CN116802289A - 用于增加胶原蛋白产量的工程化细胞 - Google Patents

用于增加胶原蛋白产量的工程化细胞 Download PDF

Info

Publication number
CN116802289A
CN116802289A CN202180079689.XA CN202180079689A CN116802289A CN 116802289 A CN116802289 A CN 116802289A CN 202180079689 A CN202180079689 A CN 202180079689A CN 116802289 A CN116802289 A CN 116802289A
Authority
CN
China
Prior art keywords
collagen
genes
tgf
cell
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180079689.XA
Other languages
English (en)
Inventor
蒂姆·约翰·马斯托维奇
迈克尔·菲茨杰拉德
杰西·林恩·吉福德
安德鲁·C·霍洛维茨
梅根·杰恩·鲍威尔
杰弗里·威廉·鲁伯蒂
Original Assignee
东北大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 东北大学 filed Critical 东北大学
Publication of CN116802289A publication Critical patent/CN116802289A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/65—Collagen; Gelatin; Keratin; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/981—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of mammals or bird
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/22—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
    • A61L15/32—Proteins, polypeptides; Degradation products or derivatives thereof, e.g. albumin, collagen, fibrin, gelatin
    • A61L15/325—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
    • A61L26/0009—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form containing macromolecular materials
    • A61L26/0028—Polypeptides; Proteins; Degradation products thereof
    • A61L26/0033—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L33/00—Antithrombogenic treatment of surgical articles, e.g. sutures, catheters, prostheses, or of articles for the manipulation or conditioning of blood; Materials for such treatment
    • A61L33/06—Use of macromolecular materials
    • A61L33/12—Polypeptides, proteins or derivatives thereof, e.g. degradation products thereof
    • A61L33/122—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Botany (AREA)

Abstract

用于增加胶原蛋白产量的细胞通过一种新的CRISPR细胞工程化方法工程化。所述方法可以使用人细胞或甚至从患者体内收集的细胞进行。与非人类细胞产生的胶原蛋白相比，所述细胞产生的胶原蛋白植入人类患者时具有较低的免疫原性风险。还提供了包括化学添加剂的细胞培养基以对胶原蛋白产量产生进一步的正向效应。

