KR20190085529A - Tau 조절제 및 그것의 전달을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 알츠하이머병에 대한 진단 및 치료학 분야에 있다.

Description

Tau 조절제 및 그것의 전달을 위한 방법 및 조성물
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2016년 12월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/428,871; 2017년 1월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 62/450,895; 2017년 3월 2일에 출원된 미국 가출원 번호 62/466,198; 2017년 5월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 62/500,807; 및 2017년 11월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 62/584,342의 이익을 주장하며, 상기 출원들의 내용은 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
기술 분야
본 개시는 알츠하이머병과 같은 타우병증(tauopathies)에 대한 진단 및 치료학 분야에 있다.
많은, 아마도 대부분의 생리적 및 병리생리적 과정들이 유전자 발현의 일탈적인 상향 또는 하향 조절과 관련이 있을 수 있다. 그 예로, 몇 가지 예를 들면, 류머티스성 관절염에서 전염증성 사이토카인의 부적절한 발현, 고콜레스테롤혈증에서 간의 LDL 수용체의 저발현, 전혈관신생 인자들의 과잉 발현 및 고체 종양 성장에서의 혈관신생 억제 인자의 저발현을 들 수 있다. 이에 더불어, 바이러스, 박테리아, 진균, 및 원생동물과 같은 병원성 유기체가 유전자 발현을 변경시킴으로써 제어될 수 있다.
유전자의 프로모터 영역은 전형적으로 인접한, 핵심 및 하류 요소들을 포함하고, 전사는 다수의 인핸서에 의해 조절될 수 있다. 이런 서열들은 다양한 전사 인자를 위한 다수의 결합 부위를 함유하고 프로모터 서열의 위치, 거리 또는 배행과 관계없이 전사를 활성화시킬 수 있다. 유전자 발현 조절을 달성하기 위하여, 인핸서-결합된 전사 인자들이 개재 서열을 루프에서 제외시키고 프로모터 영역과 접촉한다. 게다가, 진핵세포 유전자들의 활성화는 크로마틴 구조의 탈압축(de-compaction)을 필요로 할 수 있는데, 그것은 히스톤 변형 효소 또는 ATP-의존성 크로마틴 리모델링 복합체의 충원에 의해 수행되어서 크로마틴 구조가 변경되고 DNA의 유전자 발현에 포함된 다른 단백질들에 대한 접근성이 증가할 수 있다 (Ong and Corces (2011) Nat Rev Genetics 12:283).
크로마틴 구조의 변동은 여러 메커니즘에 의해 발생할 수 있고 - 그것들의 일부는 특이적 유전자에 국한되며, 다른 것들은 게놈에 퍼져 있고 크로마틴의 축합을 필요로 하는 유사분열과 같은 세포 과정들 중에 발생한다. 히스톤 상의 리신 잔기들은 아세틸화되어, 히스톤 단백질과 염색체 DNA 사이의 전하 상호작용을 효과적으로 중화시킬 수 있다. 이것은 과아세틸화된 및 고도로 전사된, 일반적인 접근성의 특징인, DNAse 민감성인 것으로 또한 밝혀진 β-글로빈 유전자좌에서 관찰되었다. 관찰된 다른 유형의 히스톤 변형으로는 메틸화, 인산화, 탈아민화, ADP 리보실화, β-N-아세틸글루코사민 당의 첨가, 유비퀴틴 첨가(ubiquitylation) 및 수모일화(sumoylation)를 들 수 있다 (Bannister and Kouzarides (2011) Cell Res 21:381 참조).
질환 관련 유전자들의 억압 또는 활성화는 조작된(조작된) 전사 인자들의 사용을 통해 이루어졌다. 조작된 아연 핑거(zinc finger) 전사 인자들 (ZFP-TF)을 설계 및 사용하는 방법들이 문서에 잘 설명되어 있고 (예를 들어 미국 특허 제 6,534,261호 참조), 보다 최근에는 이펙서 전사 인자 및 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문식(palindromic) 반복부 Cas 기반 전사 인자들 (CRISPR-Cas-TF)이 또한 기술되어 있다 (Kabadi and Gersbach (2014) Methods 69(2): 188-197 리뷰 참조). 표적화된 유전자들의 비제한적 실례로는 포스포람반(phospholamban) (Zhang et al., (2012) Mol Ther 20(8): 1508-1515), GDNF (Langaniere et al., (2010) J. Neurosci 39(49): 16469) 및 VEGF (Liu et al., (2001) J Biol Chem 276:11323-11334)를 들 수 있다. 게다가, 유전자들의 비활성화는 CRIPSR/Cas-아세틸트란스퍼라제 융합의 사용에 의해 이루어졌다 (Hilton et al., (2015) Nat Biotechnol 33(5):510-517). 유전자 발현을 억압하는 (리프레서) 조작된 TF가 또한 헌팅턴병 (HD)과 같은 트라이뉴클레오타이드 장애를 치료하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 예컨대 미국 특허 제 8,956,8282호 및 미국 특허출원 공개공보 2015/0335708 참조.
알츠하이머병 (AD)은 완전히 이해되지 않았고, 현재 아직까지는 빈약하게 이해된 방식으로 서로와 상호작용할 수 있는 여러 구별되는 질환 메커니즘을 특징으로 하는 복잡한, 다인성 질환이다. 모든 연령대에서 5백 30만명으로 추정되는 미국인이 AD를 가지고 있는데, 그것은 미국에서 상위 10위의 사망 원인 중 하나로 만들며, 2050년이 되면, 전세계적으로 1억 620만명이 이 질환에 걸릴 것으로 추정된다 (van Dijk et al., (2015) Front Neurosci 9, art. 173). 이 질환은 여성에게서 더 우세하면 (사례의 2/3) 또한 아프리카인이나 히스패닉 혈통의 사람들이 백인 혈통의 사람들보다 AD를 발생시킬 가능성이 더 많다. AD의 원인은 유전적 (특히, 사례의 5%를 차지하는 초기 발병의 경우) 및 환경적 및 라이프스타일 인자들과 관련되는 것으로 나타난다. 전형적으로, 질환은 진단이 이루어진 시점에 의해 따지자면 사람의 60대 중반에 진단되지만, 질환은 수년 동안 또는 심지어 수십년 동안 진행되어 왔다. 질환은 시간이 경과함에 따라 지속적으로 진행되고, 따라서 질환의 영향을 축소시키거나 반전시키는 치료적 개입이 더 이상은 확인될 수 없었다.
질환의 특징은 뇌에서의 시냅스의 소실이며, 인지기능 저하로 이어진다. 건강한 뇌에서는, 시냅스 가소성(synaptic plasticity)이 학습 및 기억 형성을 가능하게 하는 것이라 여겨진다. AD 과정 중에, 시냅스 가소성은 변경되고 그런 가소성을 유지하는데 포함된 많은 메커니즘이 조절에 장애를 일으켜서 시냅스 기능부전 및 붕괴로 이어진다 (Spires-Jones 및 Hyman (2014) 뉴런 82:756).
비록 AD의 개시 및 진행에 영향을 미치는 분자 인자들이 많이 있는 것으로 나타나지만, 대부분의 과학적 초점은 질환의 두가지 주요 플레이어에 대한 것이었다. 첫 번째는 아밀로이드 β (Aβ)로 불리는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 40 내지 42개 아미노산 단편으로, 베타 세크레타아제(secretase) 및 감마 세크레타아제에 의한 단백질 가수분해성 절단을 통해 생성된다 (Olsson et al., (2014) J Biol Chem 289(3):1540-1550). 불용성 Aβ 단편은 뇌의 '노인' 반('senile' plaques)에 축적되지만 이들 플라크의 존재와 신경변성 사이에 엄격한 상관관계가 있을 것으로 보이지는 않는다.
다른 인자, Tau 또한 대단한 관심을 받았다. Tau는 원래 미세소관을 안정화시키는 것으로 여겨졌던 미세소관-관련 단백질이다. AD 환자에서, 및 일반적으로, 그러나 더 적게는 고령에서, tau는 신경섬유 탱글(neurofibrillary tangles) (NFT)에서 축적될 수 있다. 질환의 과정 중에, tau는 과인산화되고 미세소관으로부터 분리되어 필라멘트에서 축적된다. Aβ 플라크와는 대조적으로, NFT의 존재와 인지기능 저하 사이에는 직접적인 상관관계가 있다 (Spires-Jones and Hyman, 상기 동일).
흥미롭게도, tau와 Aβ는 둘 다 정상적인 시냅스 기능에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타난다. Tau는 세포의 미토콘드리아를 시냅스로 수송하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타나며 tau의 과잉발현이 이 수송을 억제하는 것으로 나타났다. 미토콘드리아 수송의 손상은 ATP 생성 및 칼슘 버퍼링에서 필수적인 미토콘드리아 역할로 인하여 시냅스 손실을 유발하는 것으로 여겨진다. Aβ는 건강한 세포에서 시냅스 가소성에서 역할을 하는 것으로 나타난다. 그러나, 이 두 개의 단백질의 플라크 및 탱글에서의 축적은 AD 진행과 관련된다. 실제로, 아밀로이드 플라크의 출현은 AD의 가장 초기 단계에 중요하며 이것은 NFT의 출현으로 이어지고, 두 단백질은 실제로 질환의 진행을 가속화하기 위해 서로와 상승적으로 작용하는 것으로 여겨진다 (Pooler et al., (2015) Acta Neuropath Comm 3(14):1). 그러나 이 단백질들의 가용성 형태가 독성에 기여한다는 것이 점점 더 분명해진다 (Spires-Jones and Hyman, 상기 동일).
실제로, tau의 비정상적인 수준 및/또는 응집은 종합적으로 타우병증으로 언급되는 많은 질병에 연루되었다. 이것들로는 알츠하이머병 AD, 전주측두엽 치매 (FTD, Benussi et al., (2015) Front Ag Neuro 7, art. 171 참조), 진행성 핵상 마비 (PSP), 난치성 유전성 간질 (예컨대 드라베 증후군, Gheyara et al., (2014) Ann Neurol 76:443-456 참조) 및 피질기저핵 변성 (CBD, Scholz and Bras 2015, Int J. Mol Sci 16(10): 24629-24655 참조)을 들 수 있다. 다 자란 쥐에서 직접적으로 뇌척수액 (CSF)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용한 tau 발현의 감소는 tau 수준의 완전한 또는 부분적인 감소를 유발하였고 또한 치료된 마우스를 발작 중증도의 관점에서 화학적 유도된 발작으로부터 보호하였다 (DeVos et al., (2013) J of NeuroSci 33(31):12887).
AD는 내후각 피질(entorhinal 피질)에서 시작된 후 해마 형성체(해마 formation), 변연계(limbic) 및 연합 피질(association cortices)을 통해, 마지막으로 질환의 후기 단계에서 대부분의 뇌 영역에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, AD의 진행은 NFT의 출현에 의해 표시되고, 질환의 후기 단계에서 tau를 함축한다. 작업이 잘못 접혀진, 고도로 인산화된 tau 단백질이 뉴런에 의해 보다 쉽게 흡수될 수 있고 뇌를 통해 질환을 전파시킬 수 있음을 보여주는 것 같이, tau는 프리온과 유사한 특성을 가질 수 있고, AD 환자의 뇌로부터 분리된 이런 잘못 접혀진 tau가 마우스 뉴런에 의해 쉽게 흡수될 수 있다는 것이 시사되었다 (Takeda et al., (2015) Nat Comm doi:10.1038/ncomms9490; Hyman (2014) 뉴런 82:1189). 게다가, 형질전환 마우스 모델을 이용하여 실시한 작업은 마우스 뇌의 내후각 피질에서 탱글 형성에만 관련된 인간 tau 돌연변이의 발현이 마우스 tau의 잘못 접혀짐 및 임의의 검출 가능한 인간 tau 발현 없이 뉴런에서의 그 tau의 응집으로 이어졌음 (de Calignon et al., (2012) 뉴런 73:685-697)을 보여주었고, 그것은 잘못 접혀진 인간 단백질이 잘못 접힘을 '시딩'할 수 있으며 마우스 단백질의 응집을 유발할 수 있음을 시사한다. 추가로, 내인성 마우스 tau의 유전자 감소 또는 손실은 돌연변이 인간 tau 이식유전자의 과잉발현에 의해 유발된 신경병리학적 독성에 대해 보호한다 (Wegmann et al., (2015) EMBO J. 34(24):3028-41).
그러므로, 뇌에 대한 광범위한 전달을 나타내는 모달리티를 포함한; AD, FTD, PSP CBD 및 발작을 포함한 타우병증의 예방 및/또는 치료 방법에 대한 요구가 남아 있다.
본원에는 하나 이상의 타우병증, 예컨대 알츠하이머병 (AD)을 진단, 예방 및/또는 치료하기 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 특히, 본원에는 조작된 전사 인자 리프레서 (tau 발현을 억압함)를 포함한, AD와 같은 적어도 하나의 타우병증을 치료하기 위하여 tau 대립유전자를 변형 (예컨대 tau 대립유전자의 발현을 조절)시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 추가로, 이런 방법 및 조성물들은 AD, FTD, PSP CBD 및/또는 발작을 포함한, 기타 타우병증의 치료 및/또는 예방을 위해 tau 대립유전자를 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 특히, 본원에는 타우병증을 가진 대상체에서 tau 응집체를 검출, 감소 및/또는 제거하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
그러므로, 본원에는 미세소관 관련 단백질 tau (MAPT) 유전자의 유전자 조절제(genetic modulator)가 기술되며, 조절제는 MAPT 유전자의 적어도 12개의 뉴클레오타이드의 표적 부위에 결합하는 DNA-결합 도메인; 및 기능성 도메인 (예컨대, 전사 조절 도메인 (예컨대 억압 도메인 또는 활성화 도메인) 또는 뉴클레아제 도메인)을 포함한다. 한정하는 것은 아니지만, 아연 핑거 단백질 (ZFP), TAL-이펙터 도메인 단백질 (TALE), 단일 가이드 RNA (CRISPR 시스템의), 아르고노트(Argonaute) 단백질 등을 포함한 임의의 DNA-결합 도메인이 사용될 수 있다. 본원에 기술된 것과 같이 유전자 조절제를 암호화하는 바이러스 및 비바이러스 유전자 전달 비히클 (예컨대 mRNA, 플라스미드, AAV 벡터, 렌티바이러스 벡터, Ad 벡터로서)을 포함한, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공된다. 특정 구체예에서, 유전자 전달 비히클은 당업계에 공지되어 있는 AAV 벡터 변종 (예컨대 미국 특허 제 9,585,971호 및 미국 가특허 출원 번호 62/503,121)을 포함한, AAV 벡터, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV rh10, 이들 벡터들의 위형(pseudotype) (예컨대, AAV2/8, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/9, 등)을 포함한다. 유전자 조절제, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및/또는 하나 이상의 유전자 전달 비히클 중 하나 이상을 포함하는 제약학적 조성물 및 분리된 세포가 또한 제공된다. 발명은 또한 대상체에게 본원에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 하나 이상의 유전자 전달 비히클, 및/또는 제약학적 조성물을 제공하는 것을 포함한, 필요로 하는 대상체에서 MAPT 발현을 조정하기 위한 방법 및 사용을 제공한다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 (예컨대 대상체에서 tau의 양을 감소시킴으로써) 타우병증의 치료 및/또는 예방에 대한 것을 포함하여, 대상체에서 MAPT 발현을 억압하기 위해 사용된다. 본원에 기술된 조성물은 지속적인 기간 (6개월 내지 1년 이상) 동안 뇌 (한정하는 것은 아니지만 전두 피질, 전방 피질, 후방 피질, 해마, 뇌간(brain stem), 선조체, 시상, 중뇌, 소뇌를 포함함)에서 및 척수 (한정하는 것은 아니지만 요추, 흉부 및 경부 영역을 포함함)에서 tau 수준을 감소시킨다. 본원에 기술된 조성물은 대상체에게, 한정하는 것은 아니지만, 뇌실내, 척수강내, 두개내, 정맥내, 안와 (안와 뒤 (RO)) 및/또는 뇌수조내 (intracisternal)) 투여를 포함한, 임의의 투여에 의해 제공될 수 있다. 본원에 기술된 조성물 (예컨대, 유전자 조절제, 폴리뉴클레오타이드, 제약학적 조성물 및/또는 세포) 중 하나 이상 및 뿐만 아니라 이 조성물들을 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
그러므로, 한 측면으로, 하나 이상의 tau 유전자의 조작된 (자연적으로 발생하지 않는) 유전자 조절제 (예컨대, 리프레서)가 제공된다. 유전자 tau 조절제는 tau 대립유전자의 발현을 조정 (예컨대 억압)하는 시스템 (예컨대, 아연 핑거 단백질, TAL 이펙터 (TALE) 단백질 또는 CRISPR/dCas-TF)을 포함할 수 있다. 조작된 아연 핑거 단백질 또는 TALE은 그것의 DNA 결합 도메인이 사전에 선택된 표적 부위에 결합하도록 변경되어 있는 (예컨대, 선택 및/또는 합리적인 설계에 의하여) 자연적으로 발생하지 않는 아연 핑거 또는 TALE 단백질이다. 본원에 기술된 임의의 아연 핑거 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 아연 핑거를 포함할 수 있고, 각각의 아연 핑거는 선택된 서역(들) (예컨대, 유전자(들))에서의 표적 하위부위에 결합하는 인식 나선(recognition 나선)을 가진다. 유사하게, 본원에 기술된 임의의 TALE 단백질은 임의의 수의 TALE RVD를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 RVD는 비-특이적 DNA 결합 특징들을 가진다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 인식 나선 (또는 RVD)은 자연적으로 발생하지 않는다. CRISPR/Cas-TF는 표적 서열에 결합하는 단일 가이드 RNA를 포함한다. 특정 구체예에서, 조작된 전사 인자는 tau-암호화 유전자의 적어도 12개의 염기쌍 표적 부위, 예를 들어 표 1 내지 3 (SEQ ID No:1 내지 6, 33 및 44 내지 46)의 적어도 12개의 염기쌍 (예컨대, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개 또는 그 이상)을 포함하는 표적 부위, 및 이들 표적 부위 내의 연속적인 또는 비연속적인 서열들에 (예컨대, ZFP, TALE 또는 sgRNA DNA 결합 도메인을 통해) 결합한다. 특정 구체예에서, 아연 핑거 단백질 DNA-결합 도메인은 표 1, 2 및 3의 52288, 52322, 52366, 57890, 57880, 65888, 52364, 52389, 65894, 57930, 65918, 65920, 65887, 57947, 65968, 65976 또는 65860으로 지정된 ZFP들을 포함하여, 표 1 내지 3 중 임의의 표에 나타낸 단백질들에 인식 나선들을 가진다. 특정 구체예에서, 유전자 조절제는 전사 억압 도메인에 작동가능하게 연결된, 본원에서 기술된 DNA-결합 도메인 (ZFP, TALE, 단일 가이드 RNA)을 포함하는 유전자 리프레서이다. 다른 구체예에서, 유전자 조절제는 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인 (예컨대, 1, 2개 또는 그 이상의 뉴클레아제 도메인)에 작동가능하게 연결된, 본원에 기술된 DNA-결합 도메인 (ZFP, TALE, 단일 가이드 RNA)을 포함하는 유전자 리프레서이다. 결과적으로 얻어지는 뉴클레아제는, 예를 들어, DNA-결합 도메인 표적 서열(들) 내의; 절단 부위(들) 내의; 표적 서열(들) 및/또는 절단 부위(들)로부터 가까이 있는 (1 내지 50개 또는 그 이상의 염기쌍); 및/또는 뉴클레아제 쌍이 절단에 사용될 때 쌍을 이룬 표적 부위들 사이의 표적 유전자를 유전자 상으로 변형시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 아연 핑거 단백질 (ZFP), CRISPR/Cas 시스템의 Cas 단백질 또는 TALE 단백질은 융합 단백질의 일부로서 조절 도메인 (또는 기능성 도메인)과 작동성 결합상태에 놓일 수 있다. 기능성 도메인은, 예를 들어, 전사 활성화 도메인, 전사 억압 도메인 및/또는 뉴클레아제 (절단) 도메인일 수 있다. DNA-결합 도메인과 함께 사용하기 위해 활성화 도메인 또는 억압 도메인 중 어느 하나를 선택함으로써, 그러한 분자들은 tau 발현을 활성화하거나 억압하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 기능성 또는 조절 도메인은 히스톤 번역후 변형에서 역할을 할 수 있다. 일부 경우에, 도메인은 히스톤 아세틸트란스퍼라제 (HAT), 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC), 히스톤 메틸라아제(methylase), 또는 히스톤 또는 번역후 히스톤 변형 조절된 유전자 억압을 허용하는 기타 효소 도메인을 수모일화 또는 비오티닐화하는 효소이다 (Kousarides (2007) Cell 128:693-705). 일부 구체예에서, tau 발현을 하향 조절하기 위해 사용될 수 있는 전사 억압 도메인에 융합된, 본원에 기술된 tau 유전자 (예컨대, MAPT)에 표적화된 ZFP, dCas 또는 TALE을 포함하는 분자가 제공된다. 일부 구체예에서, 발명의 방법 및 조성물은 진핵세포를 치료하는데 유용하다. 특정 구체예에서, 조절 도메인의 활서은 외인성 작은 분자 또는 리간드에 의해 조절되어서 세포의 전사 기계와의 상호작용이 외인성 리간드의 부재시에는 일어나지 않을 것이다. 그러한 외부 리간드는 ZFP-TF, CRISPR/Cas-TF 또는 TALE-TF와 전사 기계와의 상호작용 정도를 제어한다. 조절 도메인(들)은 하나 이상의 ZFP, dCas 또는 TALE, 하나 이상의 ZFP, dCas 또는 TALE의 외부와 그것들의 임의의 조합 사이를 포함하여, ZFP, dCas 또는 TALE 중 하나 이상의 임의의 부분(들)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 조절 도메인은 표적화된 tau 유전자의 유전자 발현의 억압을 초래한다. 본원에 기술된 임의의 융합 단백질은 제약학적 조성물로 제제화될 수 있다.
일부 구체예에서, 발명의 방법 및 조성물은 본원에 기술된 둘 이상의 융합 단백질, 예를 들면 둘 이상의 tau 조절제 (예컨대, tau 리프레서)의 사용을 포함한다. 둘 이상의 융합 단백질은 상이한 표적 부위에 결합할 수 있고 동일하거나 상이한 기능성 도메인을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 둘 이상의 융합 단백질은 동일한 표적 부위에 결합할 수 있지만 상이한 기능성 도메인들을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 3개 이상의 융합 단백질이 사용되며, 다른 경우에, 4개 이상의 융합 단백질이 사용되는 한편, 다른 경우에는, 5개 이상의 융합 단백질이 사용된다. 바람직한 구체예에서, 둘 이상의, 3개 이상의, 4개 이상의, 또는 5개 이상의 융합 단백질이 세포에 핵산으로서 전달된다. 바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 표적화된 유전자의 발현의 억압을 유발한다. 일부 구체예에서, 2개의 융합 단백질은 각각의 단백질이 그 자체로도 활성이지만 조합될 때에는 억압 활성이 부가적인 용량으로 제공된다. 바람직한 구체예에서, 2개의 융합 단백질은 그 자체로도 활성이 아니고, 조합될 때에도 억압 활성이 상승적이지 않은 용량으로 제공된다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조작된 DNA 결합 도메인은 융합 단백질의 일부로서 뉴클레아제 (절단) 도메인들과 작동성 결합 상태에 놓일 수 있다. 일부 구체예에서, 뉴클레아제는 Ttago 뉴클레아제를 포함한다. 다른 구체예에서, CRISPR/Cas 시스템과 같은 뉴클레아제 시스템이 DNA에서 표적 위치로 뉴클레아제를 표적화하기 위해 특이적인 단일 가이드 RNA와 함께 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 그러한 뉴클레아제 및 뉴클레아제 융합은 뉴클레아제 융합의 활성이 tau 대립유전자의 발현을 감소시키는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC), 인간 배아 줄기 세포 (hESC), 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 뉴런 줄기 세포와 같은 줄기 세포에서 tau 대립 유전자를 표적화하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 변형된 줄기 세포를 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다.
또 다른 측면으로, 본원에 기술된 DNA 결합 단백질, 뉴클레아제 및/또는 전사 인자 중 임의의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는, 한정하는 것은 아니지만, 미국 특허 제 9,585,971호 또는 미국 특허 제 7,198,951호)에 기술된 하나 이상의 AAV 벡터 및/또는 미국 가특허 출원 번호 62/503,121에 기술된 하나 이상의 AAV 벡터를 포함한, 하나 이상의 AAV2, AAV2/9, AAV6, 또는 AAV9 벡터를 포함한, 적어도 하나의 AAV 벡터 (또는 그것의 위형 또는 변종)를 포함한다.
다른 측면으로, 발명은 표적 세포로의 도너 핵산의 전달을 포함한다. 도너는 뉴클레아제(들)을 암호화하는 핵산 전에, 후에, 또는 그것과 함께 전달될 수 있다. 도너 핵산은 세포의 게놈에, 예를 들어, 내인성 유전자좌에 통합될 외인성 서열 (형질전환 유전자)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 도너는 표적화된 절단 부위와 상동성인 영역에 의해 플랭킹된 전장 유전자 또는 그것의 단편을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 도너는 상동하는 영역이 없고 상동성 무관 메커니즘 (즉 NHEJ)을 통해 표적 유전자좌로 통합된다. 도너는 임의의 핵산 서열, 예를 들어, 뉴클레아제-유도된 이중 가닥 파괴의 상동성-지정 수복을 위한 기질로서 사용될 때 내인성 염색체 유전자좌에서 생성될 도너-특이적인 결실, 또는 대안적으로 (또는 그에 더불어) 생성될 내인성 유전자좌의 신규한 대립유전자 형태 (예컨대, 전사 인자 결합 부위를 제거하는 점 돌연변이)로 이어지는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 측면으로, 도너 핵산은 통합이 유전자 보정 사건, 또는 표적화된 결실로 이어지는 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 도너는 Tau 발현을 억압할 수 있는 전사 인자를 암호화한다. 다른 구체예에서, 도너는 Tau 단백질의 발현을 억제하는 RNA 분자이다.
일부 구체예에서, DNA 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 mRNA이다. 일부 측면으로, mRNA는 화학적으로 변형될 수 있다 (예컨대 Kormann et al., (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157 참조). 다른 측면으로, mRNA는 ARCA 캡을 포함할 수 있다 (미국 특허 제 7,074,596호 및 8,153,773호). 추가의 구체예에서, mRNA는 미변형 및 변형된 뉴클레오타이드들의 혼합물을 포함할 수 있다 (미국 특허출원 공개공보 2012/0195936 참조).
또 다른 측면으로, 본원에 기술된 임의의 폴리뉴클레오타이드 (예컨대, 유전자 조절제 (리프레서)를 암호화하는)를 포함하는 유전자 전달 벡터가 제공된다. 특정 구체예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터 (예컨대, Ad5/F35 벡터), 통합 유능한 또는 통합-결핍성 렌티바이러스를 포함한 렌티바이러스 벡터 (LV), 또는 아데노바이러스 관련 바이러스 벡터 (AAV)이다. 특정 구체예에서, AAV 벡터는 AAV2, AAV6 또는 AAV9 벡터이다. 일부 구체예에서, AAV 벡터는 혈액-뇌 장벽을 교차할 수 있는 AAV 변종이다 (예컨대 미국 특허 제 9,585,971호 및 미국 가특허 출원 번호 62/503,121 참조). 또한 본원에는 표적 유전자로의 표적화된 통합을 위해 적어도 하나의 뉴클레아제 (ZFN 또는 TALEN) 및/또는 도너 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 아데노바이러스 (Ad) 벡터, LV 또는 아데노바이러스 관련 바이러스 벡터 (AAV)가 제공된다. 특정 구체예에서, Ad 벡터는 키메릭 Ad 벡터, 예를 들어 Ad5/F35 벡터이다. 특정 구체예에서, 렌티바이러스 벡터는 인티그라아제-결핍 렌티바이러스 벡터 (IDLV) 또는 통합 유능한 렌티바이러스 벡터이다. 특정 구체예에서, 벡터는 VSV-G 엔벨로프를 가진, 또는 다른 엔벨로프를 가진 위형이다.
