CN110214184A - τ蛋白调节剂以及用于其递送的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开文本属于阿尔茨海默病的诊断学和治疗学领域，涉及疾病基因的体内遗传调节。

Description

τ蛋白调节剂以及用于其递送的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求以下专利申请的权益：2016年12月1日提交的美国临时申请号62/428,871；2017年1月26日提交的美国临时申请号62/450,895；2017年3月2日提交的美国临时申请号62/466,198；2017年5月3日提交的美国临时申请号62/500,807；和2017年11月10日提交的美国临时申请号62/584,342，将它们的公开内容通过引用以其全文特此并入。
技术领域
本公开文本涉及τ蛋白病变如阿尔茨海默病的诊断学和治疗学领域。
背景技术
许多也许是大多数生理和病理生理过程可能与基因表达的异常上调或下调相关。仅举几例，例子包括类风湿性关节炎中促炎性细胞因子的不当表达、高胆固醇血症中肝LDL受体的过低表达、实体瘤生长中的促血管生成因子的过表达和抗血管生成因子的过低表达。另外，病原性生物体(如病毒、细菌、真菌和原生动物)可以通过改变基因表达来控制。
基因的启动子区典型地包含近侧、核心和下游元件，并且可以通过多个增强子来调节转录。这些序列含有多种转录因子的多个结合位点，并且可以激活转录，与关于启动子序列的位置、距离或定向无关。为了实现基因表达调节，结合增强子的转录因子环出(loopout)间插序列并接触启动子区。另外，真核基因的激活可能需要染色质结构的解压缩，这可以通过募集组蛋白修饰酶或ATP依赖性染色质重构复合物来实施，使得改变染色质结构并且提高基因表达中所涉及的其他蛋白质对DNA的可及性(Ong和Corces(2011)Nat RevGenetics 12:283)。
染色质结构的扰动可以通过若干种机制来发生，其中一些机制局限于特定基因，并且其他机制是全基因组范围的并且在需要染色质凝集的细胞过程(如有丝分裂)期间发生。组蛋白上的赖氨酸残基可以被乙酰化，从而有效中和组蛋白与染色体DNA之间的电荷相互作用。这种机制已经在高度乙酰化并且高度转录的β-球蛋白基因座中被观察到，还已经显示所述基因座对DNA酶(一般可及性的标志)敏感。已经观察到的其他类型的组蛋白修饰包括甲基化、磷酸化、脱氨、ADP核糖基化、β-N-乙酰基葡糖胺糖的加成、泛素化和SUMO化(参见Bannister和Kouzarides(2011)Cell Res 21:381)。
已经通过使用工程化的转录因子完成了对疾病相关基因的阻遏或激活。设计和使用工程化的锌指转录因子(ZFP-TF)的方法有充分记录(参见例如美国专利号6,534,261)，并且更近地，也已经描述转录激活因子样效应子转录因子(TALE-TF)和基于成簇规律间隔短回文重复序列Cas的转录因子(CRISPR-Cas-TF)二者(参见综述Kabadi和Gersbach(2014)Methods 69(2):188-197)。所靶向基因的非限制性例子包括受磷蛋白(Zhang等,(2012)MolTher 20(8):1508-1515)、GDNF(Langaniere等,(2010)J.Neurosci 39(49):16469)和VEGF(Liu等,(2001)J Biol Chem 276:11323-11334)。另外，基因的激活已经通过使用CRIPSR/Cas-乙酰转移酶融合来实现(Hilton等,(2015)Nat Biotechnol 33(5):510-517)。还已经显示阻遏基因表达的工程化TF(阻遏物)在治疗三核苷酸障碍(如亨廷顿氏病(Huntington's Disease，HD))中有效。参见，例如，美国专利号8,956,8282和美国专利公开号2015/0335708。
阿尔茨海默病(AD)是复杂的多因子病，特征是尚未完全理解的若干种不同的疾病机制，并且这些机制以迄今没有充分理解的方式彼此相互作用。估计有五百三十万所有年龄段的美国人患有AD，使其成为美国十大死因之一，并且据估计截至2050年，全世界将有一亿零六百二十万人患有这种疾病(van Dijk等,(2015)Front Neurosci 9,art.173)。这种疾病在女性中更流行(三分之二的病例)，并且非洲或西班牙血统人种比高加索血统人种更可能发展AD。AD的病因显现与遗传学因素(尤其对于早期发作，5％的病例)以及环境和生活方式因素相关。典型地，这种疾病是在人六十五岁左右被诊断出，但截至做出诊断时，疾病已经进展了数年或甚至数十年。这种疾病继续随时间进展，并且迄今还没有鉴别出减小或逆转所述疾病的影响的治疗干预。
这种疾病的标志是脑中的突触损失，这导致认知减退。在健康的脑中，人们认为是突触可塑性的存在允许学习和记忆形成。在AD过程期间，突触可塑性被改变，并且许多参与维持这种可塑性的机制失调，导致突触功能障碍和崩溃(Spires-Jones和Hyman(2014)Neuron 82:756)。
但是显现有许多分子因子影响AD的发作和进展，大多数科学焦点集中于这种疾病中的两种主要参与者。第一种参与者是淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的40-42个氨基酸的片段，称为淀粉样蛋白β(Aβ)，其是通过β分泌酶和γ分泌酶的蛋白水解裂解而产生的(Olsson等,(2014)J Biol Chem 289(3):1540-1550)。不溶性Aβ片段在脑中的‘老年’斑中积累，但是在这些斑块的存在与神经变性之间似乎不存在严格的相关。
另一种作用物τ蛋白已受到大量关注。τ蛋白是微管相关蛋白，最初被认为可稳定微管。在AD患者中，以及在老人中(通常，但程度较低)，τ蛋白可以在神经原纤维缠结(NFT)中积累。在这种疾病的过程期间，τ蛋白变得过度磷酸化并且从微管脱离，并在细丝中积累。与Aβ斑块相比，NFT的存在与认知减退之间存在直接相关(Spires-Jones和Hyman，出处同上)。
有趣的是，τ蛋白和Aβ二者显现都在正常的突触功能中具有重要作用。τ蛋白显现在将细胞中的线粒体转运至突触中具有重要作用，并且已经显示，τ蛋白的过表达抑制此转运。由于线粒体在ATP产生和钙缓冲中所起的必要作用，线粒体转运受损被认为引起突触损失。Aβ显现在健康细胞中的突触可塑性中起作用。然而，这两种蛋白质在斑块和缠结中的积累与AD进展相关。事实上，显现淀粉样蛋白斑块的出现在AD的最早阶段中是重要的，并且这导致NFT的出现，并且这两种蛋白质实际上彼此协同作用，加快了疾病的进展(Pooler等,(2015)Acta Neuropath Comm 3(14):1)。然而，越发明显的是，这些蛋白质的可溶形式促进毒性(Spires-Jones和Hyman，出处同上)。
事实上，τ蛋白的异常水平和/或聚集涉及到多种病症，统称为τ蛋白病变。这些病症包括阿尔茨海默病AD、额颞叶痴呆(FTD，参见Benussi等,(2015)Front Ag Neuro 7,art.171)、进行性核上麻痹(PSP)、难治性遗传性癫痫(例如Dravat综合征，参见Gheyara等,(2014)Ann Neurol 76:443-456)和皮质基底节变性(CBD，参见Scholz和Bras 2015,IntJ.Mol Sci 16(10):24629-24655)。使用直接进入脑脊髓液(CSF)中的反义寡核苷酸减少成年小鼠中的τ蛋白表达引起τ蛋白水平完全或部分降低，并且还在癫痫发作严重性方面防止所治疗小鼠出现化学诱导的癫痫发作(DeVos等,(2013)J of NeuroSci 33(31):12887)。
已经显示AD以分级模式行进经过脑，在内嗅皮层开始，然后蔓延经过海马体结构、边缘皮层和联合皮层，并且最终在疾病的晚期阶段影响大部分脑区域。有趣的是，AD的进展通过NFT的出现来标记，其暗示疾病较晚阶段的τ蛋白。甚至已经提出，τ蛋白可具有朊病毒样特性，因为工作显示，错误折叠的高度磷酸化的τ蛋白更容易被神经元吸收并且可经脑传播疾病，并且从AD患者的脑分离的这种错误折叠的τ蛋白可以容易地被小鼠神经元吸收(Takeda等,(2015)Nat Comm doi:10.1038/ncomms9490；Hyman(2014)Neuron 82:1189)。另外，用转基因小鼠模型进行的工作显示，在没有任何可检测的人类τ蛋白表达的情况下，与只在小鼠脑的内嗅皮层中的缠结形成有关的人类τ蛋白突变体的表达导致小鼠τ蛋白的错误折叠和所述τ蛋白在神经元中的聚集(de Calignon等,(2012)Neuron 73:685-697)，表明错误折叠的人类蛋白质能够‘接种’错误折叠并引起小鼠蛋白质的聚集。此外，内源小鼠τ蛋白的遗传性减少或损失可抵抗由于突变体人类τ蛋白转基因过表达引起的神经病理性毒性(Wegmann等,(2015)EMBO J.34(24):3028-41)。
因此，对预防和/或治疗τ蛋白病变(包括AD、FTD、PSP CBD和癫痫发作)的方法仍然存在需要；包括对展现广泛递送至脑的方式存在需要。
发明内容
本文公开了用于诊断、预防和/或治疗一种或多种τ蛋白病变(如阿尔茨海默病(AD))的方法和组合物。特定地，本文提供了用于修饰τ蛋白等位基因(例如，调节其表达)以治疗至少一种τ蛋白病变(如AD)的方法和组合物，所述方法和组合物包括工程化的转录因子阻遏物(其阻遏τ蛋白表达)。此外，这些方法和组合物可以用于修饰用于治疗和/或预防其他τ蛋白病变(包括AD、FTD、PSP CBD和/或癫痫发作)的τ蛋白等位基因。特定地，本文提供了用于在患有τ蛋白病变的受试者中检测、减少和/或消除τ蛋白聚集体的方法和组合物。
因此，本文描述了微管相关蛋白τ蛋白(MAPT)基因的遗传调节剂，所述调节剂包含：DNA结合结构域，其结合至MAPT基因中至少12个核苷酸的靶位点；和功能结构域(例如，转录调节结构域(如阻遏结构域或激活结构域)或核酸酶结构域)。可以使用任何DNA结合结构域，包括但不限于锌指蛋白(ZFP)、TAL效应子结构域蛋白(TALE)、单一指导RNA(属于CRISPR系统)、Argonaute蛋白等。还提供一种或多种多核苷酸，包括编码如本文所述的遗传调节剂(或其在相同或不同多核苷酸上的一种或多种组分)的病毒和非病毒基因递送运载体(例如，作为mRNA、质粒、AAV载体、慢病毒载体、Ad载体)。在某些实施方案中，基因递送运载体包含AAV载体，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV 8.2、AAV9、AAV rh10，这些载体的假型(例如，作为AAV2/8、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/9等)，包括本领域已知的AAV载体变体(例如美国专利号9,585,971和美国临时专利申请号62/503,121)。还提供药物组合物和分离的细胞，其包含一种或多种遗传调节剂、一种或多种多核苷酸和/或一种或多种基因递送运载体。本发明还提供在有需要的受试者中调节MAPT表达的方法和用途，包括通过向所述受试者提供如本文所述的一种或多种多核苷酸、一种或多种基因递送运载体和/或药物组合物来进行。在某些实施方案中，本文所述的组合物用于阻遏受试者中的MAPT表达，包括用于治疗和/或预防τ蛋白病变(例如，通过减少受试者中τ蛋白的量)。本文所述的组合物在持续时间段中(6个月至1年或更久)在脑(包括但不限于额皮质、前部皮质、后部皮质、海马体、脑干、纹状体、丘脑、中脑、小脑)和脊髓(包括但不限于腰段、胸段和颈段区域)中降低τ蛋白水平。可将本文所述的组合物通过任何给予方式提供给受试者，所述给予方式包括但不限于脑室内、鞘内、颅内、静脉内、眼眶(眶后(RO))和/或脑池内给予。还提供包含一种或多种如本文所述的组合物(例如，遗传调节剂、多核苷酸、药物组合物和/或细胞)以及这些组合物的使用说明的试剂盒。
因此，在一个方面中，提供一种或多种τ蛋白基因的工程化的(非天然存在的)遗传调节剂(例如，阻遏物)。遗传τ蛋白调节剂可包含调节(例如，阻遏)τ蛋白等位基因的表达的系统(例如，锌指蛋白、TAL效应子(TALE)蛋白或CRISPR/dCas-TF)。工程化的锌指蛋白或TALE是非天然存在的锌指或TALE蛋白，其DNA结合结构域(例如，识别螺旋或RVD)已经发生改变(例如，通过选择和/或合理设计)以结合至预先选择的靶位点。本文所述的任何锌指蛋白可包括1、2、3、4、5、6或更多个锌指，每个锌指具有识别螺旋，所述识别螺旋结合至一个或多个所选择序列(例如，一种或多种基因)中的靶亚位点。类似地，本文所述的任何TALE蛋白可包括任一数目的TALE RVD。在一些实施方案中，至少一个RVD具有非特异性DNA结合特征。在一些实施方案中，至少一个识别螺旋(或RVD)是非天然存在的。CRISPR/Cas-TF包括结合至靶序列的单一指导RNA。在某些实施方案中，工程化的转录因子结合至(例如，通过ZFP、TALE或sgRNA DNA结合结构域)τ蛋白编码基因中的至少12个碱基对的靶位点，例如表1至3中包含至少12个(例如，12、13、14、15、16、17、18或更多个)碱基对(包括这些靶位点内的连续或不连续序列)的靶位点(SEQ ID No:1-6、33和44-46)。在某些实施方案中，锌指蛋白DNA结合结构域具有表1至3中任一表格所示蛋白质中的识别螺旋，包括表1、2和3中命名为52288、52322、52366、57890、57880、65888、52364、52389、65894、57930、65918、65920、65887、57947、65968、65976或65860的ZFP。在某些实施方案中，遗传调节剂是遗传阻遏物，其包含与转录阻遏结构域可操作连接的如本文所述的DNA结合结构域(ZFP、TALE、单一指导RNA)。在其他实施方案中，遗传调节剂是遗传阻遏物，其包含与至少一个核酸酶结构域(例如，1个、2个或更多个核酸酶结构域)可操作连接的如本文所述的DNA结合结构域(ZFP、TALE、单一指导RNA)。所得核酸酶能够遗传修饰(通过插入和/或缺失)靶基因，所述靶基因位于，例如，一个或多个DNA结合结构域靶序列内；一个或多个裂解位点内；一个或多个靶序列和/或一个或多个裂解位点附近(相距1-50或更多个碱基对)；和/或在使用一对核酸酶进行裂解时，位于成对靶位点之间。
在某些实施方案中，可以将如本文所述的锌指蛋白(ZFP)、CRISPR/Cas系统的Cas蛋白或TALE蛋白置为与作为融合蛋白的部分的调节结构域(或功能结构域)操作性连接。功能结构域可以是例如转录激活结构域、转录阻遏结构域和/或核酸酶(裂解)结构域。通过选择与DNA结合结构域一起使用的激活结构域或者阻遏结构域，此类分子可以用于激活或阻遏τ蛋白表达。在某些实施方案中，功能或调节结构域可以在组蛋白翻译后修饰中起作用。在一些情况下，结构域是组蛋白乙酰转移酶(HAT)、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、组蛋白甲基化酶、或sumo化或生物素化组蛋白的酶结构域，或允许翻译后组蛋白修饰调节的基因阻遏的其他酶结构域(Kousarides(2007)Cell 128:693-705)。在一些实施方案中，提供了包含如本文所述的靶向τ蛋白基因(例如，MAPT)的ZFP、dCas或TALE的分子，所述ZFP、dCas或TALE融合至可以用于下调τ蛋白表达的转录阻遏结构域。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗真核生物。在某些实施方案中，调节结构域的活性受外源小分子或配体调节，使得在外源配体不存在的情况下不会发生与细胞的转录机构的相互作用。此类外部配体控制ZFP-TF、CRISPR/Cas-TF或TALE-TF与转录机构的相互作用的程度。一个或多个调节结构域可与ZFP、dCas或TALE中的一个或多个的任何一个或多个部分操作性连接，所述部分包括在一个或多个ZFP、dCas或TALE之间，在一个或多个ZFP、dCas或TALE外部，及其任一组合。在优选实施方案中，调节结构域导致阻遏所靶向τ蛋白基因的基因表达。可将本文所述的任何融合蛋白配制为药物组合物。
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物包括使用两种或更多种如本文所述的融合蛋白，例如两种或更多种τ蛋白调节剂(例如，τ蛋白阻遏物)。两种或更多种融合蛋白可结合至不同靶位点并且包含相同或不同的功能结构域。可替代地，如本文所述的两种或更多种融合蛋白可结合至相同靶位点，但包括不同的功能结构域。在一些情况下，使用三种或更多种融合蛋白，在其他情况下，使用四种或更多种融合蛋白，而在其他情况下，使用五种或更多种融合蛋白。在优选实施方案中，将两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者五种或更多种融合蛋白作为核酸递送至细胞。在优选实施方案中，融合蛋白引起对所靶向基因的表达的阻遏。在一些实施方案中，以多种剂量给予两种融合蛋白，其中每种蛋白质自身具有活性，但组合时的阻遏活性是加和性的。在优选实施方案中，以多种剂量给予两种融合蛋白，其中任一蛋白质自身均没有活性，但组合时的阻遏活性是协同性的。
在一些实施方案中，可将如本文所述的工程化DNA结合结构域置为与作为融合蛋白的部分的核酸酶(裂解)结构域操作性连接。在一些实施方案中，核酸酶包含Ttago核酸酶。在其他实施方案中，核酸酶系统(如CRISPR/Cas系统)可与特定的单一指导RNA一起用于将核酸酶靶向DNA中的靶位置。在某些实施方案中，此类核酸酶和核酸酶融合物可用于靶向干细胞(如诱导性多潜能干细胞(iPSC)、人类胚胎干细胞(hESC)、间充质干细胞(MSC)或神经元干细胞)中的τ蛋白等位基因，其中核酸酶融合物的活性将导致τ蛋白等位基因的表达减少。在某些实施方案中，提供了包含经修饰干细胞的药物组合物。
在又另一方面中，提供了编码本文所述的DNA结合蛋白、核酸酶和/或转录因子中的任一种的多核苷酸。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含至少一种AAV载体(或其假型或变体)，包括但不限于一种或多种AAV2、AAV2/9、AAV6或AAV9载体，包括但不限于一种或多种如美国专利号9,585,971或美国专利号7,198,951中所述的AAV载体和/或一种或多种如美国临时专利申请号62/503,121中所述的AAV载体。
在其他方面中，本发明包含将供体核酸递送至靶细胞。供体可在编码一种或多种核酸酶的核酸之前、之后或一起递送。供体核酸可包含要整合到细胞的基因组(例如，内源基因座)中的外源序列(转基因)。在一些实施方案中，供体可包含全长基因或其侧接有与所靶向裂解位点具有同源性的区域的片段。在一些实施方案中，供体缺少同源性区域并通过非同源性依赖性机制(即，NHEJ)被整合至靶基因座中。供体可包含任何核酸序列，例如如下核酸，其在作为底物用于对核酸酶诱导的双链断裂的同源定向修复时，导致供体特有的缺失在内源染色体基因座处产生，或者可替代地(或另外)内源基因座的新颖等位基因形式(例如，切除转录因子结合位点的点突变)产生。在一些方面中，供体核酸是寡核苷酸，其中整合导致基因修正事件或靶向缺失。在一些实施方案中，供体编码能够阻遏τ蛋白表达的转录因子。在其他实施方案中，供体编码抑制τ蛋白表达的RNA分子。
在一些实施方案中，编码DNA结合蛋白的多核苷酸是mRNA。在一些方面中，mRNA可进行化学修饰(参见例如Kormann等,(2011)Nature Biotechnology 29(2):154-157)。在其他方面中，mRNA可包含ARCA帽(参见美国专利号7,074,596和8,153,773)。在另外的实施方案中，mRNA可包含未经修饰和经修饰核苷酸的混合物(参见美国专利公开号2012/0195936)。
在又另一方面中，提供了包含如本文所述的任何多核苷酸(例如，编码遗传调节剂(阻遏物))的基因递送载体。在某些实施方案中，所述载体是腺病毒载体(例如，Ad5/F35载体)、慢病毒载体(LV)(包括整合胜任的或整合缺陷性慢病毒载体)或腺病毒相关病毒载体(AAV)。在某些实施方案中，AAV载体是AAV2、AAV6或AAV9载体。在一些实施方案中，AAV载体是能穿越血脑屏障的AAV变体(例如美国专利号9,585,971和美国临时专利申请号62/503,121)。本文还提供了腺病毒(Ad)载体、LV或腺病毒相关病毒载体(AAV)，其包含编码至少一种核酸酶(ZFN或TALEN)的序列和/或用于靶向整合至靶基因中的供体序列。在某些实施方案中，Ad载体是嵌合Ad载体，例如Ad5/F35载体。在某些实施方案中，慢病毒载体是整合酶-缺陷性慢病毒载体(IDLV)或整合胜任的慢病毒载体。在某些实施方案中，用VSV-G包膜或用其他包膜将载体假型化。
另外，还提供了药物组合物，其包含核酸(例如，包含编码本文所述的人工转录因子(τ蛋白阻遏物)的序列的递送(例如AAV)载体)和/或蛋白质(例如ZFP、Cas或TALE，或者包含ZFP、Cas或TALE的融合蛋白)。例如，某些组合物包括核酸，所述核酸包含与调节序列可操作连接的编码本文所述的ZFP、Cas或TALE中的一种的序列，所述核酸与药学上可接受的载体或稀释剂组合，其中所述调节序列允许所述核酸在细胞中表达。在某些实施方案中，所编码的ZFP、CRISPR/Cas或TALE对突变体τ蛋白等位基因具有特异性。在一些实施方案中，药物组合物包含调节突变体τ蛋白等位基因的ZFP、CRISPR/Cas或TALE，以及调节神经营养因子的ZFP、CRISPR/Cas或TALE。基于蛋白质的组合物包括一种或多种如本文所公开的ZFP、CRISPR/Cas或TALE和药学上可接受的载体或稀释剂。
在又另一方面中，还提供了分离的细胞，其包含如本文所述的蛋白质、多核苷酸和/或组合物中的任一种。