Description

用于增加胶原蛋白产量的工程化细胞
交叉引用
本申请要求2020年10月15日提交的，序列号为63/092,433的美国临时申请的优先权，所述申请通过引用全部并入本文。
联邦资助声明-研究或开发
本发明是在美国国立卫生研究院授予的资助号为EY029167的政府支持下完成的。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术
平均而言，美国每年发生3300万例肌肉骨骼损伤，其中50％的损伤涉及肌腱和韧带(如肩袖、前交叉韧带)，并且是由于创伤或退化造成(Wu等人，2017年)。肌腱和韧带是基于胶原蛋白的软组织，受伤后往往无法有效愈合。此外，这些肌腱和韧带损伤的平均报告恢复时间为12周，受损肌腱可能永远不会完全恢复到损伤前状态(nhs.uk/conditions/hand-tendonrepair/recovery/)。为了加快这一漫长的恢复时间，正在开发治疗方法，包括在手术修复这些受损软组织后植入I型胶原蛋白补片。手术补片有助于弥合肌腱末端之间的间隙，避免拉伸受伤组织，使其保持强壮并防止再损伤(orthocarolina.com/media/how-does-a-patch-repair-a-rotator-cuff-tear)。即使在这些手术干预之后，患者的力量或活动能力通常也不会恢复到受伤前的状态。目前，这些补片的I型胶原蛋白源自动物，因此，当植入人类患者时，此类治疗具有显著的免疫系统排斥风险(Vig等人，2019)。一个实例是胶原蛋白修复补片，用于加强肩袖修复。所述补片由源自猪真皮的脱细胞胶原蛋白组成(Yao等人，2005年)。所述补片已显示出优于其他生物材料骨架的前景，但其机械性能不足以修复肌腱或韧带，且用于灭菌和净化补片的制造工艺破坏了胶原蛋白结构(Okeefe等人，2013年)。需要改善胶原蛋白的来源，用于人类患者的组织修复和重建。
发明内容
本技术提供了能够大大提高胶原蛋白产量的工程化细胞，包括人类细胞，以及使用它们获得胶原蛋白的方法，所述胶原蛋白用于治疗疾病且不存在不期望的免疫应答风险。使用本方法，可以从需要胶原蛋白补充剂治疗疾病的患者中获得细胞，然后将其工程化用于产生大量患者自己的胶原蛋白以用于植入，包括自体末端胶原蛋白、自体前原蛋白或自体去端肽胶原蛋白。此外，所述方法可用于同一物种(如人类供体细胞)以产生异体末端胶原蛋白、异体前胶原蛋白或异体去端肽胶原蛋白。细胞工程化过程通过使用CRISPR的基因工程克服胶原蛋白合成途径中的瓶颈，并在细胞生长培养基中任选使用化学添加剂，以刺激胶原蛋白合成中的翻译和转录后修饰。可以使用CRISPR激活(CRISPRa)对角膜成纤维细胞等人类细胞进行基因修饰，以增加一种或多种基因的表达，所述基因用于负责胶原蛋白(包括I型胶原蛋白)的转录、翻译和翻译后加工。所述胶原蛋白可用于，例如，软组织修复的胶原蛋白补片，并可以以当前人类胶原蛋白市场的少量成本生产。此外，本方法提供的胶原蛋白，因为不需要胃蛋白酶提取从而缺乏端肽损伤。由于胶原蛋白可能来自人类来源或来自需要用所述胶原蛋白治疗的患者的细胞，因此需要更少的筛选和纯化步骤。
所述技术的一个方面是能够增强胶原蛋白生物合成的工程化细胞。所述细胞被工程化用于对细胞胶原蛋白生物合成相关的靶基因执行基于CRISPR的激活(CRISPRa)。作为用CRISPRa系统成分转染或转导的结果，细胞表达与转录激活蛋白(dCas9激活剂)融合的核酸内切酶缺陷型Cas9(dCas9)蛋白，并表达对靶基因特异的向导RNA(gRNA)。与相同类型的未工程化细胞相比，所述工程化细胞能够增加胶原蛋白生物合成。作为CRISPRa工程化的结果，细胞的胶原蛋白生物合成率增加，例如，至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍或至少300倍。细胞优选为天然产生所需类型的胶原蛋白的细胞，所述胶原蛋白的生物合成由工程化细胞中的CRISPRa激活。举例来说，所述细胞可以选自任何所需组织或器官的成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、周细胞、造血细胞和纤维细胞。
在所述技术的另一个方面，上述工程化细胞已使用CRISPRa工程化，以增加一种或多种基因的表达，所述一种或多种基因选自COL1A1、COL1A2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。优选地，所述细胞被工程化以在同一细胞中增加这些基因中2种、3种、4种、5种或更多种的表达。例如，所述细胞可以表达gRNA分子，包括SEQ ID NO:1-156中任一条或多条的核苷酸序列。
在所述技术的另一个方面，所述工程化细胞已被工程化用于执行对一种或多种靶向基因的CRISPRa，所述一种或多种靶向基因选自脯氨酰-3-羟化酶家族基因、脯氨酰-4-羟化酶家族基因、赖氨酰羟化酶家族基因、GLT25D1、GLT25D2、Grp78、Grp94、蛋白二硫键异构酶(PDI)家族基因、钙网蛋白、钙连蛋白、亲环素B、肽基脯氨酰顺反异构酶(PPlase)家族基因、亲环素、FK 506结合蛋白(FKBP)基因、亲环素B(CypB)、HSP47、TANG01、SEC13、SEC31和迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)。这些基因表达的增加有助于工程化细胞翻译后加工或分泌胶原蛋白到培养基中。
在所述技术的另一个方面，所述工程化细胞通过CRISPRa被工程化，以增加一种或多种胶原蛋白基因和一种或多种TGFβ基因的表达。优选地，所述细胞还被工程化为增加一种或多种前肽酶基因的表达。每个激活基因的表达可能会增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍或至少300倍。与细胞中的其他激活基因相比，每个单独的激活基因可以以不同程度或相似程度被激活。
关于上述技术方面，所述细胞优选地被工程化以增加一种或多种胶原蛋白基因的表达，所述一种或多种胶原蛋白基因选自COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2和COL5A3。它还可以优选地被激活以增加一种或多种TGF-β基因的表达，所述一种或多种TGF-β基因选自TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。优选地，所述细胞还可以被工程化以增加一种或多种前肽酶基因的表达，所述一种或多种前肽酶基因选自ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
所述工程化细胞优选地含有或产生能够表达缺失核酸内切酶活性的失活或“死亡”Cas9蛋白的mRNA，所述Cas9蛋白与一种或多种转录激活蛋白融合。例如，转录激活剂可选自VP64、p65、Rta(例如，由Epstein-Barr病毒BRLF1编码)、VPR(VP64、p65和Rta的组合)、MS2、HSF1和SAM(MS2、p65和HSF-1的组合)。激活剂SunTag还可被用于激活基因并提供转录激活的荧光信号(Tannenbaum等人(2014))。
本技术的另一个方面是包含上述任何工程化细胞的细胞培养物。所述细胞培养物可以仅包含一种完全相同的单细胞类型，或者它可以包含两种或两种以上不同工程化细胞类型的混合物，或者源自同一细胞或细胞类型，或者源自不同细胞类型。培养物可源自一种或多种细胞，所述细胞从需要胶原蛋白补充的受试者中获得，从而提供了一种产生足够量胶原蛋白的途径，所述胶原蛋白在基因、生物化学和免疫学上与受试者组织的胶原蛋白相同。优选地，所述细胞培养物能够传代至少5次、至少10次、至少20次或至少30次而胶原蛋白生物合成率不产生实质性损失，或者所述细胞培养物已经永生化。
所述技术的另一个方面是一种工程化细胞以提供增强的胶原蛋白生物合成的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供产生胶原蛋白的细胞、编码dCas9激活剂的第一核酸分子和对与胶原蛋白生物合成相关的靶基因特异的第二核酸分子；和(b)用所述第一和第二核酸分子转染或转导所述细胞。所述细胞变得能够表达所述dCas9激活剂和所述gRNA，所述靶基因被激活，从而细胞的胶原蛋白合成增加。
本技术的另一个方面是生产胶原蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：提供上述细胞培养物；在胶原蛋白是由细胞培养物中的细胞生物合成的条件下，使所述细胞培养物在生物反应器中生长；并从所述生物反应器中收获和纯化胶原蛋白。优选地，所述细胞在生物反应器中的生长是在胶原蛋白生物合成调节剂或刺激剂(例如选自乙醛、抗坏血酸、透明质酸、β-氨基丙腈、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、谷氨酰胺及其组合的试剂)的存在下进行的。优选地，在胶原蛋白生物合成后，所述生物反应器的细胞生长培养基通过去除水和分子量小于50道尔顿的溶质来浓缩，同时保留了分子量更高的化合物，从而加速了胶原蛋白前肽的裂解。
所述技术的另一个方面是一套用于工程化细胞以增强细胞胶原蛋白生物合成的试剂盒。所述试剂盒包括：(i)编码dCas9激活蛋白的第一核酸分子；(ii)对一种或多种靶基因特异的一种或多种第二核酸分子，所述一种或多种靶基因与胶原蛋白生物合成相关；和(iii)任选地一种或多种试剂，用于用第一和第二核酸分子转染或转导细胞。
所述技术的另一个方面是一种医疗器械，其包含如上所述的工程化细胞或细胞培养物，或由此类细胞或细胞培养物产生的胶原蛋白。所述器械可以是一种能够通过源自临床受试者自身细胞的工程化细胞产生胶原蛋白的离体装置。可选地，所述器械可以植入受试者的身体，并且可以包含源自受试者细胞的工程化细胞，或者可以包含由这些细胞产生的胶原蛋白；所述胶原蛋白可以附着在医疗器械表面，也可以包含在储液罐中，以输送到受试者的组织中。医疗器械也可用作胶原蛋白输送装置，其中器械放置在受试者体外或由受试者佩戴，并将胶原蛋白输送至受试者的身体组织。
所述技术的另一个方面是一种治疗患有以胶原蛋白不足为特征的医学症状的哺乳动物受试者(如人类)的方法，所述方法包括：获得如上所述由细胞培养物产生的胶原蛋白，其中培养物的工程化细胞源自受试者或源自同一物种的一种或多种其他受试者；并向受试者施用胶原蛋白。在手术期间，所述胶原蛋白可注射到组织中或放置在体内。所述胶原蛋白可以是膜、片、垫、溶液、凝胶的形式，也可以包含在细胞骨架、绷带或伤口敷料中，或者可以是植入医疗器械上的涂层的形式。例如，医学症状可以是伤口、韧带或肌腱撕裂、骨折、软骨受损、眼部症状、需要美容治疗或手术的症状、皮肤病、皮肤皱纹或疤痕或烧伤。
可以通过以下特征列表进一步总结本技术。
1.一种能够增强胶原蛋白生物合成的工程化细胞，其中所述细胞被工程化以通过所述细胞对与胶原蛋白生物合成相关的靶基因进行基于CRISPR的激活(CRISPRa)，其中所述细胞表达与转录激活蛋白(dCas9激活剂)融合的内切酶缺陷Cas9(dCas9)蛋白和对靶基因特异的向导RNA(gRNA)，其中与同一类型的未工程化细胞相比，所述工程化细胞能够增加胶原蛋白生物合成的至少10倍，至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍或至少300倍。
2.根据特征1所述的工程化细胞，其中所述靶基因选自COL1A1、COL1A2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
3.根据特征2所述的工程化细胞，其中由所述细胞表达并对所述靶基因特异的gRNA包括SEQ ID NO:1-156中任一条的核苷酸序列。
4.根据前述特征中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞被工程化为执行一种或多种靶基因的CRISPRa，所述一种或多种靶基因选自脯氨酰-3-羟化酶家族基因、脯氨酰-4-羟化酶家族基因、赖氨酰羟化酶家族基因、GLT25D1、GLT25D2、Grp78、Grp94、蛋白二硫键异构酶(PDI)家族基因、钙网蛋白、钙连蛋白、亲环素B、肽基脯氨酰顺反异构酶(PPlase)家族基因、亲环素、FK 506结合蛋白(FKBP)基因、亲环素B(CypB)、HSP47、TANG01、SEC13、SEC31和迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)。
5.根据前述特征中任一项所述的工程化细胞，表达对两种或多种靶基因特异的gRNA，并且所述两种或多种靶基因中的每一种都被激活。
6.根据特征5所述的工程化细胞，其中一种或多种胶原蛋白基因和一种或多种TGFβ基因被靶向；
其中所述一种或多种胶原基因选自COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2和COL5A3；
其中所述一种或多种TGF-β基因选自TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3；和
其中所述细胞表达对所述一种或多种胶原蛋白基因和所述一种或多种TGF-β基因特异的gRNA。
7.根据特征6所述的工程化细胞，其中所述胶原基因选自COL1A1和COL1A2；所述TGF-β基因选自TGF-β1和TGF-β3，其中所述COL1A1 gRNA包括SEQ ID NO:1-4中任一条的核苷酸序列，COL1A2 gRNA包括SEQ ID NO:5-8中任一条的核苷酸序列，其中所述TGF-β1gRNA包括SEQ ID NO:13-16中任一条的核苷酸序列，TGF-β3gRNA包括SEQ ID NO:9-12中任一条的核苷酸序列。
8.根据特征6或特征7所述的工程化细胞，其中一种或多种前肽酶基因被进一步靶向，其中所述前肽酶基因选自ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
9.根据特征8所述的工程化细胞，其中前肽酶基因ADAMTS2和BMP-1被靶向，其中ADAMTS2 gRNA包括SEQ ID NO:69-72中任一条的核苷酸序列，并且所述BMP-1gRNA包括SEQID NO:153-156中任一条的核苷酸序列。
10.根据前述特征中任一项所述的工程化细胞，其中所述转录激活剂选自VP64、p65、Rta、VPR(VP64、p65和Rta的组合)、MS2、HSF1、SAM(MS2、p65和HSF-1的组合)和SunTag。
11.根据特征10所述的工程化细胞，其中所述dCas9激活剂为dCas9-VPR。
12.根据特征1-11中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞被转染以表达所述dCas9激活剂和所述一种或多种gRNA。
13.根据特征1-11中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞已被转导以表达所述dCas9激活剂和所述一种或多种gRNA。
14.根据前述特征中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是源自选自成纤维细胞、间充质细胞、肌成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞和诱导多能干细胞的细胞类型。
15.根据特征14所述的工程化细胞，其中所述细胞源自人角膜成纤维细胞。
16.根据前述特征中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞源自从哺乳动物受试者获得的细胞，所述哺乳动物受试者需要施用胶原蛋白。
17.一种细胞培养物，包括前述特征中任一项所述的工程化细胞。
18.根据特征17所述的细胞培养物是永生的。
19.一种用于工程化细胞以提供增强的胶原蛋白生物合成的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供细胞、编码dCas9激活剂的第一核酸分子和对与胶原蛋白生物合成相关的靶基因特异的第二核酸分子；和
(b)用所述第一核酸分子和第二核酸分子转染或转导所述细胞；
因此所述细胞变得能够表达所述dCas9激活剂和所述gRNA，且所述靶基因被激活。
20.根据特征19所述的方法，其中所述靶基因选自COL1A1、COL1A2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
21.根据特征20所述的方法，其中所述gRNA包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:156中任一条的核苷酸序列。
22.根据特征19-21中任一项所述的方法，其中所述细胞被工程化为执行一种或多种靶向基因的CRISPRa，所述一种或多种靶向基因选自脯氨酰-3-羟化酶家族基因、脯氨酰-4-羟化酶家族基因、赖氨酰羟化酶家族基因、GLT25D1、GLT25D2、Grp78、Grp94、蛋白二硫键异构酶(PDI)家族基因、钙网蛋白、钙连蛋白、亲环素B、肽基脯氨酰顺反异构酶(PPlase)家族基因、亲环素、FK 506结合蛋白(FKBP)基因、亲环素B(CypB)、HSP47、TANG01、SEC13、SEC31和迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)。
23.根据特征20-22中任一项所述的方法，其中所述细胞用两个或多个第二核酸分子转染，每个第二核酸分子对不同的靶基因特异，其中每个所述靶基因被激活。