추가적으로, 핵산 (예컨대, 본원에 기술된 인공 전사 인자 (tau 리프레서)를 암호화하는 서열을 포함하는 전달 (예컨대, AAV) 벡터) 및/또는 단백질 (예컨대, ZFP, Cas 또는 TALE 또는 ZFP, Cas 또는 TALE을 포함하는 융합 단백질)을 포함하는 제약학적 조성물이 또한 제공된다. 예를 들어, 특정 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합된, 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 본원에 기술된 ZFP, Cas 또는 TALE 중 하나를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하며, 여기서 조절 서열은 세포에서 핵산의 발현을 허용한다. 특정 구체예에서, 암호화된 ZFP, CRISPR/Cas 또는 TALE은 돌연변이 tau 대립유전자에 특이적이다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 돌연변이 tau 대립유전자를 조절하는 ZFP, CRISPR/Cas 또는 TALE 및 신경영양 인자를 조절하는 ZFP, CRISPR/Cas 또는 TALE을 포함한다. 단백질 기반 조성물은 본원에 기술된 하나 이상의 ZFP, CRISPR/Cas 또는 TALE 및 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.
또 다른 측면으로 또한 본원에 기술된 단백질, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 조성물 중 임의의 것을 포함하는 분리된 세포가 제공된다.
또 다른 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 알츠하이머병 또는 발작과 같은 타우병증을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 폴리뉴클레오타이드 및/또는 단백질이 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터 (예컨대, 플라스미드) 및/또는 그것들의 조합을 사용하여 전달될 수 있는 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 ZFP 또는 TALE을 포함하는 줄기 세포 집단을 포함하는, 또는 발명의 ZFN, TALEN, Ttago 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템으로 변경된 조성물을 포함한다. 본원에 기술된 조성물 (단백질, 폴리뉴클레오타이드, 세포 및/또는 이들 단백질, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 세포를 포함하는 제약학적 조성물)의 투여는, 한정하는 것은 아니지만, AD, 타우병증 또는 발작과 관련된 임의의 임상적 증상들의 개선 또는 제거, 뿐만 아니라 CNS 세포들 (예컨대, 뉴런, 성상세포, 미엘린, 등)의 기능 및/또는 수의 증가를 포함한, 치료적 (임상적) 효과를 초래한다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 및 방법은 tau 발현을 (본원에 기술된 인공 리프레서를 받지 않은 대조군과 비교하여) 적어도 30%, 또는 50%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 더 바람직하게는 적어도 70%) 감소시킨다. 일부 구체예에서, 적어도 50% 감소가 달성된다.
또 추가의 측면으로, 본원에서는 tau의 리프레서를 대상체 (예컨대 포유류 대상체, 예를 들면 마우스, 인간 또는 비-인간 영장류 (NHP))의 뇌에 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 사용하여 전달하는 방법이 기술된다. 특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터, 예를 들어, AAV9 벡터, 미국 특허 제 9,585,971호 또는 미국 가특허 출원 번호 62/503,121에서 기술된 AAV 벡터 변종이다. 전달은 임의의 뇌 영역, 예를 들어, 해마 또는 내후각 피질에, 캐뉼라 또는 임의의 다른 전달 기술의 사용을 통해 임의의 적합한 수단에 의해 이루어질 수 있다. 뇌 영역으로의 전행성 및 역행성 축삭 수송을 경유하는 것을 포함한, 대상체의 뇌에 리프레서의 광범위한 전달을 제공하는 임의의 AAV 벡터는 벡터를 직접 전달하지는 않았다 (예컨대, 피질, 흑질, 시상, 등과 같은 다른 구조로의 전달을 초래하는 피각(putamen)으로의 전달). 특정 구체예에서, 대상체는 인간이고, 다른 구체예에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 투여는 단일 용량으로 또는 다중 투여로 (투여 사이에 임의의 시간 간격으로) 이루어질 수 있다.
그러므로, 다른 측면으로, 본원에는 대상체에서 타우병증 (예컨대, AD)을 예방 및/또는 치료하는 방법이 기술되며, 방법은 하나 이상의 AAV 벡터를 사용하여 대상체에게 tau 대립유전자의 리프레서를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 리프레서를 암호화하는 AAV는 CNA (뇌 및/또는 CSF)에, 한정하는 것은 아니지만, 뇌실내, 척수강내, 또는 뇌수조내 전달을 포함한 임의의 전달 방법을 통해 투여된다. 다른 구체예에서, 리프레서를 암호화하는 AAV는 대상체의 실질(parenchyma) (예컨대, 해마 및/또는 내후각 피질) 안으로 직접 투여된다. 다른 구체예에서, 리프레서를 암호화하는 AAV는 정맥내로 (IV) 투여된다. 본원에 기술된 임의의 방법에서, 투여하는 것은 한 번 실행되거나 (단일 투여) 여러 번 실행될 수 있다 (투여 사이에 임의의 시간 간격을 두고). 여러 번 투여될 때, 동일한 또는 상이한 투여량 및/또는 전달 비히클의 투여 모드가 사용될 수 있다 (예컨대, 상이한 AAV 벡터가 IV 및/또는 ICV로 투여됨). 방법은, 전반적으로, 방법을 받지 못한 대상체와 비교하거나, 또는 방법을 받기 전 대상체 자체와 비교하여, 대상체에서, 예를 들어 AD를 가진 대상체의 AD 뉴런에서 tau의 응집을 감소시키는 방법 (예컨대, tau 응집에 특징적인 NFT를 감소시킴); 뉴런에서 또는 뉴런 집단에서 (예컨대, AD 뉴런 또는 AD 뉴런의 집단에서) 세포자멸사를 감소시키는 방법; 뉴런의 과다흥분성을 감소시키는 방법; 아밀로이드 베타 유도된 독성 (예컨대, 시냅스 손실 및/또는 을 감소시키는 방법; 신경돌기 위축); 및/또는 AD 대상체에서 하나 이상의 인지 기능에 대한 손실을 감소시키는 방법을 포함한다. 그러므로, 본원에 기술된 방법은 다음 중 하나 이상을 포함한, 타우병증의 생체마커 및/또는 증상들의 감소를 초래한다: 신경독성, 신경교증(gliosis), 위축성 신경돌기, 척추 손실, 흥분성독성, 피질 및 해마의 수축, 수지상 세포의 tau 축적, 인지 (예컨대, 설치류 모델에서 방사형 팔 미로 및 모리스 수중 미로, 공포 조건화, 등), 및/또는 운동 결손.
일부 측면으로, 세포에서 병원체성 tau 종의 양을 감소시키기 위한 발명의 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 과인산화된 tau의 감소를 초래한다. 일부 경우에, 과인산화된 tau의 감소는 가용성 또는 과립형 tau의 감소를 초래한다. 다른 구체예에서, 병원체성 tau 종의 감소는, 발명의 방법에 따라 및/또는 조성물로 치료되지 않은 세포 또는 대상체와 비교하여, tau 응집을 감소시키고 신경섬유 탱글 (NFT)의 감소를 유발한다. 추가의 구체예에서, 세포에서 관찰된 NFT의 양을 반전시키는 방법이 제공된다. 또한 추가의 구체예에서, 발명의 방법 및 조성물은 대상체의 뇌 내에서 병원체성 tau 종 (NFT, 과인산화된 tau)의 증식의 둔화를 유발한다. 일부 구체예에서, 뇌 전체에서 병원체성 tau의 증식은 정지되고, 다른 구체예에서 뇌 전체에서 병원체성 tau의 증식은 반전된다. 추가의 구체예에서, 뇌에서 아밀로이드 β 플라크와 관련된 위축성 신경돌기의 수는 감소된다. 일부 구체예에서, 위축성 신경돌기의 수는 연령-매치된 야생형 뇌에서 발견된 수준으로 감소된다. 추가의 구체예에서, 본원에는 대상체의 뇌에서 아밀로이드 β 플라크와 관련된 과인산화된 tau를 감소시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
본원에 기술된 임의의 방법에서, tau 대립유전자의 리프레서는 ZFP-TF, 예를 들어 tau 대립유전자 및 전사 억압 도메인 (예컨대, KOX, KRAB, 등)에 특이적으로 결합하는 ZFP를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 다른 구체예에서, tau 대립유전자의 리프레서는 TALE-TF, 예를 들어 tau 대립유전자 및 전사 억압 도메인 (예컨대, KOX, KRAB, 등)에 특이적으로 결합하는 TALE 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, tau 대립유전자 리프레서는 Cas 단백질의 뉴클레아제 도메인들이 비활성화되어서 단백질이 더 이상 DNA를 절단하지 않는 CRISPR/Cas-TF이다. 그 결과로 얻어진 Cas RNA-가이드된 DNA 결합 도메인은 tau 대립유전자를 억압하기 위하여 전사 리프레서 (예컨대 KOX, KRAB 등)에 융합된다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 조절제 (유전자 리프레서) (예컨대, ZFP-TF, TALE-TF 또는 CRISPR/Cas-TF)를 암호화하는 서열은 게놈에 삽입 (통합)되는 한편, 다른 구체예에서, 리프레서를 암호화하는 서열은 에피솜에서 유지된다. 일부 경우에, TF 융합을 암호화하는 핵산은 (예컨대, 뉴클레아제-매개 통합을 통해) 프로모터를 포함하는 안전한 은닉 부위에 삽입되어서 내인성 프로모터가 발현을 구동시킨다. 다른 구체예에서, 리프레서 (TF) 도너 서열은 (뉴클레아제-매개 통합을 통해) 안전한 은닉 부위에 삽입되고 도너 서열은 리프레서의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함한다. 일부 구체예에서, 유전자 조절제를 암호화하는 서열은 전달 후에 염색체 외에서 (에피솜에서) 유지되고, 이종성 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 본질적이거나 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 구체예에서, 프로모터 서열은 광범위하게 발현되는 한편, 다른 구체예에서, 프로모터는 조직 또는 세포/유형 특이적이다. 바람직한 구체예에서, 프로모터 서열은 뉴런 세포에 특이적이다. 특히 바람직한 구체예에서, 선택된 프로모터는 그것이 저발현되는 것을 특징으로 한다. 바람직한 프로모터의 비제한적인 실례로는 신경 특이적 프로모터 NSE, 시냅신, CAMKiia 및 MECP를 들 수 있다. 편재성 프로모터의 비제한적인 실례로는 CAS 및 Ubc를 들 수 있다. 추가의 구체예는 미국 특허출원 공개공보 2015/0267205에서 기술된 자가-조절 프로모터의 사용을 포함한다.
또한 추가의 구체예에서, 리프레서는 tau 대립유전자를 절단하고 그로써 비활성화시킴으로써 tau 대립유전자를 억압하는 뉴클레아제 (예컨대, ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템)를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 뉴클레아제는 삽입 및/또는 결실 ("indel")을 뉴클레아제에 의한 절단 후에 비-상동성 단부 연합 (NHEJ)을 통해 도입한다. 다른 구체예에서, 뉴클레아제는 도너 서열을 (상동하는 또는 비상동성 지정 방법에 의해) 도입하며, 이때에 도너 통합은 tau 대립유전자를 비활성화한다.
본원에서 기술된 임의의 방법에서, 리프레서는 대상체 (예컨대, 뇌)에 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질과 폴리뉴클레오타이드의 임의의 조합으로서 전달될 수 있다. 특정 구체예에서, 리프레서(들)은 AAV 벡터를 사용하여 전달된다. 다른 구체예에서, 리프레서의 적어도 하나의 구성요소 (예컨대, CRISPR/Cas 시스템의 sgRNA)는 RNA 형태로서 전달된다. 다른 구체예에서, 리프레서(들)은 본원에 기술된 발현 구성물들 중 임의의 것들의 조합, 예를 들어 한 발현 구성물 (AAV9) 상의 한 리프레서 (또는 그것의 일부분) 또는 별도의 발현 구성물 (AAV 또는 다른 바이러스 또는 비-바이러스 구성물) 상의 한 리프레서 (또는 그것의 일부분)를 사용하여 전달된다.
나아가, 본원에 기술된 임의의 방법에서, 리프레서는 원하는 효과를 제공하는 임의의 농도 (용량)에서 전달될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 리프레서는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 10,000 내지 500,000 벡터 게놈/세포 (또는 그 사이의 임의의 값)로 전달된다. 특정 구체예에서, 리프레서는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 250 내지 1,000 (또는 그 사이의 임의의 값)의 MOI로 전달된다. 다른 구체예에서, 리프레서는 플라스미드 벡터를 사용하여 0.01 내지 1,000 ng/100,000 세포 (또는 그 사이의 임의의 값)로 전달된다. 다른 구체예에서, 리프레서는 mRNA로서 150 내지 1,500 ng/100,000 세포 (또는 그 사이의 임의의 값)로 전달된다.
본원에 기술된 임의의 방법에서, 방법은 대상체의 하나 이상의 AD 뉴런에서 tau 대립유전자의 약 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 또는 약 95% 이상의 억압을 유발할 수 있다.
추가의 측면으로, 본원에 기술된 tau-조절 전사 인자들, 예컨대 아연 핑거 단백질 (ZFP TF), TALE (TALE-TF), 및 CRISPR/Cas-TF 중 하나 이상, 예를 들어 ZFP-TF, TALE-TF 또는 CRISPR/Cas-TF를 포함하는 tau-조절 전사 인자들이 대상체의 뇌 (예컨대, 뉴런)에서 돌연변이 또는 야생형 tau 대립유전자의 발현을 억압하기 위해 사용된다. 억압은 대상체의 미처리 (야생형) 뉴런과 비교하여 대상체의 하나 이상의 뉴런에서 tau 대립유전자의 약 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 약 75% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 또는 약 95% 이상의 억압일 수 있다. 특정 구체예에서, tau-조절 전사 인자는 본원에 기술된 하나 이상의 방법을 달성하기 위하여 사용될 수 있다.
또한 본원에 기술된 하나 이상의 AAV tau-조절제 (예컨대, 리프레서) 및/또는 tau-조절제의 구성요소들을 포함하는 및/또는 tau-조절제 (또는 그것의 구성요소들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 추가로 세포 (예컨대, 뉴런), 시약 (예컨대, 예를 들어 CSF에서의 tau 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한) 및/또는 본원에 기술된 방법을 포함한, 사용 설명서를 포함할 수 있다.
도 1A 내지 1D는 본원에 기술된 조작된 MAPT 유전자 조절제의 도입 후의 MAPT 발현을 도시한다. 도 1A는 유전자 조절제의 DNA-결합 분자에 대한 MAPT 유전자 내에서의 표적 부위들을 개략적으로 도시한다. 이 실험들에 대한 조절제는 리프레서였다. 도 1B는 표시된 양의 MAPT 리프레서 (52322, 52364, 52366, 52389, 57880, 57890 및 52288) 또는 GFP 또는 mRNA 형태의 mock 대조군의 Neuro 2A 세포에의 투여 (각각 좌측에서 우측으로, 1000 ng, 300 ng, 100 ng, 30, ng, 10 ng 또는 3 ng의 표시된 용량으로) 후 24시간 후의 MAPT 발현을 보여주는 그래프들이다. 도 1C는 AAV9 벡터 (CMV 프로모터 포함)를 사용하여 3 x 105 vg/세포, 1 x 105 vg/세포, 3 x 104 vg/세포, 1 x 104 vg/세포의 표시된 용량으로 MAPT 리프레서 (52322, 52364, 52366, 52389, 57880, 57890 및 52288) 또는 GFP 또는 mock 대조군의 일차 마우스 피질 뉴런 (MCN)에의 투여 후 7일 후에 MAPT 발현을 보여주는 그래프들을 도시한다. 도 1D는 57880 및 ZFP 골격의 포스페이트 접촉부에 돌연변이를 포함하고 있는 두 개의 실험 유도체 (65887 및 65888)에 의한 Tau (MAPT) 억압 및 표적 외 억압을 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 2A 내지 2C는 AAV9 벡터에 의해 운반된 표시된 리프레서 (52389)로 처리된 MCN에서의 단백질 수준 (tau, GAPDH 및 ZFP)을 도시한다. 도 2A는 표시된 AAV9 투여량에서 표시된 단백질들의 단백질 수준을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 도 2B 및 2C는 AAV9-52389 또는 mock (M)의 표시된 투여량에서 tau/GAPDH 단백질 (상부 패널) 및 ZFP/GAPDH (하부 패널)의 비율을 보여주는 그래프들이다.
도 3은 MAPT 유전자에 대한 표시된 리프레서들 (52322, 52364, 52366, 52389, 57880, 57890 또는 52288)의 특이성을 보여주는 마이크로어레이 분석 결과들의 결과를 도시한다. 분석은 300 ng에서 mRNA 형태의 리프레서들의 Neuro2A 세포에의 투여 후 24시간 후에 수행되었다. 결과는 실시예 3에서 논의된다. 각 그래프 위의 숫자들은 발현이 증가되었거나 (상향 화살표) 감소된 (억압) (하향 화살표) 유전자의 수를 나타낸다.
도 4는 300 ng에서 mRNA 형태로 리프레서들의 일차 인간 섬유모세포에의 투여 후 24시간 후에 표시된 리프레서들 (52322, 52364, 52366, 52389, 57880, 57890, 52288)의 마이크로어레이 분석 결과들의 결과를 도시한다. 결과는 실시예 3에서 논의된다. 각 그래프 위의 숫자들은 발현이 증가되었거나 (상향 화살표) 감소된 (억압) (하향 화살표) 유전자의 수를 나타낸다.
도 5A 및 5B는 표시된 리프레서들 (52322, 52364, 52366, 52389, 57880, 57890)의 마이크로어레이 분석 결과들의 결과를 도시한다. 도 5A는 AAV 벡터 (AAV)에 의해 1 x 105 vg/세포로 운반된 리프레서들의 마우스 피질 뉴런에의 투여 후 7일 후의 결과를 도시한다. 결과는 실시예 3에서 논의된다. 각 그래프 위의 숫자들은 발현이 증가되었거나 (상향 화살표) 감소된 (억압) (하향 화살표) 유전자의 수를 나타낸다. 도 5B는 동일한 나선을 가진 2개의 리프레서 57880 및 65888을 비교하는 마이크로어레이 분석 결과를 도시한다. 57880 단백질에 대한 데이터는 상부 줄에 나타내는 한편 65888 단백질에 대한 데이터는 하부 줄에 나타낸다. 65888은 아연 핑거 골격으로부터 제거된 일부 잠재적인 포스페이트 구성물을 가지며 (표 2 참조) 데이터는 65888 단백질의 특이성의 실질적인 증가를 증명한 한편 (57880은 이 실험 조건에서 75개의 유전자를 상향조절하였고 110개의 유전자를 억압한 한편 65888은 3개의 유전자를 상향조절하였고 tau를 포함하여 4개를 억압하였음), 마우스 피질 뉴런에서 유사한 tau 억압 활성을 유지하였다.
도 6A 및 6B는 리프레서의 발현이 표시된 프로모터 (CMV, 시냅신 (SYN1), 알파-칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 프로모터 (CamKII), 및 메틸 CpG-결합 단백질 2 프로모터 (MeCP2)의 229 bp 단편)에 의해 구동되는, AAV 벡터 (AAV9)에 의해 운반된 유전자 리프레서를 사용하는 세포에서의 mRNA 발현을 도시하는 그래프들이다. 도 6A는 MCN에서의 발현을 나타낸다. 도 6B는 일차 해마 뉴런에서의 발현을 나타낸다.
도 7A 내지 7D는 인간 iPSC-유도 뉴런에서의 mRNA (인간 tau 및 ZFP) 수준을 도시한다. 도 7A는 인간 및 마우스 MAPT 표적 부위 (SEQ ID NO:31 및 32)의 부분 서열을 개략적으로 도시한다. 도 7B는 표시된 투여량에서 AAV 벡터에 의해 운반된 표시된 리프레서들의 투여 후 18일 후에 iPSC에서의 mRNA 발현을 보여주는 그래프들을 도시한다. 도 7C는 표시된 프로모터를 포함한 AAV 벡터에 의해 운반된 표시된 리프레서 (52366)의 투여 후 18일 후에 iPSC에서의 mRNA 발현을 보여주는 그래프들을 도시한다. 도 7D는 인간 iPSC-derived 뉴런에서 예시적인 ZFP TF를 사용한 일련의 마이크로어레이 도표이며, ZFP TF가 고도로 특이적인 것을 나타낸다. 세포들은 분석 전 19일 동안 ZFP-TF 도너를 포함하는 AAV6의 1E5에 노출되었다.
도 8A 내지 8H는 tau 리프레서들을 전달하기 위한 다양한 AAV 벡터를 사용하여 마우스 대상체에서 ZFP-TF의 효과적인 뉴런 변환 및 mRNA (tau 및 ZFP) 발현에 미치는 생체내 효과를 도시한다. 실시예 6 참조. 도 8A는 IV (우측 패널) 또는 ICV (좌측 패널)의 AAV 투여 후 운동 피질 (상부 패널), 해마 (중간 패널) 및 소뇌 (하부 패널)의 효과적인 변환을 보여준다. 도 8B는 운동 피질 (좌측 패널, 상부 줄), 뇌간 (우측 패널, 상부 줄) 및 해마 (하부 좌측 패널)를 포함한, 핵심적인 타우병증 영역들의 두 ICV 및 IV 투여를 통한 강력한 tau 감소 (약 50 내지 70% 감소)를 보여준다. 도 8C는 AAV-ZFP-TF 벡터의 IV 또는 ICV 투여 후 뇌 및 척수 전체에서의 tau mRNA 감소 (약 40 내지 70% 감소)를 보여준다. 도 8D는 tau (MAPT) mRNA의 수준을 보여주고 도 8E는 각 해마 섹션에 대한 리프레서 (ZFP) mRNA의 수준을 보여준다. 도 8F는 AAV 벡터를 사용하여 본원에 기술된 리프레서들의 투여 후 (좌측 패널을 52389 리프레서를 나타내고 우측 패널은 57890 리프레서를 나타냄) CNS 및 척수 전체에서의 tau의 왕성한 억압을 보여주는 그래프이다. 도 8G는 표시된 조성물이 투여된 동물들의 피질 (좌측 패널) 및 해마 (우측 패널)에서 tau 억압이 신속하고 수개월 동안 지속적인 것을 보여주는 그래프이다 ("GFP"는 GFP 대조군을 나타내고; "172"는 MAPT에 결합하지 않는 무관한 대조군 ZFP-TF를 나타내며; "52389"는 AAV 구성물 상에 운반된 52389 리프레서를 나타내고; "57890"은 AAV 구성물 상에 운반된 본원에 기술된 57890 리프레서를 나타내며; "PBS"는 PBS만을 받은 동물의 대조군을 나타냄). 도 8G의 상부 줄은 Tau mRNA 발현을 나타내고 도 8G의 하부 줄은 표준화된 Tau 단백질 수준을 나타낸다. 도 8H는 표시된 조성물을 받은 동물들의 CSF (상부 줄, 좌측 패널), 피질 (상부 줄, 우측 패널) 및 해마 (상부 줄, 가장 우측 그래프)에서의 총 마우스 tau 단백질 수준을 보여주는 그래프들이다 ("VEH"는 비히클만이 투여된 대조군 동물을 나타내고; "172V"는 AAV 벡터 상에 운반된 MAPT에 결합하지 않는 무관한 대조군 ZFP-TF를 받은 동물을 나타내며; "389V"는 AAV 구성물 상에 운반된 52389 리프레서를 나타내고; "890V"는 AAV 구성물 상에 운반된 본원에 기술된 57890 리프레서를 나타냄). 또한 (하부 줄)에 CSF와 피질 (우측 패널) 및 해마 (좌측 패널)에서의 수준 사이의 상관관계를 보여주는 통계학적 분석이 도시된다.
도 9A 내지 9D는 실시예 6에서 기술된 통계학적 분석을 사용하여 MAPT의 생체내 조절 (억압)의 추가의 분석을 도시한다. 도 9A는 모든 슬라이스에 대해 Sidak 테스트 후 분석이 이어지는 변량 분석을 나타낸다 (상부 패널은 tau를 나타내고, 하부 패널은 ZFP를 나타냄). 도 9B는 평균 최대 tau 감소를 나타낸다 (상부 패널은 tau를 나타내고, 하부 패널은 ZFP를 나타냄). 도 9C는 52322 MAPT 리프레서로 처리된 동물들에서 MAPT와 ZFP-TF 수준 사이의 높은 상관관계를 보여준다. 도 9D는 52389 MAPT 리프레서로 처리된 동물들에서 MAPT와 ZFP-TF 수준 사이의 높은 상관관계를 보여준다.
도 10A 내지 10D는 해마로의 주사 후에 tau-특이적 ZFP-TF로 생체내 치료 후의 MAPT (tau) mRNA 억압을 보여주는 그래프들이다. 이 실험에서, 4개의 상이한 프로모터 (CMV, SNY1, CAMKII 또는 MeCP2)를 사용하여 ZFP-TF-Venus 구성물의 발현을 구동시켰다. 도 10A는 주사 후 6주 후에 tau의 발현을 나타내며, 선택된 프로모터와 무관하게, ZFP-TF를 받은 모든 동물에서 감소를 증명한다. 별표는 PBS 대조군과 비교하여 신호의 유의성을 나타낸다 (모든 프로모터에 대해 p<0.0001). 도 10B는 다양한 프로모터로부터의 ZFP-TF의 발현을 나타내며, 최고의 ZFP-TF 발현이 CAMKII 구동된 벡터로 처리된 동물에서 검출되었다. 활성화된 성상세포의 존재는 GFAP의 검출을 통해 각각의 치료 그룹에 대해 측정되었다 (도 10C). 이 실험에서, MeCP2 프로모터는 PBS-주사된 동물에 비교하여 GFAP 상승을 초래하지 못하였고, SYN1은 4.0배 더 높은 GFAP 수준을 초래하였으며 (P<0.0001), CMV는 3.2배 더 높은 수준을 초래하였고 (P<0.01), CAMKII는 2.4배 더 높은 수준을 초래하였다 (P<0.05). 유사하게, 소교세포(microglia)의 존재가 또한 치료 그룹들에서 측정되었는데 (도 10D), MeCP2 프로모터가 PBS-주사된 동물과 비교하여 IBA1 수준에서 유의할만한 변화를 초래하지 못하였고, SYN1이 4.7배 더 높은 IBA1 수준을 초래하였으며 (P<0.0001), CMV는 3.0배 더 높은 수준을 초래하였고 (P<0.05), CAMKII는 3.2배 더 높은 수준을 초래하였다 (P<0.001).
