各克隆。下图是显示预期缺失连接处的序列的代表性层析图。(C)用指定sgRNA处理的CRISPR/Cas9修饰的人Δ48-50 DMD成肌细胞中肌养蛋白mRNA转录物的终点RT-PCR分析。右边显示预期缺失PCR产物的代表性层析图。(D)在将DMD成肌细胞用靶向内含子44和/或内含子55的sgRNA电穿孔后通过蛋白质印迹分析恢复的肌养蛋白表达。
图23显示用于体内细胞移植实验的基于流式细胞术的富集基因修饰的DMD成肌细胞的证实。在有或没有CR1和CR5的sgRNA表达载体的情况下将DMD成肌细胞用Cas9处理，并通过流式细胞术分选GFP+细胞。使用位于基因座两侧的引物，通过终点PCR检测外显子51基因座上的缺失。阴性对照：仅用Cas9处理并针对GFP+细胞分选的DMD成肌细胞。
图24显示在CRISPR/Cas9处理的人DMD成肌细胞移植到免疫缺陷型小鼠中后恢复的人肌养蛋白的体内表达。如图19所示将人Δ48-50 DMD成肌细胞用SpCas9、CR1和CR5处理以缺失外显子51并针对GFP表达分选。将这些分选细胞和未处理对照细胞注射入免疫缺陷型小鼠的后肢，并在移植后4周后评价肌纤维中的人特异性蛋白质表达。将冰冻切片按规定用抗人血影蛋白(其通过融合入小鼠肌纤维的未纠正和纠正的成肌细胞两者表达)或抗人肌养蛋白抗体染色。白色箭头表明肌纤维对人肌养蛋白呈阳性。
图25显示探测人肌养蛋白表达的其它免疫荧光图像。左端顶部插图显示用抗人血影蛋白染色的区域的连续切片。(A-C)注射未处理人DMD成肌细胞的肌肉的切片。(D-F)通过流式细胞术富集的注射CR1/5处理的人DMD成肌细胞的肌肉的切片。白色箭头表示肌养蛋白阳性纤维。
图26显示评价人细胞中的CRISPR/Cas9毒性和外显子51的CR1/CR5介导的缺失的脱靶作用(off-target effect)。(A)用人优化SpCas9和指定sgRNA构建体处理的HEK293T细胞中细胞毒性测定法的结果。细胞毒性基于用指定核酸酶共转染的GFP阳性细胞的存活。I-SceI是充分表征的无毒的大范围核酸酶，GZF3是已知有毒的锌指核酸酶。(B)用编码Cas9和指定sgRNA的表达盒处理的分选hDMD细胞中脱靶位点的Surveyor分析。从在HEK293T细胞中测试的一组50个预测位点中鉴定出hDMD细胞中所测的这3个脱靶位点(图27和表4)。TGT：指定sgRNA的中靶基因座。OT：脱靶基因座。(C、D)检测(C)在用Cas9和CR1处理的HEK293T细胞或(D)在用Cas9、CR1和CR5处理的分选hDMD细胞中染色体易位的终点嵌套PCR。示意图表示针对各易位事件定制的嵌套引物对的相对位置。根据引物大小和各基因座上预测sgRNA切割位点的位置，估算各条带的预期大小。星号标出以预期大小检测的条带。通过从各末端的Sanger测序证实(C)中条带的特性(图30)。显示了HEK293T细胞中P2/P5易位的代表性层析图。
图27显示用于量化Surveyor测定结果以测量表4中的中靶和脱靶基因修饰的TBE-PAGE凝胶的图像。星号标出表明核酸酶活性的预期的条带大小。
图28显示检测人细胞中针对CR3和CR6/CR36由CRISPR/Cas9脱靶活性引起的染色体易位的终点嵌套PCR。在(A)按所示用Cas9和CR3处理的HEK293T或分选hDMD细胞、(B)仅用Cas9和CR36处理的HEK293T细胞、或(C)用Cas9、CR6和CR36表达盒处理的分选hDMD细胞中，采用嵌套终点PCR分析检测易位。使用各预测易位基因座的定制引物扩增易位的第二嵌套PCR反应物以使特异性最大化(参见表4)。示意图表示用于探测易位存在的嵌套引物对的相对位置。首先从自用或未用指定sgRNA处理的细胞分离的基因组DNA扩增各个可能的易位事件。使用可能产生于易位的预测PCR扩增子内的引物进行第二嵌套PCR反应。根据指定引物结合位点和各基因座上预测sgRNA切割位点估算预期大小。*表示以预期大小检测的条带，通过自各末端的Sanger测序来证实。#表示其中Sanger测序显示预测易位以外的序列的扩增子，可能为嵌套PCR期间错引发的结果。
图29显示图28中检出的条带的Sanger测序层析图，所述条带产生于在用Cas9和CR3基因盒处理的HEK293T细胞中分别在染色体X和1上CR3和CR3-OT1之间的易位。箭头显示与在由合适的sgRNA引起的预期断裂点附近的指定染色体同源的区域。注意，因通过非同源末端连接的DNA修复的易错性质所致，测序读数在断裂点附近变成异相。
图30显示图26C中检出的条带的Sanger测序层析图，所述条带产生于在用Cas9和CR1基因盒处理的HEK293T细胞中分别在染色体X和16上的CR1和CR1-OT1之间的易位。箭头显示与在由合适的sgRNA引起的预期断裂点附近的指定染色体同源的区域。注意，由通过非同源末端连接的DNA修复的易错性质所致，测序读数在断裂点附近变成异相。
图31显示体内AAV注射和组织收获的概观。
图32显示在递送AAV-SASTG-ROSA后体外和体内骨骼肌中的Rosa26 ZFN活性的Surveyor分析。箭头表示产生于Surveyor切割的预期条带。n.d.：未检出。(a)增殖的C2C12用指定量的病毒转导，在感染后4天收获。箭头表示产生于Surveyor切割的预期条带大小。(b)使C2C12在分化培养基中孵育5天，然后在24孔板中用指定量的AAV-SASTG-ROSA病毒转导。在转导后10天收集样品。(c)将指定量的AAV-SASTG-ROSA直接注射入C57BL/6J小鼠的胫骨前肌中，感染后4周收获肌肉。将收获的TA肌肉分割成8个单独的块用于基因组DNA分析，其各自在单独的泳道中显示。
图33显示Rosa T2A opt DNA序列(SEQ ID NO: 434)和Rosa T2A opt蛋白质序列(SEQ ID NO: 435)。
图34显示SASTG衣壳DNA序列(SEQ ID NO:436)和SASTG衣壳肽序列(SEQ ID NO:437)。
图35显示DZF16 ZFN靶位点序列(SEQ ID NO: 442)、DZF16-L6左侧全部氨基酸序列(SEQ ID NO: 443)和DZF16-R6右侧全部氨基酸序列(SEQ ID NO: 444)。
图36显示E51C3 ZFN靶位点序列(SEQ ID NO: 445)、E51C3-3L左侧全部氨基酸序列(SEQ ID NO: 446)和E51C3-3R右侧全部氨基酸序列(SEQ ID NO: 447)。
图37显示DZF15 ZFN靶位点序列(SEQ ID NO: 448)、DZF15-L6左侧全部氨基酸序列(SEQ ID NO: 449)、DZF15-R6右侧全部氨基酸序列(SEQ ID NO: 450)、DZF15-L5左侧全部氨基酸序列(SEQ ID NO: 451)、DZF15-R5右侧全部氨基酸序列(SEQ ID NO: 452)。
图38显示E51C4 ZFN靶位点序列(SEQ ID NO: 453)、E51C4-4L左侧全部氨基酸序列(SEQ ID NO: 454)和E51C4-4R右侧全部氨基酸序列(SEQ ID NO: 455)。
图39显示“单一载体，多重CRISPR系统”、“二元载体，多重CRISPR系统”和“单一载体，单一gRNA系统”的示意图。
图40显示SaCas9-NLS (其中NLS用下划线表示) (SEQ ID NO: 64)和SaCas9 gRNA(SEQ ID NO: 116)的核苷酸序列。
图41显示NmCas9 (其中NLS 1用下划线表示，NLS 2用下划线和粗体表示，HA标签用粗体表示)、来自Thomson PNAS 2013的NmCas9短发夹(SEQ ID NO: 118)和来自ChurchNature Biotech 2013的NmCas9长发夹(SEQ ID NO: 119)的核苷酸序列。
图42显示sgRNA和慢病毒Cas9表达构建体的验证。(a)将编码表达靶向AAVS1基因座的sgRNA的独特Pol III启动子的构建体或含有hU6启动子紧接多聚胸苷以终止表达的构建体(“PolyT”)转染至HEK293T细胞中。转染后2天采用终点RT-PCR以探测各指定启动子/sgRNA构建体的表达。-RT：无逆转录酶对照。(b)将HEK293T用编码AAVS1锌指核酸酶或Cas9-T2A-GFP和指定启动子/sgRNA表达盒的表达载体转染，采用Surveyor测定法评价转染后3天的基因修饰水平。(c)将HEK293T细胞用编码无sgRNA的指定Cas9-T2A-GFP构建体的慢病毒构建体转导，转导后7天，通过探测Cas9蛋白N端上的FLAG表位标签，通过蛋白质印迹评价Cas9表达。
图43显示单一慢病毒CRISPR/Cas9表达盒的Golden Gate装配。
图44显示多重CRISPR/Cas9系统的单一慢病毒递送。(a)将靶向不同基因组基因座的4种sgRNA克隆至表达有活性的Cas9核酸酶的慢病毒载体中。(b) HEK293T和原生人真皮成纤维细胞用表达指定sgRNA的慢病毒转导，并采用Surveyor测定法测定切割事件。转导后7天测定HEK293T。转导后10天测定人成纤维细胞。
图45显示稳定表达dCas9-VP64的HEK293T中的瞬时基因激活。将HEK293T用慢病毒转导以稳定表达dCas9-VP64，随后用表达指定sgRNA组合的质粒转染。通过改变所递送的sgRNA数，转染后3天实现内源IL1RN (a)和HBG1 (b)基因座的可调节内源基因激活。转染后3-6天，观察到内源IL1RN (c)和HBG1 (d)的峰值水平，在第15-20天之间激活水平回到背景水平。重要的是，细胞系在第20天在第二次转染后能够起反应，虽然水平比之前观察到的低。
图46显示使用单一慢病毒多个dCas9-VP64载体在HEK293T中稳定的基因激活。将HEK293T用慢病毒转导以稳定表达dCas9-VP64和gRNA的指定组合。通过改变所递送的sgRNA数，转导后7天实现内源IL1RN (a)和HBG1 (b)基因座的可调节内源基因激活。转导后6天观察到内源IL1RN (c)和HBG1 (d)的峰值水平，并保持激活水平直到第21天。
图47显示IL1RN mRNA表达水平。
图48显示代表通过异位表达BAM神经元转录因子，成纤维细胞直接转化成神经元的示意图。
图49显示(A) dCas9-VP64构建体的示意图。dCas9-VP64是一种与VP16转录激活结构域的四聚体融合的Cas9蛋白的催化上不活跃的形式。(B)显示RNA指导的dCas9-VP64募集至基因组靶上的机制的示意图。(C)产生具有CRISPR/Cas9转录因子的iN的实验方案的示意图。
图50显示在用dCas9-VP64转导和用靶向ASCL1启动子、ASCL1 cDNA或萤光素酶的gRNA的任一个转染的MEF中，在第3天通过(A) qRT-PCR测定的内源ASCL1表达或通过(B)免疫荧光检测的总ASCL1蛋白。星号(*)表示与4种gRNA相比，以共同递送8种gRNA的ASCL1表达显著增加(p<0.05)。与通过dCas9-VP64和靶向Ascl1启动子的8种gRNA所诱导的相比，ASCL1的异位表达产生更多的蛋白质，但到第3天，不激活培养物中的内源基因座。
图51显示(A)通过异位BAM因子或通过dCas9-VP64和靶向BRN2和ASCL1启动子的gRNA产生的TUJ1和MAP2阳性细胞，(B)在第11天在N3培养基中具有表达hSyn-RFP报道分子的神经元形态的细胞。
图52显示(A)在KCl存在(底部)或不存在(顶部)时在培养基中具有对GCaMP5钙指示物呈阳性的神经元形态的细胞。(B)显示细胞在响应KCl加入时去极化的随时间变化的归一化荧光强度的迹线。
图52显示iCas9-VP64处理的鼠胚胎成纤维细胞中使用dCas9-VP64转录因子以将成纤维细胞转化成神经元的Ascl1和Brn2 (即主调节基因)的下游靶标的激活。将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)用对照GFP表达质粒或iCas9-VP64表达质粒及靶向ASCL1和BRN2的8种gRNA表达质粒的组合转染。dCas9转录因子通过病毒递送。在10天后在神经诱导培养基中，针对Tuj1 (神经元分化的早期标志物)和MAP2 (更成熟的神经元分化的标志物)对细胞染色。向神经元的转化是有效的。
图53显示用于控制哺乳动物基因调节的CRISPR/Cas9平台。A. 在由与之前是赋予靶位点特异性的可交换20bp前间区的Cas9形成复合体的恒定区组成的嵌合gRNA分子的存在下，基于Cas9的效应子结合基因组序列。B. 基于Cas9的合成转录因子通过干扰RNA聚合酶活性或通过在启动子内结合并阻断内源转录因子的结合位点阻抑靶基因的转录。C. 靶向调节元件例如增强子也可潜在地阻断多个远端基因的表达。
图54显示使用CRISPR/dCas9-KRAB靶向HS2增强子。HS2区是远端调节>10kb下游的珠蛋白基因表达的强力增强子。设计一组单一gRNA以靶向沿增强子区的位点。
图55显示靶向HS2增强子的单一gRNA实现珠蛋白基因的有效转录阻抑。A. 在慢病毒载体上递送dCas9和dCas9-KRAB阻抑蛋白。使单一gRNA瞬时转染用于筛选。与未接受gRNA处理的对照细胞相比，当在转染后3天通过定量RT-PCR测定时，表达dCas9-KRAB的K562实现B. γ-珠蛋白、C. ε-珠蛋白和D. β-珠蛋白基因的高达80%阻抑。E. 与β-肌动蛋白对照相比，在第3天表达dCas9或dCas9-KRAB并用Cr4或Cr8处理的细胞中的蛋白质表达显示γ-珠蛋白表达的适度阻抑。
图56显示以不同剂量的gRNA质粒递送至A. 不用慢病毒、用B. dCas9慢病毒或C.dCas9-KRAB慢病毒处理的细胞中的珠蛋白基因座基因的表达。增加所递送的Cr4 gRNA质粒的剂量在dCas9-KRAB处理细胞中提高阻抑，表明了dCas9-KRAB效应物和打靶gRNA两者在实现阻抑中的作用。
图57显示用dCas9-KRAB稳定递送单一gRNA使珠蛋白基因的表达沉默。A. dCas9和dCas9-KRAB阻抑蛋白与单一gRNA一起在慢病毒载体上共表达。当在转导后7天通过定量RT-PCR测定时，与未接受慢病毒处理的对照细胞相比，表达dCas9-KRAB的K562实现B. γ-珠蛋白、C. ε-珠蛋白和D. β-珠蛋白基因的高达95%阻抑。
图58显示分离p300 HAT “核心”用于仅通过dCas9融合的组蛋白的靶定外遗传修饰。
图59显示酿脓链球菌(S. pyogenes) dCas9-VP64融合(顶部)和dCas9-p300核心融合(底部)的简图。在靶基因座上用箭头显示前间区序列邻近基序(PAM)，用带阴影线的箭头显示合成指导RNA (gRNA)。
图60A-60C显示在人293T细胞培养系中在没有任何融合的效应子结构域的情况下相对于dCas9-VP64和dCas9，使用dCas9-p300的激活功效的3个人基因座的代表性数据。
图61A-61C显示dCas9构建体的氨基酸序列。图61A中显示了所有图61A-61C的图例。
图62显示HAT-dCase9-p300融合蛋白未能激活基因表达。
图63显示gRNA还与dCas9-p300核心协同起作用。
图64显示TALEN介导来源于在肌养蛋白基因中携带不同缺失的人DMD患者的骨骼成肌细胞系中肌养蛋白的Dp427m骨骼肌同种型的5’UTR上的微小肌养蛋白(minidystrophin)的整合。将DMD患者细胞用编码在5’UTR基因座上有活性的TALEN对的构建体和携带微小肌养蛋白基因的供体模板电穿孔。(a)显示微小肌养蛋白如何整合进入5’UTR的示意图。(b)分离潮霉素抗性克隆细胞系，并使用(a)中所示引物，针对在5’UTR上的成功位点特异性整合通过PCR进行筛选。星号表明所选的用于(c)中的进一步分析的克隆。(c)使具有检出的整合事件的克隆分离的DMD成肌细胞分化6天，并评价与微小肌养蛋白C端融合的HA标签的表达。
发明详述
如本文所述，发现某些方法和基于工程改造的CRISPR/CRISPR相关(Cas) 9的系统组合物可用于改变基因的表达、基因组工程改造和纠正或降低涉及遗传疾病的基因突变的作用。基于CRISPR/Cas9的系统包括Cas9蛋白和至少一种指导RNA，其提供系统的DNA打靶特异性。具体地说，本公开内容描述了使基于CRISPR/Cas9的系统的DNA序列打靶功能与其它活性组合的Cas9融合蛋白，因此允许改变基因表达和/或外遗传状态。该系统还可用于基因组工程改造和纠正或降低基因突变的作用。
本公开内容还提供用于递送基于CRISPR/CRISPR相关(Cas) 9的系统和多种gRNA以靶向一个或多个内源基因的某些组合物和方法。靶向单一启动子的多种sgRNA的共转染允许协同激活，然而，由于拷贝数的差异所致，多个质粒的共转染导致各细胞中可变的表达水平。另外，在转染后的基因激活由于质粒DNA随时间推移稀释所致是瞬时的。此外，许多细胞类型不易转染，并且瞬时基因表达可能不足以引起治疗作用。为了克服这些限制，开发了单一慢病毒系统以表达Cas9和来自独立启动子的多达4种sgRNA。公开了从单一慢病毒载体表达Cas9或dCas9融合蛋白和多达4种gRNA的平台。除自独立启动子表达的1、2、3或4种gRNA以外，慢病毒载体还表达组成型或诱导型Cas9或dCas9-VP64。该系统使得能够控制基于CRISPR/Cas9的基因调节的幅度和时机两者。此外，慢病毒平台提供有效和持续水平的基因表达，这可促进CRISPR/Cas9系统在原代细胞中的治疗应用。最后，该系统可同时用于编辑多个基因，例如几个癌基因的同时敲除。
本公开内容还提供使用修饰的腺伴随病毒(AAV)载体将位点特异性核酸酶递送至骨骼肌和心肌的某些组合物和方法。可被工程改造的位点特异性核酸酶可用于改变基因表达、基因组工程改造、纠正或降低涉及遗传疾病的基因突变的作用或操作参与影响骨骼肌或心肌或肌肉再生的其它病况的基因。工程改造的位点特异性核酸酶可包括锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应核酸酶(TALEN)和/或用于基因组编辑的CRISPR/Cas9系统。如本文所述，采用该独特的递送系统，在体内成功地编辑骨骼肌组织中的基因。所公开的发明提供改写人基因组用于治疗应用的方法和用于基础科学应用的目标模型类。
基因编辑十分依赖于细胞循环和在组织与组织间变化的复杂的DNA修复途径。骨骼肌是极复杂的环境，由每个细胞超过100核的大量肌纤维组成。几十年来，基因疗法和生物制剂总的来讲因体内递送障碍而受限制。这些挑战包括体内载体的稳定性、靶向正确组织、得到足够的基因表达和有活性的基因产物，并避免可能压倒活性的毒性，这在用基因编辑工具时是常见的。在其它情况下，其它递送载体(例如质粒DNA的直接注射)在骨骼肌和心肌中起作用以表达基因，但对于获得可检测水平的基因组编辑，用这些位点特异性核酸酶无法起良好作用。
虽然许多基因序列在AAV载体中不稳定并因此无法递送，但这些位点特异性核酸酶在AAV载体中出奇的稳定。当递送和表达这些位点特异性核酸酶时，它们在骨骼肌组织中保持活性。位点特异性核酸酶的蛋白质稳定性和活性是高度组织类型依赖性和细胞类型依赖性的。这些有活性且稳定的核酸酶能够在骨骼肌的复杂环境中修饰基因序列。本发明描述了将得力有效的并促进成功的基因组修饰的这类治疗剂的活性形式递送至骨骼肌或心肌的方法。
本公开内容还提供某些融合外遗传效应分子，一种dCas9-p300融合蛋白，与dCas9-VP64融合相比，它提供用于合成转录调节的稳健和有效的更广泛适用的工具。与在所测的所有基因座上的dCas9-VP64融合蛋白相比，激活的靶基因至更大得多的程度。另外，p300对人基因组内的增强子具有固有的内源活性。dCas9-p300融合蛋白能够激活内源靶基因启动子和增强子区。
dCas9-p300融合蛋白可用于人组织培养细胞系以激活基因表达。该融合蛋白可用于以准确性和可预测性指导人细胞内靶基因座的外遗传状态以控制分化，调制细胞调节，并应用新发明的有效疗法。现行技术限于激活的强度和外遗传调节的程度及可持续性，可通过利用该新的融合蛋白消除的障碍。
本节和本文公开的整个公开内容使用的章节标题仅仅用于组织目的，并无意限制。
1. 定义
除非另有定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。在有冲突的情况下，以本文件(包括定义)为主。下面描述了优选的方法和材料，但是类似于本文所述的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体结合到本文中。本文公开的材料、方法和实例只是说明性的，并无意是限制性的。
本文所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“拥有”、“可以”、“含有”及其变体欲指不排除其它行动或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或措词。单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代物，除非文中另有规定。不论是否明确陈述，本公开内容还包括“包含”本文提供的实施方案或要素的其它实施方案、“由”和“基本由”本文提供的实施方案或要素“组成”。
对于本文数字范围的引述，明确包括其间相同精确度的各个间插数字。例如，对于6-9的范围，除6和9以外还包括数字7和8，对于范围6.0-7.0，明确包括数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
本文可互换使用的“腺伴随病毒”或“AAV”是指属于感染人和一些其它灵长类动物物种的细小病毒科(Parvoviridae)依赖病毒属(Dependovirus)的微小病毒。目前已知AAV不引起疾病，但该病毒引起极轻微的免疫应答。
本文所用“结合区”是指被核酸酶识别和结合的核酸酶靶区内的区域。
本文可互换使用的“心肌”或“心脏肌肉”意指存在于壁心脏和心脏组织基础即心肌层的非自主横纹肌的类型。心肌由心肌细胞(cardiomyocyte/myocardiocyte)构成。心肌细胞显示类似于骨骼肌细胞中的条纹，但只含有唯一一个核，与多核骨骼细胞不同。
本文所用“心肌病况”是指与心肌有关的疾病，例如心肌病、心力衰竭、心律失常和炎性心脏病。
本文所用“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可包括与调节元件(包括启动子和聚腺苷酸化信号)有效连接的起始和终止信号，所述调节元件能够指导在给予其核酸的个体或哺乳动物的细胞中表达。编码序列可以是密码子优化。
本文所用“互补序列”或“互补”意指可意味着在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的Watson-Crick (例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对的核酸。“互补性”是指两个核酸序列之间共有的性质，使得当彼此反平行比对时，各位置上的核苷酸碱基都将互补。
本文所用“纠正”、“基因组编辑”和“恢复”是指改变编码截短的蛋白质或完全不编码蛋白质的突变基因，使得获得全长功能性或部分全长功能性蛋白质表达。纠正或恢复突变基因可包括以修复机制(例如同源指导修复(HDR))置换具有突变的基因的区域或用不具有突变的基因拷贝置换整个突变基因。纠正或恢复突变基因还可包括通过在基因中产生双链断裂，然后使用非同源末端连接(NHEJ)修复，来修复引起提前终止密码子、异常剪接受体位点或异常剪接供体位点的移码突变。在可恢复合适的读框并排除提前终止密码子的修复期间，NHEJ可加入或缺失至少一个碱基对。纠正或恢复突变基因还可包括破坏异常剪接受体位点或剪接供体序列。纠正或恢复突变基因还可包括通过两种核酸酶对相同DNA链的同时作用缺失非必需基因区段，以通过除去两个核酸酶靶位点间的DNA并修复被NHEJ断裂的DNA来恢复合适的读框。
本文可互换使用的“供体DNA”、“供体模板”和“修复模板”是指包括目标基因的至少一部分的双链DNA片段或分子。供体DNA可编码完全功能性蛋白质或部分功能性蛋白质。
本文可互换使用的“杜兴型肌营养不良”或“DMD”是指导致肌肉变性和最终死亡的隐性致命性X链锁病症。DMD是一种常见的遗传性单基因病3500名男性中发生1例。DMD是引起肌养蛋白基因的无义突变或移码突变的遗传突变或自发突变的结果。引起DMD的大多数肌养蛋白突变是破坏读框和引起肌养蛋白基因的提前翻译终止的外显子缺失。DMD患者通常在儿童时代丧失身体上自我支持的能力，在十几岁时变得日益衰弱，在其二十岁左右死亡。
本文所用“肌养蛋白”是指杆状胞质蛋白质，其是肌纤维的细胞骨架与遍及细胞膜的周围胞外基质连接的蛋白质复合体的一部分。肌养蛋白提供细胞膜的营养不良蛋白聚糖复合体的结构稳定性，所述复合体负责调节肌细胞完整性和功能。本文可互换使用的肌养蛋白基因或“DMD基因”是位于基因座Xp21的2.2兆碱基。初级转录测量约2,400 kb，其成熟mRNA为约14 kb。79个外显子编码超过3500个氨基酸的蛋白质。