24.根据特征23所述的方法，其中一种或多种胶原蛋白基因和一种或多种TGFβ基因被靶向；
其中一种或多种胶原蛋白基因选自COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2和COL5A3；
其中，所述TGF-β基因选自TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3；以及
其中所述细胞表达对所述一种或多种胶原蛋白基因和所述一种或多种TGF-β基因特异的gRNA。
25.根据特征24所述的方法，其中所述胶原蛋白基因选自COL1A1和COL1A2，所述TGF-β基因选自TGF-β1和TGF-β3，其中COL1A1 gRNA包括SEQ ID NO:1-4中任一条的核苷酸序列，COL1A2 gRNA包括SEQ ID NO:5-8中任一条的核苷酸序列，TGF-β1gRNA包括SEQ IDNO:13-16中任一条的核苷酸序列，和TGF-β3gRNA包括SEQ ID NO:9-12中任一条的核苷酸序列。
26.根据特征24或特征25所述的方法，其中一种或多种前肽酶基因被进一步靶向，其中所述一种或多种前肽酶基因选自ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
27.根据特征26所述的方法，其中前肽酶基因ADAMTS2和BMP-1被靶向，并且其中ADAMTS2 gRNA包括SEQ ID NO:69-72中任一条的核苷酸序列，BMP-1gRNA包括SEQ ID NO:153-156中任一条的核苷酸序列。
28.根据特征19-27中任一项所述的方法，其中所述dCas9激活剂为dCas9-VPR。
29.根据特征19-28中任一项所述的方法，其中所述细胞源自选自成纤维细胞、成肌细胞、成骨细胞、软骨细胞和诱导多能干细胞的细胞类型。
30.根据特征29所述的方法，其中细胞源自人角膜成纤维细胞。
31.根据特征19-30中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中使用慢病毒载体转导细胞。
32.根据特征19-31中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括从需要施用胶原蛋白的哺乳动物受试者或同一物种的不同哺乳动物受试者获得样本，并从所述样本提供的细胞衍生。
33.一种用于工程化细胞以增强细胞胶原蛋白生物合成的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)编码dCas9激活蛋白的第一核酸分子；
(ii)包含或编码对胶原蛋白生物合成相关的靶基因特异的crRNA的第二核酸分子；和
(iii)任选地，一种或多种试剂，用于用所述第一核酸分子和第二核酸分子转染或转导细胞。
34.根据特征33所述的试剂盒，其中所述靶基因选自COL1A1、COL1A2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
35.根据特征34所述的试剂盒，其中所述crRNA包括SEQ ID NO:1-156中任一条的核苷酸序列。
36.根据特征33所述的试剂盒，其中提供了两个或多个第二核酸分子，每个第二核酸分子包括或编码对不同靶基因特异的crRNA。
37.根据特征36所述的试剂盒，其中所述两个或多个第二核酸分子包含或编码对一种或多种胶原蛋白基因和一种或多种TGFβ基因特异的crRNA；
其中所述一种或多种胶原基因选自COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2和COL5A3；和
其中所述TGF-β基因选自TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。
38.根据特征37所述的试剂盒，其中所述胶原蛋白基因选自COL1A1和COL1A2，所述TGF-β基因选自TGF-β1和TGF-β3，其中所述COL1A1 gRNA包括SEQ ID NO:1-4中任一条的核苷酸序列，COL1A2 gRNA包括SEQ ID NO:5-8中任一条的核苷酸序列，其中所述TGF-β1gRNA包括SEQ ID NO:13-16中任一条的核苷酸序列，TGF-β3gRNA包括SEQ ID NO:9-12中任一条的核苷酸序列。
39.根据特征37或特征38所述的试剂盒，其中所述两个或多个第二核酸还包含或编码对一种或多种前肽酶基因特异的crRNA，其中所述前肽酶基因选自ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
40.根据特征39所述的试剂盒，其中所述两个或多个第二核酸分子包括或编码对前肽酶基因ADAMTS2和BMP-1特异的crRNA，并且其中ADAMTS2gRNA包括SEQ ID NO:69-72中任一条的核苷酸序列，BMP-1gRNA包括SEQ ID NO:153-156中任一条的核苷酸序列。
41.根据特征33-40中任一项所述的试剂盒，其中所述第二核酸分子还包括或编码对一种或多种基因特异的crRNA，所述一种或多种基因选自脯氨酰-3-羟化酶家族基因、脯氨酰-4-羟化酶家族基因、赖氨酰羟化酶家族基因、GLT25D1、GLT25D2、Grp78、Grp94、蛋白二硫键异构酶(PDI)家族基因、钙网蛋白、钙连蛋白、亲环素B、肽基脯氨酰顺反异构酶((PPlase)家族基因、亲环素、FK 506结合蛋白(FKBP)基因、亲环素B(CypB)、HSP47、TANG01、SEC13、SEC31和迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)。
42.根据特征33-41中任一项所述的试剂盒，其中所述dCas9激活剂为dCas9-VPR。
43.一种包括特征1-16中任一项所述的工程化细胞的医疗器械。
44.根据特征43所述的医疗器械，植入受试者身体。
45.一种生产胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)提供特征17或18所述的细胞培养物；
(b)在胶原蛋白是由细胞培养物中的细胞生物合成的条件下，使所述细胞培养物在生物反应器中生长；并
(c)从所述生物反应器中收获和纯化胶原蛋白。
46.根据特征45所述的方法，其中步骤(b)在胶原蛋白生物合成调节剂存在下进行。
47.根据特征46所述的方法，其中所述调节剂选自乙醛、抗坏血酸、透明质酸、β-氨基丙腈、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、谷氨酰胺及其组合。
48.根据特征47所述的方法，其中所述调节剂是抗坏血酸和β-氨基丙腈的组合，或抗坏血酸、乙醛和β-氨基丙腈的组合。
49.根据特征47所述的方法，其中所述调节剂为β-氨基丙腈，并且与不存在β-氨基丙腈相比，减少或防止了胶原的交联。
50.根据特征45-49中任一项所述的方法，其中步骤(b)在对细胞施加机械应变的情况下进行。
51.根据特征50所述的方法，其中使用粘附到基底、珠子或骨架上的细胞诱导机械应变。
52.根据特征45-51所述的方法，还包括，在步骤(b)和(c)之间：
(b1)在细胞生长培养基中浓缩生物合成胶原蛋白，其中加速了所述生物合成胶原蛋白前肽的裂解。
53.根据特征45-52所述的方法，其中产生的胶原蛋白选自I-V型胶原蛋白。
54.根据特征53所述的方法，其中所述胶原蛋白为I型胶原蛋白。
55.一种治疗患有以胶原蛋白不足为特征的医学症状的哺乳动物受试者的方法，所述方法包括：
(a)执行特征32所述的方法，从而获得由源自哺乳动物受试者或同一物种的不同哺乳动物受试者的细胞产生的胶原蛋白；并
(b)向受试者施用胶原蛋白。
56.根据特征55所述的方法，其中使用医疗器械施用所述胶原蛋白。
57.根据特征55或56所述的方法，其中所述医疗器械选自烧伤/伤口覆盖物或敷料、成骨和/或骨填充材料、具有抗血栓形成表面的器械、具有治疗酶固定化表面的器械、胶原蛋白补片、闭合移植物、可操作地提供胶原蛋白的植入物、角膜植入物、绷带接触镜、胶原蛋白基膜和胶原蛋白基药物递送器械。
58.根据特征55至57中任一项所述的方法，其中所述医学症状选自伤口、韧带或肌腱撕裂、骨折、软骨受损、眼部症状、需要美容治疗或手术的症状、皮肤病、皮肤皱纹或疤痕和烧伤。
59.一种对人类受试者进行美容治疗的方法，所述方法包括：
(a)执行特征32所述的方法，从而获得由源自哺乳动物受试者或同一哺乳动物物种的其他受试者的细胞产生的胶原蛋白；和
(b)给受试者施用步骤(a)中获得的胶原蛋白。
如上所述，前缀“自体”指的是一种产品(例如，自体前胶原蛋白、自体末端胶原蛋白或自体去端肽胶原蛋白)，所述产品源自与使用所述产品进行治疗的受试者相同受试者的细胞。
如上所述，前缀“异体”指的是一种产品(例如，异体前胶原蛋白、异体末端胶原蛋白或异体去端肽胶原蛋白)，所述产品源自与使用该产品进行治疗的受试者同一物种但不同受试者的细胞。
如上所述，“前胶原蛋白”指一种新合成的无活性胶原蛋白，其通过从前胶原蛋白中裂解前肽而活化。
如本文所述，“末端胶原蛋白”指的是一种活性形式的胶原蛋白，能够组装形成胶原纤维，通过从前胶原蛋白中裂解前肽而产生。
如本文所述，“去端肽胶原蛋白”指的是从其末端胶原蛋白中剥离的胶原蛋白，如通过胃蛋白酶消化。
如本文所述，所述术语“约”指声明值的正负10％、5％、1％或0.5％的范围。
如本文所述，“基本上由……组成”允许包含实质上不影响权利要求基本和新颖特征的材料或步骤。本文对“包括”一词的任何引用，特别是对组合物成分的描述或对器械元素的描述，都可以与替代表达“由……组成”或“基本上由……组成”互换使用。
附图说明
图1示出了用于胶原合成的CRISPRa激活的转导细胞过程的图示。
图2示出了构建用于图1所示转导过程的慢病毒载体所需的质粒。
图3示出了构建用于图1所示转导过程的慢病毒载体的过程。
图4示出了SirColTM可溶性胶原蛋白检测(biocolor.co.uk/product/sir)获得的胶原蛋白标准曲线。
图5示出了胶原生产和细胞计数随转染试剂浓度变化的柱状图。
图6示出了胶原生产随转染试剂浓度和培养天数变化的柱状图。
图7示出了六天中瞬态胶原蛋白生成率的图。示出了胶原蛋白产量5-6天间的误差线(更短的培养时间未显示出统计上的显著差异)。
图8示出了胶原蛋白产量随化学添加剂变化的柱状图。标有星号的柱低于分析检测限。
图9示出了胶原蛋白产量随化学添加剂组变化的柱状图。标有星号的柱低于分析检测限。
图10示出了细胞存活率随化学添加剂的变化的柱状图。
图11示出了在流体剪切条件下胶原蛋白生成装置的示意图。细胞被接种在堆叠的玻璃板上，所述玻璃板被配置为流体流过平板和表面积优化。
图12示出了在培养基中具有漂浮玻璃珠作为细胞载体的生物反应器的示意图。
具体实施方式
本技术提供了被工程化以增加胶原蛋白产量的新型人细胞。所述细胞使用CRISPR激活(CRISPRa)细胞工程化过程来制备，以诱导包括人类细胞在内的多种细胞类型的细胞进行快速胶原蛋白生成。基因修饰被引入天然产生所需类型胶原蛋白的细胞中，使用CRISPRa增加负责胶原蛋白转录、翻译和/或翻译后加工的一种或多种基因的表达。通过使工程化细胞在存在一种或多种化学添加剂的细胞培养基中生长，可以进一步刺激工程化细胞的胶原蛋白生成，以实现更高的胶原蛋白生成率。合成的胶原蛋白可以被分离、纯化，然后用于胶原蛋白补片、凝胶或以其他形式用于软组织修复。
本发明人通过将细胞工程应用于胶原蛋白生物合成中的某些瓶颈，显著增加了胶原蛋白产量。胶原蛋白具有独特的蛋白质结构。胶原蛋白由形成三螺旋的三个氨基酸链组成。胶原蛋白中发现的主要氨基酸序列是甘氨酸-X-羟脯氨酸或甘氨酸-脯氨酸-X，其中X是任何其他氨基酸。甘氨酸的大量存在(每3个氨基酸中就有一个)允许所述螺旋形成紧密的构型，使分子结构抵抗应力(Lodish等人,2000)。I型胶原蛋白分子长300nm，直径1.5nm。每个胶原蛋白分子由一个特征性的右旋三螺旋组成，所述三螺旋由两条α1链和一条α2链组成。每条链含有1050个连续氨基酸。一旦形成单独的胶原蛋白分子，它们并排堆积在一起，形成直径约为10～300nm的纤维，相邻分子的“头”和“尾”之间有约67nm的间隙(Schleip，2012)。N-末端到C-末端共价键稳定了位于彼此相邻的胶原蛋白分子的相互作用。周期模式的分子堆积产生了电子显微镜下可见的条纹。分子间的连接有利于胶原蛋白包装稳定性，形成了强纤维。除I型胶原蛋白外，表1还列出了其他胶原蛋白类型及其特性的实例。
表1：胶原蛋白类型和关键特征
/>
胶原合成主要发生在成纤维细胞中，通过一个跨越细胞内和细胞外空间的过程。I型胶原蛋白的产生主要由两个基因控制：I型胶原蛋白α1(COL1A1)，为17号染色体上17533个碱基对的条带，出现在第50184096个碱基对之后；和I型胶原蛋白α2(COL1A2)，为7号染色体上36671个碱基对的条带，出现在第943945561个碱基对之后(NIH，2019)。
负责胶原蛋白生成的大多数基因包含外显子-内含子模式，外显子的平均数范围为3至117。根据细胞和胶原蛋白的类型，存在多种转录起始位点和外显子剪接机制，从而导致不同的mRNA物种(Gelse等人，2003)。特别地，对于I型胶原蛋白生成，所述前α1和前α2链基因分别转录自COL1A1和COL1A2基因。在胶原蛋白生成的这一阶段，前mRNA经过了剪接和盖帽。细胞转录活性取决于细胞类型，并由多种生长因子和细胞因子调节。其中一些生长因子包括转化生长因子β(TGF-β)家族成员、成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子(Gelse等人，2003年)。这些生长因子的有效性取决于细胞类型。
一旦发生翻译，所述胶原蛋白处于前前多肽链状态，并移动到粗面内质网(RER)腔中进行翻译后修饰(Wu和Crane，2019；Lodish等人，2000)。这些分子在识别胶原分子信号识别域的受体的帮助下侵入腔(Gelse等人，2003年)。进行了三种主要修饰，将此链转换为前胶原蛋白。第一种修饰是通过酶信号肽酶去除肽链N末端的信号肽。信号肽酶的有效裂解需要小氨基酸(即丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸)正好在裂解位点前，因此信号肽酶1(SPase1)可以正确裂解所述末端(Tuteja，2005)。
第二种修饰是羟化酶对赖氨酸和脯氨酸残基进行羟基化或添加羟基(-OH)(图5)。具体而言，该反应由脯氨酰3-羟化酶、脯氨酰4-羟化酶和赖氨酰羟化酶催化(Gelse等人，2003年)。这种修饰需要多种辅因子，包括抗坏血酸、亚铁离子、2-酮戊二酸和氧。羟基化的程度取决于物种和温度。对前前胶原蛋白的羟基化修饰对于形成分子内氢键以及由此产生的胶原蛋白热稳定性、单体和胶原蛋白纤维完整性至关重要。
第三种修饰是羟基赖氨酸与葡萄糖和半乳糖的糖基化。在这种修饰过程中，葡萄糖基和半乳糖基残基被置于羟基赖氨酸的羟基上。链中间特定脯氨酸和赖氨酸残基(非羟基化)的羟基化由连接到内质网膜的羟基化半乳糖基转移酶和半乳糖羟赖氨酰葡糖基转移酶催化。寡糖也连接至前胶原C末端前肽中的天冬酰胺残基(Lodish等人，2000年)。
在这三种翻译后修饰完成后，糖基化和羟基化链通过折叠组装成三螺旋，非常像拉链，因为链内二硫键“链接”在一起。所述螺旋由两个α1(I)链和一个α2(I)链亚基组成。所述组装体由三个左旋螺旋组成，所述三个左旋螺旋配置为1050个氨基酸长的右旋螺旋，它们还在翻译后加工步骤发生之前，在内质网中从C末端到N末端形成。C-前肽也在将肽链组装成胶原蛋白单体中发挥作用(Gelse等人，2003年)。
加工和前胶原蛋白组装后，三螺旋分子移动到高尔基体进行最终修饰，并在称为囊管状群(vesicular tubular cluster)的复合物管状部分内包装(Wu&Crane，2019；Bonfanti等人，1998)。在这些群中，前胶原蛋白聚集并包装在高尔基体隔室内形成分泌囊泡，并释放以运输到细胞外空间。
在细胞外，胶原蛋白肽酶裂解N-末端和C-末端未结合的前肽，以去除分子末端并将分子转化为原胶原蛋白。进行前肽裂解的蛋白酶是前胶原蛋白C-蛋白酶。原胶原蛋白终止于可能存在抗原性和免疫原性方面问题的端肽(Stuart等人，1982；Lynn等人，2004)。胶原蛋白分子在其链的每一侧都具有端肽。所述端肽不形成典型的三螺旋形式，并含有氨基酸羟基赖氨酸。羟赖氨酸残基在一个分子的C-末端和两个相邻分子的N-末端形成交联(collplant.com/technology；Lodish等人，2000年)。如果胶原蛋白被移植到另一物种，甚至是物种内，这些端肽也可以是免疫原性的来源(Stuart等人，1982；Lynn等人，2004；Uchio等人，2000)。胶原蛋白的三螺旋区在物种间是保守的。尽管螺旋内氨基酸序列的差异在物种间差异小于几个百分点，但端肽中氨基酸序列的百分之五十在物种间可能不同(Lynn等人，2004年)。由于分子在这一区域的高种间变异，端粒肽被认为是胶原蛋白植入后免疫应答的主要贡献因素。
最后一个细胞外步骤是原纤维形成。纤维形成胶原蛋白分子自发地自组装成有序的纤维结构。当赖氨酰氧化酶共价键合赖氨酸和羟基赖氨酸分子时，形成长而薄的胶原纤维。这种行为编码在胶原蛋白结构中。纤维定向取决于组织类型(Gelse等人，2003年)。在分子并排堆积在一起之后，每个纤维的直径约为100nm，纤维直径也可以在25-500nm的范围内。