도 11은 도 10에서 기술된 그룹들에서 tau 단백질 발현의 감소를 나타내는 그래프이다. PBS-주사된 대조군 수준 (269 ng/ml)과 비교하여, rAAV9-SYN1-52389V 구성물은 대조군 수준의 23%를 초래하였고 (61 ng/ml, P<0.0001), rAAV9-CAMKII-52389V 구성물은 대조군 수준의 18%를 생성하였으며 (49 ng/ml, P<0.0001), rAAV9-SYN1-52389V 구성물은 대조군 수준의 12%를 나타냈다 (32 ng/ml, P<0.0001). 그러므로, 뉴런 프로모터는 마우스 해마를 통해 80%를 넘는 tau mRNA 및 단백질 감소를 유도할 수 있다.
도 12A 내지 12F는 해마 및 연결된 뇌 영역에서 tau 감소의 조직학적 증명을 도시한다. CMV 프로모터에 의해 구동된 tau-특이적 ZFP-TF를 포함하는 AAV가 내인성 tau 단백질을 면역형광 염색에 의해 평가하기 위하여 해마로 전달되었다. ZFP-TF는 검출을 위해 형광 단백질 Venus에 결합되었고, 동물들은 주사 후 6주 후에 희생되었다. 도 12A는 해마의 단면이고 더 근접한 연구를 위한 4개의 박스 영역을 나타낸다. 도 12B는 도 12A로부터의 박스 1의 근접 촬영 사진이고 GFP/DAPI 염색 (좌측 패널); GFP/tau/DAPI (중간 패널) 및 tau (우측 패널)를 나타낸다. 도 12C는 박스 1을 가로지르는 형광 세기의 그래프로, 섹션의 동측 쪽에서의 tau의 감소를 나타낸다 (우측 패널). 도 12D는 박스 2의 근접 촬영 사진인 한편, 도 12E는 박스 3의 근접 촬영 사진으로, 동측 쪽에서의 tau 염색의 감소를 나타낸다 (우측 패널). 도 12F는 상부 패널이 주사의 동측 쪽에서 GFP (ZFP-TF의 징후) 신호를, tau 염색의 부수적인 감소 (하부 패널)와 함께 보여주는 박스 4를 나타낸다. 하부 중간 패널은 또한 tau 염색의 감소를 그래프로 보여준다. 하부 좌측 및 우측 패널은 동측 (좌측) 및 반대쪽 (우측) 섹션에서의 염색을 보여준다. 데이터는 실시예들에서 보다 상세하게 논의된다.
도 13A 내지 13J는 생체내에서 6개월 동안 ZFP-TF의 안전성 및 지속된 발현을 도시한다. 도 13A는 6주 시점에서 전체 해마에서 형질도입된 세포들에 대한 신호를 도시하며, ZFP-TF 및 GFP 단독 벡터의 발현이 거의 동일한 것을 나타낸다. 도 13B는 성상세포에 대해 특이적으로 유사한 결과를 보이는 한편, 도 13C는 소교세포에 대한 결과를 보여준다. 도 13D는 6개월 시점인 것을 제외하고 도 13A와 유사한 형질도입 데이터를 나타낸다. 유사하게, 도 13E는 6개월 시점에 대한 성상세포 데이터를 나타내며 도 13F는 6개월 시점에 대한 소교세포 데이터를 나타낸다. 도 13G는 해마의 영역의 평균 두께가 다양한 치료 그룹에서 유지되는 것을 보여주며, ZFP-TF의 장기간 발현으로부터 공공연한 뉴런 독성이 없음을 증명한다. 도 13H는 전방 (좌측 패널) 및 후방 (우측 패널) 해마에서의 주사의 범위를 나타낸다. 데이터는 실시예들에서 보다 상세하게 논의된다. 도 13I는 표시된 ZF들로 처리된 대상체에서의 표준화된 발현 수준을 보여주는 그래프들이다 (tau: 상부 좌측, ZF: 상부 중간, VG/세포: 상부 우측, GFAP (신경교 섬유질 산성 단백질, 성상세포에 대한 마커): 하부 좌측, IBA1 (이온화된 칼슘-결합 어댑터 분자 1, 소교세포의 마커): 하부 중간, 및 NeuN (상이한 종들 중에서 고도로 보존된 유사분열 후 뉴런의 잘 인식된 마커, (Wang et al., (2015) Sci Reports 5:17383, doi 10.1038/spre17383): 하부 우측). 도 13J는 표시된 조성물로 처리된 대상체에서 표시된 단백질의 표준화된 발현 수준을 보여주는 그래프들이다 ("PBS"는 tau 조절제가 없는 것을 나타내고; "89V 6w"는 6주째에 샘플화된 52389 Venus 구성물로 처리된 마우스를 나타내며; "89V 11m"은 11개월째에 샘플화된 52389 Venus 구성물을 나타낸다 (상부 패널에서 좌측으로부터 우측으로 tau, ZFP, GFAP, IBA1; 하부 패널에서 좌측으로부터 우측으로 NeuN, MAP1, MAP1A, MAP2).
도 14A 내지 14F는 ZFP-TF로 처리된 APP/PS1 마우스의 뇌 섹션의 현미경 사진들이다. 이 영상들에서, CFP는 녹색이고, RFP는 적색이며 Aβ에 특이적인 항생물질들은 이차 항체로 표지된다 (청색). 도 14A 및 14C는 야생형 피질 (CTX)의 영상이고, 좌측 CTX는 무관한 ZFP-TF로 처리되었고 (도 14A) 우측 CTX는 형광 단백질 tREP를 암호화하는 AAV로 처리되었다 (도 14C). 도 14B 및 14D는 APP/PS1 마우스로부터의 뇌 피질들의 영상이며, 좌측 CTX는 tau-특이적 ZFP-TF를 암호화하는 AAV ("389dV", 도 14B)로 처리되었거나 tREP를 암호화하는 AAV로 처리되었다 (도 14D). 영상들은 tau-특이적 ZFP-TF로 처리된 CTX에서 위축성 신경돌기의 감소를 예시한다 (Aβ 플라크 주변의 반점 염색으로서 식별 가능하고 화살표로 표시됨). 도 14E 및 14F는 tau-특이적 ZFP-TF (도 14E) 또는 tRFP (도 14F)로 처리된 APP/PS1 CTX 섹션의 두 실례의 고배율의 영상들이며, 389 ZFP-TF 처리된 섹션보다 tRFP 처리된 섹션에서 더 많은 위축성 신경돌기 (화살표로 표시됨)가 있다.
도 15는 APP/PS1 마우스에서 Aβ 플라크 당 위축성 신경돌기의 수의 정량적 표시를 보여주는 그래프를 도시한다. 각각의 점은 하나의 피질 섹션에서 모든 플라크에 대한 플라크 당 위축성 신경돌기의 평균 수를 나타낸다; 마우스 당 반구체 당 3 내지 5개의 섹션이 분석되었다. 도면에서 알 수 있는 것과 같이, tRFP로 처리된 CTX에 비교하여 389dV ZFP-TF로 처리된 CTX에서 위축성 신경돌기의 통계학적으로 유의한 감소가 있었다 (가장 좌측의 (회색) 막대는 389dV 처리이고, 좌측으로부터 두 번째 (흰색) 막대가 tREP 처리된 것임). 또한 도면에는 무관한 ZEP-TF ("172dV", 회색 줄무늬 막대, 우측으로부터 두 번째 막대) 또는 tREP (백색 줄무늬 막대, 가장 우측 막대)로 처리된 마우스에서의 CTX가 비교된다. 도면에서 알 수 있는 것과 같이, 이 샘플들 간에는 위축성 신경돌기/플라크의 수에 차이가 없었다.
도 16은 플라크 당 기준선 위축성 신경돌기에서 동물들 간에 변화를 설명해주는, 도 15에서 나타낸 데이터의 정량적 비교를 그래프로 도시한다. Aβ 플라크 당 위축성의 수를 각각의 ZFP-TF 처리된 반구체 또는 반대쪽 tREP-처리된 반구체에 대해 평균을 구하고 대응 2-꼬리 T-테스트를 사용하여 비교하였다. 각 집단에 대한 값들을 tREP-처리된 쪽의 평균 (100%로 설정됨)에 대해 조정하였다. 이 대응 분석을 사용하여, 위축성 신경돌기는 52389V-처리된 집단에 대해 유의하게 감소된 것으로 (평균 34% 감소) 나타났지만 (가장 좌측 막대 (회색)가 389dV 처리된 것이고, 좌측으로부터 두 번째 (백색) 막대가 tREP 처리된 것임), 무관한 ZFP-TF로 처리된 집단에서는 그렇지 않았다 (172dV, 우측으로부터 두 번째 (회색 줄무늬) 막대; tREP, 가장 우측 (백색 줄무늬) 막대).
도 17은 ZFP-TF로 처리된 마우스로부터 유래된 해마 조직에 대한 마이크로어레이 분석의 예시적인 결과를 도시한다. ZFP-TF는 안와 뒤 전달을 통해 본원에서 기술된 AAV를 사용하여 동물에게 전달되었다 (2.5 e12 vg/동물). 마우스들은 처리되고 10주째에 희생되었고, 도시된 결과는 무관한 ZFP-TF 대조군과 비교한 데이터이다.
본원에는 타우병증의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 특히, 본원에 기술된 조성물 및 방법은 알츠하이머병 (AD), 전주측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 발작 장애 및/또는 피질기저핵 변성과 같은 타우병증을 예방 또는 치료하기 위하여 MAPT (tau) 단백질의 발현을 억제하기 위해 사용된다. MAPT 리프레서들 (예컨대, MAPT-조절 전사 인자, 예컨대 아연 핑거 단백질 (ZFP TF), TALE (TALE-TF), 및/또는 CRISPR/Cas-TF를 포함하는 MAPT-조절 전사 인자)은 CNS를 변형시켜서, 예를 들어 타우병증 (예컨대, AD)을 가진 대상체의 뇌에서 tau의 응집을 감소시키고 뉴런의 탱글의 발생을 감소시킴으로써 타우병증의 영향 및/또는 증상들이 감소되거나 제거된다. 바람직한 구체예에서, MAPT-조절 전사 인자는 AAV와 같은 바이러스 벡터에 의해 뇌에 전달된다. AAV는 뇌 전달에 꽤 잘 맞는 것으로 나타났고, 따라서 MAPT 조절 전사 인자를 전달하기 위한 이 바이러스 벡터들의 사용은 특히 tau 단백질의 부적절한 발현 및 그로써 응집과 관련된 알츠하이머병과 같은 질환의 치료에 유용하다.
일반적 사항
본원에 개시된 방법의 실시, 뿐만 아니라 조성물의 제조 및 사용은, 다르게 표시되지 않는 한, 분자 생물학, 생화학, 크로마틴 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야의 종래 기법들을, 당업계의 숙련도 내에 있는 것과 같이 사용한다. 이 기법들은 문헌에서 자세하게 설명된다. 예를 들어, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 참조.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드", 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호 교환적으로 사용되며 선형 또는 원형 형태, 및 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 나타낸다. 본 개시의 목적에 대해, 이 용어들은 중합체의 길이와 관련하여 그것을 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 용어는 천연 뉴클레오타이드의 유사체, 뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티 (예컨대 포스포로티오에이트 골격)에서 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기쌍 형성 특이성을 가진다; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 이룰 것이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기들의 중합체를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생적인 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.
"결합"은 거대분자들 사이의 (예컨대, 단백질과 핵산 사이의) 서열-특이적, 비-공유 상호작용을 나타낸다. 상호작용이 전체로서 서열-특이적인 한, 결합 상호작용 (예컨대 DNA 골격에서 포스페이트 잔기와의 접촉)의 모든 구성요소들이 서열-특이적일 필요는 없다. 그러한 상호작용은 일반적으로 10-6　M-1 이하의 해리 상수 (Kd)를 특징으로 한다. "친화도"는 결합의 강도를 나타내며: 증가된 결합 친화도는 더 낮은 Kd와 상관이 있다.
"결합 단백질"은 또 다른 분자에 비-공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어, DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질이 경우에, 그것은 자체에 (단일다이머, 단일트라이머, 등을 형성하기 위해) 결합할 수 있거나 및/또는 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 하나 이상의 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 가진다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 그것의 구조가 아연 이온의 배위를 통해 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인, 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 단백질, 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"은 하나 이상의 TALE 반복부 도메인/단위를 포함하는 폴리펩타이드이다. 반복 도메인은 TALE의 그것의 동족 표적 DNA 서열에의 결합에 포함된다. 단일 "반복 단위" (또한 "반복부"로도 언급됨)는 전형적으로 33 내지 35개 아미노산 길이이며 자연 발생적인 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복부 서열과 적어도 일부의 서열 상동성을 나타낸다. 예컨대, 미국 특허 제 8,586,526호 참조.
"TtAgo"는 유전자 침묵에 포함되는 것으로 여겨지는 원핵 아르고노트 단백질이다. TtAgo는 박테리아 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus)로부터 유래된다. 예컨대, Swarts et al., (2014) Nature 507(7491):258-261, G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652) 참조. "TtAgo 시스템"은, 예를 들어, TtAgo 효소에 의한 절단을 위해 가이드 DNA를 포함하는 것을 필요로 하는 모든 구성요소이다. "재조합"은, 한정하는 것은 아니지만, 비-상동성 단부 연합 (NHEJ) 및 상동성 재조합에 의한 도너 포획을 포함한, 두 폴리뉴클레오타이드 간의 유전자 정보의 교환 과정을 나타낸다. 본 개시의 목적에 대해, "상동성 재조합 (HR)"은, 예를 들어, 상동성-지정 수복 메커니즘을 통해 세포에서 이중-가닥 파괴의 수복 중에 일어나는 그러한 교환의 수한 형태를 나타낸다. 이 과정은 뉴클레오타이드 서열을 필요로 하고, "표적" 분자 (즉, 이중-가닥 파괴의 경험이 있는 분자)의 주형 수복을 위해 "도너" 분자를 사용하며, "비-크로스오버 유전자 전환" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환"으로서 다양하게 알려져 있는데, 그것이 도너로부터 표적으로 유전자 정보의 전달을 이끌어내기 때문이다. 임의의 특정 이론에 의해 결합되기를 바라지 않으면서, 그러한 전달은 파괴된 표적과 도너 사이에서 형성되는 이종듀클렉스 DNA의 미스매치 교정, 및/또는 "합성-의존성 가닥 어닐링"을 포함할 수 있고, 이때에 도너는 표적, 및/또는 관련된 과정들의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하기 위해 사용된다. 그러한 특수한 HR은 종종 표적 분자의 서열의 변경을 초래하여서 도너 폴리뉴클레오타이드의 서열의 일부분 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오타이드로 통합된다.
sgRNA, 아연 핑거 결합 도메인 또는 TALE DNA 결합 도메인과 같은 DNA-결합 도메인은, 예를 들어 선택된 표적 부위에 결합하는 sgRNA의 설계를 통해 또는 자연적으로 발생하는 아연 핑거 단백질의 인식 나선 영역의 조작 (하나 이상의 아미노산의 변경)에 의해 또는 TALE 단백질의 RVD를 조작함으로써 예정된 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 "조작될" 수 있다. 그러므로, 조작된 아연 핑거 단백질 또는 TALE은 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. DNA-결합 도메인을 조작하기 위한 방법의 비제한적인 실례는 설계 및 선택이다. "설계된" 아연 핑거 단백질 또는 TALE은 그것의 설계/조성이 원칙적으로 합리적인 기준으로부터 유발되는 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적 기준은 기존의 ZFP 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이에 프로세싱을 위한 치환 규칙 및 컴퓨터화된 알고리즘을 적용하는 것을 포함한다. "선택된" 아연 핑거 단백질 또는 TALE은 생성이 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택과 같은 실험적 과정으로부터 주로 유발되는, 자연적으로 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, 미국 특허 제 8,586,526호; 6,140,081호; 6,453,242호; 6,746,838호; 7,241,573호; 6,866,997호; 7,241,574호; 및 6,534,261호 참조; 및 또한 국제 특허 공보 번호 WO　03/016496 참조.
용어 "서열"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 나타내며, DNA 또는 RNA일 수 있고; 선형, 원형 또는 분지형일 수 있고 단일-가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 용어 "도너 서열"은 게놈으로 삽입되는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 도너 서열은 임의의 길이, 예를 들어 2 내지 10,000개 뉴클레오타이드 길이 (또는 그 사이의 또는 그 이상의 임의의 정수의 값), 바람직하게는 약 100 내지 1,000개 뉴클레오타이드 길이 (또는 그 사이의 임의의 정수), 보다 바람직하게는 약 200 내지 500개 뉴클레오타이드 길이의 것일 수 있다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합에 대한 충분한 조건이 존재한다면, 결합 분자가 결합할 핵산의 부분을 규정하는 핵산 서열이다.
"외인성" 분자는 세포에 정상적으로 존재하지는 않지만, 하나 이상의 유전자, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포로 도입될 수 있는 분자이다. "세포에 정상적인 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 그러므로, 예를 들어, 근육의 배아 발생 중에만 존재하는 분자는 성인 근육 세포와 관련해서는 외인성 분자이다. 유사하게, 열 충격에 의해 유도된 분자는 비-열 충격 세포에 관련해서는 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예를 들어, 오작동하는 내인성 분자의 기능성 버전 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 오작동성 버전을 포함할 수 있다.
외인성 분자는, 다른 것들 중에서도, 작은 분자, 예컨대 조합 화학 과정에 의해 생성된 작은 분자, 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 리포단백질, 다당, 상기 분자들의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자들의 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체와 같은 거대분자일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 단일- 또는 이중-가닥일 수 있고; 선형, 분지형 또는 원형일 수 있으며; 임의의 길이의 것일 수 있다. 핵산은 듀플렉스를 형성할 수 있는 것들뿐만 아니라 트리플렉스를 형성하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,176,996호 및 5,422,251호 참조. 단백질로는, 한정하는 것은 아니지만, DNA-결합 단백질, 전사 인자, 크로마틴 리모델링 인자, 메틸화된 DNA 결합 단백질, 중합효소, 메틸라아제, 탈메틸화효소, 아세틸라아제, 탈아세틸화효소, 키나아제, 포스파타아제, 인티그라아제, 재조합효소, 결찰효소, DNA 회전효소, 기라아제 및 헬리카아제를 들 수 있다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예컨대 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염시키는 바이러스 게놈, 세포에 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 세포에 정상적으로 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자의 세포로의 도입 방법은 당업자들에게 알려져 있고, 한정하는 것은 아니지만, 지질-매개 전달 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함한 리포좀), 전기천공법, 직접 주사, 세포 융합, 입자 폭발, 칼슘 포스페이트 동시 침전, DEAE-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 들 수 있다. 외인성 분자는 또한 내인성 분자와 동일한 유형의 분자이지만 그것이 유래되는 세포와 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간 핵산 서열은 원래 마우스 또는 햄스터로부터 유래된 세포주에 도입될 수 있다.
그와 대조적으로, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하에서 특정 발달 단계에 특정 세포에 정상적으로 존재하는 것이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아의 게놈, 엽록테 또는 기타 소기관, 또는 자연적으로 발생하는 에피솜성 핵산을 포함할 수 있다. 추가적인 내인성 분자로는 단백질, 예를 들어, 전사 인자 및 효소를 들 수 있다.
"융합" 분자는 둘 이상의 하위단위 분자가, 바람직하게는 공유적으로 연결되어 있는 분자이다. 하위단위 분자는 분자의 동일한 화학적 유형이거나, 또는 분자의 상이한 화학적 유형일 수 있다. 융합 분자의 첫 번째 유형의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 융합 단백질 (예를 들어, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인과 하나 이상의 활성화 도메인 사이의 융합) 및 융합 핵산 (예를 들어, 상기에 기술된 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 들 수 있다. 융합 분자의 두 번째 유형의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 트리플렉스-형성 핵산과 폴리펩타이드 사이의 융합, 및 마이너 그루브 결합제와 핵산 사이의 융합을 들 수 있다. 용어는 또한 폴리뉴클레오타이드 구성요소가 기능성 분자를 형성하기 위하여 폴리펩타이드 구성요소와 회합하는 시스템 (예컨대, 단일 가이드 RNA가 유전자 발현을 조절하기 위하여 기능성 도메인과 회합하는 CRISPR/Cas 시스템)을 포함한다.
세포에서 융합 단백질의 발현은 융합 단백질의 세포로의 전달로부터 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 세포로의 전달에 의해 유발될 수 있고, 이때 폴리뉴클레오타이드는 전사되고, 전사물은 번역되어 융합 단백질을 생성한다. 트랜스-스플라이싱(trans-splicing), 폴리펩타이드 절단 및 폴리펩타이드 결찰이 또한 세포에서 단백질의 발현에 포함될 수 있다. 세포로의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 전달 방법은 본 개시의 다른 곳에서 제공된다.
"멀티머화 도메인" (또한 "다이머화 도메인" 또는 "단백질 상호작용 도메인"으로도 언급됨)은 ZFP TF 또는 TALE TF의 아미노, 카르복시 또는 아미노 및 카르복시 말단 영역에 통합되는 도메인이다. 이 도메인들은 다수의 ZFP TF 또는 TALE TF 단위의 멀티머화를 허용하여서 야생형 수의 길이를 가진 더 짧은 트랙에 비해 트라이뉴클레오타이드 반복부 도메인의 더 큰 트랙이 우선적으로 멀티머화된 ZFP TF 또는 TALE TF에 의해 결합된다. 멀티머화 도메인의 실례는 류신 지퍼(leucine zipper)를 들 수 있다. 멀티머화 도메인은 또한 작은 분자들에 의해 조절될 수 있는데, 멀티머화 도메인은 작은 분자 또는 외부 리단드의 존재시에만 또 다른 멀티머화 도메인과의 상호작용을 허용하기 위하여 적절한 형태를 상정한다. 이런 방법으로, 외인성 리간드는 이 도메인들의 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다.
"유전자"는, 본 개시의 목적에 대해, 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 영역 (하기 참조), 뿐만 아니라 유전자 생성물의 생성을 조절하는 모든 DNA 영역을, 그러한 조절 서열이 코딩 및/또는 전사된 서열에 인접하거나 인접하지 않거나, 포함한다. 따라서, 유전자는, 반드시 한정하는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 터미네이터, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 유입 부위와 같은 전사 조절 서열, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계선 요소, 복제 기원, 기질 부착 부위 및 유전자좌 제어 여역을 포함한다.
"유전자 발현"은 유전자에 함유된 정보의 유전자 생성물로의 전환을 나타낸다. 유전자 생성물은 유전자의 직접적인 전사 생성물 (예컨대, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화, 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 및, 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴 첨가, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조절"은 유전자의 활성의 변화를 나타낸다. 발현의 조절은, 한정하는 것은 아니지만, 유전자 활성화 및 유전자 억압을 포함할 수 있다. 게놈 편집 (예컨대, 절단, 변경, 비활성화, 무작위 돌연변이)은 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 비활성화는 본원에 기술된 ZFP 또는 TALE 단백질을 포함하지 않는 세포와 비교하여 유전자 발현의 임의의 감소를 나타낸다.
"유전자 조절제"는 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 서열을 변경시키는 임의의 분자를 나타낸다. 유전자 조절제의 비제한적 실례로는 표적 유전자에 결합하여 그것의 발현을 변경시키는 전사 인자 (예컨대 본원에 기술된 인공 전사 인자) 및 표적 유전자의 서열을 변형시키고, 계속해서 그것의 발현을 변경시키는 (예컨대, 삽입 및/또는 결실을 통한 표적의 비활성화) 뉴클레아제를 들 수 있다. 그러므로, 유전자 조절제는 유전자 리프레서 (유전자 발현을 억압 및/또는 비활성화함) 또는 유전자 활성화제일 수 있다.
"관심의 영역"은 세포의 크로마틴의 임의의 영역, 예컨대, 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직한, 예를 들면, 유전자 또는 유전자 내의 또는 유전자에 인접한 비코딩 서열이다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합의 목적을 위한 것일 수 있다. 관심의 영역은 염색체, 에피솜, 소시관의 게놈 (예컨대 미토콘드리아, 엽록체의), 또는, 예를 들면, 감염시키는 바이러스 게놈에 존재할 수 있다. 관심의 영역은 유전자의 코딩 영역 내에, 전사된 비코딩 영역, 예컨대, 예를 들어, 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내에, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류에 있는, 비-전사 영역 내에 있을 수 있다. 관심의 영역은 단일 뉴클레오타이드 쌍처럼 작거나 또는 최대 2,000개 뉴클레오티드 쌍의 길이일 수 있거나, 또는 뉴클레오티드 쌍의 임의의 적분값일 수 있다.
"진핵" 세포로는, 한정하는 것은 아니지만, 진균 세포 (예컨대 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포 및 인간 세포 (예컨대, T-세포)를 들 수 있다.
용어 "작동성 결합" 및 "작동가능하게 연결된" (또는 "작동성으로 연결된")은 둘 이상의 구성요소 (예컨대 서열 요소)의 병렬위치와 관련하여 상호교환적으로 사용되며, 이때 구성요소들은 두 구성요소가 정상적으로 기능하여 구성요소들의 적어도 하나가 다른 구성요소들 중 적어도 하나에 대해 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 배열된다. 예를 들자면, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은, 만약 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 대한 반응으로 코딩 서열의 전사 수준을 제어한다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 전사 조절 서열은 코딩 서열과 일반적으로 시스로(in cis) 작동가능하게 연결되지만, 직접적으로 그것에 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 그것들이 연속적이지는 않지만, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩타이드와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 각각의 구성요소가 다른 구성요소에 대한 결합에서 그것이 마치 연결되지 않았던 것처럼 동일한 기능을 수행한다는 사실을 나타낼 수 있다. 예를 들어, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인이 활성화 도메인에 융합되어 있는 융합 분자와 관련하여, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인은, 만약 융합 폴리펩타이드에서, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 부분이 그것의 표적 부위 및/또는 그것의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편, 활성화 도메인이 유전자 발현을 상향조절할 수 있다면 작동가능한 결합 상태에 있다. 유전자 발현을 조절할 수 있는 도메인들에 융합된 ZFP는 포괄적으로 "ZFP-TF" 또는 "아연 핑거 전사 인자"로서 언급되는 한편, 유전자 발현을 조절할 수 있는 도메인들에 융합된 TALE은 포괄적으로 "TALE-TF" 또는 "TALE 전사 인자"로서 언급된다. ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인 ("ZFN" 또는 "아연 핑거 뉴클레아제")에 융합되어 있는 융합 폴리펩타이드에서, ZFP DNA-결합 도메인 및 절단 도메인은, 만약, 융합 폴리펩타이드에서, ZFP DNA-결합 도메인 부분이 그것의 표적 부위 및/또는 그것의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편, 절단 도메인이 표적 부위와 가까운 곳에서 DNA를 절단할 수 있다면, 작동가능한 결합 상태에 있다. TALE DNA-결합 도메인이 절단 도메인 ("TALEN" 또는 "TALE 뉴클레아제")에 융합되어 있는 융합 폴리펩타이드에서, TALE DNA-결합 도메인 및 절단 도메인은, 만약 융합 폴리펩타이드에서, TALE DNA-결합 도메인 부분이 그것의 표적 부위 및/또는 그것의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편, 절단 도메인이 표적 부위와 가까운 곳에서 DNA를 절단할 수 있다면, 작동가능한 결합 상태에 있다. Cas DNA-결합 도메인 (예컨대, 단일 가이드 RNA)이 활성화 도메인에 융합되어 있는 융합 분자와 관련하여, Cas DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인은, 만약 융합 폴리펩타이드에서, Cas DNA-결합 도메인 부분이 그것의 표적 부위 및/또는 그것의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편, 활성화 도메인이 유전자 발현을 상향 조절할 수 있다면, 작동가능한 결합 상태에 있다. Cas DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합되어 있는 융합 폴리펩타이드에서, Cas DNA-결합 도메인 및 절단 도메인은, 만약 융합 폴리펩타이드에서, Cas DNA-결합 도메인 부분이 그것의 표적 부위 및/또는 그것의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편, 절단 도메인이 표적 부위 가까운 곳에서 DNA를 절단할 수 있다면, 작동가능한 결합 상태에 있다.