本文所用“外显子51”是指肌养蛋白基因的第51个外显子。外显子51通常接近DMD患者的读框破坏性缺失，并且在临床试验中被靶中用于基于寡核苷酸的外显子跳跃。用于外显子51跳跃化合物eteplirsen的临床试验最近报告了在48周内的显著功能益处，具有与基线相比平均47%的肌养蛋白阳性纤维。外显子51中的突变通过基于NHEJ的基因组编辑，理想地适于永久纠正。
本文可互换使用的“移码”或“移码突变”是指其中添加或缺失一个或多个核苷酸引起mRNA中密码子的读框移动的基因突变类型。读框的移动可导致蛋白质翻译上氨基酸序列的改变，例如错义突变或提前终止密码子。
本文所用“功能性”和“完全功能性”描述具有生物活性的蛋白质。“功能基因”是指转录成mRNA的基因，所述mRNA翻译成功能性蛋白质。
本文所用“融合蛋白”是指通过连接最初编码各自的蛋白质的两个或更多个基因所产生的嵌合蛋白。融合基因的翻译导致具有来源于原始蛋白质各自的功能性质的单一多肽。
本文所用“基因构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括与调节元件(包括启动子和聚腺苷酸化信号)有效连接的起始和终止信号，所述调节元件能够在给予其核酸分子的个体的细胞中指导表达。本文所用术语“可表达形式”是指含有与编码蛋白质的编码序列有效连接的必需调节元件使得当存在于个体的细胞中时编码序列可表达的基因构建体。
本文所用“遗传疾病”是指由基因组中的一个或多个异常区部分或完全、直接或间接引起的疾病，尤其自出生时就存在的病况。异常可以是突变、插入或缺失。异常可影响基因的编码序列或其调节序列。遗传疾病可以是但不限于DMD、血友病、囊性纤维化、亨廷顿舞蹈病、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、肝胚细胞瘤、肝豆状核变性(Wilson'sdisease)、先天性肝性卟啉病、遗传性肝代谢病症、莱-尼综合征(Lesch Nyhan syndrome)、镰状细胞性贫血、地中海贫血、着色性干皮病、Fanconi贫血、色素性视网膜炎、共济失调毛细血管扩张、布卢姆氏综合征(成视网膜细胞瘤)、成视网膜细胞瘤和泰-萨病(Tay-Sachsdisease)。
本文可互换使用的“同源指导修复”或“HDR”是指大部分在细胞周期的G2和S期，当DNA的同源段存在于胞核中时，在细胞中修复双链DNA损害的机制。HDR使用供体DNA模板指导修复，并可用于产生基因组的特定序列变化，包括整个基因的靶定添加。如果供体模板与位点特异性核酸酶(例如基于CRISPR/Cas9的系统)一起提供，则细胞机器将通过同源重组修复断裂，在DNA切割存在时这被提高几个数量级。当同源DNA段存在时，则可发生非同源末端连接。
本文所用“基因组编辑”是指改变基因。基因组编辑可包括纠正或恢复突变基因。基因组编辑可包括敲除基因，例如突变基因或正常基因。基因组编辑可通过改变目标基因而用于治疗疾病或增强肌肉修复。
本文所用“相同的”或“同一性”在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下意指序列在特定区域内具有相同残基的特定百分比。百分比可如下计算：通过最优地比对两个序列，比较特定区域内的2个序列，测定两个序列中出现的相同残基的位置数以得出匹配位置数，将匹配位置数除以特定区域中的总位置数，将结果乘以100得到序列同一性的百分比。在其中2个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端且比较的特定区域只包括单一序列的情况下，单一序列的残基包括在计算的分母中，但不在分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可视为等同的。可手工或通过应用计算机序列算法例如BLAST或BLAST 2.0，进行同一性计算。
本文可互换使用的“突变基因”或“突变的基因”是指进行了可检测突变的基因。突变基因经过改变，例如遗传物质的丧失、获得或交换，这影响基因的正常传递和表达。本文所用“被破坏的基因”是指具有引起提前终止密码子的突变的突变基因。破坏的基因产物相对于全长未被破坏的基因产物被截短。
本文所用“非同源末端连接(NHEJ)途径”是指在不需要同源模板的情况下通过直接连接断裂端修复DNA中的双链断裂的途径。通过NHEJ的不依赖模板的DNA再连接是在DNA断裂点随机引入微插入和微缺失(得失位(indel))的随机易错修复过程。该方法可被有意用来中断、缺失或改变靶定基因序列的读框。NHEJ通常使用称为微同源物(microhomologies)的短的同源DNA序列指导修复。这些微同源物常常存在于双链断裂末端上的单链突出端。当突出端完全相容时，NHEJ通常准确地修复断裂，然而导致核苷酸丢失的不精确修复也可能发生，但是当突出端不相容时不精确修复更普遍得多。
本文所用“正常基因”是指未经过改变例如遗传物质的丢失、获得或交换的基因。正常基因进行正常基因传递和基因表达。
本文所用“核酸酶介导的NHEJ”是指核酸酶(例如cas9)切断双链DNA后开始的NHEJ。
本文所用“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还包括所述单链的互补链。核酸的许多变体可用于与指定核酸相同的目的。因此，核酸还包括基本相同的核酸及其互补序列。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的，或可含有双链和单链序列两者的一部分。核酸可以是DNA (基因组和cDNA两者)、RNA或杂合体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，并且包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤在内的碱基的组合。可通过化学合成方法或重组方法获得核酸。
本文所用“有效连接”意指基因的表达在与之在空间上连接的启动子的控制下。启动子可位于在其控制下的基因的5' (上游)或3' (下游)。启动子与基因之间的距离可与所述启动子与它控制的基因(启动子来源于该基因)的距离大致相同。正如本领域已知，可调节该距离的变化而不丧失启动子功能。
本文所用“部分功能性”描述由突变基因编码并具有比功能性蛋白质低但比非功能性蛋白质高的生物活性的蛋白质。
本文可互换使用的“提前终止密码子”或“读框外终止密码子”是指DNA序列的无义突变，其导致通常不存在于野生型基因中的位置处的终止密码子。提前终止密码子可能引起蛋白质被截短或短于蛋白质的全长形式。
本文所用“启动子”意指能够赋予、激活或提高细胞中核酸表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特异性转录调节序列以进一步提供表达和/或改变所述序列的空间表达和/或时间表达。启动子还可包含远端增强子或阻抑蛋白元件，其可定位于距转录起始位点多达几千碱基对。启动子可来源于以下来源，包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物。就其中发生表达的细胞、组织或器官而言，或者就发生表达时的发育阶段而言，或者在响应外部刺激例如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂时，启动子可组成型或差异性地调节基因成分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵基因启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子。
本文可互换使用的“重复可变二残基”或“RVD”是指DNA识别基序内的相邻氨基酸残基对(亦称“RVD模件”)，其包括TALE DNA结合结构域的33-35个氨基酸。RVD决定RVD模件的核苷酸特异性。RVD模件可以组合以产生RVD阵列。本文所用“RVD阵列长度”是指相当于被TALEN识别的TALEN靶区(即结合区)内核苷酸序列的长度的RVD模件的数目。
本文所用“位点特异性核酸酶”是指能够特异性识别和切割DNA序列的酶。可对位点特异性核酸酶进行工程改造。工程改造的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应核酸酶(TALEN)和基于CRISPR/Cas9的系统。
本文所用“骨骼肌”是指横纹肌的类型，其在体细胞神经系统的控制下，并通过称为肌腱的胶原纤维束与骨连接。骨骼肌由称为肌细胞或“肌肉细胞”的各成分组成，有时通称为“肌纤维”。肌细胞在称为肌生成的过程中由发育的成肌细胞(产生肌肉细胞的胚胎祖细胞的一个类型)融合形成。这些长的圆柱形多核细胞亦称肌纤维。
本文所用“骨骼肌病况”是指与骨骼肌有关的病况，例如肌营养不良、老化、肌肉变性、伤口愈合和肌无力或萎缩。
本文可互换使用的“间隔区”和“间隔区域”是指介于2个TALEN或ZFN的结合区之间但非其一部分的TALEN或ZFN靶区内的区域。
本文可互换使用的“受试者”和“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如猴，例如食蟹猴(cynomolgous)或猕猴、黑猩猩等)和人)。在一些实施方案中，受试者可以是人或非人。可对受试者或患者进行其它形式的治疗。
本文所用“靶基因”是指编码已知或推定基因产物的任何核苷酸序列。靶基因可以是涉及遗传疾病的突变基因。
本文所用“靶区”是指设计位点特异性核酸酶以与之结合并切割的靶基因的区域。
本文所用“转录激活因子样效应物”或“TALE”是指识别并结合特定DNA序列的蛋白质结构。“TALE DNA结合结构域”是指包括一系列串联33-35个氨基酸重复序列的DNA结合结构域，亦称RVD模件，其各自特异性识别DNA的单一碱基对。RVD模件可以任何顺序排列以装配识别规定序列的阵列。
TALE DNA结合结构域的结合特异性由RVD阵列接着20个氨基酸的单一截短重复序列确定。TALE DNA结合结构域可具有12-27个RVD模件，其各自含有RVD并识别DNA的单一碱基对。已鉴定出识别4种可能的DNA核苷酸(A、T、C和G)每一个的特异性RVD。因为TALE DNA结合结构域是模块化的，识别4种不同的DNA核苷酸的重复序列可连接在一起以识别任何特定的DNA序列。然后，这些靶定的DNA结合结构域可与催化结构域结合以产生功能性酶，包括人工转录因子、甲基转移酶、整合酶、核酸酶和重组酶。
本文可互换使用的“转录激活因子样效应核酸酶”或“TALEN”是指核酸酶的催化结构域(例如内切核酸酶FokI)和可被定制DNA序列靶定的设计的TALE DNA结合结构域的工程改造融合蛋白。“TALEN单体”是指具有催化核酸酶结构域和设计的TALE DNA结合结构域的工程改造融合蛋白。可设计两个TALEN单体以靶向并切割TALEN靶区。
本文所用“转基因”是指含有从一种生物体分离并导入不同生物体中的基因序列的基因或遗传物质。DNA的这种非天然区段可保留在转基因生物体中产生RNA或蛋白质的能力，或可以改变转基因生物体的遗传密码的正常功能。转基因的引入具有改变生物体的表型的潜力。
本文使用的有关核酸的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列的互补序列或其部分；(iii)与参考核酸基本相同的核酸或其互补序列；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与之基本相同的序列杂交的核酸。
有关肽或多肽的“变体”是指以氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同但保留至少一种生物活性。变体还可指与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白质基本相同的氨基酸序列的蛋白质。氨基酸的保守取代，即将氨基酸用不同的性质类似(例如亲水性、带电荷区的程度和分布)的氨基酸置换在本领域被视为通常涉及少量变化。正如本领域所了解的，在某种程度上，通过考虑氨基酸的亲水指数，可鉴定这些少量变化。Kyte等, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考量。本领域已知，相似亲水指数的氨基酸可被取代并仍保留蛋白质功能。一方面，取代亲水指数为±2的氨基酸。氨基酸的亲水性还可用于揭示可产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情况下考虑氨基酸的亲水性，允许计算该肽的最大局部平均亲水性。取代可用彼此亲水性值在±2内的氨基酸进行。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者受氨基酸的特定侧链影响。要了解，与该观察结果一致，与生物功能相容的氨基酸取代取决于通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质显示的氨基酸的相对相似性，特别是那些氨基酸的侧链。
本文所用“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RN载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，优选是DNA质粒。例如，载体可编码包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的iCas9-VP64融合蛋白或SEQ ID NO: 5-40、65-144、492-515、540-563和585-625的任一个的至少一种gRNA核苷酸序列。或者，载体可编码Cas9和SEQ ID NO: 5-40、65-144、492-515、540-563和585-625的任一个的至少一种gRNA核苷酸序列。
本文所用“锌指”是指识别并结合DNA序列的蛋白质结构。锌指结构域是人蛋白质组中最常见的DNA结合基序。单一锌指含有约30个氨基酸，该结构域通常通过每碱基对的单个氨基酸侧链的相互作用，经结合DNA的3个连续的碱基对而起作用。
本文可互换使用的“锌指核酸酶”或“ZFN”是指包含与至少一种核酸酶或在完全装配时能够切割DNA的核酸酶的一部分有效连接的至少一个锌指DNA结合结构域的嵌合蛋白分子。
除非本文另有定义，否则与本公开内容联用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的意义。例如，与本文所述细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交及其技术联用的任何术语是本领域众所周知和常用的术语。术语的含义和范围应是明确的；然而在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外来定义。另外，除非文中另有要求，否则单数形式的术语应包括复数形式，复数术语应包括单数。
2. 用于基因组编辑的组合物
本发明涉及用于基因组编辑、基因组改变或改变靶基因的基因表达的组合物。组合物可包括病毒载体和例如位点特异性核酸酶或CRISPR/Cas9-系统的融合蛋白与至少一种gRNA。
a. 用于肌肉中基因组编辑的组合物
本发明涉及用于基因组编辑受试者骨骼肌或心肌中的靶基因的组合物。组合物包括修饰的AAV载体和编码位点特异性核酸酶的核苷酸序列。组合物将活性形式的位点特异性核酸酶递送至骨骼肌或心肌。组合物还可包含供体DNA或转基因。这些组合物可用于基因组编辑、基因组工程改造和纠正或降低突变在涉及遗传疾病和/或其它骨骼或心肌病况的基因中的作用。
靶基因可参与细胞的分化或其中可能需要激活、阻抑或中断基因的其它过程，或可具有突变例如缺失、移码突变或无义突变。如果靶基因具有引起提前终止密码子、异常剪接受体位点或异常剪接供体位点的突变，则可设计位点特异性核酸酶以识别并结合提前终止密码子、异常剪接受体位点或异常剪接供体位点的上游或下游的核苷酸序列。还可以使用位点特异性核酸酶通过靶向剪接受体和供体来中断正常基因剪接以诱导提前终止密码子跳跃或恢复被中断的读框。位点特异性核酸酶可能介导或不介导脱靶改变成为基因组的蛋白质编码区。
3. CRISPR系统
本文可互换使用的“成簇有规间隔短回文重复序列”和“CRISPR”是指含有存在于约40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌的基因组中的多个短的同向重复序列的基因座。CRISPR系统是微生物核酸酶系统，参与防御提供获得性免疫形式的入侵噬菌体和质粒。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相关(Cas)基因以及能够编程CRISPR介导的核酸切割特异性的非编码RNA元件的组合。将短的外来DNA区段(称为间隔区)在CRISPR重复序列之间整合到基因组中，并用作暴露后的“记忆”。Cas9与sgRNA的3’端形成复合体，该蛋白质-RNA对通过sgRNA序列的5’端和预先确定的20 bp DNA序列(称为前间区)之间的互补碱基配对识别其基因组靶。该复合体通过crRNA内编码的区域(即前间区)和病原体基因组内的前间区序列邻近基序(PAM)导向病原体DNA的同源基因座。同向重复序列内的非编码CRISPR阵列(CRISPR array)被转录并切割成含有各间隔区序列的短的crRNA，其将Cas核酸酶引导至靶位点(前间区)。通过简单交换表达的sgRNA的20 bp识别序列，Cas9核酸酶可被引向新的基因组靶标。使用CRISPR间隔区以类似于真核生物的RNAi的方式识别外源遗传元件并使之沉默。
已知CRISPR系统的3个类别(I、II和III型效应器系统)。II型效应器系统使用单一效应酶Cas9，在4个相继步骤进行靶定DNA双链断裂以切割dsDNA。与需要多个不同的效应器起复合体作用的I型和III型效应器系统相比，II型效应器系统可在非传统情况下(例如真核细胞)起作用。II型效应器系统由长的前crRNA (pre-crRNA) (其自含有间隔区的CRISPR基因座转录)、Cas9蛋白和参与前crRNA加工的tracrRNA组成。tracrRNA与分隔前crRNA的间隔区的重复区杂交，因此通过内源RNase III开始dsRNA切割。该切割接着通过Cas9在各间隔区内的第二切割事件，产生保留与tracrRNA和Cas9缔合的成熟crRNA，形成Cas9:crRNA-tracrRNA复合体。
Cas9:crRNA-tracrRNA复合体解开DNA双链体，并搜寻匹配crRNA的序列以切割。靶标识别在检测靶DNA中的“前间区”序列和crRNA中的其余间隔区序列之间的互补性时发生。如果纠正前间区序列邻近基序(PAM)还存在于前间区的3’端，则Cas9介导靶DNA的切割。对于前间区打靶，所述序列必须紧接前间区序列邻近基序(PAM)，一种被是DNA切割所必需的Cas9核酸酶识别的短序列。不同的II型系统具有不同的PAM要求。酿脓链球菌CRISPR系统可具有作为5’-NRG-3’的这种Cas9 (SpCas9)的PAM序列，其中R为A或G，并以该系统在人细胞中的特异性为特征。CRISPR/Cas9系统的独特能力是通过共表达单一Cas9蛋白与两种或更多种sgRNA同时靶向多个不同基因组基因座的直接能力。例如，酿脓链球菌II型系统天然更喜欢使用“NGG”序列，其中“N”可为任何核苷酸，但还可接受其它PAM序列，例如工程改造系统中的“NAG” (Hsu等, Nature Biotechnology (2013) doi:10.1038/nbt.2647)。同样，来源于脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的Cas9 (NmCas9)通常具有NNNNGATT的天然PAM，但具有多种PAM间的活性，包括高度简并的NNNNGNNN PAM (Esvelt等, Nature Methods (2013) doi:10.1038/nmeth.2681)。
4. 基于CRISPR/Cas9的系统
显示了在人细胞中起作用的用于基因组工程改造的酿脓链球菌的II型效应器系统的一种工程改造形式。在该系统中，通过合成再造的“指导RNA” (“gRNA”，在本文也可互换用作嵌合单一指导RNA(“sgRNA”))，其是一般避免RNase III和crRNA加工的需要的crRNA-tracrRNA融合物，Cas9蛋白指向基因组靶位点(参见图53A)。本文提供基于CRISPR/Cas9的工程改造系统用于基因组编辑和治疗遗传疾病。可设计基于CRISPR/Cas9的工程改造系统以靶向任何基因，包括涉及遗传疾病、老化、组织再生或伤口愈合的基因。基于CRISPR/Cas9的系统可包括Cas9蛋白或Cas9融合蛋白和至少一种gRNA。Cas9融合蛋白可包括例如具有不同活性对Cas9是内源的结构域，例如反式激活域。
靶基因可参与细胞的分化或其中可能需要激活基因或可具有突变例如移码突变或无义突变的其它过程。如果靶基因具有引起提前终止密码子、异常剪接受体位点或异常剪接供体位点的突变，则可设计基于CRISPR/Cas9的系统以识别并结合提前终止密码子、异常剪接受体位点或异常剪接供体位点的上游或下游的核苷酸序列。基于CRISPR-Cas9的系统也可用来通过靶向剪接受体和供体中断正常基因剪接以诱导提前终止密码子跳跃或恢复被中断的读框。基于CRISPR/Cas9的系统可能介导或不介导脱靶改变成为基因组的蛋白质编码区。
a. Cas9
基于CRISPR/Cas9的系统可包括Cas9蛋白或Cas9融合蛋白。Cas9蛋白是切割核酸的内切核酸酶，由CRISPR基因座编码，并参与II型CRISPR系统。Cas9蛋白可来自任何细菌或古细菌物种，例如酿脓链球菌。可使Cas9蛋白突变，使得核酸酶活性失活。没有内切核酸酶活性的来自酿脓链球菌的失活Cas9蛋白(iCas9，亦称“dCas9”)最近通过gRNA靶向细菌、酵母和人细胞中的基因以通过位阻使基因表达沉默。本文所用“iCas9”和“dCas9”两者是指具有氨基酸取代D10A和H840A且其核酸酶活性失活的Cas9蛋白。例如，基于CRISPR/Cas9的系统可包括SEQ ID NO: 459或461的Cas9。
b. Cas9融合蛋白
基于CRISPR/Cas9的系统可包括融合蛋白。融合蛋白可包含2个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含Cas蛋白，第二多肽结构域具有活性，例如转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸酶活性、核酸缔合活性、甲基化酶活性或脱甲基酶活性。融合蛋白可包括与具有以下活性的第二多肽结构域融合的上述Cas9蛋白或突变的Cas9蛋白：例如转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸酶活性、核酸缔合活性、甲基化酶活性或脱甲基酶活性。
(1) 转录激活活性
第二多肽结构域可具有转录激活活性，即反式激活域。例如，可通过gRNA的组合将iCas9和反式激活域的融合蛋白靶向哺乳动物启动子，实现内源哺乳动物基因例如人基因的基因表达。反式激活域可包括VP16蛋白、多种VP16蛋白，例如VP48结构域或VP64结构域或NFκB激活因子活性的p65结构域。例如，融合蛋白可为iCas9-VP64。
(2) 转录阻遏活性
第二多肽结构域可具有转录阻遏活性。第二多肽结构域可具有Kruppel相关框活性，例如KRAB结构域、ERF阻抑蛋白结构域活性、Mxi1阻抑蛋白结构域活性、SID4X阻抑蛋白结构域活性、Mad-SID阻抑蛋白结构域活性或TATA框结合蛋白活性。例如，融合蛋白可为dCas9-KRAB。
(3) 转录释放因子活性
第二多肽结构域可具有转录释放因子活性。第二多肽结构域可具有真核释放因子1 (ERF1)活性或真核释放因子3 (ERF3)活性。
(4) 组蛋白修饰活性
第二多肽结构域可具有组蛋白修饰活性。第二多肽结构域可具有组蛋白脱乙酰酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱甲基酶或组蛋白甲基转移酶活性。组蛋白乙酰转移酶可为p300或CREB结合蛋白(CBP)蛋白质或其片段。例如，融合蛋白可为dCas9-p300。
(5) 核酸酶活性
第二多肽结构域可具有不同于Cas9蛋白的核酸酶活性的核酸酶活性。核酸酶或具有核酸酶活性的蛋白质是能够切割核酸的核苷酸亚单位之间的磷酸二酯键的酶。核酸酶通常进一步分为内切核酸酶和外切核酸酶，虽然一些酶可落入两个类别内。众所周知的核酸酶是脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶。
(6) 核酸缔合活性
第二多肽结构域可具有核酸缔合活性，或者核酸结合蛋白-DNA-结合结构域(DBD)是含有识别双链或单链DNA的至少一个基序的独立折叠的蛋白质结构域。DBD可识别特定的DNA序列(识别序列)或对DNA具有普遍的亲和力。核酸缔合区选自螺旋-转角-螺旋区、亮氨酸拉链区、翼状螺旋区、翼状螺旋-转角-螺旋区、螺旋-环-螺旋区、免疫球蛋白折叠、B3结构域、锌指、HMG框、Wor3结构域、TAL效应子DNA结合结构域。