规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白编码基因(Cas)是原核生物免疫系统使用的一组蛋白质。CRISPR相关蛋白9(Cas9)可以切割DNA，是一种高效的DNA靶向酶，已被修饰用于基因编辑研究应用。CRISPR-Cas9系统由四个主要部分组成：Cas9酶、向导RNA(gRNA)、间隔序列前体临近基序(PAM)序列和匹配宿主DNA(匹配基因组序列)。Cas9是一种内切酶，使用向导RNA的大约20个碱基对区段识别、解压缩和诱导DNA的双链断裂(Biolabs，2019)。向导RNA(gRNA)定向CRISPR-Cas9系统在基因组中的去向，可以使得CRISPR-Cas9切割宿主DNA的过程发生，然后让自然的DNA修复过程在宿主基因组(由g RNA定义)的一个特定位点将插入的目标基因整合到宿主的基因组中。g RNA有两个主要成分，CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)(图10A，PriorArt，Packer，2016)。crRNA区段包含18-23个碱基对序列，将Cas9蛋白定向至所需的互补基因组位置进行编辑。所述crRNA通过与成熟的tracrRNA的一个区段杂交相连接，帮助crRNA定向。在这两个区段上可以连接一个连接环结构，形成单个向导RNA(sg RNA)(Packer,2016)。
匹配宿主DNA是一条18-23碱基对序列，位于目标基因的启动子区或附近。所述序列必须紧跟NGG(表示跟随两个鸟嘌呤的任何碱基对)或“PAM序列”。为了确定gRNA在给定基因中应靶向哪些碱基对，开发了计算生物学工具，以查找PAM序列和目标碱基对序列(CRISPR Guide Design Software，Pelligrini，2016)。这些碱基对以Cas9系统能够与该序列结合而不会意外地与基因组中的其他类似序列结合的程度进行排序。此外，生产商如DharmaconTM也有专有软件，用于计算g RNA的高特异性结合位点。
本发明人选择使用CRISPR基因激活(CRISPRa)来工程化细胞以使细胞产生比天然存在的细胞更多胶原蛋白。在CRISPRa中，缺失内切酶活性的失活或死亡Cas9酶(dCas9)与向导RNA(gRNA或sgRNA)一起用于定位特定基因靶点。dCas9可以与一种或多种转录激活蛋白融合。生成的融合蛋白在本文被称为“dCas9激活剂”。融合到dCas9的一种或多种激活剂可以是例如VP64(单纯疱疹病毒蛋白16的四聚体)或VPR(与p53和R转录因子结合的VP64)。例如，VPR激活剂可以是从融合到VP64-p65-Rta的化脓性链球菌(S.pyrogenes)的dCas9。可根据待激活的细胞类型或基因选择其他激活剂或激活剂组合。dCas9不切割所连接的DNA，而是上调靶基因的表达。与dCas9融合的激活剂结构域通过向这些基因的启动子区域招募转录复合物使得转录激活。
进行CRISPRa时的一种重要设计考虑是选择dCas9与基因结合的位置；一般来说，选择基因启动子的位置。虽然可以使用计算机算法预测gRNA序列的特异性及PAM序列的位置，启动子的位置及其结果的有效性是可变的。虽然CRISPRa有效性的启动子区域通常是转录起始位点上游的50-400个碱基对，但激活的最有效位置因基因而异，并且一些位置是完全无效的(Mohr等人，2016)。
有两种实用的方法将CRISPR-Cas9系统递送至细胞以进行CRISPRa(即dCas9激活剂和待激活的基因gRNA)：转染和转导。
转染是将核酸(通常是对应于转录基因的mRNA)递送至细胞，并随后由宿主细胞翻译mRNA。当使用转染进行CRISPRa时，CRISPR-Cas9系统通常表达约24-48小时。可以通过微注射、电穿孔或使用核糖核蛋白(RNP)复合物递送mRNA来转染具有CRISPRa成分的细胞。使用转染的瞬态表达比转导更简单，成本更低，并且由于其短表达窗口，降低了脱靶激活的几率。此外，哺乳动物表达载体的使用允许比传统的非哺乳动物转染载体更短暂的转染。
商业试剂盒可用于通过细胞转染进行CRISPRa。例如，Dharmacon(horizondiscovery.com)提供了方案和试剂，用于使用DharmaFECTDuo转染试剂在96孔板中混合转染gRNA和dCas9 mRNA进行培养。所述方案可以放大到48孔板或更大，以收获更多胶原蛋白，例如在工程化细胞增加胶原蛋白产量的同时进行更精确的胶原蛋白定量。此外，当两组或多组不同的gRNA用于同时激活两个或多个基因时，可以对dCas9 mRNA的量和转染试剂的量进行适当的调整。例如，为了同时激活人细胞中COLA1、COLA2和TGF-β3基因的表达，所述材料可包括CRISPRa人COL1A1 crRNA库、CRISPRa人COL1A2crRNA库，CRISPRa人TGF-β3crRNA库、CRISPR-Cas9合成tracrRNA、编辑-R GFP dCas9 VPR mRNA、DharmaFECTDuo转染试剂、10mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液和无血清培养基。用于混合转染人角膜成纤维细胞以增加胶原生成所需的试剂如表2所示。由于目标crRNA可以在购买的一个库(一个库包含CRISPRa所需的最少单个crRNA的四倍)中混合和匹配，因此只需要购买一个混合的crRNA，而且超过所需的最少crRNA可以使得基因激活更佳(CRISPR设计软件指南)。
表2：混合转染所需的试剂
CRISPRa人COL1A1 crRNA库包括大量与COL1A1启动子不同区域互补的个体RNA序列(参见表3中的靶序列SEQ ID NO:1-4)。
表3：与胶原蛋白生物合成相关的靶基因启动子的CRISPR靶序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
表4：crRNA序列的基因组定位和PAM
/>
/>
/>
/>
/>
/>
DharmaFECTDuo1转染试剂已被证明是同时转染小RNA和质粒的有效转染试剂(Borawski等人，2007年)。
用于本技术的dCas9蛋白质的实例具有如下所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:157(uniprot.org/uniprot/A0A386IRG9))：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
Jinek等人(2012年)发表了一种用于本技术的合成tracrRNA的实例，其序列为GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:158)。crRNA可能包括与部分tracrRNA互补的区域。可选地，可以在crRNA和tracrRNA之间添加接头序列，以产生单个gRNA分子。
VP64是转录激活剂，包括VP16(单纯疱疹病毒蛋白16，氨基酸437-447，用甘氨酸-丝氨酸接头连接)的四个串联拷贝。VP64的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:159，(parts.igem.org/Part:BBa-J176013))：
GACGCTTTGGACGACTTCGACTTGGACATGTTGGGTTCTGACGCTTTGGACGACTTCGACTTGGACATGTTGGGTTCTGACGCTTTGGACGACTTCGACTTGGACATGTTGGGTTCTGACGCTTTGGACGACTTCGACTTGGACATGTTG
转录激活剂p65包括通过选择性剪接产生的四种亚型(uniprot.org/uniprot/Q04206)。亚型1具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:160):
MDELFPLIFPAEPAQASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTDTTKTHPTIKINGYTGPGTVRISLVTKDPPHRPHPHELVGKDCRDGFYEAELCPDRCIHSFQNLGIQCVKKRDLEQAISQRIQTNNNPFQVPIEEQRGDYDLNAVRLCFQVTVRDPSGRPLRLPPVLSHPIFDNRAPNTAELKICRVNRNSGSCLGGDEIFLLCDKVQKEDIEVYFTGPGWEARGSFSQADVHRQVAIVFRTPPYADPSLQAPVRVSMQLRRPSDRELSEPMEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS
转录激活剂HSF1的氨基酸序列，SEQ ID NO:161，如下所示(SEQ ID NO:161((uniprot.org/uniprot/Q00613))。
MDLPVGPGAAGPSNVPAFLTKLWTLVSDPDTDALICWSPSGNSFHVFDQGQFAKEVLPKYFKHNNMASFVRQLNMYGFRKVVHIEQGGLVKPERDDTEFQHPCFLRGQEQLLENIKRKVTSVSTLKSEDIKIRQDSVTKLLTDVQLMKGKQECMDSKLLAMKHENEALWREVASLRQKHAQQQKVVNKLIQFLISLVQSNRILGVKRKIPLMLNDSGSAHSMPKYSRQFSLEHVHGSGPYSAPSPAYSSSSLYAPDAVASSGPIISDITELAPASPMASPGGSIDERPLSSSPLVRVKEEPPSPPQSPRVEEASPGRPSSVDTLLSPTALIDSILRESEPAPASVTALTDARGHTDTEGRPPSPPPTSTPEKCLSVACLDKNELSDHLDAMDSNLDNLQTMLSSHGFSVDTSALLDLFSPSVTVPDMSLPDLDSSLASIQELLSPQEPPRPPEAENSSPDSGKQLVHYTAQPLFLLDPGSVDTGSNDLPVLFELGEGSYFSEGDGFAEDPTISLLTGSEPPKAKDPTVS
转录激活剂MS2的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:162(uniprot.org/uniprot/P03612))。
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
如上所述，dCas9 mRNA是下文所述方案的限制试剂，允许在11个孔中使用5nmol起始材料。铺设测试板条件的示例方案为：
1.48孔板中的板成纤维细胞密度为第二天70-90％成纤维细胞汇合的密度。
根据达摩再悬浮程序(Dharmacon’s resuspension procedure)，将COL1A1、COL1A2和TGF-β3crRNA和tracrRNA(总crRNA与tracrRNA的比例为1:1)稀释并混合至2.5μM的工作浓度[165]。这就是本申请的gRNA溶液。
a、购买的crRNA和tracrRNA为5nmol。通过向每份crRNA库和tracrRNA中添加1000μl 10mM pH 7.4的Tris，将这些中每一个稀释至5μM。
b、当1:1混合时，生成的tracrRNA：crRNA的工作浓度为2.5μM。
3.将20μg dCas9 mRNA在200μl无血清培养基中稀释至100ng/μl的浓度。
4.向微离心管中分别加入3μl三种gRNA溶液、18μl dCas9溶液和9μl培养基(形成30μl的体积)。
5.原始方案要求测试一系列转染试剂量(.1-.8μL)，以确定哪个量最适合所用细胞类型。当从96孔板放大至48孔板配置，使用3倍mRNA量(3种不同的gRNA-Cas9 mRNA复合物，每个目标基因一种)，该范围为.9-7.2μL转染试剂。产生一系列由7.2、4.05和.9μl转染试剂组成的Duo转染试剂工作溶液，并用无血清培养基将这些试剂的体积增加到30μl。
6.室温孵育5分钟
7.将30μL每种浓度的转染试剂与30μL dCas9/gRNA溶液混合，并用移液管轻轻混合。
8.室温孵育20分钟
9.向每个组合中添加240μL无血清培养基，并用新开发的转染混合物替换细胞上的培养基。
10.每48小时采集培养基用于胶原蛋白测定，持续108小时。
11.COL1A1、COL1A2和TGFβ3的基因激活应在24小时左右开始，并在转染后约72小时左右具有最大表达。
为了测量胶原蛋白的产生，可以使用羟脯氨酸测定，任选地所述羟脯氨酸测定发生在浓缩胶原蛋白溶液或培养基后(参见，例如，D.D.Cissell等人，(2017).Tissue EngPart C Methods.2017Apr；23(4):243-250)。可选地，可以使用SirColTM染料结合胶原蛋白检测(www.biocolor.co.uk/product/sircol-soluble-collagen-assay)。如图4所示，可以使用SirColTM检测程序，使用五种由SircolTM胶原蛋白标准品和DMEM培养基混合组成的标准溶液确定标准曲线。
比较了三种水平的转染试剂；转染试剂在高浓度下可能对细胞有毒。高(H)、中(M)和低(L)转染试剂浓度分别为每孔7.2μL、4.05μL和0.9μL转染试剂。两天内，培养基每12小时收集一次并混合。每两天对每孔的胶原蛋白进行一次定量，在培养基采集结束后进行细胞计数。每个细胞产生的胶原蛋白是根据培养基收集结束时每个细胞的数量估算的。图2示出了每个浓度水平的总(第1-6天)混合胶原蛋白产量(每孔，而不是每个细胞)和细胞计数的比较。与对照组相比，该图显示了高、中、低转染浓度的胶原蛋白生成和细胞计数。尽管随着转染试剂的增加，细胞存活率持续下降，但观察到转染试剂增加后总胶原蛋白增加的趋势(尽管无统计学意义)，尽管这些孔中可以产生胶原蛋白的成纤维细胞比转染试剂较少的孔少。这表明与对照细胞相比，CRISPR细胞每细胞胶原蛋白产量增加。
表5示出了试验组(高、中、低)的平均胶原蛋白产量(分子/细胞/小时)，组名表示转染水平和进行检测的天数(即，1-2为第1天和第2天)。
表5：试验组的胶原蛋白产量。
组 平均胶原蛋白产量(分子/细胞/小时,百万) 标准差 n
对照1-2 1.06 0.00 3
对照3-4 4.86 3.91 3
对照5-6 1.06 0.00 3
低1-2 1.06 0.00 3
低3-4 6.47 6.01 3
低5-6 4.49 5.94 3
中1-2 1.06 0.00 3
中3-4 6.62 5.69 3
中5-6 15.93 16.65 3
高1-2 1.06 0.00 3
高3-4 44.29 74.88 3
高5-6 95.39 40.16 3
低于最小可检测胶原蛋白量的含量被设置为最小可检测的胶原蛋白量(106万分子/细胞/小时)(表5)。如果一些含量低于最小可检测量，则有必要捕获CRISPR条件下胶原蛋白生成的上限。第1-2天的数据和大多数对照样本处于或低于最小可检测胶原蛋白量，但第3-4天和第5-6天CRISPR结果的每个数据点都高于最小阈值。对应于对照孔的第1-2天的实际结果与CRISPR应在大约两天后提高胶原蛋白产量的预期一致。这种胶原蛋白的增加在图6中的图形形式显示。
基于图6中的图，瞬时的胶原蛋白产生可能存在差异，且由于转染试剂浓度，胶原蛋白的产生可能存在差异。为了确定CRISPR样本中每细胞胶原蛋白的增加是否具有统计学意义，进行了Tukey成对比较，并在表6中示出。不属于任何相似子集的组在α＝0.05时有统计学差异(表在IBM SPSS 25中生成)；胶原蛋白产量以分子/细胞/小时，百万计)。
表6：表5和图6的Tukey成对比较图。
表6示出了图6和表5所示实验的子集分组。第5-6天的高转染浓度显示胶原蛋白产量具有统计学意义的增加，显著性为0.05。给定样本大小和方差，试验的观测功效为0.971，效应量为1.30。这可以在图7所示的图表中的时间图中看到，该图显示了六天内瞬时胶原蛋白生成率。在图7中示出了5-6天内胶原蛋白产量的误差线(其他日子的条件未显示出具有统计学显著差异)。
为了防止新合成胶原蛋白的不期望的交联，优选将BAPN添加到培养基中。还可以调整培养条件以优化胶原蛋白结构和功能的保持。例如，由于胶原蛋白在37℃储存不稳定，细胞可以在37℃以下培养，和/或可以定期(例如，每8-24小时)收获胶原蛋白，然后储存在较低温度以保持稳定性。
从表5和图6中的数据可以看出，与实验对照相比，CRISPR系统可以增加胶原蛋白产量约90倍(约40％std)。
如上所述，发现与实验对照相比，CRISPR系统可以增加胶原蛋白产量约90.29倍。当放大到T-75小瓶时，该生产水平将每周产生约554mg胶原蛋白。然而，购买商用dCas9mRNA、每个目标基因的gRNA(crRNA和tracrRNA)试剂和转染试剂的成本将令人望而却步。因此，希望使用成本大大降低的其他CRISPRa递送方法放大规模。合适的方法包括使用细菌产生人类胚胎肾(HEK)细胞产生的dCas9和gRNA质粒和病毒载体，以将dCas9与gRNA序列递送并稳定整合到宿主基因组中，将显著降低放大成本并降低胶原蛋白生成成本。
图1示出了使用慢病毒载体转导细胞的CRISPRa过程。首先，购买(或工程化)三种慢病毒质粒：转移、包装和包膜(图1中图A)。转移质粒含有待整合到宿主细胞(dCas9和/或gRNA)中的转基因，包装和包膜质粒含有构建慢病毒所需成分。慢病毒的成分和制造它们所需的质粒在下面的实例中详细说明。这些质粒随后被转化到大肠杆菌(图1中图B)，通过孵育复制(图1中图C)，并收获(图1中图D)。这些质粒随后转染到HEK细胞中。HEK细胞组装病毒并将其排泄到培养基中(图1中图E)。然后将这种病毒培养基添加到宿主细胞(成纤维细胞)。病毒培养基中的LV随后将转基因(dCas9和/或gRNA)整合到宿主细胞中(图1中图F)。这些细胞随后暴露于杀死任何未转导细胞的抗生素(图1中图G)。转基因细胞由于作为转基因载体一部分的抗生素抗性而存活。表达转基因(dCas9和/或gRNA)的存活细胞随后倍增并用于胶原蛋白收获(图1中图H)。本申请提供了胶原蛋白的稳定增加(图1中图I)。此外，CRISPR靶向胶原蛋白相关基因的过度表达是稳定的，并随着细胞生长和传代而保存。