단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "기능성 단편"은 그것의 서열이 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지는 않지만, 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하고 있는 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 기능성 단편은 상응하는 천연 분자보다 많거나, 적거나, 또는 동일한 수의 잔기를 가질 수 있고, 및/또는 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환을 가질 수 있다. 핵산의 기능을 측정하기 위한 방법 (예컨대, 코딩 기능, 다른 핵산을 혼성화하는 능력)은 기술분야에 잘 알려져 있다. 유사하게, 단백질 기능을 측정하기 위한 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 DNA-결합 기능은, 예를 들어, 필터-결합, 전기영동적 이동성-이동, 또는 면역침전 검정에 의해 측정될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동에 의해 검정될 수 있다. Ausubel et al., 상기 동일 참조. 단백질이 또 다른 단백질과 상호작용하는 능력은, 예를 들어, 동시 면역침전, 유전학적 및 생화학적 2-하이브리드 검정 또는 보완에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, Fields et al., (1989) Nature 340:245-246; 미국 특허 제 5,585,245호 및 국제 특허 공개 번호 WO 98/44350 참조.
"벡터"는 세포를 표적화하기 위한 유전자 서열을 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 구성물", "발현 벡터", 및 "유전자 전달 벡터"는 관심의 유전자의 발현을 지시할 수 있고 유전자 서열을 세포를 표적화하기 위해 전달할 수 있는 임의의 핵산 구성물을 의미한다. 그러므로, 용어는 클로닝, 및 발현 비히클, 뿐만 아니라 통합 벡터를 포함한다.
"리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"은 바람직하게는 반드시 기본적인 검정으로는 아닐지라도, 쉽게 측정되는 단백질 생성물을 생성하는 임의의 서열을 나타낸다. 적합한 리포터 유전자로는, 한정하는 것은 아니지만, 항생물질 내성 (예컨대 암피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 푸로마이신 내성)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열, 착색된 또는 형광 또는 발광 단백질 (예컨대, 녹색 형광 단백질, 향상된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시페라제)을 암노화하는 서열, 및 향상된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 중재하는 단백질 (예컨대, 다이하이드로폴레이트 환원효소)을 들 수 있다. 에피토프 태그로는, 예를 들어, FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 임의의 검출 가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 복사물을 들 수 잇다. "발현 태그"로는 관심의 유전자의 발현을 모니터링하기 위하여 바람직한 유전자 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 리포터를 암호화하는 서열들을 포함한다.
Tau 및 알츠하이머병
tau 단백질은 16개의 엑손을 포함하는 MAPT 유전자에 의해 암호화된다. 흥미롭게도, 엑손 1, 4, 5, 7, 9, 11 및 12는 본질적으로 발현되는 반면 엑손 2, 3 및 10은 대안적으로 스플라이스된 변종으로부터 유래된 tau 단백질에 존재할 수 있고, 성인 뇌에서 6개의 상이한 tau 단백질 이소형태의 존재로 이어진다. Tau는 단백질의 C-말단 절반에서 3 또는 4개의 반복된 튜불린-결합 모티프를 통해 미세소관에 결합하며, tau4R (4 튜불린 결합 모티프)이 tau3R보다 더 강력하게 미세소관과 상호작용하는 것으로 여겨지는 소관들을 안정화시키는 것으로 여겨진다. 4R에 대한 3R의 비율은 일반적으로 안정적이지만 병리적 상태에서는 영향을 받을 수 있다. 미세소관과 상호작용하는 tau 형태는 인산화되고 과인산화는 tau가 미세소관으로부터 탈착되는 것을 유발하는 것으로 나타난다. 과인산화된 tau는 세포에서 격리될 수 있고, 그런 다음 단백질의 형태적 변화 및 응집으로 이어질 수 있다. 이런 응집체들은 병원성 신경섬유 탱글 (NFT)의 형성의 초기 단계일 수 있지만, 과인산화된 tau는 탱글에 존재할 때뿐만 아니라 가용성 형태로 병원성일 수 있다 (Bodea et al., (2016) J of Neurochem 138 (Suppl 1): 71-94). NFT는 AD의 초기 단계에서 내후각 피질과 중앙 측두엽에 한정되며, 질환의 중증 임상 증상들이 존재할 때쯤에는, NFT는 뇌 전체에 퍼져 있다. 풍부한 NFT의 존재와 일치하여, 아밀로이드 플라크의 광범위한 분포가 또한 발생한다. 실제로, 피질에서 아밀로이드 침착은 tau 증식의 속도 및 뇌의 먼 영역으로의 NFT의 확산의 증가로 이어진다. tau 탱글이 확산됨에 따라, 뉴런의 손실의 부수적인 증가가 일어난다 (Pooler et al., (2015) Acta Neuropathol Commun 3:14, doi:10.1186/s40478-015-0199-x).
Tau는 인산화될 수 있는 95개의 아미노산 잔기를 가지며, 글리코겐 합성효소-3, 사이클린-의존성 키나아제 5, MAPK 패밀리의 구성원들, 세포외-조절된 키나아제, c-Jun N-AKFEKS 키나아제 및 미세소관-친화도 조절 키나아제를 포함한, tau 인산화에 기여할 수 있는 여러 키나아제가 확인되었는데, 그것은 새로운 치료제에 대한 가능한 표적 후보일 수 있다 (Bodea (2016) 상기 동일).
아밀로이드 β 단백질 (Aβ)은 노인성 플라크의 주요 구성성분으로, NFT와 함께, 알츠하이머병의 신경병리학적 확인의 특징이다. Aβ는 39 내지 42개 아미노산 사슬을 가지는 펩타이드이고; 42개 아미노산은 보다 탐욕스럽게(avidly) 응집체를 형성하며 질환의 발병에 연루되는 것으로 여겨지고 아밀로이드 가설의 기반이 된다 (뇌에서 Aβ의 축적이 AD의 주요 원인이라는 제의, Hardy and Selkoe (2002) Science 297:353 리뷰 참조). Aβ는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 단백질 가수분해성 절단의 생성물이고, 편재하는, 글리코실화된, 황산화된, 및 인산화된 통합 막 단백질이다 (Sorrentino et al., (2014) FEBS Lett 588:641-652). 그러나, AD로 이어지는 발병기전은 매우 복잡하고 Aβ 축적의 발병기전이 비정상적인 tau 거동에 역할을 할 수 있는 것이 점점 분명해지고 있다 (Ando et al., (2016) PLoS Genet 12(3):e1005917).
뇌에서 tau의 감소는 AD의 병리학을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 쥐과 AD 모델에서 tau 형질전환 유전자 발현의 조절된 억제는 형질전환 유전자 관련 tau 응집체의 축소 및 과인산화된 tau 및 NFT의 농도의 감소를 증명하였다. 실제로, 이 작업은 또한 전체 NFT의 손실을 나타냈고, NFT의 축적이 가역적일 수 있음을 나타냈다 (Polydoro et al., (2013) J of Neurosci 33(33):13300-13311). 추가적으로, 해마내 투여를 통해 직접적으로 AAV를 통해 전달된 세포내 항-tau 항체로 수행된 연구는 불용성 tau 종의 감소, NFT 및 미처리 마우스 모델에서 관찰된 해마 위축의 구제를 증명하였다 (Liu et al., (2016) J Neurosci 36(49):12425-12435).
DNA-결합 도메인
본원에 기술된 방법들은 tau (MATP) 유전자에서 표적 서열에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함하는 조성물, 예를 들어 tau-조절 전사 인자를 사용한다. 임의의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 DNA-결합 도메인, 예를 들어 DNA-결합 단백질 (예컨대, ZFP 또는 TALE) 또는 DNA-결합 폴리뉴클레오타이드 (예컨대, 단일 가이드 RNA)가 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 그러므로, tau 유전자의 유전자 조절제 (리프레서)가 기술된다.
특정 구체예에서, tau-리프레서, 또는 그 안의 DNA 결합 도메인은 아연 핑거 단백질을 포함한다. 표적 부위의 선택; 융합 단백질 (및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 제조를 위한 ZFP 및 방법들은 당업자들에게 알려져 있고 미국 특허 제　6,140,081호; 5,789,538호; 6,453,242호; 6,534,261호; 5,925,523호; 6,007,988호; 6,013,453호; 6,200,759호; 및 국제 특허출원 공보 번호 WO　95/19431; WO　96/06166; WO　98/53057; WO　98/54311; WO　00/27878; WO　01/60970; WO　01/88197; WO　02/099084; WO　98/53058; WO　98/53059; WO　98/53060; WO　02/016536; 및 WO　03/016496에 상세하게 기술되어 있다.
Tau 표적 부위는 전형적으로 를 포함하지만 다수의 아연 핑거 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 핑거)를 포함할 수 있다. 보통, ZFP는 적어도 3개의 핑거를 포함한다. 특정 ZFP는 4, 5, 또는 6개의 핑거를 포함하는 한편, 일부 ZFP는 8, 9, 10, 11 또는 12개의 핑거를 포함한다. 3개의 핑거를 포함하는 ZFP가 전형적으로 9 내지 10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적 부위를 인식하며; 4개의 핑거를 포함하는 ZFP가 전형적으로 12 내지 14개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적 부위를 인식하는 한편; 6개의 핑거를 가진 ZFP가 18 내지 21개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적 부위를 인식할 수 있다. ZFP는 또한 전사 활성화 또는 억압 도메인일 수 있는, 하나 이상의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 함께 연결된 두 개의 ZFP DNA 결합 도메인을 포함한다. 이 아연 핑거 단백질들은 그러므로 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 이상의 핑거를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 2개의 DNA 결합 도메인은 연장 가능한 가요성 링커를 통해 연결되어서 하나의 DNA 결합 도메인이 4, 5, 또는 6개의 아연 핑거를 포함하고 두 번째 DNA 결합 도메인이 추가적인 4, 5, 또는 6개의 아연 핑거를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 표준 핑거-간 링커여서 핑거 어레이는 8, 9, 10, 11 또는 12개 또는 그 이상의 핑거를 포함하는 하나의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 링커는 가요성 링커와 같은 비전형 링커이다. DNA 결합 도메인은 적어도 하나의 조절 도메인에 융합되고 'ZFP-ZFP-TF' 구조로서 여겨질 수 있다. 이런 구체예들의 특정 실례는 가요성 링커와 연결되고 KOX 리프레서에 융합된 2개의 DNA 결합 도메인을 포함하는 "ZFP-ZFP-KOX" 및 2개의 ZFP-KOX 융합 단백질이 링커를 통해 함께 융합되어 있는 "ZFP-KOX-ZFP-KOX"로서 언급될 수 있다.
조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연적으로 발생하는 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법으로는, 한정하는 것은 아니지만, 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택을 들 수 있다. 합리적 설계는, 예를 들어, 트리플렛 (또는 콰드라플렛) 뉴클레오타이드 서열 및 개별적인 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하는데, 이때 각각의 트리플렛 또는 콰드라플렛 뉴클레오타이드 서열은 특정 트리플렛 또는 콰드라플렛 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 회합된다. 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 제 6,453,242호 및 6,534,261호 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.
게다가, 상기 및 다른 참고문헌에서 개시된 것과 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 아연 핑거 단백질은 예를 들어, 5개 또는 그 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함한, 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 제 6,479,626호; 6,903,185호; 및 7,153,949호 참조. 본원에 기술된 단백질들은 단백질의 각각의 아연 핑거 사이의 적합한 링커들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
ZFP는 ZF-TF (예컨대, 리프레서)를 형성하기 위하여 하나 이상의 전사 조절 도메인 (예컨대, 억압 도메인)에 작동가능하게 회합될(연결될) 수 있다. 예를 들어 미국 특허 출원 번호 15/685,580에서 기술된 것과 같은 ZFP 골격에 대한 돌연변이에 의해 표적-외 부위로서 알려져 있는 다른 의도하지 않은 절단 부위와 비교하여 의도된 표적에 대한 ZFP의 특이성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물들이 또한 사용될 수 있다. 그러므로, 본원에 기술된 tau 리프레서는 그것들의 DNA 결합 도메인 골격 영역들 중 하나 이상에서 돌연변이들 및/또는 그것들의 전사 조절 도메인에서 하나 이사의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 ZFP들은 DNA 골격 상에서 포스페이트와 비특이적으로 상호작용할 수 있는 ZFP DNA 결합 도메인 ('ZFP 골격') 내에 아미노산에 대한 돌연변이들을 포함할 수 있지만, DNA 인식 나선들에 변화를 포함하지는 않는다. 그러므로, 발명은 뉴클레오타이드 표적 특이성에는 필요하지 않은 ZFP 골격에서의 양이온성 아미노산 잔기들의 돌연변이들을 포함한다. 일부 구체예에서, ZFP 골격의 이러한 돌연변이들은 중성 또는 음이온성 아미노산 잔기로 양이온성 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, ZFP 골격의 이러한 돌연변이들은 중성 또는 비극성 아미노산 잔기로 극성 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, DNA 결합 나선에 비해 위치 (-5), (-9) 및/또는 위치 (-14)에서 돌연변이가 만들어졌다. 일부 구체예에서, 아연 핑거는 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 다중-핑거 아연 핑거 단백질에서 하나 이상의 아연 핑거는 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, (-5), (-9) 및/또는 (-14)의 아미노산 (예컨대, 아르기닌 (R) 또는 리신 (K))은 알라닌 (A), 류신 (L), 세린 (S), 아스파르트산 (N), 글루탐산 (E), 티로신 (Y) 및/또는 글루타민 (Q)으로 돌연변이된다.
대안적으로, DNA-결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 호우밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열이 알려져 있다. 또한 미국 특허 제 5,420,032호; 미국 특허 제 6,833,252호; Belfort et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al., (1989) Gene 82:115-118; Perler et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al., (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al., (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs catalogue 참조. 게다가, 호우밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-천연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Chevalier et al., (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al., (2006) Nature 441:656-659; Paques et al., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 미국 특허출원 공개공보 2007/0117128 참조.
"양손" 아연 핑거 단백질은 아연 핑거 DNA 결합 도메인의 2개의 클러스터가 개재 아미노산에 의해 분리되어서 2개의 아연 핑거 도메인이 2개의 불연속적인 표적 부위에 결합되는 단백질들이다. 아연 핑거 결합 단백질의 양손 유형의 실례는 SIPI로, 4개의 아연 핑거의 클러스터가 단백질의 아미노 말단에 위치하며 3개의 핑거의 클러스터가 카르복실 말단에 위치하고 있다 (Remacle et al., (1999) EMBO Journal 18 (18): 5073-5084 참조). 이런 단백질들에서 아연 핑거들의 각각의 클러스터는 특유한 표적 서열에 결합할 수 있고 두 표적 서열 사이의 공간은 많은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 양손 ZFP는 예를 들어, 하나 또는 둘 다의 ZFP에 융합된 기능성 도메인을 포함할 수 있다. 그러므로, 기능성 도메인은 하나 또는 둘 다의 ZFP의 외부에 부착되거나 ZFP 사이에 위치할 수 있는 것 (두 ZFP에 모두 부착)이 명백할 것이다.
특정 구체예에서, DNA-결합 도메인은 자연적으로 발생하는 또는 조작된 (자연적으로 발생하지 않는) TAL 이펙터 (TALE) DNA 결합 도메인을 포함한다. 예컨대, 미국 특허 제 8,586,526로 참조 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 특정 구체예에서, TALE DNA-결합 단백질은 표 1 또는 2 (SEQ ID NO:1 내지 6 또는 33)에 나타낸 것과 같이 tau 표적 부위의 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오타이드에 대한 결합을 포함한다. tau 표적 부위에 결합하는 TALE DNA-결합 단백질의 RVD는 자연적으로 발생하거나 자연적으로 발생하지 않는 RVD일 수 있다. 미국 특허 제 8,586,526호 및 9,458,205호 참조.
크산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 농작물에서 많은 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 카산토모나스의 병원성은 25개 이상의 상이한 이펙터 단백질을 식물 세포 안으로 분출하는 보존된 유형 III 분비 (T3S) 시스템에 좌우된다. 분출된 단백질 중에는 식물 전사 활성화제를 모방하고 식물 전사체를 조종하는 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE)가 있다 (Kay et al., (2007) Science 318:648-651 참조). 이런 단백질들은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 가장 잘 특성화되어 있는 TALE 중 하나는 카산토모나스 캄페스트그리스(Xanthomonas campestgris) 병원체 변종 베시카토리아(Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다 (Bonas et al., (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 및 WO2010079430 참조). TALE은 연쇄 반복부(tandem repeat)의 중심 도메인을 함유하며, 각 반복부는 대략 34개의 아미노산을 함유하고, 그것들은 이런 단백질들의 DNA 결합 특이성에 대한 핵심이다. 게다가, 그것들은 핵 정위(localization) 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다 (리뷰를 위해서는 Schornack S, et al., (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272 참조). 게다가, 식물 병원성 박테리아 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에서, brg11 및 hpx17로 지정된 2개의 유전자는 R. 솔라나세아룸 생태형(biovar) 1 스트레인 GMI1000 및 생태형 4 스트레인 RS1000의 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리와 상동하는 것으로 밝혀졌다 (Heuer et al., (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384 참조). 이런 유전자들은 서로에 대해 뉴클레오타이드 서열이 98.9% 동일하지만 hpx17의 반복부 도메인에서 1,575개 bp의 결실만큼 상이하다. 그러나, 두 유전자 생성물은 모두 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질들과 40% 미만의 서열 동일성을 가진다.
이런 TALE의 특이성은 연쇄 반복부에서 발견된 서열들에 좌우된다. 반복된 서열은 대략 102 bp를 포함하며 반복부들은 전형적으로 서로와 91 내지 100% 상동한다 (Bonas et al., 상기 동일). 반복부의 다형태는 보통 위치 12 및 13에 위치하며 위치 12 및 13에 있는 초가변성 이잔기(diresidues)의 정체와 TALE의 표적 서열의 연속하는 뉴클레오타이드들의 정체 사이에 일-대-일 상응성이 있는 것으로 나타난다 (Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501 및 Boch et al., (2009) Science 326:1509-1512 참조). 실험적으로, 이런 TALE의 DNA 인식을 위한 암호는 위ㅊ 12 및 13에 있는 HD 서열이 사이토신(C)에 대한 결합으로 이어지고, NG는 T에 결합하며, NI는 A, C, G 또는 T에 결합하고, NN은 A 또는 G에 결합하며, NG는 T에 결합하도록 측정되었다. 이런 DNA 결합 반복부들은 반복부의 새로운 조합 및 수를 가진 단백질로 조립되어 새로운 서열과 상호작용할 수 있는 인공 전사 인자가 만들어진다. 게다가, 미국 특허 제 8,586,526호 및 미국 특허출원 공개공보 2013/0196373 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)은 N-캡 폴리펩타이드, C-캡 폴리펩타이드 (예컨대, +63, +231 또는 +278) 및/또는 신규한 (비전형적인) RVD를 가진 TALE을 기술한다.
예시적인 TALE은 미국 특허 제 8,586,526호 및 9,458,205호에서 기술된다 (그 전문이 참조로 포함됨).
특정 구체예에서, DNA 결합 도메인은 다이머화 및/또는 멀티머화 도메인, 예를 들어 코일드-코일() (CC) 및 다이머화 아연 핑거 (DZ)를 포함한다. 미국 특허출원 공개공보 2013/0253040 참조.
또한 추가의 구체예에서, DNA-결합 도메인은 CRISPR/Cas 시스템의 단일-가이드 RNA, 예를 들어 20150056705에 개시된 sgRNA를 포함한다.
진핵 RNAi 경로와 평행하여 가설이 세워졌던 고세균 및 많은 박테리아에서의 RNA-매개 게놈 방어 경로의 증거에 대한 강력한 증거가 최근 나타났다 (리뷰를 위해서는 Godde and Bickerton, 2006. J. Mol. Evol. 62: 718-729; Lillestol et al., 2006. Archaea 2: 59-72; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7.; Sorek et al., 2008. Nat. Rev. Microbiol. 6: 181-186 참조). CRISPR-Cas 시스템 또는 원핵 RNAi (pRNAi)로서 알려져 있는 경로는 2개의 진화적으로 및 때로는 물리적으로 연결된 유전자좌: 시스템의 RNA 구성요소들을 암호화하는 CRISPR (간헐적으로 반복되는 짧은 회문 구조 염기 서열 집합체) 유전자좌, 및 단백질을 암호화하는 cas (CRISPR-관련) 유전자좌로부터 발생하는 것으로 제시된다 (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleics Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60). 미생물 숙주에서 CRISPR 유전자좌들은 CRISPR-관련 (Cas) 유전자뿐만 아니라 CRISPR-매개된 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-코딩 RNA 요소들의 조합을 함유한다. 개별적인 Cas 단백질들은 유의한 서열 유사성을 진핵 RNAi 기계의 단백질 구성요소들과 공유하지 않지만, 유사한 예측된 기능을 가진다 (예컨대, RNA 결합, 뉴클레아제, 헬리카아제, 등). (Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7). CRISPR-관련 (cas) 유전자는 종종 CRISPR 반복부-스페이서 어레이와 관련된다. 40개 이상의 상이한 Cas 단백질 패밀리가 기술되어 있다. 이런 단백질 패밀리 중에서, Cas1은 상이한 CRISPR/Cas 시스템들 중에서도 편재성인 것으로 나타난다. cas 유전자 및 반복부 구조들의 특정 조합은 8개의 CRISPR 아형 (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, 및 Mtube)을 정의하기 위해 사용되었고, 그 중 일부는 반복부-관련된 불가사의한 단백질들 (RAMP)을 암호화하는 추가의 유전자 모듈과 관련된다. 한 개 이상의 CRISPR 아형이 단일 게놈에서 발생할 수 있다. CRISPR/Cas 아형들의 산발적인 분포는 시스템이 미생물 진화 중에 수평적인 유전자 전달의 대상임을 시사한다.
S. 피오게네스(S. pyogenes)에서 처음으로 기술된 유형 II CRISPER는 가장 잘 특성화된 시스템 중 하나이며 4개의 순차적인 단계로 표적화된 DNA 이중-가닥 파괴를 수행한다. 먼저, 2개의 비-코딩 RNA, 즉 사전-crRNA 어레이 및 tracrRNA가 CRISPR 유전자좌로부터 전사된다. 두 번째로, tracrRNA가 사전-crRNA의 반복부 영역에 혼성화하여 사전-crRNA의, 개별적인 스페이서 서열을 함유한 성숙한 crRNA로의 프로세싱을 매개하는데, 이때 프로세싱은 Cas9 단백질의 존재하에 이중 가닥-특이적 RNase III에 의해 발생한다. 세 번째로, 성숙한 crRNA:tracrRNA 복합체가 ㅍ표적 인식의 추가적인 필요조건인, RNA 상의 스페이서와 표적 DNA 상의 모티프에 인접한 프로토스페이서 (PAM) 사이의 왓슨-크릭 염기쌍을 통해 Cas9이 표적 DNA로 향하게 한다. 게다가, tracrRNA는 또한 그것의 3' 단부에서 crRNA와 염기쌍을 이루기 때문에 존재해야 하고, 이 회합은 Cas9 활성을 촉발시킨다. 마지막으로, Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에 이중-가닥 파괴를 유발한다. CRISPR/Cas 시스템의 활성은 3 단계로 구성된다: (i) '적응'으로 불리는 과정으로, 추후의 공격을 방지하기 위하여 외계 DNA 서열의 CRISPR 어레이 안으로의 삽입, (ii) 관련 단백질의 발현, 뿐만 아니라 어레이의 발현 및 프로세싱, 이어서 (iii) RNA-매개된 외계 핵산의 간섭. 그러므로, 박테리아 세포에서, 여러 소위 'Cas' 단백질들이 CRISPR/Cas 시스템의 천연 기능에 연루된다.
유형 II CRISPR 시스템은 많은 상이한 박테리아에서 발견되었다. Fonfara 등에 의한, 공공연하게 입수 가능한 게놈들에 대한 BLAST 조사는 (Fonfara et al., ((2013) Nuc Acid Res 42(4):2377-2590) 347개 종의 박테리아에서 Cas9 오르톨로그를 발현하였다. 추가적으로, 상기 그룹은 에스. 피오게네스(S. pyogenes), 에스. 뮤탄스(S. mutans), 에스. 테로필루스(S. therophilus), 시. 제주니(C. jejuni), 엔. 메닝기티데스(N. meningitides), 피. 멀토시다(P. multocida) 및 에프. 노비시다(F. novicida)로부터의 Cas9 오르톨로그를 사용하여 DNA 표적의 시험관내 CRISPR/Cas 절단을 증명하였다. 그러므로, 용어 "Cas9"는 DNA 결합 도메인 및 2개의 뉴클레아제 도메인을 포함하는 RNA 안내된 DNA 뉴클레아제를 나타내며, 이때 Cas9를 암호화하는 유전자는 임의의 적합한 박테리아로부터 유래될 수 있다.
Cas9 단백질은 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인을 가진다: 하나의 뉴클레아제 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제에 유사한 한편, 다른 것은 Ruv 엔도뉴클레아제 도메인을 닮는다. HNH-형 도메인은 crRNA에 상보하는 DNA 가닥을 절단하는 데 기여하는 한편 Ruv 도메인은 비-상보성 가닥을 절단하는 것으로 나타난다. Cas 9 뉴클레아제는 뉴클레아제 도메인들 중 하나만이 기능적이어서, Cas 니카아제(nickase)를 생성하도록 조작될 수 있다 (Jinek et al., (2012) Science 337:816 참조). 니카아제는 효소의 촉매성 도메인의 아미노산들의 특이적 돌연변이에 의해, 또는 그것이 더 이상 기능성이 아니도록 도메인의 부분 또는 전부를 절단함으로써 생성될 수 있다. Cas9가 2개의 뉴클레아제 도메인을 포함하기 때문에, 이런 접근법은 어느 하나의 도메인에 대해 이루어질 수 있다. 이중 가닥 파괴는 2개의 그러한 Cas9 키나아제를 사용함으로써 표적 DNA에서 이루어질 수 있다. 니카아제는 각각 DNA의 한 가닥을 절단할 것이고 두 개의 사용은 이중 가닥 파괴를 생성할 것이다.
crRNA-tracrRNA 복합체의 요건은 crRNA 및 tracrRNA의 어닐링에 의해 정상적으로 형성된 헤어핀을 포함하는 조작된 "단일-가이드 RNA" (sgRNA)의 사용에 의해 피할 수 있다 (Jinek et al., 상기 동일 및 Cong et al., (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143 참조). 에스. 피로게네스에서, 조작된 tracrRNA:crRNA 융합, 또는 sgRNA는 이중 가닥 RNA:DNA 이종다이머가 Cas 관련된 RNA와 표적 DNA 사이에서 형성될 때 Cas9가 표적 DNA를 절단하도록 안내한다. Cas9 단백질 및 PAM 서열을 함유한 조작된 sgRNA를 포함하는 이런 시스템은 RNA 안내된 게놈 편집에 사용되었고 (Ramalingam et al., Stem Cells and Development 22(4):595-610 (2013) 참조), 제브라피시의 생체내 배아 게놈 편집에 유용하였으며 (Hwang et al., (2013) Nature Biotechnology 31 (3):227 참조), 편집 효율은 ZFN 및 TALEN에 유사하였다.