(7) 甲基化酶活性
第二多肽结构域可具有甲基化酶活性，其包括将甲基转移到DNA、RNA、蛋白质、小分子、胞嘧啶或腺嘌呤上。第二多肽结构域可包括DNA甲基转移酶。
(8) 脱甲基酶活性
第二多肽结构域可具有脱甲基酶活性。第二多肽结构域可包括从核酸、蛋白质(特别是组蛋白)和其它分子中脱去甲基(CH3-)的酶。或者，第二多肽可在使DNA脱甲基的机制中将甲基转移到羟基甲基胞嘧啶中。第二多肽可催化该反应。例如，催化该反应的第二多肽可为Tet1。
c. gRNA
gRNA提供基于CRISPR/Cas9的系统的打靶。gRNA是两种非编码RNA即crRNA和tracrRNA的融合物。sgRNA可通过交换20 bp前间区的序列(这通过与所需DNA靶的互补碱基配对赋予打靶特异性)，而靶向任何所需的DNA序列。gRNA模拟参与II型效应器系统的天然存在的crRNA:tracrRNA双链体。可包括例如42个核苷酸crRNA和75个核苷酸tracrRNA的这种双链体，起指导Cas9切割靶核酸的作用。本文可互换使用的“靶区”、“靶序列”或“前间区”是指基于CRISPR/Cas9的系统所靶向的靶基因的区域。基于CRISPR/Cas9的系统可包括至少一种gRNA，其中gRNA靶向不同的DNA序列。靶DNA序列可以是重叠的。靶序列或前间区后面是前间区3’端的PAM序列。不同的II型系统具有不同的PAM要求。例如，酿脓链球菌II型系统使用“NGG”序列，其中“N”可为任何核苷酸。
给予细胞的gRNA的数目可为至少1种gRNA、至少2种不同的gRNA、至少3种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA、至少5种不同的gRNA、至少6种不同的gRNA、至少7种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA、至少9种不同的gRNA、至少10种不同的gRNA、至少11种不同的gRNA、至少12种不同的gRNA、至少13种不同的gRNA、至少14种不同的gRNA、至少15种不同的gRNA、至少16种不同的gRNA、至少17种不同的gRNA、至少18种不同的gRNA、至少18种不同的gRNA、至少20种不同的gRNA、至少25种不同的gRNA、至少30种不同的gRNA、至少35种不同的gRNA、至少40种不同的gRNA、至少45种不同的gRNA或至少50种不同的gRNA。给予细胞的gRNA的数目可介于至少1种gRNA与至少50种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少45种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少40种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少35种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少30种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少25种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少20种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少16种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少12种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少8种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少4种不同的gRNA、至少4种gRNA与至少50种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少45种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少40种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少35种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少30种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少25种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少20种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少16种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少12种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少8种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少50种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少45种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少40种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少35种不同的gRNA、8种不同的gRNA与至少30种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少25种不同的gRNA、8种不同的gRNA与至少20种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少16种不同的gRNA或8种不同的gRNA与至少12种不同的gRNA之间。
gRNA可包含靶DNA序列的互补多核苷酸序列接着PAM序列。gRNA可在互补多核苷酸序列5’端包含“G”。gRNA可包含靶DNA序列的至少10个碱基对、至少11个碱基对、至少12个碱基对、至少13个碱基对、至少14个碱基对、至少15个碱基对、至少16个碱基对、至少17个碱基对、至少18个碱基对、至少19个碱基对、至少20个碱基对、至少21个碱基对、至少22个碱基对、至少23个碱基对、至少24个碱基对、至少25个碱基对、至少30个碱基对或至少35个碱基对互补多核苷酸序列接着PAM序列。PAM序列可为“NGG”，其中“N”可为任何核苷酸。gRNA可靶向启动子区、增强子区或靶基因的转录区的至少一个。gRNA可包括SEQ ID NO: 5-40、65-144、492-515、540-563、585-625、462 (图40)、464 (图41)和465 (图41)的至少一个的核酸序列。
gRNA可靶向任何核酸序列。核酸序列靶可以是DNA。DNA可以是任何基因。例如，gRNA可靶向基因，例如BRN2、MYT1L、ASCL1、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2、MYOD1、OCT4和DMD。
(1) 肌养蛋白
肌养蛋白是一种杆状胞质蛋白质，其是肌纤维的细胞骨架与遍及细胞膜的周围胞外基质连接的蛋白质复合体的一部分。肌养蛋白提供细胞膜的营养不良蛋白聚糖复合体的结构稳定性。肌养蛋白基因是位于基因座Xp21的2.2兆碱基。初级转录测量约2,400 kb，其成熟mRNA为约14 kb。79个外显子编码超过3500个氨基酸的蛋白质。正常骨骼肌组织只含少量的肌养蛋白，但其存在的异常表达导致发生严重和无法治愈的症状。肌养蛋白基因中的一些突变导致在受累患者中产生有缺陷的肌养蛋白和严重的营养不良表型。肌养蛋白基因中的一些突变在受累患者中导致部分功能性肌养蛋白和更轻微得多的营养不良表型。
DMD是引起肌养蛋白基因中的无义突变或移码突变的遗传突变或自发突变的结果。对于DMD，天然存在的突变及其后果是相对充分了解的。已知rod结构域内所含的外显子45-55区中出现的符合读框的缺失可产生高度功能性肌养蛋白，而且许多携带者是无症状的或显示轻微症状。此外，理论上，可通过靶向肌养蛋白基因的这个区域的外显子来治疗超过60%的患者。已尝试通过在mRNA剪接期间跳过非必需外显子以产生内部缺失但有功能的肌养蛋白，以恢复DMD患者中的中断的肌养蛋白读框。内部肌养蛋白外显子的缺失保留合适的读框，但引起较不严重的贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy)。
(2) 靶向肌养蛋白的基于CRISPR/Cas9的系统
本文公开了对肌养蛋白基因有特异性的基于CRISPR/Cas9的系统。基于CRISPR/Cas9的系统可包括Cas9和至少一种gRNA以靶向肌养蛋白基因。基于CRISPR/Cas9的系统可结合并识别靶区。可以选择紧接可能的读框外终止密码子上游的靶区，使得修复过程期间的插入或缺失通过读框转换恢复肌养蛋白读框。靶区还可以是剪接受体位点或剪接供体位点，使得修复过程期间的插入或缺失通过剪接位点中断和外显子排除中断剪接并恢复肌养蛋白读框。靶区还可以是异常终止密码子，使得修复过程期间的插入或缺失通过消除或中断终止密码子来恢复肌养蛋白读框。
可设计单一或多种sgRNA，通过靶向外显子45-55处的突变热点并引入外显子内的小的插入和缺失或大的一个或多个外显子的缺失，恢复肌养蛋白读框。在用Cas9和一种或多种sgRNA处理后，体外杜兴肌营养不良患者肌细胞中的肌养蛋白表达可恢复。在将遗传纠正的患者细胞移植入免疫缺陷型小鼠体内后，检出了人肌养蛋白。重要的是，CRISPR/Cas9系统独特的多重基因编辑能力使得能够通过通用编辑方法或患者特异性基因编辑方法有效地产生该突变热区的大的缺失，这可纠正高达62%的患者突变。
基于CRISPR/Cas9的系统可使用不同序列和长度的gRNA。gRNA的实例可参见表6。基于CRISPR/Cas9的系统可靶向SEQ ID NO :65-144的核酸序列或其互补序列。gRNA可包括SEQ ID NO: 65-144的核苷酸序列或其互补序列。例如，对所公开的基于CRISPR/Cas9的系统进行工程改造以介导肌养蛋白基因的外显子51处的高度有效的基因编辑。这些基于CRISPR/Cas9的系统在DMD患者的细胞中恢复肌养蛋白表达。
(a) 外显子51和45-55
外显子51通常与DMD中读框破坏性缺失邻接。通过外显子跳跃排除肌养蛋白转录物的外显子51可用于治疗所有DMD患者的约15%。这类DMD突变理论上适于通过基于NHEJ的基因组编辑和HDR的永久性纠正。开发了本文描述的基于CRISPR/Cas9的系统用于人肌养蛋白基因中外显子51靶定修饰。这些基于CRISPR/Cas9的系统被转染至人DMD细胞中，并介导有效的基因修饰和转换以纠正读框。蛋白质修复伴随读框修复，并在大群基于CRISPR/Cas9的系统处理细胞中检出。同样，肌养蛋白转录物的外显子45-55的排除可用于治疗所有DMD患者的约62%。
(3) AAV/CRISPR构建体
可使用不同的构建体配置，将AAV用于递送CRISPR (参见图39)。例如，AAV可递送各个载体中的Cas9和gRNA表达盒。或者，如果使用来源于例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或脑膜炎奈瑟球菌等菌种的小的Cas9蛋白，则在4.7 kb包装限内的单一AAV载体可结合Cas9和至多两个gRNA表达盒两者(参见图39)。
5.基于多个CRISPR/Cas9的系统
本公开内容涉及基于多个CRISPR/Cas9的系统(其包括基于CRISPR/CRISPR相关(Cas) 9的系统，例如Cas9或dCas9)和多种gRNA以靶向一个或多个内源基因。这个平台利用便利的Golden Gate克隆方法以将多达4个独立的sgRNA表达盒快速并入单一慢病毒载体中。各sgRNA有效地表达，并可在永生化和原代人细胞系中介导不同基因座上的多重基因编辑。已表明通过1-4种sgRNA的协同激活，稳定表达dCas9-VP64的细胞系中的瞬时转录激活是可调节的。此外，单一慢病毒载体可在永生化和原代人细胞中诱导持久长期的内源基因表达。该系统允许单一慢病毒载体的快速装配，这使在模型和原代细胞系中的多重基因编辑或激活成为可能。
基于多个CRISPR/Cas9的系统提供转录激活和转录激活的可调节诱导的效能。除自独立启动子的1、2、3或4种sgRNA表达以外，通过Golden Gate装配容易产生的最终载体表达组成型Cas9或dCas9-VP64。各启动子能够有效地表达指导类似水平的Cas9核酸酶活性的sgRNA。此外，表达Cas9和靶向独立基因座的4种sgRNA的单一载体的慢病毒递送导致所有4个基因座的同时多重基因编辑。使用有或没有sgRNA的Cas9的慢病毒递送，实现了在瞬时和不稳定的两种情况下2种内源基因的可调节转录激活。实现了原代人细胞中十分有效的长期基因激活。该系统因此是在人细胞中产生多重基因编辑和长期转录激活的有吸引力的有效方法。
基于多个CRISPR/Cas9的系统允许有效的多重基因编辑以同时使多个基因失活。CRISPR/Cas9系统可通过共表达单一Cas9蛋白与两种或更多种sgRNA，使该系统特别适用于多重基因编辑或协同激活应用，来同时靶向多个不同的基因组基因座。CRISPR/Cas9系统通过简单的修饰表达的sgRNA分子，极大地加快完成分子靶向新位点的过程。单一慢病毒载体可与各种方法联合，通过化学或光遗传学调节，实现这些成分的诱导型控制，以促进在时间和空间两者上基因调节的动力学的研究。
基于多个CRISPR/Cas9的系统可在转录上激活两个或更多个内源基因。基于多个CRISPR/Cas9的系统可在转录上阻抑两个或更多个内源基因。例如，至少两个内源基因、至少3个内源基因、至少4个内源基因、至少5个内源基因或至少10个内源基因可被基于多个CRISPR/Cas9的系统激活或阻抑。介于2个和15个之间的基因，介于2个和10个之间的基因，介于2个和5个之间的基因，介于5个和15个之间的基因或介于5个和10个之间的基因可被基于多个CRISPR/Cas9的系统激活或阻抑。
(1) 修饰的慢病毒载体
基于多个CRISPR/Cas9的系统包括修饰的慢病毒载体。修饰的慢病毒载体包括编码融合蛋白的第一多核苷酸序列和编码至少一种sgRNA的第二多核苷酸序列。融合蛋白可以是上述基于CRISPR/Cas9的系统的融合蛋白。第一多核苷酸序列可与启动子有效连接。启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子或可调节启动子。
第二多核苷酸序列编码至少1种sgRNA。例如，第二多核苷酸序列可编码至少1种sgRNA、至少2种sgRNA、至少3种sgRNA、至少4种sgRNA、至少5种sgRNA、至少6种sgRNA、至少7种sgRNA、至少8种sgRNA、至少9种sgRNA、至少10种sgRNA、至少11种sgRNA、至少12种sgRNA、至少13种sgRNA、至少14种sgRNA、至少15种sgRNA、至少16种sgRNA、至少17种sgRNA、至少18种sgRNA、至少19种sgRNA、至少20种sgRNA、至少25种sgRNA、至少30种sgRNA、至少35种sgRNA、至少40种sgRNA、至少45种sgRNA或至少50种sgRNA。第二多核苷酸序列可编码介于以下的sgRNA：1种sgRNA和50种sgRNA、1种sgRNA和45种sgRNA、1种sgRNA和40种sgRNA、1种sgRNA和35种sgRNA、1种sgRNA和30种sgRNA、1种sgRNA和25种不同的sgRNA、1种sgRNA和20种sgRNA、1种sgRNA和16种sgRNA、1种sgRNA和8种不同的sgRNA、4种不同的sgRNA和50种不同的sgRNA、4种不同的sgRNA和45种不同的sgRNA、4种不同的sgRNA和40种不同的sgRNA、4种不同的sgRNA和35种不同的sgRNA、4种不同的sgRNA和30种不同的sgRNA、4种不同的sgRNA和25种不同的sgRNA、4种不同的sgRNA和20种不同的sgRNA、4种不同的sgRNA和16种不同的sgRNA、4种不同的sgRNA和8种不同的sgRNA、8种不同的sgRNA和50种不同的sgRNA、8种不同的sgRNA和45种不同的sgRNA、8种不同的sgRNA和40种不同的sgRNA、8种不同的sgRNA和35种不同的sgRNA、8种不同的sgRNA和30种不同的sgRNA、8种不同的sgRNA和25种不同的sgRNA、8种不同的sgRNA和20种不同的sgRNA、8种不同的sgRNA和16种不同的sgRNA、16种不同的sgRNA和50种不同的sgRNA、16种不同的sgRNA和45种不同的sgRNA、16种不同的sgRNA和40种不同的sgRNA、16种不同的sgRNA和35种不同的sgRNA、16种不同的sgRNA和30种不同的sgRNA、16种不同的sgRNA和25种不同的sgRNA或16种不同的sgRNA和20种不同的sgRNA。编码不同sgRNA的多核苷酸序列各自可与启动子有效连接。与不同的sgRNA有效连接的启动子可以是相同的启动子。与不同的sgRNA有效连接的启动子可以是不同的启动子。启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子或可调节启动子。
至少一种sgRNA可与靶基因或基因座结合。如果包括一种以上的sgRNA，则sgRNA各自与一个靶基因座内的不同靶区结合或sgRNA各自与不同基因座内的不同靶区结合。融合蛋白可包括Cas9蛋白或iCas9-VP64蛋白。融合蛋白可包括VP64结构域、p300结构域或KRAB结构域。
6. 位点特异性核酸酶
上述组合物包括编码结合并切割靶区的位点特异性核酸酶的核苷酸序列。可对位点特异性核酸酶进行工程改造。例如，工程改造的位点特异性核酸酶可以是基于CRISPR/Cas9的系统、ZFN或TALEN。位点特异性核酸酶可结合和切割骨骼肌或心肌中的细胞的基因组的基因或基因座。例如，基因或基因座可以是Rosa26基因座或肌养蛋白基因。
a. 基于CRISPR/Cas9的系统
上述基于CRISPR/Cas9的系统可用于在靶定的基因组基因座处引入位点特异性双链断裂。
b. 锌指核酸酶(ZFN)
位点特异性核酸酶可以是ZFN。单个锌指含有约30个氨基酸，该结构域通过每碱基对的单个氨基酸侧链的相互作用，经结合DNA的3个连续的碱基对起作用。锌指基序的模块结构允许几个结构域串联连接，允许识别并靶向多重的3个核苷酸的延长序列。这些靶定的DNA结合结构域可与核酸酶结构域(例如FokI)组合，以产生可在靶定的基因组基因座上引入位点特异性双链断裂的位点特异性核酸酶，称为“锌指核酸酶” (ZFN)。这种DNA切割刺激天然DNA修复机器，导致两种可能的修复途径之一，NHEJ和HDR。例如，ZFN可靶向Rosa26基因座(Perez-Pinera等，Nucleic Acids Research (2012) 40:3741-3752)或肌养蛋白基因。ZFN的实例见表1和图35-38。表1中，DNA识别螺旋用下划线表示，“Fok ELD-S”和“Fok KKR-S”是指与锌指蛋白DNA结合结构域融合的FokI核酸酶结构域。在图35-38中，靶位点中的靶DNA序列(即SEQ ID NO: 442、445、448、和453中)和ZFN氨基酸序列(即SEQ ID NO: 443、444、446、447、449-452、454和455)中的DNA识别螺旋分别用下划线表示。
表1 鉴定的ZFN的完全氨基酸序列。
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c. TAL效应核酸酶(TALEN)
TALEN可用于将位点特异性双链断裂引入靶定的基因组基因座上。当2个独立的TALEN与附近的DNA序列结合，从而允许FokI二聚化并切割靶DNA时，产生位点特异性双链断裂。由于其成功有效的遗传修饰的高速率所致，TALEN具有高级基因组编辑。这种DNA切割可刺激天然DNA修复机器，导致两种可能的修复途径之一：同源指导修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)途径。可设计TALEN以靶向涉及遗传疾病的任何基因。
TALEN可包括核酸酶和结合TALEN靶区中的靶基因的TALE DNA结合结构域。靶基因可具有突变例如移码突变或无义突变。如果靶基因具有引起提前终止密码子的突变，则可设计TALEN以识别并结合提前终止密码子上游或下游的核苷酸序列。“TALEN靶区”包括2个TALEN的结合区和出现在结合区之间的间隔区。2个TALEN结合TALEN靶区内的不同结合区，之后TALEN靶区被切割。TALEN的实例描述于国际专利申请号PCT/US2013/038536，其通过引用以其整体结合到本文中。
7. 转录激活因子
上述组合物，包括编码激活基因的转录激活因子的核苷酸序列。可对转录激活因子进行工程改造。例如，工程改造的转录激活因子可以是基于CRISPR/Cas9的系统、锌指融合蛋白或TALE融合蛋白。
a. 基于CRISPR/Cas9的系统
上述基于CRISPR/Cas9的系统可用来与RNA一起激活靶基因的转录。基于CRISPR/Cas9的系统可包括上述融合蛋白，其中第二多肽结构域具有转录激活活性或组蛋白修饰活性。例如，第二多肽结构域可包括VP64或p300。
b. 锌指融合蛋白
转录激活因子可以是锌指融合蛋白。靶定上述DNA结合结构域的锌指可与具有转录激活活性或组蛋白修饰活性的结构域组合。例如，结构域可包括VP64或p300。
c. TALE融合蛋白
TALE融合蛋白可用来激活靶基因的转录。TALE融合蛋白可包括TALE DNA结合结构域和具有转录激活活性或组蛋白修饰活性的结构域。例如，结构域可包括VP64或p300。
8. 组合物
本发明涉及用于改变细胞或受试者中的基因表达和工程改造或改变基因组DNA的组合物。组合物还可包括病毒递送系统。
a. 用于肌肉中的基因组编辑的组合物
本发明涉及在受试者骨骼肌或心肌中进行靶基因的基因组编辑的组合物。组合物包括修饰的AAV载体和编码位点特异性核酸酶的核苷酸序列。组合物将活性形式的位点特异性核酸酶递送至骨骼肌或心肌。组合物还可包含供体DNA或转基因。这些组合物可用于基因组编辑、基因组工程改造和纠正或降低突变在涉及遗传疾病和/或其它骨骼或心肌病况的基因中的作用。
靶基因可参与细胞的分化或其中可能需要激活、阻抑或中断基因的其它过程，或可具有突变例如缺失、移码突变或无义突变。如果靶基因具有引起提前终止密码子、异常剪接受体位点或异常剪接供体位点的突变，则可设计位点特异性核酸酶以识别并结合提前终止密码子、异常剪接受体位点或异常剪接供体位点的上游或下游的核苷酸序列。还可以使用位点特异性核酸酶通过靶向剪接受体和供体来中断正常基因剪接以诱导提前终止密码子跳跃或恢复被中断的读框。位点特异性核酸酶可能介导或不介导脱靶改变成为基因组的蛋白质编码区。
b. 腺伴随病毒载体
上述组合物包括修饰的腺伴随病毒(AAV)载体。修饰的AAV载体可具有改进的心肌和骨骼肌组织嗜性。修饰的AAV载体将能够在哺乳动物细胞中递送和表达位点特异性核酸酶。例如，修饰的AAV载体可以是AAV-SASTG载体(Piacentino等 (2012) Human GeneTherapy 23:635-646)。修饰的AAV载体在体内可将核酸酶递送至骨骼和心肌。修饰的AAV载体可基于几种衣壳类型的一种或多种，包括AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9。修饰的AAV载体可基于通过全身和局部递送有效转导骨骼肌或心肌的具有备选的嗜肌性AAV衣壳的AAV2准型，例如AAV2/1、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8、AAV2/9、AAV2.5和AAV/SASTG载体(Seto等,Current Gene Therapy (2012) 12:139-151)。
c. 基于CRISPR/Cas9的系统
本公开内容还提供DNA打靶系统或至少一个上述基于CRISPR/Cas9的系统的组合物。这些组合物可用于基因组编辑、基因组工程改造和纠正或降低涉及遗传疾病的基因突变的作用。组合物包括基于CRISPR/Cas9的系统，其包括上述Cas9蛋白或Cas9融合蛋白。基于CRISPR/Cas9的系统还可包括至少一种上述gRNA。
d. 基于多个CRISPR/Cas9的系统
本公开内容还提供上述基于多个CRISPR/Cas9的系统。这些组合物可用于基因组编辑、基因组工程改造和纠正或降低涉及遗传疾病的基因突变的作用。这些组合物可用来靶向一个以上的基因。组合物包括修饰的慢病毒载体，其包含包括上述Cas9蛋白或Cas9融合蛋白和一种以上的上述gRNA的基于CRISPR/Cas9的系统。
9. 使用方法
组合物的潜在应用在科学和生物工程学的多个领域中是多种多样的。所公开的组合物可用来修复引起疾病的遗传突变。所公开的组合物可用来中断基因使得基因中断导致肌肉再生或肌肉强度增加，或肌肉老化减弱。所公开的组合物可用来引入治疗性基因从骨骼肌或心肌起在全身表达，例如凝血因子或单克隆抗体。所公开的组合物可用来调节哺乳动物基因表达。所公开的组合物可用来转分化或诱导细胞分化或纠正细胞中的突变基因。提供了激活与细胞和基因疗法、遗传重编程和再生医学有关的基因的实例。RNA指导的转录激活因子可用来重编程细胞谱系规格。对于遗传重编程、转分化和/或诱导分化，激活编码细胞命运的关键调节因子的内源基因，而不是迫使这些因子过量表达，可能导致更快速有效的稳定的特异性方法。
10. 肌肉中基因组编辑的方法
本公开内容涉及在受试者骨骼肌或心肌中进行基因组编辑的方法。所述方法包括如上所述将组合物给予受试者的骨骼肌或心肌用于在骨骼肌或心肌中进行基因组编辑。基因组编辑可包括纠正突变基因或插入转基因。纠正突变基因可包括缺失、重排或置换突变基因。纠正突变基因可包括核酸酶介导的NHEJ或HDR。
11. 使用基于CRISPR/Cas9的系统的方法
基于CRISPR/Cas9的系统的潜在应用在科学和生物工程学的多个领域中是多种多样的。所公开的基于CRISPR/Cas9的系统可用来调节哺乳动物基因表达。所公开的基于CRISPR/Cas9的系统可用来转分化或诱导细胞分化或纠正细胞中的突变基因。提供了激活与细胞和基因疗法、遗传重编程和再生医学有关的基因的实例。RNA指导的转录激活因子可用来重编程细胞谱系规格。虽然在这些实验中重编程是不完全的和无效率的，但是仍有可对该方法加以改进的许多方式，包括iCas9-VP64/gRNA组合的重复转染、这些因子的稳定表达和靶向多个基因，除Ascl1用于转分化成为神经元表型以外例如Brn2和Myt1l。对于细胞的遗传重编程和转分化或诱导分化，激活编码细胞命运的关键调节因子的内源基因，而不是迫使这些因子过量表达，可能导致更快速有效的稳定的特异性方法。最后，与其它结构域的Cas9融合物，包括阻抑和外遗传修饰性结构域，可提供RNA指导转录调节因子的较大多样性以补充用于哺乳动物细胞工程改造的其它基于RNA的工具。
a. 激活基因表达的方法
本公开内容提供根据使用上述基于CRISPR/Cas9的系统通过RNA靶向启动子的转录激活因子，激活内源基因(例如哺乳动物基因)表达的机制。这根本不同于基于工程改造序列特异性DNA结合蛋白的前述方法，并可提供靶定基因调节的机会。因为gRNA表达质粒的产生只包括合成2个短的定制寡核苷酸和1个克隆步骤，所以可能快速和节约地产生许多新的基因激活因子。gRNA还可在体外转录后被直接转染至细胞中。显示了靶向单一启动子的多种gRNA，但同时靶向多个动子也将是可能的。用RNA而不是蛋白质识别基因组靶位点还可以克服靶向外遗传修饰的位点(例如甲基化DNA)的限制。
与基于工程改造的DNA结合蛋白的现行方法形成对比，与转录激活结构域融合的Cas9可被指导RNA分子的组合靶定以诱导内源人基因的表达。这种用于靶定基因激活的简单且通用的方法克服了对工程改造的新的蛋白质的需要，并允许广泛合成基因调节。
所述方法可包括将上述基于CRISPR/Cas9的系统、编码所述基于CRISPR/Cas9的系统的多核苷酸或载体或DNA打靶系统或至少一个基于CRISPR/Cas9的系统的组合物给予细胞或受试者。所述方法可包括给予基于CRISPR/Cas9的系统，例如给予含有转录激活结构域的Cas9融合蛋白或编码所述Cas9融合蛋白的核苷酸序列。Cas9融合蛋白可包括转录激活结构域例如VP16蛋白或转录辅激活蛋白例如p300蛋白。
(1)dCas9-VP16
Cas9融合蛋白可包括转录激活结构域例如VP16蛋白。转录激活结构域可含有至少1种VP16蛋白、至少2种VP16蛋白、至少3种VP16蛋白、至少4种VP16蛋白(即VP64激活因结构域)、至少5种VP16蛋白、至少6种VP16蛋白、至少6种VP16蛋白或至少10种VP16蛋白。Cas9蛋白可以是其中核酸酶活性失活的Cas9蛋白。例如，融合蛋白中的Cas9蛋白可以是iCas9(SEQ ID NO: 1的氨基酸36-1403)，其包括D10A和H840A的氨基酸取代。Cas9融合蛋白可以是iCas9-VP64。
(2)dCas9-p300
Cas9融合蛋白可包括转录共激活结构域例如p300蛋白。p300蛋白(亦称EP300或E1A结合蛋白p300)由EP300基因编码，调节整个机体组织中许多基因的活性。p300蛋白在调节细胞生长和分裂、促进细胞成熟和呈特化功能(分化)和防止癌性肿瘤的生长中起作用。p300蛋白通过连接转录因子与在细胞核中执行转录的蛋白质复合体而激活转录。p300与转录因子的相互作用以下p300结构域的一个或多个的控制：核受体相互作用结构域(RID)、CREB和MYB相互作用结构域(KIX)、半胱氨酸/组氨酸区(TAZ1/CH1和TAZ2/CH3)和干扰素反应结合结构域(IBiD)。p300的最后4种结构域KIX、TAZ1、TAZ2和IBiD，各自与跨越转录因子p53的两个反式激活域9aaTAD的序列紧密结合。该蛋白质起通过染色质重建调节转录的组蛋白乙酰转移酶的作用，并且在细胞增殖和分化过程中是重要的。它通过与磷酸化CREB蛋白特异性结合介导cAMP-基因调节。
p300蛋白可激活母体抗十五褶同源物7 (Mothers against decapentaplegichomolog 7)、MAF、TSG101、过氧化物酶体增殖物激活受体α、NPAS2、PAX6、DDX5、MYBL2、母体抗十五褶同源物1、母体抗十五褶同源物2、淋巴样细胞增强子结合因子1 (Lymphoidenhancer-binding factor)、SNIP1、TRERF1、STAT3、EID1、RAR相关孤儿受体α、ELK1、HIF1A、ING5、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、SS18、TCF3、Zif268、雌激素受体α、GPS2、MyoD、YY1、ING4、PROX1、CITED1、HNF1A、MEF2C、MEF2D、MAML1、Twist转录因子、PTMA、IRF2、DTX1、Flap结构特异性内切核酸酶1、肌细胞特异性增强子因子2A、CDX2、BRCA1、HNRPU、STAT6、CITED2、RELA、TGS1、CEBPB、Mdm2、NCOA6、NFATC2、甲状腺激素受体α、BCL3、TFAP2A、PCNA、P53和TAL1。
转录共激活结构域可包括人p300蛋白或其片段。转录共激活结构域可包括野生型人p300蛋白或突变型人p300蛋白或其片段。转录共激活结构域可包括人p300蛋白的核心赖氨酸-乙酰转移酶结构域，即p300 HAT核心(亦称“p300 WT核心”；参见图58)。Cas9蛋白可以是其中核酸酶活性失活的Cas9蛋白。例如，融合蛋白中的Cas9蛋白可以是iCas9 (SEQ IDNO: 1的氨基酸36-1403)，其包括D10A和H840A的氨基酸取代。Cas9融合蛋白可以是iCas9-p300 WT核心。
(3)gRNA
所述方法还可包括将基于CRISPR/Cas9的系统和至少一种gRNA给予细胞或受试者，其中gRNA靶向不同的DNA序列。靶DNA序列可以是重叠的。给予细胞的gRNA的数目可为至少1种gRNA、至少2种不同的gRNA、至少3种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA、至少5种不同的gRNA、至少6种不同的gRNA、至少7种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA、至少9种不同的gRNA、至少10种不同的gRNA、至少11种不同的gRNA、至少12种不同的gRNA、至少13种不同的gRNA、至少14种不同的gRNA、至少15种不同的gRNA、至少16种不同的gRNA、至少17种不同的gRNA、至少18种不同的gRNA、至少18种不同的gRNA、至少20种不同的gRNA、至少25种不同的gRNA、至少30种不同的gRNA、至少35种不同的gRNA、至少40种不同的gRNA、至少45种不同的gRNA或至少50种不同的gRNA。给予细胞的gRNA的数目可介于以下之间：至少1种gRNA与至少50种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少45种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少40种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少35种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少30种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少25种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少20种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少16种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少12种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少8种不同的gRNA、至少1种gRNA与至少4种不同的gRNA、至少4种gRNA与至少50种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少45种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少40种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少35种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少30种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少25种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少20种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少16种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少12种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA与至少8种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少50种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少45种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少40种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少35种不同的gRNA、8种不同的gRNA与至少30种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少25种不同的gRNA、8种不同的gRNA与至少20种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少16种不同的gRNA、8种不同的gRNA与至少12种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA与至少8种不同的gRNA。
gRNA可包含靶DNA序列的互补多核苷酸序列接着是NGG。gRNA可在互补多核苷酸序列5’端包含“G”。gRNA可包含至少10个碱基对、至少11个碱基对、至少12个碱基对、至少13个碱基对、至少14个碱基对、至少15个碱基对、至少16个碱基对、至少17个碱基对、至少18个碱基对、至少19个碱基对、至少20个碱基对、至少21个碱基对、至少22个碱基对、至少23个碱基对、至少24个碱基对、至少25个碱基对、至少30个碱基对或至少35个碱基对靶DNA序列的互补多核苷酸序列接着是NGG。gRNA可靶向启动子区、增强子区或靶基因的转录区的至少一个。gRNA可包括SEQ ID NO: 5-40、65-144、492-515、540-563和585-625的至少一个的核酸序列。
b. 阻抑基因表达的方法
本公开内容提供使用上述基于CRISPR/Cas9的系统通过RNA，根据靶向基因组调节元件(例如远端增强子)阻抑内源基因(例如哺乳动物基因)表达的机制。Cas9融合蛋白可包括转录阻抑蛋白，例如KRAB阻抑蛋白。Cas9融合蛋白可以是dCas9-KRAB。dCas9-KRAB另外可通过将异染色质形成因子募集至靶定基因座而影响外遗传基因调节。CRISPR/dCas9-KRAB系统可用来阻抑基因的转录，但还可用来靶向通过之前通过传统阻抑方法(例如RNA干扰)达不到的基因组调节元件(图53B)。用靶定远端增强子的gRNA递送dCas9-KRAB可中断表达受该靶定增强子调节的多个基因(参见图53C)。靶定的增强子可以是基因的任何增强子，例如HS2增强子。
a. 转分化或诱导分化的方法
本公开内容提供通过使用上述基于CRISPR/Cas9的系统通过RNA激活内源基因来使细胞转分化或诱导细胞分化的机制。
(1)转分化
基于CRISPR/Cas9的系统可用来使细胞转分化。转分化，亦称谱系重编程或直接转换，是其中细胞从一种分化的细胞类型转化成另一种而无需经历中间多能状态或祖细胞类型的过程。它是一种化生类型，包括所有细胞命运转变，包括干细胞的相互转换。细胞的转分化对于疾病建模、药物研发、基因疗法和再生医学具有潜在用途。例如BRN2、MYT1L、ASCL1、NANOG和/或MYOD1等内源基因的激活，使用上述基于CRISPR/Cas9的系统可导致若干细胞类型例如成纤维细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、间质祖细胞、造血干细胞或平滑肌细胞分别转分化成神经元和肌源表型。
(2)诱导分化
基于CRISPR/Cas9的系统可用来诱导例如干细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、间质祖细胞、造血干细胞或平滑肌细胞等的细胞分化。例如干细胞，例如胚胎干细胞或多能干细胞可被诱导分化成肌细胞或血管内皮细胞，即诱导神经元或生肌分化。
12.基于多个CRISPR/Cas9的系统的应用
基于多个CRISPR/Cas9的系统利用sgRNA设计的简便性和低成本，并可采用CRISPR/Cas9技术以助于利用高通量基因组研究的进展。例如，本文所述单一慢病毒载体可用于在不同的细胞系(例如本文所述原代成纤维细胞)中表达Cas9和多种sgRNA (图47)。基于多个CRISPR/Cas9的系统可与上述基于CRISPR/Cas9的系统的相同方式使用。
除了所述转录激活和核酸酶功能性以外，该系统还可用于表达控制外遗传修饰的其它新的基于Cas9的效应器用于各种目的，包括基因组体系结构和内源基因调节途径的研究。由于内源基因调节在多种酶之间的微妙平衡，具有不同功能性的多重Cas9系统将允许检查不同调节信号间的复杂的相互作用。本文所述载体应与适体修饰的sgRNA和直向同源的Cas9相容以使使用一套sgRNA独立遗传操作成为可能。
可使用基于多个CRISPR/Cas9的系统以激活细胞中的至少一个内源基因。所述方法包括使细胞与修饰的慢病毒载体接触。内源基因可被瞬时激活或稳定激活。内源基因可被瞬时阻抑或稳定阻抑。融合蛋白可以与sgRNA相似的水平表达。融合蛋白可以与sgRNA相比不同的水平表达。细胞可以是原代人细胞。
基于多个CRISPR/Cas9的系统可用于在细胞中进行多重基因编辑的方法。所述方法包括使细胞与修饰的慢病毒载体接触。多重基因编辑可包括纠正突变基因或插入转基因。纠正突变基因可包括缺失、重排或置换突变基因。纠正突变基因可包括核酸酶介导的非同源末端连接或同源指导修复。多重基因编辑可包括缺失或纠正至少一个基因，其中基因是内源正常基因或突变基因。多重基因编辑可包括缺失或纠正至少两个基因。例如，至少2个基因、至少3个基因、至少4个基因、至少5个基因、至少6个基因、至少7个基因、至少8个基因、至少9个基因或至少10个基因可缺失或纠正。
基于多个CRISPR/Cas9的系统可用于在细胞中多重调节基因表达的方法。所述方法包括使细胞与修饰的慢病毒载体接触。所述方法可包括调节至少一个基因的基因表达水平。当与至少一个靶基因的正常基因表达水平相比至少一个靶基因的基因表达水平提高或降低时，至少一个靶基因的基因表达被调节。基因表达水平可以是RNA或蛋白质水平。
13.纠正突变基因和治疗受试者的方法
本公开内容还涉及纠正受试者的突变基因的方法。所述方法包括将组合物给予受试者的骨骼肌或心肌用于在上述骨骼肌或心肌中进行基因组编辑。组合物将位点特异性核酸酶递送至骨骼肌或心肌的用途可用修复模板或供体DNA恢复完全功能性或部分功能性蛋白质的表达，这可置换整个基因或含有突变的区域。位点特异性核酸酶可用来将位点特异性双链断裂引入靶定的基因组基因座中。当位点特异性核酸酶与靶DNA序列结合，因此允许切割靶DNA时，造成位点特异性双链断裂。这种DNA切割可刺激天然DNA修复机器，导致两种可能的修复途径之一：同源指导修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)途径。
本公开内容涉及在没有修复模板的情况下用位点特异性核酸酶进行基因组编辑，这可有效地纠正读框并恢复涉及遗传疾病的功能性蛋白质的表达。所公开的位点特异性核酸酶可包括采用同源指导修复或基于核酸酶介导的非同源末端连接(NHEJ)的纠正方法，其使得在可能不适于同源重组或基于选择的基因纠正的增殖受限制的原代细胞系中的有效纠正成为可能。这种策略将有活性的位点特异性核酸酶的快速稳健的装配与有效的基因编辑方法整合用于治疗由引起移码、提前终止密码子、异常剪接供体位点或异常剪接受体位点的非必需编码区中的突变所引起的遗传疾病。
a. 核酸酶介导的非同源末端连接
从内源突变基因修复蛋白质表达可以通过无模板NHEJ介导的DNA修复。与靶向靶基因RNA的瞬时方法形成对比，通过瞬时表达位点特异性核酸酶纠正基因组中的靶基因读框可导致各个修饰细胞及其所有子代永久性地恢复靶基因表达。
核酸酶介导的NHEJ基因纠正可纠正突变的靶基因，并提供优于HDR途径的若干潜在优势。例如，NHEJ不需要可能引起非特异性插入诱变的供体模板。与HDR形成对比，NHEJ在细胞周期的所有阶段都有效地操作，因此可有效用于周期中的细胞和有丝分裂后细胞(例如肌纤维)两者中。相对于基于寡核苷酸的外显子跳跃或终止密码子的药理学强制通读以外，这提供备选的稳健的永久性基因修复，并且在理论上将需要少至一种药物治疗。除本文所述质粒电穿孔方法以外，使用基于CRISPR/Cas9的系统的基于NHEJ的基因纠正，以及包括大范围核酸酶和锌指核酸酶的其它工程改造的核酸酶可与用于基于细胞和基因的疗法的其它现行离体和体内平台联合。例如，通过基于mRNA的基因转移的CRISPR/Cas9型系统的递送或作为纯化的细胞可渗透蛋白质可使不含DNA的基因组编辑方法成为可能，所述方法可克服插入诱变的任何可能性。
b. 同源指导修复
蛋白质表达自内源突变基因的修复可包括同源指导修复。上述方法还包括将供体模板给予细胞。供体模板可包括编码完全功能性蛋白质或部分功能性蛋白质的核苷酸序列。例如，供体模板可包括小型化肌养蛋白构建体，称为微小肌养蛋白(“minidys”)，一种完全功能性肌养蛋白构建体用于恢复突变型肌养蛋白基因或肌养蛋白基因的片段，其在同源指导修复后导致突变型肌养蛋白基因修复。
c. 使用CRISPR/Cas9纠正突变基因和治疗受试者的方法
本公开内容还涉及用修复模板或供体DNA以基于CRISPR/Cas9的系统进行基因组编辑以恢复完全功能性或部分功能性蛋白质的表达，这可置换整个基因或含有突变的区域。基于CRISPR/Cas9的系统可用来将位点特异性双链断裂引入靶定的基因组基因座中。当基于CRISPR/Cas9的系统利用gRNA与靶DNA序列结合，因此允许切割靶DNA时，造成位点特异性双链断裂。基于CRISPR/Cas9的系统由于其成功有效的遗传修饰的高速率所致，具有高级基因组编辑的优势。这种DNA切割可刺激天然DNA修复机器，导致两种可能的修复途径之一：同源指导修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)途径。例如，涉及肌养蛋白基因的基于CRISPR/Cas9的系统可包括具有SEQ ID NO: 65-115的任一个的核酸序列的gRNA。
本公开内容涉及无需修复模板以基于CRISPR/Cas9的系统进行基因组编辑，这可有效地纠正读框并恢复涉及遗传疾病的功能性蛋白质的表达。所公开的基于CRISPR/Cas9的系统和方法可包括采用同源指导修复或基于核酸酶介导的非同源末端连接(NHEJ)的纠正方法，其使在可能不适于同源重组或基于选择的基因纠正的增殖受限制的原代细胞系中进行有效纠正成为可能。这种策略将有活性的基于CRISPR/Cas9的系统的快速稳健装配与有效的基因编辑方法整合用于治疗由引起移码、提前终止密码子、异常剪接供体位点或异常剪接受体位点的非必需编码区中的突变引起的遗传疾病。
本公开内容提供纠正细胞中的突变基因和治疗患有遗传疾病(例如DMD)的受试者的方法。所述方法可包括将上述基于CRISPR/Cas9的系统、编码所述基于CRISPR/Cas9的系统的多核苷酸或载体或所述基于CRISPR/Cas9的系统的组合物给予细胞或受试者。所述方法可包括给予基于CRISPR/Cas9的系统，例如给予Cas9蛋白或含有具有核酸酶活性的第二结构域的Cas9融合蛋白、编码所述Cas9蛋白或Cas9融合蛋白的核苷酸序列和/或至少一种gRNA，其中gRNA靶向不同的DNA序列。靶DNA序列可以是重叠的。给予细胞的gRNA的数目如上所述可为至少1种gRNA、至少2种不同的gRNA、至少3种不同的gRNA、至少4种不同的gRNA、至少5种不同的gRNA、至少6种不同的gRNA、至少7种不同的gRNA、至少8种不同的gRNA、至少9种不同的gRNA、至少10种不同的gRNA、至少15种不同的gRNA、至少20种不同的gRNA、至少30种不同的gRNA或至少50种不同的gRNA。gRNA可包括SEQ ID NO: 65-115的至少一个的核酸序列。所述方法可包括同源指导修复或非同源末端连接。
14. 治疗疾病的方法
本公开内容涉及治疗有需要的受试者的方法。所述方法包括如上所述将组合物给予受试者的组织用于在细胞或受试者基因组编辑中改变基因表达和进行工程改造或改变基因组DNA。所述方法可包括将组合物给予受试者的骨骼肌或心肌用于在上述骨骼肌或心肌中进行基因组编辑。受试者可能患有引起变性或衰弱或遗传疾病的骨骼肌或心肌病况。例如，受试者可能患有上述杜兴型肌营养不良。
a. 杜兴型肌营养不良
上述方法可用于纠正肌养蛋白基因并恢复所述突变的肌养蛋白基因的完全功能性或部分功能性蛋白质表达。在一些方面和实施方案中，本公开内容提供用于降低患者的DMD的作用(例如临床症状/适应症)的方法。在一些方面和实施方案中，本公开内容提供用于治疗患者的DMD的方法。在一些方面和实施方案中，本公开内容提供用于预防患者的DMD的方法。在一些方面和实施方案中，本公开内容提供用于防止患者的DMD进一步发展的方法。
15. 构建体和质粒
上述组合物可包含编码本文公开的基于CRISPR/Cas9的系统的基因构建体。基因构建体(例如质粒)可包含编码基于CRISPR/Cas9的系统例如Cas9蛋白和Cas9融合蛋白和/或gRNA的至少一种的核酸。上述组合物可包含编码修饰的AAV载体的基因构建体和编码本文公开的位点特异性核酸酶的核酸序列。基因构建体(例如质粒)可包含编码位点特异性核酸酶的核酸。上述组合物可包含编码本文公开的修饰的慢病毒载体的基因构建体。基因构建体(例如质粒)可包含编码Cas9-融合蛋白和至少一种sgRNA的核酸。基因构建体可存在于细胞中作为起作用的染色体外分子。基因构建体可以是线性微染色体，包括着丝粒、端粒或质粒或黏粒。
基因构建体还可以是包括重组慢病毒、重组腺病毒和重组腺病毒相关病毒在内的重组病毒载体的基因组的一部分。基因构建体可以是生活在细胞中的活的减毒微生物或重组微生物载体的遗传物质中的一部分。基因构建体可包含核酸编码序列的基因表达的调节元件。调节元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或聚腺苷酸化信号。
核酸序列可构成可以是载体的基因构建体。载体将能够在哺乳动物的细胞中表达融合蛋白，例如Cas9-融合蛋白或位点特异性核酸酶。载体可以是重组体。载体可包含编码融合蛋白(例如Cas9-融合蛋白或位点特异性核酸酶)的异源核酸。载体可以是质粒。载体可用于用编码Cas9-融合蛋白或位点特异性核酸酶的核酸转染细胞，在其中发生Cas9-融合蛋白或位点特异性核酸酶系统表达的条件下培养并维持转化的宿主细胞。
针对表达的稳定性和高水平，可使编码序列优化。在某些情况下，选择密码子以减少RNA的二级结构形成，例如因分子内键合形成的二级结构。
载体可包含编码基于CRISPR/Cas9的系统或位点特异性核酸酶的异源核酸，并另可包含起始密码子(其可以是基于CRISPR/Cas9的系统或位点特异性核酸酶编码序列的上游)和终止密码子(其可以是基于CRISPR/Cas9的系统或位点特异性核酸酶编码序列的下游)。起始和终止密码子可与基于CRISPR/Cas9的系统或位点特异性核酸酶编码序列一起在读框中。载体还可包含与基于CRISPR/Cas9的系统或位点特异性核酸酶编码序列有效连接的启动子。与基于CRISPR/Cas9的系统或位点特异性核酸酶编码序列有效连接的启动子可以是来自以下的启动子：猿猴病毒40 (SV40)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子例如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV即时早期启动子、EB病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子还可以是来自以下的启动子：人基因例如人泛素C (hUbC)、人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。启动子还可以是天然或合成的组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子。所述启动子的实例描述于美国专利申请公布号US20040175727，其内容通过引用以其整体结合到本文中。
载体还可包含聚腺苷酸化信号，其可以是基于CRISPR/Cas9的系统或位点特异性核酸酶的下游。聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号或人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体的聚腺苷酸化信号(Invitrogen，San Diego，CA)。
载体还可包含基于CRISPR/Cas9的系统(即Cas9蛋白或Cas9融合蛋白编码序列或sgRNA)或位点特异性核酸酶上游的增强子。增强子可能是DNA表达必需的。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，例如来自CMV、HA、RSV或EBV的那些。多核苷酸功能增强子描述于美国专利号5,593,972、5,962,428和WO94/016737，其内容通过引用完整予以结合。载体还可包含哺乳动物复制起点以在染色体外保持载体，并在细胞中产生多拷贝的载体。载体还可包含调节序列，其非常适于在给予其载体的哺乳动物或人细胞中的基因表达。载体还可包含报道分子基因，例如绿色荧光蛋白(“GFP”)和/或选择标记，例如潮霉素(“Hygro”)。
载体可以是表达载体或通过常规技术和容易获得的起始原料产生蛋白质的系统，包括Sambrook等, Molecular Cloning and Laboratory Manual, 第2版, Cold SpringHarbor (1989)，其通过引用完全予以结合。在一些实施方案中，载体可包含编码基于CRISPR/Cas9的系统的核酸序列，包括编码Cas9蛋白或Cas9融合蛋白的核酸序列和编码至少一种gRNA的核酸序列，所述gRNA包含SEQ ID NO: 5-40、65-144、492-515、540-563和585-625的至少一个的核酸序列。
16. 药物组合物
组合物可呈药物组合物。药物组合物可包含约1 ng-约10 mg编码基于CRISPR/Cas9的系统或基于CRISPR/Cas9的系统蛋白质成分(即Cas9蛋白或Cas9融合蛋白)的DNA。药物组合物可包含约1 ng-约10 mg修饰的AAV载体的DNA和编码位点特异性核酸酶的核苷酸序列。药物组合物可包含约1 ng-约10 mg修饰的慢病毒载体的DNA。本发明的药物组合物按照待采用的给药方式配制。在其中药物组合物是注射用药物组合物的情况下，它们是灭菌、无致热原和无颗粒的。优选使用等渗制剂。一般而言，用于等渗性添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在某些情况下，优选等渗溶液例如磷酸缓冲盐溶液。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩药加入制剂中。
组合物还可包含药物可接受的赋形剂。药物可接受的赋形剂可为功能性分子作为载体、辅助剂、载体或稀释剂。药物可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂，例如免疫刺激复合体(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡例如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒或其它已知的转染促进剂。
转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子，包括聚L-谷氨酸(LGS)或脂质。转染促进剂为聚L-谷氨酸，更优选聚L-谷氨酸以小于6 mg/ml的浓度存在于组合物中用于在骨骼肌或心肌中进行基因组编辑。转染促进剂还可包括表面活性剂，例如免疫刺激复合体(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡例如角鲨烯和角鲨烯，而且透明质酸还可用来与基因构建体联合给予。在一些实施方案中，编码组合物的DNA载体还可包括转染促进剂例如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其它脂质体，像DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒或其它已知的转染促进剂。优选转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子，包括聚L-谷氨酸(LGS)或脂质。
17. 递送方法
本文提供递送用于提供基因构建体的药物制剂(优选上述组合物)的方法。组合物的递送可以是将作为在细胞中表达的核酸分子的组合物转染或电穿孔并递送至细胞表面。可采用BioRad Gene Pulser Xcell或Amaxa Nucleofector IIb装置，将核酸分子电穿孔。可使用几种不同的缓冲液，包括BioRad电穿孔溶液、Sigma磷酸缓冲盐水制品#D8537(PBS)、Invitrogen OptiMEM I (OM)或Amaxa Nucleofector溶液V (N.V.)。转染可包括转染试剂，例如Lipofectamine 2000。
在组合物递送至组织时，载体因此进入哺乳动物细胞，转染的细胞将表达融合蛋白，例如基于CRISPR/Cas9的系统和/或位点特异性核酸酶。可将组合物给予哺乳动物以改变基因表达或再改造或改变基因组。例如，可将组合物给予哺乳动物以纠正哺乳动物的肌养蛋白基因。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛科动物、鹿、刺猬、大象、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠或鸡，优选人、牛、猪或鸡。
a. 基于CRISPR/Cas9的系统
可在有或没有体内电穿孔、脂质体介导、纳米粒促进和/或重组载体的情况下，通过DNA注射(亦称DNA接种)将编码基于CRISPR/Cas9的系统蛋白质成分(即Cas9蛋白或Cas9融合蛋白)的载体递送至哺乳动物中。重组载体可通过任何病毒方式递送。病毒方式可以是重组慢病毒、重组腺病毒和/或重组腺伴随病毒。
可将编码基于CRISPR/Cas9的系统蛋白质成分(即Cas9蛋白或Cas9融合蛋白)的核苷酸导入细胞以在遗传上纠正靶基因或改变基因的基因表达，例如激活或阻抑内源基因。例如，可将通过gRNA指向突变型肌养蛋白基因的编码基于CRISPR/Cas9的系统蛋白质成分(即Cas9蛋白或Cas9融合蛋白)的核苷酸导入DMD患者的成肌细胞中。或者，可将它们导入DMD患者的成纤维细胞中，且经遗传纠正的成纤维细胞用MyoD处理以诱导分化成为成肌细胞，可将其植入受试者(例如受试者的受损肌肉)中以证实经纠正的肌养蛋白是有功能的和/或治疗受试者。修饰的细胞还可以是干细胞，例如诱导多能干细胞、骨髓衍生祖细胞、骨骼肌祖细胞、DMD患者的人骨骼成肌细胞、CD133+细胞、mesoangioblast和MyoD-或Pax7-转导的细胞或其它生肌祖细胞。例如，基于CRISPR/Cas9的系统可引起诱导多能干细胞的神经元或生肌分化。
18. 给药途径
可通过不同的途径将组合物给予受试者，包括口服、胃肠外、舌下、经皮、直肠、跨粘膜、局部、通过吸入、通过口腔给药、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、鞘内和关节内或其组合。对于兽用，按照正常的兽医实践，将组合物作为合适的可接受的制剂给药。兽医可容易地确定最合于具体动物的剂量方案和给药途径。可通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪”或其它物理方法例如电穿孔(“EP”)、“流体动力方法”或超声给予组合物。
可在有或没有体内电穿孔、脂质体介导、纳米粒促进、重组载体例如重组慢病毒、重组腺病毒和重组腺病毒相关病毒的情况下，通过几种技术包括DNA注射(亦称DNA接种)将组合物递送至哺乳动物中。可将组合物注射到骨骼肌或心肌中。例如，可将组合物注射到胫骨前肌中。
19. 细胞类型
这些递送方法和/或给药途径的任一种可与多种细胞类型(例如目前在研究中的基于细胞的疗法的这些细胞类型)一起使用。细胞类型可为成纤维细胞、多能干细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、间质祖细胞、造血干细胞、平滑肌细胞或K562人类红细胞白血病细胞系。
a. DMD
目前在研究中用于DMD的基于细胞的疗法的细胞类型包括永生化成肌细胞，例如野生型和DMD患者衍生系，例如Δ48-50 DMD、DMD 8036 (del48-50)、C25C14和DMD-7796细胞系、原始DMD真皮成纤维细胞、诱导多能干细胞、骨髓衍生祖细胞、骨骼肌祖细胞、DMD患者的人骨骼成肌细胞、CD133+细胞、mesoangioblasts、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、间质祖细胞、造血干细胞、平滑肌细胞和MyoD-或Pax7-转导的细胞或其它生肌祖细胞。人成肌细胞的永生化可用于经遗传纠正的成肌细胞的克隆衍化。可将细胞离体修饰以分离和扩增含有经遗传纠正的肌养蛋白基因且不含基因组蛋白质编码区中的其它核酸酶引导的突变的永生化DMD成肌细胞的克隆群。或者，通过非病毒或非整合性病毒基因转移，或通过含有细胞渗透性基序的纯化蛋白质和gRNA的直接递送，核酸酶的瞬时体内递送可能使具有最小或无外源DNA整合风险的高特异性原位纠正成为可能。
20. 药盒
本文提供药盒，其可用来编辑骨骼肌或心肌中的基因组，例如纠正突变基因。药盒包含用于在上述骨骼肌或心肌中进行基因组编辑的组合物和使用所述组合物的说明书。药盒中所包括的说明书可附在包装材料上或可作为药品说明书包括在内。虽然说明书通常为书面或印刷材料，但它们不限于此。本公开内容预期能够储存所述说明书并将其向终端用户传达的任何介质。所述介质包括包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如CD ROM)等。本文所用术语“说明书”可包括提供说明书的互联网站网址。
用于在骨骼肌或心肌中进行基因组编辑的组合物可包括修饰的AAV载体和编码上述位点特异性核酸酶的核苷酸序列。位点特异性核酸酶可包括特异性结合并切割突变基因的ZFN、TALEN或上述基于CRISPR/Cas9的系统。可将上述位点特异性核酸酶包括在药盒中以特异性结合并靶向突变基因的特定区域。位点特异性核酸酶可能对上述突变的肌养蛋白基因有特异性。药盒还可包括上述供体DNA、gRNA或转基因。
a. 基于CRISPR/Cas9的系统
本文提供可用来纠正突变基因的药盒。药盒包含用于纠正突变基因至少一种成分和使用基于CRISPR/Cas9的系统的说明书。药盒中所包括的说明书可附在包装材料上或可作为药品说明书包括在内。虽然说明书通常为书面或印刷材料，但它们不限于此。本公开内容预期能够储存所述说明书并将其向终端用户传达的任何介质。所述介质包括包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如CD ROM)等。本文所用术语“说明书”可包括提供说明书的互联网站网址。
至少一种成分可包括至少一种上述特异性靶向基因的基于CRISPR/Cas9的系统。药盒可包括Cas9蛋白或Cas9融合蛋白、编码所述Cas9蛋白或Cas9融合蛋白的核苷酸序列和/或至少一种gRNA。药盒中可包括上述基于CRISPR/Cas9的系统以特异性结合并靶向靶基因编码区上游、内部或下游的特定靶区。例如，基于CRISPR/Cas9的系统可能对靶基因的启动子区有特异性或基于CRISPR/Cas9的系统可能对突变基因(例如上述突变的肌养蛋白基因)有特异性。药盒可包括上述供体DNA。
21. 实施例
对本领域技术人员极显而易见的是，本文所述公开内容的方法的其它合适的修改和改编是极适用的和值得重视的，可采用合适的等同方法实施而不偏离本公开内容的范围或本文公开的实施方案的方面。现已详细描述了本公开内容，通过参照下列实施例将更清楚地理解本公开内容，所述实施例不仅仅旨在说明本公开内容的某些方面和实施方案，不应视为限制公开内容的内容。本文引用的所有期刊参考文献、美国专利和出版物的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
本发明具有多个方面，通过下列非限制性实施例说明。
实施例1
材料和方法
细胞培养和转染。HEK293T细胞通过杜克大学癌症中心机构(Duke UniversityCancer Center Facilities)获自美国组织保藏中心(American Tissue CollectionCenter，ATCC)，在补充10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中在37℃、5% CO2下维持。按照生产厂说明书，将HEK293T细胞用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)转染。转染效率按常规高于80%，在递送对照eGFP表达质粒后通过荧光显微镜术测定。按与个别gRNA表达质粒或等量的gRNA表达质粒(由等量的4种gRNA的混合物组成) 3:1的质量比转染Cas9表达质粒。
将原生小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF-HL，Millipore，Billerica，MA)接种(75,000个/孔)在24孔TCPS板(BD，Franklin Lakes，NJ)中，在由补充10% Premium Select FBS(Atlanta Biologicals，Lawrenceville，GA)、25 µg mL-1庆大霉素(Invitrogen)、1XGlutaMAX、非必需氨基酸、丙酮酸钠和β-巯基乙醇(Invitrogen)的高葡萄糖DMEM组成的完全MEF培养基中在37℃和5% CO2下维持。如前所述，MEF转染用单次1 µg cm-2剂量的总质粒DNA进行，在用含聚(CBA-ABOL)的无血清和无抗生素的OptiMEM静电缩合后作为阳离子纳米复合物递送(Adler等, Molecular therapy. Nucleic acids 1, e32 (2012))。在转染后4小时，将OptiMEM用完全MEF培养基更换。在转染后48小时，对MEF进行qRT-PCR处理，或者将完全MEF培养基用含有以下的N3神经诱导培养基更换：DMEM/F-12 (Invitrogen)、1X N-2Supplement (Invitrogen)、10 ng mL-1人bFGF2 (Stemgent，Cambridge，MA)和25 µg mL-1庆大霉素(Invitrogen)。使用GFP报道分子载体(pmax-GFP，3486 bp，Amaxa，Cologne，Germany)以优化转染条件。将Cas9表达质粒按与4种gRNA表达质粒相同的混合物3:1或1:1的质量比转染。
质粒。编码野生型和H840A Cas9的质粒获自Addgene (质粒#39312和质粒#39316；Jinek等, Science 337, 816-821 (2012))。将H840A Cas9与FLAG表位标签和具有引入D10A突变的引物对的核定位序列(NLS)一起在N端符合读框地克隆至载体pcDNA3.1中。将VP64结构域、NLS和HA表位标签与Cas9 ORF符合读框地克隆在C端(图1a，图9a)。以gBlocks(Integrated DNA Technologies (IDT))订购tracrRNA和crRNA表达盒(Cong等,Science339, 819-823 (2013))，并克隆至具有KpnI和SacII位点的pZ供体质粒(Sigma)中。以gBlocks加以改动以包括BbsI限制位点促进新的指导RNA间隔区序列的快速克隆，订购嵌合指导RNA表达盒(Mali等, Science339, 823-826 (2013)) (图9b)。含有靶序列的寡核苷酸获自IDT，使之杂交，磷酸化，并使用BbsI位点克隆至合适的质粒中。靶序列见表2。
Figure 706600DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
蛋白质印迹。将细胞在50 mM Tris-Cl (pH 7.4)、150 mM NaCl、0.5% Triton X-100和0.1% SDS中裂解。将裂解物与加载缓冲液混合，煮沸5分钟，将等体积的蛋白质在NuPAGE® Novex 4-12%或10% Bis-Tris凝胶聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并转移至硝酸纤维素膜上。将非特异性抗体结合用含5%脱脂奶的50 mM Tris/150 mM NaCl/0.1% Tween-20(TBS-T)封闭30分钟。将膜与在含5% BSA的TBS-T中1:1000稀释的第一抗体(HRP缀合的抗Flag (Cell Signaling，目录号2044)一起温育过夜；与在含5%牛奶的TBS-T中1:5000稀释的抗GAPDH (Cell Signaling，克隆14C10)温育30分钟；与在5% BSA中1:500稀释的抗ASCL1(Santa Cruz，克隆sc-48449)温育；或与在5%牛奶中1:500稀释的抗g-珠蛋白(Santa Cruz，克隆51-7)温育，并将膜用TBS-T洗涤30分钟。用第一抗体标记的膜与1:5000稀释的抗兔HRP缀合的抗体(Sigma-Aldrich)、抗山羊(1:3000)或抗小鼠(1:5000)温育30分钟，用TBS-T洗涤30分钟。使用Immun-Star WesternC™化学发光试剂盒(Bio-Rad)观测膜，使用ChemiDoc™ XRS+系统拍摄图像并应用ImageLab软件(Bio-Rad)处理。
ELISA。收集无血清培养基(OPTI-MEM)，在-80℃下冷冻。按照生产商的方案，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量测定分泌到培养基中的人IL-1ra (R&D Systems，目录号DY280)。通过将重组人IL-1ra在OPTI-MEM中稀释，制备标准曲线，未经稀释地测量培养基中的IL-1ra。通过经由3 kDa MWCO滤膜离心20分钟，使样品浓缩约8倍(Amicon Ultra，目录号UFC500396)。报告值通过各样品的浓度系数校正。
以540 nm处的波长校正，测量450 nm处的光密度。各标准品和样品以一式两份测定。对一式两份读数取平均，并通过减去平均零标准品光密度标准化。通过log转换数据生成标准曲线，并进行IL-1ra浓度与光密度的线性回归。报告值为在不同日期以对各实验取平均的技术性一式两份进行3个独立实验的均值和均值的标准误差(n = 3)。
qRT-PCR。使用RNeasy Plus RNA分离试剂盒(Qiagen)，分离总RNA。使用SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒(Invitrogen)，进行cDNA合成。用应用Primer3Plus软件设计并购自IDT的表3中报告的寡核苷酸引物，用CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行使用PerfeCTa® SYBR® Green FastMix的实时PCR。
Figure 13954DEST_PATH_IMAGE004
引物特异性通过琼脂糖凝胶电泳和解链曲线分析证实。计算在适当的动态范围内的反应效率以确保标准曲线的线性(图10)。结果表示为通过ΔΔCT方法归一化至GAPDH表达的目标基因mRNA表达的倍数增加。报告值为在不同日期以对各实验取平均的技术性一式两份进行的3个独立实验的均值和均值的标准误差(n = 3)。
RNA-Seq。构建了RNA seq文库。简单地讲，使用SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒(Invitrogen)，自寡dT Dynabead® (Invitrogen)俘获的mRNA合成第一链cDNA。使用DNA聚合酶I (New England Biolabs)合成第二链cDNA。使用Agencourt AMPure XP珠粒(Beckman Coulter)纯化cDNA，并使用Nextera转座酶(Illumina；在55℃下5分钟)同时片段化并将测序引物插入双链cDNA中。使用QG缓冲液(Qiagen)终止转座反应，在AMPure XP珠粒上纯化片段化cDNA。通过6个PCR循环，产生编入索引的测序文库。
在Illumina HiSeq 2000仪器的2条道上使用50-bp单端读数对文库测序，产生每文库2900万和7400万读数。应用Bowtie，将读数与人RefSeq转录物比对(Langmeadet等，Genome biology10，R25 (2009))。应用DESeq，计算差异表达的统计显著性，包括多重假设检验的校正(Anders等, Genome biology11, R106 (2010))。在Gene Expression Omnibus(GEO)中保存原始RNA-seq读数和与各RefSeq转录物比对的读数的数目用于公共存取，登记号目前待定。
免疫荧光染色。对于Tuj1和MAP2表达的检测，在N3培养基中培养第10天时，将转染的MEF用4% PFA (EMS，Hatfield，PA)在室温(RT)下固定20分钟。然后将细胞在含有0.2%Triton X-100、3% w/v BSA和10%山羊血清(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO)的封闭缓冲液中与兔抗Tuj1 (Covance，Princeton，New Jersey，克隆TUJ1 1-15-79，1:500)和小鼠抗MAP2 (BD，克隆Ap20，1:500)一起在室温下温育2小时，或再与小鼠抗Ascl1 (BD克隆24B72D11.1，1:100)在4℃下温育24小时。然后将细胞用PBS洗涤3次，在封闭缓冲液中与Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG (Invitrogen，1:200)一起在室温下温育1小时，并用PBS洗涤3次。然后染色的MEF用带有ProScanII装发动机的镜台(Prior Scientific，Rockland，MA)的Nikon Eclipse TE2000-U倒置荧光显微镜扫描以产生各完全培养区的大的镶嵌图像。按照局部对比，用FIJI macro处理这些镶嵌图案以自动和均匀地对图像设置阈值，排除小的碎片，并对各孔中Tuj1+细胞的数目计数。
统计资料。在JMP 10 Pro中通过Tukey检验进行统计分析，α等于0.05。
实施例2
结果
为了产生基于CRISPR/Cas9的转录激活系统，使Cas9的催化残基(D10A、H840A)突变以产生iCas9，并且与C端VP64酸性反式激活域遗传融合(图1a、b)。通过N端Flag表位标签的蛋白质印迹，从人胚肾(HEK) 293T细胞中的转染质粒中观察到稳健的iCas9-VP64表达(图3)。CRISPR系统通过gRNA中的20 bp序列与互补DNA靶(其后面是NGG前间区序列邻近基序(PAM)序列，其中N是任何碱基对)的碱基配对识别其靶标。靶定内源人启动子的合成转录因子的组合导致基因表达协同和稳健的激活。因此在转录起始位点500 bp内的IL1RN基因的启动子中鉴定出后面接NGG PAM序列的4个gRNA靶位点(图4，表2)。为了比较基于crRNA和基于gRNA的打靶策略，将4个靶位点序列引入crRNA和gRNA表达质粒中17，并用iCas9-VP64表达质粒共转染至HEK293T细胞中。虽然在用crRNA的组合处理的样品中通过qRT-PCR观察到可观诱导的IL1RN表达，但用gRNA的组合实现高得多的水平(图1c)。在用gRNA和无VP64的iCas9的表达质粒处理的细胞中未观察到基因表达的改变，表明了激活结构域在调节基因表达中的关键作用(图1c)。通过在用iCas9-VP64和野生型Cas9处理的样品中进行Surveyor测定法以检测DNA修复事件，证实在iCas9-VP64系统中这些靶位点处的核酸酶活性已消除(图5)。通过单独或组合地转染4种gRNA的每一种，用gRNA的组合靶向启动子中的多个位点显示基因表达的稳健增加(图1d)。只有当gRNA组合与iCas9-VP64共转染时，才观察到高水平的IL1RN表达(图1d)，如用其它类别的改造的转录因子观察到的一样。同样，在3个不同的实验中，只用gRNA的组合处理的6个样品中有3个观察到由IL1RN基因编码的IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)蛋白的产生，而在用单一gRNA或对照质粒处理的样品中从未观察到(图1e)。为了检查由iCas9-VP64引起的基因激活的特异性，通过RNA-seq评价了用4种gRNA的组合处理的HEK293T细胞的整个基因表达(图1f)。显然，仅相对于对照表达显著增加的基因(错误发现率≤ 3 x 10-4)是从IL1RN基因座表达的4个同种型(图4)，表明了高水平的基因激活特异性。
为了证实该系统的普遍适用性，设计了4种gRNA以靶向与医学和生物工程学有关的8种其它基因的启动子的每一个，包括ASCL1、NANOG、HBG1/2、MYOD1、VEGFA、TERT、IL1B和IL1R2 (图4，表2)。ASCL1和MYOD1的强制表达导致几个细胞类型分别转分化成神经元和肌源表型。NANOG是多能性的标志物，也用于遗传重编程策略。在胚胎发育期间编码γ-珠蛋白的同源物HBG1和HBG2的激活，可用作补偿镰状细胞病中的β-珠蛋白突变的治疗策略。仔细研究了VEGFA通过合成转录因子的增量调节作为提高组织再生和伤口愈合的策略。由TERT基因编码的端粒酶的强制表达，可用来使细胞系永生化。IL1B编码介导炎症和自身免疫的IL-1β细胞因子。可通过IL-1ra或由IL1R2编码的诱杀型受体的表达，阻断IL-1β信号转导。通过qRT-PCR测定，通过iCas9-VP64和4种gRNA的表达质粒共转染至HEK293T细胞提高这些基因各自的表达(图2)。在某些情况下，单一gRNA的表达足以诱导基因表达，但在任何情况下，4种gRNA的共转染导致协同效应(图2a-d)。显然，通过DNase-seq测定的染色质可及性不是成功基因激活的预测指标(图4)。在用iCas9-VP64和靶向HBG1的4种gRNA (其中3种还靶向HBG2)转染的细胞上进行RNA-seq。这揭示了无法通过RNA-seq区分的HBG1和HBG2两者表达中的特异性和可再现的增加，虽然由于总表达水平低所致无法达到统计显著性(图6)。通过蛋白质印迹检测在用iCas9-VP64和4种gRNA处理后Ascl1和γ-珠蛋白的蛋白质表达的增加(图7)，证实通过qRT-PCR观察到高较的mRNA水平(图2)。在空载体对照中可检出低的基线水平的Ascl1和γ-珠蛋白的蛋白质表达。由于通过iCas9-VP64激活基因靶的初步证据可导致基因网和细胞表型的继发改变，因此将iCas9-VP64和靶向ASCL1的4种gRNA的表达质粒共转染至鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中(图8)。MEF中Ascl1的强制表达表明部分激活神经元基因网，包括下游靶标Tuj1。由于gRNA靶位点在人和小鼠ASCL1启动子中是保守的(图8a)，因此还在用编码iCas9-VP64和4种gRNA的质粒处理的MEF中观察到ASCL1表达的激活(图8b)。此外，在iCas9-VP64/gRNA处理的样品中，在转染后12天通过免疫荧光染色，容易检出表达Ascl1和神经元标志物Tuj1的细胞(图8c-h)。在用对照质粒处理的细胞中未观察到Tuj1阳性细胞。
迄今没有哺乳动物细胞中Cas9/CRISPR活性的特异性的任何全面调查。采用RNA-seq，显示靶定基因激活与可检测脱靶基因激活没有极强的特异性(图1f，图6)。对于该特异性分析选择IL1RN和HBG1/2，因为基因产物IL-1ra和γ-珠蛋白不会对HEK293T细胞中的基因表达产生继发效应。与使用单个强激活因子形成对比，利用多个弱转录激活因子的协同活性可增加特异性基因调节，因为多个相邻的脱靶位点会存在于另一个基因座上是不可能的。引人关注的是，与只用空表达质粒处理的对照样品相比，在用iCas9-VP64和靶定IL1RN或HBG1/2的gRNA处理的两种样品中，IL32基因适度被减量调节(错误发现率< 0.03) (图1f、图6)。因为靶定IL1RN和HBG1/2的样品两者同样受影响，所以这是与靶序列同一性有关的脱靶iCas9-VP64活性的结果是不可能的。
为了评价iCas9-VP64与之结合基因组的特异性，使用抗HA抗体，对用iCas9-VP64和靶向IL1RN启动子的4种gRNA处理的细胞进行了ChIP测序。实验显示，iCas9靶向IL1RN启动子(图15)。此外，实验显示极高水平的特异性。iCas9只有10个潜在的脱靶结合位点(FDR< 5%)。为了进一步查询特异性，用iCas9 EGEM进行了RNA测序实验，发现相对于对照，仅IL1RN基因同种型的表达增加(FDR ≤ 3 x 10.4)。
实施例3
靶向肌养蛋白基因的CRISPR—方法和材料
质粒构建体。如前所述，使用酿脓链球菌sgRNA和人密码子优化的Cas9 (hCas9)核酸酶的表达盒(Perez-Pinera等, Nat Methods 10:973-976 (2013))。为了产生荧光报道分子系统以富集CRISPR/Cas9修饰的细胞，合成了GeneBlock (IDT)。其含有与多个克隆位点的紧接上游的T2A跳跃肽融合的Cas9编码序列3’端的一部分，随后克隆至hCas9表达载体中。然后将eGFP报道分子基因克隆至T2载体中，以供来自相同表达载体(hCas9-T2A-GFP，SEQ ID NO: 116)的Cas9和eGFP蛋白共翻译。
细胞培养和转染。HEK293T细胞经由Duke Cell Culture Facility获自美国组织保藏中心(ATCC)，在补充10%小牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中维持。使永生化成肌细胞(Mamchaoui, K.等, Skelet Muscle 1, 1-11 (2011)) (一种来自野生型供体，两种来自Δ48-50 DMD患者衍生系)在补充20%小牛血清(Sigma)、50 μg/ml胎球蛋白、10 ng/ml人表皮生长因子(Sigma)、1 ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(Sigma)、10 μg/ml人胰岛素(Sigma)、1% GlutaMAX (Invitrogen)和1%青霉素/链霉素(Invitrogen)的骨骼肌培养基(PromoCell)中维持。原生DMD真皮成纤维细胞获自Coriell Cell存放库(GM05162A，Δ46-50)，在补充10%胎牛血清、1 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子和1%青霉素/链霉素的DMEM中维持。所有细胞系都在37℃和5% CO2下维持。
按照生产商的方案，用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)将HEK293T细胞用400ng各表达载体在24孔板中转染。使用针对各系的优化条件，使用Gene Pulser XCell(BioRad)以PBS作为电穿孔缓冲液通过电穿孔，将永生化成肌细胞和原生成纤维细胞用5 µg各表达载体转染(图1) (Ousterout等, Mol Ther 21:1718-1726 (2013))。通过递送eGFP表达质粒(pmaxGFP，Clontech)并采用流式细胞术，测量转染效率。这些效率对于HEK293T通常≥95%，对于原生成纤维细胞和永生化成肌细胞≥70%。对于全部实验，电穿孔质粒的标示质量相当于用于各基于CRISPR/Cas9的系统的量。
内源基因修饰的Cel-I定量测定(Surveyor测定法)。采用Surveyor核酸酶测定法，定量测定内源靶位点处基于CRISPR/Cas9的系统诱导的损害(Guschin, D.Y.等, Meth Mol Biol 649, 247-256 (2010))，这可检测核酸酶介导的NHEJ的突变特性。在转染后，将细胞在37℃下孵育3或10天，使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒(QIAGEN)，提取基因组DNA。使用对各基因座有特异性的引物(参见表4)，例如5’-GAGTTTGGCTCAAATTGTTACTCTT-3’(SEQ ID NO: 60)和5’-GGGAAATGGTCTAGGAGAGTAAAGT-3’ (SEQ ID NO: 61)，用AccuPrimeHigh Fidelity PCR试剂盒(Invitrogen)，通过35个PCR循环扩增靶基因座。
表4 计算机预测的最前面10个脱靶位点的汇总和在用Cas9和所示sgRNA表达盒转染的HEK293T细胞中通过Surveyor测定法检测的各位点的活性。n.d.：未检出。
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所得PCR产物被随机解链，并在循环变温加热器按以下程序以各步骤间-0.3℃/s的速率重退火：95℃持续240 s，接着85℃持续60 s、75℃持续60 s、65℃持续60 s、55℃持续60 s、45℃持续60 s、35℃持续60 s和25℃持续60 s。在重退火后，将8 μL PCR产物与1 μL Surveyor核酸酶S和1 μL增强子S (Transgenomic)混合，在42℃下温育1小时。在温育后，将6 μL消化产物加载到10% TBE聚丙烯酰胺凝胶上，以200V电泳30分钟。将凝胶用溴化乙锭染色，并如前所述采用ImageLab (Bio-Rad)通过光密度测定法定量测定(Guschin等，Meth Mol Biol 649，247-256 (2010))。
成肌细胞的荧光激活细胞分选。将DMD成肌细胞用5微克各hCas9-T2A-GFP和sgRNA表达载体电穿孔，并在37℃下和5% CO2孵育。在电穿孔后3天，对细胞进行胰蛋白消化，使用FACSvantage II分选机收集FACS分选物。收集GFP阳性细胞，使之生长用于分析。
检测基因组缺失的基于PCR的测定法。使用侧接各基因座的引物，通过PCR(Invitrogen AccuPrime High Fidelity PCR试剂盒)，从基因组DNA扩增外显子51或外显子45-55基因座。对于外显子51，侧接引物为CelI-CR1/2-F和CelI-CR5-R，或对于外显子45-55分析为CelI-CR6-F和CelI-CR36-R (表4)。在TAE-琼脂糖凝胶中分析PCR产物，用溴化乙锭染色用于分析。
易位的基于PCR的检测。通过来自用仅Cas9 (对照)或Cas9与sgRNA转染的细胞的基因组DNA的两步嵌套PCR (Invitrogen AccuPrime High Fidelity PCR试剂盒用于各步骤)，扩增预测的可能易位的基因座。在第一步中，使用经修饰以包括促进克隆和测序分析的限制位点的各基因座的Surveyor引物的组合，通过35个PCR循环扩增可能发生在各中靶和脱靶sgRNA靶位点的易位(表4)。使用针对每个个别预测易位定制设计的嵌套引物组，对1微升各PCR反应物进行了35轮PCR的第二轮扩增(表4)。各第二嵌套PCR引物在主要扩增子内相同的近似区域内结合；然而，应用Primer3在线生物信息学软件优化各对以确保各易位的特异性检测。纯化相当于预测易位的预期长度且仅存在于用sgRNA处理的细胞中的PCR扩增子(QIAGEN Gel Extraction试剂盒)，并通过Sanger测序分析。
mRNA分析。在对细胞进行胰蛋白消化前5天，通过将生长培养基用补充1%胰岛素-运铁蛋白-硒(Invitrogen #51500056)和1%青霉素/链霉素(Invitrogen #15140)的DMEM更换，使永生化成肌细胞分化成为肌纤维，并收集。按照生产商的说明书，使用RNeasy PlusMini试剂盒(QIAGEN)从这些细胞中分离总RNA。按照生产商的说明书，使用VILO cDNA合成试剂盒(Life Technologies#11754)和1.5微克RNA在42℃下2小时，使RNA反转录为cDNA。使用通过CR1/5或CR2/5退火至外显子44和52以检测外显子51缺失的引物或通过CR6/36退火至外显子44和60以检测外显子45-55缺失的引物，用AccuPrime High Fidelity PCR试剂盒(Invitrogen)通过35个PCR循环扩增靶基因座(表4)。使PCR产物在TAE-琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色用于分析。使溶解的PCR条带克隆，并通过Sanger测序分析以证实预期的外显子连接处。表5列出实施例4中所用引物的序列。
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蛋白质印迹分析。为了评价肌养蛋白表达，通过将生长培养基用补充1%胰岛素-运铁蛋白-硒(Invitrogen)和1%抗生素/抗真菌剂(Invitrogen)的DMEM更换4-7天，例如6或7天，使永生化成肌细胞分化成肌纤维。通过诱导MyoD过量表达，并使细胞在补充1%胰岛素-运铁蛋白-硒(Invitrogen)、1%抗生素/抗真菌剂(Invitrogen)和3 μg/mL多西环素的DMEM中孵育15天，使成纤维细胞转分化成为成肌细胞。在转染HEK293T细胞后3天，评价肌养蛋白表达。对细胞进行胰蛋白消化，收集，在补充蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的RIPA缓冲液(Sigma)中裂解，并按照生产商的说明书(Pierce)，采用二辛可宁酸测定法，定量测定总的蛋白质量。然后将样品与NuPAGE加载缓冲液(Invitrogen)和5% β-巯基乙醇混合，加热至85℃ 10分钟。在4-12% NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上用MES缓冲液(Invitrogen)分离25微克蛋白质。将蛋白质在含有10-20%甲醇(例如10%甲醇)和0.01% SDS的转移缓冲液中转移到硝酸纤维素膜中达1-2小时。然后将印迹用5%牛奶-TBST在室温下封闭1小时。印迹用下列第一抗体探测：MANDYS8以检测肌养蛋白(1:100，Sigma D8168)和兔抗GAPDH (1:5000，Cell Signaling 2118S)。然后将印迹与小鼠或兔辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(SantaCruz)一起温育，采用ChemiDoc化学发光系统(BioRad)和Western-C ECL底物(BioRad)观测。
移植至免疫缺陷型小鼠中。所有动物实验按照经Duke Institutional AnimalCare & Use Committee批准的方案进行。对细胞进行胰蛋白消化，收集，并在1X Hank平衡盐溶液(HBSS，Sigma)中洗涤。在临注射前，使200万个细胞沉淀，重新悬液于补充心脏毒素(Sigma #C9759)的5 µL 1X HBSS (Sigma)中。通过肌内注射，将这些细胞移植入NOD.SCID.γ (NSG)小鼠(Duke CCIF Breeding Core)的后肢胫骨前肌(TA)肌肉中。在注射后4周，使小鼠安乐死，收获TA肌肉。
免疫荧光染色。将收获的肌肉在30%甘油中在4℃下温育过夜后，在OptimalCutting Temperature化合物中封片并冷冻。通过对-20℃下的包埋肌肉组织冷冻切片，获得连续的10微米切片。然后将冰冻切片在PBS中洗涤除去OCT化合物，随后在含有10%热灭活胎牛血清(用于血影蛋白检测)或5%热灭活胎牛血清(用于肌养蛋白检测)的PBS中在室温下封闭30-60分钟。将冰冻切片与下列只对人表位有特异性的第一抗体一起在4℃下温育过夜：抗血影蛋白(1:20，Leica NCL-SPEC1)或抗肌养蛋白(1:2，Leica NCL-DYS3)。在初步染色后，使用基于tyramide的免疫荧光信号扩增检测试剂盒(Life Technologies，TSA Kit #22，目录号T-20932)，检测血影蛋白或肌养蛋白表达。简单地讲，将冰冻切片与1:200第二山羊抗小鼠生物素-XX (Life Technologies #B2763)在封闭缓冲液中在室温下温育1小时。然后使用链霉抗生物素-HRP缀合物(1:100，来自TSA Kit )在封闭缓冲液中使信号在室温下扩增1小时。最后，将冰冻切片与tyramide-AlexaFluor488缀合物(1:100，TSA Kit )一起在生产商提供的扩增缓冲液中在室温下温育10分钟。然后染色的冰冻切片在ProLongAntiFade (Life Technologies #P36934)中封片，用常规荧光显微术观测。
细胞毒性测定法。为了定量评价潜在的sgRNA或SpCas9核酸酶相关细胞毒性，按照生产商的说明书，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，将HEK293T细胞用10 ng GFP报道分子和100 ng SpCas9表达载体和100 ng sgRNA表达载体转染。通过流式细胞术，在2和5天评价GFP阳性细胞的百分比。计算存活率为从第2天到第5天GFP阳性细胞的降低，按所述归一化至用空核酸酶表达载体转染的细胞(Cornu等, Meth Mol Biol 649:237-245(2010))。
实施例4
靶向肌养蛋白基因的CRISPR—结果
设计基于CRISPR/Cas9的系统以靶向肌养蛋白基因。选择不同的gRNA以靶向基于NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN NGG和GNNNN NNNNN NNNNN NNNNN NGG的人和小鼠肌养蛋白基因的不同区(参见表6、7和8)。
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Figure 123933DEST_PATH_IMAGE024
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Figure 365427DEST_PATH_IMAGE026
表7
名称 注释 % Mod
DCR1 缺失外显子51 6.6
DCR2 缺失外显子51 10.3
DCR3 移码 13
DCR4 缺失外显子51 11.9
DCR5 缺失外显子51 12.4
DCR6 在内含子44中尽可能接近外显子44 (在患者缺失的情况下) 16.1
DCR7 在内含子55内尽可能接近外显子56 (在患者缺失的情况下) 6.8
DCR8 只可纠正外显子42-43缺失(-1/+2)，(-2/+1)不可被此纠正 17.3
DCR9 跳跃外显子44 (5') 14.4
DCR10 移码 14.9
DCR11 纠正外显子45的下游 <1
DCR12 5'剪接受体/移码 <1
DCR13 纠正外显子46的下游 16.9
DCR14 移码 17.2
DCR15 纠正外显子47的下游 15.4
DCR16 移码 11.5
DCR17 纠正外显子48的下游 <1
DCR18 5'剪接受体/移码 1.8
DCR19 纠正外显子49的下游 33.7
DCR20 5'剪接受体 14.9
DCR21 纠正外显子50的下游 24.1
DCR22 移码 25.9
DCR23 纠正外显子52的下游 25.2
DCR24 移码(只可纠正+1读框) 24.8
DCR25 纠正外显子53的下游 2.6
DCR26 移码 24.5
DCR27 纠正外显子54的下游 13.4
DCR28 5'剪接受体 21.6
DCR29 纠正外显子55的下游 19.2
DCR30 在外显子1中整合微小肌养蛋白 未检测
DCR31 纠正外显子51的下游 18.9
DCR32 缺失终止密码子 未检测
DCR33 CR6的备选 1.3
DCR34 CR6的备选 13.2
DCR35 CR7的备选 22.5
DCR36 CR7的备选 26.4
DCR40 中断外显子23 5'剪接供体(纠正mdx突变)
DCR41 中断外显子23 5'剪接供体(纠正mdx突变)
DCR42 缺失外显子53 mdx4cv突变
DCR43 中断肌肉生长抑制素(myostatin)受体
Figure DEST_PATH_IMAGE027
Figure 529692DEST_PATH_IMAGE028
Figure DEST_PATH_IMAGE029
具体地说，将400 ng Cas9与400 ng空载体或靶向包括外显子51的区域的gRNA即CR1、CR2、CR3、CR4和CR5一起共转染入HEK 293T细胞中(参见图11(b))。在转染后2天收获基因组DNA，采用Surveyor测定法分析(参见图11(a)和11(c))。
将基于CRISPR/Cas9的系统用于DMD 8036 (del48-50)细胞中以测定系统是否可修复突变型肌养蛋白基因。将5 µg Cas9与7.5 µg空载体或gRNA一起共转染至DMD 8036(del48-50)细胞中。具体地说，使用7.5 µg CR1 (“DCR1”)、7.5 µg CR5 (“DCR5”)、15 µgCR3 (“DCR3”)或7.5 µg CR1和CR5的组合(DCR1+DCR5)。在转染后3天收获基因组DNA，采用跨越整个基因座的Surveyor测定法(图12)或PCR分析(图13)进行分析。使用侧接含有针对CR1和CR5的基因组靶的区域的引物(正向引物：5’-gagaggttatgtggctttacca (SEQ ID NO:457)，反向引物：5’-ctgcgtagtgccaaaacaaa (SEQ ID NO:458))，通过PCR扩增该基因座，得到野生型基因座的1447bp条带或缺失基因座约630bp的预期大小。在分化7天后，处理细胞的蛋白质印迹显示表达肌养蛋白(参见图14)。
实施例5
将CRISPR/Cas9靶向人肌养蛋白基因中的热点突变
为了利用CRISPR/Cas9基因编辑平台以纠正广泛的肌养蛋白突变，产生靶向显子45-55间的热点突变区12种sgRNA (图16)。使用利用人密码子优化的SpCas9核酸酶和嵌合单一指导RNA(sgRNA)表达载体以指导有效的位点特异性基因编辑的酿脓链球菌系统。与实施例4用TALEN靶向外显子51相似，选择靶向符合SpCas9的5’-NRG-3’ PAM要求的外显子45-55的5’和3’端的前间区。通过这些外显子内的基于NHEJ的DNA修复所产生的少量插入或缺失可产生克服各外显子周围各种肌养蛋白突变的靶定移码突变(图16A-16B)。例如，设计CR3，通过在外显子51的5’端引入少量插入或缺失以恢复下游肌养蛋白读框，来纠正外显子51周围的肌养蛋白突变或缺失(图16B)。另外，设计sgRNA以利用CRISPR/Cas9系统的多重能力，并特异缺失个别外显子或系列外显子以恢复肌养蛋白读框，与基于寡核苷酸的外显子跳跃的方法类似。为此目的，将sgRNA靶向外显子51 (图16C)或外显子45-55 (图16D)周围的内含子区。使这些sgRNA有意靶向最接近欲包括在所得转录物中的外显子下游或上游的位点，以使背景患者缺失将包括内含子sgRNA靶位点的可能性降到最小。
实施例6
靶向人细胞中的肌养蛋白基因的sgRNA的筛选
对人HEK293T细胞系中的基因编辑频率进行了评价以快速测定不同的sgRNA打靶效率。将HEK293T用编码人密码子优化SpCas9和指定sgRNA的构建体转染。按规定，设计各sgRNA以修饰肌养蛋白基因。在转染后第3天或第10天，通过Surveyor测定法测定基因修饰的频率。计算在第3天和第10天所测Surveyor信号的比率以量化人细胞中各sgRNA的基因编辑频率的稳定性。如转染后3通过天Surveyor测定法测定的，29/32 (约90%)的所测sgRNA能够在预期的基因座中介导高效的基因修饰(表9，图17)。基因编辑频率对几乎所有的sgRNA都稳定(从第3天到第10天的信号变化<25%，表9，图18)，表明了由每个个别sgRNA介导的基因编辑是极耐受的。一个明显的例外是CR33，其在第10天没可检测的活性，虽然活性可低于Surveyor测定法的灵敏度(估计约1%)。
Figure 240159DEST_PATH_IMAGE030
Figure DEST_PATH_IMAGE031
实施例7
使用基于荧光的报道分子系统富集基因编辑的细胞
选择sgRNA以纠正DMD患者成肌细胞系的特定突变。在转染至DMD成肌细胞中后，如通过Surveyor测定法测量的，观察到未意料到的低的或未检出的基因修饰活性(图19C，整群)。采用流式细胞术，通过与SpCas9蛋白连接的2A核糖体跳跃肽选择共表达GFP的转染的细胞(图19A)。将该荧光报道分子加入SpCas9表达载体中似乎不会显著影响HEK293T细胞中的基因编辑活性(图19B)。在电穿孔后3天，低百分比的转染成肌细胞(约0.5-2%)表达荧光报道分子，尽管对照GFP表达质粒的高转染效率(通常>70%，图19D，pmaxGFP)。鉴于在容易转染的HEK293T系中高水平的CRISPR/Cas9活性，在将SpCas9-T2A-GFP和sgRNA构建体电穿孔至DMD细胞中后低效的转基因表达可解释未分选细胞中低的实测基因编辑效率。在分选GFP阳性DMD成肌细胞后，在大部分sgRNA靶基因座上，观察到可检测活性的大幅增加(图19C)。因此，所有随后的实验使用通过该荧光报道分子表达针对SpCas9表达分选的细胞。
实施例8
通过靶定的移码修复肌养蛋白表达
通过NHEJ DNA修复产生的少量插入和缺失可用来产生靶定移码以纠正异常读框。设计sgRNA CR3，以通过在外显子51内引入少量插入和缺失恢复肌养蛋白读框(图16B、20A)。来自用SpCas9和CR3 sgRNA的表达质粒共转染的HEK293T细胞的基因组DNA的等位基因，通过Sanger测序评价在该基因座上通过CRISPR/Cas9产生的插入和缺失的类型(图20B)。显然，插入和缺失导致转换成所有3个读框(图20B、20C)。为了证实相关患者细胞系中的遗传纠正，将SpCas9和CR3 sgRNA的表达质粒电穿孔至具有通过在外显子51中产生移码可纠正的外显子48-50的缺失的DMD成肌细胞系中。处理的细胞经分选，通过Surveyor测定法证实具有基因修饰活性(CR3，图19C分选群)，并分化成肌管以测试恢复的肌养蛋白表达。观察到肌养蛋白表达伴以可检测的核酸酶活性(图20D)。酿脓链球菌CRISPR/Cas9系统提供快速产生靶定移码以克服多种患者突变并恢复人肌养蛋白基因表达的有力方法。
实施例9
多重CRISPR/Cas9基因编辑介导外显子51的基因组缺失并拯救肌养蛋白表达
CRISPR/Cas9系统的多重能力提供有效产生用于靶定基因纠正的特定外显子的基因组缺失的新的方法。如图19中，将具有通过外显子51跳跃可纠正的背景缺失的DMD患者成肌细胞用侧接外显子51的sgRNA的两种组合(CR1/CR5或CR2/CR5)处理，并分选以富集基因编辑的细胞。如这些处理细胞的基因组DNA的终点PCR所检测的，当将两种sgRNA电穿孔至具有SpCas9的细胞时，预期的基因组缺失才存在(图21A)。对于两种缺失，Sanger测序证实远端染色体区段的预期连接处(图21B)。在区分出分选的成肌细胞后，只在用两种sgRNA处理的细胞中，观察到来自mRNA转录物的外显子51的缺失(图21C)。最后，在处理细胞中检测到恢复的肌养蛋白表达伴以外显子51的实测基因组水平和mRNA水平缺失(图21D)。
实施例10
通过多外显子大基因组缺失拯救肌养蛋白
虽然克服患者特异性突变是CRISPR/Cas9系统的重大用途，但是开发可克服多种常见的患者缺失的单一方法将是有利的。例如，一种有前景的策略是排除整个外显子45-55区作为纠正高达62%的已知患者缺失的方法。测试基于多重CRISPR/Cas9的基因编辑以测定它是否能够在人细胞中产生外显子45-55基因座的有效缺失。在转染至HEK293T细胞中后，通过基因组DNA的PCR检出约336,000 bp的预期缺失(图22A)。同样，通过来自SpCas9/sgRNA处理的DMD患者细胞的基因组DNA的PCR检出该缺失，所述细胞带有外显子48-50的未知长度的背景缺失(图22A)。来自经处理的DMD细胞的基因组DNA的该缺失条带的Sanger测序显示内含子44和内含子55的预期连接处与sgRNA靶位点直接邻接(图22B)。在处理的DMD细胞分化后，在肌养蛋白mRNA转录物中检出外显子45-55的预期缺失，通过Sanger测序证实是外显子44和56的融合物(图22C)。通过蛋白质印迹，在含有CRISPR/Cas9诱导的来自基因组外显子45-55的缺失和所得mRNA转录物的分选细胞群中观察到恢复的蛋白质表达(图22D)。这些数据表明，多重CRISPR/Cas9编辑在超过60%的DMD患者突变中提供恢复肌养蛋白读框的单一通用方法。
实施例11
将纠正的成肌细胞移植到免疫缺陷型小鼠中
对于DMD疗法的一种有前景的方法是纠正可植入患者骨骼肌组织以拯救肌养蛋白表达的自体患者肌肉祖细胞群。为了证实纠正的细胞体内表达人肌养蛋白的能力，如前所述，移植用侧接外显子51的sgRNA CR1和CR5处理的DMD成肌细胞群，并针对GFP的表达进行分选(图19、图23)。4周后，在注射的肌肉组织的冰冻切片中，观察到通过纠正和未纠正的细胞两者表达的对人血影蛋白呈阳性的肌纤维(图24)。这些纤维的许多也对人肌养蛋白呈阳性，其表达定位于肌膜，表明了这些细胞中的功能性基因纠正(图24，图25)。在来自注射未处理DMD成肌细胞的小鼠的切片中，未观察到对人肌养蛋白呈阳性的纤维(图24、图25)，表明了CRISPR/Cas9修饰的细胞是人肌养蛋白表达的来源。
实施例12
脱靶和细胞毒性分析
如前所述，通过改编基于流式细胞术的GFP保留测定法，针对精选的sgRNA，评价了人细胞中CRISPR/Cas9系统的相对细胞毒性(Ousterout等, Mol Ther 21:1718-1726(2013))。在转染到人细胞中后，针对有或没有sgRNA的SpCas9共表达，观察到最小细胞毒性(图26A)。可根据sgRNA前间区序列中指定错配的预测位置偏倚和预期靶位点错配的总数，获得可公开获取的工具以评价和优选列出脱靶基因座上潜在的CRISPR/Cas9活性(Hsu等，Nat Biotechnol 31:827-826 (2013))。利用这种公众网页服务器预测用于纠正该研究中的肌养蛋白基因的sgRNA的最可能的脱靶位点(表4)。通过Surveyor测定法评价用SpCas9和CR1、CR3、CR5、CR6或CR36的各sgRNA表达盒处理的HEK293T细胞中最前面的10个潜在的脱靶位点。各自具有这10个预测的脱靶基因座之一的CR1、CR3和CR36表明基因修饰的显著水平(表4和图27)。引人关注的是，CR3脱靶序列具有与预期中靶基本相同和相似的修饰频率(在OT-1上的9.3%相对于在预期位点上的13.3%) (表4和图27)。显然，CR3-OT1是通过Surveyor测定法在分选hDMD细胞中显示显著活性水平的这3个脱靶位点中的唯一一个(图26B)。
通过在不同染色体上在切割的靶标和脱靶基因座之间的远端再连接，在脱靶位点上的核酸酶活性可能引起非预期的染色体重排。由于使用两种或更多种核酸酶(例如在多重CRISPR/Cas9基因编辑中)引起脱靶活性的潜力增加所致，这对基于缺失的基因纠正策略提出重大顾虑。在单一和多重CRISPR/Cas9编辑策略两者中，使用高灵敏嵌套基因组PCR测定法探测潜在易位，以检测经证实的脱靶基因座上的易位(表4)。采用该测定法，在也显示高水平的脱靶活性的模式HEK293T细胞系中，在中靶和脱靶位点之间容易检出易位(图26C和图28A、28B)。PCR扩增子的Sanger测序证实各引物对的预测易位事件的特性(图29-30)。在HEK293T细胞中检出的一类易位也可在分选的hDMD成肌细胞通过嵌套PCR检出，虽然信号较弱得多，且未证实序列同一性由产物产量低所致(图26D和图28A、28C)。分别在HEK293T或用CR6或CR6/CR36处理的分选hDMD细胞中，采用该测定法未检出易位(图28)，只在HEK293T细胞中在CR6-OT3处具有低水平的脱靶活性(表4)。这些结果强调选择高特异性sgRNA特别对于多重编辑应用的重要性，并且表明该方法可获益于不断的努力以改进CRISPR/Cas9系统的特异性。这些数据表明，所选的sgRNA能够纠正肌养蛋白基因而无重大毒性且仅单一强有力预测的具有可检出的活性水平的脱靶位点。
实施例13
论述
基因组编辑是用于纠正遗传疾病的有力工具，CRISPR/Cas9系统的最新发展显著加快该领域的进展。表明了DMD，一种目前还没有经批准的治疗选择方法的最常见的遗传疾病得到纠正。DMD的许多基于基因和基于细胞的疗法处于临床前研究和临床试验中，而且基因组编辑方法与许多这类方法相容。例如，基因组编辑可与DMD的患者特异性基于细胞的疗法联合。正如所示，CRISPR/Cas9系统可在人多能干细胞和其它人细胞系以及人骨骼成肌细胞中起作用。重要的是，用CRISPR/Cas9的基因编辑不会完全破坏这些细胞的生肌能力，正如在移植到免疫缺陷型小鼠中体外和体内有效的肌养蛋白表达所证实的一样。因此，这种策略应与DMD的基于细胞的疗法相容。
另外，基因纠正的细胞的富集库显示在植入免疫缺陷型小鼠后体内人肌养蛋白的表达。如通过稳定的基因编辑频率和几种sgRNA的最低细胞毒性所观察的，CRISPR/Cas9基因编辑在人成肌细胞中没有明显的毒性作用。然而，证实了5种sgRNA间在50个预测的脱靶位点中有3个有基因编辑活性，且在中靶和脱靶位点之间可检出基因编辑活性。CRISPR/Cas9技术是用于纠正大部分肌养蛋白突变的有效和多用途的方法，可用作治疗遗传疾病的通用平台。
另外，与本文所用的基于质粒的递送方法形成对比，sgRNA和Cas9 mRNA的直接转染可用来通过降低Cas9表达的持续时间并消除随机质粒整合的可能性，提高特异性和完全性。或者，对于该方法的体内基因组编辑和翻译，可使用通过病毒、质粒或RNA递送载体将CRISPR/Cas9系统直接递送至骨骼和/或心肌。大尺寸的酿脓链球菌Cas9基因(约4.2千碱基)对其在大小受限制的腺伴随病毒载体中的用途提出了挑战。然而，来自其它菌种(例如脑膜炎奈瑟球菌和嗜热链球菌(S. thermophilus)的Cas9基因短到足以将Cas9和sgRNA表达盒两者有效包装入单一AAV载体中用于体内基因编辑应用。
CRISPR/Cas9系统使有效修饰几乎90%的受测靶标成为可能，与不同基因座上该系统的稳健活性的其它报告一致。该技术的稳健性和多用途对于任意创建患者特异性基因编辑是一个重大进展。低水平的肌养蛋白，包括少至4%的野生型表达，可足以提高小鼠模型的存活、运动功能和心脏功能。CRISPR/Cas9活性的水平对于治疗益处可能是足够的。
与CRISPR/Cas93复用的缺失外显子的用途还提供一类独特的机会和挑战。进行了从基因组缺失完整外显子以恢复肌养蛋白表达，与用在单一核酸酶作用后由基于NHEJ的DNA修复产生少量得失位恢复肌养蛋白基因的读框形成对比。经编辑的基因的蛋白质产物是可预测的，已在有天然存在的缺失的贝克肌营养不良患者中表征，与通过单一核酸酶的外显子内作用所创建的随机得失位(将导致产生来自各DNA修复事件的新的表位)形成对照。此外，对于每个成功的基因编辑事件，产生于外显子缺失的产物将导致恢复的肌养蛋白，而用外显子内的随机得失位修饰基因将只恢复导致纠正读框的编辑事件的三分之一的读框。
所有所测的sgRNA与人细胞中的重大细胞毒性作用无关。对于所用的5种sgRNA，自50个总的受测位点中鉴定出恢复肌养蛋白表达的3个潜在脱靶位点。此外，在表达高水平的Cas9和sgRNA的HEK293T细胞中，通过高灵敏嵌套PCR测定法，可检出预期的中靶位点和这些脱靶位点之间的染色体易位。显然，在HEK293T细胞(其是一种表达极高水平的Cas9和sgRNA的永生化和非整倍的细胞系)中鉴定的脱靶活性和易位不以高水平发生，并且在某些情况下在hDMD成肌细胞中无法检出。重要的是，鉴于DMD的严重性，这种特异性水平可以是耐受的，在人细胞中缺乏明显的细胞毒性作用。
实施例14
开发了工程改造的AAV衣壳，称为SASTG (图34；SEQ ID NO: 436和437)用于改进的心肌和骨骼肌组织嗜性(Piacentino等(2012) Human Gene Therapy 23:635-646)。靶向Rosa26基因座的ZFN (“Rosa26 ZFN”；图33；SEQ ID NO: 434和435)显示在小鼠细胞中是有高度活性的(Perez-Pinera等, Nucleic Acids Research (2012) 40:3741-3752)。设计编码Rosa26 ZFN蛋白的AAV-SASTG载体，随后通过UNC Viral Vector Core产生并纯化。采用Surveyor测定法(Guschin等, Methods Mol Biol 649, 247-256 (2010))以表明在培养的C2C12成肌细胞中递送AAV-SASTG Rosa26 ZFN后在Rosa26基因座上的NHEJ诱变，所述细胞主动循环，或通过除去血清被强制分化(未显示)。
为了证实在AAV转移后成熟有丝分裂后骨骼肌被Rosa26 ZFN有效靶中，将编码Rosa26 ZFN的AAV-SASTG载体以le10载体基因组(vg)或2.5el0 vg/肌肉的滴度直接注射到6周龄C57BL6/J小鼠的胫骨前肌(TA)肌肉中。在注射后4周处死小鼠，收获TA肌肉，分割成几段用于基因组DNA提取和分析(图31)。对基因组DNA进行PCR扩增，并进行Surveyor测定法以检测Rosa26靶位点上ZFN诱变的NHEJ突变特性(图32)。图32显示在递送AAV-SASTG-ROSA后Surveyor分析的体外和体内骨骼肌中的Rosa26 ZFN活性。增殖性C2C12用指定量的病毒转导，在感染后4天收获(图32(a))。使C2C12在分化培养基孵育5天，然后在24孔板中用指定量的AAV-SASTG-ROSA病毒转导(图32(b))。在转导后10天收集样品。将指定量的AAV-SASTG-ROSA直接注射到C57BL/6J小鼠的胫骨前肌，并在感染后4周收获肌肉。将收获的肌肉分割成8个单独的块用于基因组DNA分析，其各自在单独的泳道中显示(图32(c))。显然，在最高剂量(2.5el0 vg)下，在所有节段中检出高水平的基因修饰。
实施例15
靶向突变型肌养蛋白基因的AAV-CRISPR构建体
设计AAV构建体以治疗性地纠正引起杜兴型肌营养不良及骨骼和心肌变性的肌养蛋白基因的突变。CRISPR/Cas9系统可使用AAV递送以通过缺失外显子51、缺失外显子45-55、中断剪接供体或受体位点或在外显子51内产生移码(Ousterout等, MolecularTherapy 2013)恢复肌养蛋白读框以恢复肌养蛋白读框和蛋白质表达。CRISPR/Cas9系统可包括具有SEQ ID NO: 64或114的序列的Cas9 (参见图40和41)。提供可与这些Cas9组合靶向其各自的PAM序列的gRNA (参见图40和41；另参见表2和3)。
实施例16
诱导神经元(iN)的产生
从其它细胞谱系中产生诱导神经元(iN)在神经疾病的再生医学和研究中具有潜在应用。小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)直接转换成功能性神经元细胞可通过递送3种神经元转录因子-BRN2、ASCL1和MYT1L的混合物(BAM因子，图48)而发生。其它方法可包括诱导不同神经元亚型的其它因子。这些实验需要异位递送的转录因子，并激活相应的内源基因座以保持神经元表型。将CRISPR/Cas9系统改造成多用途转录因子以激活具有通过RNA指导的机制靶向基因组中的任何启动子的哺乳动物细胞的内源基因(图49A、49B)。
材料与方法。使用CRISPR/Cas9-转录因子激活编码ASCL1和BRN2的内源基因以指导MEF重编程成功能性诱导神经元。
细胞培养：将MEF接种到24孔TCPS板上或聚D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片上。在dCas9-VP64转导和gRNA转染后(对于gRNA的序列参见表10和11)，将细胞在MEF培养基(Adler等, Mol Ther Nucleic Acids 1:e32 (2012)中培养24小时，然后转移到N3神经诱导培养基(Vierbuchen等, Nature 463:1035-1041 (2010))中持续实验的持续时间(图49B)。
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qRT-PCR和IF：在dCas9-VP64和gRNA、ASCL1 cDNA或编码萤光素酶的阴性对照载体递送的第3天，通过在MEF中的qRT-PCR和免疫荧光，评价内源ASCL1的激活。通过TUJ1和MAP2共染色，且鉴定具有神经元形态和延长的细胞突的细胞，评价iN的产生。
活细胞报道分子：在N3培养基中7-8天后，将在聚D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片上培养的MEF用携带hSyn-RFP和MAP2-GCamP5报道分子的病毒转导以通过钙成像和电生理学针对功能特征鉴定大部分成熟的iN (图49B)。
结果。dCas9-VP64和靶向ASCL1启动子的gRNA激活MEF中的内源基因。相对于通过共同递送4种gRNA诱导激活的100倍，8种gRNA的共同递送激活内源基因400倍显著增加(p<0.05) (图50A)。通过免疫荧光，检出MEF中核定位的ASCL1蛋白。与dCas9-VP64与gRNA混合物相比，异位Ascl1表达产生更多的ASCL1蛋白，但是到第3天不激活内源基因座(图50A、50B)。在递送dCas9-VP64和靶向ASCL1和BRN2启动子的gRNA后，在神经发生培养基中13天之后，通过免疫荧光，鉴定出具有延长的细胞突的TUJ1和MAP2共阳性细胞(图51A第一行)。用BAM因子的异位表达，鉴定出类似数目的TUJ1和MAP2共阳性细胞(图51A第二行)。在神经发生培养基中早在第11天，在培养物中可观察到表达hSyn-RFP报道分子具有神经元形态的细胞(图51B)。表达MAP2-GCaMP5钙指示物的细胞显示用荧光显微镜检出的KCl诱导的去极化(图52A、52B)。
小鼠胚胎成纤维细胞直接转换成具有神经元形态的TUJ1和MAP2共阳性细胞通过经由基于CRISPR/Cas9激活的转录因子的内源BRN2和ASCL1来实现。虽然dCas9-VP64比ASCL1的异位表达产生较少的蛋白质(图50B)，但是神经元样细胞的产生相似。内源基因座的激活可诱导与用异位表达产生的在机械理论上不同的事件的重编程级联。
dCas9-VP64能够渗入异染色质，并激活稳定沉默的内源基因，唯一的一亚类“先驱(pioneer)”转录因子的特性。因此，用CRISPR/Cas9-转录因子转化细胞谱系可比转录因子的异位表达更好地克服重编程的外遗传障碍，特别是难以重编程细胞类型，例如成人细胞。这在再生医学领域可具有临床重要性，因为在细胞替代疗法常常需要使用自体源。
实施例17
基于多重CRISPR/Cas9的基因组工程改造—材料和方法
质粒构建体。如上所述，使用酿脓链球菌sgRNA和人密码子优化的Cas9 (hCas9)核酸酶的表达盒。使用GeneBlocks (IDT)，合成mU6 (Ohshima等, Nucleic Acids Res 9:5145-5158 (1981))、H1 (Myslinski等, Nucleic Acids Res 29:2502-2509 (2001))和7SK (Murphy等, Cell 51:81-87 (1987)) pol-III启动子的其它启动子，并克隆以替换hU6 sgRNA表达盒。将GeneBlock (IDT)克隆至Cas9编码序列的3’端以紧接Cas9之后融合T2A跳跃肽和eGFP基因以监测载体表达。然后将hCas9-T2A-GFP的编码区(SEQ ID NO: 145)转移至慢病毒表达载体中，所述载体含有驱动hCas9-T2A-GFP表达的人泛素C (hUbC)启动子以及促进紧接hUbC启动子上游的sgRNA表达盒的Golden Gate克隆的限制位点(图42A)。
用于定制慢病毒载体装配的方案。表达高达4种选定的sgRNA和有活性的Cas9、dCas9或dCas9-VP64的定制慢病毒载体的装配在少于5天内完成。克隆方法采用GoldenGate克隆和切割其识别序列以外产生独特突出端的IIS型限制性内切酶。Golden Gate装配加快完成克隆，因为所有4种表达盒在一个步骤中连接进入最终的慢病毒载体中。除来自独立启动子的1、2、3或4种sgRNA表达以外，慢病毒载体表达有活性的Cas9、cCas9或dCas9-VP64。
步骤1：使各含有20 bp前间区的单链寡核苷酸以产生黏性末端的所述方式退火，并连接至所需的pZ供体-启动子载体中。订购各个所需的基因组靶的2个单链寡核苷酸。为了使互补寡核苷酸退火，将8 µL有义寡+ 8 µL反义寡(两者为10mM) + 2 µL 10X连接酶缓冲液混合。使寡核苷酸解链，并在PCR机中按以下程序以步骤之间-0.3℃/秒钟速率再退火：96℃持续300秒钟，接着85℃持续20秒钟、75℃持续20秒钟、65℃持续20秒钟、55℃持续20秒钟、45℃持续20秒钟、35℃持续20秒钟和25℃持续20秒钟。为了使黏性末端磷酸化，加入1 µL 25mM ATP + 1微升T4多核苷酸激酶(NEB)，在37℃下温育60分钟接着65℃温育20分钟以使酶热灭活。按照生产厂说明书，在10 μL反应体积中，使用50ng载体和1 μL退火寡核苷酸，使用在16℃下温育60分钟的T4 DNA连接酶(NEB)使各前间区连接至所需的表达载体中。按照生产商的说明书，将5微升连接物转化至XL1 blue化学感受态细菌(Agilent)中。将板变换成含有50 μg/mL卡那霉素(Sigma)的LB琼脂板，在37℃下温育过夜。按我们的经验，>90%的菌落将含有所需的连接产物。在进入步骤2之前，进行了使用M13反向标准测序引物的测序，以证实各最终的sgRNA构建体。
步骤2：使用Golden Gate装配构建进入慢病毒目标载体的4个启动子-gRNA盒。在完成步骤1后，有4种各自表达来自不同启动子的不同sgRNA的独立质粒。为了将4种不同的启动子-sgRNA构建体装配进入所需的目标载体中，将200 ng各sgRNA表达质粒和所需的慢病毒目标载体与1 μL T4 DNA连接酶(NEB)、1 μL BsmBI FastDigest (FisherScientific)和2 μL 10X T4连接酶缓冲液(NEB)在20 μL反应体积中混合。如下温育反应物：37℃持续10分钟，16℃持续15分钟，37℃持续30分钟，80℃持续5分钟。按照生产商的说明书，将5μL连接反应转化至SURE 2化学感受态细胞(Agilent)中。将板转换至含有100 μg/mL氨苄西林的LB琼脂板中，在37℃下温育过夜。任选可使用IPTG和X-gal，通过基于lacZ的蓝/白色筛选菌落；然而，按我们的经验，>90%的转化株含有合适的连接产物。由于通过反向sgRNA表达盒形成的反向重复序列，最终的构建体可能不稳定，因此我们建议将这些质粒在SURE 2细胞系中维持，并使用有义引物5’-TCGGGTTTATTACAGGGACAGCAG-3’ (SEQ ID NO:464)和反义引物5’-TCTAAGGCCGAGTCTTATGAGCAG-3’ (SEQ ID NO:465)，用试验PCR筛选最终的质粒。这些引物跨4个启动子-gRNA区扩增。由于重复性质所致，应观察到不同的带型，其最大产物的大小为约1800 bp。
细胞培养和转染。HEK293T细胞经由杜克大学癌症中心机构获自美国组织保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并在补充10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中维持。原生人真皮成纤维细胞(Catalog ID：GM03348)获自Coriell Institute (Camden，New Jersey)，并在补充10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中维持。将所有细胞在37℃、5% CO2下培养。按照生产商的方案，用Lipofectamine 2000 (Life Technologies)，将HEK293T细胞在24孔板中用200 ng各sgRNA表达载体(800 ng总的pDNA)转染。
病毒产生和转导。本研究所用的所有慢病毒载体均为第二代，并采用标准病毒生产方法生产。简单地讲，每10cm培养皿接种350万个HEK293T。次日，通过磷酸钙转染方法用20μg转移载体、6μg pMD2G和10μg psPAX2转染细胞。转染后12-14小时更换培养基。在该培养基更换后24和48小时收集病毒上清液，通过0.45微米滤器，并合并。对于转导，将细胞培养基用补充4μg/mL聚凝胺(polybrene)的病毒上清液更换。12-24小时后，将病毒上清液更换为新鲜培养基。
反转录PCR。使用miRNeasy Mini RNA分离试剂盒(Qiagen)分离RNA。使用不含DNA的试剂盒(Applied Biosystems)进行DNA酶消化。使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒(Invitrogen)进行cDNA合成。使用Taq DNA聚合酶(NEB)对cDNA进行PCR扩增，使所得产物在TAE琼脂糖凝胶中电泳。采用ChemiDoc XRS+系统拍摄图像，并应用ImageLab软件(Bio-Rad)处理。
定量实时PCR。使用RNeasy Plus RNA分离试剂盒(Qiagen)分离RNA。使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒(Invitrogen)进行cDNA合成。用CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)，进行使用PerfeCTa SYBR Green FastMix (Quanta Biosciences)的实时PCR。通过琼脂糖凝胶电泳和解链曲线分析，证实引物特异性。计算适当的动态范围内的反应效率以确保标准曲线的线性。采用ΔΔCt方法，将结果表示为归一化至β-肌动蛋白表达的目标基因mRNA表达的倍数增加。报告值为2个独立实验(n = 2)的均值和S.E.M.，其中对于各实验，对技术性一式两份取平均。
蛋白质印迹。将细胞在补充蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的RIPA缓冲液(Sigma)中裂解。采用BCA蛋白质测定法试剂(Thermo Scientific)和BioTek Synergy 2 Multi-Mode微量板读数器，测量蛋白质浓度。将裂解物与加载缓冲液混合，并煮沸5分钟；使25μg蛋白质在NuPage 10% Bis-Tris凝胶聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)中电泳，并转移到硝酸纤维素膜上。将非特异性抗体结合用TBST (50mM Tris，150mM NaCl和0.1% Tween-20)与5%脱脂奶在室温下封闭1小时。使膜与以下第一抗体在以下条件下温育：抗MyoD (1:250，Santa CruzSc-32758)在含5% BSA的TBST中在4℃下过夜；抗Myogenin (1:250，Santa Cruz Sc-12732)在5% BSA中在4℃下过夜；抗FLAG-HRP (1:1000，Cell Signaling 2044)在含5%牛奶的TBST在室温下60分钟；抗GAPDH (1:5000，Cell Signaling，克隆14C10)在含5%牛奶的TBST中在室温下30分钟。然后将膜用TBST洗涤3次共15分钟。将膜与1:5,000稀释的抗兔HRP缀合的抗体(Sigma，6154)或抗小鼠HRP缀合的抗体(Santa Cruz，SC-2005)一起温育30分钟，用TBST洗涤3次各15分钟。使用ImmunStar WesternC化学发光试剂盒(Bio-Rad)观察膜，采用ChemiDoc XRS+系统拍摄图像，并应用ImageLab软件(Bio-Rad)处理。
内源基因修饰的Cel-I定量测定。采用可检测核酸酶介导的NHEJ的突变特性的Surveyor核酸酶测定法，定量测定内源靶位点处的CRISPR/Cas9核酸酶损害。在转染或转导后，将细胞在37℃下温育3-10天，使用DNeasy血液与组织试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA。用AccuPrime High Fidelity PCR试剂盒(Invitrogen)，通过35个PCR循环扩增靶基因座。使所得PCR产物随机解链，并在PCR机中按以下程序在步骤之间以-0.3℃/秒钟速率再退火：95℃持续240秒钟，接着85℃持续60秒钟，75℃持续60秒钟，65℃持续60秒钟，55℃持续60秒钟，45℃持续60秒钟，35℃持续60秒钟和25℃持续60秒钟。在再退火后，将8 μL PCR产物与1μL Surveyor核酸酶S和1 μL增强子S (Transgenomic，Omaha，NE)混合，在42℃下温育1小时。在温育后，将6 μL消化产物加载到10% TBE聚丙烯酰胺凝胶上，以200 V电泳30分钟。将凝胶用溴化乙锭染色，通过光密度测定法使用ImageLab (Bio-Rad)定量测定(Perez-Pinera等, Nucleic Acids Res 40:3741-3751 (2012))。
统计分析。将至少2个独立实验编制为均值和均值的标准误差。应用JMP 10 Pro，用多变量ANOVA和Dunnett事后检验评价作用。
实施例18
用于多重CRISPR/Cas9应用的单一慢病毒载体的开发
现行CRISPR/Cas9基因编辑系统，特别是反式激活蛋白系统的限制，是用于多重基因编辑和协同基因激活应用(尤其在难以转染细胞类型中)同时有效地递送多种sgRNA和Cas9蛋白。为了克服这种限制，我们开发了有效表达Cas9和多达4种sgRNA的单一慢病毒载体。为了使各sgRNA的表达效率最大化，该载体表达来自独立pol III启动子(人U6启动子、小鼠U6启动子、7SK和H1)的4种sgRNA。我们证实了终点RT-PCR的各启动子的sgRNA表达以检测靶向AAVS1基因座的sgRNA (图42A)。为了检测各sgRNA表达构建体的活性，我们将独立表达靶向AAVS1的sgRNA的各启动子构建体与活性Cas9表达构建体共转染至人HEK293T细胞中。显然，我们检出与充分表征的在AAVS1基因座上具有高活性的锌指核酸酶相当的各sgRNA在靶基因座上的一致和高水平的基因修饰(图42B)。此外，基于不同Cas9的构建体，包括有活性的Cas9核酸酶、死Cas9和与VP64反式激活蛋白结构域融合的死Cas9的慢病毒递送，导致HEK293T细胞中全长Cas9蛋白的表达，如通过蛋白质印迹测定的一样(图42C)。
使用这些成分，我们开发了Golden Gate克隆方法以促进多个sgRNA表达盒快速有效地克隆至表达所需Cas9效应子的单一慢病毒载体中(图43)。在第一步中，将编码sgRNA前间区序列的寡核苷酸独立地克隆至各自具有驱动sgRNA表达的不同启动子的不同的表达载体中。在第二步中，通过Golden Gate装配，将各sgRNA表达构建体亚克隆至所选的慢病毒Cas9表达载体中。这种策略允许将多达4种sgRNA快速稳健克隆至单一慢病毒载体中用于基因编辑或激活应用。为了表达少于4种sgRNA，在未使用的启动子下游克隆PolyT终止子序列以防止从未使用的启动子转录。各载体通过2A跳跃肽共表达所选的Cas9与eGFP以使具有高感染复数的细胞的荧光激活流式细胞分选和富集成为可能。最后，含有sgRNA和Cas9表达盒的整个区域的两侧是loxP位点以介导通过Cre-lox切除的去除。
实施例19
用于多重基因组工程改造的单一慢病毒sgRNA/Cas9表达载体的验证
为了证实各sgRNA的独立活性，我们装配了表达有活性的Cas9和各自靶向独立基因座的4种sgRNA的单一慢病毒载体(图44A)。作为对照载体，我们装配了表达仅一种sgRNA连同在其它3个位置处的polyT前间区的构建体。我们用表达指定sgRNA的慢病毒载体转导HEK293T和原生成纤维细胞，分别在转导后7或10天监测基因修饰频率(图44B)。在两种细胞类型中，单一慢病毒载体在所有4个基因座上介导高效的多重编辑(图44B)。引人关注的是，在成纤维细胞的4基因座中的3个中，所有4种sgRNA一起的表达导致比单一sgRNA高的修饰频率(图44B)。在按惯例是难以转染的细胞类型的成纤维细胞中，我们观察到有效的多重基因编辑。这些数据表明，单一慢病毒可有效表达4种有活性的sgRNA，该慢病毒平台可用来靶向4个不同的基因座用于多重CRISPR/Cas9基因编辑。
实施例20
稳定表达基于慢病毒Cas9的反式激活蛋白的细胞系中的瞬时RNA指导基因激活
接下来，我们将兴趣放在开发通过将sgRNA转染至稳定表达Cas9的模式细胞系中使瞬时基因激活成为可能的系统。将HEK293T用不同的Cas9-T2A-GFP转导，采用流式细胞术监测GFP表达。在每2-3天正常传代后，各细胞系显示稳定的GFP表达直到转导后35天。然后将转导的HEK293T用靶向IL1RN或HBG1启动子的1-4种单独的sgRNA表达构建体转染。这些sgRNA构建体在稳定表达dCas9-VP64的细胞系中的瞬时转染导致可调节内源基因激活(图45A、45B)。在表达dCas9-VP64的细胞中sgRNA构建体瞬时转染后，基因激活在转染后约3-6天达到最大激活水平，到转染后20天下降到未检出的水平(图45CD、45D)。此外，我们能够通过第二次转染靶向各启动子的所有4种sgRNA构建体重新激活各基因，尽管激活水平显著低于第一次转染所观察到的(图45C、45D)。第二次转染后的这种活性降低可能是由于载体表达降低或未转导细胞的竞争性生长所致。尽管如此，这些数据表明慢病毒Cas9与瞬时sgRNA递送组合可用作多用途系统在Cas9稳定转导的细胞系中可调节且瞬时激活和重新激活靶基因。
实施例21
HEK293T细胞中使用单一慢病毒sgRNA/Cas9反式激活蛋白表达载体的稳定基因激活
慢病毒递送可通过CRISPR/Cas9反式激活使长期稳定的基因激活成为可能。为了检验这一点，使用编码dCas9-VP64和1-4种sgRNA表达盒的单一慢病毒载体转导HEK293T。与我们的瞬时转染结果类似(图45)，我们能够可调节且稳健地激活内源IL1RN和HBG1基因的表达(图46A、46B)。通过用dCas9-VP64和靶向IL1RN和HBG1启动子的4种sgRNA共转染HEK293T细胞诱导的基因激活在转染后3-5天达到峰值，在转染后15-20天，基因表达回到背景水平。相比之下，dCas9-VP64和相同4种靶定IL1RN或HBG1的sgRNA的慢病毒递送诱导持续的基因激活在转导后超过20天(图46C、46D)。因此，多重dCas9-VP64反式激活蛋白的单一慢病毒递送是稳定有效地增量调节靶内源基因的有用平台。
实施例22
dCas9-KRAB—靶向HS2增强子
HS2增强子是充分表征的激活珠蛋白基因基因座所必需的远端调节元件。递送dCas9-KRAB与靶向HS2增强子的gRNA以确定该系统是否可在K562人类红细胞白血病细胞系中阻抑γ-、ε-和β-珠蛋白表达(图54)。产生靶向沿HS2增强子的核心区(SEQ ID NO: 467)的不同位点的一组gRNA。参见表12。
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通过CRISPR/dCas9筛选珠蛋白基因座上的单一gRNA。在用5 µg编码U6-sgRNA的表达质粒电穿孔前5-8天，用慢病毒递送dCas9和dCas9-KRAB效应物(图55A)。包括不用gRNA电穿孔的细胞(无gRNA)和用靶向不同基因座的gRNA处理的细胞(IL1RN)作为对照。在转染后3天测定时，多种gRNA实现ε-、γ-和β-珠蛋白基因的有效阻抑，达到高达80%敲除(图55B、55C、55D)。表达gRNA与dCas9或dCas9-KRAB抑制珠蛋白基因座上的基因表达。总的来讲，与仅dCas9相比，用dCas9-KRAB处理导致指定gRNA的较强阻抑，表明了KRAB结构域在募集提高阻抑的异染色质因子中的重要作用。所达到的阻抑水平依赖于只在dCas9-KRAB处理细胞中通过转染所递送的gRNA质粒的量(图56A、56B、56C)。增加Cr4 gRNA质粒的剂量直到10 µg提高在dCas9-KRAB处理细胞中沉默珠蛋白基因的水平。
通过dCas9-KRAB使珠蛋白基因稳定沉默。通过慢病毒使dCas9/dCas9-KRAB与单一gRNA在K562中共表达(图57A)。包括不用慢病毒处理(NT)、用dCas9/dCas9-KRAB但无gRNA处理(无gRNA)和用dCas9/dCas9-KRAB和靶向不同基因座(IL1RN)的gRNA处理的细胞作为对照。从第4天到第7天选择用慢病毒处理的细胞。当在转导后7天测定时，多种gRNA实现ε-、γ-和β-珠蛋白基因的有效转录阻抑，达到高达95%敲除(图57B、57C、57D)。ε-珠蛋白的表达大多在响应靶定HS2增强子的gRNA时沉默。与用dCas9和gRNA处理相比，用dCas9-KRAB与gRNA处理导致显著更多的阻抑。
这些观察结果表明，通过gRNA靶向HS2增强子的dCas9-KRAB实现远端珠蛋白基因的有效阻抑。这是在哺乳动物细胞中通过CRISPR/Cas9系统靶定外遗传控制的远端调节元件的第1个实例。增强子调节发育和疾病，并且本公开内容提供探测并控制增强子功能的方法，且可用来测定dCas9-KRAB对局部染色质可及性和全基因组表达的作用。
实施例23
dCas9-p300
设计dCas9-p300融合蛋白，并与dCas9-VP64融合蛋白进行比较(参见图59)。dCas9构建的氨基酸构建体见图61A-61C。在用Lipofectamine 2000转染试剂(LifeTechnologies)转染前1天，将人胚肾(Human Embryonic Kidney)组织培养系HEK293T的细胞(ATCC；CRL-11268)以1.5e5个细胞/孔的密度接种在24孔组织培养培养皿中。24小时后，将细胞用1µL Lipofectamine 2000、375ng dCas9表达构建体(分别为dCas9、dCas9VP64或dCas9p300)和125ng合并的gRNA表达质粒(4种，各为等摩尔比率)转染。表13显示gRNA信息。
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收获转染后3天的细胞，通过RT-QPCR测定mRNA表达。RT-QPCR引物序列列于表14中。
表14 RT-QPCR引物
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采用ΔΔCt方法，将RT-QPCR归一化至GAPDH表达。结果表示为相对于仅用Lipofectamine而无DNA转染处理的细胞(“无DNA”)，目标基因表达的倍数增加(参见图60A-60C)。
图62显示p300 HAT结构域中的残基突变引起其激活基因表达的能力丧失。图63显示多种gRNA与dCas-9-p300协同作用，如与dCas-9-VP64所示一样。
实施例24
图64显示来源于肌养蛋白基因中携带不同缺失的人类DMD患者的骨骼成肌细胞系中肌养蛋白的Dp427m骨骼肌同种型5’UTR的微小肌养蛋白的TALEN介导的整合。将DMD患者细胞用编码对5’UTR基因座有活性的TALEN对的构建体和携带微小肌养蛋白基因的供体模板电穿孔。图64(a)显示微小肌养蛋白如何整合至5’UTR中的示意图。图64(b)显示分离潮霉素抗性克隆细胞系，并使用图64(a)所示引物，通过PCR筛选在5’UTR上的成功位点特异性整合。星号标出选择用于图64(c)中的进一步分析的克隆。图64(c)显示使具有检出整合事件的克隆分离的DMD成肌细胞分化6天，并评价与微小肌养蛋白C端融合HA标签的表达。
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附录
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AAV/Rosa26构建体(SEQ ID NO: 456)
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HS2增强子靶序列(SEQ ID NO:467)
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dSpCas9-KRAB序列(SEQ ID NO:466)
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGatggcccccaagaagaagaggaaggtgggccgcggaATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGCCATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAAACCGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCtgcaGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGgatcCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATGCCATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAgcacGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGGCGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCTCCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGctagCGATGCTAAGTCACTGACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTGTTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCCTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAGAGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAGAGACTGCATTTGAAATCAAATCATCAGTTCCGAAAAAGAAACGCAAAGttGctagCG

Claims (21)

1.一种融合蛋白，其包含第一多肽结构域和第二多肽结构域，所述第一多肽结构域包含成簇有规间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，所述第二多肽结构域具有选自以下的活性：转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸酶活性、核酸缔合活性、甲基化酶活性和脱甲基酶活性。
2.一种DNA打靶系统，其包含权利要求1的融合蛋白和至少一种指导RNA (gRNA)。
3.权利要求2的DNA打靶系统，其中所述至少一种指导RNA靶向选自以下的基因的启动子区：ASCL1、BRN2、MYT1L、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2和MYOD1；或者
其中所述至少一种指导RNA包含SEQ ID NO: 5-40、65-144、492-515、540-563和585-625的至少一个。
4.一种结合肌养蛋白基因的DNA打靶系统，所述DNA打靶系统包含Cas9和至少一种指导RNA (gRNA)。
5.一种结合γ珠蛋白基因的DNA打靶系统，所述DNA打靶系统包含Cas9和至少一种指导RNA (gRNA)。
6.一种多核苷酸，其编码权利要求1的融合蛋白或权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统。
7.一种载体，其包含权利要求6的多核苷酸。
8.一种病毒载体，其包含编码成簇有规间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白的第一多核苷酸和编码至少一种指导RNA (gRNA)的第二多核苷酸。
9.一种用于调节细胞中基因表达的组合物，所述组合物包含权利要求1的融合蛋白、权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸或权利要求7或8的载体。
10.一种用于诱导细胞中基因表达的组合物，所述组合物包含权利要求1的融合蛋白、权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸或权利要求7或8的载体。
11.一种用于在受试者中调节或编辑基因的组合物，所述组合物包含权利要求1的融合蛋白、权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸或权利要求7或8的载体。
12.一种用于在受试者的肌肉中调节或编辑基因的组合物，所述组合物包含腺伴随病毒(AAV)载体和编码位点特异性核酸酶的多核苷酸。
13.一种细胞，其包含权利要求1的融合蛋白、权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体或权利要求9-12中任一项的组合物。
14.一种药盒，其包含权利要求1的融合蛋白、权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体、权利要求9-12中任一项的组合物或权利要求13的细胞。
15.一种调节细胞中至少一个内源基因的表达的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1的融合蛋白、权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体或权利要求9-12中任一项的组合物接触。
16.一种激活细胞中的内源基因的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1的融合蛋白、权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体或权利要求9-12中任一项的组合物接触。
17.一种使细胞转分化或诱导细胞分化的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1的融合蛋白、权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体或权利要求9-12中任一项的组合物接触。
18.一种在细胞中进行多重基因编辑的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1的融合蛋白、权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体或权利要求9-12中任一项的组合物接触。
19.一种纠正细胞中的突变基因的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1的融合蛋白、权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体或权利要求9-12中任一项的组合物接触。
20.一种在受试者肌肉中进行基因组编辑的方法，所述方法包括使肌肉与权利要求1的融合蛋白、权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体或权利要求9-12中任一项的组合物接触，其中所述肌肉是骨骼肌或心肌。
21.权利要求1的融合蛋白、权利要求2-5中任一项的DNA打靶系统、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的载体或权利要求9-12中任一项的组合物在制备用于治疗受试者的疾病或病况的药物中的用途。
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