为了转导，一旦建立了病毒生产管道，病毒质粒就由细菌廉价产生，转染到准备好包装并排出大量病毒颗粒的HEK细胞中，并添加到宿主细胞培养基中，以便将目标基因整合到宿主细胞基因组中。
通过病毒递送的胶原蛋白生成的放大过程首先是决定使用哪种病毒。简言之，使用AAV(腺相关病毒)的益处包括高滴度，可用的靶向不同细胞类型的多种血清型的多功能性，由于病毒残留在游离基因或19号染色体上的特定位点的低毒性，以及由于最小宿主免疫应答的低免疫原性。LV的优点包括，它们几乎感染所有哺乳动物细胞类型，可用于递送较大的DNA序列，通常长度约为5-6kb，由于转基因在基因组中随机位置的整合，可用于在体内器官和组织中产生稳定的细胞系或驱动稳定的基因表达。由于LV允许快速和容易地稳定整合转基因，因此它们在这里是明确的选择。特别是因为选择使用的任何细胞类型(表皮成纤维细胞、角膜成纤维细胞、i PSCs等)均可使用同一类LV。如果希望开发一种用于患者的系统，所述系统靶向用于增加胶原蛋白产量的特定组织类型，则可考虑使用AAV。形成LV的组分的具体内容以及如何使用质粒构建LV在图2所示的实例中进一步详细说明。
慢病毒构建中涉及三个主要基因：env、gag和pol。Env或重组VSV-G(图2中图B)编码切割成两个亚单位的表面糖蛋白：表面蛋白和跨膜蛋白(分别为椭圆形和矩形，图2中图A)。这些蛋白质对于病毒识别、粘附和进入宿主细胞至关重要。与野生型env相比，VSV-G被广泛使用，因为它提供了一种更稳定的糖蛋白，所述糖蛋白识别更广泛的细胞类型亚群。Gag(图2中图B)被转录并剪接成基质、衣壳(图2中图A中分别为浅虚线和实线)和核衣壳蛋白。基质蛋白参与病毒组装。衣壳蛋白形成病毒的疏水核心，核衣壳蛋白包被并保护转基因。Pol(图2中图B中指示的加粗黑线载体)编码病毒复制所必需的三种蛋白质：蛋白酶、逆转录酶和整合酶(图2中图A，黑色椭圆形、加号和六边形)。蛋白酶在多聚蛋白前体加工和病毒成熟中发挥作用。逆转录酶用于将病毒递送的目标RNA载体在递送到宿主细胞时转化为DNA。整合酶用于将新的DNA转基因整合到宿主基因组中。一旦进入宿主基因组，转基因的长末端重复序列(LTR)区作为普遍的启动子和增强子，确保宿主细胞表达。在野生型HIV中，病毒蛋白(vif、vpr、vpn和nef)包含在转基因中，在这个阶段，所述转基因被转录并翻译以制造新病毒。为了确保感染的细胞不会致病并感染其他细胞(出于操作人员安全原因)，这些蛋白已经从当前的慢病毒系统中被清除。病毒加工的另一个重要组成部分是RRE。RRE在病毒包装(图2中图B中RRE)过程中起到促进病毒RNA转运的作用。这些成分共同作用组装成能够递送目标载体(转基因)的慢病毒。
最后一种成分是转移质粒，它携带着想要整合到宿主细胞中的目标载体。所述载体在插入细菌细胞复制之前通常用限制性酶工程化。因此，所述转移质粒具有目标载体(和一些其他必需成分)的病毒区和具有抗生素抗性基因的非病毒区。这种抗生素抗性用于选择在转化(质粒插入)后不含新工程化质粒的细菌。病毒区由上述LTR启动。除了在宿主基因组中的LTR作为启动子外，这些在目标载体两侧的LTR允许载体在病毒产生和转导过程中被多种其他病毒蛋白识别。一旦进入宿主基因组，该载体的转录具有两个主要功能。第一种是针对未被转导的细胞进行选择。在转基因中，存在由宿主细胞转录的抗生素抗性基因(图2中图C和D)。这允许对未转导细胞进行选择。最后，该转基因还携带拟由宿主细胞转录的构建体(在这种情况下为dCas9或gRNA)(图2中图C和D)。
图3描述了宿主细胞的LV包装和转导。首先，在细菌中培养含有目标载体(gRNA或dCas9)的慢病毒兼容质粒(称为转移质粒)(图3中图A和B)。这些质粒随后被收获并与慢病毒包膜和包装质粒混合(图3中图C)。这些质粒含有构建提供递送目标载体的病毒所需的病毒组分。这些质粒随后与转染试剂混合并添加到HEK细胞的培养基中。在大约24小时的时间跨度内，HEK细胞将转录和/或翻译质粒到制备病毒所需的RNA/蛋白质中，然后HEK细胞将使用这些新的RNA和蛋白质包装病毒并将其分泌到培养基中(图3中图D)。这种培养基可以立即使用，也可以冷冻并储存备用。收获的病毒培养基随后被添加到目标细胞的培养基中(图3中图E)。添加病毒培养基后，所述慢病毒将目标载体RNA沉积到细胞中，使用病毒包装的逆转录酶将该RNA连续复制为DNA，并使用病毒包装的整合酶将该新DNA整合到宿主细胞基因组中。逆转录酶和整合酶用黑点表示，例如图3中图E。图3示出了参与该过程的病毒蛋白的实例。最后，可以通过整合在转移质粒病毒区(gRNA或dCas9质粒)的选择标记物选择转导的细胞(可能与抗生素一起)。然后将选择标记物、sgRNA/dCas9、gRNA靶序列/dCas9激活结构域和质粒的病毒片段(图3中图A和B)整合到宿主基因组中，如图3中图E所示。
表达dCas9-VPR的慢病毒载体可商购(Dharmacon Edit-R CRISPA慢病毒dCas9-VPR)。这可以与编码对靶基因特异的gRNA的另一载体一起、或者作为单个向导RNA分子、或作为复合在一起形成向导RNA分子的独立的crRNA和tracrRNA分子来使用。
研究表明，使用玻璃作为成纤维细胞基质比在培养物中产生更多胶原蛋白。当细胞置于体内未发现的基质上时，它们产生胶原蛋白，作为从将自身与板分离的方法。成纤维细胞也有在硬度较高的基质(如玻璃)上扩散胶原，而非聚集的倾向。在此之后，胶原蛋白层将开始在板上细胞的下方聚集。在大多数胶原蛋白生成研究中，胶原蛋白生成量受基质大小限制。
图11为用于流体剪切的玻璃板阵列图。所述器械可用于优化可用于Ⅰ型胶原生长的表面积的量和每个表面施加的流体剪切量。玻片的数量和横截面积可以通过基于CRISPR的方法和维生素/生长因子增强的预测模型确定。利用流体建模软件可以确定施加在细胞上的合适流速。成本函数可用于绘制流速与对胶原蛋白产量影响大小之间的关系。
所述装置包括一系列由夹具限制的在流体入口/出口端的堆叠载玻片和非流动侧的防水侧壁(图11)。使用鲁尔转接器(luer adapter)和低顺应性管道，使用脉动流体泵推动流体通过板。
在流动剪切之后，可以从玻璃板上去除培养物和胶原蛋白原纤维，并测定I型胶原蛋白的量以确定产生的量。
使用玻璃作为基质的胶原蛋白产生的替代方法是使用玻璃珠。图12示出了示例器械。微载体在成纤维细胞生长应用中具有优势，因为它们为胶原蛋白生长提供了最大的表面积，同时能够在完全浸没培养基中包装。使用叶轮搅拌珠网并向成纤维细胞提供局部流动，所述系统可以为生长网络提供剪切应力(图12)。拟议的生物反应器可以是小型的，并具有一个流体入口端口和两个流体出口端口。可以使用流体建模软件确定提供的细胞流速。胶原蛋白将在去除培养基后从系统中提取，并检测以定量。
实施例
实施例1：使用混合转染进行CRISPR。
比较了CRISPR设计的三个水平的转染试剂。所述转染试剂为DharmaFECT 1转染试剂，如表2所示。在所有细胞培养基中，培养基应使用PBS透析(以50道尔顿分子量截断)至少浓缩10倍，以促进前肽切割。高、中、低转染试剂浓度分别为每孔7.2μL、4.05μL和0.9μL转染试剂。两天内，培养基每12小时收集一次并混合。每两天定量一次每孔的胶原蛋白，在培养基收集结束后进行细胞计数。每个细胞产生的胶原蛋白是根据培养基收集结束时每个细胞的数量估算的。图5示出了每个浓度水平的总(第1-6天)混合胶原蛋白产量(每孔，而不是每个细胞)和细胞计数的比较。
低于最小可检测胶原蛋白量的含量被设置为最小可检测的胶原蛋白量(106万分子/细胞/小时)(表5)。如果一些含量低于最小可检测量，则有必要捕获CRISPR条件下胶原蛋白生成的上限。换句话说，在定量胶原蛋白之前，我们可能没有稀释样本，这样CRISPR胶原蛋白生成的上限可能高于胶原蛋白定量的上限而无法检测到。注意，第1-2天的数据和大多数对照样本均等于或低于最小可检测胶原蛋白量，但第3-4天和第5-6天CRISPR结果的每个数据点都高于最小阈值。这对于计算倍数变化和统计学意义非常重要，因为对照孔的实际胶原蛋白产量可能比我们所说的要低得多。最后，对应于对照孔的早期时间点(第1-2天)很有意义，因为预计CRISPR将在大约两天后上调胶原蛋白产量。基于图6中的图，由于瞬时的胶原蛋白产生和转染试剂浓度，胶原蛋白的产生可能存在差异。
图7的一个重要特征是，与较早的时间点相比，在最近时间点没有观察到胶原产量下降。由于使用的CRISPR转染方法使得胶原蛋白相关基因的瞬时激活，与对照相比，预计胶原蛋白产量会先增加，随后胶原蛋白产量会下降。在此仅观察到胶原蛋白生成随时间增加，表明可能未观察到胶原蛋白生成的峰值时间点。因此，如果在更晚的时间点进行测试，每个细胞的胶原蛋白产量可能会有更大的增加。
与实验对照相比，使用CRISPR的胶原蛋白产量峰值显示胶原蛋白产量增加90.29倍(42.1％std)。
可以在含有实施例2中发现的最高性能化学条件的培养基中培养用CRISPR基因修饰的细胞，包括在传统培养基中用CRISPR细胞的对照和第二对照。
除了图1、图2和图3所示的放大方法外，表20中还制备了Dharmacon混合转导所需试剂的成本分析，表21中制备了慢病毒的CRISPR放大成本分析。在表20中，只需要购买一套4个慢病毒sgRNA，因为目标sgRNA可以通过购买的一套4个混合和配制。此外，与靶基因无关，所有来自Dharmacon的crRNA成本相同。在表21中，虽然CRISPR试剂和转导的常用成本为零，但在CRISPR细胞系中获得、转导和验证胶原蛋白过表达的成本很大。
表20：混合转导所需的试剂。
实施例2：添加剂对胶原蛋白产量的影响。
研究了可能用于增加成纤维细胞的胶原蛋白产量的多种化学刺激剂。乙醛，也被称为乙醇，是乙醇的衍生物，当以高达300μM的浓度添加到培养基中时，已显示可增加狒狒肝肌成纤维细胞和人类真皮成纤维细胞中产生的胶原蛋白的水平。
已知抗坏血酸有利于在包括牛、小鼠和人类在内的细胞类型胶原蛋白的产生。据推测，向培养基中添加咖啡因可能有益于任何基于慢病毒的CRISPR设计方案，因为在基因治疗领域中，其对增加慢病毒活性的效果已得到证明。然而，咖啡因在低至1-5mM的培养基浓度下对胶原蛋白生成有负面影响。这可能主要是由于其抑制包括白细胞介素-8在内的多种生长因子的积累。
虽然众所周知，在高浓度下，向细胞培养基中添加乙醇具有很大的负面影响，但许多研究以50mM浓度进行，以推测酒精肝纤维化的原因。虽然纤维化通常与组织中胶原蛋白含量的增加同义，但以这些浓度在肌成纤维细胞和成纤维细胞中进行的研究报导了这对胶原蛋白生成水平没有直接影响。
尽管谷氨酸与谷氨酰胺密切相关，但谷氨酸对胶原蛋白产生的影响还没有得到广泛的研究，而谷氨酰胺对胶原蛋白转录率有很大的积极影响。一项研究表明，添加了谷氨酸的培养基用于培养人真皮成纤维细胞，相比于对照增加了400％。
为了观察在培养基中存在谷氨酰胺时人真皮成纤维细胞的反应，已经进行了许多研究。在这些研究中所见的浓度范围高达10mM，证明了在250μM时有最大优势，胶原蛋白的产量为对照的近300％。这种效应被认为是通过将谷氨酰胺转化为吡咯啉-5-羧酸来增加胶原蛋白基因转录的水平。
透明质酸在500μg/ml的培养基中对铺板于未暴露表面的人真皮成纤维细胞的胶原蛋白产生表现出中性作用。当置于胶原蛋白上用于培养人真皮成纤维细胞的培养基中透明质酸以150μg/ml存在时，它增加了细胞分裂率和一般原纤维生成，但研究人员没有具体量化胶原蛋白的生成。当它以透明质酸与胶原蛋白重量比为1:19加入培养物表面时，它将鸡胚胎成纤维细胞产生的胶原蛋白量增加到对照的230％。基于这些研究中提供的信息以及众所周知的细胞一旦包裹在胶原蛋白中就停止产生胶原蛋白的趋势，小组假设这会干扰反馈过程，使细胞产生超过适合微环境的实际需要的胶原蛋白。
已经证明，培养基中胰岛素样生长因子1(IGF-1)的水平与胶原蛋白产量之间为正相关，所述胶原蛋白产量通过控制应用于培养人真皮成纤维细胞的培养基的大鼠血清进行。其他研究量化了在浓度为100ng/ml时人肺成纤维细胞的这些值，与对照组相比，人肺成纤维细胞中这些值最大增加300％。从宏观上看，这种效应可以在因遭受动脉粥样硬化而愈合缓慢或疼痛的糖尿病个体中看到。
白细胞介素(IL)具有广泛的与免疫应答相关的糖蛋白。研究人员研究了1β、4、6、8、10和13型对胶原蛋白生成的具体影响。IL-4显示出与对照组相比增加250％的最大正效应。在人类软骨细胞中，任何类型白介素可观察到的阳性效应所需的最低浓度为2.5pM的IL-1β。在上面列出的六种类型中，只有10种IL-10被发现可以降低胶原蛋白的生成水平。
饮酒后，乳酸通常高浓度存在于体内，尤其是在患有酒精肝纤维化的个体中。因此，在培养基中添加酒精可能使得胶原蛋白产量增加，甚至在体外。一项研究似乎认可这一逻辑论点，其表明向用于培养狒狒肝肌成纤维细胞的培养基中添加5mM酒精后，胶原蛋白产量在统计学上显著增加。然而，在人类真皮成纤维细胞中，浓度为40mM的酒精导致胶原蛋白产量下降。
山黧豆素已被用于抑制胶原蛋白交联的形成，而无细胞毒性作用。细胞培养中最常用的山黧豆素是β-氨基丙腈(BAPN)，其通过不可逆地阻断赖氨酰氧化酶发挥作用。其他细胞效应包括防止粘合剂强度的发展和GuHCl可提取胶原蛋白交联前体的构建。任何细胞类型的研究都显示不会对细胞存活率、胶原蛋白合成或非胶原蛋白合成产生不利影响。然而，一项研究表明，在剂量依赖性模式下，0.25和0.5mM的BAPN抑制成纤维细胞迁移。先前的研究已成功使用浓度为0.1mM-0.5mM的BAPN。
脯氨酸在翻译后修饰期间稳定胶原蛋白。一项研究发现，浓度范围为5-10mM的脯氨酸应用于人类真皮成纤维细胞的培养基，与对照值相比，胶原蛋白产量最大增加200％。
吡咯啉-5-羧酸对胶原蛋白生成的影响已在人类真皮成纤维细胞中多次记录。这些研究中提供的信息表明，吡咯啉-5-羧酸的最佳浓度为1mM，相比对照值最大增加260％。有趣的是，这种效应可以在短至6小时内看到。人们认为它具有如此强大的效果，是因为它启用了IGF-1。此外，它可以转换为脯氨酸。
TGF-β家族中的亚家族均显示出对胶原蛋白生成产生积极影响。一般来说，它对细胞中核糖体的数量有正向效应，核糖体是负责翻译包括胶原蛋白在内的所有蛋白质的细胞器。TGF-β1以低至1ng/ml的浓度应用于培养基中的大鼠肝M细胞，显示相比对照组胶原蛋白产量未量化的增加。已经表明，TGF-β产生的胶原蛋白类型与和TGF-β3特别相关的I型胶原蛋白不同。资料源似乎表明浓度为12.5ng/ml，对人类真皮成纤维细胞具有最大效果。
基于加权评分(表13)，在使用表14所示浓度的1阶段筛选研究中，选择了七种最佳添加剂并分别添加到成纤维细胞培养基中。表14显示了待测的添加剂和浓度。文献中引用的常见浓度应为标准条件，增加一个为该值50％的浓度和另一个为该值150％的浓度(表14)。这些添加剂的正向效应已在其他细胞系中示出，但在测试添加剂组合之前，需要独立探索其对角膜成纤维细胞的主要影响。这种因子阶段筛选在生物工程应用的设计实验中很常见。特别是，当对培养基成分采用析因设计时，建议在应用具有优化的高级设计之前，对未知领域进行筛选实验。筛选研究可以通过多种方式进行。最简单的筛选实验设计在两个层面上都是可变的，但这假设了输入和输出之间的线性关系。在本研究中，选择了三级设计以确定最大值。实验的这一阶段确定了哪些添加剂对胶原蛋白生成具有统计学显著影响，以及每种添加剂的浓度具有最高的积极影响。这些数据被纳入实验的第2阶段，其中最高性能添加剂在其最佳浓度范围内使用。
还允许使用七种添加剂，以最大限度地减少板数量和使用的孔数。这形成了3个板，每个板都有具有标准培养基对照组。在试验的第一阶段，在3个浓度下测试了7种培养基添加剂，每个条件下的样本量为4。所用添加剂和浓度由上述先前研究确定。每个孔的胶原蛋白量被量化，但没有进行细胞计数。每个细胞产生的胶原蛋白是基于预期的每孔细胞数估算的。结果见表15。一些组低于SirCol标准曲线1-50μg的范围。这些值表示为1.00μg/100μl，并在结果择优分析中指定为最低的有效性评级。
确定了三种不同的最高性能添加剂(BAP、ACE和ASC)。基于单一添加剂性能，只有三种培养基添加剂使得胶原蛋白产量高于对照组，三种不同的添加剂进行DOE。对于提高了每种添加剂最高排名的三种添加剂，用作DOE中心点。由于库存不足，用ACE低替代ACE中。作为这些修饰的结果，第1阶段的最终选择是BAP低、乙醛低和抗坏血酸低为中心点，而三者在中浓度下为高点(100％)。
在第2阶段，最高性能培养基添加剂被纳入全因子DOE。使用的浓度由多种因素决定，包括折衷研究、剩余实验室供应，最后是相似情况下与较低浓度相关的较低成本。该组将接近情况(near-tie situation)定义为总得分在1％以内的相同化学品的浓度。对于BAP，中心点的浓度被确定为从第1阶段到0.25mM的低浓度，因为它在折衷研究中得分最高。对于抗坏血酸，观察到接近情况，因此第1阶段选择了0.5mM的低浓度。对于乙醛，由于库存问题，选择0.2mM的低浓度。对于完成全因子DOE计划的构建所需的100％浓度限值，这些值中的每一个都加倍，对应于第1阶段的中等条件。
如图9所示，只有三种条件的胶原输出超过检测极限：ACS:BAP、ACS:BAP:ACE和中心点(CPT或000)。这三种情况的增加倍数分别为1.96、7.23和6.68。在这些条件下，标准差很大。这可能是由于随后两种条件下的细胞死亡、pH或结晶。由于这些大的偏差在组之间没有统计学差异。需要更多的样本来检测此差异。
参考文献