CRISPR 유전자좌의 일차 생성물은 인베이더(invader) 표적화 서열을 함유한 짧은 RNA인 것으로 나타나며, 경로에서 그것의 가설화된 역할을 기반으로 가이드 RNA 또는 원핵 침묵 RNA (psiRNA)로 명명된다 (Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Hale et al., 2008. RNA, 14: 2572-2579). RNA 분석은 CRISPR 유전자좌 전사물이 반복부 서열 내에서 절단되어 개별적인 인베이더 표적화 서열 및 플랭킹 반복부 단편들을 함유하는 약 60- 내지 70-뉴클레오타이드 RNA 중간체가 방출되는 것을 나타낸다 (Tang et al., 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 7536-7541; Tang et al., 2005. Mol. Microbiol. 55: 469-481; Lillestol et al., 2006. Archaea 2: 59-72; Brouns et al., 2008. Science 321: 960-964; Hale et al., 2008. RNA, 14: 2572-2579). 고세균 파이로코쿠스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 이런 중간체 RNA는 추가로 풍부한, 안정적인 약 35- 내지 45-뉴클레오타이드 성숙한 psiRNA로 프로세싱된다 (Hale et al., 2008. RNA, 14: 2572-2579).
crRNA-tracrRNA 복합체의 요건은 crRNA 및 tracrRNA의 어닐링에 의해 정상적으로 형성된 헤어핀을 포함하는 조작된 "단일-가이드 RNA" (sgRNA)의 사용에 의해 피할 수 있다 (Jinek et al., (2012) Science 337:816 및 Cong et al., (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143 참조). 에스. 피로게네스에서, 조작된 tracrRNA:crRNA 융합, 또는 sgRNA는 이중 가닥 RNA:DNA 이종다이머가 Cas 관련된 RNA와 표적 DNA 사이에서 형성될 때 Cas9가 표적 DNA를 절단하도록 안내한다. Cas9 단백질 및 PAM 서열을 함유한 조작된 sgRNA를 포함하는 이런 시스템은 RNA 안내된 게놈 편집에 사용되었고 (Ramalingam, 상기 동일), 제브라피시의 생체내 배아 게놈 편집에 유용하였으며 (Hwang et al., (2013) Nature Biotechnology 31 (3):227 참조), 편집 효율은 ZFN 및 TALEN에 유사하였다.
키메릭 또는 sgRNA는 임의의 원하는 표적에 상보하는 서열을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 구체예에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 또는 그 이상, 또는 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구체예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 미만, 또는 그 미만의 뉴클레오타이드 길이이다. 특정 구체예에서, sgRNA는 표 1 또는 2 (SEQ ID NO:1 내지 6 또는 33)에서 나타낸 것과 같이 tau 표적 부위의 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오타이드에 결합하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, RNA는 표적에 상보하고 형태 G[n19]의 22개 염기, 이어서 에스. 피오게네스 CRISPR/Cas 시스템과 사용하기 위한 형태 NGG 또는 NAG의 프로토스페이서-인접한 모티프 (PAM)을 포함한다. 그러므로, 한 방법에서, sgRNA는 (i) ZFN 이종다이머의 인식 서열을 관련된 게놈 (인간, 마우스, 또는 특정 식물 종의)의 기준 서열과 정렬시킴으로써; (ii) ZFN 절반-부위들 사이의 스페이서 영역을 확인함으로써; (iii) 스페이서 영역에 가장 가까운 모티프 G[N20]GG의 위치를 확인함으로써 (하나 이상의 그러한 모티프가 스페이서와 중복할 때, 스페이서에 비해 중심에 있는 모티프가 선택됨); (iv) 그 모티프를 sgRNA의 코어로서 사용함으로써 관심의 유전자에서 공지의 ZFN 표적을 활용함으로써 설계될 수 있다. 이런 벙법은 유익하게도 증명된 뉴클레아제 표적에 의존한다. 대안적으로, sgRNA는 단순히 G[n20]GG 식을 따르는 적합한 표적 서열을 확인함으로써 관심의 임의의 영역을 표적화하도록 설계될 수 있다. 상보성 영역과 함께, sgRNA는 sgRNA의 tracrRNA 부분의 꼬리 영역까지 연장되도록 추가적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다 (Hsu et al., (2013) Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647 참조). 꼬리는 +67 내지 +85 뉴클레오타이드의 것일 수 있거나, 그 사이의 임의의 수일 수 있으며, +85 뉴클레오타이드가 바람직한 길이이다. 절단된 sgRNA, "tru-gRNAs" 또한 사용될 수 있다 (Fu et al., (2014) Nature Biotech 32(3): 279 참조). tru-gRNA에서, 상보성 영역은 17 또는 18개 뉴클레오타이드 길이로 감소된다.
추가로, 대안적인 PAM 서열이 또한 이용될 수 있는데, 이때 PAM 서열은 에스. 피오게네스 Cas9를 사용하여 NGG에 대한 대안으로서 NAG일 수 있다 (Hsu 2013, 상기 동일). 추가적인 PAM 서열 또한 초기 G가 없는 것들을 포함할 수 있다 (Sander and Joung (2014) Nature Biotech 32(4):347). 에스. 피오게네스 암호화된 Cas9 PAM 서열에 더불어, 다른 박테리아 근원으로부터의 Cas9 단백질에 특이적인 다른 PAM 서열이 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 제시된 PAM 서열들 (Sander and Joung, 상기 동일, 및 Esvelt et al., (2013) Nat Meth 10(11):1116에 따름)이 이런 Cas9 단백질들에 대해 특이적이다:
종 PAM
에스. 피오게네스 NGG
에스. 피오게네스 NAG
에스. 뮤탄스 NGG
에스. 써모필루스 NGGNG
에스. 써모필루스 NNAAAW
에스. 써모필루스 NNAGAA
에스. 써모필루스 NNNGATT
시. 제주니 NNNNACA
엔. 메틸기티데스 NNNNGATT
피. 멀토시다 GNNNCNNA
에프. 노비시다 NG
그러므로, 에스. 피오게네스 CRISPR/Cas 시스템과 사용하기에 적합한 표적 서열은 다음의 가이드라인에 따라 선택될 수 있다: [n17, n18, n19, 또는 n20](G/A)G. 대안적으로, PAM 서열은 가이드라인 G[n17, n18, n19, n20](G/A)G를 따른다. 에스. 피오게네스가 아닌 박테리아로부터 유래된 Cas9 단백질들의 경우, 동일한 가이드라인이 사용될 수 있는데, 이때 대체 PAM은 에스. 피오게네스 PAM 서열에 대해서 치환된다.
가장 바람직한 것은 잠재적인 오프 표적 서열을 피하는 특이성의 가능성이 가장 높은 표적 서열을 선택하는 것이다. 이런 바람직하지 못한 오프 표적 서열은 다음의 속성들을 비교함으로써 확인될 수 있다: i) 기능하는 것으로 알려져 있는 PAM 서열이 이어지는 표적 서열에서 이용되는 Cas9 단백질과의 유사성; ii) 원하는 표적 서열로부터 3개 미만의 미스매치를 가지는 유사한 표적 서열; iii) ii)에서와 유사한 표적 서열로, 미스매치는 모두 PAM에 가가운 영역에서보다는 PAM에서 먼 영역에 위치하는 표적 서열 (때때로 '시드' 영역 (Wu et al., (2014) Nature Biotech doi:10.1038/nbt2889)으로서 언급되는, PAM에 바로 인접하거나 PAM에 가까운 뉴클레오타이드 1 내지 5가 인식에 가장 결정적이고, 따라서 시드 영역에 위치한 미스매치를 가진 추정되는 오프 표적 부위들은 sgRNA에 의해 인식된 가능성이 가장 적을 수 있음); 및 iv) 미스매치가 연속적으로 공간배치되어 있지 않거나 4개의 뉴클레오타이드보다 큰 간격으로 공간배치되어 있는 유사한 표적 서열 (Hsu 2014, 상기 동일). 그러므로, 상기 기준들을 사용하여, 어떤 CRIPSR/Cas 시스템이 사용되든지 게놈의 잠재적인 오프 표적 부위의 수의 분석을 수행함으로써, sgRNA에 적합한 표적 서열이 확인될 수 있다.
특정 구체예에서, Cas 단백질은 자연적으로 발생하는 Cas 단백질의 "기능성 유도체"일 수 있다. 천연 서열 폴리펩타이드의 "기능성 유도체"는 천연 서열 폴리펩타이드와 마찬가지의 정성적 생물학적 특성을 가진 화합물이다. "기능성 유도체"로는, 한정하는 것은 아니지만, 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩타이드 및 그것들의 단편의 유도체를 들 수 있는데, 단 그것들은 상응하는 천연 서열 폴리펩타이드와 마찬가지의 생물학적 활성을 가져야 한다. 본원에서 고려되는 생물학적 활성은 기능성 유도체가 DNA 기질을 단편들로 가수분해하는 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변종, 그것들의 공유 변형, 및 융합을 모두 포함한다. 일부 측면으로, 기능성 유도체는 자연적으로 발생하는 Cas 단백질의 단일한 생물학적 특성을 포함할 수 있다. 다른 측면으로, 기능성 유도체는 자연적으로 발생하는 Cas 단백질의 생물학적 특성의 하위세트를 포함할 수 있다. Cas 폴리펩타이드 또는 그것의 단편의 적합한 유도체들로는, 한정하는 것은 아니지만, Cas 단백질 또는 그것의 단편의 돌연변이, 융합, 공유 변형을 들 수 있다. Cas 단백질 또는 그것의 단편, 뿐만 아니라 Cas 단백질 또는 그것의 단편의 유도체들을 포함하는 Cas 단백질은 세포로부터 얻을 수 있거나 화학적으로 또는 이들 두 과정의 조합에 의해 합성될 수 있다. 세포는 자연적으로 Cas 단백질을 생성하는 세포이거나, 또는 자연적으로 Cas 단백질을 생성하고 내인성 Cas 단백질을 더 높은 발현 수준으로 생성하거나 또는 외래적으로 도입된 핵산으로부터 Cas 단백질을 생성하도록 유전자 조작되는 세포일 수 있으며, 이때 핵산은 내인성 Cas와 동일하거나 상이한 Cas를 암호화한다. 일부 경우에, 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생성하지 않으며 Cas 단백질을 생성하도록 유전자 조작된다.
특정 유전자 (안전한 은닉 유전자를 포함함)에 표적화된 예시적인 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 예를 들어, 미국 특허출원 공보 2015/0056705에서 개시된다.
그러므로, 뉴클레아제는 DNA를 절단하는 뉴클레아제 도메인과 조합된 도너 (형질전환 유전자)를 삽입하기에 바람직한 임의의 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합한다는 점에서 DNA-결합 도메인을 포함한다.
Tau 유전자 조절제
tau DNA-결합 도메인은 본원에 기술된 방법에 사용하기 위하여 임의의 추가적인 분자들 (예컨대, 폴리펩타이드)에 융합되거나 또는 그렇지 않으면 회합될 수 있다. 특정 구체예에서, 방법은 적어도 하나의 DNA-결합 분자 (예컨대, ZFP, TALE 또는 단일 가이드 RNA) 및 이종성 조절 (기능성) 도메인 (또는 그것의 기능성 단편)을 포함하는 융합 분자를 사용한다.
특정 구체예에서, tau 조절제의 기능성 도메인은 전사 조절 도메인을 포함한다. 공통 도메인으로는, 예컨대, 전사 인자 도메인 (활성화제, 리프레서, 동시-활성화제, 공동-리프레서), 사일런서, 발암유전자 (예컨대, myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos 패밀리 구성원들); DNA 수복 효소 및 그것들의 관련 인자들 및 변형제들; DNA 재배열 효소 및 그것들의 관련 인자들 및 변형제들; 크로마틴 관련 단백질들 및 그것들의 변형제들 (예컨대 키나아제, 아세틸화효소 및 탈아세틸화효소); 및 DNA 변형 효소들 (예컨대 메틸트란스퍼라제, 토포아이소어라제, 헬리카아제, 결찰효소, 키나아제, 포스파타제, 중합효소, 엔도뉴클레아제) 및 그것들의 관련 인자들 및 변형제들을 들 수 있다. 예컨대, 미국 특허출원 공보 번호 2013/0253040 (그 전문이 참조로 본원에 포함됨) 참조.
활성화를 이루기에 적합한 도메인들로는 HSV VP16 활성화 도메인 (예컨대, Hagmann et al., J. Virol. 71, 5952-5962 (1997) 참조), 핵 호르몬 수용체 (예컨대, Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998) 참조); 핵 인자 카파 B의 p65 하위단위 (Bitko & Barik, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) 및 Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)), 또는 인공 키메릭 기능성 도메인, 예컨대 VP64 (Beerli et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33), 및 degron (Molinari et al., (1999) EMBO J. 18, 6439-6447)을 들 수 있다. 추가적인 예시의 활성화 도메인으로는, Oct 1, Oct-2A, Sp1, AP-2, 및 CTF1 (Seipel et al., EMBO J. 11, 4961-4968 (1992), 뿐만 아니라 p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A 및 ERF-2를 들 수 있다. 예를 들어, Robyr et al., (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood et al., (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275; Leo et al., (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna et al., (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik et al., (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; 및 Lemon et al., (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504를 참조한다. 추가적인 예시의 활성화 도메인으로는, 한정하는 것은 아니지만, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5,-6,-7, 및 -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, 및 TRAB1을 들 수 있다. 예를 들어, Ogawa et al., (2000) Gene 245:21-29; Okanami et al., (1996) Genes Cells 1:87-99; Goff et al., (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho et al., (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429; Ulmason et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels et al., (2000) Plant J. 22:1-8; Gong et al., (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; 및 Hobo et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353을 참조한다.
tau 리프레서를 제조하기 위해 사용될 수 있는 예시의 억압 도메인으로는, 한정하는 것은 아니지만, KRAB A/B, KOX, TGF-베타-유도성 초기 유전자 (TIEG), v-erbA, SID, MBD2, MBD3, DNMT 패밀리의 구성원들 (예컨대, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb, 및 MeCP2를 들 수 있다. 예를 들어, Bird et al., (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al., (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al., (1999) Cell 99:447-450; 및 Robertson et al., (2000) Nature Genet. 25:338-342를 참조한다. 추가적인 예시의 억압 도메인으로는, 한정하는 것은 아니지만, ROM2 및 AtHD2A를 들 수 있다. 예를 들어, Chem et al., (1996) Plant Cell 8:305-321; 및 Wu et al., (2000) Plant J. 22:19-27을 참조한다.
일부 경우에, 도메인은 염색체의 후생유전학적 조절에 포함된다. 일부 구체예에서, 도메인은 히스톤 아세틸트란스퍼라제 (HAT), 예컨대 핵 국한된 타입-A, 예컨대 MYST 패밀리 구성원들 MOZ, Ybf2/Sas3, MOF, 및 Tip60, GNAT 패밀리 구성원 Gcn5 또는 pCAF, p300 패밀리 구성원 CBP, p300 또는 Rtt109 (Berndsen and Denu (2008) Curr Opin Struct Biol 18(6):682-689)이다. 다른 경우에 도메인은 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC), 예컨대 클래스 I (HDAC-1, 2, 3, 및 8), 클래스 II (HDAC IIA (HDAC-4, 5, 7 및 9), HDAC IIB (HDAC 6 및 10)), 클래스 IV (HDAC-11), 클래스 III (또한 서투인(sirtuin)으로도 알려져 있음 (SIRT); SIRT1-7) (Mottamal et al., (2015) Molecules 20(3):3898-3941)이다. 일부 구체예에서 사용되는 또 다른 도메인은 히스톤 포스포릴라아제 또는 키나아제로, 그것의 예로는 MSK1, MSK2, ATR, ATM, DNA-PK, Bub1, VprBP, IKK-α, PKC
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1, Dik/Zip, JAK2, PKC5, WSTF 및 CK2를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 메틸화 도메인이 사용되며 예컨대 Ezh2, PRMT1/6, PRMT5/7, PRMT 2/6, CARM1, set7/9, MLL, ALL-1, Suv 39h, G9a, SETDB1, Ezh2, Set2, Dot1, PRMT 1/6, PRMT 5/7, PR-Set7 및 Suv4-20h의 군으로부터 선택될 수 있다. 수모일화 및 비오티닐화에 포함된 도메인들 (Lys9, 13, 4, 18 및 12) 또한 일부 구체예에서 사용될 수 있다 (리뷰는 Kousarides (2007) Cell 128:693-705 참조함).
융합 분자는 당업자들에게 잘 알려져 있는 클로닝 및 생화학적 콘쥬게이션 방법에 의해 제조되었다. 융합 분자는 DNA-결합 도메인 및 기능성 도메인 (예컨대, 전사 활성화 또는 억압 도메인)을 포함한다. 융합 분자는 또한 선택적으로 핵 정위 신호 (예컨대, 예를 들어, SV40 중간 T-항원으로부터 유래됨) 및 에피토프 태그 (예컨대, 예를 들어, 플래그(FLAG) 및 헤마글루티닌)를 포함한다. 융합 단백질 (및 그것을 암호화하는 핵산)은 번역 리딩 프레임이 융합 구성요소들 중에서 보존되도록 설계된다.
한편으로 기능성 도메인 (또는 그것의 기능성 단편)의 폴리펩타이드 구성요소와, 다른 한편으로 비-단백질 DNA-결합 도메인 (예컨대, 항생물질, 인터칼레이터, 마니어 그루브 결합제, 핵산) 사이의 융합은 당업자들에게 알려져 있는 생화학적 콘쥬게이션 방법에 의해 제조된다. 예를 들어, Pierce Chemical Company (Rockford, IL) 카탈로그를 참조한다. 마이너 그루브 결합제와 폴리펩타이드 사이의 융합을 제조하기 위한 방법 및 조성물은 이미 기술되어 있다. Mapp et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935. 마찬가지로, CRISPR/Cas TF 및 폴리펩타이드 구성요소 기능 도메인과 결합된 sgRNA 핵산 구성요소를 포함하는 뉴클레아제 또한 당업자들에게 공지되어 있고 본원에서 상세하게 기술된다.
융합 분자는 당업자들에게 알려져 있는 것과 같이, 제약학적으로 허용되는 담체와 제제화될 수 있다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985; 및 공동 소유의 국제 특허 출원 공보 번호 WO 00/42219를 참조한다.
융합 분자의 기능성 구성요소/도메인은 일단 융합 분자가 그것의 DNA 결합 도메인을 통하여 표적 서열에 결합한 후에 유전자의 전사에 영향을 미칠 수 있는 다양한 상이한 구성요소들 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 그러므로, 기능성 구성요소로는, 한정하는 것은 아니지만, 다양한 전사 인자 도메인, 예컨대 활성화제, 리프레서, 동시 활성화제, 공동 리프레서, 및 사일런서를 들 수 있다.
특정 구체예에서, 융합 분자는 그것들의 조작된 (ZFP 또는 TALE 또는 sgRNA) DNA 결합 도메인을 통해 그것들의 의도된 핵산 표적을 인식할 수 있는 기능성 실체를 생성하고 DNA가 뉴클레아제 활성을 통해 DNA 결합 부위 가까이에서 절단되는 것을 유발하는 뉴클레아제 (예컨대, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 TALE 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제)를 생성하기 위하여 DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 이런 절단은 tau 유전자의 비활성화 (억압)을 초래한다. 그러므로, tau 리프레서는 또한tau 뉴클레아제 를 포함한다.
그러므로, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 광범위하게 적용될 수 있고 관심의 임의의 뉴클레아제를 포함할 수 있다. 뉴클레아제의 비제한적인 실례로는 메가뉴클레아제, TALEN 및 아연 핑거 뉴클레아제를 들 수 있다. 뉴클레아제는 이종성 DNA-결합 및 절단 도메인 (예컨대, 아연 핑거 뉴클레아제; TALEN; 이종성 절단 도메인을 가진 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인, 뉴클레아제 도메인과 회합된 sgRNA)을 포함하거나, 또는 대안적으로, 자연적으로 발생하는 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 선택된 표적 부위에 결합하도록 변경될 수 있다 (예컨대, 동족 결합 부위 이외의 상이한 부위에 결합하도록 조작된 메가뉴클레아제).
뉴클레아제 도메인은 임의의 뉴클레아제, 예를 들어 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 본원에 기술된 tau DNA-결합 도메인에 융합될 수 있는 적합한 뉴클레아제 (절단) 도메인들의 비제한적인 실례로는 임의의 제한 효소, 예를 들어 타입 IIS 제한 효소 (예컨대, FokI)로부터의 도메인들을 포함한다. 특정 구체예에서, 절단 도메인은 절단 활성을 위해 다이머화를 필요로 하는 절반 절단-도메인이다. 예컨대, 미국 특허 제 8,586,526호; 8,409,861호; 및 7,888,121호 (모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조. 일반적으로, 융합 단백질이 절반 절단-도메인을 포함한다면, 2개의 융합 단백질이 절단에 필요하다. 대안적으로, 2개의 절반 절단-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절반 절단-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그것의 기능성 단편)로부터 유래되거나, 또는 각각의 절반 절단-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그것의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있다. 게다가, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위가 바람직하게 서로와 관련하여 배치되어서, 2개의 융합 단백질의 각각의 표적 부위에 대한 결합이, 예컨대 다이머화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성하는 것을 허용하는, 서로에 대한 공간 배향으로 절반 절단-도메인들이 놓이게 한다.
뉴클레아제 도메인은 또한 절단 활성을 가진 임의의 메가뉴클레아제 (호우밍 엔도뉴클레아제) 도메인으로부터 유래될 수 있고 본원에서 기술된 뉴클레아제들, 이를테면 한정하는 것은 아니지만 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII과 함께 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 뉴클레아제는 압축 TALEN (cTALEN)을 포함할 수 있다. 이것들은 TALE DNA 결합 도메인을 TevI 뉴클레아제 도메인에 연결시키는 단일 사슬 융합 단백질이다. 융합 단백질은 TALE DNA 결합 도메인이 메가뉴클레아제 (예컨대, TevI) 뉴클레아제 도메인과 관련하여 위치하는 곳이 어디인가에 따라 TALE 영역에 국한된 니카아제로서 작용하거나, 또는 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있다 (Beurdeley et al., (2013) Nat Comm: 1-8 DOI: 10.1038/ncomms2782 참조).
다른 구체예에서, TALE-뉴클레아제는 메가 TAL이다. 이런 메가 TAL 뉴클레아제는 TALE DNA 결합 도메인 및 메가뉴클레아제 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 메가뉴클레아제 절단 도메인은 모노머로서 활성을 나타내며 활성을 위해 다이머화를 필요로 하지 않는다 (Boissel et al., (2013) Nucl Acid Res: 1-13, doi: 10.1093/nar/gkt1224 참조).
게다가, 메가뉴클레아제의 뉴클레아제 도메인은 또한 DNA-결합 기능성을 나타낼 수 있다. 임의의 TALEN은 추가적인 TALEN (예컨대, 하나 이상의 메가-TAL을 가진 하나 이상의 TALEN (cTALEN 또는 FokI-TALEN)) 및/또는 ZFN과 조합하여 사용될 수 있다.
게다가, 절단 도메인은 야생형과 비교하여, 예를 들어 표적 외 절단 효과를 감소시키거나 제거하는 불가피한 이종다이머의 형성을 위해 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제 7,914,796호; 8,034,598호; 및 8,623,618호 (모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.
본원에 기술된 뉴클레아제는 이중-가닥 표적 (예컨대 유전자)에서 이중- 또는 단일-가닥 파괴를 생성할 수 있다. 단일-가닥 파괴 ("닉(nick))"의 생성은, 예를 들어, 뉴클레아제 도메인들 중 하나의 촉매 도메인의 돌연변이가 니카아제를 초래하는 방법을 기술하는 미국 특허 제 8,703,489호 및 9,200,266호 (본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다.
그러므로, 뉴클레아제 (절단) 도메인 또는 절반 절단-도메인은 기능성 도메인을 형성하기 위하여 절단 활성을 보유한, 또는 멀티머화 능력을 보유한 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "스플릿-효소" 기술을 사용하여 생체내에서 핵산 표적 부위에서 조립될 수 있다 (예컨대, 미국 특허출원 공개공보 2009/0068164 참조). 그러한 스플릿 효소들의 구성요소는 별도의 발현 구성물에서 발현되거나, 하나의 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있는데, 오픈 리딩 프레임에서 개별적인 구성요소들은, 예를 들어, 자가-절단 2A 펩타이드 또는 IRES 서열에 의해 분리된다. 구성요소들은 개별적인 아연 핑거 결합 도메인이거나 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인들일 수 있다.
뉴클레아제는 미국 특허 출원 공보 번호 2009/0111119에서 기술된 것과 같이, 예를 들어, 효모-기반 염색체 시스템에서 사용 전에 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 뉴클레아제 발현 구성물은 당업계에 공지되어 있는 방법들을 사용하여 쉽게 설계될 수 있다.
융합 단백질 (또는 그것의 구성요소)의 발현은 본질적인 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들어 라피노오스 및/또는 갈락토오스의 존재하에 활성화 (탈-억압)되거나 및/또는 글루코오스의 존재하에 억압되는 갈락토키나아제 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 바람직한 프로모터의 비제한적 실례로는 뉴런 특이적 프로모터 NSE, 시냅신, CAMKiia 및 MECP를 들 수 있다. 편재성 프로모터의 비제한적 실례로는 GAS 및 Ubc를 들 수 있다. 추가의 구체예들은 에 기술된 것과 같이, 자가-조절 프로모터들의 사용 (tau DNA-결합 도메인에 대한 고친화도 결합 부위들의 포함을 경유함)을 포함한다.
전달
본원에 기술된 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드 (예컨대, tau 조절제) 및 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해, 이를 테면, 예를 들어, 단백질의 주입에 의해, mRNA를 통해, 및/또는 발현 구성물 (예컨대, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, AAV 벡터, Ad 벡터, 등)을 사용하여 표적 세포에 전달될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 리프레서는, 한정하는 것은 아니지만, 미국 특허 제 9,585,971호에 기술된 AAV 벡터 및/또는 미국 가특허 출원 번호 62/503,121에 기술된 AAV 벡터를 포함한, AAV 벡터를 사용하여 전달된다.
본원에 기술된 아연 핑거 단백질을 포함하는 단백질을 전달하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제 6,453,242호; 6,503,717호; 6,534,261호; 6,599,692호; 6,607,882호; 6,689,558호; 6,824,978호; 6,933,113호; 6,979,539호; 7,013,219호; 및 7,163,824호 (모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다.
한정하는 것은 아니지만, 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스 바이러스 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터, 등을 포함하여, 임의의 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 미국 특허 제 8,586,526호; 6,534,261호; 6,607,882호; 6,824,978호; 6,933,113호; 6,979,539호; 7,013,219호; 및 7,163,824호 (전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조. 나아가, 이런 벡터들 중 임의의 벡터는 하나 이상의 DNA-결합 단백질-암호화 서열을 포함할 수 있는 것이 명백할 것이다. 그러므로, 하나 이상의 tau 조절제 (예컨대, 리프레서)가 세포에 도입될 때, 단백질 구성요소 및/또는 폴리뉴클레오타이드 구성요소를 암호화하는 서열들은 동일한 벡터 상에 또는 상이한 벡터 상에 운반될 수 있다. 다중 벡터가 사용되는 경우, 각각의 벡터는 하나 또는 다중 tau 조절제 (예컨대, 리프레서) 또는 그것들의 구성요소를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 벡터 시스템은 AAV 벡터, 예를 들어 미국 특허 제 9,585,971호 및/또는 미국 가특허 출원 번호 62/503,121에서 기술된 AAV9 또는 AAV 변종이다.