在另一方面中，本文提供了使用本文所述的方法和组合物治疗和/或预防τ蛋白病变(如阿尔茨海默病或癫痫发作)的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及组合物，其中的多核苷酸和/或蛋白质可以使用病毒载体、非病毒载体(例如，质粒)和/或其组合来递送。在一些实施方案中，所述方法涉及包含干细胞群的组合物，所述干细胞群包含ZFP或TALE，或者经本发明的ZFN、TALEN、Ttago或CRISPR/Cas核酸酶系统改变。给予如本文所述的组合物(蛋白质、多核苷酸、细胞和/或包含这些蛋白质、多核苷酸和/或细胞的药物组合物)导致治疗(临床)效应，包括但不限于与AD、τ蛋白病变或癫痫发作相关的任何临床症状的改善或消除，以及CNS细胞(例如，神经元、星形胶质细胞、髓磷脂等)的功能和/或数目的增加。在某些实施方案中，本文所述的组合物和方法(如与不接受如本文所述的人工阻遏物的对照相比)将τ蛋白表达减少至少30％，或40％，优选地至少50％，甚至更优选地至少70％。在一些实施方案中，实现至少50％的减少。
在再另外的方面中，本文描述了使用病毒或非病毒载体将τ蛋白的阻遏物递送至受试者(例如，哺乳动物受试者，如小鼠、人类或非人灵长类动物(NHP))的脑的方法。在某些实施方案中，病毒载体是AAV载体，例如AAV9载体，或如美国专利号9,585,971或美国临时专利申请号62/503,121中所述的AAV载体变体。可通过任何适宜方式(包括通过使用插管或任何其他递送技术)递送至任何脑区域，例如海马体或内嗅皮层。提供将阻遏物广泛递送至受试者的脑(包括通过顺向轴突运输和逆向轴突运输至脑区域)的任何AAV载体不直接给予载体(例如，递送至壳核导致递送至其他结构，如皮质、黑质、丘脑等)。在某些实施方案中，受试者是人类，并且在其他实施方案中，受试者是非人灵长类动物。给予可呈单一剂量或呈多次给予(给予之间相隔任何时限)。
因此，在其他方面中，本文描述了预防和/或治疗受试者的τ蛋白病变(例如，AD)的方法，所述方法包括使用一种或多种AAV载体将τ蛋白等位基因的阻遏物给予受试者。在某些实施方案中，通过任何递送方法(包括但不限于脑室内、鞘内或脑池内递送)将编码阻遏物的AAV给予CNS(脑和/或CSF)。在其他实施方案中，将编码阻遏物的AAV直接给予至受试者的实质(例如，海马体和/或内嗅皮层)中。在其他实施方案中，编码阻遏物的AAV是静脉内(IV)给予的。在本文所述的任何方法中，给予可进行一次(单一给予)或可进行多次(给予之间相隔任何时间)。在多次给予时，可使用给予方式的相同或不同剂量和/或递送运载体(例如，IV和/或ICV给予的不同AAV载体)。所述方法包括例如在患有AD的受试者的AD神经元中减少受试者的τ蛋白聚集的方法(例如，减少τ蛋白聚集的NFT特征)；减少神经元或神经元群(例如，AD神经元或AD神经元群)的细胞凋亡的方法；减少神经元过度兴奋的方法；减小淀粉样蛋白β诱导的毒性(例如突触损失和/或神经炎性营养不良)的方法；和/或减少AD受试者的一种或多种认知功能损失的方法，上文所有方法都是与不接受所述方法的受试者相比，或者与接受所述方法之前的所述受试者自身相比。因此，本文所述方法导致τ蛋白病变的生物标志物和/或症状减少，所述生物标志物和/或症状包括以下各项中的一种或多种：神经毒性、神经胶质增生、营养不良性神经突、脊柱损失、兴奋性毒性、皮质和海马体萎缩、树突状τ蛋白积累、认知(例如，啮齿类动物模型中的放射臂迷宫和Morris水迷宫、恐惧条件化等)和/或运动缺陷。
在一些方面中，提供用于减少细胞中病原性τ蛋白种类的量的本发明的方法和组合物。在一些实施方案中，所述方法导致过度磷酸化τ蛋白的减少。在一些情况下，过度磷酸化τ蛋白的减少导致可溶或粒状τ蛋白的减少。在其他实施方案中，如与尚未遵循所述方法和/或用本发明组合物治疗的细胞或受试者相比，病原性τ蛋白种类的减少降低τ蛋白聚集并引起神经原纤维缠结(NFT)的减少。在另外的实施方案中，提供了逆转细胞中观察到的NFT的量的方法。在再另外的实施方案中，本发明的方法和组合物引起病原性τ蛋白种类(NFT、过度磷酸化τ蛋白)在受试者脑内的传播的减慢。在一些实施方案中，病原性τ蛋白横越脑的传播被阻止，并且在其他实施方案中，病原性τ蛋白横越脑的传播被逆转。在另外的实施方案中，脑中与淀粉样蛋白β斑块相关的营养不良性神经突的数目有所减小。在一些实施方案中，营养不良性神经突的数目减小至在年龄匹配的野生型脑中发现的水平。在另外的实施方案中，本文提供了用于减少受试者脑中与淀粉样蛋白β斑块相关的过度磷酸化τ蛋白的方法和组合物。
在本文所述的任何方法中，τ蛋白等位基因的阻遏物可以是ZFP-TF，例如包含特异性结合至τ蛋白等位基因的ZFP和转录阻遏结构域(例如，KOX、KRAB等)的融合蛋白。在其他实施方案中，τ蛋白等位基因的阻遏物可以是TALE-TF，例如包含特异性结合至τ蛋白等位基因的TALE多肽和转录阻遏结构域(例如，KOX、KRAB等)的融合蛋白。在一些实施方案中，τ蛋白等位基因阻遏物是CRISPR/Cas-TF，其中Cas蛋白中的核酸酶结构域已经失活，使得所述蛋白质不再裂解DNA。所得的Cas RNA指导的DNA结合结构域融合至转录阻遏物(例如KOX、KRAB等)以阻遏τ蛋白等位基因。
在一些实施方案中，将编码如本文所述的遗传调节剂(遗传阻遏物)(例如，ZFP-TF、TALE-TF或CRISPR/Cas-TF)的序列插入(整合至)基因组中，而在其他实施方案中，编码阻遏物的序列维持游离状态。在一些情况下，将编码TF融合物的核酸插入(例如，通过核酸酶介导的整合)安全的港口位点，所述安全的港口位点包含启动子，使得内源启动子驱动表达。在其他实施方案中，将阻遏物(TF)供体序列插入(通过核酸酶介导的整合)安全的港口位点中，并且供体序列包含驱动阻遏物表达的启动子。在一些实施方案中，使编码遗传调节剂的序列在递送后维持在染色体外(游离状态)，并且可包括异源启动子。启动子可以是组成型或诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子序列广泛地表达，而在其他实施方案中，启动子是组织或细胞/类型特异性的。在优选实施方案中，启动子序列是神经元细胞所特有的。在尤其优选的实施方案中，所选启动子的特征在于其具有低表达。优选启动子的非限制性例子包括神经特异性启动子NSE、突触蛋白、CAMKiia和MECP。遍在启动子的非限制性例子包括CAS和Ubc。另外的实施方案包括使用如美国专利公开号2015/0267205中所述的自调节启动子。
在再另外的实施方案中，阻遏物可包含核酸酶(例如，ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas系统)，所述核酸酶通过裂解τ蛋白等位基因并由此使τ蛋白等位基因失活来阻遏τ蛋白等位基因。在某些实施方案中，在通过核酸酶裂解后，核酸酶通过非同源末端接合(NHEJ)引入插入和/或缺失(“indel”)。在其他实施方案中，核酸酶引入供体序列(通过同源或非同源定向方法)，其中供体整合使τ蛋白等位基因失活。
在本文所述的任何方法中，可将阻遏物作为蛋白质、多核苷酸或蛋白质与多核苷酸的任一组合递送至受试者(例如，脑)。在某些实施方案中，使用AAV载体递送一种或多种阻遏物。在其他实施方案中，阻遏物的至少一种组分(例如，CRISPR/Cas系统的sgRNA)是作为RNA形式来递送。在其他实施方案中，使用本文所述的任何表达构建体的组合递送一种或多种阻遏物，例如一种阻遏物(或其部分)在一种表达构建体(AAV9)上并且一种阻遏物(或其部分)在单独的表达构建体(AAV或另一病毒或非病毒构建体)上。
此外，在本文所述的任何方法中，阻遏物可以按提供所需效应的任何浓度(剂量)来递送。在优选实施方案中，阻遏物是使用腺相关病毒(AAV)载体以10,000-500,000个载体基因组/细胞(或其之间的任一值)来递送。在某些实施方案中，阻遏物是使用慢病毒载体以介于250与1,000之间(或其之间的任一值)的MOI来递送。在其他实施方案中，阻遏物是使用质粒载体以0.01-1,000ng/100,000个细胞(或其之间的任一值)来递送。在其他实施方案中，阻遏物是作为mRNA以150-1,500ng/100,000个细胞(或其之间的任一值)来递送。
在本文所述的任何方法中，所述方法可以产生约50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约92％或更高或约95％或更高的对受试者的一个或多个AD神经元中的τ蛋白等位基因的阻遏。
在其他方面中，如本文所述的τ蛋白调节转录因子(如包含锌指蛋白(ZFPTF)、TALE(TALE-TF)和CRISPR/Cas-TF中的一种或多种(例如ZFP-TF、TALE-TF或CRISPR/Cas-TF)的τ蛋白调节转录因子)用于阻遏受试者脑(例如，神经元)中的突变体或野生型τ蛋白等位基因的表达。如与受试者的未经处理(野生型)神经元相比，所述阻遏可以是约50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、约75％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约92％或更高或约95％或更高的对受试者的一个或多个神经元中的τ蛋白等位基因的阻遏。在某些实施方案中，τ蛋白调节转录因子可以用于实现一种或多种本文所述的方法。
还提供试剂盒，其包含AAVτ蛋白调节剂(例如，阻遏物)和/或包含如本文所述的τ蛋白调节剂的组分和/或编码所述τ蛋白调节剂(或其组分)的多核苷酸中的一种或多种。所述试剂盒可进一步包含细胞(例如，神经元)、试剂(例如，用于检测和/或量化例如CSF中的τ蛋白)和/或使用说明(包括如本文所述的方法)。
附图说明
图1A至1D描绘在引入如本文所述的工程化MAPT遗传调节剂后的MAPT表达。图1A是显示MAPT基因内用于遗传调节剂的DNA结合分子的靶位点的示意图。用于这些实验的调节剂是阻遏物。图1B显示图表，所述图表显示在将所指示量的MAPT阻遏物(52322、52364、52366、52389、57880、57890和52288)或GFP或模拟对照以mRNA形式(从左至右分别以1000ng、300ng、100ng、30ng、10ng或3ng的所指示剂量)给予Neuro 2A细胞后24小时的MAPT表达。图1C描绘图表，所述图表显示在将MAPT阻遏物(52322、52364、52366、52389、57880、57890和52288)或GFP或模拟对照使用AAV9载体(具有CMV启动子)以3x 105vg/细胞、1x105vg/细胞、3x 104vg/细胞、1x 104vg/细胞的所指示剂量给予原代小鼠皮质神经元(MCN)后7天的MAPT表达。图1D显示图表，所述图表描绘57880和两种示例性衍生物(65887和65888)的τ蛋白(MAPT)阻遏和脱靶阻遏，所述衍生物包含ZFP骨架中的磷酸触点(phosphatecontact)中的突变。
图2A至2C描绘用通过AAV9载体运载的所指示阻遏物(52389)处理的MCN中的蛋白质水平(τ蛋白、GAPDH和ZFP)。图2A是蛋白质印迹，其显示在所指示AAV9剂量下，所指示蛋白质的蛋白质水平。图2B和图2C是显示在所指示剂量的AAV9-52389或模拟物(M)下，τ蛋白/GAPDH蛋白(顶部图)和ZFP/GAPDH(底部图)的比例的图表。
图3显示微阵列分析结果的结果，其显示所指示的阻遏物(52322、52364、52366、52389、57880、57890或52288)对MAPT基因的特异性。分析是在将呈mRNA形式的阻遏物以300ng给予Neuro2A细胞后24小时进行。结果论述于实施例3中。每个图表上方的数字代表表达增加(向上箭头)或减少(阻遏)(向下箭头)的基因数。
图4显示在将呈mRNA形式的阻遏物以300ng给予原代人类成纤维细胞后24小时，所指示阻遏物(52322、52364、52366、52389、57880、57890、52288)的微阵列分析结果的结果。结果论述于实施例3中。每个图表上方的数字代表表达增加(向上箭头)或减少(阻遏)(向下箭头)的基因数。
图5A和5B显示所指示阻遏物(52322、52364、52366、52389、57880、57890)的微阵列分析结果的结果。图5A显示在将通过AAV载体(AAV)运载的阻遏物以1x 105vg/细胞给予小鼠皮质神经元后7天的结果。结果论述于实施例3中。每个图表上方的数字代表表达增加(向上箭头)或减少(阻遏)(向下箭头)的基因数。图5B显示比较具有相同螺旋的两种阻遏物57880与65888的微阵列分析结果。57880蛋白的数据显示于顶部行中，而65888蛋白的数据显示于底部行中。65888从锌指骨架移除了一些潜在的磷酸触点(参见表2)，并且数据证实，在小鼠皮质神经元中，65888蛋白的特异性显著增加(在这些实验条件下，57880上调75种基因并阻遏110种基因，而65888上调3种基因并阻遏包括τ蛋白在内的4种基因)，同时维持类似的τ蛋白阻遏活性。
图6A和6B是描绘使用通过AAV载体(AAV9)运载的遗传阻遏物的细胞中的mRNA表达的图表，其中阻遏物的表达是由所指示的启动子(CMV、突触蛋白(SYN1)、α-钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶启动子(CamKII)和甲基CpG结合蛋白2启动子(MeCP2)的229bp片段)驱动的。图6A显示MCN中的表达。图6B显示原代海马体神经元中的表达。
图7A至7D显示人类iPSC衍生的神经元中的mRNA(人类τ蛋白和ZFP)水平。图7A是显示人类和小鼠MAPT靶位点(从左至右分别为SEQ ID NO:31、32和48-51)的部分序列的示意图。图7B显示图表，所述图表显示在以所指示剂量给予通过AAV载体运载的所指示阻遏物后18天，iPSC中的mRNA表达。图7C显示图表，所述图表显示在给予通过具有所指示启动子的AAV载体运载的所指示阻遏物(52366)后18天，iPSC中的mRNA表达。图7D是在人类iPSC衍生的神经元中使用示例性ZFP TF的一系列微阵列图，并且指示ZFP TF具有高特异性。在分析前使细胞暴露于包含ZFP-TF供体的AAV6的1E5达19天。
图8A至8H显示ZFP-TF的有效神经元转导和使用各种AAV载体递送τ蛋白阻遏物对小鼠受试者中mRNA(τ蛋白和ZFP)表达的体内效应。参见实施例6。图8A显示在AAV给予IV(右图)或ICV(左图)后，运动皮质(顶部图)、海马体(中图)和小脑(底部图)的有效转导。图8B显示通过关键τ蛋白病变区域的ICV和IV给予二者，有效的τ蛋白减少(约50％-70％减少)，所述区域包括运动皮质(左图，顶部行)、脑干(右图，顶部行)和海马体(底部左图)。图8C显示在AAV-ZFP-TF载体的IV或ICV给予后，整个脑和脊髓中的τ蛋白mRNA减少(约40％-70％减少)。对于每个海马体区段，图8D显示τ蛋白(MAPT)mRNA的水平，并且图8E显示阻遏物(ZFP)mRNA的水平。图8F是图表，所述图表描绘在使用AAV载体给予本文所述的τ蛋白阻遏物后，整个CNS和脊髓中对τ蛋白的稳健阻遏(左图显示52389阻遏物并且右图显示57890阻遏物)。图8G是图表，所述图表描绘在给予所指示组合物的动物的皮质(左图)和海马体(右图)中，τ蛋白阻遏是快速的并持续几个月(“GFP”是指GFP对照；“172”是指不结合至MAPT的无关对照ZFP-TF；“52389”是指在AAV构建体上运载的52389阻遏物；“57890”是指在AAV构建体上运载的本文所述的57890阻遏物；并且“PBS”是指仅接受PBS的动物的对照)。图8G中的顶部行描绘τ蛋白mRNA表达，并且底部行描绘归一化的τ蛋白水平。图8H是图表，所述图表显示接受所指示组合物(“VEH”是指仅给予运载体的对照动物；“172V”是指接受不结合至在AAV载体上运载的MAPT的无关对照ZFP-TF的动物；“389V”是指在AAV构建体上运载的52389阻遏物；并且“890V”是指在AAV构建体上运载的本文所述的57890阻遏物)的动物的CSF(顶部行，左图)、皮质(顶部行，右图)和海马体(顶部行，最右图)中的总小鼠τ蛋白水平。还显示(底部行)统计学分析，其显示CSF与皮质(右图)和海马体(左图)中的水平之间的相关。
图9A至9D描绘使用如实施例6中所述的统计学分析对MAPT的体内调节(阻遏)的进一步分析。图9A显示所有切片的ANOVA和之后的Sidak检验后分析(顶部图显示τ蛋白，底部图显示ZFP)。图9B显示平均最大τ蛋白减少(顶部图显示τ蛋白，底部图显示ZFP)。图9C显示在用52322MAPT阻遏物治疗的动物中，MAPT与ZFP-TF水平之间的高度相关。图9D显示在用52389MAPT阻遏物治疗的动物中，MAPT与ZFP-TF水平之间的高度相关。
图10A至10D是图表，所述图表描绘在注射至海马体中后，在体内用τ蛋白特异性ZFP-TF治疗后的MAPT(τ蛋白)mRNA阻遏。在这个实验中，使用四种不同的启动子(CMV、SNY1、CAMKII或MeCP2)来驱动ZFP-TF-venus构建体的表达。图10A显示在注射后6周τ蛋白的表达，并且不管选择哪种启动子，所述表达在所有接受ZFP-TF的动物中都展示减少。星号指示信号如与PBS对照相比的显著性(对于所有启动子，p<0.0001)。图10B显示来自各种启动子的ZFP-TF的表达，其中在用CAMKII驱动的载体治疗的动物中检测到最高的ZFP-TF表达。对于每个治疗组(图10C)，通过GFAP的检测，测量激活的星形胶质细胞的存在。在这个实验中，与注射PBS的动物相比，MeCP2启动子没有导致GFAP升高，SYN1导致高4.0倍的GFAP水平(P<0.0001)，CMV导致高3.2倍的水平(P<0.01)，并且CAMKII导致高2.4倍的水平(P<0.05)。类似地，还在治疗组中确定小胶质细胞的存在(图10D)，其中与注射PBS的动物相比，MeCP2启动子不导致IBA1水平显著变化，SYN1导致高4.7倍的IBA1水平(P<0.0001)，CMV导致高3.0倍的水平(P<0.05)，并且CAMKII导致高3.2倍的水平(P<0.001)。
图11是显示图10中所述组中τ蛋白表达的减少的图表。与注射PBS的对照水平(269ng/ml)相比，rAAV9-SYN1-52389V构建体导致23％的对照水平(61ng/ml，P<0.0001)，rAAV9-CAMKII-52389V构建体产生18％的对照水平(49ng/ml，P<0.0001)，rAAV9-SYN1-52389V构建体具有12％的对照水平(32ng/ml，P<0.0001)。因此，神经元启动子能够在整个小鼠海马体中驱动>80％的τ蛋白mRNA和蛋白质减少。
图12A至12F描绘海马体和相连脑区域中的τ蛋白减少的组织学证明。将包含由CMV启动子驱动的τ蛋白特异性ZFP-TF的AAV递送至海马体以通过免疫荧光染色评价内源τ蛋白减少。将ZFP-TF连接至荧光蛋白Venus以供检测，并在注射后6周处死动物。图12A是海马体的横截面并描绘4个加框区域以供更仔细的研究。图12B是来自图12A的框1的特写，并且显示GFP/DAPI染色(左图)；GFP/τ蛋白/DAPI(中图)和τ蛋白(右图)。图12C是横越框1的荧光强度的图表，其展示截面同侧中的τ蛋白的减少(右图)。图12D显示框2的特写，而图12E是框3的特写，其展示同侧上τ蛋白染色的减少(右图)。图12F显示框4，其中顶部图显示注射同侧中的GFP(指示ZFP-TF)信号，且τ蛋白染色同步减少(下图)。中下图还显示τ蛋白染色减少的图表描绘。左下图和右下图显示同侧(左)和对侧(右)截面中的染色。数据更详细地论述于实施例中。
图13A至13J展示在体内在海马体中达6个月的ZFP-TF的安全性和持续表达。图13A描绘在6周时间点在海马体中经转导细胞作为整体的信号，指示ZFP-TF载体和仅GFP的载体的表达几乎相同。图13B显示特定地星形胶质细胞的类似结果，而图13C显示小胶质细胞的结果。图13D显示与图13A类似的转导数据，但6个月时间点除外。类似地，图13E显示6个月时间点的星形胶质细胞数据，并且图13F显示6个月时间点的小胶质细胞数据。图13G展示在各个治疗组中维持海马体的区域的平均厚度，证实没有来自ZFP-TF的长期表达的明显神经元毒性。图13H显示注射在前部(左图)和后部(右图)海马体中的覆盖度。数据更详细地论述于实施例中。图13I是显示用所指示ZF(τ蛋白在顶部左图，ZF在顶部中图，VG/细胞在顶部右图，GFPA(胶质纤维酸性蛋白，星形胶质细胞的标志物)在底部左图，IBA1(离子化钙结合适配分子1，小胶质细胞的标志物)在底部中图，并且NeuN(在不同物种之间高度保守的有丝分裂后神经元的众所公认的标志物(Wang等,(2015)SciReports 5:17383,doi 10.1038/spre17383))在底部右图)治疗的受试者的归一化表达水平的图表。图13J是显示用所指示组合物(“PBS”是指无τ蛋白调节剂；“89V 6周”是指在6周时取样的用52389Venus构建物治疗的小鼠，并且“89V 11m”是指在11个月时取样的52389Venus构建体(τ蛋白、ZFP、GFAP、IBA1从左至右在顶部图中；NeuN、MAP1、MAP1A、MAP2从左至右在底部图中))治疗的受试者中所指示蛋白质的归一化表达水平的图表。
图14A至14F是用ZFP-TF处理的APP/PS1小鼠的脑切片的显微照片。在这些图像中，GFP呈绿色，RFP呈红色，并且对Aβ具有特异性的抗体用二抗标记(蓝色)。图14A和14C是野生型皮质(CTX)的图像，其中左侧CTX用无关的ZFP-TF处理(图14A)，并且右侧CTX用编码荧光蛋白tRFP的AAV处理(图14C)。图14B和14D是来自APP/PS1小鼠的脑皮质的图像，其中左侧CTX用编码τ蛋白特异性ZFP-TF的AAV(“389dV”，图14B)或编码tRFP的AAV(图14D)处理。所述图像图解说明用τ蛋白特异性ZFP-TF处理的CTX中的营养不良性神经突(可鉴别为Aβ斑块周围的点状染色并通过箭头来指示)的减少。图14E和14F是用τ蛋白特异性ZFP-TF(图14E)或tRFP(图14F)处理的APP/PS1CTX切片的两个例子的较高放大率图像，其中与389ZFP-TF处理的切片相比，tRFP处理的切片中的营养不良性神经突(通过箭头指示)更多。
图15是显示APP/PS1小鼠中每个Aβ斑块的营养不良性神经突数目的定量表示的图表。每个点代表一个皮质切片的所有斑块中每个斑块的营养不良性神经突的平均数；每只小鼠的每个半球分析3-5个切片。如图可见，如与用tRFP处理的CTX相比，在用389dV ZFP-TF处理的CTX中，营养不良性神经突存在统计学上显著的减少(最左侧(灰色)条形是389dV处理的，左数第二个(白色)条形是tRFP处理的)。还显示用无关的ZFP-TF(“172dV”，灰色条纹状条形，右数第二个条形)或tRFP(白色条纹状条形，最右侧条形)处理的小鼠中的CTX的比较。如图可见，这些样品之间的营养不良性神经突/斑块的数目没有差异。
图16是描绘图15中表示的数据的定量比较的图表，其解释每个斑块的基线营养不良性神经突在动物之间的变化。对于每个ZFP-TF处理的半球或对侧tRFP处理的半球，将每个Aβ斑块的营养不良数目取平均值，并使用成对双尾T检验进行比较。将每个群组的值针对tRFP处理侧的平均值(设置为100％)加以缩放。使用这种成对分析，发现52389V处理群组的营养不良性神经突显著减少(平均34％减少)(最左侧(灰色)条形是389dV处理的，左数第二个(白色)条形是tRFP处理的)，但是用无关的ZFP-TF处理的群组的营养不良性神经突没有显著减少(172dV，右数第二个(灰色条纹状)条形；tRFP，最右侧(白色条纹状)条形)。
图17描绘对从用ZFP-TF处理的小鼠获得的海马体组织进行的微阵列分析的示例性结果。通过眶后递送使用本文所述的AAV(2.5e12vg/动物)将ZFP-TF递送至动物。处理小鼠并在十周时处死，并且所描绘的结果是与无关的ZFP-TF对照相比较的数据。
具体实施方式
本文公开了用于预防和/或治疗τ蛋白病变的组合物和方法。特定地，本文所述的组合物和方法用于阻遏MAPT(τ蛋白)蛋白的表达以预防或治疗τ蛋白病变，例如阿尔茨海默病(AD)、额颞叶痴呆、进行性核上麻痹、癫痫发作和/或皮质基底节变性。MAPT阻遏物(例如，MAPT调节转录因子，如包含锌指蛋白(ZFP TF)、TALE(TALE-TF)和/或CRISPR/Cas-TF的MAPT调节转录因子)修饰CNS，使得例如通过减少患有τ蛋白病变(例如，AD)的受试者脑中τ蛋白的聚集以及减少神经缠结的出现来减小或消除τ蛋白病变的影响和/或症状。在优选实施方案中，将MAPT调节转录因子通过病毒载体(如AAV)递送至脑。已经显示AAV非常适合于脑递送，因此使用这些病毒载体递送MAPT调节转录因子尤其可用于治疗与τ蛋白的不适当表达和由此聚集相关的疾病，如阿尔茨海默病。
概述
除非另有指示，否则方法的实践以及本文所公开的组合物的制备和使用采用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA和相关领域的常规技术，这些技术是本领域所熟知的。这些技术在文献中有充分解释。参见，例如，Sambrook等,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第二版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989和第三版,2001；Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,JohnWiley&Sons,New York,1987和定期更新；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,第三版,Academic Press,SanDiego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY,第304卷,“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编辑),Academic Press,San Diego,1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第119卷,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker编辑)Humana Press,Totowa,1999。
定义
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指呈线性或环状构象并且呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本公开文本的目的，不应将这些术语视为在聚合物的长度方面加以限制。这些术语可以涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如，硫代磷酸酯骨架)中被修饰的核苷酸。通常，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即，A的类似物将与T进行碱基配对。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所述术语还适用于如下氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸是相应天然存在的氨基酸的化学类似物或经修饰衍生物。
“结合”是指高分子之间(例如，蛋白质与核酸之间)的序列特异性非共价相互作用。并非结合相互作用的所有组分都需要是序列特异性的(例如，与DNA骨架中的磷酸残基接触)，只要所述相互作用作为整体是序列特异性的即可。此类相互作用的特征通常是解离常数(Kd)为10-6M-1或更低。“亲和性”是指结合强度：增强的结合亲和性与较低的Kd相关。
“结合蛋白”是能够非共价结合至另一分子的蛋白质。结合蛋白可以结合至例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。在蛋白质结合蛋白的情形中，其可以结合至自身(以形成同二聚体、同三聚体等)，和/或其可以结合至一种或多种不同蛋白质的一个或多个分子。结合蛋白可以具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白质结合活性。
“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是蛋白质或较大蛋白质内的结构域，其以序列特异性方式通过一个或多个锌指结合DNA，所述锌指是结合结构域内的氨基酸序列区域，所述结合结构域的结构通过锌离子的配位而稳定。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。
“TALE DNA结合结构域”或“TALE”是包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域参与TALE与其同源靶DNA序列的结合。单一的“重复单元”(还称作“重复序列”)的长度典型地是33-35个氨基酸，并展现与天然存在的TALE蛋白内的其他TALE重复序列的至少一定序列同源性。参见，例如，美国专利号8,586,526。
“TtAgo”是原核Argonaute蛋白，被认为参与基因沉默。TtAgo源自细菌嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)。参见，例如，Swarts等,(2014)Nature 507(7491):258-261，G.Sheng等,(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,652。“TtAgo系统”是所需的所有组分，包括例如用于通过TtAgo酶裂解的指导DNA。“重组”是指两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程，包括但不限于通过非同源末端接合(NHEJ)进行的供体捕捉以及同源重组。出于本公开文本的目的，“同源重组(HR)”是指这种交换的特化形式，其发生于例如细胞中的双链断裂通过同源定向修复机制修复期间。这个过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子模板修复“靶”分子(即，经历双链断裂的分子)，并且因为其导致遗传信息从供体转移至靶标，被不同地称为“非交换型基因转化”或“短束基因转化”。不希望受任何特定理论约束，这种转移可以涉及在断裂的靶标与供体之间形成的异源双链体DNA的错配修正，和/或“合成依赖性链退火”(其中使用供体重合成将成为靶标的一部分的遗传信息)，和/或相关过程。这种特化的HR通常导致靶分子的序列改变，使得供体多核苷酸的部分或全部序列并入靶多核苷酸中。
DNA结合结构域(如sgRNA、锌指结合结构域或TALE DNA结合结构域)可以进行“工程化”以结合至预定的核苷酸序列，例如通过结合至所选靶位点的sgRNA的设计，或通过工程化(改变一个或多个氨基酸)天然存在的锌指蛋白的识别螺旋区，或通过工程化TALE蛋白的RVD来进行。因此，工程化的锌指蛋白或TALE是非天然存在的蛋白质。工程化DNA结合结构域的方法的非限制性例子是设计和选择。“设计的”锌指蛋白或TALE是在自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要源自合理标准。设计的合理标准包括应用替换规则和计算机化算法，用于处理存储现有ZFP设计和绑定数据的信息的数据库中的信息。“所选择的”锌指蛋白或TALE是并非在自然界中发现的蛋白质，其产生主要源自经验过程，如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交体选择。参见，例如，美国专利号8,586,526；6,140,081；6,453,242；6,746,838；7,241,573；6,866,997；7,241,574；和6,534,261；还参见国际专利公开号WO 03/016496。
术语“序列”是指任何长度的核苷酸序列，其可以是DNA或RNA；可以是线性、环状或分支的，并且可以是单链或双链的。术语“供体序列”是指被插入基因组中的核苷酸序列。供体序列可以具有任何长度，例如长度介于2与10,000个核苷酸之间(或其之间或高于其的任何整数值)，优选地长度介于约100与1,000个核苷酸之间(或其之间的任何整数)，更优选地长度介于约200与500个核苷酸之间。
“靶位点”或“靶序列”是定义核酸的一部分的核酸序列，结合分子将结合至所述部分，前提是存在用于结合的充分条件。
“外源”分子是正常地在细胞中不存在，但可以通过一种或多种遗传、生物化学或其他方法引入细胞中的分子。“在细胞中正常存在”是关于细胞的特定发育阶段和环境条件来确定。因此，例如，仅在肌肉的胚胎发育期间存在的分子是关于成体肌肉细胞的外源分子。类似地，通过热休克引入的分子是关于非热休克细胞的外源分子。外源分子可以包含例如功能失常的内源分子的功能形式或功能正常的内源分子的功能失常形式。
外源分子尤其可以是小分子，如通过组合化学工艺产生的小分子，或高分子，如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何经修饰衍生物、或者包含一种或多种上述分子的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链的；可以是线性、分支或环状的；并且可以是任何长度。核酸包括能够形成双螺旋的那些，以及形成三螺旋的核酸。参见，例如，美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重构因子、甲基化的DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰基酯酶、脱乙酰酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解螺旋酶。
外源分子可以是与内源分子类型相同的分子，例如，外源蛋白质或核酸。例如，外源核酸可以包含引入细胞中的感染性病毒基因组、质粒或游离体，或正常地在细胞中不存在的染色体。将外源分子引入细胞中的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于脂质介导的转移(即，脂质体，包括中性和阳离子型脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。外源分子还可以是与内源分子类型相同，但源自与细胞来源不同物种的分子。例如，可将人类核酸序列引入最初源自小鼠或仓鼠的细胞系中。
相比之下，“内源”分子是在特定发育阶段在特定环境条件下在特定细胞中正常存在的分子。例如，内源核酸可以包含染色体、线粒体、叶绿体或其他细胞器的基因组、或天然存在的游离型核酸。其他内源分子可以包括蛋白质，例如转录因子和酶。
“融合”分子是其中两个或更多个亚单元分子被连接(优选地共价连接)的分子。亚单元分子可以是相同化学类型的分子，或者可以是不同化学类型的分子。第一类型的融合分子的例子包括但不限于融合蛋白(例如，ZFP或TALE DNA结合结构域与一个或多个激活结构域之间的融合物)和融合核酸(例如，编码上述融合蛋白的核酸)。第二类型的融合分子的例子包括但不限于形成三螺旋的核酸与多肽之间的融合物，以及小沟结合物与核酸之间的融合物。所述术语还包括其中多核苷酸组分与多肽组分缔合形成功能分子的系统(例如，CRISPR/Cas系统，其中单一指导RNA与功能结构域缔合以调节基因表达)。
细胞中融合蛋白的表达可以源自将融合蛋白递送至细胞或通过将编码融合蛋白的多核苷酸递送至细胞来获得，其中多核苷酸发生转录，并且转录物发生翻译，以产生融合蛋白。反式剪接、多肽裂解和多肽连接也可以参与蛋白质在细胞中的表达。将多核苷酸和多肽递送至细胞的方法呈现于本公开文本中的其他地方。
“多聚化结构域”(还称作“二聚化结构域”或“蛋白质相互作用结构域”)是在ZFPTF或TALE TF的氨基末端区域、羧基末端区域、或氨基末端区域和羧基末端区域处并入的结构域。这些结构域允许多个ZFP TF或TALE TF单元进行多聚化，使得相对于具有野生型长度数的较短束，三核苷酸重复结构域的较大束成为多聚化ZFP TF或TALE TF所优先结合的。多聚化结构域的例子包括亮氨酸拉链。多聚化结构域还可通过小分子来调节，其中多聚化结构域采取适当构象以允许仅在小分子或外部配体的存在下与另一多聚化结构域相互作用。以这种方式，外源配体可以用于调节这些结构域的活性。
出于本公开文本的目的，“基因”包括编码基因产物(参见下文)的DNA区域，以及所有调节基因产物的产生的DNA区域，不论此类调节序列是否与编码序列和/或所转录序列相邻。因此，基因包括但不必限于启动子序列、终止子、翻译调节序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区域。
“基因表达”是指将基因中所含的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑等方法修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、肉豆蔻酸化(myristilation)和糖基化修饰的蛋白质。
对基因表达的“调节”是指基因活性的变化。对表达的调节可以包括但不限于基因激活和基因阻遏。基因组编辑(例如，裂解、改变、失活、随机突变)可以用于调节表达。基因失活是指如与不包括如本文所述的ZFP或TALE蛋白的细胞相比，基因表达的任何减少。因此，基因失活可以是部分失活或完全失活。
“遗传调节剂”是指改变一个或多种基因的表达和/或序列的任何分子。遗传调节剂的非限制性例子包括结合至靶基因并改变其表达的转录因子(例如如本文所述的人工转录因子)，以及修饰靶基因的序列继而改变其表达(例如，通过插入和/或缺失使靶标失活)的核酸酶。因此，遗传调节剂可以是遗传阻遏物(其阻遏基因表达和/或使基因表达失活)或遗传激活因子。
“所关注区域”是细胞染色质的任何区域，例如基因或者基因内或与基因相邻的非编码序列，其中可期望所述区域结合外源分子。结合可以用于所靶向DNA裂解和/或所靶向重组的目的。例如，所关注区域可以存在于染色体、游离体、细胞器基因组(例如，线粒体、叶绿体)或感染性病毒基因组中。所关注区域可以位于基因的编码区内，位于经转录非编码区内(例如前导序列、尾随序列或内含子)，或位于在编码区上游或下游的非转录区内。所关注区域的长度可以小至单一核苷酸对或多达2,000个核苷酸对，或任何整数值的核苷酸对。
“真核”细胞包括但不限于真菌细胞(如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人类细胞(例如，T细胞)。
关于两个或更多个组分(如序列元件)的并列，术语“操作性连接”和“操作性地连接”(或“可操作连接”)可互换使用，其中所述组分经排列使得两个组分正常发挥功能并允许以下可能性：至少一个所述组分可以介导对至少一个其他组分发挥的功能。通过说明，如果转录调节序列响应一种或多种转录调节因子的存在或不存在控制编码序列的转录水平，那么转录调节序列(如启动子)与编码序列操作性连接。转录调节序列通常与编码序列顺式操作性连接，但无需与其直接相邻。例如，增强子是与编码序列操作性连接的转录调节序列，即使其不邻接。
关于功能多肽，术语“操作性连接”可以指以下事实：每个组分在与另一组分连接时发挥的功能与其没有如此连接时发挥的功能相同。例如，关于其中ZFP或TALE DNA结合结构域与激活结构域融合的融合分子，如果在功能多肽中，ZFP或TALE DNA结合结构域部分能结合其靶位点和/或其结合位点，同时激活结构域能上调基因表达，那么ZFP或TALE DNA结合结构域和激活结构域呈操作性连接。与能调节基因表达的结构域融合的ZFP被统称为“ZFP-TF”或“锌指转录因子”，而与能调节基因表达的结构域融合的TALE被统称为“TALE-TF”或“TALE转录因子”。在功能多肽中的ZFP DNA结合结构域与裂解结构域融合时(“ZFN”或“锌指核酸酶”)，如果在功能多肽中，ZFP DNA结合结构域部分能结合其靶位点和/或其结合位点，同时裂解结构域能裂解靶位点附近的DNA，那么ZFP DNA结合结构域和裂解结构域呈操作性连接。在功能多肽中的TALE DNA结合结构域与裂解结构域融合时(“TALEN”或“TALE核酸酶”)，如果在功能多肽中，TALE DNA结合结构域部分能结合其靶位点和/或其结合位点，同时裂解结构域能裂解靶位点附近的DNA，那么TALE DNA结合结构域和裂解结构域呈操作性连接。关于其中Cas DNA结合结构域(例如，单一指导RNA)与激活结构域融合的融合分子，如果在功能多肽中，Cas DNA结合结构域部分能结合其靶位点和/或其结合位点，同时激活结构域能上调基因表达，那么Cas DNA结合结构域和激活结构域呈操作性连接。在功能多肽中的Cas DNA结合结构域与裂解结构域融合时，如果在功能多肽中，Cas DNA结合结构域部分能结合其靶位点和/或其结合位点，同时裂解结构域能裂解靶位点附近的DNA，那么CasDNA结合结构域和裂解结构域呈操作性连接。
蛋白质、多肽或核酸的“功能性片段”是蛋白质、多肽或核酸，其序列与全长蛋白质、多肽或核酸不同，但保留与全长蛋白质、多肽或核酸相同的功能。功能性片段可以具有与相应的天然分子相比较多、较少或相同的残基数，和/或可以含有一个或多个氨基酸或核苷酸取代。确定核酸功能(例如，编码功能、与另一核酸杂交的能力)的方法是本领域所熟知的。类似地，确定蛋白质功能的方法是众所周知的。例如，多肽的DNA结合功能可以例如通过滤膜结合、电泳迁移率变动或免疫沉淀测定来确定。DNA裂解可以通过凝胶电泳来测定。参见Ausubel等，同上。蛋白质与另一蛋白质相互作用的能力可以例如通过免疫共沉淀、双杂交测定或互补(遗传和生物化学二者)来确定。参见，例如，Fields等,(1989)Nature 340:245-246；美国专利号5,585,245和国际专利公开号WO 98/44350。
“载体”能将基因序列转移至靶细胞。典型地，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能引导所关注基因表达并且可以将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，所述术语包括克隆和表达运载体，以及整合载体。
“报道基因”或“报道序列”是指产生蛋白质产物的任何序列，所述蛋白质产物在常规测定中优选地但不一定易于测量。适宜报道基因包括但不限于编码介导抗生素抗性(例如，氨苄西林抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白质的序列、编码有色或荧光或发光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、增强绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、萤光素酶)和介导增强的细胞生长和/或基因扩增的蛋白质(例如，二氢叶酸还原酶)的序列。表位标签包括例如一个或多个拷贝的FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可检测的氨基酸序列。“表达标签”包括编码报道基因的序列，其可与所需基因序列可操作连接以监测所关注基因的表达。
τ蛋白和阿尔茨海默病
τ蛋白是由包含16个外显子的MAPT基因编码。有趣的是，外显子1、4、5、7、9、11和12是组成型表达的，而外显子2、3和10可以存在于源自可变剪接的变体的τ蛋白种类中，导致在成体脑中存在六种不同的τ蛋白同种型。τ蛋白通过蛋白质的C末端一半中的3个或4个重复微管蛋白结合基序结合至微管，并且被认为可稳定小管，其中tau4R(4个微管蛋白结合基序)被认为比tau3R更强地与微管相互作用。3R与4R的比率通常是稳定的，但是在病理状态中可以受到影响。与微管相互作用的τ蛋白形式发生磷酸化，并且显现过度磷酸化引起τ蛋白从微管脱离。过度磷酸化的τ蛋白可以被隔绝在细胞中，其随后导致蛋白质的构象变化并导致聚集。这些聚集体可为形成病原性神经原纤维缠结(NFT)的初始步骤，然而，过度磷酸化的τ蛋白在呈可溶形式时以及在存在于缠结中时可以是病原性的(Bodea等,(2016)J ofNeurochem 138(增刊1):71-94)。NFT在AD的早期阶段中受限于内嗅皮层和内侧颞叶，并且截至疾病的严重临床症状存在时，NFT在整个脑中广泛分布。与高丰度NFT的存在一致，淀粉样蛋白斑块也出现广泛分布。事实上，显现淀粉样蛋白在皮质中的沉积导致τ蛋白传播和NFT蔓延至脑的远侧区域的速度增加。随着τ蛋白缠结蔓延，神经元损失存在一致的增加(Pooler等,(2015)Acta Neuropathol Commun 3:14,doi:10.1186/s40478-015-0199-x)。
τ蛋白具有95个能被磷酸化的氨基酸残基，并且已经鉴别出若干种激酶可负责τ蛋白磷酸化，这些激酶可以是新治疗学的可能候选靶标，包括糖原合酶-3、细胞周期蛋白依赖性激酶5、MAPK家族成员、细胞外调节激酶、c-Jun N末端激酶和微管亲和性调节激酶(Bodea(2016)出处同上)。
淀粉样蛋白β蛋白(Aβ)是老年斑的主要成分，其与NFT一起是阿尔茨海默病的神经病理性确认的标志。Aβ是具有39至42个氨基酸的链的肽；所述42个氨基酸更倾向于形成聚集体，并且被认为参与疾病的发病机制，并且是淀粉样蛋白假说的基础(Aβ在脑中的积累是AD的主要病因的提议，参见综述Hardy和Selkoe(2002)Science 297:353)。Aβ是淀粉样蛋白前体蛋白(APP)发生蛋白水解裂解的产物，所述蛋白质是普遍存在的、糖基化的、硫酸化且磷酸化的膜内在蛋白(Sorrentino等,(2014)FEBS Lett 588:641-652)。然而，越来越明显的是，导致AD的发病机制极端复杂，并且Aβ积累的发病机制可能在异常的τ蛋白行为中起作用(Ando等,(2016)PLoS Genet 12(3):e1005917)。
已经显示脑中τ蛋白的减少会改良AD的病理学。鼠类AD模型中τ蛋白转基因表达的受调节抑制展示转基因相关τ蛋白聚集体的减少以及过度磷酸化的τ蛋白和NFT的浓度的降低。事实上，这个工作还显示总NFT的损失，指示NFT的积累可能是可逆的(Polydoro等,(2013)J of Neurosci 33(33):13300-13311)。另外，用直接通过海马体内给予用AAV递送的细胞内抗τ蛋白抗体进行的研究展示不可溶τ蛋白种类、NFT的减少，以及对在未治疗的小鼠模型中观察到的海马体萎缩的援救(Liu等,(2016)J Neurosci 36(49):12425-12435)。
DNA结合结构域
本文所述方法利用组合物，例如τ蛋白调节转录因子，其包含特异性结合至τ蛋白(MATP)基因中的靶序列的DNA结合结构域。本文所公开的组合物和方法中可以使用任何多核苷酸或多肽DNA结合结构域，例如DNA结合蛋白(例如，ZFP或TALE)或DNA结合多核苷酸(例如，单一指导RNA)。因此，描述τ蛋白基因的遗传调节剂(阻遏物)。
在某些实施方案中，τ蛋白阻遏物或其中的DNA结合结构域包含锌指蛋白。靶位点的选择；用于设计和构建融合蛋白(和编码所述融合蛋白的多核苷酸)的ZFP和方法是本领域技术人员已知的并且详细描述于以下文献中：美国专利号6,140,081；5,789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；和国际专利公开号WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536；和WO 03/016496。
τ蛋白靶位点典型地包括至少一个锌指，但可以包括多个锌指(例如，2、3、4、5、6或更多个锌指)。通常，ZFP包括至少三个指状物。某些ZFP包括4、5或6个指状物，而一些ZFP包括8、9、10、11或12个指状物。包括三个指状物的ZFP典型地识别包括9或10个核苷酸的靶位点；包括4个指状物的ZFP典型地识别包括12至14个核苷酸的靶位点；而具有6个指状物的ZFP可以识别包括18至21个核苷酸的靶位点。ZFP还可以是融合蛋白，其包括一个或多个调节结构域，所述结构域可以是转录激活或阻遏结构域。在一些实施方案中，融合蛋白包含两个连接在一起的ZFP DNA结合结构域。这些锌指蛋白可因此包含8、9、10、11、12或更多个指状物。在一些实施方案中，两个DNA结合结构域是通过可延伸的柔性接头连接，使得一个DNA结合结构域包含4、5或6个锌指，并且第二DNA结合结构域包含另外4、5或5个锌指。在一些实施方案中，接头是标准指间接头，使得指状物阵列包含一个DNA结合结构域，所述DNA结合结构域包含8、9、10、11或12或更多个指状物。在其他实施方案中，接头是非典型接头，例如柔性接头。DNA结合结构域与至少一个调节结构域融合，并且可被视为‘ZFP-ZFP-TF’体系结构。这些实施方案的具体例子可以被称为“ZFP-ZFP-KOX”，其包含两个用柔性接头连接并与KOX阻遏物融合的DNA结合结构域，以及被称为“ZFP-KOX-ZFP-KOX”，其中两个ZFP-KOX融合蛋白通过接头融合在一起。
与天然存在的锌指蛋白相比，工程化的锌指结合结构域可以具有新颖的结合特异性。工程化方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择。合理设计包括例如使用数据库，所述数据库包含三联体(或四联体)核苷酸序列和个别锌指氨基酸序列，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列缔合。参见，例如，共同拥有的美国专利号6,453,242和6,534,261，其通过引用以其整体并入本文中。
另外，如这些和其他参考文献中所披露，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可使用任何适宜的接头序列(包括例如，长度为5个或更多个氨基酸的接头)连接在一起。对于长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头序列，还参见美国专利号6,479,626；6,903,185；和7,153,949。本文所述蛋白质可包括蛋白质的个别锌指之间的适宜接头的任一组合。
ZFP可与一个或多个转录调节(例如，阻遏结构域)可操作缔合(连接)，以形成ZF-TF(例如，阻遏物)。方法和组合物还可以例如通过ZFP骨架中的突变，用于相对于其他非预期裂解位点(称为脱靶位点)，增加ZFP对其预期靶标的特异性，如美国专利申请号15/685,580中所述。因此，本文所述的τ蛋白阻遏物可以包含在其一个或多个DNA结合结构域骨架区中的突变和/或在其转录调节结构域中的一个或多个突变。这些ZFP可以包括对ZFP DNA结合结构域(‘ZFP骨架’)内可以与DNA骨架上的磷酸非特异性相互作用的氨基酸的突变，但其不包含DNA识别螺旋中的变化。因此，本发明包括ZFP骨架中是核苷酸靶标特异性不需要的阳离子型氨基酸残基的突变。在一些实施方案中，ZFP骨架中的这些突变包含使阳离子型氨基酸残基突变为中心或阴离子型氨基酸残基。在一些实施方案中，ZFP骨架中的这些突变包含使极性氨基酸残基突变至中性或非极性氨基酸残基。在优选实施方案中，突变是在相对于DNA结合螺旋的位置(-5)、(-9)和/或位置(-14)进行。在一些实施方案中，锌指可包含在(-5)、(-9)和/或(-14)的一个或多个突变。在另外的实施方案中，多指锌指蛋白中的一个或多个锌指可包含(-5)、(-9)和/或(-14)中的突变。在一些实施方案中，在(-5)、(-9)和/或(-14)的氨基酸(例如精氨酸(R)或赖氨酸(K))突变为丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、Ser(S)、Asp(N)、Glu(E)、Tyr(Y)和/或谷氨酰胺(Q)。
可替代地，DNA结合结构域可能源自核酸酶。例如，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII的识别序列是已知的。还参见美国专利号5,420,032；美国专利号6,833,252；Belfort等,(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujon等,(1989)Gene 82:115-118；Perler等,(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224–228；Gimble等,(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等,(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和New England Biolabs目录。另外，可以对归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性进行工程化以结合非天然靶位点。参见，例如，Chevalier等,(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat等,(2003)Nucleic AcidsRes.31:2952-2962；Ashworth等,(2006)Nature 441:656-659；Paques等,(2007)CurrentGene Therapy 7:49-66；美国专利公开号2007/0117128。
“双手型(two handed)”锌指蛋白是那些蛋白质，其中锌指DNA结合结构域的两个簇通过间插氨基酸隔开，使得两个锌指结构域结合至两个不连续的靶位点。双手型锌指结合蛋白的例子是SIP1，其中4个锌指的簇位于蛋白质的氨基末端处，并且三个指状物的簇位于羧基末端处(参见Remacle等,(1999)EMBO Journal 18(18):5073-5084)。这些蛋白质中锌指的每个簇能够结合至唯一靶序列，并且两个靶序列之间的间隔可以包含许多核苷酸。双手型ZFP可包括功能结构域，例如所述功能结构域与一个或两个ZFP融合。因此，将了解，功能结构域可附接至一个或两个ZFP的外部，或者可定位于ZFP之间(附接至两个ZFP)。
在某些实施方案中，DNA结合结构域包含天然存在的或工程化的(非天然存在的)TAL效应子(TALE)DNA结合结构域。参见，例如，美国专利号8,586,526，其通过引用以其整体并入本文。在某些实施方案中，TALE DNA结合蛋白包含结合至如表1或2中所示的τ蛋白靶位点(SEQ ID NO:1至6或33)的12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸。结合至τ蛋白靶位点的TALE DNA结合蛋白的RVD可以是天然存在的或非天然存在的RVD。参见美国专利号8,586,526和9,458,205。
已知黄单胞菌属(Xanthomonas)的植物病原性细菌会在重要的作物植物中引起许多种疾病。黄单胞菌属的致病性取决于保守的III型分泌(T3S)系统，其将多于25种不同的效应子蛋白注入植物细胞中。在所注入的这些蛋白质中有转录激活因子样效应子(TALE)，其模拟植物转录激活因子并操纵植物转录组(参见Kay等,(2007)Science 318:648-651)。这些蛋白质含有DNA结合结构域和转录激活结构域。最充分表征的TALE之一是来自野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种(Xanthomonas campestgris pv.Vesicatoria)的AvrBs3(参见Bonas等,(1989)Mol Gen Genet 218:127-136和WO 2010079430)。TALE含有串联重复序列的中心化结构域，每个重复序列含有约34个氨基酸，所述重复序列是这些蛋白质的DNA结合特异性的关键。另外，其含有核定位序列和酸性转录激活结构域(综述参见Schornack S等,(2006)J Plant Physiol 163(3):256-272)。另外，在植物致病性细菌青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)中，已经发现在青枯雷尔氏菌生物变型1菌株GMI1000和生物变型4菌株RS1000中，名为brg11和hpx17的两种基因与黄单胞菌属的AvrBs3家族是同源的(参见Heuer等,(2007)Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384)。这些基因的核苷酸序列彼此98.9％一致，但不同之处在于hpx17的重复结构域中1,575bp的缺失。然而，两种基因产物与黄单胞菌属的AvrBs3家族蛋白具有小于40％序列同一性。
这些TALE的特异性取决于在串联重复序列中发现的序列。重复序列包含约102bp，并且这些重复序列典型地彼此91-100％同源(Bonas等，出处同上)。重复序列的多态性通常位于位置12和13处，并且在位置12和13的高变双残基的身份与TALE的靶序列中连续核苷酸的身份之间显现存在一一对应关系(参见Moscou和Bogdanove(2009)Science 326:1501，以及Boch等,(2009)Science 326:1509-1512)。在实验中，已经确定这些TALE的DNA识别代码，使得位置12和13的HD序列导致结合至胞嘧啶(C)，NG结合至T，NI结合至A、C、G或T，NN结合至A或G，并且NG结合至T。这些DNA结合重复序列已经与新组合和数目的重复序列装配为蛋白质，以制造能与新序列相互作用的人工转录因子。另外，美国专利号8,586,526和美国专利公开号2013/0196373(通过引用以其整体并入本文)描述具有N帽多肽、C帽多肽(例如，+63、+231或+278)和/或新颖(非典型)RVD的TALE。
示例性TALE描述于美国专利号8,586,526和9,458,205中，其是通过引用以其整体并入。
在某些实施方案中，DNA结合结构域包括二聚化和/或多聚化结构域，例如卷曲螺旋(CC)和二聚化锌指(DZ)。参见美国专利公开号2013/0253040。
在再另外的实施方案中，DNA结合结构域包含CRISPR/Cas系统的单一指导RNA，例如如20150056705中所披露的sgRNA。
对于RNA介导的基因组防御途径在古细菌和许多细菌中的存在，最近已经出现令人信服的证据，已经假设所述途径与真核RNAi途径平行(对于综述，参见Godde和Bickerton,2006.J.Mol.Evol.62:718-729；Lillestol等,2006.Archaea 2:59-72；Makarova等,2006.Biol.Direct 1:7.；Sorek等,2008.Nat.Rev.Microbiol.6:181-186)。所述途径被称为CRISPR-Cas系统或原核RNAi(pRNAi)，有人提出这种途径源自两个在进化上和通常在物理上相关联的基因座：CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)基因座，其编码系统的RNA组分，以及cas(CRISPR相关)基因座，其编码蛋白质(Jansen等,2002.Mol.Microbiol.43:1565-1575；Makarova等,2002.Nucleic Acids Res.30:482-496；Makarova等,2006.Biol.Direct 1:7；Haft等,2005.PLoS Comput.Biol.1:e60)。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相关(Cas)基因以及能将CRISPR介导的核酸裂解的特异性程序化的非编码RNA元件的组合。个别Cas蛋白不与真核RNAi机构的蛋白质组分共享显著序列相似性，但是具有类似的预测功能(例如，RNA结合、核酸酶、解螺旋酶等)(Makarova等,2006.Biol.Direct 1:7)。CRISPR相关(cas)基因通常与CRISPR重复序列-间隔区阵列相关。已经描述了多于40种不同的Cas蛋白家族。在这些蛋白质家族中，Cas1显现在不同的CRISPR/Cas系统之间普遍存在。cas基因和重复结构的特定组合已经用于定义8种CRISPR亚型(Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube)，其中一些与编码重复序列相关未知蛋白(RAMP)的另一基因模块相关。单一基因组中可能存在多于一种CRISPR亚型。CRISPR/Cas亚型的散在性分布表明，所述系统在微生物进化期间经历水平基因转移。
最初描述于酿脓链球菌(S.pyogenes)中的II型CRISPR是表征最充分的系统之一，并且在四个连续步骤中实施靶向DNA双链断裂。首先，从CRISPR基因座转录两个非编码RNA，即前crRNA阵列和tracrRNA。第二，tracrRNA与前crRNA的重复区域杂交并介导将前crRNA加工为含有个别间隔区序列的成熟crRNA，其中加工是通过双链特异性RNA酶III在Cas9蛋白的存在下进行。第三，成熟crRNA:tracrRNA复合物通过crRNA上的间隔区与靶DNA上紧靠原间隔区相邻基序(PAM)的原间隔区之间的Watson-Crick碱基配对将Cas9引导至靶DNA，这是靶标识别的另一需要。另外，tracrRNA必须也存在，因为其与crRNA在其3'端碱基配对，并且这种缔合触发Cas9活性。最后，Cas9介导靶DNA的裂解以在原间隔区内产生双链断裂。CRISPR/Cas系统的活性包括三个步骤：(i)在称为‘适应’的过程中将外来DNA序列插入CRISPR阵列中以防止后来的攻击，(ii)表达相关蛋白质，以及表达并加工所述阵列，之后(iii)RNA介导干扰外来核酸。因此，在细菌细胞中，若干种所谓的‘Cas’蛋白与CRISPR/Cas系统的天然功能有关。
已经在多种不同细菌中发现了II型CRISPR系统。Fonfara等对公众可获得的基因组的BLAST检索((2013)Nuc Acid Res 42(4):2377-2590)在347个细菌物种中发现了Cas9直系同源物。另外，这个群组使用来自以下物种的Cas9直系同源物在体外展示DNA靶标的CRISPR/Cas裂解：酿脓链球菌、变形链球菌(S.mutans)、嗜热链球菌(S.therophilus)、空肠弯曲菌(C.jejuni)、脑膜炎双球菌(N.meningitides)、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)和新凶手弗朗西斯菌(F.novicida)。因此，术语“Cas9”是指RNA指导的DNA核酸酶，其包含DNA结合结构域和两个核酸酶结构域，其中编码Cas9的基因可源自任何适宜细菌。
Cas9蛋白具有至少两个核酸酶结构域：一个核酸酶结构域与HNH核酸内切酶类似，而另一个与Ruv核酸内切酶结构域类似。HNH型结构域显现负责裂解与crRNA互补的DNA链，而Ruv结构域裂解非互补链。可以将Cas 9核酸酶工程化，使得只有一个核酸酶结构域有功能，从而产生Cas切口酶(参见Jinek等,(2012)Science 337:816)。切口酶可以通过酶的催化结构域中氨基酸的特定突变来产生，或者通过截短所述结构域的部分或全部使得其不再有功能来产生。由于Cas 9包含两个核酸酶结构域，这种途径可以对任一个结构域进行。双链断裂可以在靶DNA中通过使用两个此类Cas 9切口酶来实现。切口酶将各自裂解DNA的一条链，并且使用两个切口酶将产生双链断裂。
对crRNA-tracrRNA复合物的需要可以通过使用工程化的“单一指导RNA”(sgRNA)来避免，所述sgRNA包含通常通过crRNA和tracrRNA的退火形成的发夹(参见Jinek等，出处同上，以及Cong等,(2013)Sciencexpress/10.1126/science.1231143)。在酿脓链球菌中，当在Cas相关RNA与靶DNA之间形成双链RNA:DNA异二聚体时，工程化的tracrRNA:crRNA融合物或sgRNA指导Cas9裂解靶DNA。这个包含Cas9蛋白和含有PAM序列的工程化sgRNA的系统已经用于RNA指导的基因组编辑(参见Ramalingam等,Stem Cells and Development 22(4):595-610(2013))，并且已经可用于体内斑马鱼胚胎基因组编辑(参见Hwang等,(2013)Nature Biotechnology 31(3):227)，并且编辑效率与ZFN和TALEN类似。
CRISPR基因座的主要产物显现是含有侵入物靶向序列的短RNA，并且基于其在所述途径中假设的作用将其命名为指导RNA或原核沉默RNA(psiRNA)(Makarova等,2006.Biol.Direct 1:7；Hale等,2008.RNA,14:2572-2579)。RNA分析指示，CRISPR基因座转录物在重复序列内裂解，以释放约60至70-nt RNA中间体，所述中间体含有个别侵入物靶向序列和侧接重复序列片段(Tang等,2002.Proc.Natl.Acad.Sci.99:7536-7541；Tang等,2005.Mol.Microbiol.55:469-481；Lillestol等,2006.Archaea 2:59-72；Brouns等,2008.Science 321:960-964；Hale等,2008.RNA,14:2572-2579)。在古细菌焦酚火球菌(Pyrococcus furiosus)中，这些中间体RNA被进一步加工为高丰度的稳定的约35至45-nt成熟psiRNA(Hale等,2008.RNA,14:2572-2579)。
对crRNA-tracrRNA复合物的需要可以通过使用工程化的“单一指导RNA”(sgRNA)来避免，所述sgRNA包含通常通过crRNA和tracrRNA的退火形成的发夹(参见Jinek等,(2012)Science 337:816，以及Cong等,(2013)Sciencexpress/10.1126/science.1231143)。在酿脓链球菌中，当在Cas相关RNA与靶DNA之间形成双链RNA:DNA异二聚体时，工程化的tracrRNA:crRNA融合物或sgRNA指导Cas9裂解靶DNA。这个包含Cas9蛋白和含有PAM序列的工程化的sgRNA的系统已经用于RNA指导的基因组编辑(参见Ramalingam，出处同上)，并且已经可用于体内斑马鱼胚胎基因组编辑(参见Hwang等,(2013)NatureBiotechnology 31(3):227)，并且编辑效率与ZFN和TALEN类似。
嵌合或sgRNA可以进行工程化以包含与任一所需靶标互补的序列。在一些实施方案中，指导序列的长度是约或大于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列的长度是小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个或更少核苷酸。在某些实施方案中，sgRNA包含结合至如表1或2中所示τ蛋白靶位点(SEQ ID NO:1至6或33)的12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，RNA包含与靶标互补并且具有形式G[n19]的22个碱基，之后是用于酿脓链球菌CRISPR/Cas系统的形式NGG或NAG的原间隔区相邻基序(PAM)。因此，在一种方法中，sgRNA可以利用所关注基因中的已知ZFN靶标通过以下方式来设计：(i)将ZFN异二聚体的识别序列与相关基因组(人类、小鼠或特定植物物种)的参考序列对齐；(ii)鉴别ZFN半位点之间的间隔区；(iii)鉴别最接近间隔区的基序G[N20]GG的位置(在多于一个这种基序与间隔区重叠时，选择相对于间隔区定中心位的基序)；(iv)使用所述基序作为sgRNA的核心。这种方法有利地依赖于已经证实的核酸酶靶标。可替代地，sgRNA可以设计为仅通过鉴别符合G[n20]GG公式的适宜靶序列来靶向任何所关注区域。连同互补区一起，sgRNA可包含其他核苷酸以延伸至sgRNA的tracrRNA部分的尾区(参见Hsu等,(2013)Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647)。尾部可以是+67至+85个核苷酸，或其间的任何数目，并且优选长度是+85个核苷酸。还可以使用截短的sgRNA，即“tru-gRNA”(参见Fu等,(2014)Nature Biotech 32(3):279)。在tru-gRNA中，互补区的长度减小至17或18个核苷酸。
此外，还可以利用替代性PAM序列，其中PAM序列可以是NAG，其作为NGG的替代(Hsu2013，出处同上)，使用酿脓链球菌Cas9。其他PAM序列还可包括缺少初始G的那些(Sander和Joung(2014)Nature Biotech 32(4):347)。除了酿脓链球菌编码的Cas9PAM序列以外，可以使用对来自其他细菌来源的Cas9蛋白具有特异性的其他PAM序列。例如，下文所示的PAM序列(从以下文献调整：Sander和Joung，出处同上，以及Esvelt等,(2013)Nat Meth 10(11):1116)对这些Cas9蛋白具有特异性：
因此，用于酿脓链球菌CRISPR/Cas系统的适宜靶序列可以根据以下准则来选择：[n17、n18、n19或n20](G/A)G。可替代地，PAM序列可以遵循准则G[n17,n18,n19,n20](G/A)G。对于源自非酿脓链球菌细菌的Cas9蛋白，可使用相同准则，其中用替代性PAM取代酿脓链球菌PAM序列。
最优选的是选择具有避免潜在脱靶序列的特异性的最高可能性的靶序列。这些不期望的脱靶序列可以通过考虑以下属性来鉴别：i)在已知发挥功能的PAM序列之前的靶序列中与所利用的Cas9蛋白的相似性；ii)相对于所需靶序列具有少于三个错配的类似靶序列；iii)与ii)中类似的靶序列，其中错配都位于PAM远侧区域中而不是PAM近侧区域中(有一些证据证实，紧邻或靠近PAM的核苷酸1-5(有时称作‘种子’区，Wu等,(2014)NatureBiotech doi:10.1038/nbt2889)对于识别是最关键的，因此具有位于种子区中的错配的假定脱靶位点可能最不可能被sg RNA识别)；和iv)类似靶序列，其中失配并非连续间隔或者间隔开大于4个核苷酸(Hsu 2014，出处同上)。因此，通过使用上文的这些标准对无论哪个所采用的CRIPSR/Cas系统进行基因组中潜在脱靶位点的数目的分析，可鉴别sgRNA的适宜靶序列。
在某些实施方案中，Cas蛋白可以是天然存在的Cas蛋白的“功能衍生物”。天然序列多肽的“功能衍生物”是具有与天然序列多肽共同的定性生物特性的化合物。“功能衍生物”包括但不限于天然序列的片段和天然序列多肽和其片段的衍生物，前提是其具有与相应的天然序列多肽共同的生物活性。本文所预期的生物活性是功能衍生物将DNA底物水解为片段的能力。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体、共价修饰物和其融合物。在一些方面中，功能衍生物可包含天然存在的Cas蛋白的单一生物特性。在其他方面中，功能衍生物可包含天然存在的Cas蛋白的生物特性的子集。Cas多肽或其片段的适宜衍生物包括但不限于Cas蛋白或其片段的突变体、融合物、共价修饰物。Cas蛋白包括Cas蛋白或其片段以及Cas蛋白或其片段的衍生物，所述Cas蛋白可从细胞获得或以化学方式合成或通过这两个程序的组合获得。细胞可以是天然地产生Cas蛋白的细胞，或天然地产生Cas蛋白并且进行遗传工程化从而以较高表达水平产生内源Cas蛋白或从外源引入核酸产生Cas蛋白的细胞，所述外源引入核酸编码与内源Cas相同或不同的Cas。在一些情形中，细胞并非天然地产生Cas蛋白，并且进行遗传工程化以产生Cas蛋白。
靶向特定基因(包括安全的港口基因)的示例性CRISPR/Cas核酸酶系统披露于例如美国公开号2015/0056705中。
因此，核酸酶包含特异性结合至任何基因中的靶位点的DNA结合结构域，期望将与裂解DNA的核酸酶结构域组合的供体(转基因)插入所述靶位点中。
τ蛋白基因调节剂
τ蛋白DNA结合结构域可与用于本文所述方法中的任何其他分子(例如，多肽)融合或以其他方式缔合。在某些实施方案中，所述方法采用融合分子，所述融合分子包含至少一种DNA结合分子(例如，ZFP、TALE或单一指导RNA)和异源调节(功能)结构域(或其功能性片段)。
在某些实施方案中，τ蛋白调节剂的功能结构域包含转录调节结构域。常见结构域包括例如转录因子结构域(激活因子、阻遏物、共激活因子、共阻遏物)、沉默子、癌基因(例如，myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mos家族成员等)；DNA修复酶和其相关因子和修饰剂；DNA重排酶和其相关因子和修饰剂；染色质相关蛋白和其修饰剂(例如激酶、乙酰基酯酶和脱乙酰酶)；和DNA修饰酶(例如，甲基转移酶、拓扑异构酶、解螺旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、核酸内切酶)和其相关因子和修饰剂。参见，例如，美国公开号2013/0253040，其通过引用以其整体并入本文。
用于实现激活的适宜结构域包括HSV VP16激活结构域(参见，例如，Hagmann等,J.Virol.71,5952-5962(1997))核激素受体(参见，例如，Torchia等,Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-383(1998))；核因子κB的p65亚单元(Bitko和Barik,J.Virol.72:5610-5618(1998)以及Doyle和Hunt,Neuroreport 8:2937-2942(1997)；Liu等,Cancer Gene Ther.5:3-28(1998))；或人工嵌合功能结构域，如VP64(Beerli等,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14623-33)，以及降解子(Molinari等,(1999)EMBO J.18,6439-6447)。其他示例性激活结构域包括Oct 1、Oct-2A、Sp1、AP-2和CTF1(Seipel等,EMBOJ.11,4961-4968(1992))以及p300、CBP、PCAF、SRC1PvALF、AtHD2A和ERF-2。参见，例如，Robyr等,(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347；Collingwood等,(1999)J.Mol.Endocrinol.23:255-275；Leo等,(2000)Gene 245:1-11；Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.46:77-89；McKenna等,(1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.69:3-12；Malik等,(2000)Trends Biochem.Sci.25:277-283；和Lemon等,(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504中。其他示例性激活结构域包括但不限于OsGAI、HALF-1、C1、AP1、ARF-5、ARF-6、ARF-7和ARF-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1。参见，例如，Ogawa等,(2000)Gene 245:21-29；Okanami等,(1996)Genes Cells 1:87-99；Goff等,(1991)Genes Dev.5:298-309；Cho等,(1999)Plant Mol.Biol.40:419-429；Ulmason等,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:5844-5849；Sprenger-Haussels等,(2000)PlantJ.22:1-8；Gong等,(1999)Plant Mol.Biol.41:33-44；和Hobo等,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15,348-15,353。
可以用于制造τ蛋白阻遏物的示例性阻遏结构域包括但不限于KRAB A/B、KOX、TGF-β诱导型早期基因(TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMT家族的成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb和MeCP2。参见，例如，Bird等,(1999)Cell 99:451-454；Tyler等,(1999)Cell 99:443-446；Knoepfler等,(1999)Cell 99:447-450；和Robertson等,(2000)Nature Genet.25:338-342。其他示例性阻遏结构域包括但不限于ROM2和AtHD2A。参见，例如，Chem等,(1996)Plant Cell 8:305-321；和Wu等,(2000)Plant J.22:19-27。
在一些情况下，结构域参与染色体的表观遗传调节。在一些实施方案中，结构域是组蛋白乙酰转移酶(HAT)，例如A型核定位的，如MYST家族成员MOZ、Ybf2/Sas3、MOF和Tip60，GNAT家族成员Gcn5或pCAF，p300家族成员CBP、p300或Rtt109(Berndsen和Denu(2008)CurrOpin Struct Biol 18(6):682-689)。在其他情况下，结构域是组蛋白脱乙酰酶(HDAC)，如I类(HDAC-1、2、3和8)、II类(HDAC IIA(HDAC-4、5、7和9)、HDAC IIB(HDAC 6和10))、IV类(HDAC-11)、III类(还称为瑟土因(sirtuin)(SIRT)；SIRT1-7)(参见Mottamal等,(2015)Molecules 20(3):3898-3941)。用于一些实施方案中的另一结构域是组蛋白磷酸化酶或激酶，其中例子包括MSK1、MSK2、ATR、ATM、DNA-PK、Bub1、VprBP、IKK-α、PKCβ1、Dik/Zip、JAK2、PKC5、WSTF和CK2。在一些实施方案中，使用甲基化结构域并且其可选自诸如以下项的组：Ezh2、PRMT1/6、PRMT5/7、PRMT 2/6、CARM1、set7/9、MLL、ALL-1、Suv 39h、G9a、SETDB1、Ezh2、Set2、Dot1、PRMT 1/6、PRMT 5/7、PR-Set7和Suv4-20h。在一些实施方案中还可使用参与SUMO化和生物素化的结构域(Lys9、13、4、18和12)(综述参见Kousarides(2007)Cell 128:693-705)。
融合分子是通过克隆和生化缀合方法来构建的，所述方法是本领域技术人员所熟知的。融合分子包含DNA结合结构域和功能结构域(例如，转录激活或阻遏结构域)。融合分子还任选地包含核定位信号(例如，来自SV40中型T抗原)和表位标签(例如，FLAG和血凝素)。融合蛋白(和其编码核酸)设计为使得在融合物的组分之间保存翻译阅读框。
一方面功能结构域(或其功能性片段)的多肽组分与另一方面非蛋白质DNA结合结构域(例如，抗生素、嵌入剂、小沟结合物、核酸)之间的融合物是通过本领域技术人员已知的生化缀合方法来构建。参见，例如，Pierce Chemical Company(Rockford,IL)目录。已经描述用于制造小沟结合物与多肽之间的融合物的方法和组合物。Mapp等,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3930-3935。同样，CRISPR/Cas TF和包含与多肽组分功能结构域缔合的sgRNA核酸组分的核酸酶也是本领域技术人员已知的并且详述于本文中。
融合分子可以用药学上可接受的载体来配制，如本领域技术人员已知。参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,1985；和共同拥有的国际专利公开号WO 00/42219。
融合分子的功能性组分/结构域可以选自多种不同组分中的任一种，所述组分能在融合分子通过其DNA结合结构域结合至靶序列后影响基因转录。因此，功能性组分可以包括但不限于各种转录因子结构域，如激活因子、阻遏物、共激活因子、共阻遏物和沉默子。
在某些实施方案中，融合分子包含DNA结合结构域和核酸酶结构域，以产生能通过其工程化的(ZFP或TALE或sgRNA)DNA结合结构域识别其预期核酸靶标的功能性实体，并产生核酸酶(例如，锌指核酸酶或TALE核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶)，所述核酸酶通过核酸酶活性使DNA在DNA结合位点附近被切割。此裂解导致τ蛋白基因的失活(阻遏)。因此，τ蛋白阻遏物还包括τ蛋白核酸酶。
因此，本文所述的方法和组合物是广泛适用的，并且可包括任何所关注核酸酶。核酸酶的非限制性例子包括大范围核酸酶、TALEN和锌指核酸酶。核酸酶可包含异源DNA结合和裂解结构域(例如，锌指核酸酶；TALEN；大范围核酸酶DNA结合结构域和异源裂解结构域、与核酸酶结构域缔合的sgRNA)，或者可替代地，天然存在的核酸酶的DNA结合结构域可发生改变以结合至所选靶位点(例如，已经工程化以结合至与同源结合位点不同的位点的大范围核酸酶)。
核酸酶结构域可源自任何核酸酶，例如任何核酸内切酶或核酸外切酶。可与如本文所述的τ蛋白DNA结合结构域融合的适宜核酸酶(裂解)结构域的非限制性例子包括来自任何限制性酶、例如IIS型限制性酶(例如，FokI)的结构域。在某些实施方案中，裂解结构域是裂解半结构域，其裂解活性需要二聚化。参见，例如，美国专利号8,586,526；8,409,861；和7,888,121，其通过引用以其整体并入本文。通常，如果融合蛋白包含裂解半结构域，那么裂解需要两个融合蛋白。可替代地，可以使用包含两个裂解半结构域的单一蛋白质。两个裂解半结构域可以源自相同核酸内切酶(或其功能性片段)，或者每个裂解半结构域可以源自不同核酸内切酶(或其功能性片段)。另外，两个融合蛋白的靶位点优选地关于彼此来布置，使得两个融合蛋白与其各自的靶位点的结合将裂解半结构域置于针对彼此的空间定向中，此允许裂解半结构域例如通过二聚化形成功能性裂解结构域。
核酸酶结构域还可源自具有裂解活性的任何大范围核酸酶(归巢核酸内切酶)结构域，还可用于本文所述的核酸酶，包括但不限于I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。
在某些实施方案中，核酸酶包含紧凑TALEN(cTALEN)。这些是将TALE DNA结合结构域连接至TevI核酸酶结构域的单链融合蛋白。融合蛋白可以用作通过TALE区定位的切口酶，或者可以产生双链断裂，取决于TALE DNA结合结构域关于大范围核酸酶(例如，TevI)核酸酶结构域定位的位置(参见Beurdeley等,(2013)Nat Comm:1-8DOI:10.1038/ncomms2782)。
在其他实施方案中，TALE-核酸酶是大范围TAL。这些大范围TAL核酸酶是包含TALEDNA结合结构域和大范围核酸酶裂解结构域的融合蛋白。大范围核酸酶裂解结构域作为单体具有活性，并且其活性不需要二聚化。(参见Boissel等,(2013)Nucl Acid Res:1-13,doi:10.1093/nar/gkt1224)。
另外，大范围核酸酶的核酸酶结构域还可展现DNA结合功能性。任何TALEN可与其他TALEN(例如，具有一个或多个大范围TAL的一个或多个TALEN(cTALEN或FokI-TALEN))和/或ZFN组合使用。
另外，如与野生型相比，裂解结构域可包括一个或多个改变，例如用于形成减小或消除脱靶裂解效应的专性异二聚体。参见，例如，美国专利号7,914,796；8,034,598；和8,623,618，其通过引用以其整体并入本文。
如本文所述的核酸酶可在双链靶标(例如，基因)中产生双链或单链断裂。单链断裂(“切口”)的产生描述于例如美国专利号8,703,489和9,200,266中，所述案件是通过引用并入本文，其描述一个核酸酶结构域的催化结构域的突变如何产生切口酶。
因此，核酸酶(裂解)结构域或裂解半结构域可以是蛋白质的任一部分，其保留裂解活性，或者保留多聚化(例如，二聚化)以形成功能性裂解结构域的能力。
可替代地，核酸酶可使用所谓的“分裂酶”技术在体内装配于核酸靶位点处(参见例如美国专利公开号2009/0068164)。此类分裂酶的组分可在单独的表达构建体上表达，或者可以连接于一个开放式阅读框中，其中个别组分例如由自裂解的2A肽或IRES序列隔开。组分可以是个别锌指结合结构域或大范围核酸酶核酸结合结构域的结构域。
可在使用前例如在基于酵母的染色体系统中针对活性来筛选核酸酶，如美国公开号2009/0111119中所述。核酸酶表达构建体可以使用本领域已知的方法容易地设计。
融合蛋白(或其组分)的表达可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述启动子例如半乳糖激酶启动子，其在棉子糖和/或半乳糖的存在下被激活(去阻遏)并在葡萄糖存在下被阻遏。优选启动子的非限制性例子包括神经特异性启动子NSE、突触蛋白、CAMKiia和MECP。遍在启动子的非限制性例子包括CAS和Ubc。另外的实施方案包括使用自调节启动子(通过包括τ蛋白DNA结合结构域的高亲和性结合位点)，如美国专利公开号2015/0267205中所述。
递送
可通过任何适宜方式将本文所述的蛋白质和/或多核苷酸(例如，τ蛋白调节剂)和包含所述和/或多核苷酸的组合物递送至靶细胞，所述方式例如通过注射蛋白质、通过mRNA和/或使用表达构建体(例如，质粒、慢病毒载体、AAV载体、Ad载体等)。在优选实施方案中，阻遏物是使用AAV载体来递送，包括但不限于AAV9(参见美国专利号7,198,951)、如美国专利号9,585,971中所述的AAV载体和/或如美国临时专利申请号62/503,121中所述的AAV载体。
递送如本文所述的包含锌指蛋白的蛋白质的方法描述于例如以下文献中：美国专利号6,453,242；6,503,717；6,534,261；6,599,692；6,607,882；6,689,558；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824，上述所有文献的公开内容都是通过引用以其整体并入本文。
可使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等。还参见美国专利号8,586,526；6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824，其是通过引用以其整体并入本文。此外，将了解，这些载体中的任一种可包含一个或多个DNA结合蛋白编码序列。因此，在将一种或多种τ蛋白调节剂(例如，阻遏物)引入细胞中时，编码蛋白质组分和/或多核苷酸组分的序列可在相同载体上或在不同载体上运载。在使用多种载体时，每种载体可包含编码一种或多种τ蛋白调节剂(例如，阻遏物)或其组分的序列。在优选实施方案中，载体系统是AAV载体，例如AAV9或美国专利号9,585,971和/或美国临时专利申请号62/503,121中所述的AAV变体。
常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于在细胞(例如，哺乳动物细胞)和靶组织中引入编码工程化的τ蛋白调节剂的核酸。此类方法还可用于在体外将编码此类阻遏物(或其组分)的核酸给予细胞。在某些实施方案中，给予编码阻遏物的核酸用于体内或离体基因治疗用途。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、裸核酸和与递送运载体(如脂质体或泊洛沙姆(poloxamer))复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有游离型或整合的基因组。对于基因治疗程序的综述，参见Anderson,Science256:808-813(1992)；Nabel和Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993)；Mitani和Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993)；Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller,Nature 357:455-460(1992)；Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988)；Vigne,RestorativeNeurology and Neuroscience 8:35-36(1995)；Kremer和Perricaudet,British MedicalBulletin 51(1):31-44(1995)；Haddada等,Current Topics in Microbiology andImmunology Doerfler和(编)(1995)；和Yu等,Gene Therapy 1:13-26(1994)。
核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂转染、显微注射、生物弹道学、病毒体、脂质体、免疫脂质体、多聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、裸RNA、人工病毒粒子和试剂增强的DNA摄取。还可以使用采用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声致穿孔(sonoporation)来递送核酸。在优选实施方案中，一种或多种核酸是作为mRNA来递送。同样优选的是使用加帽的mRNA来增加翻译效率和/或mRNA稳定性。尤其优选的是ARCA(抗反向帽类似物)帽或其变体。参见美国专利号7,074,596和8,153,773，其是通过引用并入本文。
其他示例性核酸递送系统包括由以下各项提供的那些：Amaxa Biosystems(Cologne，德国)、Maxcyte,Inc.(Rockville，马里兰)、BTX分子递送系统(Holliston，MA)和Copernicus Therapeutics Inc(参见例如美国专利号6,008,336)。脂转染描述于例如美国专利号5,049,386；4,946,787；和4,897,355中，并且脂转染试剂在市场上有售(例如，TransfectamTM和LipofectinTM和LipofectamineTM RNAiMAX)。适合于多核苷酸的有效受体识别脂转染的阳离子型和中性脂质包括Felgner，国际专利公开号WO 91/17424和WO 91/16024的那些。可以递送至细胞(离体给予)或靶组织(体内给予)。
脂质:核酸复合物(包括所靶向的脂质体，如免疫脂质复合物)的制备是本领域技术人员所熟知的(参见，例如，Crystal,Science 270:404-410(1995)；Blaese等,CancerGene Ther.2:291-297(1995)；Behr等,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994)；Remy等,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao等,Gene Therapy 2:710-722(1995)；Ahmad等,Cancer Res.52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183；4,217,344；4,235,871；4,261,975；4,485,054；4,501,728；4,774,085；4,837,028；和4,946,787)。
其他递送方法包括使用将要递送的核酸包装至EnGeneIC递送运载体(EDV)中。这些EDV被使用双特异性抗体特异性地递送至靶组织中，其中所述抗体的一个臂对所述靶组织具有特异性，并且另一个臂对EDV具有特异性。抗体将EDV携带至靶细胞表面，之后EDV通过胞吞作用被引入细胞中。位于细胞中之后，释放内含物(参见MacDiarmid等,(2009)Nature Biotechnology 27(7):643)。
使用基于RNA或DNA病毒的系统递送编码工程化的ZFP、TALE或CRISPR/Cas系统的核酸利用高度演进的方法将病毒靶向体内的特定细胞并将病毒有效负载运输至细胞核中。可将病毒载体直接给予患者(体内)，或其可用于在体外处理细胞，以及将经修饰细胞给予患者(离体)。常规的递送ZFP、TALE或CRISPR/Cas系统的基于病毒的系统包括但不限于用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒和单纯疱疹病毒载体。使用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法时，在宿主基因组中整合是可能的，通常导致所插入转基因的长期表达。另外，已经在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
逆转录病毒的向性可通过并入外来包膜蛋白、扩大靶细胞的潜在靶群体来改变。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且典型地产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。逆转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体包括顺式作用的长末端重复序列，其具有对多达6-10kb的外来序列的包装能力。最小顺式作用LTR对载体的复制和包装而言是足够的，所述载体随后用于将治疗性基因整合至靶细胞中以提供持久的转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于以下病毒的那些：小鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和其组合(参见，例如，Buchscher等,J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等,J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommerfelt等,Virol.176:58-59(1990)；Wilson等,J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等,J.Virol.65:2220-2224(1991)；国际专利公开号WO 1994/026877)。
在其中瞬时表达是优选的应用中，可以使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高的转导效率，并且不需要细胞分裂。使用此类载体，已经获得高滴度和高表达水平。这种载体可以在相对简单的系统中大量生产。腺相关病毒(“AAV”)载体还用于例如在核酸和肽的体外生产中用靶核酸转导细胞，以及用于体内和离体基因治疗程序中(参见，例如，West等,Virology 160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；国际专利公开号WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994))。重组AAV载体的构建描述于多个出版物中，包括美国专利号5,173,414；Tratschin等,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat&Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984)；和Samulski等,J.Virol.63:03822-3828(1989)。
至少六种病毒载体方法目前可用于临床试验中的基因转移，所述试验利用涉及通过插入辅助细胞系中的基因与缺陷性载体互补以产生转导剂的途径。
pLASN和MFG-S是已经用于临床试验中的逆转录病毒载体的例子(Dunbar等,Blood85:3048-305(1995)；Kohn等,Nat.Med.1:1017-102(1995)；Malech等,PNAS 94:22 12133-12138(1997))。PA317/pLASN是第一个用于基因治疗试验中的治疗性载体。(Blaese等,Science 270:475-480(1995))。已经观察到MFG-S包装的载体的转导效率为50％或更高。(Ellem等,Immunol Immunother.44(1):10-20(1997)；Dranoff等,Hum.Gene Ther.1:111-2(1997))。
重组腺相关病毒载体(rAAV)是有前景的基于缺陷性和非病原性细小病毒腺相关2型病毒的替代性基因递送系统。所有载体都源自仅保留侧接转基因表达盒的AAV 145bp反相末端重复序列的质粒。由于整合至经转导细胞基因组中所致的有效基因转移和稳定转基因递送是这种载体系统的关键特征。(Wagner等,Lancet 351:9117 1702-3(1998),Kearns等,Gene Ther.9:748-55(1996))。其他AAV血清型(包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV 8.2、AAV9和AAV rh10)以及假型化AAV(如AAV2/8、AAV2/5、AAV2/9和AAV2/6)也可以根据本发明来使用。能穿越血脑屏障的新颖AAV血清型也可以根据本发明来使用(参见例如美国专利号9,585,971)。在优选实施方案中，使用AAV9载体(包括AAV9的变体和假型)。
复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad)可以以高滴度产生，并且易于感染多种不同的细胞类型。对大多数腺病毒载体进行工程化，使得转基因替代AdE1a、E1b和/或E3基因；随后使复制缺陷性载体在反式供应所缺失的基因功能的人类293细胞中增殖。Ad载体可以在体内转导多种类型的组织，包括非分裂的已分化细胞，如在肝、肾和肌肉中发现的那些。常规Ad载体具有较大运载能力。Ad载体在临床试验中的使用的例子涉及使用肌内注射的用于抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法(Sterman等,Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998))。在临床试验中使用腺病毒载体进行基因转移的其他例子包括Rosenecker等,Infection 24:1 5-10(1996)；Sterman等,Hum.Gene Ther.9:7 1083-1089(1998)；Welsh等,Hum.Gene Ther.2:205-18(1995)；Alvarez等,Hum.Gene Ther.5:597-613(1997)；Topf等,Gene Ther.5:507-513(1998)；Sterman等,Hum.Gene Ther.7:1083-1089(1998)。
包装细胞用于形成能感染宿主细胞的病毒粒子。此类细胞包括包装腺病毒的293细胞以及包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。用于基因疗法中的病毒载体通常是由将核酸载体包装至病毒粒子中的生产细胞系产生。载体典型地含有包装和随后整合至宿主中(如果适用)所需的最小病毒序列，其他病毒序列由编码要表达的蛋白质的表达盒替代。失去的病毒功能由包装细胞系反式供应。例如，用于基因疗法中的AAV载体典型地仅具有来自AAV基因组的反相末端重复(ITR)序列，所述序列是包装和整合至宿主基因组中所需的。将病毒DNA包装于细胞系中，所述细胞系含有编码其他AAV基因(即，rep和cap)但缺少ITR序列的辅助质粒。所述细胞系还被作为辅助者的腺病毒感染。辅助病毒促进AAV载体的复制和来自辅助质粒的AAV基因的表达。由于缺少ITR序列，辅助质粒并未被大量包装。腺病毒的污染可通过例如热处理来减少，腺病毒对所述热处理比AAV更敏感。
在许多基因疗法应用中，可期望以高度特异性将基因疗法载体递送至特定组织类型。因此，可修饰病毒载体，以通过将配体表达为与病毒外表面上的病毒外壳蛋白的融合蛋白而具有对给定细胞类型的特异性。配体被选择以具有对已知存在于所关注细胞类型上的受体的亲和性。例如，Han等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)报道，莫洛尼(Moloney)小鼠白血病病毒可被修饰以表达与gp70融合的人类神经生长因子，并且重组病毒感染某些表达人类表皮生长因子受体的人类乳腺癌细胞。这个原则可扩展至其他病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体并且病毒表达包含针对细胞表面受体的配体的融合蛋白。例如，丝状噬菌体可被工程化以展示对实际上任何所选细胞受体具有特定结合亲和性的抗体片段(例如，FAB或Fv)。虽然上述说明主要适用于病毒载体，但是相同原则可适用于非病毒载体。此类载体可被工程化以含有特定摄取序列，所述摄取序列有利于被特定靶细胞摄取。
基因疗法载体可以通过给予个别患者在体内递送，典型地通过全身给予(例如，静脉内、腹膜内、肌内、真皮下、鞘内、脑池内、脑室内或颅内输注，包括直接注射至脑中，包括注射至脑的任何区域中，如海马体、皮质、纹状体等)或局部施用，如下文所述。可替代地，可以将载体离体递送至细胞中，例如从个别患者外植的细胞(例如，淋巴细胞、骨髓抽取物、组织活检)或全适供血者造血干细胞，之后将所述细胞再植入患者体内，通常在选择已经并入所述载体的细胞后再植入。
在某些实施方案中，如本文所述的组合物(例如，多核苷酸和/或蛋白质)是直接在体内递送。可将组合物(细胞、多核苷酸和/或蛋白质)直接给予中枢神经系统(CNS)，包括但不限于直接注射至脑或脊髓中。可靶向脑的一个或多个区域，包括但不限于海马体、黑质、Meynert基底核(NBM)、纹状体和/或皮质。可替代地或者除了CNS递送以外，组合物可以全身给予(例如，静脉内、腹膜内、贲门内、肌内、真皮下、鞘内、脑池内、脑室内和/或颅内输注)。用于将如本文所述的组合物直接递送至受试者(包括直接递送至CNS)的方法和组合物包括但不限于通过针组件直接注射(例如，立体定向注射)。此类方法描述于例如美国专利号7,837,668和8,092,429(涉及将组合物(包括表达载体)递送至脑)以及美国专利公开号2006/0239966中，其是通过引用以其整体并入本文。
要给予的有效量将随患者而变，并且根据给予方式和给予位点而定。因此，有效量最佳由给予组合物的医师来决定，并且本领域普通技术人员可以容易地决定适当剂量。在允许足够时间进行整合和表达(例如，典型地4-15天)后，分析治疗性多肽的血清或其他组织水平以及与给予之前的初始水平相比较将确定所给予的量是否过低、在适当范围内或者过高。用于初始和后续给予的适宜方案也是可变的，但是如果需要，以初始给予随后为后续给予为代表。后续给予可以按可变间隔来给予，介于每天至每年至每隔若干年的范围内。在某些实施方案中，
为了使用腺相关病毒(AAV)载体将ZFP直接递送至人脑，可以施加1x1010-5x 1015(或其之间的任一值)个载体基因组/纹状体的剂量范围。如所述，剂量可针对其他脑结构和针对不同递送方案加以变化。将AAV载体直接递送至脑的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号9,089,667；9,050,299；8,337,458；8,309,355；7,182,944；6,953,575；和6,309,634。
用于诊断学、研究或基因疗法的离体细胞转染(例如，通过将经转染细胞再输注至宿主生物体中)是本领域技术人员所熟知的。在优选实施方案中，将细胞从受试生物体分离，用至少一种τ蛋白调节剂(例如，阻遏物)或其组分转染，并且再输注回至受试生物体(例如，患者)体内。在优选实施方案中，使用AAV9递送τ蛋白调节剂(例如，阻遏物)的一种或多种核酸。在其他实施方案中，τ蛋白调节剂(例如，阻遏物)的一种或多种核酸是作为mRNA来递送。同样优选的是使用加帽的mRNA来增加翻译效率和/或mRNA稳定性。尤其优选的是ARCA(抗反向帽类似物)帽或其变体。参见美国专利号7,074,596和8,153,773，其是通过引用以其整体并入本文。适于离体转染的多种细胞类型是本领域技术人员所熟知的(参见，例如，Freshney等,Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique(第3版1994)和其中关于如何从患者分离并培养细胞的讨论引用的参考文献)。
在一个实施方案中，在离体程序中使用干细胞进行细胞转染和基因疗法。使用干细胞的优点在于，其可以在体外分化为其他细胞类型，或者可以被引入哺乳动物(如细胞供体)中，其中其将移入骨髓中。在体外使用细胞因子(如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α)将CD34+细胞分化为临床上重要的免疫细胞类型的方法是已知的(参见Inaba等,J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。
使用已知方法分离干细胞以供转导和分化。例如，通过用结合不期望细胞(如CD4+和CD8+(T细胞)、CD45+(全B细胞)、GR-1(粒细胞)和Iad(已分化的抗原呈递细胞))的抗体淘选骨髓细胞来从骨髓细胞分离干细胞(参见Inaba等,J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。
已经被修饰的干细胞也可用于一些实施方案中。例如，已经变得可抵抗细胞凋亡的神经元干细胞可用作治疗性组合物，其中干细胞还含有本发明的ZFP TF。对细胞凋亡的抵抗可例如通过在干细胞中使用BAX或BAK特异性TALEN或ZFN敲除BAX和/或BAK来实现(参见，美国专利号8,597,912)，或者例如在那些半胱天冬酶被破坏的干细胞中，也使用半胱天冬酶-6特异性ZFN来进行。这些细胞可用已知可调节τ蛋白基因的ZFP TF或TALE TF来转染。
也可将含有治疗性ZFP核酸的载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、脂质体等)直接给予生物体用于在体内转导细胞。可替代地，可给予裸DNA。给予是通过通常用于引入分子使其最终与血细胞或组织细胞接触的任何途径来进行，包括但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。给予此类核酸的适宜方法是本领域技术人员可获得的并且所熟知的，并且虽然可以使用多于一种途径来给予特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一途径更直接并且更有效的反应。
将DNA引入造血干细胞中的方法披露于例如美国专利号5,928,638中。可用于将转基因引入造血干细胞(例如，CD34+细胞)中的载体包括腺病毒35型。
适于将转基因引入免疫细胞(例如，T细胞)中的载体包括非整合性慢病毒载体。参见，例如，Ory等,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11382-11388；Dull等,(1998)J.Virol.72:8463-8471；Zuffery等,(1998)J.Virol.72:9873-9880；Follenzi等,(2000)Nature Genetics 25:217-222。
药学上可接受的载体部分取决于所给予的特定组合物，以及取决于用于给予所述组合物的特定方法。因此，存在众多种可使用的药物组合物的适宜制剂，如下文所述(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,1989)。
如上所述，所公开的方法和组合物可以用于任何类型的细胞中，包括但不限于原核细胞、真菌细胞、古细菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞、脊椎动物细胞、哺乳动物细胞和人类细胞。用于蛋白质表达的适宜细胞系是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)、perC6、昆虫细胞(如草地贪夜蛾(Spodoptera fugiperda)(Sf))和真菌细胞(如酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pischia)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。还可以使用这些细胞系的子代、变体和衍生物。在优选实施方案中，将方法和组合物直接递送至例如纹状体中的脑细胞中。
CNS障碍的模型
对CNS障碍的研究可以在动物模型系统中进行，如非人灵长类动物(例如，帕金森病(Parkinson's Disease)(Johnston和Fox(2015)Curr Top Behav Neurosci 22:221-35)；肌萎缩侧索硬化(Jackson等,(2015)J.Med Primatol:44(2):66-75)、亨廷顿氏病(Yang等,(2008)Nature 453(7197):921-4)；阿尔茨海默病(Park等,(2015)Int J Mol Sci16(2):2386-402)；癫痫发作(Hsiao等,(2016)E Bio Med 9:257-77))、犬(例如MPS VII(Gurda等,(2016)Mol Ther 24(2):206-216)；阿尔茨海默病(Schutt等,(2016)JAlzheimers Dis 52(2):433-49)；癫痫发作(Varatharajah等,(2017)Int J Neural Syst27(1):1650046))和小鼠(例如癫痫发作(Kadiyala等,(2015)Epilepsy Res 109:183-96)；阿尔茨海默病(Li等,(2015)J Alzheimers Dis Parkin 5(3)doi 10:4172/2161-0460))，(综述：Webster等,(2014)Front Genet 5art 88,doi:10.3389f/gene.2014.00088)。即使在没有动物模型完全重演CNS疾病时，也可使用这些模型，因为其可用于研究疾病的特定症状集。这些模型可帮助确定本文所述的治疗方法和组合物(遗传阻遏物)的功效和安全性概况。
应用
包含如本文所述的MAPT结合分子(例如，ZFP、TALE、CRISPR/Cas系统、Ttago等)和其编码核酸的如本文所述的τ蛋白调节剂(例如，τ蛋白阻遏物)可以用于多种应用中。这些应用包括治疗方法，其中使用病毒(例如，AAV)或非病毒载体将MAPT结合分子(包括编码DNA结合蛋白的核酸)给予受试者，并用于调节靶基因在受试者体内的表达。调节可以呈阻遏形式，例如阻遏促进AD疾病状态的τ蛋白表达。可替代地，在内源细胞基因的表达的激活或增加的表达可以改善疾病状态时，调节可以呈激活形式。在再另外的实施方案中，调节可以是通过裂解(例如，通过一种或多种核酸酶)来阻遏，例如用于使MAPT基因失活。如上所述，对于此类应用，用药学上可接受的载体将MAPT结合分子(或更典型地其编码核酸)配制为药物组合物。
可以将单独的或与其他适宜组分(例如脂质体、纳米颗粒或本领域已知的其他组分)组合的MAPT结合分子或其编码载体制成气溶胶制剂(即，其可以被“雾化”)以通过吸入给予。可以将气溶胶制剂置入加压的可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。适于肠胃外给予(例如，通过静脉内、肌内、真皮内和皮下途径)的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。组合物可以例如通过以下方式来给予：静脉内输注、口服、局部、腹膜内、膀胱内、眶后(RO)、颅内(例如，给予至脑的任何区域，包括但不限于海马体和/或皮质)或鞘内。化合物的制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，如安瓿和小瓶。注射溶液和悬浮液可以从先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂来制备。
给予患者的剂量应该足以随时间在患者体内实现有益的治疗反应。所述剂量取决于以下因素：所采用特定MAPT结合分子的功效和Kd、靶细胞和患者的状况，以及要治疗的患者的体重或表面积。剂量大小还取决于以下因素：伴随特定化合物或载体在特定患者中的给予的任何不良副作用的存在、性质和程度。
以下实施例涉及本公开文本的示例性实施方案，其中MAPT-调节剂包含锌指蛋白。将了解，这仅用于例示的目的，并且可使用其他MAPT-调节剂(例如，阻遏物)，包括但不限于TALE-TF、CRISPR/Cas系统、其他ZFP、ZFN、TALEN、其他CRISPR/Cas系统、具有工程化的DNA结合结构域的归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)。将明了，这些调节剂可使用技术人员已知的方法容易地获得，以结合至如下问所例示的靶位点。类似地，以下实施例涉及示例性实施方案，其中递送运载体是任何AAV载体，但是将明了，任何病毒(Ad、LV等)或非病毒(质粒、mRNA等)可用于递送本文所述的τ蛋白阻遏物。
实施例
实施例1：MAPT阻遏物
对约185种基本上如美国专利号6,534,261；美国专利公开号2015/0056705；2011/0082093；2013/0253040；和2015/0335708所述工程化的锌指蛋白进行筛选，并且ZFP结合至其MAPT靶位点。选择靶向小鼠MAPT的锌指蛋白52288、52322、52364、52366、52389、57880、57890和65888(参见下表1至3)用于进一步研究。针对65888列示的磷酸触点突变体如先前所述(参见例如美国专利申请号15/685,580)。表1显示这些ZFP的DNA结合结构域的识别螺旋，以及这些ZFP的靶序列。还制造一组ZFP以靶向小鼠与人类基因之间共享的MAPT序列。这些显示于表2中。表3显示亲本和衍生的ZFPTF，其中ZFP骨架已经在所指示位置发生突变，以移除潜在的非特异性磷酸触点。通过标准SELEX分析评估ZFP，并且显示其结合至其靶位点。
表1：小鼠MAPT特异性阻遏物设计
表2：人类/小鼠MAPT特异性阻遏物设计
还制备了如美国专利申请号15/685,580中所述的包括骨架区中的一个或多个突变(例如，相对于DNA结合螺旋在位置(-5)、(-9)和/或位置(-14)进行的突变，例如R或K至A、L、S、N、E、Y或Q)的ZFP(参见，例如，表1-3中的65888、57930、65918、65920、65894、57947、65,968、65887、65860和65976)。本文所述的所有ZFP都与KRAB阻遏结构域可操作连接以形成ZFP-TF，并且都阻遏MAPT表达。
将示例性ZFP TF转染至小鼠Neuro2a细胞或原代小鼠皮质神经元中。在24小时后，提取总RNA并使用实时RT-qPCR监测MAPT和两种参考基因(ATP5b、RPL38)的表达。如图1中所示，发现ZFP-TF在阻遏MAPT表达中有效，具有多样性的剂量反应和MAPT阻遏活性(参见图1B)。
将ZFP-TFτ蛋白阻遏物工程化，其包括对骨架区的突变。表3描绘示例性ZFP-TF阻遏物(和其亲本化合物)。使用这些最佳化ZFP TF的结果(例如比较65888与57880显示的示例性结果)证实显著改良的特异性(超过10倍)并且不影响在原代神经元中的活性(τ蛋白阻遏，参见图1B)。此外，在Neuro2A细胞中测试57880亲本的两种衍生物65887和65888对BOD1和MOSPD1脱靶的阻遏活性(参见图1D)，其中在ZFP骨架中包含磷酸触点突变的蛋白质的脱靶阻遏减小。还参见美国专利申请号15/685,580。
实施例2：小鼠神经元中的τ蛋白阻遏
将所有ZFP阻遏物都使用CMV启动子克隆至rAAV2/9载体中以驱动表达。病毒在HEK293T细胞中产生，使用CsCl密度梯度纯化，并通过实时qPCR根据本领域中已知的方法来滴定。使用纯化的病毒以3E5、1E5、3E4和1E4VG/细胞感染所培养的原代小鼠皮质神经元。在7天后，提取总RNA并使用实时RT-qPCR监测MAPT和两种参考基因(ATP5b、EIF4a2)的表达。
如图1C中所示，发现所有编码AAV载体的ZFP-TF都在宽感染剂量范围内有效阻遏小鼠MAPT，其中一些ZFP在多个剂量下将靶标减少大于95％。相比之下，对于在等效剂量下测试的rAAV2/9CMV-GFP病毒或模拟处理的神经元，没有观察到MAPT阻遏(参见图1)。
使用编码CMV-52389-KRAB的rAAV2/9以3E5、1E5和3E4VG/细胞感染小鼠皮质神经元。在10天后，从一组重复提取总蛋白；使用平行感染组进行总RNA提取。通过蛋白质印迹探测等量的总细胞裂解物的总τ蛋白(抗τ蛋白-5)、52389-KRAB(抗ZNF10)和GAPDH(抗GAPDH)(参见图2A)。使用LiCOR Odyssey系统测量定量荧光，揭示与模拟处理的神经元相比，在3E5VG/细胞剂量下出现98％的τ蛋白减少(参见图2)。使用实时RT-qPCR监测MAPT、52389-KRAB和两种参考基因(ATP5b、EIF4a2)的表达。在3E5VG/细胞组中，相对于模拟处理的神经元，MAPT转录物水平降低98％(参见图2)。
因此，在配制为质粒、呈mRNA形式、于Ad载体中和/或于AAV载体中时，如本文所述的遗传调节剂(例如，阻遏物)(包括结合至如表1和2中所示的靶位点的那些)是功能性阻遏物。
实施例3：MAPT阻遏的特异性
通过微阵列分析在小鼠Neuro2A细胞中评估表1和2中所示ZFP-TF的总体特异性。简单来说，将300ng编码mRNA的ZFP-TF以生物学一式四份转染至150,000个Neuro2A细胞中。在24小时后，提取总RNA并根据制造商的方案加工(Affymetrix Genechip MTA1.0)。使用稳健多阵列平均值(RMA)将来自每个探针组的原始信号归一化。使用TranscriptomeAnalysis Console 3.0(Affymetrix)以“基因水平差异性表达分析”选项进行分析。将ZFP转染的样品与已经用无关ZFP-TF(其不结合至MAPT靶位点)处理的样品相比较。报道了具有>2倍的平均信号相对于对照的差异以及P值<0.05(用于每个探针组的单因素ANOVA分析、非配对T检验)的转录物(探针组)变化信息(change call)。
如图3中所示，SBS#52322阻遏除了MAPT以外的5种基因，并引起另外3种基因增加。SBS#52364和#52366阻遏除了MAPT以外的4种基因，而SBS#52389仅引起MAPT基因的阻遏以及1种基因的增加。SBS#57880减少除了MAPT以外的2种基因，并增加1种基因。SBS#57890减少除了MAPT以外的4种基因，并增加1种基因。SBS#52288阻遏除了MAPT以外的124种基因并增加25种基因的表达。
还在原代人类成纤维细胞中评价ZFP-TF特异性，所述细胞对转染更敏感并允许在甚至更高的有效ZFP-TF水平下评估特异性。使用每种处理的四个生物学重复，每个重复由300ng转染至150,000个人类成纤维细胞中的编码mRNA的ZFP-TF组成。在24小时后，提取总RNA并根据制造商的方案加工(Affymetrix Human Primeview)。加工和分析如针对Neuro2A细胞所述。重要的是，人类成纤维细胞不表达MAPT，因此没有检测到MAPT水平的变化。基于先前概述的倍数变化标准，SBS#52322阻遏58种基因并引起另外53种基因的增加。SBS#52364阻遏43种基因并增加25种基因。SBS#52366阻遏63种基因并引起另外63种基因的增加。SBS#52389未阻遏任何基因，并增加另外13种基因。SBS#57880减少7种基因，并增加2种基因。SBS#57890减少1种基因，并增加2种基因，而SBS#52288阻遏594种基因，同时增加302种基因的表达(参见图4)。
在ZFP-TF的AAV递送后，在原代小鼠皮质神经元中进一步评价ZFP-TF特异性。使用每种处理的六个生物学重复，每个重复由以1E5VG/细胞感染至16万个原代小鼠皮质神经元中的编码CMV-ZFP-TF的rAAV2/9组成。在7天后，提取总RNA并根据制造商的方案加工(Affymetrix Genechip MTA1.0)。加工和分析如针对Neuro2A和成纤维细胞所述。
基于先前概述的倍数变化标准，SBS#52322阻遏除了MAPT以外的80种基因，并引起另外19种基因增加。SBS#52364阻遏除了MAPT以外的29种基因，并增加2种基因。SBS#52389阻遏除了MAPT以外的1种基因。SBS#57880减少除了MAPT以外的60种基因，并增加3种基因。SBS#57890仅阻遏MAPT，并增加1种基因(参见图5)。
还进行实验以检查来自锌指骨架的潜在磷酸触点的一个或多个修饰(如本文中美国专利申请号15/685,580中所述)对特异性的效应。比较两种示例性ZFPτ蛋白阻遏蛋白(57880和65888)，其具有相同的螺旋结构域(参见表3)，但是65888具有锌指骨架中的突变以移除潜在的磷酸接触性氨基酸残基。
如图5B中所示，由57800上调和下调的基因数(分别是75种和110种)被65888蛋白显著减少(3种上调和4种下调，包括τ蛋白)，证实通过对骨架区的修饰提高了特异性。
实施例4：用于CNS限制性ZFP-TF表达的神经元启动子
评估3种神经元启动子在原代小鼠神经元中表达ZFP-TF的能力：人类突触蛋白1启动子的469bp片段(SYN1；Kügler等,(2001)Methods Mol Med 53:139-50)、α-钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶启动子的375bp片段(CamKII；Dittgen等,(2004)Proc Natl Acad Sci USA101(52):18206-11)和甲基CpG结合蛋白2启动子的229bp片段(MeCP2；Adachi等,(2005)HumMol Genet 14(23):3709-22)。).克隆每种片段来代替实施例2中使用的CMV启动子，并针对驱动52389-KRAB的每种启动子构建体制造rAAV2/9，其通过2A肽序列连接以使得能够共表达两种蛋白质(Nagai等,(2002)Nat Biotechnol 20(1):87-90和M.D.Ryan等,(1991)J.Gen.Virol.72p.2727)。
使用纯化的病毒以3E5、1E5、3E4和1E4VG/细胞感染所培养的原代小鼠皮质神经元。在7天后，提取总RNA并使用实时RT-qPCR监测MAPT和两种参考基因(ATP5b、EIF4a2)的表达。
所有启动子都导致ZFP表达，并且SYN1和CamKII二者实现与CMV类似的转录物水平。相比之下，MeCP2以低约10倍的水平表达。MAPT也在宽感染剂量范围内被阻遏，其中SYN1显示最强反应，CAMKII其次，再其次是CMV，并且最后MeCP2的MAPT阻遏水平最弱。在3E5VG/细胞的最高剂量下，与模拟处理的神经元相比，所有启动子都能够将MAPT阻遏>90％，其中SYN1显示99.4％的最强MAPT减少(降低约175x倍)(参见图6A)。
还使用纯化的病毒感染所培养的原代海马体神经元，并且如针对皮质神经元所述来分析和加工样品。所有神经元启动子都导致ZFP表达和MAPT阻遏，其具有相同等级次序的活性、类似的阻遏程度以及在原代皮质神经元中观察到的剂量反应曲线(参见图6B)。
总之，这些结果表明，任何神经元启动子将足以在MAPT相关适应证的所关注主要区域(即海马体和皮质)中实现ZFP表达和MAPT阻遏。
此外，在ZFP-TF的充分递送是一种限制(例如，通过静脉内或鞘内递送)时，和/或在可能选择低亲和性ZFP-TF来使脱靶基因调节最小化的情形中，强神经元启动子(如SYN1或CAMKII)的使用可以用于降低高表达转录物靶标的水平。相反，在所关注靶基因以中等水平至低水平表达时，在足够递送至靶区域是非限制性的(例如直接颅内递送)时，和/或为了使高亲和性ZFP-TF的脱靶活性最小化，可以选择较弱的神经元启动子(如MeCP2)。
实施例5：在iPS衍生的神经元中对人类MAPT的阻遏
基于对本文所述的所有ZFP的标准SELEX特异性分析，预测表2和3中所列的ZFP可耐受在人类MAPT序列中的一个(在SBS#57890和SBS#52366的情形中)或两个(在SBS#57880的情形中)非保守位置的错配(参见图7A，从左至右分别为SEQ ID NO:31、32和48-51)。
将表2和3中的示例性ZFP-TF克隆至具有实施例4中所述的469bp SYN1启动子片段的AAV载体(AAV6、AAV9AAV2/9或其变体)中。rAAV病毒在HEK293T细胞中产生，使用CsCl密度梯度纯化，并通过qPCR滴定。使用纯化的病毒以3E5、1E5、3E4和1E4VG/细胞感染人类iPS衍生的神经元(iCell神经元，Cellular Dynamics International Inc)。在18或19天后，提取总RNA并使用实时RT-qPCR评价人类MAPT、ZFP-KRAB和三种参考基因(ATP5b、EIF4a2、GAPDH)的表达。每种病毒在所测试的剂量范围中表达类似的ZFP水平。
示例性结果显示于图7中。在3E5VG/细胞的最高剂量下，与模拟感染的细胞相比，57880-KRAB将人类MAPT阻遏95％，52366-KRAB导致87％MAPT减少，并且57890-KRAB将MAPT降低45％(参见图7B)。对于本文所述的其他转录因子(例如，如表1至3中所示的ZFP-TF)获得类似的结果。对于与针对小鼠MAPT观察到的行为相比，SBS#57890的降低的人类MAPT阻遏活性的一种解释是，其异常的全基因组特异性程度，这与对其靶位点中的错配的耐受性较低是一致的(参见实施例3)。
使用ZFP-TF 52366，针对ZFP-TF表达和人类MAPT的MAPT阻遏评估CMV、SYN1和CAMKII启动子。针对驱动52366-KRAB的每种启动子构建体制造rAAV2/9，并用于感染如所述的人类iPS衍生的神经元。与CAMKII(模拟的40％)和CMV(模拟的71％)相比，SYN1启动子导致最高水平的ZFP表达和MAPT减少(模拟处理的神经元的5％)(参见图7C)。
人类iPS衍生的神经元也经历如上所述的微阵列分析，以分析19,959种编码转录物的群体中的脱靶阻遏的量。在每种情形中，基于先前概述的倍数变化标准将ZFP-TF与65976蛋白相比较，并且图指示出测试ZFP-TF的概况的变化(参见图7D)。结果指示，若干种人类τ蛋白ZFP-TF在人类神经元中具有高特异性。
实施例6：由AAV递送的ZFP TF驱动的体内MAPT阻遏
使用多种不同的AAV载体将如本文所述的各种ZFP-TF递送至小鼠海马体以在体内评估对MAPT的阻遏。将编码τ蛋白阻遏物的AAV用57890.T2A.Venus静脉内(IV)或脑室内(ICV)给予，或通过立体定向注射颅内(IC)给予。
简单来说，对于AAV 2/9，每个半球的rAAV2/9-CMV-ZFP-TF的8E9 VG的总剂量是通过立体定向注射经由双重双侧2μL注射来给予。对于美国专利号9,585,971中所述的AAV载体，将AAV载体以1E12的总剂量脑室内(ICV)或静脉内(IV)给予。将如美国临时专利申请号62/503,121中所述的AAV载体以1E12vg/动物ICV给予，或以2E12vg/动物IV给予。
在注射后4周(IV和ICV)或5周(IC)时，将动物处死。对于IV和ICV治疗的动物，将右半球解剖为不同脑区用于RT-qPCR分析，并且使用左半球进行组织学分析。对于IC治疗的动物，将每个海马体切片为3片用于RT-qPCR分析(A，前部；B，中间；C，后部海马体)。还通过实时RT-qPCR分析MAPT和ZFP-TF表达，并针对三种持家基因(ATP5b、EIF4a2和GAPDH)的几何平均值进行归一化。
数据显示，在脑室内或静脉内给予时，AAV载体有效转导神经元靶标，并且ZFP-TF在整个CNS中(脑和脊髓，包括在额皮质、前部皮质、后部皮质、海马体、脑干、纹状体、丘脑、中脑、小脑、腰段脊髓、胸段脊髓和颈段脊髓中)导致有效且持续的τ蛋白减少。图8A至8C显示如与AAV9(图8B中的“9”)相比，在给予62/503,121中所述的AAV载体(图8B中的“SGMO”)后，使用ZFP-TFSBS#52322、SBS#52389和SBS#57890的示例性结果。图8A中描绘的显微照片是在递送SGMO载体后4周时拍摄，其中ICV递送的剂量是1e11vg/小鼠，并且IV递送的剂量是2e12vg/小鼠。图8C描绘在同一实验中通过ICV或IV给药单一给予后，τ蛋白mRNA水平的变化。对于所测试的所有其他ZFP-TF发现相同结果。
图8D和8E显示使用AAV2/9载体的示例性结果，并且证实，对于颅内递送至海马体，52389-KRAB和52322-KRAB二者都能够有效阻遏MAPT(参见图8D)。对于每个半球，通过横越3个切片的相对ZFP表达水平来评价覆盖度。这个分析揭示，虽然许多切片具有极佳的覆盖度，但是若干个切片具有极少或没有ZFP-TF表达，表明在颅内立体定向递送后，若干个动物在整个海马体上的覆盖度不均匀(参见图8E)。使用如本文所述的其他ZFP-TF时获得类似的结果。
另外，使用美国专利号9,585,971中所述的AAV载体递送的如本文所述的τ蛋白阻遏物也显著阻遏CNS(包括脊髓)中的τ蛋白。示例性结果显示于图8F-8H中。对于本文所述的所有ZFP-TF，在mRNA蛋白质水平上，CNS中的阻遏是快速并且随时间持续的。此外，τ蛋白的CSF水平与脑水平相关，并且因此可用作τ蛋白阻遏物功能的指示物(参见，示例性图8H)。
总之，通过任何AAV载体通过任何途径递送的如本文所述的任何τ蛋白阻遏物都在持续时间段内有效调节(阻遏)τ蛋白。
为了进一步理解在海马体中ZFP-TF诱导的MAPT阻遏的程度，使用三种分析方法。第一，将来自治疗组中每只动物的所有6个切片的ZFP-TF和MAPT表达值取平均值，并通过ANOVA和之后的Sidak事后检验与PBS组相比较。对于52322(平均MAPT减少66％)和52389(平均MAPT减少55％)二者都观察到高显著性的(P<0.0001)MAPT阻遏(参见图9A)。
第二，鉴别来自具有最高ZFP-TF表达水平的每只动物的切片并用于计算在理想覆盖场景下的平均最大τ蛋白减少。同样，对于所测试的所有ZFP-TF都观察到高显著性的(P<0.0001)MAPT阻遏。显示于图9B中的示例性结果显示使用52322(平均MAPT减少73％)和52389(平均MAPT减少89％)减少超过70％。
第三，评价MAPT与ZFP-TF水平(本文中表示为ZFP拷贝/ng RT-qPCR反应中的RNA输入的绝对值)的相关。对于52322(P<0.0001，R2＝0.53)和52389(P<0.0001，R2＝0.82)二者都观察到高显著性联系(参见图9C和9D)。
还在给予如本文所述的遗传阻遏物后评价τ蛋白病变的P301L突变体人类τ蛋白(P301L)转基因小鼠模型(rTg4510，Jackson Labs)中的τ蛋白减少。另外，在这个和其他小鼠AD模型中(例如，APPswe/PS1d9，Jackson Labs)评估阻遏物的临床和治疗有效性，以确定是否存在τ蛋白病变的生物标志物和症状的减少，所述生物标志物和症状包括以下各项中的一种或多种：神经毒性、神经胶质增生、营养不良性神经突、脊柱损失、兴奋性毒性、皮质和海马体萎缩、树突状τ蛋白积累、认知(例如，放射臂迷宫和Morris水迷宫、恐惧条件化等)以及运动缺陷。参见，例如，Bryan等,(2009)第1章:Transgenic Mouse Models ofAlzheimer’s Disease:Behavioral Testing and Considerations in Methods ofBehavior Analysis in Neuroscience.第2版Buccafusco,Boca Raton(FL):CRC Press/Taylor&Francis。另外，还在给予如本文所述的遗传阻遏物后4-8周评价化学诱导的癫痫发作模型，例如用兴奋毒性化合物(如戊四唑(PTZ，参见例如Meyers等,(1975)Epilepsia 16(2):257-67)或红藻氨酸盐(Ferraro等,(1997)Mamm Genome 8:200-208))处理的野生型小鼠，以确定τ蛋白减少是否赋予针对癫痫发作的保护性效应，包括与癫痫发作相关的致命性、延长的癫痫发作的潜伏期和/或癫痫发作严重性的降低。
将如本文所述的τ蛋白调节剂(例如，阻遏物)使用如本文所述的非病毒或病毒(例如，AAV)载体直接递送至脑中，例如通过颅内注射至海马体或皮质中、脑室内或静脉内递送。在给予阻遏物后一段时间(阻遏物给予后1-11个月)后，收获脑，切片并对其进行免疫组织化学分析和/或成像分析(例如，双光子成像)，以评价神经元活力、神经胶质增生、营养不良性神经突、树突棘密度、皮质和海马体厚度、τ蛋白mRNA表达和τ蛋白水平。
在给予ZFP阻遏物后8周，接受阻遏物的小鼠在表达ZFP的神经元中显示80-90％或更高的对τ蛋白(mrna和蛋白质)的阻遏。在长期(6个月)τ蛋白敲低后，没有见到显著神经元损失或升高的神经胶质增生。小鼠τ蛋白阻遏也针对神经炎性营养不良加以保护。因此，如本文所述的τ蛋白调节剂(例如，阻遏物)向患有τ蛋白病变的受试者提供体内临床和治疗益处。
实施例7：通过从神经元启动子表达的AAV递送的ZFP TF驱动的体内MAPT阻遏和蛋白质敲低
将编码通过实施例5中所述的CMV、SYN1、CAMKII或MeCP2启动子驱动的如本文所述的ZFP-TF 2A-Venus构建体的重组AAV载体递送至小鼠海马体，以评估MAPT mRNA和蛋白质的体内降低。简单来说，通过双重双侧1.5μL注射将每个半球2.4E10VG的总剂量通过立体定向注射给予成年野生型小鼠。在注射后6周将动物处死，并将每个海马体用保险刀片精细匀浆化，并将所得组织分配为两个等量。取一半进行mRNA分析，其中通过实时RT-qPCR分析MAPT、ZFP-TF、GFAP和IBA1表达，并针对三种持家基因(ATP5b、EIF4a2和GAPDH)的几何平均值进行归一化。取另一半用于通过ELISA进行定量τ蛋白分析，并且示例性结果呈现于图10中。相对于对照处理的动物，在给予AAV ZFP-TF后τ蛋白mRNA减少至少85％。在给予rAAV9-CMV-52389V后的示例性结果如下：rAAV9-SYN1-52389V将τ蛋白表达减少63％；rAAV9-CAMKII-52389V将τ蛋白表达减少74％；并且rAAV9-MeCP2-52389V构建体减少83％(对于所有启动子，P<0.0001)。发现编码CAMKII启动子的载体的平均ZFP表达最高(设为1的值)，MeCP2启动子的平均ZFP表达最低(CAMKII水平的15％)，并且CMV(CAMKII水平的59％)和SYN1(CAMKII水平的90％)启动子的平均ZFP表达为中等。
还使用RT-qPCR试剂分别针对IBA1和GFAP评价小胶质细胞和激活的星形胶质细胞的存在。与注射PBS的动物相比，MeCP2启动子不导致IBA1水平的显著变化，SYN1导致高4.7倍的IBA1水平(P<0.0001)，CMV导致高3.0倍的水平(P<0.05)，并且CAMKII导致高3.2倍的水平(P<0.001)。类似地，与注射PBS的动物相比，MeCP2启动子不导致GFAP升高，SYN1导致高4.0倍的GFAP水平(P<0.0001)，CMV导致高3.2倍的水平(P<0.01)，并且CAMKII导致高2.4倍的水平(P<0.05)。
对于所有三种神经元启动子构建体，还观察到总τ蛋白的稳健减少(使用SBS52389的示例性结果显示于图11中)。与注射PBS的对照水平(269ng/ml)相比，rAAV9-SYN1-52389V构建体导致23％的对照水平(61ng/ml，P<0.0001)，rAAV9-CAMKII-52389V构建体产生18％的对照水平(49ng/ml，P<0.0001)，rAAV9-SYN1-52389V构建体具有12％的对照水平(32ng/ml，P<0.0001)。使用如本文所述的其他ZFP-TF(例如，57890、65894、57930、65918、65920、57880、65887、65888、57947、65968、52322、52364、52366、52288、52389和/或65860)获得类似水平或高水平的减少。
因此，神经元启动子能够在整个小鼠海马体中驱动>80％的τ蛋白mRNA和蛋白质减少。
实施例8：在整个海马体和相连脑区域中τ蛋白减少的组织学证据
将本文所述的人工转录因子递送至小鼠海马体以通过免疫荧光染色评估在体内对τ蛋白的阻遏。将2.4E10VG的总剂量的rAAV-CMV-ZFP-TF(rAAV2/9、rAAV6等)通过立体定向注射经由双重单侧1.5μL注射给予成年野生型小鼠。将ZFP-TF与荧光Venus蛋白相连以定位TF表达。在注射后6周将动物处死，并收集整个脑并切片，用于使用标准方法对核(DAPI)、τ蛋白和GFP进行组织学染色。还进行荧光激活的细胞分选(FACS)分析。简单来说，为了在AAV ZFP-dVenus转导的细胞中评估τ蛋白敲低效率，使用木瓜蛋白酶解离试剂盒(Worthington Biochem.Corp.)根据制造商手册解离注射有AAV CMV ZFP-dVenus的海马体，然后使用流式细胞术(Miltenyi MACSQuant VYB流式细胞仪)分析细胞悬浮液。然后通过FACS使用绿色488nm激光(BioRadS3细胞分选仪；每个样品30k-50k个GFP阳性细胞)分离相同样品中的dVenus或GFP表达细胞。分选后，通过以1,000x g离心10min将细胞旋转沉淀，并且再悬浮于100μl RNA(ThermoFisher)中用于RNA分析。
示例性结果显示于图12中(注射有rAAV2/9-CMV-ZFP-TF SBS#52389的动物)。图12A显示穿过前部海马体的小鼠脑的横截面，并鉴别4个加框区域，并编号为1-4。注射至左半球(同侧)中，其在横截面的左侧导致更高荧光。之后的图是这些框中每个框的特写图像。这些框描述于下文中：
框1(图12B)显示横越压后皮质的荧光强度的量化，其中ZFP-TF表达在同侧与对侧半球之间区分明显。在图12B的左图中，中线同侧(“ipsi”)上的荧光信号高于对侧(“contra”)上的荧光信号。此处的ZFP表达可能是从海马体轴突投射产生。图右侧上的大部分信号是由于核的DAPI染色所致。中图显示使用抗τ蛋白标记抗体的总荧光，其中图的同侧(左)中的信号几乎都是由于GFP信号所致，而图对侧(右)上的信号主要是由于τ蛋白的存在和下层DAPI染色所致。12B的右图显示针对τ蛋白信号的定量加以分析的横截面框(描绘于图12C中)。所述图显示来自所注射(处理)侧的减少的τ蛋白特异性荧光(“同侧”相对于“对侧”)的。
图12D框2(同侧)和图12E框3(对侧)是来自海马体的图像，显示同侧(经处理)与对侧的τ蛋白减少，相对于同侧，τ蛋白敲低在对侧上的齿状回中特别明显(由箭头指示)。
框4下丘脑中的区域，其中在同侧中存在焦点ZFP表达(顶部图显示GFP荧光，左侧椭圆形)，并且本体τ蛋白荧光(底部图)显示总τ蛋白信号的约50％减少(参见同侧与对侧之间的图表)。使用包含如表1、2和3中所述的ZFP-TF的AAV构建体获得类似结果。
因此，如本文所述的ZFP-TF在体内阻遏τ蛋白表达。
实施例9：小鼠海马体中的体内安全性、τ蛋白减少和ZFP-TF的持续表达
为了评价本文所述的τ蛋白靶向的人工转录因子的短期和长期海马体表达二者的安全性，将如本文所述的ZFP-TF体内递送至小鼠海马体以监测ZFP表达以及星形胶质细胞和小胶质细胞反应，以及总体海马体解剖学。在一个实验中，将2.4E10VG的总剂量的rAAV2/9-CMV-52389-2A-Venus(“389dV”)、rAAV2/9-CMV-ZFP-TF(“389”)、rAAV2/9-CMV GFP(“GFP”)或PBS(“PBS”)通过立体定向注射经由双重单侧1.5μL注射给予成年野生型小鼠。在注射后6周或6个月将两个群组处死，并收集整个脑并切片用于使用标准方法对核(DAPI)、GFP、GFAP(以检测激活的星形胶质细胞)和IBA1(以检测小胶质细胞)进行组织学染色，并且结果显示于图13中。图13H包含描绘海马体中两个区域的荧光的图像，其证实在注射后，τ蛋白在海马体的前部和后部区域中都被阻遏。
对于6周时间点(图13A)，描绘海马体中经转导细胞的信号，ZFP-TF的信号与GFP载体几乎相同。图13B显示星形胶质细胞的结果，并且还显示在三种处理中几乎相同的结果，如也在海马体小胶质细胞中所见(图13C)。
对于6个月时间点，图13D中的数据展示与在6周时间点所见极其相似的GFP和ZFPTF载体的荧光水平，表明海马体中经转导细胞的量没有随时间显著变化。图13E还显示，不同处理之间的信号非常相似，并且在6周时间点与6个月时间点之间没有显著变化(图13B相对于图13E，注意两个图之间y轴的差异)。在用AAV载体处理后6个月时间点的小胶质细胞几乎相同，在PBS处理样品中略有降低。
对平均CA1(海马体区域之一)厚度的测量显示在ZFP表达6个月后没有显著变化(图13G)，证实ZFP的长期表达没有明显神经元毒性。
进行另一分析，其中如上所述给予ZFP-TF，但是仅比较PBS与连接至2a-Venus的52288、52364和52389构建体。给药是如实施例6中所述。在给药后，在4周时将动物处死，并且数据呈现于图13I中。所呈现的数据显示，与其他构建体相比，用52288构建体处理导致显著减弱的载体基因组和ZFP表达，并且未以任何显著方式阻遏τ蛋白表达。然而，其确实导致GFAP和IBA1的水平升高。ZFP 52364具有高于52288构建体的载体基因组水平和ZFP表达，但导致差不多高的GFAP和IBA1水平，并且未显著阻遏τ蛋白表达。相比之下，52389构建体能够引起τ蛋白表达显著下降，并且不影响GFAP或IBA1表达。
ZFP 52288和52364的体内τ蛋白减少的缺乏和升高的神经炎症性生物标志物与在Neuro2A细胞、人类成纤维细胞和原代神经元(图3、4、5)中评价的ZFP特异性概况相关，显示高特异性ZFP显著减少τ蛋白表达并且在体内是可耐受的。
接受PBS或52389-2a-Venus的给药组的一部分被延长至11个月。除了分析τ蛋白阻遏的量以外，还分析样品的所表达ZFP的量的mRNA表达水平，以及编码GFAP、IBA1、NeuN、MAP1A、MAP1B和MAP2的转录物的量的任何变化。简单来说，将每个海马体用保险刀片精细匀浆化，并将所得组织分配为两个等量。取一半进行mRNA分析，其中通过实时RT-qPCR分析MAPT、ZFP、GFAP、IBA1、NeuN、MAP1A、MAP1B和MAP2表达，并且针对三种持家基因(ATP5b、EIF4a2和GAPDH)的几何平均值进行归一化。示例性结果呈现于图13J中，其还包括用于比较的6周数据。数据证实，通常在6周与11个月时间范围之间分析的大多数数据集没有显著变化。然而，检测到所检测的ZFP表达的量减少。对于三种其他微管相关蛋白(MAP1A、MAP1B和MAP2)没有观察到显著的补偿性变化，NeuN水平也没有任何降低，这与在ZFP递送后6个月评价的ZFP处理的半球中海马体体积的保持是一致的。使用如本文所述的ZFP-TF进行其他实验，并产生类似结果。
因此，结果证实，在单一给予后，ZFP表达在体内随时间持续，并且不产生对受试者CNS的毒性，并且成体海马体中ZFP介导的τ蛋白减少持续并良好耐受至少11个月。
使用C57BL/6野生型小鼠(8周龄雌性)进行另一研究，其中使用本文所述的AAV通过眶后递送来递送ZFP-TF。使用每只动物2.5e12个病毒基因组(vg)，并且在10周后将动物处死。对来自经处理小鼠的海马体组织进行微阵列分析，所显示数据是与以相同方式递送的无关ZFP-TF相比较。图17显示，如与用GFP编码AAV处理相比，57890V和52389V蛋白特异性阻遏τ蛋白。这些数据证实，在体外观察到的这些蛋白质的特异性也在体内有所发现。
实施例10：小鼠AD模型中的τ蛋白减少
除了上文在野生型小鼠中进行的那些研究以外，在小鼠AD模型中进行研究。用如本文所述的ZFP-TF处理APP/PS1小鼠(综述于Li等中，出处同上)以在此模型中分析功效。
简单来说，在一个实验中，在4.5月龄处理4只APP/PS1小鼠和2只野生型对照。进行单一注射，将3μL AAV组合物引入脑的对侧皮质(CTX)中。每只小鼠的左侧CTX接受3μLAAV9，所述AAV9包含由突触蛋白1启动子驱动的连接至GFP的ZFP-TF(无关的ZFP-TF对照(“172”；AAV9syn1-172v))或52389ZFP-TF(“389”；AAV9syn1-389v)。每只小鼠的右侧CTX接受3μL AAV9，所述AAV9包含由突触蛋白1启动子驱动的RFP表达构建体(“AAV9 syn1-tRFP”)。
在处理后十一(11)周，向7月龄小鼠灌注4％PFA/PBS。然后移除全脑并用4％PFA/PBS在4℃下后固定2天。然后将组织冷冻保护于30％蔗糖/PBS溶液中。分析50μm冠状切片针对tRFP、GFP和淀粉样蛋白β(“Aβ”)的免疫荧光标记。每只小鼠分析3个脑切片，并且每个切片获取3-5个图像。在富含Aβ的斑块中计数营养不良性神经突，使得每只动物分析介于121个与256个之间的斑块。对于AAV9syn1-389v处理的CTX计数到708个斑块，并且对于AAV9syn1-tRFP CTX计数到287个斑块。示例性数据呈现于图14A-D中，并且显示如与tRFP处理的皮质相比，用52389ZFP-TF处理的皮质中，每一定数目的Aβ斑块中营养不良性神经突数目的统计学上显著的差异(图15和16)。相比之下，在用无关ZFP-TF处理的动物中，每个斑块的营养不良没有差异。另外，在经处理和未经处理的动物二者中，斑块的数目和体积不变。使用如本文所述的其他AAV载体、给予方式和/或ZFP-TF进行的其他实验产生类似结果。
因此，本文所述的τ蛋白遗传阻遏物提供针对τ蛋白病变(如AD)的临床和治疗益处，如通过在已知小鼠AD模型中的研究所示。
实施例11：灵长类动物脑中的体内τ蛋白减少
在食蟹猴(cynomolgus monkey，M.fascicularis)中测试灵长类动物τ蛋白特异性ZFP-TF以在灵长类动物(非人灵长类动物(NHP)模型)中观察对τ蛋白表达的阻遏。将食蟹猴饲养于配备有不锈钢网状地板和自动化供水阀的不锈钢笼中。研究遵守动物福利法案最终规则(Final Rules of the Animal Welfare Act)条例(美国联邦法规(Code of FederalRegulations)，第9篇)的所有适用章节。
实施初始实验以确定是否可充分靶向猴子的海马体。在研究第1天将对照物(配制缓冲液，PBS和0.001％Pluronic F-68，pH 7.1)和测试物解冻并分配，其中将测试物和对照物通过MRI指导的AAV9-GFP或AAV9-ZFP-TF递送给予海马体。
在第一实验中，将包含hSYN1驱动的GFP基因的AAV9以3.84e11vg/半球递送至左半球并以7.68e11vg/半球递送至右半球。一只动物以40μL体积在左半球接受单一剂量的测试物，并在右半球接受80μL的单一剂量。第二动物在左半球接受两次20μL剂量，并在右半球接受两次40μL剂量。对于两种测试物，剂量浓度为9.6e12vg/mL。在14天后，将动物处死并将脑切成对半，并分为约17个切片(每个3mm)。使用包含海马体/内嗅皮层区域的切片分析固有的GFP荧光和GFP免疫组织化学。使用其他切片收集组织打孔样品用于通过qRT-PCR进行mRNA分析，其中分析τ蛋白和持家基因的水平。另外，收集一些打孔样品并保留用于探索性τ蛋白分析。结果显示，hSYN1启动子能驱动在递送后在海马体区域中可检测的GFP表达。
进行第二实验以评估给予途径对GFP在脑中的表达和定位的效应。在此研究中，GFP转基因是由SB3AAV颗粒运载(参见美国临时申请号62/503,121)，并且测试物的剂量浓度为2.5e13vg/mL。所述剂量是通过脑室内、鞘内或静脉内途径来给予，其中剂量体积(mL/动物)分别为约1、1.5和10-16。在给药后14天，如上所述将动物处死并将脑切成对半。除了通过qRT-PCR分析τ蛋白和持家基因的水平以外，还分析与炎症相关的基因(GFAP和Iba1)。还进行探索性研究以分析脑组织样品和脑脊髓液中的τ蛋白水平。这些研究显示，给药途径都被良好耐受并且都能将GFP转基因递送至海马体区域。
随后，进行研究以分析在食蟹猴脑中如本文所述的人工转录因子对τ蛋白表达的阻遏。测试如本文所述的三种或更多种ZFP-TF(表1至3)，其中所述三种ZFP已经被表征为具有高特异性(0个脱靶)和高(≥90％阻遏)体外功效的蛋白质(ZFP-TF 1)；具有中等特异性(5-10个脱靶)和高体外功效的蛋白质(ZFP-TF2)；以及具有高特异性和中等(50-60％)体外功效的蛋白质(ZFP-TF3)。在1、3和6个月时间点将动物处死，并如上所述进行分析。观察到在整个脑和CSF中显著阻遏τ蛋白，且无显著神经元损失。
研究证实，在灵长类动物脑中，τ蛋白ZFP-TF试剂阻遏τ蛋白表达(包括在治疗水平下)。
本文中提到的所有专利、专利申请和公开都是出于所有目的通过引用以其整体特此并入。
虽然已经出于清晰理解的目的通过说明和实施例详细提供了公开文本，但是本领域技术人员将了解，可以在不背离本公开文本的精神或范围的情况下进行各种改变和修改。因此，前述说明和实施例不应视为限制性的。

Claims (16)

1.一种微管相关蛋白τ蛋白(MAPT)基因的遗传调节剂，所述调节剂包含
DNA结合结构域，其结合至所述MAPT基因中至少12个核苷酸的靶位点；和
转录调节结构域或核酸酶结构域。
2.权利要求1的遗传调节剂，其中所述DNA结合结构域包括锌指蛋白(ZFP)、TAL效应子结构域蛋白(TALE)或单一指导RNA。
3.权利要求1或权利要求2的遗传调节剂，其中所述转录调节结构域包含阻遏结构域或激活结构域。
4.一种多核苷酸，其编码权利要求1至3中任一项的遗传调节剂。
5.一种基因递送运载体，其包含权利要求4的多核苷酸。
6.权利要求5的基因递送运载体，其中所述基因递送运载体包含AAV载体。
7.一种药物组合物，其包含一种或多种权利要求1至3的遗传调节剂、一种或多种权利要求4的多核苷酸和/或一种或多种权利要求5或6的基因递送运载体。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述遗传调节剂包含核酸酶结构域，并且所述遗传调节剂裂解所述MAPT基因。
9.权利要求8的药物组合物，其进一步包含供体分子，其整合至所裂解的MAPT基因中。
10.一种分离的细胞，其包含一种或多种权利要求1至3的遗传调节剂、一种或多种权利要求4的多核苷酸、一种或多种权利要求5或6的基因递送运载体和/或权利要求7至9中任一项的药物组合物。
11.一种或多种权利要求1至3的遗传调节剂、一种或多种权利要求4的多核苷酸、一种或多种权利要求5或6的基因递送运载体和/或权利要求7至9中任一项的药物组合物用于调节受试者中的MAPT表达的用途。
12.权利要求11的用途，其中MAPT表达被阻遏。
13.权利要求11或权利要求12的用途，其中对所述受试者的给予是脑室内、鞘内、颅内、静脉内、眶后或脑池内给予。
14.权利要求11至13中任一项的用途，其中对所述受试者中的MAPT表达的阻遏治疗和/或预防τ蛋白病变。
15.权利要求11至14中任一项的用途，其中所述受试者中τ蛋白的量减少。
16.一种试剂盒，其包含一种或多种权利要求1至3的遗传调节剂、一种或多种权利要求4的多核苷酸、一种或多种权利要求5或6的基因递送运载体、权利要求7至9中任一项的药物组合物和/或使用说明。
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