Wu,F.,Nerlich,M.,&Docheva,D.(2017).Tendon injuries:Basic science andnew repair proposals.EFORTopenreviews,2(7),332–342.；doi.org/10.1302/2058-5241.2.160075.
(nhs.uk/conditions/hand-tendon-repair/recovery/)Recovery Hand TendonRepair.(2018,June 14).RetrievedFebruary 13,2020,fromnhs.uk/conditions/hand-tendon-repair/recovery/.
(orthocarolina.com/media/how-does-a-patch-repair-a-rotator-cuff-tear)Rotator Cuff Surgery.(2018,May 21).Retrieved February 16,2020,fromorthocarolina.com/media/how-does-a-patch-repair-a-rotator-cuff-tear.
Vig K,Chaudhari A,Tripathi S,Dixit S,Sahu R,Pillai S,Dennis V.A.,Singh S.R.Advances in SkinRegenerationUsingTissue Engineering 18,789,2017.
Yao,J.Q.,Blanchard,C.R.,&Bloor,S.(2005).Collagen Repair Patchfor Rotator Cuff Tendon Repair.Zimmer,Inc.
OKeefe,R.J.,Chu,C.R.,Jacobs,J.J.,&Einhorn,T.A.(2013).Orthopaedicbasic science:foundations of clinical practice(4th ed.).Rosemont,IL:AmericanAcademy of OrthopaedicSurgeons.
Packer,H.(2016,February 04),reprinted with permission from CRISPRguide RNA format affects genome editing outcomes；retrieved from(idtdna.com/pages/education/decoded/article/crispr-guide-rna-format-affects-genome-editing-).
Biolabs:(neb.com,2019),reprinted with permission from New EnglandBiolabs from neb.com.
Biolabs,2019:Biolabs,N.E.CRISPR/Cas9&Targeted Genome Editing:New Erain Molecular Biology.Retrieved from(neb.com/tools-and-resources/feature-articles/crispr-cas9-and-targeted-genome-editing-a-new-era-in-molecular-biology).
Lodish H,Berk A,Zipursky SL,et al.,Molecular Cell Biology.4thedition.New York:W.H.Freeman；2000.Section 22.3,“Collagen:The Fibrous Proteinsofthe Matrix”；available from:(ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21582/).
Schleip,R.(2012).Fascia:the tensional network of the human body thescience and clinical applications in manual and movement therapy.Edinburgh:Churchill Livingstone/Elsevier.
NIH,COL1A1 and COL1A2 genes-Genetics Home Reference-(2019,May 28).Retrieved from(ghr.nlm.nih.gov/gene/COL1A1)and retrieved from(ghr.nlm.nih.gov/gene/COL1A2).
Gelse,K.,E.,&Aigner,T.(2003).Collagens--structure,function,andbiosynthesis.Advanced Drug Delivery Reviews.Available from:(core.ac.uk/download/pdf/2756387.pdf).
Wu M,Crane JS.Biochemistry,Collagen Synthesis.[Updated 2019 Apr 21].In:StatPearls[Internet].Treasure Island(FL):StatPearls Publishing；2019 Jan-.Available from:(ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507709/).
Stuart,J.M.,Townes,A.S.,&Kang,A.H.(1982).Nature and specificity oftheimmune response to collagen in type II collagen-induced arthritis in mice.TheJournal ofclinical investigation,69(3),673–683.doi:10.1172/jci110495.
Lynn,A.K.,Yannas,I.V.,&Bonfield,W.(2004).Antigenicity andimmunogenicity of collagen.Journal ofBiomedical Materials Research,71B(2),343–354.doi:10.1002/jbm.b.30096.
Tuteja,R.(2005).Type I signal peptidase:An overview.ArchivesofBiochemistry and Biophysics.https://doi.org/10.1016/j.abb.2005.07.013.
Bonfanti,L.,Mironov,A.A.,Martínez-Menárguez,J.A.,Martella,O.,Fusella,A.,Baldassarre,M.,…Luini,A.(1998).Procollagen traverses the Golgi stackwithout leaving the lumen of cisternae:Evidence for cisternalmaturation.Cell.https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)81723-7.
Uchio,Y.,Ochi,M.,Matsusaki,M.,Kurioka,H.,&Katsube,K.(2000).Humanchondrocyte proliferation and matrix synthesis cultured in Atelocollagengel.Journal of Biomedical Materials Research,50(2),138–143.doi:10.1002/(sici)1097-4636(200005)50:2<138::aid-jbm7>3.0.co；2-k.
CRISPR Guide.(n.d.).Retrieved from(addgene.org/crispr/guide/).
CRISPR Guide Design Software.(n.d.).Retrieved from(benchling.com/crispr/)
COL1A1 crRNA Pool:
horizondiscovery.com/en/crisprmod/crispra/products/crispra-crrna？nodeid＝entrezgene-1277COL1A2 crRNA Pool:
horizondiscovery.com/en/crisprmod/crispra/products/crispra-crrna？nodeid＝entrezgene-1278TGF-β3 crRNAPool:
horizondiscovery.com/en/crisprmod/crispra/products/crispra-crrna？nodeid＝entrezgene-7043Borawski,J.,et al.,Optimization Procedure for smallinterfering RNA Transfection in a 384-well format.J.Bimolecular Screening.12,546-559(2007).
Pellegrini,A.(2016,February 1).How to Design gRNA to Target YourFavorite Gene[Web log post].Retrieved from(blog.benchling.com/2016/02/01/how-to-design-gRNA-to-target-your-favorite-gene/).
Wyatt,D.,&Ramsden,D.(2015,April 16).CRISPR 101:Non-Homologous EndJoining[Web log post].Retrieved from(blog.addgene.org/crispr-101-non-homologous-end-joining).
Mohr,S.E.,Hu,Y.,Ewen-Campen,B.,Housden,B.E.,Viswanatha,R.,&Perrimon,N.(2016).CRISPR guide RNA design for research applications.The FEBS journal,283(17),3232–3238.https://doi.org/10.1111/febs.13777.
Zhang,Feng；Wen,Yan；Guo,Xiong；CRISPR/Cas9 for genome editing:progress,implications and challenges,Human Molecular Genetics,Volume 23,Issue R1,15September 2014,Pages R40–R46,(doi.org/10.1093/hmg/ddu125).
COL1A1 gene,2019-Genetics Home Reference-NIH.(2019,May 28).Retrievedfrom(ghr.nlm.nih.gov/gene/COL1A1).
COL1A2 gene,2019-Genetics Home Reference-NIH.(2019,May 28).Retrievedfrom(ghr.nlm.nih.gov/gene/COL1A2).
Introduction to Transfection.no date(n.d.).Retrieved from(thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/introd uction-to-transfection.html).
Human COL1A1 gene(1277).(n.d.).Retrieved from(dharmacon.horizondiscovery.com/biology-overview-entrezgene-1277-col1a1/.
MeSH Browser:Transduction,Genetic.(n.d.).Retrieved from(meshb.nlm.nih.gov/record/ui？name＝Transduction,Genetic).
Edit-R CRISPRa crRNA.(n.d.).Retrieved from(dharmacon.horizondiscovery.com/crispr-activation/crispra-guide-rna/edit-r-crispra-crrna/？term＝&p[73]005D982AF75C&sourceId＝entrezgene/1277).
Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a singlelentiviral vector.(n.d.).Retrieved from(addgene.org/browse/article/8975/).
Kabadi,Ami M.；David G.Ousterout,Isaac B.Hilton,Charles A.Gersbach,Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviralvector,Nucleic Acids Research,Volume 42,Issue 19,29 October[145]2014,Pagee147,(doi.org/10.1093/nar/gku749).
Inspired Cell Solutions,2018:DharmaconTMEdit-RTMCRISPRatranscriptional activation system with synthetic guide RNA.(2018).Cambridge,MA:Horizon[150]Discovery Group Company.
Electroporation,2015:Electroporation of DharmaconTM Edit-RTM dCas9-VPRmRNA and synthetic guide RNA for gene modulation..(2015,October).Retrievedfrom(dharmacon.horizondiscovery.com/uploadedFiles/Resources/dcas9-vpr-mrna-electroporation-protocol).
Transfection Protocol.(2016,September).Retrieved from(dharmacon.horizondiscovery.com/uploadedFiles/Resources/dcas9-vpr-mrna-quick-protocol.pdf).
Human TGFβ1 gene(7040).(n.d.).Retrieved from(dharmacon.horizondiscovery.com/biology-overview-entrezgene-7040-tgfb1/).
Transcriptional Activation System,2018:DharmaconTM Edit-RTMtranscriptional activation system with expressed sgRNA.(2018).Retrieved fromdharmacon.horizondiscovery.com/uploadedFiles/Resources/edit-r-crispra-lentiviral-guide-rna-manu).
Trans-Lentiviral shRNA Packaging System,2016:Trans-Lentiviral shRNAPackaging System.(n.d.).Retrieved from (dharmacon.horizondiscovery.com/viral-packaging/trans-lentiviral-shrna-packaging-system/).
Mandenius,C.-F.and Brundin,A.(2008),Bioprocess optimization usingdesign-of-experiments methodology.Biotechnol Progress,24:1191-1203.doi:10.1002/btpr.67.
Wang Y.-H,Yang B,Ren J,Dong M.-L,Liang D,Xu A.-L.Optimization ofmedium composition for the production of clavulanic acid by Streptomycesclavuligerus.Process Biochem.2004；40:1161–1166.
Jinek,M.,et al.A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease inAdaptive Bacterial Immunity.Science.337(6096),816-821(2012).
Tanenbaum,M.E.,et al.A Protein Tagging System for SignalAmplification in Gene Expression and Fluorescence Imaging.Cell 159(3):635-646(2014).