종래의 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법은 세포 (예컨대, 포유류 세포)에 조작된 tau 조절제를 암호화하는 핵산을 도입하고 조직을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 방법은 또한 시험관내에서 세포에 그러한 리프레서 (또는 그것의 구성요소들)를 암호화하는 핵산을 투여하지 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 리프레서를 암호화하는 핵산은 생체내 또는 시험관내 유전자 요법 사용을 위해 투여된다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드(naked) 핵산, 및 리포솜 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합체를 형성한 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 그것들은 에피솜성 게놈 또는 세포에 전달된 후 통합된 게놈을 가진다. 유전자 요법 과정의 리뷰에 대해서는, Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)을 참조한다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법으로는 전기천공법, 리포펙션, 마이크로주입, 바이오리스틱스(biolistics), 비로좀, 피로좀, 면역리포좀, 다가 양이온 또는 지질; 핵산 콘쥬게이트, 네이키드 DNA, 네이키드 RNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-향상된 흡수를 들 수 있다. 예컨대 Sonitron 2000 시스템 (Rich-Mar)을 사용하는 소노포레이션 (Sonoporation)이 또한 핵산 전달을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 핵산은 mRNA로서 전달된다. 또한 바람직한 것은 번역 효율 및/또는 mRNA 안정성을 증가시키기 위해 캡핑된 mRNA를 사용하는 것이다. 특히 바람직한 것은 ARCA (항-반전 캡 아날로그) 캡 또는 그것의 변종이다. 미국 특허 제 7,074,596호 및 8,153,773호 (본원에 참조로 포함됨) 참조.
추가적인 예시의 핵산 전달 시스템으로는 Amaxa BioSystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) 및 Copernicus Therapeutics Inc.에 의해 제공되는 것들을 들 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제 6,008,336호 참조). 리포펙션은 예컨대, 미국 특허 제 5,049,386호; 4,946,787호; 및 4,897,355호에서 기술되며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판된다 (예컨대, TransfectamTM 및 LipofectinTM 및 LipofectamineTM RNAiMAX). 폴리뉴클레오타이드의 효과적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질로는 Felgner, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 91/17424 및 WO 91/16024의 것들을 들 수 있다. 전달은 세포 (생체외 투여) 또는 표적 조직 (생체내 투여)에 대한 것일 수 있다.
면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 포함한 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자들에게 잘 알려져 있다 (예컨대, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 미국 특허 제 4,186,183호; 4,217,344호; 4,235,871호; 4,261,975호; 4,485,054호; 4,501,728호; 4,774,085호; 4,837,028호; 및 4,946,787호 참조).
추가적인 전달 방법으로는 EnGeneIC 전달 비히클 (EDV) 안으로의 전달될 핵산의 포장의 사용을 들 수 있다. 이런 EDV는 이중특이적 항체를 사용하여 표적 조직으로 특이적으로 전달되는데, 이중특이적 항체에서 항체의 한 팔(arm)은 표적 조직에 대한 특이성을 가지며 다른 팔은 EDV에 대한 특이성을 가진다. 항체는 EDV를 표적 세포 표면으로 가져가고 그런 후 EDV는 세포내이입에 의해 세포 안으로 들어가게 된다. 세포에 있게 된 후에는, 내용물이 방출된다 (MacDiarmid et al., (2009) Nature Biotechnology 27(7):643 참조).
조작된 ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 신체의 특정 세포로 바이러스를 표적화하고 그 바이러스 페이로드(payload)를 핵으로 수송하기 위한 고도로 진환된 과정이라는 장점을 취한다. 바이러스 벡터는 직접 환자에게 투여될 수 있거나 (생체내) 또는 시험관내에서 세포를 치료하기 위해 사용될 수 있고 변형된 세포는 환자에게 투여된다 (생체외). ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템의 전달을 위한 종래의 바이러스 기반 시스템으로는, 한정하는 것은 아니지만, 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련, 백시니아 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터를 들 수 있다. 숙주 게놈에의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 방법으로 가능하며, 자주 삽입된 형질전환 유전자의 장기간 발현을 초래한다. 추가적으로, 높은 형질도입 효율이 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다.
레트로바이러스의 향성(tropism)은 외래 엔벨로프 단백질을 혼입시키고, 표적 세포의 잠재적인 표적 집단을 확대시킴으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분할 세포를 형질도입시키거나 감염시킬 수 있고 전형적으로 고바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 좌우된다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6 내지 10 kb의 외래 서열에 대한 포장 수용력을 가진 시스-작용 긴 말단 반복부들로 구성된다. 최소 시스-작용 LTR은 벡터의 복제 및 포장에 충분한데, 그런 다음 벡터는 치료 유전자를 표적 세포에 통합시켜서 영구적인 형질전환 유전자 발현을 제공하기 위해 사용된다. 광범위하게 사용되는 레트로바이러스 벡터로는 마우스 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV), 유인원 면역결핍증 바이러스 (SIV), 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV), 및 그것들의 조합을 기반으로 한 것들을 들 수 있다 (예컨대, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); 국제 특허 출원 공보 번호 WO 1994/026877 참조).
일과성 발현이 바람직한 용도에서, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율을 낼 수 있고 세포 분할을 필요로 하지 않는다. 그러한 벡터를 사용하여, 고역가 및 고수준의 발현이 얻어졌다. 이런 벡터는 상대적으로 간단한 시스템으로 대량으로 제조될 수 있다. 아데노-관련 바이러스 ("AAV") 벡터는 또한, 예컨대 핵산 및 펩타이드의 시험관내 제조에서, 및 생체내 및 생체외 유전자 요법 과정을 위해 세포를 표적 핵산으로 형질도입시키기 위해 사용된다 (예컨대, West et al., Virology 160:38-47 (1987); 미국 특허 제 4,797,368; 국제 특허출원 공보 번호 WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994) 참조). 재조합 AAV 벡터의 구성은 많은 출판물에, 이를테면 미국 특허 제 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)에서 기술된다.
적어도 6가지의 바이러스 벡터 접근법이 현재 임상 실험에서 유전자 전달에 이용될 수 있는데, 그것들은 형질도입제를 생성하기 위해 헬퍼 세포주에 삽입된 유전자들에 의한 결핍 벡터의 보완을 포함하는 접근법을 사용한다.
pLASN 및 MFG-S가 임상 실험에서 사용되었던 레트로바이러스 벡터의 실레들이다 (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN은 유전자 요법 시도에서 첫 번째로 사용된 치료용 벡터였다 (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). 50% 이상의 형질도입 효율은 MFG-S 포장된 벡터에 대해 관찰되었다 (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. 유전자 Ther. 1:111-2 (1997).
재조합 아데노-관련 바이러스 벡터 (rAAV)는 결핍성 및 비병원성 파르보바이러스 아데노-관련 유형 2 바이러스를 기반으로 한 유망한 대체 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 형질전환 유전자 발현 카세트를 플랭킹하는 AAV 145 bp 반전 말단 반복부만을 함유한 플라스미드로부터 유래된다. 형질도입된 세포의 게놈으로의 통합으로 인한 효과적인 유전자 전달 및 안정적인 형질전환 유전자 전달은 이런 벡터 시스템의 핵심 특징이다 (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9, 및 AAV rh10 및 위형 AAV, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5, AAV2/9 및 AAV2/6을 포함한, 다른 AAV 혈청형 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있는 신규한 AAV 혈청형 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다 (예컨대 미국 특허 제 9,585,971호 참조). 바람직한 구체예에서, AAV9 벡터 (AAV9의 변종 및 위형을 포함함)가 사용된다.
복제-결핍 재조합 아데노바이러스 벡터 (Ad)는 고역가로 제조될 수 있고 많은 상이한 세포 유형을 쉽게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 형질전환 유전자가 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 대체하고; 계속해서 복제 결핍 벡터가 결실된 유전자 기능을 트랜스로 공급하는 인간 293 세포에서 증식되도록 조작된다. Ad 벡터는 비분할, 분화된 세포, 예컨대 간, 신장 및 근육에서 발견되는 것들을 포함한, 다중 유형의 조직을 생체내에서 형질도입할 수 있다. 종래의 Ad 벡터는 큰 운반 수용량을 가진다. Ad 벡터의 임상 실험에서의 사용의 실례는 근육내 주사로 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오타이드 요법을 포함하였다 (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). 임상 실험에서 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 사용의 추가적인 실례는 Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)를 포함한다.
세포 포장은 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하기 위해 사용된다. 그러한 세포로는 아데노바이러스를 포장하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 포장하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 들 수 있다. 유전자 요법에 사용된 바이러스 벡터는 보통 핵산 벡터를 바이러스 입자 안으로 포장하는 프로듀서 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 포장 및 숙주 (해당하는 경우) 안으로의 후속되는 통합에 필요한 최소한의 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현된 단백질을 암호화하는 발현 카세트에 의해 대체된다. 없어진 바이러스 기능은 세포주를 포장함으로써 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용된 AAV 벡터는 전형적으로 포장 및 숙주 게놈으로의 통합에 필요한 AAV 게놈으로부터의 반전된 말단 반복부 (ITR) 서열만을 가진다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 암호화하지만, ITR 서열이 없는 헬퍼 플라스미드를 함유한 세포주에서 포장된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터의 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 부족으로 인해 유의한 양으로 포장되지 않는다. 아데노바이러스로의 감염은, 예컨대 아데노바이러스가 AAV보다 민감한 열 치료에 의해 감소될 수 있다.
많은 유전자 요법 적용에서, 유전자 요법 벡터가 특정 조직 유형에 대한 고도의 특이성으로 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 바이러스의 외면에서 바이러스 코트 단백질을 가지는 융합 단백질로서 리간드를 발현시킴으로써 주어진 세포 유형에 대한 특이성을 갖도록 변형될 수 있다. 리간드는 관심의 세포 유형에서 존재하는 것으로 알려진 수용체에 대한 친화도를 갖도록 선택된다. 예를 들어, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)에는 몰로니(Moloney) 마우스 백혈병 바이러스가 gp70에 융합된 인간 헤레굴린을 발현하도록 변형될 수 있고, 재조합 바이러스는 인간 상피 성장 인자 수용체을 발현하는 특정 인간 유방암 세포를 감염시킨다고 보고된다. 이런 원리는 표적 세포가 수용체를 발현하고 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 다른 바이러스-표적 세포 쌍에도 연장될 수 있다. 예를 들어, 필라멘트상 파지는 실제로 임의의 선택된 세포 수용체에 대한 특정 결합 친화도를 가지는 항체 단편 (예컨대, FAB 또는 Fv)을 나타내도록 조작될 수 있다. 비록 상기 설명이 주로 바이러스 벡터에 적용되지만, 동일한 원리가 비바이러스 벡터에 적용될 수 있다. 그러한 벡터는 특정 표적 세포에 의한 흡수를 선호하는 특이적 흡수 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.
유전자 요법 벡터는 개별적인 환자에 대한 투여에 의해, 하기에서 기술되는 것과 같이, 전형적으로 전신성 투여 (예컨대, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척수강내, 뇌수조내, 뇌실내, 또는 해마, 피질, 선조체와 같은 뇌의 임의의 영역으로의 주사를 포함한 뇌로의 직접 주사를 포함한 두개내 주입, 등)에 의해 또는 국소 적용에 의해 생체내에서 전달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 생체외로, 예컨대 개별적인 환자로부터 외식된 세포 (예컨대, 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검) 또는 보편적 도너 조혈 줄기 세포에 전달되고, 이어서 대개는 벡터를 통합시키는 세포에 대한 선택 후에, 세포의 환자로의 재이식이 이루어질 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 (예컨대, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 단백질)은 생체내에서 직접 전달된다. 조성물 (세포, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 단백질)은, 한정하는 것은 아니지만 뇌 또는 척수로의 직접 주사를 포함하여, 중추 신경 시스템 (CNS)에 직접 투여될 수 있다. 한정하는 것은 아니지만, 해마, 흑질, 마이네르트 기저핵 (nucleus basalis of Meynert (NBM)), 선조체 및/또는 피질을 포함한 뇌의 하나 이상의 구역이 표적화될 수 있다. CNS 전달에 대해 대안적으로 또는 그에 더불어 조성물은 전신적으로 투여될 수 있다 (예컨대, 정맥내, 복강내, 심장내, 근육내, 피하, 척수강내, 뇌수조내, 뇌실내 및/또는 두개내 주입). 본원에 기술된 조성물의 대상체로의 직접적인 전달 (CNS로의 직접 전달을 포함함)을 위한 방법 및 조성물로는, 한정하는 것은 아니지만, 바늘 어셈블리를 통한 직접 주사 (예컨대, 정위적 주사(stereotactic injection))를 들 수 있다. 그러한 방법은, 예를 들어, 뇌로의 조성물 (발현 벡터를 포함함)의 전달에 관한 미국 특허 제 7,837,668호 및 8,092,429호 및 미국 특허출원 공개공보 2006/0239966 (본원에 그 전문이 참조로 포함됨)에서 기술된다.
투여될 유효량은 환자마다 및 투여 방식과 투여 부위에 따라 다를 것이다. 따라서, 유효량은 조성물을 투여하는 의상 의해 가장 잘 결정되며 적절한 투여량이 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 통합 및 발현에 대해 충분한 시간 (정형적으로, 예를 들면 4 내지 15일)이 허용된 후, 치료용 폴리펩타이드의 혈청 또는 다른 조직 수준의 분석 및 투여 전의 초기 수준과의 비교는 투여되는 양이 너무 낮은지, 정확한 범위 내에 있는지 또는 너무 높은지를 측정할 것이다. 초기 및 후속되는 투여에 대한 적합한 양생법은 또한 가변적이지만, 초기 투여와 이어서 필요하다면 후속 투여가 전형적이다. 후속 투여는 가변적인 간격으로, 매일 내지는 연간 내지 수년마다의 범위로 투여될 수 있다.
아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 ZFP를 직접 인간 뇌에 전달하기 위하여, 선조체당 1x1010-5x1015 (또는 그 사이의 임의의 값) 벡터 게놈의 용량 범위가 적용될 수 있다. 주지된 것과 같이, 투여량은 다른 뇌 구조에 대해 및 상이한 전달 프로토콜에 대해 다를 수 있다. AAV 벡터를 직접 뇌에 전달하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 미국 특허 제 9,089,667호; 9,050,299호; 8,337,458호; 8,309,355호; 7,182,944호; 6,953,575호; 및 6,309,634호 참조.
진단, 조사, 또는 유전자 요법 (예컨대, 트랜스펙션된 세포의 숙주 유기체로의 재주입을 통한)을 위한 생체외 세포 트랜스펙션은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 바람직한 구체예에서, 세포는 대상 유기체로부터 분리되고, 적어도 하나의 tau 조절제 (예컨대, 리프레서) 또는 그것의 성분으로 트랜스펙션되고, 대상 유기체 (예컨대, 환자)로 되돌아 재주입된다. 바람직한 구체예에서, tau 조절제 (예컨대, 리프레서)의 하나 이상의 핵산은 AAV9를 사용하여 전달된다. 다른 구체예에서, tau 조절제 (예컨대, 리프레서)의 하나 이상의 핵산은 mRNA를 사용하여 전달된다. 또한 바람직한 것은 번역 효율 및/또는 mRNA 안정성을 증가시키기 위한 캡핑된 mRNA의 사용이다. 특히 바람직한 것은 ARCA (항-반전 캡 아날로그) 캡 또는 그것의 변종이다. 미국 특허 제 7,074,596호 및 8,153,773호 (그 전문이 참조로 본원에 포함됨) 참조. 생체외 트랜스펙션에 적합한 다양한 세포 유형에 당업자들에게 잘 알려져 있다 (예컨대, Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994) 및 환자로부터 세포를 분리하고 배양하는 방법의 논의에 대하여 이 문헌에서 인용된 참고문헌들 참조).
한 구체예에서, 줄기 세포가 세포 트랜스펙션 및 유전자 요법에 대한 생체외 과정들에서 사용된다. 줄기 세포를 사용하는 장점은 그것들이 시험관내에서 다른 세포 유형으로 분화할 수 있거나, 또는 그것들이 골수에서 접목될 포유류 (예컨대 세포의 도너)로 도입될 수 있다는 것이다. 시험관내에서 CD34+ 세포를 사이토킨, 예컨대 GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α를 사용하여 임상적으로 중요한 면역 세포 유형들로 분화시키는 방법은 알려져 있다 (Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992) 참조).
줄기 세포는 공지된 방법을 사용하여 형질유도 및 분화를 위해 분리된다. 예를 들어, 줄기 세포는 골수 세포로부터 골수 세포를 원하지 않는 세포, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ (T 세포), CD45+ (panB 세포), GR-1 (과립구), 및 Iad (분화된 항원 제공 세포)에 결합하는 항체들로 패닝시킴으로써 분리된다 (Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992) 참조).
변형된 줄기 세포는 또한 일부 구체예에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포자멸사에 대해 내성으로 만들어진 뉴런 줄기 세포는 줄기 세포가 또한 발명의 ZFP TF를 함유하는 치료 조성물로서 사용될 수 있다. 세포자멸사에 대한 내성은 예를 들어, 줄기 세포에서 BAX- 또는 BAK-특이적 TALEN 또는 ZFN (미국 특허 제 8,597,912호 참조)을 사용하여 BAX 및/또는 BAK를 녹아웃시킴으로써, 또는 카스파제에서 파괴되고, 다시 예를 들어 카스파제-6 특이적 ZFN을 사용하는 것들에 의해 생길 수 있다. 이런 세포들은 tau 유전자를 조절하는 것으로 알려져 있는 ZFP TF 또는 TALE TF로 트랜스펙션될 수 있다.
치료용 ZFP 핵산을 함유한 벡터 (예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포좀, 등)는 또한 생체내에서 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 분자를, 한정하는 것은 아니지만, 주사, 주입, 국소 적용 및 전자천공을 포함한, 혈액 또는 조직 세포와 궁극적인 접촉으로 몰아가기 위해 정상적으로 사용되는 경로들 중 임의의 경로에 의해 이루어진다. 그러한 핵산을 투여하는 적합한 방법은 활용 가능하고 당업자들에게 잘 알려져 있지만, 한 가지 이상의 경로가 특정 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있고, 특정 경로는 종종 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
DNA의 조혈 줄기 세포 안으로 도입하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 제 5,928,638호에 개시된다. 형질전환 유전자를 조혈 줄기 세포, 예컨대, CD34+ 세포 안으로 도입하기에 유용한 벡터로는 아데노바이러스 타입 35를 들 수 있다.
형질전환 유전자의 면역 세포 (예컨대, T-세포)로의 도입에 적합한 벡터로는 비-통합 렌티바이러스 벡터를 들 수 있다. 예를 들어, Ory et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al., (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al., (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al., (2000) Nature Genetics 25:217-222 참조.
제약학적으로 허용되는 담체는 부분적으로는 투여되는 특정 조성물에 의해, 뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용된 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 하기 기술되는 것과 같이, 활용 가능한 제약학적 조성물의 광범위한 적합한 제제가 있다 (예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989 참조).
상기에서 주지된 것과 같이, 개시된 방법 및 조성물은, 한정하는 것은 아니지만, 원핵 세포, 진균 세포, 고세균 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 척추동물 세포, 포유류 세포 및 인간 세포를 포함한 임의의 유형의 세포에서 사용될 수 있다. 단백질 발현에 적합한 세포주는 당업자들에게 알려져 있으며, 한정하는 것은 아니지만 COS, CHO (예컨대, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (예컨대, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, 곤충 세포, 예컨대 스포도프테라 퍼기페르다 (Spodoptera fugiperda (Sf)), 및 진균 세포, 예컨대 맥주효모균 (Saccharomyces), 피스치아 (Pischia) 및 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces)를 포함한다. 이런 세포주들의 자손, 변종 및 유도체들 또한 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 방법 및 조성물은 직접 뇌에, 예를 들어 선조체로 전달된다.
CNS 장애의 모델
CNS 장애에 대한 연구는 비-인간 영장류와 같은 동물 모델 시스템에서 (예컨대, 파킨슨병 (Johnston and Fox (2015) Curr Top Behav Neurosci 22: 221-35); 근위축성 축삭 경화증 (Jackson et al., (2015) J. Med Primatol: 44(2):66-75), 헌팅턴병 (Yang et al., (2008) Nature 453(7197):921-4); 알츠하이머병 (Park et al., (2015) Int J Mol Sci 16(2):2386-402); 발작 (Hsiao et al., (2016) E Bio Med 9:257-77)), 개에서 (예컨대 MPS VII (Gurda et al., (2016) Mol Ther 24(2):206-216); 알츠하이머병 (Schutt et al., (2016) J Alzheimers Dis 52(2):433-49); 발작 (Varatharajah et al., (2017) Int J Neural Syst 27(1):1650046)) 및 마우스에서 (예컨대, 발작 (Kadiyala et al., (2015) Epilepsy Res 109:183-96); 알츠하이머병 (Li et al., (2015) J Alzheimers Dis Parkin 5(3) doi 10:4172/2161-0460)) 수행될 수 있다 (리뷰: Webster et al., (2014) Front Genet 5 art 88, doi:10.3389f/gene.2014.00088). 이런 모델들은 이것들이 질환의 특이적 증상 세트를 조사하는 데 유용할 수 있기 때문에 CNS 질환을 완전하게 되풀이하는 동물 모델이 없을 때에도 사용될 수 있다. 모델은 본원에 기술된 치료 방법 및 조성물 (유전자 리프레서)의 효능 및 안전성 프로파일을 측정하는데 도움이 될 수 잇다.
적용
본원에 기술된 MAPT-결합 분자 (예컨대, ZFP, TALE, CRISPR/Cas 시스템, Ttago, 등)를 포함하는 본원에 기술된 Tau 조절제 (예컨대, tau 리프레서), 및 그것들을 암호화하는 핵산은 다양한 적용에 대해 사용될 수 있다. 이러한 적용으로는 MAPT-결합 분자 (DNA-결합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함함)가 바이러스 (예컨대, AAV) 또는 비바이러스 벡터를 사용하여 대상체에게 투여되고 그 대상체 내에서 표적 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용되는 치료 방법을 들 수 있다. 조절은 억압의 형태, 예를 들어, AD 질환 상태에 기여하는 tau 발현의 억압일 수 있다. 대안적으로, 조절은 발현의 활성화 또는 내인성 세포 유전자의 증가된 발현이 질환 상태를 개선할 수 있을 때 활성화 형태일 수 있다. 또 추가의 구체예에서, 조절은 MAPT 유전자의 비활성화를 위한 절단 (예컨대, 하나 이상의 뉴클레아제에 의한)에 의한 억압일 수 있다. 상기 주지된 것과 같이, 그러한 적용을 위해, MAPT-결합 분자, 또는 보다 전형적으로, 그것들을 암호화하는 핵산이 제약학적 조성물로서 제약학적으로 허용되는 담체로 제제화된다.
MAPT-결합 분자, 또는 그것들을 암호화하는 벡터는 단독으로 또는 다른 적합한 구성요소들 (예컨대, 리포좀, 나노입자 또는 당업계에 알려져 있는 기타 구성요소들)와 조합하여 흡입을 통해 투여될 에어로졸 제제 (즉, 그것들은 "분무될" 수 있음)로 만들어질 수 있다. 에어로졸 제제는 가압된 허용된 추진제, 예컨대 다이클로로플루오로메탄, 프로판, 질소, 등으로 배치될 수 있다. 비경구 투여, 예컨대 정맥내, 근육내, 피내, 및 피하 경로와 같은 투여에 적합한 제제로는 항산화제, 완충제, 정균제(bacteriostats), 및 제제를 의도된 수령체의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성, 등장성 멸균된 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균된 현탁액을 들 수 있다. 조성물은, 예를 들어, 정맥내 주입에 의해, 경구로, 국소적으로, 복강내로, 방광내로, 안와 뒤로 (RO), 두개내로 (예컨대, 한정하는 것은 아니지만 해마 및/또는 피질을 포함한 뇌의 임의의 영역으로) 또는 척수강내로 투여될 수 있다. 화합물의 제제는 단일 용량 또는 다중 용량 밀봉 용기, 예컨대 앰풀 및 바이알로 제공될 수 있다. 주사 용액 및 현탁액은 앞서 기술된 종류의 멸균된 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다.
환자에게 투여된 용량은 시간이 경과함에 따라 환자에서 유익한 치료 반응을 이루기에 충분해야 한다. 용량은 사용되는 특정 MAPT-결합 분자의 효능 및 Kd, 표적 세포, 및 환자의 상태, 뿐만 아니라 치료되는 환자의 체중 또는 체표면적에 의해 결정된다. 용량의 크기는 또한 특정 환자에서 특정 화합물 또는 벡터의 투여에 수반되는 임의의 불리한 부작용의 존재, 성질, 및 정도에 의해 결정된다.
다음의 실시예들은 MAPT-조절제가 아연 핑거 단백질을 포함하는 본 개시의 예시적인 구체예들에 관련된다. 이것은 단지 예시의 목적을 위한 것이고, 한정하는 것은 아니지만, 조작된 DNA-결합 도메인을 가지는 TALE-TF, CRISPR/Cas 시스템, 추가적인 ZFP, ZFNs, TALEN, 추가적인 CRISPR/Cas 시스템, 호우밍 엔도뉴클레아제 (메가뉴클레아제)를 포함하여, 다른 MAPT-조절제 (예컨대, 리프레서)가 사용될 수 있다는 것이 인정될 것이다. 이런 조절제들은 하기 예시된 표적 부위들에 결합하는 것으로 당업자들에게 공지되어 있는 방법들을 사용하여 쉽게 얻어질 수 있다. 유사하게, 다음의 실시예들은 전달 비히클이 임의의 AAV 벡터인 예시적인 구체예들에 관련되지만 본원에 기술된 tau 리프레서를 전달하기 위해 임의의 바이러스 (Ad, LV, 등)가 사용될 수 LDt다는 것이 분명할 것이다.
실시예
실시예 1: MAPT 리프레서
본질적으로 미국 특허 제 6,534,261호; 미국 특허출원 공개 공보 번호 2015/0056705; 2011/0082093; 2013/0253040; 및 2015/0335708에 기술된 것과 같이 조작된 대략 185개의 아연 핑거 단백질의 스크리닝을 수행하였고 ZFP를 그것들의 MAPT 표적 부위에 결합시켰다. 마우스 MAPT에 표적화된 아연 핑거 단백질 52288, 52322, 52364, 52366, 52389, 57880, 57890 및 65888 (하기 표 1 내지 3 참조)을 추후 연구를 위해 선택하였다. 65888에 대해 열겨된 인산염 접촉 돌연변이는 앞서 기술된 것과 같다 (예컨대 미국 특허 출원 번호 15/685,580 참조). 표 1은 이 ZFP들의 DNA 결합 도메인의 인식 나선들, 및 이 ZFP들의 표적 서열들을 나타낸다. ZFP의 세트 또한 마우스와 인간 유전자 사이에 공유된 MAPT 서열을 표적화하기 위해 만들어졌다. 이것들은 표 2에 나타낸다. 표 3은 부모 ZFP 및 ZFP 골격이 잠재적인 비-특이적 인산염 접촉을 제거하기 위하여 표시된 위치에서 돌연변이되어 있는 유도체 ZFP TF를 나타낸다. ZFP를 표준 SELEX 분석에 의해 평가하였고 그것들의 표적 부위에 결합하는 것으로 나타난다.
Figure pct00002
Figure pct00003
미국 특허 출원 번호 15/685,580에서 기술된 것과 같이 골격 영역에 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, DNA 결합 나선에 대해 위치 (-5), (-9) 및/또는 위치 (-14)에서 만들어진 돌연변이, 예를 들어 R 또는 K의 A, L, S, N, E, Y 또는 Q로의 돌연변이)를 포함하는 ZFP를 또한 제조하였다 (예컨대, 표 1 내지 3의 65888, 57930, 65918, 65920, 65894, 57947, 65,968, 65887, 65860 및 65976). 본원에 기술된 모든 ZFP는 ZFP-TF를 형성하기 위해 KRAB 억압 도메인에 작동 가능하게 연결되었고 모두 MAPT 발현을 억압하였다.
예시적인 ZFP TF를 마우스 Neuro2a 세포 또는 일차 마우스 피질 뉴런으로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 총 RNA를 추출하였고 MAPT 및 두 개의 참조 유전자 (ATP5b, RPL38)의 발현을 실시간 RT-qPCR을 사용하여 모니터링하였다. 도 1에서 나타낸 것과 같이, ZFP-TF는 MAPT 발현을 다양한 용량-반응 및 MAPT 억압 활성으로 억압하는 데 효과적인 것으로 나타났다 (도 1B 참조).
ZFP-TF tau 리프레서를 골결 영역에 대한 돌연변이들을 포함하도록 조작하였다. 표 3은 예시적인 ZFP-TF 리프레서들 (및 그것들의 부모 화합물)을 나타낸다. 이런 최적화된 ZFP TF로 얻어진 결과 (예컨대 65888을 57880과 비교하여 나타낸 예시적인 결과)는 일차 뉴런의 활성에 영향을 미치지 않으면서 극적으로 개선된 특이성 (10배 이상)을 증명하였다 (tau 억압, 도 1B 참조). 추가로, 57880 부모의 두 유도체, 65887 및 65888을 Neuro2A 세포에서 BOD1 및 MOSPD1 오프 표적에 대한 억압 활성에 대해 테스트하였고 (도 1D 참조), 이때 ZFP 골격에 인산염 접촉 돌연변이를 포함한 단백질들에 의한 표적 외 억압이 감소하였다. 또한, 미국 특허 출원 번호 15/685,580 참조.
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실시예 2: 마우스 뉴런에서 Tau 억압
모든 ZFP 리프레서를 발현을 구동하기 위하여 CMV 프로모터를 사용하여 rAAV2/9 벡터로 클로닝하였다. 바이러스를 HEK293T 세포에서 생성시키고, CsCl 밀도-구배를 사용하여 정제하고, 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 실시간 qPCR에 의해 적정하였다. 정제된 바이러스를 사용하여 배양된 일차 마우스 피질 뉴런을 3E5, 1E5, 3E4, 및 1E4 VG/세포에서 감염시켰다. 7일 후에, 총 RNA를 추출하고 MAPT 및 2개의 참조 유전자 (ATP5b, EIF4a2)의 발현을 실시간 RT-qPCR을 사용하여 모니터링하였다.
도 1C에서 나타낸 것과 같이, AAV 벡터를 암호화하는 모든 ZFP-TF는 광범위한 감염된 용량에 걸쳐 마우스 MAPT를 효과적으로 억압하고, 이때 일부 ZFP는 표적을 다중 용량에서 95% 이상 감소시키는 것으로 나타났다. 대조적으로, 동등한 용량에서 테스트된 rAAV2/9 CMV-GFP 바이러스, 또는 mock-처리된 뉴런에 대해 MAPT 억압은 관찰되지 않았다 (도 1 참조).
CMV-52389-KRAB를 암호화하는 rAAV2/9를 사용하여 마우스 피질 뉴런을 3E5, 1E5, 및 3E4 VG/세포에서 감염시켰다. 10일 후에, 총 단백질을 한 세트의 복제물로부터 추출하였다; 병행 감염 그룹을 총 RNA 추출에 대해 사용하였다. 동일한 양의 총 세포 용해물을 웨스턴 블롯에 의하여 총 tau 단백질 (항-tau-5), 52389-KRAB (항-ZNF10), 및 GAPDH (항-GAPDH)에 대해 프로빙하였다 (도 2A 참조). 정량적 형광을 LiCOR Odyssey 시스템을 사용하여 측정하였고, mock-처리된 뉴런에 비교하여 3E5 VG/세포 용량에서 98% tau 단백질 감소가 나타났다 (도 2 참조). MAPT, 52389-KRAB, 및 2개의 참조 유전자 (ATP5b, EIF4a2)의 발현을 실시간 RT-qPCR을 사용하여 모니터링하였다. MAPT 전사물 수준은 mock-처리된 뉴런에 비교하여 3E5 VG/세포 그룹에서 98% 감소하였다 (도 2 참조).
그러므로, 표 1 및 2에 나타낸 것과 같이 표적 부위에 결합하는 것들을 포함한, 본원에 기술된 유전자 조절제 (예컨대, 리프레서)는 플라스미드, mRNA 형태, Ad 벡터 및/또는 AAV 벡터에서 제제화될 때 기능성 리프레서였다.
실시예 3: MAPT 억압의 특이성
표 1 및 2에 나타낸 ZFP-TF들의 전반적인 특이성을 마우스 Neuro2A 세포에서 마이크로어레이 분석에 의하여 평가하였다. 간단히 설명하면, 300 ng의 ZFP-TF 암호화 mRNA를 생물학적으로 4개 한 세트로 150,000개의 Neuro2A 세포에 트랜스펙션하였다. 24시간 후에, 총 RNA를 추출하고 제조자의 프로토콜 (Affymetrix Genechip MTA1.0)을 통해 처리하였다. 로부스트 멀티-어레이 평균 (RAM)을 사용하여 각 프로브 세트로부터의 미가공 신호를 표준화하였다. 분석을 "유전자 수준 차등 발현 분석" 선택권을 포함한 전사체 분석 콘솔 3.0 (Affymetrix)을 사용하여 수행하였다. ZFP-트랜스펙션된 샘플을 무관한 ZFP-TF (MAPT 표적 부위에 결합하지 않음)로 처리된 샘플과 비교하였다. 변화된 세포를 전사물 (프로브 세트)에 대해 기록하는데, 대조군과 비교하여 평균 신호의 2배를 넘는 차이가 있었고, P-값은 0.05 미만이었다 (일원 변량 분석, 각 프로브 세트에 대해 쌍을 이루지 않은 T-테스트).
도 3에 나타낸 것과 같이, SBS#52322는 MAPT 외에 5개의 유전자를 억압하였고, 3개의 다른 것의 증가를 유발하였다. SBS#52364 및 #52366은 MAPT 외에 4개의 유전자를 억압한 반면, SBS#52389는 MAPT 유전자만의 억압 및 1개 유전자의 증가를 유발하였다. SBS#57880은 MAPT 외에 2개의 유전자를 감소시켰고, 1개 유전자를 증가시켰다. SBS#57890은 MAPT 외에 4개의 유전자를 감소시켰고, 1개 유전자를 증가시켰다. SBS# 52288은 MAPT 외에 124개의 유전자를 억압하였고, 25개 유전자의 발현을 증가시켰다.
ZFP-TF 특이성을 또한, 트랜스펙션에 대해 보다 민감하고 더 높은 효과적인 ZFP-TF 수준에서 특이성을 평가하는 것을 허용하는 일차 인간 섬유모세포에서 평가하였다. 150,000개의 인간 섬유모세포로 트랜스펙션된 300 ng의 ZFP-TF 암호화 mRNA로 구성된 각 치료의 4개의 생물학적 복제물을 사용하였다. 24시간 후에, 총 RNA를 추출하고 제조자의 프로토콜 (Affymetrix Human Primeview)을 통해 처리하였다. 프로세싱 및 분석은 Neuro2A 세포에 대해 기술한 것과 같았다. 중요한 것은, 인간 섬유모세포는 MAPT를 발현하지 않으며, 그러므로 MAPT 수준의 변화는 검출되지 않았다. 이전에 개관된 배수 변화 기준을 기반으로, SBS#52322는 58개의 유전자를 억합하였고 53개의 다른 것에서 증가를 유발하였다. SBS#52364는 43개의 유전자를 억압하였고 25개의 유전자를 증가시켰다. SBS#52366은 63개를 억압하였고 63개의 다른 것에서 증가를 유발하였다. SBS#52389는 어떠한 유전자도 억압하지 못하였고, 13개의 다른 것을 증가시켰다. SBS#57880은 7개의 유전자를 감소시켰고, 2개를 증가시켰다. SBS#57890은 1개의 유전자를 감소시켰고, 2개를 증가시킨 한편, SBS#52288은 594개의 유전자를 억압하는 한편 302개의 유전자의 발현을 증가시켰다 (도 4 참조).
ZFP-TF 특이성을 ZFP-TF의 AAV 전달 후에 추가로 일차 마우스 피질 뉴런에서 평가하였다. 1E5 VG/세포에서 160k 일차 마우스 피질 뉴런으로 감염된 CMV-ZFP-TF를 암호화하는 rAAV2/9로 구성된, 각 치료의 6개의 생물학적 복제물을 사용하였다. 7일 후에, 총 RNA를 추출하고 제조자의 프로토콜 (Affymetrix Genechip MTA1.0)을 통해 처리하였다. 프로세싱 및 분석은 Neuro2A 세포 및 섬유모세포에 대해 기술한 것과 같았다.
이전에 개관된 배수 변화 기준을 기반으로, SBS#52322는 MAPT 외에 80개의 유전자를 억압하였고, 19개의 다른 것의 증가를 유발하였다. SBS#52364는 MAPT 외에 29개의 유전자를 억압하였고, 2개의 유전자를 증가시켰다. SBS#52389는 MAPT 외에 1개의 유전자를 억압하였다. SBS#57880은 MAPT 외에 60개의 유전자를 억압하였고, 3개를 증가하였다. SBS#57890은 MAPT만을 억압하였고, 1개의 유전자를 증가시켰다 (도 5 참조).
아연 핑거 골격으로부터의 잠재적 인산염 접촉의 변형(들) (본원에 기술된 것과 같이, 미국 특허 출원 번호 15/685,580)인 특이성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실험을 또한 수행하였다. 동일한 나선 도메인을 갖지만 (표 3 참조), 65888은 잠재적인 인산염 접촉 아미노산 잔기를 제거하기 위하여 아연 핑거 골격에 돌연변이를 가지는 2개의 예시적인 ZFP tau 억압 단백질 (57880 및 65888)을 비교하였다.
도 5B에 나타낸 것과 같이, 57800에 의해 상향 및 하향 조절된 유전자들의 수 (각각 75 및 110)는 65888 단백질에 의해 현저하게 감소하였고 (tau를 포함하여, 3개는 상향조절되었고 4개는 하향조절됨), 골격 영역에 대한 변형에 의한 증가된 특이성을 증명한다.
실시예 4: CNS-제한된 ZFP-TF 발현에 대한 뉴런 프로모터
3개의 뉴런 프로모터를 일차 마우스 뉴런에서 ZFP-TF를 발현하는 능력에 대해 평가하였다: 인간 시냅신1 프로모터의 469 bp 단편 (SYN1; K
Figure pct00006
gler et al., (2001) Methods Mol Med 53:139-50), 알파-칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 프로모터의 375 bp 단편 (CamKII; Dittgen et al., (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101(52):18206-11), 및 메틸 CpG-결합 단백질 2 프로모터의 229 bp 단편 (MeCP2; Adachi et al., (2005) Hum Mol Genet 14(23):3709-22). 각 단편을 실시예 2에서 사용한 CMV 프로모터 대신 클로닝하였고, rAAV2/9를 두 단백질의 동시 발현을 가능하게 하기 위하여 2A 펩타이드 서열에 의해 연결된 52389-KRAB를 구동시키는 각 프로모터 구성물에 대해 제조하였다 (Nagai et al., (2002) Nat Biotechnol 20(1):87-90 및 M.D. Ryan et al., (1991) J. Gen. Virol. 72 p. 2727).
정제된 바이러스를 사용하여 배양된 일차 마우스 피질 뉴런을 3E5, 1E5, 3E4, 및 1E4 VG/세포에서 감염시켰다. 7일 후에, 총 RNA를 추출하였고 MAPT 및 2개의 참조 유전자 (ATP5b, EIF4a2)의 발현을 실시간 RT-qPCR을 사용하여 모니터링하였다.
모든 프로모터는 ZFP 발현을 초래하였고, 이때 SYN1 및 CamKII는 둘 다 CMV에 유사한 전사물 수준을 달성하였다. 대조적으로, MeCP2는 대략 10배 더 낮은 수준으로 발현되었다. MAPT는 또한 광범위한 감염 용량에 걸쳐 억압되었고, 이때 SYN1은 가장 강력한 반응을 보였으며, 그 뒤를 CAMKII와 CMV가 이었고, 마지막으로 MeCP2가 가장 약한 수준의 MAPT 억압을 보였다. 3E5 VG/세포의 최고 용량에서, 모든 프로모터는 MAPT를 90% 넘게 억압할 수 있었고, 이때 SYN1은 mock-처리된 뉴런에 비교하여 99.4% (약 175배 더 낮음)의 가장 강력한 MAPT 감소를 나타냈다 (도 6A 참조).
정제된 바이러스를 또한 배양된 일차 해마 뉴런 및 샘플을 감염시키기 위하여 사용하였고 피질 뉴런에 대해 기술한 것과 같이 처리하였다. 모든 뉴런 프로모터는 ZFP 발현 및 MAPT 억압을 초래하였고, 이때 일차 피질 뉴런에서 동일한 등급 크기의 활성, 유사한 정도의 억압, 및 용량-반응 프로파일을 관찰하였다 (도 6B 참조).
종합적으로, 이런 결과들은 임의의 뉴런 프로모터가 MAPT-관련 징후에 대한 관심의 일차 영역, 즉 해마 및 피질에서 ZFP 발현 및 MAPT 억압을 이루기에 충분할 것임을 시사한다.
추가로, 강력한 뉴런 프로모터 (예컨대 SYN1 또는 CAMKII)의 사용은, ZFP-TF의 적당한 전달이 제한적이거나 (예를 들어 정맥내 또는 척수강내 전달을 통해), 및/또는 저친화도 ZFP-TF가 표적 외 유전자 조절을 최소화하기 위해 선택되어야 할 때, 고도로 발현된 전사물 표적의 수준을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 역으로, 더 약한 뉴런 프로모터 (예컨대 MeCP2)는 관심의 표적 유전자가 중간 내지 저 수준으로 발현될 때, 표적 영역으로의 충분한 전달이 비제한적일 때 (예를 들어 직접 두개내 전달), 및/또는 고친화도 ZFP-TF의 표적 외 활성을 최소화하기 위해 선택될 수 있다.
실시예 5: iPS-유도된 뉴런에서 인간 MAPT의 억압
본원에 기술된 모든 ZFP의 표준 SELEX 특이성 분석을 기반으로, 표 2 및 3에 열거한 ZFP를 인간 MAPT 서열의 하나 (SBS#57890 및 SBS#52366의 경우에) 또는 2개 (SBS#57880의 경우에)의 비보존 위치에서의 미스매치를 허용할 것으로 예측하였다 (도 7A, SEQ ID NO:31 및 32 참조).
표 2 및 3의 예시적인 ZFP-TF를 실시예4에서 기술한 469 bp SYN1 프로모터 단편을 포함한 AAV 벡터 (AAV6, AAV9 AAV2/9, 또는 그것의 변종)에 클로닝하였다. rAAV 바이러스가 HEK293T 세포에서 생성되었고, 그것을 CaCl 밀도-구배를 사용하여 정제하였으며, qPCR에 의해 적정하였다. 정제된 바이러스를 사용하여 인간 iPS-유도된 뉴런을 3E5, 1E5, 3E4, 및 1E4 VG/세포 (iCell Neurons, Cellular Dynamics International Inc)에서 감염시켰다. 18 또는 19시간 후에, 총 RNA를 추출하였고 인간 MAPT, ZFP-KRAB, 및 3개의 참조 유전자 (ATP5b, EIF4a2, GAPDH)의 발현을 실시간 RT-qPCR을 사용하여 평가하였다. 유사한 수준의 ZFP가 테스트된 용량 범위 전체에서 각 바이러스에 대해 발현되었다.
예시적인 결과를 도 7에 나타낸다. 3E5 VG/세포의 최고 용량에서, mock-감염된 세포에 비교하여 57880-KRAB는 인간 MAPT를 95% 억압하였고, 52366-KRAB는 87% MAPT 감소를 초래하였으며, 57890-KRAB는 MAPT를 45% 저하시켰다 (도 7B 참조). 유사한 결과를 본원에 기술된 다른 전사 인자들에 대해 얻었다 (예컨대, 표 1 내지 3에 나타낸 것과 같은 ZFP-TF들). 마우스 MAPT에 대해 관찰된 거동과 비교하여 - SBS#57890의 감소된 인간 MAPT 억압 활성에 대한 한 가지 설명은 그것의 표적 부위에서의 미스매치에 대한 빈약한 허용성과 일치하는, 그것의 예외적인 게놈-광범위 특이성 정도이다 (실시예 3 참조).
CMV, SYN1, 및 CAMKII 프로모터를 ZFP-TF 52366을 사용하여 ZFP-TF 발현 및 인간 MAPT의 억압에 대해 평가하였다. rAAV2/9를 52366-KRAB를 구동하는 각각의 프로모터 구성물에 대해 제조하고 기술된 인간 iPS-유도된 뉴런을 감염시키기 위해 사용하였다. SYN1 프로모터는 CAMKII (mock의 40%) 및 CMV (mock의 71%)에 비교하여 최고 수준의 ZFP 발현 및 MAPT 감소 (mock-처리된 뉴런의 5%)를 초래하였다 (도 7C 참조).
인간 iPS 유도된 뉴런을 또한 상기에서 기술된 것과 같이 마이크로어레이 분석을 수행하여 19,959개의 코딩 전사물 집단에서 표적 외 억압의 양을 분석하였다. 각각의 경우에, ZFP-TF를 앞서 개관된 배수 변화 기준을 기반으로 65976 단백질과 비교하였고, 도표는 테스트 ZFP-TF에 대한 프로파일의 변화를 나타낸다 (도 7D). 결과는 여러 인간 tau ZFP-TF가 인간 뉴런에서 고도로 특이적인 것을 나타낸다.
실시예 6: 생체내에서 AAV-전달된 ZFP TF에 의해 구동된 MAPT 억압
본원에 기술된 다양한 ZFP-TF를, 생체내에서 MAPT의 억압을 평가하기 위하여 다양한 상이한 AAV 벡터를 사용하여 마우스 해마에 전달하였다. Tau 리프레서를 암호화하는 AAV를 57890.T2A.Venus로 정맥내로 (IV) 또는 뇌실내로 (ICV) 또는 정위적 주사에 의해 두개내로 투여하였다.
간단히 설명하면, AAV 2/9에 대하여, 반구당 rAAV2/9-CMV-ZFP-TF의 8E9 VG의 총 용량을 정위적 주사에 의해 이중, 양쪽 2 μL 주사를 통해 투여하였다. 미국 특허 제 9,585,971호에 기술된 AAV 벡터에 대해, AAV 벡터를 뇌실내로 (ICV) 또는 정맥내로 (IV) 1E12의 총 용량으로 투여하였다. 미국 가특허 출원 번호 62/503,121에 기술된 AAV 벡터를 ICV로 1E12 vg로 또는 IV의 경우 2E12 vg/동물로 투여하였다.
동물들을 주사 후 4주 (IV 및 ICV) 또는 5주 (IC) 후에 희생시켰다. IV 및 ICV 처리된 동물의 경우, 우반구를 RT-qPCR 분석을 위해 다양한 뇌영역으로 해부하고, 좌반구를 조직학에 사용하였다. IC 처리된 동물의 경우, 각각의 해마를 RT-qPCR 분석을 위해 3조각으로 절개하였다 (A, 전방; B, 중간; C, 후방 해마). MAPT 및 ZFP-TF 발현을 또한 실시간 RT-qPCR에 의해 분석하고 3개의 하우스키핑 유전자 (ATP5b, EIF4a2 및 GAPDH)의 기하학적 평균에 대해 표준화하였다.
데이터는 AAV 벡터가 뇌실내로 또는 정맥내로 투여되었을 때 뉴런 표적을 효과적으로 형질전환시켰고 ZFP-TF는 CNS 전체에서 (전두 피질, 전방 피질, 후방 피질, 해마, 뇌간, 선조체, 시상, 중뇌, 소뇌, 요추 척수, 흉부 척수 및 경부 척수에서를 포함한, 뇌 및 척수에서) 강력하고 지속적인 tau 감소를 초래한 것을 보여주었다. 도 8A 내지 8C는 AAV9 (도 8B에서 "9")와 비교하여 62/503,121에서 기술된 AAV 벡터의 투여 후 ZFP-TF SBS#52322, SBS#52389 및 SBS#57890을 사용한 예시적인 결과 (도 8B에서 "SGMO")를 보여준다. 도 8A에 도시된 현미경 사진을, ICV 전달의 경우 1e11 vg/마우스 및 IV 전달의 경우 2e12 vg/마우스의 용량으로, SGMO 벡터의 전달 후 4주 후에 택하였다. 도 8C는 동일한 실험으로부터 ICV 또는 IV 투여를 통한 단일 투여 후 tau mRNA 수준의 변화를 도시한다. 동일한 결과를 테스트한 모든 추가적인 ZFP-TF에 대해 발견하였다.
도 8D 및 8E는 AAV2/9 벡터를 사용하는 예시적인 결과를 도시하며 해마로의 두개내 전달에 대해, 52389-KRAB 및 52322-KRAB 둘 다 MAPT를 효과적으로 억압할 수 있는 것을 증명하였다 (도 8D 참조). 각 반구에 대해 3개의 슬라이스를 가로지르는 상대적인 ZFP 발현 수준에 의해 적용 범위를 평가하였다. 이런 분석은, 많은 슬라이스가 우수한 적용 범위를 가진 한편으로, 여러 개는 ZFP-TF 발현이 거의 없거나 없는 것을 드러냈고, 두개내 정위적 전달 후에 여러 동물의 경우 해마 전체에서 균일하지 않은 적용 범위를 시사한다 (도 8E 참조). 유사한 결과를 본원에 기술된 다른 ZFP-TF로 얻었다.
게다가, 미국 특허 제 9,585,971호에 기술된 AAV를 사용하여 전달된 본원에 기술된 tau 리프레서는 또한 CNA (척수를 포함함)에서 tau를 유의하게 억압하였다. 예시적인 결과는 도 8F 내지 8H에 도시된다. 본원에 기술된 모든 ZFP-TF에 대해, CNS에서의 억압은 mRNA 단백질 수준에서 모두 신속하였고 시간의 경과에도 지속적이었다. 나아가, tau의 CSF 수준은 뇌 수준과 상관되며 따라서 tau 리프레서 기능의 지표로서 사용될 수 있다 (예시저으로 도 8H 참조).
요약하면, AAV 벡터에 의해 임의의 경로에 의해 전달된, 본원에 기술된 임의의 tau 리프레서는 지속적인 기간 동안 tau를 효과적으로 조절 (억압)한다.
해마에서 ZFP-TF 유도된 MAPT 억압의 정도를 한층 더 이해하기 위하여, 3가지 분석 방법을 사용하였다. 첫째, 치료 그룹의 각 동물로부터의 6개의 모든 슬라이스로부터의 ZFP-TF 및 MAPT 발현 값을 평균을 구하고 변량 분석과 이어서 Sidak 사후 검정에 의해 PBS 그룹과 비교하였다. 52322 (평균 MAPT 감소 66%) 및 52389 (평균 MAPT 감소 55%) 둘 다에 대해 고도로 유의한 (P<0.0001) MAPT 억압을 관찰하였다 (도 9A 참조).
둘째, 최고 수준의 ZFP-TF 발현을 보인 각 동물로부터의 섹션을 확인하고 이상적인 적용 범위 시나리오 하에 평균 최대 tau 감소를 계산하는 데 사용하였다. 다시, 고도로 유의한 (P<0.0001) MAPT 억압을 모든 테스트한 ZFP-TF에 대해 관찰하였다. 도 9B에 도시한 예시적인 결과는 52322 (평균 MAPT 감소 73%) 및 52399 (평균 MAPT 감소 89%)를 사용하여 70%를 넘는 감소를 보여준다.
셋째, MAPT와 ZFP-TF 수준 사이의 상관관계 (본원에서 RT-qPCR 반응에서 ZFP 복사물/RNA 유입 ng의 절대값으로서 표시됨)를 평가하였다. 고도로 유의한 관계를 52322 (P<0.0001, R2 = 0.53) 및 52389 (P<0.0001, R2 = 0.82) 둘 다에 대해 관찰하였다 (도 9C 및 9D 참조).
타우병증의 P301L 돌연변이 인간 tau (P301L) 형질전환 마우스 모델 (rTg4510, Jackson Labs)에서 Tau 감소를 또한 본원에 기술된 유전자 리프레서의 투여 후에 평가한다. 게다가, 리프레서의 임상적 및 치료적 유효성을 이 모델 및 AD의 다른 마우스 모델 (예컨대, APPswe/PS1d9, Jackson Labs)에서 평가하여 다음 중 하나 이상을 포함한 타우병증의 생체마커와 증상의 감소가 있는지를 측정한다: 신경독성, 신경교증, 위축성 신경돌기, 척추 손실, 흥분성독성, 피질 및 해마 수축, 수지상 tau 축적, 인지 (예컨대, 방사형 팔 미로 및 모리스 수중 미로, 공포 조건화, 등), 및 운동 결손. 예컨대, Bryan et al., (2009) Chapter 1: Transgenic Mouse Models of Alzheimer's Disease: Behavioral Testing and Considerations in Methods of Behavior Analysis in Neuroscience . 2nd edition, ed. Buccafusco, Boca Raton (FL): CRC Press/Taylor & Francis 참조. 추가적으로, 화학적으로 유도된 발작 모델, 예를 들어, 펜틸렌테트라졸 (PTZ, 예컨대 Meyers et al., (1975) Epilepsia 16(2):257-67 참조) 또는 카이네이트(kainate) (Ferraro et al., (1997) Mamm Genome 8:200- 208)와 같은 흥분성 독성 화합물로 처리된 야생형 마우스 또한 본원에 기술된 유전자 리프레서의 투여 후 4 내지 8주 후에 평가하여, tau 감소가 발작과 관련된 치사율, 발작에 대한 연장된 잠복기, 및/또는 발작 중증도의 감소를 포함한, 발작에 대한 보호 효과를 부여하는지를 측정한다.
본원에 기술된 Tau 조절제 (예컨대, 리프레서)를 본원에 기술된 비바이러스 또는 바이러스 (예컨대, AAV) 벡터를 사용하여 직접 뇌로, 예를 들어 두개내 주사에 의해 해마 또는 피질로, 뇌실내 또는 정맥내 전달에 의하여 전달하였다. 리프레서의 투여 후 일정 시간 (리프레서 투여 후 1 내지 11개월) 후에, 뇌를 수득하고, 섹션을 만들고 면역조직화학 분석 및/또는 영상화 분석 (예컨대, 2-광자 영상화)을 수행하여 뉴런 생존율, 신경교증, 위축성 신경돌기, 척추 밀도, 피질 및 해마 두께, tau mRNA 발현 및 tau 단백질 수준을 평가하였다.
리프레서를 받은 마우스들은 ZFP 리프레서의 투여 후 8주 후에 ZFP 발현 뉴런에서 80 내지 90% 또는 그 이상의 tau (mRNA 및 단백질)의 억압을 보였다. 장기간 (6개월) tau 녹다운 후에 유의한 뉴런 손실 또는 상승된 신경교증은 볼 수 없었다. 마우스 tau 억압 또한 신경돌기 위축에 대해 보호하였다. 그러므로, 본원에 기술된 tau 조절제 (예컨대, 리프레서)는 생체내에서 타우병증 대상체에게 임상적 및 치료적 이익을 제공한다.
실시예 7: 뉴런 프로모터로부터 발현된 AAV-전달된 ZFP TF에 의해 구동된 생체내 MAPT 억압 및 단백질 녹다운
실시예 5에서 기술된 CMV, SYN1, CAMKII, 또는 MeCP2 프로모터에 의해 구동된, 본원에 기술된 ZFP-TF 2A-Venus 구성물을 암호화하는 재조합 AAV 벡터를 마우스 해마에 전달하여 생체내에서 MAPT mRNA 및 단백질 감소를 평가하였다. 간단히 설명하면, 반구당 2.4E10 VG의 총 용량을 정위적 주사에 의해 다 자란 야생형 마우스에 이중, 양쪽 1.5 μL 주사를 통해 투여하였다. 동물들을 주사 후 6주 후에 희생시키고 각 해마를 면도날로 미세하게 균등화한 후, 결과적으로 얻어진 조직을 2개의 동등한 양으로 분배하였다. 이분의 일을 mRNA 분석을 위해 택하였는데, MAPT, ZFP-TF, GFAP, 및 IBA1 발현을 실시간 RT-qPCR에 의해 분석하고 3개의 하우스키핑 유전자 (ATP5b, EIF4a2 및 GAPDH)의 기하학적 평균에 대해 표준화하였다. 다른 절반을 ELISA에 의한 정량적 tau 단백질 분석을 위해 택하였고, 예시적인 결과를 도 10에 제시한다. 대조군-처리된 동물들에 비해, tau mRNA는 AAV ZFP-TF의 투여 후 적어도 85% 감소하였다. rAAV9-CMV-52389V의 투여 후 예시적인 결과는 다음과 같았다: rAAV9-SYN1-52389V에 의해 tau 발현의 63% 감소; rAAV9-CAMKII-52389V에 의해 tau 발현의 74% 감소; 및 rAAV9-MeCP2-52389V 구성물에 의해 83% 감소 (모든 프로모터에 대해 P<0.0001). 평균 ZFP 발현은 CAMKII 프로모터를 암호화하는 벡터에 대해 가장 높았고 (1의 값으로 설정함), MeCP2 프로모터에 대해 가장 낮았으며 (CAMKII 수준의 15%), CMV (CAMKII 수준의 59%) 및 SYN1 (CAMKII 수준의 90%) 프로모터에 대해 중간이었다.
소교세포 및 활성화된 성상세포의 존재를 또한 각각 IBA1 및 GFAP에 대한 RT-qPCR 시약을 사용하여 평가하였다. MeCP2 프로모터는 PBS-주사된 동물에 비교하여 IBA1 수준의 유의한 차이를 초래하지 않았고, SYN1은 4.7배 더 높은 IBA1 수준을 초래하였으며 (P<0.0001), CMV는 3.0배 더 높은 수준을 초래하였고 (P<0.05), CAMKII는 3.2배 더 높은 수준을 초래하였다 (P<0.001). 유사하게, MeCP2 프로모터는 PBS-주사된 동물에 비교하여 GFAP 상승을 초래하지 않았고, SYN1은 4.0배 더 높은 GFAP 수준을 초래하였으며 (P<0.0001), CMV는 3.2배 더 높은 수준을 초래하였고 (P<0.01), CAMKII는 2.4배 더 높은 수준을 초래하였다 (P<0.05).
총 tau 단백질의 로부스트 감소 또한 모든 3개의 뉴런 프로모터 구성물에 대해 관찰되었다 (SBS 52389를 사용한 예시적인 결과는 도 11에 도시함). PBS-주사된 대조군 수준 (269 ng/ml)에 비교하여, rAAV9-SYN1-52389V 구성물은 대조군 수준의 23%를 초래하였고 (61 ng/ml, P<0.0001), rAAV9-CAMKII-52389V 구성물은 대조군 수준의 18%를 생성하였으며 (49 ng/ml, P<0.0001), rAAV9-SYN1-52389V 구성물은 대조군 수준의 12%를 나타냈다 (32 ng/ml, P<0.0001). 유사하거나 높은 수준의 감소는 본원에 기술된 다른 ZFP-TF들 (예컨대, 57890, 65894, 57930, 65918, 65920, 57880, 65887, 65888, 57947, 65968, 52322, 52364, 52366, 52288, 52389 및/또는 65860)로 얻어진다.
그러므로, 뉴런 프로모터는 하우스 해마 전체에서 80%를 넘는 tau mRNA 및 단백질 감소를 구동시킬 수 있다.
실시예 8: 해마 및 연결된 뇌 영역 전체에서 tau 감소의 조직학적 증거
본원에 기술된 인공 전사 인자를 마우스 해마에 전달하여 면역형광 염색에 의해 생체내에서 tau의 억압을 평가하였다. 총 용량 2.4E10 VG의 rAAV-CMV-ZFP-TF (rAAV2/9, rAAV6, 등)를 정위적 주사에 의해 이중, 일측 1.5 μL 주사를 통해 다 자란 야생형 마우스에 투여하였다. ZFP-TF를 형광 Venus 단백질에 결합시켜서 TF 발현의 위치를 확인하였다. 동물을 주사 후 6주 후에 희생시키고 전뇌를 수집하고 표준 방법을 사용하여 핵 (DAPI), tau 및 GFP에 대한 조직학적 염색을 위해 섹션을 만들었다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 또한 수행하였다. 간단히 설명하면, AAV ZFP-dVenus 형질도입된 세포에서 tau 녹다운 효율을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 제조자의 매뉴얼에 따라 파파인 분리 키트 (Worthington Biochem. Corp.)를 사용하여 AAV CMV ZFP-dVenus를 주사한 해마를 분리한 후 유동 세포분석기 (Miltenyi MACSQuant VYB Flow Cytometer)를 사용하여 세포 현탁액을 분석하였다. 동일한 샘플 중의 dVenus 또는 GFP 발현 세포를 그런 다음 FACS에 의하여 녹색 488 nm 레이저 (BioRadS3 세포 분류기; 샘플 당 30k 내지 50k GFP 양성 세포)를 사용하여 분리하였다. 분류 후에, 세포를 원심분리에 의해 10분 동안 1,000x g에서 회전시키고, RNA 분석을 위해 100 μl RNA (ThermoFisher)에 재현탁하였다.
예시적인 결과를 도 12에 도시한다 (rAAV2/9-CMV-ZFP-TF SBS #52389로 주사한 동물). 도 12A는 전방 해마를 통한 마우스 뇌의 단면을 도시하며 박스로 나타낸 4개의 영역을 확인하고 1 내지 4의 번호를 매긴다. 주사를 좌반구 (동측쪽)에 놓았고, 단면의 좌측에 더 높은 형광을 초래한다. 후속 패널들은 이런 박스들의 각각의 확대 영상이다. 박스들은 하기에서 기술한다:
박스 1 (도 12B)은 ZFP-TF 발현이 동측 및 반대쪽 반구 사이에서 분명하게 경계를 이루고 있는 후뇌량팽대 피질(retrosplenial cortex)을 가로지르는 형광 세기의 정량화를 나타낸다. 도 12B의 좌측 패널에서, 형광 신호는 반대쪽 ("contra")에서보다 중앙선의 동측 쪽 ("ipsi")에서 더 높았다. 여기서 ZFP 발현은 해마 축삭돌기 투영으로부터 발생하는 가능성이 있다. 패널의 우측에서 신호의 대부분은 핵의 DAPI 염색으로 인한 것이었다. 중간 영상은 항-Tau 태그된 항체로의 전체 형광을 보여주는데, 패널의 동측 (좌측) 쪽에서의 신호는 거의 모두 GFP 신호로 인한 것이었던 한편으로 패널의 반대쪽 (우측)에서의 신호는 대부분 Tau의 존재 및 기저의 DAPI 염색으로 인한 것이었다. 도 12B의 우측 패널은 tau 신호의 정량화를 위해 분석했던 단면 박스를 나타낸다 (도 12C에서 도시됨). 숫자는 주사된 (처리된) 쪽으로부터의 감소된 tau-특이적 형광을 나타낸다 ("ipsi" 대비 "contra").
박스 2, 도 12D (동측) 및 박스 3, 도 12E (반대쪽)는 반대쪽에 대비된 동측 (처리된) 쪽에서의 tau 감소를 보여주는 해마로부터의 영상들이고, tau 녹다운은 특히 동측에 대비하여 반대쪽에서 치아 이랑(dentate gyrus)에서 분명하였다 (화살표로 표시됨).
박스 4는 동측 쪽에서의 중점적인 ZFP 발현 (상부 패널은 GFP 형광을 나타냄, 좌측 타원형)이 있었고 대량의 tau 형광 (하부 패널)은 총 tau 신호의 약 50% 감소를 보여주는 시상하부 영역이다 (동측 쪽과 반대쪽 사이의 그래프 참조). 유사한 결과를 표 1, 2 및 3에서 기술된 것과 같은 ZFP-TF를 포함하는 AAV 구성물을 사용하여 얻는다.
그러므로, 본원에 기술된 ZFP-TF는 생체내에서 tau 발현을 억압한다.
실시예 9: 마우스 해마에서 ZFP-TF의 생체내 안전성, tau 감소, 및 지속적인 발현
본원에 기술된 tau 표적화된 인공 전사 인자의 단기간 및 장기간 해마 발현 둘 다의 안전성을 평가하기 위하여, 본원에 기술된 ZFP-TF를 생체내에서 마우스 해마에 전달하여 ZFP 발현뿐만 아니라 성상세포 및 소교세포 반응, 및 전체 해마 해부를 모니터링하였다. 한 실험에서, 2.4E10 VG의 총 용량의 rAAV2/9-CMV-52389-2A-Venus ("389dV"), rAAV2/9-CMV-ZFP-TF ("389"), rAAV2/9-CMV GFP ("GFP"), 또는 PBS ("PBS")를 이중, 일측 1.5 μL 주사를 통해 다 자란 야생형 마우스에 정위적 주사에 의해 투여하였다. 두 집단을 주사 후 6주째에 또는 6개월째에 희생시켰고, 전체 뇌를 수집하고 표준 방법을 사용하여 핵 (DAPI), GFP, GFAP (활성화된 성상세포를 검출하기 위함), 및 IBA1 (소교세포를 검출하기 위함)에 대한 조직학적 염색을 위해 섹션화하고 그 결과를 도 13에 나타낸다. 도 13H는 주사 후에 tau가 해마의 전방 및 후방 영역 둘 다에서 억압된 것을 증명하는 해마의 두 영역의 형광을 묘사하는 영상을 포함한다.
해마에서 형질도입된 세포에 대한 신호를 묘사하는 6주 시점에 대해 (도 13A), ZFP-TF에 대한 신호는 거의 ZFP 벡터에 대한 것과 동일하다. 도 13B는 성상세포에 대한 결과를 나타내며 또한 해마 소표세포에서 또한 볼 수 있는 것과 같이, 3가지 치료를 가로질러 거의 동일한 결과를 보여준다 (도 13C).
6개월 시점에 대해, 도 13D의 데이터는 6주 시점에서 볼 수 있는 것과 매우 유사한 수준의 GFP 및 ZFP TF 벡터에 대한 형광을 증명하며, 이것은 시간 경과에 따라 해마에서 형질도입된 세포의 양에 큰 변화가 없었음을 시사한다. 도 13E는 또한 상이한 치료들 사이의 신호가 매우 유사하였고 6주 시점과 6개월 시점 사이에 유의할만하게 변화하지 않았음을 보여준다 (도 13B 대비 13E - 두 도면 사이에서 y축의 차이 주의). AAV 벡터로 치료 후 6개월 시점에서 소교세포는 거의 동일하고, PBS 처리된 샘플에서 약간 감소하였다.
평균 CA1 (해마 영역 중 하나) 두께의 측정은 ZFP 발현의 6개월 후에 유의한 변화가 없음을 보여주며 (도 13G), ZFP의 장기간 발현으로부터 명시적인 뉴런 독성이 없음을 증명한다.
추가적인 분석을 단독 PBS 및 2a-Venus에 결합된 52288, 52364 및 52389 구성물을 비교한 것을 제외하고는 상기와 같이 ZFP-TF를 투여하여 수행하였다. 투여 후에, 동물들을 4주째에 희생시켰고, 데이터를 도 13I에 제시한다. 제시된 데이터는 52288 구성물로의 치료가 다른 구성물들과 비교하여 실질적으로 약독화된 벡터 게놈 및 ZFP 발현을 초래하였고, 임의의 유의한 방식으로 tau 발현을 억압하지 않았음을 보여준다. 그러나 GFAP 및 IBA1의 상승된 수준을 초래하였다. ZFP 52364는 52288 구성물보다 더 높은 벡터 게놈 수준 및 ZFP 발현을 보였지만, 유사하게 높은 수준의 GFAP 및 IBA1으로 이어졌고, tau 발현을 유의하게 억압하지 않았다. 대조적으로, 52389 구성물은 GFAP 또는 IBA1 발현에 영향을 미치지 않으면서 tau 발현에 상당한 강하를 유발할 수 있었다.
생체내에서 tau 감소 및 ZFP 52288 및 52364에 대한 상승된 신경염증성 생체마커의 결핍은 Neuro2A 세포, 인간 섬유모세포, 및 일차 뉴런에서 평가된 ZFP 특이성 프로파일과 상관이 있으며 (도 3, 4, 5), 고도로 특이적인 ZFP가 tau 발현을 유의하게 감소시켰고 생체내에서 허용적이었음을 보여준다.
PBS 또는 52389-2a-Venus를 받은 투약 그룹의 일부를 11개월 동안 연장시켰다. tau 억압의 양을 분석하는 것에 더불어, 샘플을 또한 발현된 ZFP의 양의 mRNA 발현 수준, 및 GFAP, IBA1, NeuN, MAP1A, MAP1B, 및 MAP2를 암호화하는 전사물의 양의 임의의 변화에 대해 분석하였다. 간단히 설명하면, 각각의 해마를 면도날로 미세하게 균등화하고, 그 결과로 얻어진 조직을 2개의 동일한 양으로 분배하였다. 이분의 일을 mRNA 분석을 위해 택하였는데, MAPT, ZFP, GFAP, IBA1, NeuN, MAP1A, MAP1B, 및 MAP2 발현을 실시간 RT-qPCR에 의해 분석하고 3개의 하우스키핑 유전자 (ATP5b, EIF4a2 및 GAPDH)의 기하학적 평균에 대해 표준화하였다. 예시적인 결과를 도 13J에 제시하는데, 그것은 또한 비교를 위한 6주 데이터를 포함한다. 데이터는 일반적으로 6주와 11개월 시점 프레임 사에에 분석된 대부분의 데이터 세트에서 큰 차이가 없었음을 증명한다. 그러나 검출된 ZFP 발현의 양에서는 감소가 검출되었다. 3개의 다른 미세소관 관련 단백질 (MAP1A, MAP1B, 및 MAP2)에 대해서는 유의한 보상적 변화가 관찰되지 않았고, 또한 NeuN 수준에서도 어떠한 감소가 없었으며, 이것은 ZFP 전달 후 6개월 후에 평가된 ZFP-처리된 반구에서 해마 부피의 보존과 일치한다. 추가적인 실험을 본원에 기술된 ZFP-TF들을 사용하여 수행하였고 유사한 결과를 얻었다.
그러므로, 결과는, 단일 투여 후에, ZFP 발현은 생체내에서 시간이 경과함에 따라 지속적이고 대상체의 CNS에 독성을 초래하지 않으며, 성인 해마에서 ZFP-매개된 tau 감소는 지속적이고 적어도 11개월 동안 잘 허용되는 것을 증명한다.
또 다른 연구를 C57BL/6 야생형 마우스 (생후 8주령 암컷)를 사용하여 수행하였는데, ZFP-TF를 본원에 기술된 AAV를 사용하여 안와 뒤 전달을 통해 전달하엿다. 동물당 2.5e12 바이러스 게놈 (vg)을 사용하였고 동물들을 10주 후에 희생시켰다. 마이크로어레이 분석을 처리된 마우스로부터의 해마 조직에 대해 수행하였는데, 데이터는 동일한 방식으로 전달된 무관한 ZFP-TF와 비교하여 제시된다. 도 17은 GFP 암호화 AAV로의 치료와 비교하여 tau가 57890V 및 52389V 단백질에 의해 특이적으로 억압되었음을 보여준다. 이런 데이터들은 시험관내에서 관찰된 이런 단백질들의 특이성이 또한 생체내에서도 발견되는 것을 증명한다.
실시예 10: AD의 마우스 모델에서 Tau 감소
연구를 야생형 마우스에서 상기와 같이 시행된 것들 외에 AD의 마우스 모델에서 수행하였다. APP/PS1 마우스 (Li et al., 상기 동일)를 본원에 기술된 ZFP-TF들로 처리하여 이 모델에서 효능을 분석하였다.
간단히 설명하면, 한 실험에서, 4마리의 APP/PS1 마우스 및 2마리의 야생형 대조군을 4.5개월의 연령시점에서 처리하였다. 3 μL의 AAV 조성물을 뇌의 반대족 피질 (CTX)에 도입하는 단일 주사를 수행하였다. 각 마우스의 좌측 CTX에 시냅신1 프로모터에 의해 구동된 GFP에 결합된 ZFP-TF (무관한 ZFP-TF 대조군 ("172"; AAV9 syn1-172v)) 또는 52389 ZFP-TF ("389"; AAV9 syn1-389v)를 포함하는 3 μL의 AAV9를 주었다. 각 마우스의 우측 CTX에는 시냅신1 프로모터에 의해 구동된 RFP 발현 구성물 ("AAV9 syn1-tRFP")을 포함하는 3 μL의 AAV9를 주었다.
치료 후 11주 후에, 생후 7개월령의 마우스를 4% PFA/PBS로 관류하였다. 그런 후 전뇌를 제거하고 2일 동안 4% PFA/PBS로 4℃에서 후-고정시켰다. 그런 후 조직을 30% 수크로오스/PBS 용액에서 저온보호하였다. 50 μm의 두정 섹션을 tRFP, GFP, 및 아밀로이드 베타 ("Aβ")에 대한 면역형광 표지화에 대해 분석하였다. 마우스당 3개의 뇌 섹션을 분석하였고 각 섹션의 3 내지 5장의 영상을 택하였다. 위축성 신경돌기를 Aβ-풍부한 플라크에서 계수하여서 동물당 121 내지 256개 플라크를 분석하였다. AAV9 syn1-389v 처리된 CTX에 대해서는 708개의 플라크를 계수하였고, AAV9 syn1-tRFP CTX에 대해서는 287개를 계수하였다. 예시적인 데이터를 도 14A 내지 14D에 도시하는데, tREP 처리된 피질에 비교하여 52389 ZFP-TF로 처리된 피질에서 Aβ 플라크의 수 당 위축성 신경돌기의 수에 통계적으로 유의한 차리가 나타났다 (도 15 및 16). 대조적으로, 무관한 ZFP-TF로 처리된 동물에서 플라크당 위축증의 차이는 없었다. 게다가, 플라크의 수 및 부피는 처리된 동물에서 및 비처리 동물에서 모두 변화하지 않았다. 추가의 실험을 다른 AAV 벡터, 투여 방식 및/또는 본원에 기술된 ZFP-TF들을 사용하여 수행하였고 유사한 결과를 얻었다.
그러므로, 본원에 기술된 tau 유전자 리프레서는 AD의 공지된 마우스 모델에서의 연구에 의해 나타난 것과 같이, AD와 같은 타우병증에 대한 임상적 및 치료적 이익을 제공한다.
실시예 11: 영장류 뇌에서의 생체내 Tau 감소
영장류 tau-특이적 ZFP-TF를 시노몰구스 원숭이 (M. fascicularis)에서 테스트하여 영장류 (비인간 영장류 (NHP) 모델)에서의 tau 발현의 억압을 관찰하였다. 시노몰구스 원숭이를 스테인레스 메시 마루와 자동 급수 밸브가 장착된 스테인레스 강철 우리에 하우징하였다. 연구는 동물 복지법 규제 (Code of Federal Regulations, Title 9)의 최종 규정의 모든 적용 섹션에 부합한다.
초기 실험을 원숭이의 해마가 적당하게 표적화될 수 있는지를 결정하기 위해 수행한다. 대조군 물품 (Formulation Buffer, PBS 및 0.001% Pluronic F-68, pH 7.1) 및 테스트 물품을 해동하고 연구의 제 1일에 분배하였는데, 테스트 및 대조군 물품을 AAV9-GFP 또는 AAV9-ZFP-TF의 MRI-안내된 전달을 통해 해마로 투여한다.
첫 번째 실험으로, hSYN1 구동된 GFP 유전자를 포함하는 AAV9를 3.84 e11 vg/반구로 좌측 반구에 전달하고 7.68 e11 vg/반구로 우측 반구에 전달한다. GS 동물은 40 μL의 부피의 테스트 물품의 단일 용량을 좌측에 받고 80 μL의 단일 용량을 우측에 받는다. 두 번째 동물은 20 μL의 두 용량을 좌측에 받고, 40 μL의 두 용량을 우측 반구에 받는다. 두 테스트 물품에 대하여, 용량 농도는 9.6e12 vg/mL이다. 14일 후에, 동물들을 희생시키고 뇌를 똑같이 2등분하고 대략 17개의 슬라이스로 나누었다 (각각 3 mm). 해마/내후각 피질 영역을 포함하는 슬라이스들을 사용하여 고유한 GFP 형광 및 GFP 면역조직화학을 분석하였다. 다른 슬라이스들을 사용하여 qRT-PCR을 통한 mRNA 분석을 위해 조직 펀치를 수집하는데, tau 및 하우스키핑 유전자들의 수준을 분석한다. 추가적으로, 일부 펀치를 수집하고 외삽 tau 단백질 분석을 위해 보유한다. 그 결과는 hSYN1 프로모터가 전달 후 해마 영역에서 검출 가능한 GFP 발현을 구동할 수 있음을 보여준다.
두 번째 실험은 뇌에서 GFP 발현 및 위치에 미치는 투여 경로의 영향을 평가하기 위해 수행한다. 이 연구에서, GFP 형질전환 유전자를 SB3 AAV 입자에 의해 운반하고 (미국 가출원 번호 62/503,121 참조), 테스트 물품의 용량 농도는 2.5e13 vg/mL이다. 용량을 뇌실내, 척수강내 또는 정맥내 경로에 의해 투여하고, 용량 부피 (mL/동물)는 각각 대략 1, 1.5 및 10 내지 16이다. 투약 후 14일 후에, 동물들을 희생시키고 뇌를 상기 기술한 것과 같이 똑같이 이등분한다. tau 및 하우스키핑 유전자의 수준을 qRT-PCR에 의하여 분석하는 것에 더불어, 염증과 관련된 유전자들 (GFAP 및 Iba1)을 또한 분석한다. 외삽 연구를 또한 수행하여 뇌 조직 샘플 및 뇌척수액에서의 tau 단백질의 수준을 분석한다. 이런 연구들은 투약 경로가 모두 잘 허용되며 GFP 형질전환 유전자를 해마 영역으로 전달할 수 있음을 보여준다.
계속해서, 시노몰구스 뇌에서 본원에 기술된 인공 전사 인자에 의한 tau 발현의 억압을 분석하기 위한 연구를 수행한다. 본원에 기술된 3개 이상의 ZFP-TF (표 1 내지 3)를 테스트하는데, 3개의 ZFP는 높은 특이성 (표적 외 0) 및 높은 (= 90% 억압) 시험관내 효능을 가지며 (ZFP-TF 1); 중간 특이성 (표적 외 5 내지 10) 및 높은 시험관내 효능을 가지고 (ZFP-TF 2); 높은 특이성 및 중간 (50 내지 60%) 시험관내 효능을 가진다 (ZFP-TF3). 동물들을 1, 3 및 6개월 시점에서 희생시키고 상기에서 기술한 것과 같이 분석한다. 뇌 및 CSF 전체에서 tau의 억압이 관찰되며 유의한 뉴런 손실은 보이지 않는다.
연구들은 tau ZFP-TF 시약이 영장류 뇌에서 tau 발현 (치료적 수준을 포함함)을 억압하는 것을 증명한다.
본원에서 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공개물은 그 전문이 모든 목적에 대해 참조로 본원에 포함된다.
비록 개시가 이해를 분명히 할 목적으로 예시 및 실시예에 의하여 일부 상세하게 제공되었지만, 당업자에게는 다양한 변화 및 변형이 개시의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 실시될 수 있는 것이 분명할 것이다. 따라서, 전술한 설명 및 실시예들은 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
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Claims (16)

  1. 미세소관 관련된 단백질 tau (MAPT) 유전자의 유전자 조절제로서,
    MAPT 유전자의 적어도 12개의 뉴클레오타이드의 표적 부위에 결합하는 DNA-결합 도메인; 및
    전사 조절 도메인 또는 뉴클레아제 도메인
    을 포함하는 유전자 조절제.
  2. 제 1 항에 있어서, DNA-결합 도메인은 아연 핑거 단백질 (ZFP), TAL-이펙터 도메인 단백질 (TALE) 또는 단일 가이드 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 조절제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 전사 조절 도메인은 억압 도메인 또는 활성화 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 조절제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따르는 유전자 조절제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제 4 항에 따르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 전달 비히클.
  6. 제 5 항에 있어서, 유전자 전달 비히클은 AAV 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 비히클.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항에 따르는 하나 이상의 유전자 조절제, 제 4 항에 따르는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제 5 항 또는 제 6 항에 따르는 하나 이상의 유전자 전달 비히클을 포함하는 제약학적 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 유전자 조절제는 뉴클레아제 도메인을 포함하고 유전자 조절제는 MAPT 유전자를 절단하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 절단된 MAPT 유전자로 통합되는 도너 분자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항에 따르는 하나 이상의 유전자 조절제, 제 4 항에 따르는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 제 5 항 또는 제 6 항에 따르는 하나 이상의 유전자 전달 비히클 및/또는 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따르는 제약학적 조성물을 포함하는 분리된 세포.
  11. 대상체에서 MAPT 발현의 조절을 위한 제 1 항 내지 제 3 항에 따르는 하나 이상의 유전자 조절제, 제 4 항에 따르는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 제 5 항 또는 제 6 항에 따르는 하나 이상의 유전자 전달 비히클 및/또는 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따르는 제약학적 조성물의 사용.
  12. 제 11 항에 있어서, MAPT 발현은 억압되는 것을 특징으로 하는 사용.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 대상체에 대한 투여는 뇌실내, 척수강내, 두개내, 정맥내, 안와 뒤 또는 뇌수조내 투여인 것을 특징으로 하는 사용.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 MAPT 발현의 억압은 타우병증을 치료 및/또는 예방하는 것을 특징으로 하는 사용.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 tau의 양은 감소되는 것을 특징으로 하는 사용.
  16. 제 1 항 내지 제 3 항에 따르는 하나 이상의 유전자 조절제, 제 4 항에 따르는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 제 5 항 또는 제 6 항에 따르는 하나 이상의 유전자 전달 비히클, 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따르는 제약학적 조성물 및/또는 사용 설명서를 포함하는 키트.
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