Claims (59)

1.一种能够增强胶原蛋白生物合成的工程化细胞，其中所述细胞被工程化以通过所述细胞对与胶原蛋白生物合成相关的靶基因进行基于CRISPR的激活(CRISPRa)，其中所述细胞表达与转录激活蛋白(dCas9激活剂)融合的内切酶缺陷Cas9(dCas9)蛋白和对靶基因特异的向导RNA(gRNA)，其中与同一类型的未工程化细胞相比，所述工程化细胞能够增加胶原蛋白生物合成的至少10倍，至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍或至少300倍。
2.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述靶基因选自COL1A1、COL1A2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
3.根据权利要求2所述的工程化细胞，其中由所述细胞表达并对所述靶基因特异的gRNA包括SEQ ID NO:1-156中任一条的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述细胞被工程化为执行一种或多种靶基因的CRISPRa，所述一种或多种靶基因选自脯氨酰-3-羟化酶家族基因、脯氨酰-4-羟化酶家族基因、赖氨酰羟化酶家族基因、GLT25D1、GLT25D2、Grp78、Grp94、蛋白二硫键异构酶(PDI)家族基因、钙网蛋白、钙连蛋白、亲环素B、肽基脯氨酰顺反异构酶(PPlase)家族基因、亲环素、FK 506结合蛋白(FKBP)基因、亲环素B(CypB)、HSP47、TANG01、SEC13、SEC31和迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)。
5.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞表达对两种或多种靶基因特异的gRNA，并且所述两种或多种靶基因中的每一种都被激活。
6.根据权利要求5所述的工程化细胞，其中一种或多种胶原蛋白基因和一种或多种TGFβ基因被靶向；
其中所述一种或多种胶原基因选自COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2和COL5A3；
其中所述一种或多种TGF-β基因选自TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3；和
其中所述细胞表达对所述一种或多种胶原蛋白基因和所述一种或多种TGF-β基因特异的gRNA。
7.根据权利要求6所述的工程化细胞，其中所述胶原基因选自COL1A1和COL1A2；所述TGF-β基因选自TGF-β1和TGF-β3，其中所述COL1A1 gRNA包括SEQ ID NO:1-4中任一条的核苷酸序列，COL1A2 gRNA包括SEQ ID NO:5-8中任一条的核苷酸序列，其中所述TGF-β1gRNA包括SEQ ID NO:13-16中任一条的核苷酸序列，TGF-β3gRNA包括SEQ ID NO:9-12中任一条的核苷酸序列。
8.根据权利要求6所述的工程化细胞，其中一种或多种前肽酶基因被进一步靶向，其中所述前肽酶基因选自ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
9.根据权利要求8所述的工程化细胞，其中所述前肽酶基因ADAMTS2和BMP-1被靶向，其中ADAMTS2 gRNA包括SEQ ID NO:69-72中任一条的核苷酸序列，并且所述BMP-1gRNA包括SEQ ID NO:153-156中任一条的核苷酸序列。
10.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述转录激活剂选自VP64、p65、Rta、VPR(VP64、p65和Rta的组合)、MS2、HSF1、SAM(MS2、p65和HSF-1的组合)和SunTag。
11.根据权利要求10所述的工程化细胞，其中所述dCas9激活剂为dCas9-VPR。
12.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述细胞被转染以表达所述dCas9激活剂和所述一种或多种gRNA。
13.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述细胞已被转导以表达所述dCas9激活剂和所述一种或多种gRNA。
14.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述细胞是源自选自成纤维细胞、间充质细胞、肌成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞和诱导多能干细胞的细胞类型。
15.根据权利要求14所述的工程化细胞，其中所述细胞源自人角膜成纤维细胞。
16.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述细胞源自从哺乳动物受试者获得的细胞，所述哺乳动物受试者需要施用胶原蛋白。
17.一种细胞培养物，包括权利要求1所述的工程化细胞。
18.根据权利要求17所述的细胞培养物，所述细胞培养物是永生的。
19.一种用于工程化细胞以提供增强的胶原蛋白生物合成的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供细胞、编码dCas9激活剂的第一核酸分子和对与胶原蛋白生物合成相关的靶基因特异的第二核酸分子；和
(b)用所述第一核酸分子和第二核酸分子转染或转导所述细胞；
所述细胞变得能够表达所述dCas9激活剂和所述gRNA，所述靶基因被激活。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶基因选自COL1A1、COL1A2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述gRNA包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:156中任一条的核苷酸序列。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞被工程化为执行一种或多种靶向基因的CRISPRa，所述一种或多种靶向基因选自脯氨酰-3-羟化酶家族基因、脯氨酰-4-羟化酶家族基因、赖氨酰羟化酶家族基因、GLT25D1、GLT25D2、Grp78、Grp94、蛋白二硫键异构酶(PDI)家族基因、钙网蛋白、钙连蛋白、亲环素B、肽基脯氨酰顺反异构酶(PPlase)家族基因、亲环素、FK 506结合蛋白(FKBP)基因、亲环素B(CypB)、HSP47、TANG01、SEC13、SEC31和迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞用两个或多个第二核酸分子转染，每个第二核酸分子对不同的靶基因特异，其中每个所述靶基因被激活。
24.根据权利要求23所述的方法，其中一种或多种胶原蛋白基因和一种或多种TGFβ基因被靶向；
其中一种或多种胶原蛋白基因选自COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2和COL5A3；
其中，所述TGF-β基因选自TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3；以及
其中所述细胞表达对所述一种或多种胶原蛋白基因和所述一种或多种TGF-β基因特异的gRNA。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述胶原蛋白基因选自COL1A1和COL1A2，所述TGF-β基因选自TGF-β1和TGF-β3，其中COL1A1 gRNA包括SEQ ID NO:1-4中任一条的核苷酸序列，COL1A2 gRNA包括SEQ ID NO:5-8中任一条的核苷酸序列，TGF-β1gRNA包括SEQ IDNO:13-16中任一条的核苷酸序列，和TGF-β3gRNA包括SEQ ID NO:9-12中任一条的核苷酸序列。
26.根据权利要求24所述的方法，其中一种或多种前肽酶基因被进一步靶向，其中所述一种或多种前肽酶基因选自ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述前肽酶基因ADAMTS2和BMP-1被靶向，并且其中ADAMTS2 gRNA包括SEQ ID NO:69-72中任一条的核苷酸序列，BMP-1gRNA包括SEQ ID NO:153-156中任一条的核苷酸序列。
28.根据权利要求19所述的方法，其中所述dCas9激活剂为dCas9-VPR。
29.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞源自选自成纤维细胞、成肌细胞、成骨细胞、软骨细胞和诱导多能干细胞的细胞类型。
30.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞源自人角膜成纤维细胞。
31.根据权利要求19所述的方法，其中在步骤(b)中使用慢病毒载体转导所述细胞。
32.根据权利要求19所述的方法，其中步骤(a)包括从需要施用胶原蛋白的哺乳动物受试者或同一物种的不同哺乳动物受试者获得样本，并从所述样本提供的细胞衍生。
33.一种用于工程化细胞以增强细胞胶原蛋白生物合成的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)编码dCas9激活蛋白的第一核酸分子；
(ii)包含或编码对胶原蛋白生物合成相关的靶基因特异的crRNA的第二核酸分子；和
(iii)任选地，一种或多种试剂，用于用所述第一核酸分子和第二核酸分子转染或转导细胞。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述靶基因选自COL1A1、COL1A2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述crRNA包括SEQ ID NO:1-156中任一条的核苷酸序列。
36.根据权利要求33所述的试剂盒，其中提供了两个或多个第二核酸分子，每个第二核酸分子包括或编码对不同靶基因特异的crRNA。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述两个或多个第二核酸分子包含或编码对一种或多种胶原蛋白基因和一种或多种TGFβ基因特异的crRNA；
其中所述一种或多种胶原基因选自COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2和COL5A3；和
其中所述TGF-β基因选自TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述胶原蛋白基因选自COL1A1和COL1A2，所述TGF-β基因选自TGF-β1和TGF-β3，其中所述COL1A1 gRNA包括SEQ ID NO:1-4中任一条的核苷酸序列，COL1A2 gRNA包括SEQ ID NO:5-8中任一条的核苷酸序列，其中所述TGF-β1gRNA包括SEQ ID NO:13-16中任一条的核苷酸序列，TGF-β3gRNA包括SEQ ID NO:9-12中任一条的核苷酸序列。
39.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述两个或多个第二核酸还包含或编码对一种或多种前肽酶基因特异的crRNA，其中所述前肽酶基因选自ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、TLL1、TLL2和BMP1。
40.根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述两个或多个第二核酸分子包括或编码对前肽酶基因ADAMTS2和BMP-1特异的crRNA，并且其中ADAMTS2 gRNA包括SEQ ID NO:69-72中任一条的核苷酸序列，BMP-1gRNA包括SEQ ID NO:153-156中任一条的核苷酸序列。
41.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述第二核酸分子还包括或编码对一种或多种基因特异的crRNA，所述一种或多种基因选自脯氨酰-3-羟化酶家族基因、脯氨酰-4-羟化酶家族基因、赖氨酰羟化酶家族基因、GLT25D1、GLT25D2、Grp78、Grp94、蛋白二硫键异构酶(PDI)家族基因、钙网蛋白、钙连蛋白、亲环素B、肽基脯氨酰顺反异构酶(PPlase)家族基因、亲环素、FK 506结合蛋白(FKBP)基因、亲环素B(CypB)、HSP47、TANG01、SEC13、SEC31和迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)。
42.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述dCas9激活剂为dCas9-VPR。
43.一种包括权利要求1所述的工程化细胞的医疗器械。
44.根据权利要求43所述的医疗器械，所述医疗器械被植入受试者身体。
45.一种生产胶原蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供权利要求17所述的细胞培养物；
(b)在胶原蛋白是由细胞培养物中的细胞生物合成的条件下，使所述细胞培养物在生物反应器中生长；并
(c)从所述生物反应器中收获和纯化胶原蛋白。
46.根据权利要求45所述的方法，其中步骤(b)在胶原蛋白生物合成调节剂存在下进行。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述调节剂选自乙醛、抗坏血酸、透明质酸、β-氨基丙腈、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、谷氨酰胺及其组合。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述调节剂是抗坏血酸和β-氨基丙腈的组合，或抗坏血酸、乙醛和β-氨基丙腈的组合。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述调节剂为β-氨基丙腈，并且与不存在β-氨基丙腈相比，减少或防止了胶原的交联。
50.根据权利要求45所述的方法，其中步骤(b)在对细胞施加机械应变的情况下进行。
51.根据权利要求50所述的方法，其中使用粘附到基底、珠子或骨架上的细胞诱导机械应变。
52.根据权利要求45所述的方法，还包括，在步骤(b)和(c)之间：
(b1)在细胞生长培养基中浓缩生物合成胶原蛋白，其中加速了所述生物合成胶原蛋白前肽的裂解。
53.根据权利要求45所述的方法，其中产生的胶原蛋白选自I-V型胶原蛋白。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述胶原蛋白为I型胶原蛋白。
55.一种治疗患有以胶原蛋白不足为特征的医学症状的哺乳动物受试者的方法，所述方法包括：
(a)执行权利要求32所述的方法，从而获得由源自哺乳动物受试者或同一物种的不同哺乳动物受试者的细胞产生的胶原蛋白；并
(b)向受试者施用胶原蛋白。
56.根据权利要求55所述的方法，其中使用医疗器械施用所述胶原蛋白。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述医疗器械选自烧伤/伤口覆盖物或敷料、成骨和/或骨填充材料、具有抗血栓形成表面的器械、具有治疗酶固定表面的器械、胶原蛋白补片、闭合移植物、可操作地提供胶原蛋白的植入物、角膜植入物、绷带接触镜、胶原蛋白基膜和胶原蛋白基药物递送器械。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述医学症状选自伤口、韧带或肌腱撕裂、骨折、软骨受损、眼部症状、需要美容治疗或手术的症状、皮肤病、皮肤皱纹或疤痕和烧伤。
59.一种对人类受试者进行美容治疗的方法，所述方法包括：
(a)执行权利要求32所述的方法，从而获得由源自哺乳动物受试者或同一哺乳动物物种的其他受试者的细胞产生的胶原蛋白；和
(b)给受试者施用步骤(a)中获得的胶原蛋白。
CN202180079689.XA 2020-10-15 2021-10-15 用于增加胶原蛋白产量的工程化细胞 Pending CN116802289A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063092433P 2020-10-15 2020-10-15
US63/092,433 2020-10-15
PCT/US2021/055315 WO2022082070A1 (en) 2020-10-15 2021-10-15 Engineered cells for increased collagen production

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116802289A true CN116802289A (zh) 2023-09-22

Family

ID=81209349

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180079689.XA Pending CN116802289A (zh) 2020-10-15 2021-10-15 用于增加胶原蛋白产量的工程化细胞

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20240043818A1 (zh)
EP (1) EP4229193A1 (zh)
JP (1) JP2023545510A (zh)
KR (1) KR20230090331A (zh)
CN (1) CN116802289A (zh)
AU (1) AU2021362215A1 (zh)
BR (1) BR112023007024A2 (zh)
CA (1) CA3195756A1 (zh)
IL (1) IL302123A (zh)
WO (1) WO2022082070A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116694683B (zh) * 2023-06-02 2024-06-14 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 靶向猪COL1A1基因下游序列的CRISPR-Cas9系统及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2508212A1 (en) * 2011-04-05 2012-10-10 Universitätsklinikum Freiburg Biocompatible and biodegradable gradient layer system for regenerative medicine and for tissue support
CN114230675A (zh) * 2013-06-05 2022-03-25 杜克大学 Rna指导的基因编辑和基因调节
EP3169776A4 (en) * 2014-07-14 2018-07-04 The Regents of The University of California Crispr/cas transcriptional modulation
WO2020081922A1 (en) * 2018-10-18 2020-04-23 University Of Utah Research Foundation Rna-guided transcriptional regulation and methods of using the same for the treatment of back pain

Also Published As

Publication number Publication date
EP4229193A1 (en) 2023-08-23
BR112023007024A2 (pt) 2023-10-03
US20240043818A1 (en) 2024-02-08
AU2021362215A1 (en) 2023-06-01
WO2022082070A1 (en) 2022-04-21
CA3195756A1 (en) 2022-04-21
JP2023545510A (ja) 2023-10-30
KR20230090331A (ko) 2023-06-21
IL302123A (en) 2023-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2703893B2 (ja) 外来遺伝子物質を発現する上皮細胞
US4980286A (en) In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
CA1341311C (en) Transduced fibroblasts and uses therefor
DE69636122T2 (de) Verfahren zum gentransfer in zielzellen mit einem retrovirus
KR100214740B1 (ko) 골유도조성물
CN112334168A (zh) 真皮填充剂和其应用
Meyer-Ingold et al. Platelet-derived growth factor.
JPH03505036A (ja) 内皮細胞の遺伝子修飾
WO2001090345A2 (en) Methods and compositions for enhancing the delivery of a nucleic acid to a cell
CN114480505B (zh) 间充质干细胞及其抗炎应用
US20240043818A1 (en) Engineered Cells for Increased Collagen Production
Andreadis Gene transfer to epidermal stem cells: implications for tissue engineering
Salyapongse et al. Gene therapy and tissue engineering
Hao et al. Gene transfer and living release of transforming growth factor-β3 for cartilage tissue engineering applications
CN111620953A (zh) 类胶原融合蛋白组合物及制备方法
WO2022018884A1 (ja) 栄養障害型表皮水疱症の治療薬
KR20200132740A (ko) 요산분해효소를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 통풍의 예방 또는 치료용 조성물
AU2021330721A1 (en) Cellulose binding domain (CBD) cell effector protein (CEP) chimera, for the tissue engineering
US20210310021A1 (en) Gene therapy based on vector vtvaf17
Wissel et al. Fibroblast-mediated delivery of GDNF induces neuronal-like outgrowth in PC12 cells
TWI846476B (zh) 重組iii型人源化膠原蛋白及其核苷酸序列、製備方法與用途
Woolf et al. Gene transfer into the mammalian kidney: First steps towards renal gene therapy.
Skowron et al. DNA-FACE™-An Escherichia coli-based DNA Amplification-Expression Technology for Automatic Assembly of Concatemeric ORFs and Proteins
CN102105488A (zh) 真核细胞的长期培养方法及其应用
JPS62501071A (ja) 成長因子活性を有する新規なポリペプチド及び該ポリペプチドをコ−ドする核酸配列

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination