FR3058160A1 - Procede de differenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes - Google Patents
Procede de differenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes Download PDFInfo
- Publication number
- FR3058160A1 FR3058160A1 FR1660531A FR1660531A FR3058160A1 FR 3058160 A1 FR3058160 A1 FR 3058160A1 FR 1660531 A FR1660531 A FR 1660531A FR 1660531 A FR1660531 A FR 1660531A FR 3058160 A1 FR3058160 A1 FR 3058160A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- stem cells
- pluripotent stem
- expression
- vector
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 126
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 98
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 75
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 72
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 55
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 161
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 140
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 112
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 112
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 98
- 101150003286 gata4 gene Proteins 0.000 claims description 66
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 60
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 55
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 48
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 35
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims description 27
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 26
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 26
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 26
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 25
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 24
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 24
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 claims description 24
- 108060006662 GSK3 Proteins 0.000 claims description 22
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 claims description 19
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 15
- 101150107475 MEF2C gene Proteins 0.000 claims description 14
- 101150115978 tbx5 gene Proteins 0.000 claims description 14
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 5
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 claims description 3
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 71
- 102000055120 MEF2 Transcription Factors Human genes 0.000 description 48
- 108010018650 MEF2 Transcription Factors Proteins 0.000 description 48
- WRKPZSMRWPJJDH-UHFFFAOYSA-N N-(6-methyl-1,3-benzothiazol-2-yl)-2-[(4-oxo-3-phenyl-6,7-dihydrothieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]acetamide Chemical compound S1C2=CC(C)=CC=C2N=C1NC(=O)CSC1=NC=2CCSC=2C(=O)N1C1=CC=CC=C1 WRKPZSMRWPJJDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 108010014480 T-box transcription factor 5 Proteins 0.000 description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 35
- 102100024755 T-box transcription factor TBX5 Human genes 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 30
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 29
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N n-[2-chloro-5-(trifluoromethyl)phenyl]-2-[3-(4-ethyl-5-ethylsulfanyl-1,2,4-triazol-3-yl)piperidin-1-yl]acetamide Chemical compound CCN1C(SCC)=NN=C1C1CN(CC(=O)NC=2C(=CC=C(C=2)C(F)(F)F)Cl)CCC1 NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 13
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 12
- -1 for example Proteins 0.000 description 12
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 11
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 11
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 241000766026 Coregonus nasus Species 0.000 description 8
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 8
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 6
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 5
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 5
- 102000004987 Troponin T Human genes 0.000 description 5
- 108090001108 Troponin T Proteins 0.000 description 5
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000011458 pharmacological treatment Methods 0.000 description 5
- 102100032964 Alpha-actinin-2 Human genes 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101100013973 Mus musculus Gata4 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100036639 Myosin-11 Human genes 0.000 description 4
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 102100031620 Cysteine and glycine-rich protein 3 Human genes 0.000 description 3
- 101150039256 GMT1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000797275 Homo sapiens Alpha-actinin-2 Proteins 0.000 description 3
- 101001000104 Homo sapiens Myosin-11 Proteins 0.000 description 3
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 3
- 101100388545 Mus musculus Slc1a3 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100026925 Myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform Human genes 0.000 description 3
- 101710105127 Myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 102100029948 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 230000001269 cardiogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 101150103339 gmt2 gene Proteins 0.000 description 3
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 102000017920 ADRB1 Human genes 0.000 description 2
- 102000017919 ADRB2 Human genes 0.000 description 2
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100031621 Cysteine and glycine-rich protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000892264 Homo sapiens Beta-1 adrenergic receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000959437 Homo sapiens Beta-2 adrenergic receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000940764 Homo sapiens Cysteine and glycine-rich protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000977765 Homo sapiens Iroquois-class homeodomain protein IRX-4 Proteins 0.000 description 2
- 101000819088 Homo sapiens Transcription factor GATA-6 Proteins 0.000 description 2
- 101000863873 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 2
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 102100038934 Myosin-7 Human genes 0.000 description 2
- 101150114527 Nkx2-5 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 101150013356 TNNT2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100021382 Transcription factor GATA-6 Human genes 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 101100460507 Xenopus laevis nkx-2.5 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000037020 contractile activity Effects 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- JLHWBVQBEGDSEZ-LFOOZZFTSA-N (4s)-5-[[(2s)-1-[(2s)-2-[(2s)-2-[[(2s)-1-[(2s)-2-[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-carbamoylpyrrolidin-1-yl]-1-oxo-3-phosphonooxypropan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidine-1-carbonyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]carbamoyl]p Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](COP(O)(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(N)=O)CCC1 JLHWBVQBEGDSEZ-LFOOZZFTSA-N 0.000 description 1
- GDVRVPIXWXOKQO-UHFFFAOYSA-N 1-[(3-hydroxyphenyl)methyl]-3-(4-pyridin-4-yl-1,3-thiazol-2-yl)urea Chemical compound OC1=CC=CC(CNC(=O)NC=2SC=C(N=2)C=2C=CN=CC=2)=C1 GDVRVPIXWXOKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RCKYSTKYIVULEK-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-[3-(4-methylsulfinylphenyl)-1-benzofuran-5-yl]-1,3,4-oxadiazole Chemical compound O1C(C)=NN=C1C1=CC=C(OC=C2C=3C=CC(=CC=3)S(C)=O)C2=C1 RCKYSTKYIVULEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWHVZCLBMTZRQM-UHFFFAOYSA-N 2H-pyrazolo[4,3-b]quinoxalin-3-amine Chemical compound C1=CC=CC2=NC3=C(N)NN=C3N=C21 DWHVZCLBMTZRQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JCSGFHVFHSKIJH-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4-dichlorophenyl)-4-(1-methyl-3-indolyl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C12=CC=CC=C2N(C)C=C1C(C(NC1=O)=O)=C1C1=CC=C(Cl)C=C1Cl JCSGFHVFHSKIJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CLGRAWDGLMENOD-UHFFFAOYSA-N 3-[5-[4-(2-hydroxy-2-methylpropanoyl)piperazin-1-yl]-2-(trifluoromethyl)phenyl]-4-(1h-indol-3-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C1CN(C(=O)C(C)(O)C)CCN1C1=CC=C(C(F)(F)F)C(C=2C(NC(=O)C=2C=2C3=CC=CC=C3NC=2)=O)=C1 CLGRAWDGLMENOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VPVLEBIVXZSOMQ-UHFFFAOYSA-N 3-[[6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]oxy]phenol Chemical compound NC1=CC=CC(C=2NC3=NC=NC(OC=4C=C(O)C=CC=4)=C3C=2)=C1 VPVLEBIVXZSOMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ULVWJFBHQIXEPE-UHFFFAOYSA-N 5-ethyl-7,8-dimethoxypyrrolo[3,4-c]isoquinoline-1,3-dione Chemical compound C12=CC(OC)=C(OC)C=C2C(CC)=NC2=C1C(=O)NC2=O ULVWJFBHQIXEPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005075 5S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150099796 ACTN2 gene Proteins 0.000 description 1
- BLTVBQXJFVRPFK-UHFFFAOYSA-N AZD1080 Chemical compound OC=1NC2=CC=C(C#N)C=C2C=1C(N=C1)=CC=C1CN1CCOCC1 BLTVBQXJFVRPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 1
- 108060003345 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000017910 Adrenergic receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101710115259 Alpha-actinin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100040794 Beta-1 adrenergic receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010064535 CCAAT-Enhancer-Binding Protein-beta Proteins 0.000 description 1
- MDZCSIDIPDZWKL-UHFFFAOYSA-N CHIR-98014 Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(N)=NC(NCCNC=2N=C(C(=CN=2)N2C=NC=C2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=C1 MDZCSIDIPDZWKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100366604 Caenorhabditis elegans unc-120 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 208000002330 Congenital Heart Defects Diseases 0.000 description 1
- 102100031051 Cysteine and glycine-rich protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710185487 Cysteine and glycine-rich protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710185482 Cysteine and glycine-rich protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 102100028043 Fibroblast growth factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000589599 Francisella tularensis subsp. novicida Species 0.000 description 1
- 108010052320 GATA4 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018715 GATA4 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010021779 GATA5 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000008412 GATA5 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 101000597041 Gallus gallus Transcriptional enhancer factor TEF-3 Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101710184435 Heart- and neural crest derivatives-expressed protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023855 Heart- and neural crest derivatives-expressed protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 102100027875 Homeobox protein Nkx-2.5 Human genes 0.000 description 1
- 101001060280 Homo sapiens Fibroblast growth factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000632197 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-2.5 Proteins 0.000 description 1
- 101001053263 Homo sapiens Insulin gene enhancer protein ISL-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001014572 Homo sapiens MARCKS-related protein Proteins 0.000 description 1
- 101100456626 Homo sapiens MEF2A gene Proteins 0.000 description 1
- 101000629402 Homo sapiens Mesoderm posterior protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000629405 Homo sapiens Mesoderm posterior protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001030243 Homo sapiens Myosin-7 Proteins 0.000 description 1
- 101001094649 Homo sapiens Popeye domain-containing protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000685824 Homo sapiens Probable RNA polymerase II nuclear localization protein SLC7A6OS Proteins 0.000 description 1
- 101000608234 Homo sapiens Pyrin domain-containing protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000713590 Homo sapiens T-box transcription factor TBX1 Proteins 0.000 description 1
- 101000653635 Homo sapiens T-box transcription factor TBX18 Proteins 0.000 description 1
- 101000713606 Homo sapiens T-box transcription factor TBX20 Proteins 0.000 description 1
- 101000666775 Homo sapiens T-box transcription factor TBX3 Proteins 0.000 description 1
- 101000578693 Homo sapiens Target of rapamycin complex subunit LST8 Proteins 0.000 description 1
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000653735 Homo sapiens Transcriptional enhancer factor TEF-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000597045 Homo sapiens Transcriptional enhancer factor TEF-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000597043 Homo sapiens Transcriptional enhancer factor TEF-5 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100024392 Insulin gene enhancer protein ISL-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100023531 Iroquois-class homeodomain protein IRX-4 Human genes 0.000 description 1
- 241000029603 Leptotrichia shahii Species 0.000 description 1
- 101150074995 MYL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930187691 Meridianin Natural products 0.000 description 1
- 102100026822 Mesoderm posterior protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026817 Mesoderm posterior protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100013967 Mus musculus Gata3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100079042 Mus musculus Myef2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021148 Myocyte-specific enhancer factor 2A Human genes 0.000 description 1
- 101710115164 Myosin-11 Proteins 0.000 description 1
- 101710204029 Myosin-7 Proteins 0.000 description 1
- OLIIUAHHAZEXEX-UHFFFAOYSA-N N-(6-fluoro-1H-indazol-5-yl)-6-methyl-2-oxo-4-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-3,4-dihydro-1H-pyridine-5-carboxamide Chemical compound C1C(=O)NC(C)=C(C(=O)NC=2C(=CC=3NN=CC=3C=2)F)C1C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 OLIIUAHHAZEXEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010063250 N-myristoyl-glycyl-lysyl-glutamyl-alanyl-prolyl-prolyl-alanyl-prolyl-prolyl-glutaminyl-phosphoseryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100023136 Probable RNA polymerase II nuclear localization protein SLC7A6OS Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 102100039889 Pyrin domain-containing protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 101001120884 Rana temporaria Melittin-like peptide Proteins 0.000 description 1
- 101001133082 Rattus norvegicus Intestinal mucin-like protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- PQCXVIPXISBFPN-UHFFFAOYSA-N SB 415286 Chemical compound C1=C(Cl)C(O)=CC=C1NC1=C(C=2C(=CC=CC=2)[N+]([O-])=O)C(=O)NC1=O PQCXVIPXISBFPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150036449 SIRPA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 1
- 108010029625 T-Box Domain Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100036771 T-box transcription factor TBX1 Human genes 0.000 description 1
- 102100029848 T-box transcription factor TBX18 Human genes 0.000 description 1
- 102100038721 T-box transcription factor TBX2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036833 T-box transcription factor TBX20 Human genes 0.000 description 1
- 102100038409 T-box transcription factor TBX3 Human genes 0.000 description 1
- 101710167708 T-box transcription factor TBX5 Proteins 0.000 description 1
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100035148 Transcriptional enhancer factor TEF-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100035147 Transcriptional enhancer factor TEF-5 Human genes 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000589892 Treponema denticola Species 0.000 description 1
- 102000004903 Troponin Human genes 0.000 description 1
- 108090001027 Troponin Proteins 0.000 description 1
- 102100036859 Troponin I, cardiac muscle Human genes 0.000 description 1
- 101710128251 Troponin I, cardiac muscle Proteins 0.000 description 1
- 108010064978 Type II Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101710183617 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010051583 Ventricular Myosins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- KLGQSVMIPOVQAX-UHFFFAOYSA-N XAV939 Chemical compound N=1C=2CCSCC=2C(O)=NC=1C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 KLGQSVMIPOVQAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HUDSYNWJCPDHLL-CJLVFECKSA-N [(E)-[2-(6-bromo-2-hydroxy-1H-indol-3-yl)indol-3-ylidene]amino] acetate Chemical compound CC(=O)O\N=C1\C(=Nc2ccccc12)c1c(O)[nH]c2cc(Br)ccc12 HUDSYNWJCPDHLL-CJLVFECKSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- OLUKILHGKRVDCT-UHFFFAOYSA-N alsterpaullone Chemical compound C1C(=O)NC2=CC=CC=C2C2=C1C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N2 OLUKILHGKRVDCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010014494 beta-1 Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- MGQSIUXWCFOENX-UHFFFAOYSA-N cazpaullone Chemical compound C12=NC=CC=C2NC(=O)CC2=C1NC1=CC=C(C#N)C=C21 MGQSIUXWCFOENX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- PIDGGJYETVQYET-UHFFFAOYSA-N chembl173171 Chemical compound C12=CC=C(Br)C=C2N(C)C(O)=C1C1=C(N=O)C2=CC=CC=C2N1 PIDGGJYETVQYET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 208000028831 congenital heart disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000555 contractile cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010023942 cysteine and glycine-rich protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- DDCWMFYLYYJVTF-UHFFFAOYSA-N dibromoisophakellin hydrochloride Natural products O=C1N2CCCC32NC(N)=NC3C2=C1NC(Br)=C2Br DDCWMFYLYYJVTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N fasudil Chemical compound C=1C=CC2=CN=CC=C2C=1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002435 fasudil Drugs 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000009067 heart development Effects 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- 230000004398 heart morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000018578 heart valve disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 208000015210 hypertensive heart disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- HBDSHCUSXQATPO-BGBJRWHRSA-N indirubin-3'-monoxime Chemical compound O=C/1NC2=CC=CC=C2C\1=C\1/C(=N/O)/C2=CC=CC=C2N/1 HBDSHCUSXQATPO-BGBJRWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- ZGSXEXBYLJIOGF-BOPNQXPFSA-N iwr-1 Chemical compound C=1C=CC2=CC=CN=C2C=1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1N1C(=O)[C@@H]2C(C=C3)CC3[C@@H]2C1=O ZGSXEXBYLJIOGF-BOPNQXPFSA-N 0.000 description 1
- QQUXFYAWXPMDOE-UHFFFAOYSA-N kenpaullone Chemical compound C1C(=O)NC2=CC=CC=C2C2=C1C1=CC(Br)=CC=C1N2 QQUXFYAWXPMDOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L lithium carbonate Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]C([O-])=O XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052808 lithium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- FUCSLKWLLSEMDQ-MKYGIPPKSA-N manzamine A Chemical compound C1C\C=C/CCCCN2CC[C@H]3C(C=4C=5NC6=CC=CC=C6C=5C=CN=4)=C[C@]1(O)[C@@H]1N4CCCC\C=C/[C@H]4C[C@@]13C2 FUCSLKWLLSEMDQ-MKYGIPPKSA-N 0.000 description 1
- FUCSLKWLLSEMDQ-UHFFFAOYSA-N manzamine A hydrochloride Natural products C1CC=CCCCCN2CCC3C(C=4C=5NC6=CC=CC=C6C=5C=CN=4)=CC1(O)C1N4CCCCC=CC4CC13C2 FUCSLKWLLSEMDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 101150014102 mef-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- JYCNWQGNEJYDQS-UHFFFAOYSA-N n-(3-chloro-4-methylphenyl)-5-(4-nitrophenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-amine Chemical compound C1=C(Cl)C(C)=CC=C1NC1=NN=C(C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)O1 JYCNWQGNEJYDQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YAEMHJKFIIIULI-UHFFFAOYSA-N n-(4-methoxybenzyl)-n'-(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)urea Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CNC(=O)NC1=NC=C([N+]([O-])=O)S1 YAEMHJKFIIIULI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 102000005681 phospholamban Human genes 0.000 description 1
- 108010059929 phospholamban Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- QSKQVZWVLOIIEV-NSHDSACASA-N ripasudil Chemical compound C[C@H]1CNCCCN1S(=O)(=O)C1=CC=CC2=CN=CC(F)=C12 QSKQVZWVLOIIEV-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 229950007455 ripasudil Drugs 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 230000022379 skeletal muscle tissue development Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000023895 stem cell maintenance Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- PMJIHLSCWIDGMD-UHFFFAOYSA-N tideglusib Chemical compound O=C1SN(C=2C3=CC=CC=C3C=CC=2)C(=O)N1CC1=CC=CC=C1 PMJIHLSCWIDGMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950005284 tideglusib Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
La présente invention concerne un procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprenant une étape d'activation d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.
Description
Titulaire(s) : UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE - PARIS 6 (UPMC),APHP (ASSISTANCE PUBLIQUE HOPITAUX DE PARIS), INSERM (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE) Etablissement public.
Demande(s) d’extension
Mandataire(s) : ICOSA.
54) PROCEDE DE DIFFERENCIATION DE CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES EN CARDIOMYOCYTES.
f5/) La présente invention concerne un procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprenant une étape d'activation d'au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.
FR 3 058 160 - A1
i
PROCÉDÉ DE DIFFÉRENCIATION DE CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES EN CARDIOMYOCYTES
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne le domaine de la différenciation des cellules souches pluripotentes en cellules spécialisées, en particulier en cardiomyocytes.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE
Les cellules pluripotentes induites (ou iPSC, de l’anglais, inducedpluripotent stem cells) 10 ont été mises au point en 2007 à partir de fibroblastes humains (Takahashi et al.,
2007. Cell. 131(5):861-72). Ce type de cellules est obtenu par transfection des gènes de pluripotence (comme par exemple c-Myc, Oct3/4, Sox2 et Klf4) dans des cellules somatiques. Ces cellules sont ensuite sélectionnées pour leur capacité à exprimer Oct3/4 et Nanog, deux protéines impliquées dans la pluripotence (Takahashi et al.,
2007. Cell. 131(5):861-72; Yu étal., 2007. Science. 318(5858):1917-20).
Les iPSC possèdent les mêmes caractéristiques que les cellules souches embryonnaires, tant par leur morphologie, leur expression génique et leur statut épigénétique. Elles présentent la capacité de s’autorenouveler en conservant leur pluripotence et de pouvoir se différencier dans les trois feuillets embryonnaires, endoderme, ectoderme et mésoderme, in vitro et in vivo.
Les iPSC possèdent en outre l'avantage de pouvoir reproduire les étapes précoces du développement, contrairement aux modèles existants issus de cultures primaires de cellules de patients. De plus, elles possèdent l'ensemble du patrimoine génétique du patient donneur, constituant ainsi un excellent modèle pour étudier la physiopathologie des maladies génétiques. En effet, les anomalies responsables de ces pathologies peuvent s'exprimer au niveau cellulaire à différents stades de la différenciation des iPSC in vitro.
Enfin, les iPSC et les cellules qui en sont dérivées, aux différents stades de différenciation, permettent de tester de nouvelles molécules thérapeutiques in vitro (Yamanaka & Blau, 2010. Nature. 465(7299):704-12), et représentent donc un espoir pour le développement de nouvelles thérapies cellulaires, dans le cadre de la médecine régénérative.
Par conséquent, ces cellules constituent une source quasi-infinie de matériel pour l'étude 5 des fonctions cellulaires normales ou pathologiques. Cependant, l'obstacle principal pour la compréhension de ces mécanismes est la mise en place de protocoles robustes et efficaces permettant l'obtention de cellules matures d'intérêt.
Parmi ces cellules d’intérêts, les cardiomyocytes sont des cellules contractiles composant le muscle cardiaque, dont l’accès est excessivement limité chez l’homme. Le processus de différenciation d’iPSC en cardiomyocytes est actuellement basé sur la stimulation successive de facteurs clés de la cardiogenèse par l’utilisation de cytokines ou de petites molécules.
Ces procédés présentent deux inconvénients : une efficacité limitée (généralement autour de 50%) et la nécessité de suivre temporellement les différentes étapes de l’embryogénèse, se traduisant par un délai d’environ 4 semaines avant la production des cardiomyocytes.
La Demanderesse propose ici une amélioration majeure de ces procédés par le biais de l’activation précise d’un programme génique impliqué dans la cardiogenèse. Ce nouveau procédé, applicable aux cellules souches pluripotentes, permet ainsi d’induire une différenciation spontanée, efficace et rapide vers les cardiomyocytes.
En effet, les inventeurs ont pu montrer qu’étonnamment, le procédé de l’invention permet d’augmenter l’efficacité de production des cardiomyocytes par un facteur 3, et ceci seulement une semaine après l’induction de la différenciation.
RÉSUMÉ
La présente invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes, comprenant une étape d’activation d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi Gala4, Mef2c et/ou Tbx5.
Selon un mode de réalisation, ladite étape d’activation comprend l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARN guide spécifique (ARNgs) complémentaire de la région promotrice du gène dudit au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.
Selon un mode de réalisation, ladite étape d’activation comprend l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’un vecteur permettant l’expression d’une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase.
Selon un autre mode de réalisation, lesdites cellules souches pluripotentes expriment de manière stable une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase.
Dans un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend en outre avant, concomitamment et/ou après ladite étape d’activation, la mise en contact desdites cellules souches pluripotentes avec au moins un agent pharmacologique de différenciation, de préférence au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.
Dans un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend :
a) l’introduction dans lesdites cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARN guide spécifique (ARNgs) dirigé contre la région promotrice du gène dudit au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque ;
b) avant, concomitamment et/ou après l’étape a), l’expression dans lesdites cellules souches pluripotentes d’une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase ;
c) la culture desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance ;
et
d) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation, de préférence dans un milieu de différenciation supplémenté d’au moins un agent pharmacologique de différenciation, de préférence d’au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou d’au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.
Un autre objet de l’invention est un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARN guide spécifique (ARNgs), ledit ARN guide étant complémentaire d’au moins 80% de la région promotrice du gène d’un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi Gala4, Mef2c et/ou Tbx5.
Selon un mode de revendication, le vecteur de l’invention comprend au moins une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, et/ou 17, de préférence les séquences SEQ ID NOs: 10, 11, 12 13, 14, 15, 16 et 17.
La présente invention concerne également une composition comprenant un vecteur tel que décrit ci-dessus.
De plus, la présente invention concerne un kit comprenant :
- un vecteur ou une composition tels que décrits ci-dessus ;
- une lignée de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée ou un vecteur exprimant une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase ; et optionnellement, au moins un agent pharmacologique de différenciation, de préférence, au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.
DÉFINITIONS
Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :
Dans la présente invention, le terme « cellules souches pluripotentes » se réfère à des cellules souches capables de se différencier en n’importe quel type de cellule mature, i.e.
en n’importe quelle cellule normalement dérivée de l’un des trois feuillets embryonnaires, à savoir l’endoderme, le mésoderme et l’ectoderme, y compris en cellules de la lignée germinale. A ce titre, le terme « cellules souches pluripotentes » englobe les cellules souches embryonnaires et les cellules souches pluripotentes induites.
Dans la présente invention, le terme « cellules souches embryonnaires » se réfère à des cellules pluripotentes dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste, i.e., de l’embryon à un stade précoce. Dans un mode de réalisation, les cellules souches embryonnaires ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines (hESCs).
Dans la présente invention, le terme « cellules souches pluripotentes induites » ou « iPSC » ou « cellules iPS » se réfère à des cellules souches pluripotentes artificielles, dérivées de cellules non-pluripotentes, généralement de cellules somatiques matures, par dédifférenciation ou reprogrammation. Outre leur morphologie et leur potentiel d'autorenouvellement et de pluripotence similaires à ceux des cellules souches embryonnaires, les iPSC présentent également une reprogrammation épigénétique avec un profil global de méthylation des histones et d'expression des gènes très proche de celui des cellules souches embryonnaires. Les iPSC sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, notamment la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines Nanog, Sox2, Oct4 et Ssea3/4.
Dans la présente invention, le terme « différenciation » se réfère à un processus par lequel une cellule plunpotente acquiert une spécialisation structurale et fonctionnelle au cours de sa division, prolifération et croissance.
Dans la présente invention, le terme « cardiomyocyte » ou « cellule du muscle cardiaque » s’emploient de manière interchangeable. Ces termes se réfèrent à une cellule impliquée dans les fonctions cardiaques normales, entre autres, dans la contraction du muscle cardiaque. Les cardiomyocytes sont les unités contractiles de base du cœur. De ce fait, la contraction synchronisée des cellules du muscle cardiaque résulte en un battement cardiaque.
Dans la présente invention, le terme « activation » se réfère à un processus direct ou indirect de stimulation de l’expression d’un gène et/ou d’une protéine. De ce fait, « l’activation d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque » se réfère à la stimulation directe ou indirecte de la transcription du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque et/ou à la stimulation directe ou indirecte de la traduction de l’ARN messager (ARNm) d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.
Dans la présente invention, le terme « CRISPR/Cas9 » se réfère à un système ribonucléoprotéique constitué de deux partenaires : la protéine Cas9 et un ARN guide (ARNgs). CRISPR se réfère au système « Clustered Regularly Interspaced Short Palindromie Repeats type II » utilisé en immunité innée chez les bactéries et les archées. Ce système permet aux bactéries et aux archées de détecter les acides nucléiques exogènes (par exemple, les acides nucléiques viraux ou plasmidiques) de manière séquencespécifique (Jinek et al., 2012. Science. 337(6096):816-21). Dans un système de type II, un ARN guide (ARNgs) interagit avec l’endonucléase Cas9 et dirige l’activité nucléase de Cas9 vers la séquence d’ADN cible, complémentaire de celle de l’ARN guide.
Dans la présente invention, le terme « ARN guide spécifique » ou « ARNgs » se réfère à une molécule d’ARN simple-brin capable de diriger l’endonucléase Cas9 vers un ADN cible, par complémentarité de séquence. Dans un mode de réalisation de l’invention, un ARNgs est un ARN simple-brin de séquence complémentaire à la région promotrice du gène codant pour un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.
Dans la présente invention, le terme « domaine de transactivation » se réfère à un domaine contenant un/des site(s) de liaison à d’autres biomolécules corégulatrices (protéines ou acides nucléiques, par exemple). La liaison de ces molécules corégulatrices au domaine de transactivation permet d’induire, ou d’augmenter l’efficacité d’une expression génique. Des exemples de domaines de transactivation comprennent, sans y être limités, le domaine VP 16 du virus Herpes simplex (SEQ ID NO : 19), des répétitions multiples de VP 16 (généralement, 3, 4 ou 10 répétitions, dénommées respectivement VP48, VP64 (SEQ ID NO : 20) et VP 160), le domaine d’activation de la sous-unité de transactivation du facteur NF-κΒ (p65, SEQ IDNO : 21), le transactivateur R du virus Epstein-Barr (Rta, SEQ ID NO : 22).
Dans la présente invention, le terme « promoteur reconnu par l’ARN Polymérase III » se réfère à une séquence d’ADN permettant d’initier la transcription par l’ARN polymérase
III de gènes codant pour des ARN de transfert, l’ARN ribosomal 5S et d’autres petits ARN. En particulier, un promoteur reconnu par l’ARN Polymérase III permet d’initier la transcription de gènes codant pour des ARN guides. De préférence, le promoteur reconnu par l’ARN Polymérase III est un promoteur humain. De tels promoteurs comprennent, sans y être limités, U6, 7SK et Hl.
Dans la présente invention, le terme « séquence polyT » se réfère à une séquence nucléotidique comprenant au moins 3 nucléotides thymine (T) consécutifs. Dans un mode de réalisation, la séquence polyT comprend de 5 à 50 nucléotides, de préférence de 7 à 30 nucléotides.
Dans la présente invention, le terme « vecteur » se réfère à tout type de vecteur (tels que, par exemple, plasmide, cosmide, phage, chromosome artificiel) contenant un gène (codant pour une protéine ou un ARN), capable d’être exprimé par une cellule (c’est-à-dire, incluant par exemple un promoteur, un codon d’initiation ATG, un codon stop, etc.). Ainsi, un vecteur permettant l’expression d’une protéine par une cellule pluripotente peut comprendre la séquence ADN codant ladite protéine, sous le contrôle d’un promoteur.
Dans la présente invention, le terme « sujet » fait référence à un animal, y compris un être humain. Au sens de la présente invention, un sujet peut être un patient, c’est-à-dire une personne recevant des soins médicaux, subissant ou ayant subi un traitement médical, ou surveillée dans le cadre du développement d'une maladie.
Dans la présente invention, le terme « traitement » se réfère à la réduction ou au soulagement d’au moins un effet indésirable ou symptôme d’une maladie, d’un désordre ou d’une condition associé avec la déficience ou l’absence d’un organe, tissu ou fonction cellulaire. Un sujet est traité avec succès si, après avoir reçu les cardiomyocytes obtenues ou susceptibles d’être obtenus par le procédé de différenciation de l’invention, le sujet présente une amélioration d’au moins un symptôme, une réduction du nombre de cellules pathogéniques, et/ou une réduction de la morbidité ou de la mortalité. Les paramètres ci-dessus sont facilement mesurables par des procédures courantes pour un praticien.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
La présente invention concerne un procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes, comprenant une étape d’activation d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.
Selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention est un procédé in vitro. Selon un autre mode de réalisation, le procédé de l’invention est un procédé ex vivo.
Les facteurs de transcription spécifiques du tissu cardiaque comprennent, mais ne sont pas limités à, BOP, CRP1, CRP2/SmLIM, CRP3/MLP, CSRP3, dHAND, eHAND, GATA4, GATA5, GATA6, HAND2, ISL1, MEF2A, MEF2B, MEF2C, MEF2D,
MESP1, MESP2, NKX2-5, POP3, TBX1, TBX2, TBX3, TBX5, TBX18, TBX20, TEF-1, TEF-3, TEF-5, TINMAN, UNC-120/SFR.
Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d’activation d’au moins un facteur de transcription sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5.
Fe facteur de transcription GATA4 ou GATA Binding Protein 4 (numéro d’accession Uniprot P43694) est codé chez l’homme par le gène GATA4 (Gene ID 2626). GATA4 appartient à la famille des facteurs de transcription GATA, constituée de GATAI à GATA6. Ces protéines se fixent sur la séquence ADN « GATA », retrouvée dans les promoteurs d'une multitude de gènes, par l’intermédiaire de doigts de zinc. GATA4 est notamment impliqué dans la régulation des gènes impliqués dans l'embryogénèse et dans la différenciation du myocarde.
Fe facteur de transcription MEF2C ou Myocyte Enhancer Factor-2 isoform C (numéro d’accession Uniprot Q06413) est codé chez l’homme par le gène MEF2C (Gene ID 4208). MEF2C est l’un des 4 isoformes connus de la protéine MEF2, un important régulateur de la morphogenèse cardiaque et de la myogenèse.
Fe facteur de transcription TBX5 ou T-Box 5 (numéro d’accession Uniprot Q99593) est codé chez l’homme par le gène TBX5 (GenelD 6910). TBX5 est un membre d’une famille très conservée de protéines partageant un domaine de liaison à l’ADN commun, le domaine T-Box. Il joue un rôle important dans le développement cardiaque et la différenciation des membres supérieurs.
Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d’activation de GATA4.
Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d’activation de MEF2C.
Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d’activation de TBX5.
Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d’activation de GATA4 et MEF2C.
Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d’activation de GATA4 et TBX5.
Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d’activation de MEF2C et TBX5.
Selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes comprend une étape d’activation de GATA4, MEF2C et TBX5.
Selon un mode de réalisation, l’activation d’au moins un facteur de transcription tel que défini ci-dessus est réalisée par activation de la transcription du gène dudit au moins un facteur de transcription.
Selon un autre mode de réalisation, l’activation d’au moins un facteur de transcription tel que défini ci-dessus est réalisée par activation de la traduction de l’ARNm du gène dudit au moins un facteur de transcription.
Dans un mode de réalisation, l’activation d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque utilise un système dérivé du système CRISPR/Cas9, dans lequel la protéine Cas9 est dépourvue d’activité endonucléase et possède une activité de ίο transactivation. Dans la présente invention, cette protéine Cas9 modifiée est appelée dCas9.
Dans un mode de réalisation, dCas9 est une protéine Cas9 catalytiquement inactive fusionnée à un peptide d’activation de la transcription (aussi appelé domaine de transactivation, ou domaine transactivateur) qui permet d’augmenter la transcription d’un gène.
Ainsi, selon ce mode de réalisation, la cellule pluripotente exprime une protéine Cas9 dépourvue d’activité endonucléase et possédant une activité de transactivation.
La protéine Cas9 est une endonucléase retrouvée dans plusieurs espèces bactériennes et archées. La plus répandue est la protéine Cas9 de Streptococcus pyogenes (numéro d’accession Uniprot Q99ZW2), bien que des homologues de Cas9 aient été isolés dans d’autres espèces telles que Francisella novicida, Leptotrichia shahii, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus thermophilus, Treponema denticola.
Dans un mode de réalisation, la protéine Cas9 utilisée dans la présente invention est dérivée de la protéine Cas9 de Streptococcus pyogenes (SP-Cas9).
Les protéines Cas9 modifiées sont bien connues de l’homme du métier (Perez-Pinera étal., 2013. Nat. Methods. 10:973-976 ; Chavez et al., 2015. Nat. Methods. 12(4):326-8).
Dans un mode de réalisation, au moins un résidu catalytique responsable de l’activité endonucléase de Cas9 est muté (par exemple, en résidu alanine) pour créer une protéine dCas9 dépourvue d’activité endonucléase. Les résidus catalytiques responsables de l’activité endonucléase de Cas9 comprennent notamment AsplO, Asp839, His840 et Asn863 (numérotation d’après SP-Cas9, Uniprot Q99ZW2). Un exemple de Cas9 dépourvue d’activité endonucléase est SEQ ID NO : 18. SEQ ID NO : 18 est dérivée de SP-Cas9, et contient des mutations des résidus AsplO, Asp839, His840 et Asn863.
Dans un mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à l’une de ses extrémités N- ou C-terminale, de préférence C-terminale, à au moins un domaine de transactivation.
Dans un mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son 5 extrémité C-terminale à un domaine de transactivation, de préférence choisi parmi le groupe comprenant ou consistant en VP 16, VP48, VP64, VP 160, p65 et Rta. Selon un mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité
C-terminale à VP64 (alors nommée dCas9-VP64). Selon un second mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité C-terminale à p65 (alors nommée dCas9-p65). Selon un troisième mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité C-terminale à Rta (alors nommée dCas9-Rta).
Dans un mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité C-terminale à deux domaines de transactivation, de préférence choisis parmi le groupe comprenant ou consistant en VP 16, VP48, VP64, VP 160, p65 et Rta.
Dans un mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité C-terminale à trois domaines de transactivation, de préférence choisis parmi le groupe comprenant ou consistant en VP 16, VP48, VP64, VP 160, p65 et Rta. Selon un mode de réalisation, la protéine dCas9 est génétiquement fusionnée à son extrémité C-terminale à VP64, p65 et Rta (alors nommée dCas9-VPR) (Chavez et al., 2015. Nat.
Methods. 12(4):326-8).
Selon un mode de réalisation, le gène codant pour une protéine Cas9 modifiée est inséré dans un vecteur, de préférence un plasmide, permettant son expression dans une cellule pluripotente, de préférence une cellule pluripotente humaine. Des exemples de vecteurs incluent, mais ne sont pas limités à, pcDNA, p-Shuttle, ou équivalents.
Selon un mode de réalisation, le gène codant pour la protéine dCas9-VP64 est inséré dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, le vecteur permettant l’expression de la protéine dCas9-VP64 est le vecteur pcDNA-dCas9-VP64 (Addgene #47107).
Selon un mode de réalisation, le gène codant pour la protéine dCas9-VPR est inséré dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, le vecteur permettant l’expression de la protéine dCas9-VPR est le vecteur SP-dCas9-VPR (Addgene #63798).
Selon un premier mode de réalisation, l’expression de la protéine Cas9 modifiée dans les 5 cellules souches pluripotentes comprend l’introduction dans lesdites cellules d’un vecteur permettant l’expression d’une protéine Cas9 modifiée, de préférence une protéine dCas9, de préférence la protéine dCas9-VP64 ou la protéine dCas9-VPR.
Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend :
a) l’introduction dans des cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ; et
b) l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase.
Selon un mode de réalisation, l’étape b) est réalisée avant, concomitamment ou après l’étape a).
Selon un second mode de réalisation, le vecteur permettant l’expression d’au moins un
ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque comprend en outre le gène codant pour une protéine Cas9 modifiée tel que décrit ci-dessus.
Ainsi, selon ce mode de réalisation, ledit au moins un ARNgs et la protéine Cas9 modifiée sont exprimés à partir du même vecteur.
Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend l’introduction dans des cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi
GATA4, MEF2C et TBX5, et l’expression de la protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase.
Selon un troisième mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes utilisées dans 5 la présente invention expriment de manière stable une protéine Cas9 modifiée telle que décrite ci-dessus.
Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend l’introduction dans des cellules souches pluripotentes exprimant une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase, d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C etTBX5.
Les techniques permettant de mettre au point une lignée cellulaire exprimant stablement une protéine d’intérêt sont connues de l’homme du métier. En particulier, ces méthodes incluent, mais ne se limitent pas à, la transfection stable, la transfection transitoire, l’infection par vecteur rétroviral.
Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes utilisées dans la présente invention expriment de manière stable la protéine dCas9-VP64. Selon un autre mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes utilisées dans la présente invention expriment de manière stable la protéine dCas9-VPR.
Selon un quatrième mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes utilisées dans la présente invention comprennent un système d’expression permettant d’induire l’expression de la protéine Cas9 modifiée par lesdites cellules.
Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend :
a) l’introduction dans des cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ; et
b) l’induction de l’expression d’une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase, dans les cellules souches pluripotentes comprennent un système d’expression permettant d’induire l’expression de la protéine Cas9 modifiée par lesdites cellules.
Selon un mode de réalisation, l’étape b) est réalisée avant, concomitamment ou après l’étape a).
Selon un autre mode de réalisation, l’activation d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque est réalisée par administration d’au moins un plasmide ou vecteur comprenant une séquence codant pour au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.
Selon un mode de réalisation, la séquence codant pour au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque est associée avec des éléments appropriés permettant de contrôler sa transcription, tels qu’un promoteur, un amplificateur, et optionnellement un terminateur ; et optionnellement sa traduction.
Dans un mode de réalisation, le plasmide ou le vecteur comprend une séquence codant pour au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5.
Dans un mode de réalisation, le plasmide ou le vecteur comprend une séquence codant pour au moins 2 facteurs de transcription spécifiques du tissu cardiaque, de préférence sélectionnés parmi GATA4, MEF2C et TBX5. Dans un mode préféré de réalisation, le plasmide ou le vecteur comprend une séquence codant pour au moins 3 facteurs de transcription spécifiques du tissu cardiaque, de préférence sélectionnés parmi GATA4, MEF2C etTBX5.
Dans un autre mode de réalisation, l’activation d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque est réalisée par administration de 2 plasmides ou vecteurs ou plus, comprenant chacun une séquence codant pour au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C etTBX5.
Dans un mode particulier de l’invention, l’activation d’au moins un facteur de 5 transcription spécifique du tissu cardiaque est réalisée par administration de 3 plasmides ou vecteurs distincts, comprenant chacun une séquence codant pour au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence GATA4, MEF2C et TBX5 respectivement.
Dans un mode de réalisation, la séquence est une séquence ADN ou ARN.
Selon un mode de réalisation, le vecteur est un vecteur d’expression. Tel qu’utilisé dans l’invention, le terme « vecteur d’expression » signifie un véhicule par lequel la séquence codant pour au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque est introduite dans une cellule hôte (dans le cas de la présente invention, une cellule souche pluripotente), de manière à transformer la cellule hôte et à promouvoir l’expression de la séquence (par exemple la transcription ou la traduction).
Selon un mode de réalisation, le vecteur est un vecteur viral. Dans un mode de réalisation, les vecteurs viraux incluent, mais ne se limitent pas à, un adénovirus, un rétrovirus, un virus de l’herpès et un virus AAV (adeno-associated virus). De tels vecteurs viraux peuvent être produits par des procédés connus par l’homme du métier.
Selon un autre mode de réalisation, l’activation d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque est réalisée par culture des cellules souches pluripotentes dans un milieu de culture comprenant ledit au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5.
Dans un mode de réalisation, ledit au moins un facteur de transcription est ajouté dans le milieu de culture après culture des cellules dans un milieu ne contenant pas de facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence pendant au moins 6 heures, 12 heures, 24 heures, 36 heures, ou 48 heures. Dans un autre mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont directement cultivées dans un milieu de culture comprenant au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.
Dans un mode de réalisation, au moins 2 facteurs de transcription spécifiques du tissu cardiaque sont ajoutés dans le milieu de culture, de préférence sélectionnés parmi
GATA4, MEF2C et TBX5. Dans un mode de réalisation, les 3 facteurs GATA4, MEF2C et TBX5 sont ajoutés au milieu de culture.
Dans un mode de réalisation, lesdits au moins 2 facteurs de transcription, de préférence 3 facteurs, sont ajoutés simultanément dans le milieu de culture. Dans un autre mode de réalisation, lesdits au moins 2 facteurs de transcription, de préférence 3 facteurs, sont ajoutés séquentiellement dans le milieu de culture.
Selon un mode de réalisation, l’activation d’au moins un facteur de transcnption spécifique du tissu cardiaque par un système dénvé du système CRISPR/Cas9 utilise un ARN guide spécifique (ARNgs).
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend en outre 15 l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’au moins un ARN guide spécifique (ARNgs) dirigé contre la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence contre la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5.
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend en outre 20 l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotf ce du gène d’au moins un facteur de transcnption spécifique du tissu cardiaque, de préférence de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcnption sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5.
Dans la présente invention, les termes « dirigé contre la région promotf ce du gène » ou 25 « complémentaire de la région promotf ce du gène » se disent d’un ARNgs dif gé contre ou complémentaire de la totalité ou d’une partie, de préférence d’une partie, de la région promotf ce dudit gène.
Préférentiellement, les ARNgs de la présente invention sont dirigés ou sont complémentaire de régions situées dans les mille paires de bases en amont du site de démarrage de la transcription du gène cible.
Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention comportent entre 10 et 40 nucléotides, préférentiellement entre 10 et 30 nucléotides, préférentiellement entre 15 et 25 nucléotides, préférentiellement 20 nucléotides.
Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention comportent
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,
34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 nucléotides.
Selon la présente invention, le terme « complémentaire » signifie complémentaire d’au moins 80% de la région promotrice ciblée, de préférence à au moins 85%, plus préférentiellement à au moins 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%.
Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires de la région promotrice du gène GATA4. Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend l’introduction dans les cellules souches pluripotentes de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou plus, ARNgs complémentaires de la région promotrice du gène GATA4. Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires d’au moins une séquence de la région promotrice du gène GATA4 choisie parmi SEQ ID Nos : 9-13, de préférence parmi SEQ ID NOs : 10-13, ou toute séquence présentant au moins 75%, de préférence au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec une des séquences SEQ ID Nos : 9-13, de préférence avec une des séquences SEQ ID NOs : 10-13.
Au sens de la présente invention, le terme « identité », lorsqu'il est utilisé dans une relation entre les séquences de deux ou plusieurs séquences nucléotidiques, se réfère au degré de parenté entre ces séquences nucléotidiques, tel que déterminé par le nombre de correspondances entre les chaînes de deux bases ou plus. Selon l’invention, « l’identité » correspond ainsi à un pourcentage d’identité entre deux (ou plus de 2) séquences. Ce pourcentage est défini comme le nombre de positions pour lesquelles les bases sont identiques lorsque les séquences sont alignées de manière optimale, divisé par le nombre total de bases de la plus petite des 2 séquences. Les différences entre les séquences peuvent être réparties au hasard et sur toutes leurs longueurs.
Deux séquences sont dites alignées de manière optimale lorsque le pourcentage d'identité est maximal. Par ailleurs, comme cela apparaîtra de manière claire à l'homme du métier, il peut être nécessaire de faire appel à des ajouts de positions lacunaires (des « gaps ») de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques peut donc être déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est alors calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Préférentiellement, les méthodes de détermination de l’identité sont conçues pour donner la plus grande concordance possible entre les séquences comparées.
Le pourcentage d’identité peut être déterminé par un modèle mathématique particulier ou par un programme d’ordinateur (généralement désigné par le terme « d’algorithme »). Des méthodes de calcul de l’identité entre des séquences nucléotidiques sont bien connues de l’homme du métier. Des exemples non limitatifs de telles méthodes incluent celles décrites dans les documents suivants : Arthur M. Lesk, Computational Molecular Biology: Sources and Methods for Sequence Analysis (New-York : Oxford University Press, 1988) ; Douglas W. Smith, Biocomputing: Informatics and Genome Projects (New-York: Academie Press, 1993) ; Hugh G. Griffin and Annette M. Griffin, Computer Analysis of Sequence Data, Part 1 (New Jersey: Humana Press, 1994) ; Gunnar von Heinje, Sequence Analysis in Molecular Biology: Treasure Trove or Trivial Pursuit (Academie Press, 1987) ; Michael Gribskov and John Devereux, Sequence Analysis Primer (New York: M. Stockton Press, 1991) ; et Carillo et al., 1988. SIAM J. Appl. Math. 48(5):1073-1082.
Des méthodes de détermination de l’identité ont été décrites dans des programmes d’ordinateurs accessibles au public. Des exemples préférés de méthodes utilisant des programmes d’ordinateurs incluent, sans y être limités, le progiciel GCG, incluant GAP (Devereux et al., 1984. Nucl. Acid. Res. 12(1 Pt 1) :387-395 ; Genetics Computer Group,
University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, et FASTA (Altschul et al., 1990. J. Mol. Biol. 215(3) :403-410). Le programme BLASTX est disponible auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) et d’autres sources (BLASTManual, Altschul étal. NCB/NLM/NIHBethesda, Md. 20894 ; Altschul étal., 1990. J. Mol. Biol. 215(3) :403-410). L’algorithme de Smith-Waterman, qui est bien connu de l’homme du métier, peut également être utilisé pour déterminer le pourcentage d’identité entre deux séquences.
Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires de la région promotrice du gène MEF2C. Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend l’introduction dans les cellules souches pluripotentes de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 (ou plus) ARNgs complémentaires de la région promotrice du gène MEF2C. Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires d’au moins une séquence de la région promotrice du gène MEF2C choisie parmi SEQ ID NO : 14 et SEQ ID NO : 15, ou toute séquence présentant au moins 75%, de préférence au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou
99% d’identité avec une des séquences SEQ ID NOs : 14-15.
Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires de la région promotrice du gène TBX5. Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend l’introduction dans les cellules souches pluripotentes de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ARNgs complémentaires de la région promotrice du gène TBX5. Selon un mode de réalisation, les ARNgs utilisés dans la présente invention sont complémentaires d’au moins une séquence de la région promotrice du gène TBX5 choisie parmi SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17, ou toute séquence présentant au moins 75%, de préférence au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% d’identité avec une des séquences SEQ ID Nos : 16-17.
La présente invention concerne donc également une séquence ARN complémentaire d’une séquence d’acide nucléique sélectionnée parmi SEQ ID NO : 9-17, de préférence parmi SEQ ID NO s : 10-17.
Selon un mode de réalisation, la séquence ADN codant au moins pour un ARNgs tel que décrit ci-dessus est insérée dans un vecteur permettant son expression dans une cellule souche pluripotente, de préférence un plasmide. Selon un mode de réalisation, la séquence ADN encodant au moins un ARNgs tel que décrit ci-dessus est insérée dans un vecteur, sous contrôle d’un promoteur reconnu par l’ARN Polymérase III, de préférence un promoteur humain reconnu par l’ARN Polymérase III, de préférence le promoteur U6, 7SKouHl.
Dans un mode de réalisation, le vecteur comprend en outre un site de clonage simple et optionnellement une séquence polyT. Des exemples de séquences polyT bien connues de l’homme du métier incluent, mais ne se limitent pas à, TATTTAT, et TATTTAA, AATTTAT.
Selon un mode particulier de réalisation, la séquence ADN codant au moins pour un ARNgs tel que décrit ci-dessus est insérée dans un vecteur pSPgRNA (Addgene #47108).
Selon un mode de réalisation, entre 1 et 20 séquences d’ADN codant un ARNgs sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 séquences d’ADN codant un ARNgs sont insérées dans un vecteur.
La présente invention concerne donc également un vecteur ou un plasmide comprenant au moins une séquence d’acide nucléique codant pour au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice d’un gène codant pour un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque tel que décrit ci-dessus, de préférence sélectionnées parmi les séquences SEQ ID NO : 9-17. Dans un mode de réalisation, la séquence d’acide nucléique est une séquence ADN.
Dans un mode de réalisation, le vecteur de l’invention comprend plusieurs séquences ADN distinctes codant pour des ARNgs distincts complémentaires de la région promotrice d’un même gène. Dans un autre mode de réalisation, le vecteur de l’invention comprend des séquences ADN distinctes codant pour des ARNgs distincts complémentaires de régions promotrices de différents gènes. Dans un autre mode de réalisation, le vecteur de l’invention comprend plusieurs séquences ADN distinctes codant pour des ARNgs distincts complémentaires de la région promotrice d’un même gène et des séquences ADN codant pour des ARNgs complémentaires de régions promotrices de différents gènes.
A titre d’illustration, le vecteur de l’invention peut comprendre 2 séquences ADN, codant pour deux ARNgs distincts complémentaire de la région promotrice du gène GATA4. Dans un autre exemple illustratif, le vecteur de l’invention peut comprendre 2 séquences ADN codant pour deux ARNgs distincts complémentaire de la région promotrice du gène GA1A4, et une séquence ADN codant pour un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène TBX5.
Selon un mode de réalisation, le vecteur de l’invention comprend au moins une séquence (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 séquences) sélectionnée(s) parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17.
Selon un mode de réalisation, chaque séquence d’ADN codant pour un ARNgs est sous contrôle d’un promoteur reconnu par l’ARN Polymérase III distinct, de préférence un promoteur humain reconnu par l’ARN Polymérase III, de préférence le promoteur U6, 7SKouHl.
Selon un autre mode de réalisation, toutes les séquences d’ADN codant pour un ARNgs sont sous contrôle d’un promoteur unique reconnu par l’ARN Polymérase III, de préférence un promoteur humain reconnu par l’ARN Polymérase III, de préférence le promoteur U6, 7SK ou Ht.
Selon un mode de réalisation, toutes les séquences d’ADN codant pour un ARNgs sont espacées d’une courte région comprenant un motif de coupure de l’ARN. Dans un mode de réalisation, le motif de coupure comprend de 5 à 20 nucléotides, de préférence de 7 à 15 nucléotides, de préférence 10 nucléotides.
Selon un mode de réalisation, toutes les séquences d’ADN codant pour un ARNg spécifique sont suivies d’une séquence ADN codant pour un ARNg constant.
Dans la présente invention, le terme « ARNg constant » se réfère à un ARN palindromique formant une structure dite « en épingle à cheveux » ou tige-boucle.
Dans un mode de réalisation, le vecteur comprend dans le sens 5’ vers 3’ un promoteur U6, la séquence codant pour un ARNgs, la séquence codant pour un ARNg constant, une séquence polyT et un motif de coupure.
Selon le mode de réalisation dans lequel le vecteur comprend 2 séquences ADN codant pour deux ARNgs distincts, le vecteur comprend alors dans le sens 5’ vers 3’ un promoteur U6, la séquence codant pour le premier ARNgs, la séquence codant pour un ARNg constant, une séquence polyT, un motif de coupure ; et un promoteur U6, la séquence codant pour le second ARNgs, la séquence codant pour un ARNg constant, une séquence polyT et un motif de coupure. Ceci s’applique également aux vecteurs comprenant 3 séquences ADN codant pour des ARNgs distincts ou plus.
Selon un mode de réalisation, au moins une séquence sélectionnée parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 est insérée dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, deux séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, trois séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, quatre séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, cinq séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, six séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, sept séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, huit séquences sélectionnées parmi SEQ ID NOs : 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, les huit séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur.
Selon un mode de réalisation, les séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur. Selon un mode de réalisation, les séquences SEQ ID NOs : 10, 11, 14, 15, 16 et 17 sont insérées dans un vecteur, sous contrôle de promoteurs distincts, de préférence, de promoteurs reconnus par l’ARN Polymérase III, de préférence de promoteurs humains reconnus par l’ARN Polymérase III, de préférence le promoteur U6, 7SKouHl.
Selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend donc l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs tel que décrit ci-dessus. Selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend donc l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’un vecteur comprenant une séquence ADN codant pour au moins un ARNgs tel que décrit ci-dessus.
Un autre objet de l’invention est une population de cellules souches pluripotentes permettant l'expression d'au moins un ARNgs tel que décrit ci-dessus.
Dans un mode de réalisation, la population de cellules souches pluripotentes comprend un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs tel que décrit ci-dessus, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5. Dans un mode de réalisation, plus de 50%, de préférence plus de 60, 70, 80, 85, 90, 95% ou plus des cellules de la population de cellules souches pluripotentes de l’invention comprennent un vecteur tel que décrit ci-dessus.
Selon un mode de réalisation de l’invention, les cellules souches pluripotentes sont des cellules souches embryonnaires.
Selon un mode de réalisation de l’invention, les cellules souches pluripotentes sont des cellules souches pluripotentes induites.
Les procédés permettant l'obtention d’iPSC sont bien connus de l'homme du métier. En particulier, les iPSC peuvent être obtenues à partir de cellules somatiques humaines transfectées avec les facteurs de transcription Oct3/4, Sox2, Klf4 et c-Myc (Takahashi et al., 2007. Cell. 131(5):861-72), Oct3/4, Sox2, Nanog et Lin28 (Yu et al., 2007. Science. 318(5858) :1917-20) ou avec les gènes Oct3/4, Sox2 et Klf4 (Nakagawa et al., 2008. Nat. Biotechnol. 26(1) :101-6). Les iPSC peuvent être obtenues à partir d'une large variété de cellules telles que, par exemple, les fibroblastes, les lymphocytes B, les kératinocytes ou les cellules de la membrane méningée (Patel et al., 2010. Stem Cell Rev. 6(3):367-80).
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention pourra comprendre une étape de mise en culture de cellules souches pluripotentes telles que décrites ci-dessus, dans un système de culture adhérent et dans un milieu de culture sans sérum. Ces conditions de culture diffèrent de celles utilisées pour la formation de corps embryoïdes qui requiert l'utilisation de systèmes de culture non adhérents afin de permettre aux cellules souches de s'agréger.
Des exemples de systèmes de culture adhérente susceptibles d'être utilisés dans le procédé selon l'invention incluent, de façon non limitative, un système de culture en monocouche adhérente ou un système de culture sur cellules nourricières. Le système de culture peut se présenter sous toute forme adaptée au procédé selon l'invention, en particulier sous forme de flacon, plaque multi-puits ou boîte.
Selon un mode de réalisation, le système de culture adhérente est un système de culture sur cellules nourricières qui favorisent la prolifération et/ou contrôlent la différenciation des cellules avec lesquelles elles sont co-cultivées. De préférence, ces cellules nourricières stimulent la prolifération des cellules en culture sans induire leur différenciation. Elles sont fréquemment irradiées afin de prévenir leur prolifération et l'envahissement de la culture d'intérêt. Les cellules nourricières susceptibles d'être utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent être aisément choisies par l'homme du métier parmi les différents types connus tels que, par exemple, les fibroblastes embryonnaires de souris (cellules MEF), les fibroblastes embryonnaires humains (HEF), ou les cellules épithéliales humaines de la trompe de Fallope, de préférence en présence d'un inhibiteur de la voie de signalisation FGF, tel que SU5402 (Mohammadi et al., 1997. Science. 276(5314) :955-60).
Selon un mode de réalisation, le système de culture adhérent est un système de culture en monocouche adhérente. Ce système comprend un support solide, par exemple du verre ou du plastique, généralement revêtu d'une matrice ou d'un substrat favorisant l'adhérence des cellules. Le substrat peut être un substrat protéique constitué de facteurs d'attachement et favorisant l'adhésion des cellules au support. Ces facteurs d'attachement peuvent notamment être choisis parmi la poly-L-lysine, le collagène, la fibronectine, la laminine ou la gélatine.
Les matrices ou substrats favorisant l'adhérence des cellules sont bien connus de l'homme du métier et de nombreuses variétés sont disponibles dans le commerce. Ces matrices comprennent, par exemple, les matrices de type Matrigel™, Geltrex® ou d'autres matrices comprenant une ou plusieurs protéines d'ancrage telles que le collagène, la laminine, la fibronectine, l'élastine, des protéoglycanes, des aminoglycanes ou la vitronectine. Les matrices 3D de type hydrogel peuvent également être utilisées.
Les cellules souches pluripotentes peuvent être cultivées dans un milieu de maintenance sans sérum permettant de propager et maintenir les cellules dans un état indifférencié.
Dans la présente invention, le terme « milieu de maintenance » se réfère à un milieu de culture contenant les facteurs FGFp et/ou TGF3, et permettant la culture et la prolifération de cellules souches pluripotentes sans induire leur différenciation. De nombreux milieux de maintenance sont disponibles dans le commerce et sont bien connus de l'homme du métier (Chen et al., 2011. Aging Cell. 10(5) :908-11). Selon un mode de réalisation, le milieu de maintenance peut être, par exemple, les milieux mTESRl™ et mTESR2™ (STEMCELL Technologies), le milieu E8 (Life Technologies) ou le milieu hPSC (Promocell).
Selon un mode de réalisation, les cellules sont de préférence repiquées régulièrement afin d'empêcher la culture d'atteindre la confluence, c'est-à-dire de recouvrir l'ensemble de la surface disponible. En effet, la confluence peut induire un arrêt de la prolifération et des changements métaboliques non souhaités. Selon un mode de réalisation, l’étape d’introduction de vecteurs dans les cellules souches pluripotentes s’effectue à un pourcentage de confluence variant de 60 à 90%, de préférence de 70 à 80%.
Les cellules peuvent être repiquées en utilisant des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Elles peuvent notamment être détachées de la matrice ou du support par l'action d'enzymes telles que la collagénase IV ou un milieu de détachement cellulaire commercial tel que TrypLE™ Express (Life Technologies), récupérées par centrifugation, dissociées mécaniquement et réensemencées dans un nouveau système de culture.
Selon un mode de réalisation, l’introduction d’un vecteur (permettant l’expression des ARNgs ou de la Cas9 modifiée) dans les cellules souches pluripotentes est réalisée par transfection, nucléofection, lipofection, microinjection, ou électroporation.
Selon un mode de réalisation, une quantité de vecteur variant de 1 ng à 50 pg, de préférence de 100 ng à 5 pg, encore plus préférentiellement de 180 ng à 1 pg est utilisé.
Selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend deux étapes de transfection par un vecteur permettant l’expression de un ou plusieurs ARNgs (vecteur ARNgs) et par un vecteur de transfection par un vecteur permettant l’expression de la Cas9 modifiée (vecteur Cas9), et un ratio molaire vecteur ARNgs:vecteur Cas9 variant de 10:1 à 1:10, de préférence de 1:1 à 1:5, encore plus préférentiellement de environ 1:3 est utilisé.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend une étape de transfection par un vecteur permettant l’expression d’un ou plusieurs ARNgs (vecteur ARNgs) et de la Cas9 modifiée (vecteur Cas9).
Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de maintenance. Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de maintenance avant et/ou lors de l’introduction d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs et/ou l’expression de la Cas9 modifiée.
Dans un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de maintenance pendant au moins 6 heures, de préférence au moins 12 heures, heures, 36 heures, 2 jours, 5 jours ou 7 jours avant l’introduction d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs et/ou l’expression de la Cas9 modifiée.
Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de différenciation. Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de différenciation lors de et/ou après l’introduction d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs et/ou l’expression de la Cas9 modifiée.
Dans la présente invention, le terme « milieu de différenciation » se réfère à un milieu de culture ne contenant pas les facteurs FGF3 et/ou TGF3, et permettant la différenciation des cellules souches pluripotentes. Selon un mode de réalisation, le milieu de maintenance peut être, par exemple, le milieu E5 ou E6 (Life Technologies).
Dans un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de différenciation pendant au moins 6 heures, de préférence au moins 12 heures, 24 heures, 36 heures, 2 jours, 5 jours ou 7 jours ou 14 jours ou plus après l’introduction d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs et/ou l’expression de la Cas9 modifiée.
Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu de maintenance avant et pendant et 1 ou 2 jours après les étapes d’introduction de vecteurs, et dans un milieu de différenciation par la suite.
Dans un mode de réalisation, que ce soit en milieu de maintenance ou de différenciation, les cellules souches pluripotentes sont cultivées à 37°C dans une atmosphère à 95% d'humidité et 5% de CO2.
Préférentiellement, le milieu de maintenance et/ou le milieu de différenciation est/sont supplémenté(s) d’au moins un inhibiteur de la Rho-associated protein kinase ou ROCK, afin de prévenir l’anoïkose des cellules. Des exemples d’inhibiteurs de ROCK incluent, sans y être limités: AT13148, Fasudil, GSK429286A, Ripasudil, RKI-1447, Thiazovivine et Y-27632.
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) la culture de cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance ;
b) l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;
c) l’introduction dans lesdites cellules souches pluripotentes d’un vecteur permettant l’expression d’une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase, de préférence dCas9-VPR ;
d) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation, de préférence 24 à 48h après la dernière des étapes b) et c).
Selon ce mode de réalisation, l’étape c) peut être réalisée avant, concomitamment ou après 15 l’étape b).
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) la culture de cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance ;
b) l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5, et l’expression d’une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase, de préférence dCas9-VPR ;
c) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation, de préférence 24 à 48h après l’étape b).
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) la culture dans un milieu de maintenance de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase, de préférence dCas9-VPR ;
b) l’introduction dans lesdites cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcnption spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;
c) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation, de préférence 24 à 48h après l’étape b).
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) la culture dans un milieu de maintenance de cellules souches plufpotentes comprenant un système d’expression inductible d’une protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase, de préférence dCas9-VPR ;
b) l’introduction dans lesdites cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcnption spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;
c) l’induction de l’expression de la protéine Cas9 modifiée par lesdites cellules ; et
d) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation, de préférence 24 à 48h après la dernière des étapes b) et c).
Selon ce mode de réalisation, l’étape c) peut être réalisée avant, concomitamment ou après 25 l’étape b).
Selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend en outre une étape de traitement pharmacologique des cellules souches pluripotentes.
Tel qu’utilisé dans la présente invention, le terme « traitement pharmacologique » se réfère à l’introduction dans le milieu de culture des cellules souches plufpotentes (ou la mise en contact des cellules souches pluripotentes) d’au moins un agent pharmacologique de différenciation.
Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend en outre avant, concomitamment et/ou après l’étape d’activation d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, la mise en contact des cellules souches pluripotentes avec au moins un agent pharmacologique de différenciation.
Dans un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont mises en contact avec l’agent pharmacologique avant l’introduction d’un vecteur selon l’invention. Dans un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont mises en contact avec l’agent pharmacologique pendant l’introduction d’un vecteur selon l’invention. Dans un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont mises en contact avec l’agent pharmacologique après l’introduction d’un vecteur selon l’invention.
Dans un mode de réalisation, la mise en contact avec l’agent pharmacologique consiste en l’addition dans le milieu de culture des cellules souches pluripotentes d’au moins une molécule pharmacologique utilisée pour induire la transformation mésodermique de cellules pluripotentes.
Dans un mode de réalisation, ladite au moins une molécule pharmacologique est ajoutée dans le milieu de maintenance. Dans un mode de réalisation, ladite au moins une molécule pharmacologique est ajoutée dans le milieu de différenciation. Dans un mode de réalisation, ladite au moins une molécule pharmacologique est ajoutée dans le milieu de maintenance et dans le milieu de différenciation.
Les molécules pharmacologiques utilisées dans la différenciation des cellules souches pluripotentes pour induire leur transformation mésodermique, de préférence leur transformation cardiomyocytaire, sont bien connues de l’homme du métier. Ces molécules pharmacologiques peuvent par exemple moduler des voies de signalisations, notamment les voies des Smad (activine/nodal, TGF3, BMP), GSK3 et/ou Wnt.
Dans un mode de réalisation, ledit traitement pharmacologique consiste en l’addition d’au moins un inhibiteur de la glycogen synthase kinase 3 ou GSK3. Des exemples d’inhibiteurs de GSK3 comprennent, sans y être limités, CHIR90021, Alsterpaullone, AZD1080, 3F8, A1070722, AR-A014418, BIO, BIO-acetoxime, Cazpaullone, CHIR98014, CHIR98023, Dibromocantharelline, HMK-32, 10Z-Hymenialdisine, Indirubin-3'-oxime, Kenpaullone, L803, L803-mts, Lithium carbonate, Manzamine A, MeBIO, Meridianins, NP00111, NP031115, NSC693868, Palinurine, SB216763, SB415286, TC-G 24, TCS2002, TCS21311, TDZD-8, Tideglusib, Tricantine, et TWS119. De préférence, l’inhibiteur de GSK3 est CHIR90021.
Dans un mode de réalisation, ledit traitement pharmacologique consiste en l’addition d’au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt. Des exemples d’inhibiteurs de la voie de signalisation Wnt comprennent, sans y être limités, IWP2, IWP4, IWR1, IWR4, C59, et XAV939. De préférence, l’inhibiteur de Wnt est IWP2.
Dans un mode de réalisation, ledit traitement pharmacologique consiste en l’addition d’au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et d’au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2).
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) la culture de cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2) ;
b) l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;
c) l’expression dans lesdites cellules souches pluripotentes d’une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase, de préférence dCas9-VPR, soit (i) par introduction dans lesdites cellules d’un vecteur permettant l’expression de ladite Cas9 modifiée par lesdites cellules, soit (ii) par induction d’un système inductible permettant l’expression de ladite Cas9 modifiée par lesdites cellules, ledit système inductive étant préalablement compris dans lesdites cellules ;
d) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation ;
l’étape c) pouvent être réalisée avant, concomitamment ou après l’étape b).
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) la culture de cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance ;
b) l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;
c) l’expression dans lesdites cellules souches pluripotentes d’une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase, de préférence dCas9-VPR, soit (i) par introduction dans lesdites cellules d’un vecteur permettant l’expression de ladite Cas9 modifiée par lesdites cellules, soit (ii) par induction d’un système inductible permettant l’expression de ladite Cas9 modifiée par lesdites cellules, ledit système inductive étant préalablement compris dans lesdites cellules ;
d) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2) ;
l’étape c) pouvant être réalisée avant, concomitamment ou après l’étape b).
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) la culture de cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence
IWP2) ;
b) l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;
c) l’induction de l’expression dans lesdites cellules souches pluripotentes d’une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase, de préférence dCas9-VPR, soit (i) par introduction dans lesdites cellules d’un vecteur permettant l’expression de ladite Cas9 modifiée par lesdites cellules, soit (ii) par induction d’un système inductible permettant l’expression de ladite Cas9 modifiée par lesdites cellules, ledit système inductive étant préalablement compris dans lesdites cellules ;
d) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2) ;
l’étape c) pouvant être réalisée avant, concomitamment ou après l’étape b).
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) la culture de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase, de préférence dCas9-VPR dans un milieu de maintenance supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2) ;
b) l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;
c) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation.
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) la culture de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase, de préférence dCas9-VPR dans un milieu de maintenance ;
b) l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;
c) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2).
Selon un mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) la culture de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue d’activité nucléase, de préférence dCas9-VPR dans un milieu de maintenance supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2) ;
b) l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 ;
c) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation supplémenté avec au moins un inhibiteur de GSK3 (de préférence
CHIR90021) et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt (de préférence IWP2).
Selon un mode de réalisation, les cellules souches pluripotentes sont mises en contact avec l’agent pharmacologique pendant au moins 2h, 4h, 8h, 12h, 16h, 20h, 24h, 36h, 48h,
60h, ou 72h.
Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention permet d’obtenir une population de cellules comprenant plus de 50% de cardiomyocytes différenciés, de préférence plus de 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de cardiomyocytes différenciés.
Les cardiomyocytes différenciés peuvent être caractérisés par les marqueurs suivants :
expression de la troponine T cardiaque (cTnT, encodée par le gène TNNT2), de la Troponine I cardiaque, de la chaîne lourde de la myosine 7 (MYH7, encodée par le gene Λ7///7), de la chaîne légère régulatrice de la myosine ventriculaire (MLC-2v, encodée par le gène MYL2), de la chaîne lourde de la myosine 11 (MYH11, encodée par le gène MYHllf du gène Iroquois Homeobox 4 (IRX4), de gènes codant pour les protéines typiques du cycle calcique d’un cardiomyocyte (Serca2a, Phospholamban, de l’alpha-actinine 2 (ACTN2, encodée par le gène ACTN2),
Selon un mode de réalisation, le procédé de l'invention permet d’obtenir une population de cellules dont le niveau d’expression d’au moins un marqueur sélectionné parmi cTnT, ACTN2, MLC-2v et MYH11 est supérieur, de préférence supérieur de 20%, 25%, 30%,
35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou plus, au niveau d’expression dudit marqueur dans des cellules souches pluripotentes.
Selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend en outre une étape de sélection ou de tri sélectif des cardiomyocytes différenciés. Des exemples non limitatifs de méthodes qui peuvent être utilisées pour sélectionner ou trier des cellules incluent le tri par clonage, par cytofluorimétrie de flux ou encore par colonnes d'immunoaffinité ou immunomagnétiques utilisant des anticorps spécifiques des marqueurs de surface des cardiomyocytes tels que SIRPA (également appelé Tyrosine-protein phosphatase nonreceptor type substrate 1, SIRP alpha ou CD172a).
Des marqueurs de surface des cardiomyocytes incluent, mais ne sont pas limités à, ADRB1 (récepteur β-l adrénergique) et ADRB2 (récepteur β-l adrénergique).
Selon un mode de réalisation, les cardiomyocytes différenciés n’expriment pas les marqueurs de surface CD31 et/ou CD34.
Cependant, de façon avantageuse, le procédé de différenciation de l'invention est caractérisé en ce qu'il ne comprend pas d'étapes de purification, de sélection positive, ou de clonage d'un type cellulaire spécifique. Par sélection positive, il faut comprendre toute étape permettant de trier les cellules sur la base d'au moins une caractéristique particulière et notamment l'expression d'un marqueur cellulaire.
Il a été montré en particulier, que le procédé de différenciation de l'invention, contrairement aux procédés décrits dans l'état de la technique, permet d'obtenir une population de cardiomyocytes comprenant un fort pourcentage de cardiomyocytes, sans étape de sélection. L'absence d'étapes de clonage, de purification ou de sélection positive, permet d'améliorer nettement le rendement final obtenu.
En outre, le procédé de différenciation de l'invention présente l’avantage de réduire significativement le délai d’obtention des cardiomyocytes. Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de différenciation de cardiomyocytes de l’invention permet d’obtenir une population comprenant plus de 50% de cardiomyocytes différenciés, de préférence plus de 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de cardiomyocytes différenciés, en environ 7 jours, ou en 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14 jours.
L’invention concerne également des cardiomyocytes, ou une population de cardiomyocytes, susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention.
Dans un mode de réalisation, les cardiomyocytes sont des cardiomyocytes différenciés.
Dans un mode de réalisation, la population de cardiomyocytes comprend plus de 50% de cardiomyocytes différenciés, de préférence plus de 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de cardiomyocytes différenciés.
Dans un mode de réalisation, la population de cardiomyocytes ne comprend substantiellement que des cardiomyocytes différenciés. Dans un mode de réalisation, la population de cardiomyocytes ne comprend substantiellement plus de cellules souches pluripotentes non différenciées.
Dans un mode de réalisation, la population de cardiomyocytes comprend d’autres types cellulaires que les cardiomyocytes. Dans un autre mode de réalisation, la population de cardiomyocytes ne comprend pas d’autres types cellulaires que les cardiomyocytes.
Les méthodes de caractérisation des cardiomyocytes différenciés sont bien connues de l’homme du métier.
Selon un mode de réalisation, les cardiomyocytes susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention présentent une activité contractile périodique spontanée. Les méthodes pour mesurer la contractilité sont bien connues de l’homme de métier (GoBmann et al., 2016. Cell. Physiol. Biochem. 38:1182-1198). L’activité contractile des cardiomyocytes peut notamment être observée lorsque les cardiomyocytes sont cultivés dans un environnement adéquat, en particulier dans un environnement avec une concentration de calcium Ca2+ et une balance d’électrolyte adéquate. Dans ces conditions, les cardiomyocytes peuvent présenter une contractilité périodique le long d’un axe de la cellule, suivie d’un relâchement de la contraction.
Selon un mode de réalisation, les cardiomyocytes susceptibles d'être obtenus par le procédé de l’invention présentent au moins un phénotype sélectionné parmi cTnT+, ACTN2+, MLC-2v+, MYH11+, ADRB1+, ADRB2+, CD31' et CD34'.
L’invention porte en outre sur l’utilisation des cardiomyocytes obtenus ou susceptibles d’être obtenus par le procédé de différenciation de l’invention dans la préparation de produits de thérapie cellulaire.
Un autre objet de l’invention est l’utilisation des cardiomyocytes obtenus ou susceptibles d’être obtenus par le procédé de différenciation de l’invention dans le traitement de pathologies cardiaques.
Dans un mode de réalisation, les cardiomyocytes tels que décrits ci-dessus peuvent administrés à un sujet souffrant d’une maladie cardiaque.
Des exemples de maladies cardiaques incluent, mais ne sont pas limitées à, l’insuffisance cardiaque, incluant l’infarctus du myocarde, la cardiomyopathie, la cardiopathie ischémique, la cardiopathie hypertensive, la cardiopathie valvulaire, une maladie cardiaque congénitale et toute autre condition provoquant une insuffisance cardiaque congestive.
L’invention porte également sur l’utilisation des cardiomyocytes obtenus ou susceptibles d’être obtenus par le procédé de différenciation de l’invention comme outil de recherche.
Dans un mode de réalisation, les cardiomyocytes selon l’invention peuvent être utilisés pour tester des agents pharmacologiques ou thérapeutiques tels que des médicaments.
L’invention porte en outre sur une méthode de traitement de maladies cardiaques comprenant l’administration de cardiomyocytes obtenus ou susceptibles d’être obtenus par le procédé de différenciation de l’invention.
Dans un mode de réalisation, les cardiomyocytes sont administrés par injection chez le sujet, de préférence par injection directement dans le cœur. Dans un autre mode de réalisation, les cardiomyocytes sont transplantés chirurgicalement sous forme d’un implant, d’un transplant ou d’un greffon chez le sujet.
Dans un mode de réalisation, les cardiomyocytes sont administrés dans la région cardiaque, par exemple dans la région de l’infarctus.
Dans un mode de réalisation, le nombre de cardiomyocytes administrés va de 106 à 1O10 cellules, de préférence de 107 à 109 cellules.
L’invention concerne également un kit pour la mise en œuvre du procédé de différenciation telle que décrite ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, le kit comprend :
un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 tel que décrit ci-dessus ;
un vecteur permettant l’expression d’une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase ; et optionnellement, au moins un agent de différenciation supplémentaire, de préférence, au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.
Selon un mode de réalisation, le kit comprend :
un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi GATA4, MEF2C et TBX5 tel que décrit ci-dessus ;
une lignée de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée ; et optionnellement, au moins un agent de différenciation supplémentaire, de préférence, au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.
Selon un mode de réalisation, le kit de l’invention comprend en outre un milieu de maintenance et/ou un milieu de différenciation.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 est un histogramme montrant l'expression des gènes MyoDl (en gris clair) et Ascii (en gris foncé) après transfection d’iPSC avec 4 vecteurs d’expression permettant l’expression chacun d’un ARNgs ciblant les gènes MyoDl et Ascii d’une part, et un vecteur permettant l’expression de la GFP (contrôle positif GFP), un vecteur permettant l’expression de dCas9 comportant une seul transactivateur VP64 (VP64), un vecteur permettant l’expression de VP64m4 ou un vecteur permettant l’expression de dCas9 comportant 3 transactivateurs VP65, p65 etRta (VPR) d’autre part. Une transfection sans plasmide a également été réalisée (contrôle négatif sans plasmide).
La figure 2 est un histogramme montrant une comparaison de différentes conditions de transfection : (1) 500 ng SP-dCas9-VPR (permettant l’expression de dCas9 comportant les 3 transactivateurs VP65, p65 et Rta) + 350 ng pSPgRNA multiplex MyoDl (permettant l’expression de 4 ARNgs ciblant le gène MyoDlI) \ (2) 1 pg
SP-dCas9-VPR + 700 ng pSPgRNA multiplex MyoDl ; (3) 250 ng SP-dCas9-VPR + 180 ng pSPgRNA multiplex MyoDl \ et (4) 500 ng SP-dCas9-VPR + 500 ng pSPgRNA multiplex MyoDl. Une transfection sans plasmide (contrôle négatif sans plasmide) et avec un vecteur permettant l’expression de GFP (contrôle positif GFP) ont également été réalisés.
La figure 3 est un histogramme montrant l’efficacité d’activation du facteur GATA4 après transfection par un vecteur permettant l’expression de dCas9-VPR d’une part et 1, 2, 3 ou 4 vecteurs permettant l’expression chacun d’un ARNgs dingé contre la région promotnce du gène GATA4 d’autre part (nommés respectivement 1 ARNgs, 2 ARNgs, 3 ARNgs et 4 ARNgs). Une transfection sans plasmide (contrôle négatif sans plasmide) et avec un vecteur permettant l’expression de la GFP (contrôle positif GFP) ont également été réalisés.
La figure 4 est un ensemble de quatre histogrammes montrant l’expression de GATA4 (A), MEF2C (B), Isll (C) et Nkx2.5 (D), après transfection d’un vecteur permettant l’expression de dCas9-VPR d’une part, et soit d’un vecteur permettant l’expression d’un ARNgs ciblant la région promotrice du gène GATA4 (deuxième paire d’histogrammes, GATA4), soit d’un vecteur permettant l’expression des ARNgs ciblant la région promotnce des gènes GATA4, MEF2C et TBX5 (troisième paire d’histogrammes, GMT) d’autre part. Une transfection avec un plasmide vide a également été réalisée (première paire d’histogrammes, vide). L’expression des marqueurs a été mesurée 4 jours (gris foncé) et 8 jours (gris clair) après transfection.
La figure 5 est un ensemble de deux histogrammes, montrant l’expression de GATA4 (en noir) et MEF2C (en gris), 4 jours (A) et 8 jours (B) après transfection d’un vecteur permettant l’expression de dCas9-VPR d’une part, et soit de 4 vecteurs permettant l’expression chacun d’un ARNgs complémentaire de la région promotrice du gène GATA4 (GATA4) ; ou soit de trois concentrations croissantes (10 pg, 20 pg et 30 pg) d’un vecteur unique permettant l’expression de plusieurs ARNgs ciblant la région promotrice des gènes G AT A4, MEF2C et TBX5 (GMT1, GMT2 et GMT3 respectivement) d’autre part.
La figure 6 est un ensemble de deux histogrammes, montrant la surexpression de GATA4 (en noir) et MEF2C (en gris), 4 jours après la transfection d’un vecteur permettant l’expression de dCas9-VPR d’une part, et d’un plasmide vide ou d’un vecteur permettant l’expression des ARNgs ciblant la région promotrice des gènes GAFA4, MEF2C et TBX5 (GMT) d’autre part (A) ; ainsi que l’expression de cTnT (TNNT2) 14 jours après la transfection d’un vecteur permettant l’expression de dCas9-VPR et du vecteur GMT (B).
La figure 7 est un ensemble de deux histogrammes, montrant la surexpression de GATA4 (en noir), MEF2C (en gris clair) et TBX5 (en gris foncé), 4 jours après la transfection d’un vecteur permettant l’expression de dCas9-VPR d’une part, et d’un plasmide vide (J4 vide) ou d’un vecteur permettant l’expression des ARNgs ciblant la région promotrice des gènes G AT A4, MEF2C et TBX5 (J4 GMT) d’autre part (A) ; ainsi que l’expression de cTnT (TNNT2) 7 jours après la transfection d’un vecteur permettant l’expression de dCas9-VPR d’une part, et d’un plasmide vide ou du vecteur GMT d’autre part, combiné à une approche pharmacologique : CHIR90021 (6 μΜ) appliqué entre J2 et J4 puis IWP2 (5 μΜ) entre J4 et J6 (nommé Chir J2 IWP2 J4) ; CHIR90021 (6 μΜ) et IWP2 (5 pM) appliquées en même temps entre J2 et J4 (nommé Chir J2 IWP2 J2) ; IWP2 (5 pM) appliqué seul entre J2 et J4 (nommé IWP2 J2) ou IWP2 (5 pM) appliqué seul entre J4 et J6 (nommé IWP2 J4).
La figure 8 est un ensemble d’images et de graphiques, montrant l’efficacité de la différenciation par l’approche GMT combinée à une stimulation pharmacologique dans les 4 conditions suivantes : vecteur vide seul (CTL), vecteur vide et CHIR90021 (6 pM) et IWP2 (5 pM) appliquées en même temps entre J2 et J4 (CTL + Chir J2 IWP2 J2), vecteur permettant l’expression des ARNgs ciblant la région promotrice des gènes GATA4, MEF2C et TBX5 seul (GMT) ; et vecteur GMT et CHIR90021 (6 μΜ) et IWP2 (5 μΜ) appliquées en même temps entre J2 et J4 (GMT + Chir J2 IWP2 J2). A : Aspect des cellules à J7 dans les 4 différentes conditions. Magnification : 20x. B-C : Expression de cTNT par analyse en cytométrie sur deux lignées iPS différentes, lignée 31.3 (B) et lignée 5.5 (C). Gris clair : cellules cTNT' ; gris foncé : cellules cTNT+. Le pourcentage de cellules cTNT+ est indiqué dans chaque condition.
EXEMPLES
Les exemples suivants qui illustrent non-limitativement l’invention.
Exemple 1 : Sélection du transactivateur dCas9
Dans un premier temps, une comparaison directe de deux versions de dCas9 a été faite afin de sélectionner une version optimale de transactivation dans un modèle cellulaire.
Deux différentes versions de dCas9 ont été étudiées. La première version correspond à 15 une version humanisée et mutée (D10A, H840A) de Cas9 de Streptococcus pyogenes, et fusionnée au domaine transactivateur VP64, permettant de remplacer son activité nucléase par une activité de transactivation. Le transactivateur VP64 correspond à copies en tandem de VP 16 (Herpes simplex viral protein 16), connectées entre elles par des liaisons glycine-sérine (pcDNA-dCas9-VP64, Addgene #47107). Ce module VP 16 est un outil classique de biologie moléculaire mais l’activité transactivatrice est souvent limitée. La seconde version (nommée VPR) correspond à Cas9 de Streptococcus pyogenes fusionnée à plusieurs domaines transactivateurs en C-terminal, dont VP64 mais aussi p65 et Rta (SP-dCas9-VPR, Addgene #63798).
Ces deux transactivateurs ont été comparés directement en utilisant des ARN guides rapportés dans la littérature, ciblant les gènes MyoDl et Ascii (Perez-Pinera et al., 2013. Nat. Methods. 10:973-976). Des fragments d’ADN codant pour ces ARN guides (4 pour chaque gène ; SEQ ID Nos : 1-4 pour MyoDl -, SEQ ID Nos : 5-8 pour Ascii), de 20 paires de bases (pb) chacun (Eurogentec), ont été clonés dans des vecteurs d’expression indépendants (pSPgRNA, Addgene #47108). Les séquences de ces fragments d’ADN contiennent de surcroît la séquence CACC en 5’ de l’amorce sens et CAAA en 5’ de l’amorce antisens, correspondant aux séquences cible de l’enzyme de restriction Bbsl.
Après hybridation, les amorces sont clonées dans le plasmide pSPgRNA linéarisé par Bbsl.
Quatre vecteurs d’expression pSPgRNA (500 ng chacun) sont ainsi transférés en plus du vecteur d’expression (1 pg) pcDNA-dCas9-VP64 ou SP-dCas9-VPR dans des iPSC. Par la suite toutes les expériences de nucléofection ont été réalisées sur des iPSC.
L’expression des gènes Ascii et MyoDl a été suivie par qPCR (Figure 1). On observe qu’en comparaison à une dCas9 comportant un seul transactivateur VP64, dCas9-VPR permet une expression du gène MyoDl équivalente et une expression à’Ascll 7 fois plus importante. Par rapport aux contrôles, le système permet une augmentation de l’expression des gènes ciblés d’un facteur 4 à 15.
Exemple 2 : Multiplexage des ARNgs par la technique du Golden Gâte
Lors de la nucléofection telle que présentée dans l’exemple 1, un total de 5 vecteurs d’expression est nécessaire pour activer le système : le vecteur comportant la dCas9-VPR et 4 vecteurs indépendants codant chacun pour un ARNgs. Le fait de multiplier les vecteurs ne facilite pas la reproductibilité des résultats, puisqu’il est fort probable que certaines cellules ne reçoivent pas la totalité des vecteurs lors des conditions de transfection multiples. Ainsi, la construction d’un plasmide qui permettrait d’exprimer l’ensemble des ARNgs en un seul temps pourrait permettre de simplifier l’approche.
Afin d’y remédier, nous avons utilisé la technique du Golden Gâte qui consiste à multiplexer plusieurs vecteurs plasmidiques pour ne former qu’un seul et unique vecteur codant pour plusieurs ARN guide. Cette technique s’appuie sur la faculté des enzymes de restriction de type II (Bbsl) à reconnaître un motif nucléotidique et à cliver à l’extérieur de ce motif. On peut donc, en choisissant des amorces pertinentes, concaténer avec la même enzyme plusieurs fragments d’ADN.
Pour tester ce système, nous avons réalisé le dessin des quatre amorces à l’aide de l’éditeur NEB Golden Gâte vl .0 Assembly Tool (NEB). Après amplification par PCR du vecteur de base pSPgRNA ainsi que des différents inserts, la réaction de ligation et de digestion se fait en une seule et même étape. Ainsi, un vecteur dit « multiplex » est généré.
Dans un premier temps, afin de valider cette nouvelle approche, nous avons utilisé les 4 ARNgs préalablement utilisés pour transactiver MyoDl (Séquence ADN complémentaire : SEQ ID Nos : 1-4). Afin de valider la nouvelle construction, quatre conditions de nucléofections ont été testées :
a) Condition 1 : 500 ng SP-dCas9-VPR + 350 ng pSPgRNA multiplex MyoDl, ratio molaire 2/1 ;
b) Condition 2 : 1 pg SP-dCas9-VPR + 700 ng pSPgRNA multiplex MyoDl, ratio molaire 2/1 ;
c) Condition 3 : 250 ng SP-dCas9-VPR + 180 ng pSPgRNA multiplex MyoDl, ratio molaire 2/1 ;
d) Condition 4 : 500 ng SP-dCas9-VPR + 500 ng pSPgRNA multiplex MyoDl, ratio molaire 3/1.
L’expression du gène MyoDl a été suivie par qPCR (Figure 2). On observe une expression largement stimulée avec la condition 2 (1 pg SP-dCas9-VPR et 700 ng pSPgRNA multiplex MyoDl}, similaire à celle obtenue avec la transfection individuelle des 4 vecteurs pSPgRNA codant séparément pour un ARNgs (Figure 1).
Exemple 3 : Dessin de 4 nouveaux ARNgs de Gata4
Suite à ces résultats préparatoires, nous ciblons à présent le gène Gata4, un facteur de transcription essentiel dans l’initiation de la formation du mésoderme pré-cardiaque. Le dessin des fragments d’ADN codant pour les ARNgs de Gata4 a été réalisé à l’aide de l’éditeur CRISPR-ERA (Stanford University, California). Les ARNgs ont été choisis sur la base des données de Genome Browser (UCSC, California), rapportant les régions promotrices et activatrices des gènes. Les amorces dessinées se situent dans les mille paires de bases en amont du site de démarrage de la transcription du gène Gata4.
Quatre positions différentes ont été retenues dans les zones prédites comme étant des zones activatrices (SEQ ID Nos : 9, 11, 12 et 13). Le clonage est identique à celui décrit précédemment (4 vecteurs pSPgRNA codant séparément chaque ARNgs, nommés Gata-1 à Gata-4).
Quatre conditions de nucléofections ont été testées, comprenant 1 (Gata-2), 2 (Gata-2 et Gata-1), 3 (Gata-2, Gata-1 et Gata-4) ou 4 (Gata-2, Gata-1, Gata-4 et Gata-3) vecteurs pSPgRNA ciblant Gaia4, avec pour chaque condition, 500 ng de vecteur et 1 pg de chacun des quatre guides.
L’expression du gène Gata4 a été suivie par qPCR (Figure 3). Les résultats bruts 10 montrent une augmentation d’expression par un facteur 4, obtenu au mieux après transfert de 2 vecteurs pSPgRNA. Les résultats relatifs représentent un ajustement d’expression pour tenir compte des différences théoriques du niveau de transfection de l’ensemble des plasmides (d’une double transfection pour la condition 1 pSPgRNA à une quintuple transfection pour la condition 4 pSPgRNA).
Après ajustement, le maximum d’activation semble être obtenu avec un minimum de 2 pSPgRNA.
Exemple 4 : Création d’un vecteur d’expression multiplexé GaicG, Mef2c et Tbx5
Afin d’activer un programme cardiogénique complet, nous ciblons à présent 3 facteurs de transcription clés de la formation du mésoderme pré-cardiaque et de la génération des cardiomyocytes : Gala4, Mef2c et Tbx5.
Selon les résultats précédents, il est décidé d’utiliser 2 ARNgs par gène ciblé afin de procéder à leur transactivation. De plus, l’objectif est de créer un vecteur multiplex permettant l’expression des 2 ARNgs pour les 3 gènes cibles (soit un total de 6 ARNgs). Ce nouveau vecteur permettrait ainsi d’obtenir en un temps, l’activation simultanée de
3 gènes différents.
Pour développer cette approche, la technique du Golden Gâte est utilisée pour créer le vecteur multiplexé contenant chacun des fragments d’ADN codant pour les ARNgs contre les trois gènes de la cardiogenèse Gaia4, Mef2c et Tbx5 (Séquence ADN complémentaire: SEQ ID Nos: 10-11 pour Gata4 \ SEQ ID Nos : 14-15 pour Mef2c \ SEQ ID Nos : 16-17 pour Tbx5). L’approche est identique à celle décrite précédemment.
L’activité du nouveau système est testée de manière similaire aux précédentes expérimentations. Trois conditions de nucléofection sont comparées : transfection par un vecteur pSPgRNA vide (contrôle négatif), transfection par le vecteur pSPgRNA multiplex GMT (ou système GMT, pour Gata4lMef2clTbx5) et transfection par les quatre vecteurs pSPgRNA codant chacun pour un ARNgs ciblant Gata4.
L’analyse par qPCR a montré une augmentation forte de l’expression de Gata4 et Mef2c avec le système GMT (Figures 4A et 4B). De manière intéressante, nous avons pu observer que l’utilisation de vecteurs codant pour les ARNgs contre Gata4 permet une légère augmentation de l’expression de Me(2c, un facteur de transcription activé secondairement par l’activation de Gata4. Ceci suggère que la surexpression du gène cible Gata4 se traduit par une activation fonctionnelle d’un programme d’expression cardiogénique.
De même, nous avons mesuré le niveau d’expression de Isll etNkx2.5, deux facteurs de transcription impliqués plus tardivement dans la formation des cardiomyocytes et non ciblés directement par nos systèmes (Figures 4C et 4D). Nous avons ainsi pu observer une augmentation nette de leur niveau d’expression, et ceci notamment avec le système GMT.
Exemple 5 : Mise au point d’un nouveau protocole de différenciation basée sur l’approche de transactivation spécifique d’un programme cardiogénique
Définition des milieux de culture
Dans un premier temps, différentes conditions de nucléofection pour le transfert du matériel génique (plasmides SP-dCas9-VPR et pSPgRNA multiplex GMT ou pSPgRNA multiplex vide) ont été étudiées. L’utilisation d’un plasmide codant pour la GFP a servi de témoin positif de nucléofection (fourni par le kit Human Stem Cell Nucleofector® Kit 1).
Dans une première expérience, les iPSC ont été maintenues en milieu mTesrl pendant 7 jours après la nucléofection. L’observation des cultures montre une hyperprolifération des iPSC dans ce milieu riche en facteurs de maintien de la pluripotence. Il est donc très probable que ce milieu induit une sélection privilégiée des cellules de types pluripotentes au dépend des cellules en cours de différenciation.
Dans une seconde expérience, nous avons reproduit les mêmes conditions de nucléofection, mais les cellules n’ont été maintenues en milieu mTesrl que pendant 48 heures, avant d’être placées dans un milieu pauvre de type B27 sans insuline. Nous avons observé une mortalité très importante des cellules, ne permettant pas d’analyses complémentaires.
Finalement, nous avons modifié les conditions de milieu de culture en conservant une première phase de 48 heures en milieu mTesrl, suivie d’un milieu nourricier neutre proposé pour la différenciation des cardiomyocytes (milieu essential E6, Thermo Fischer). Dans ces conditions, nous n’avons pas observé de surmortalité ou d’hyperprolifération des cellules.
Ce protocole de 48 heures en milieu mTesrl après nucléofection, suivi d’un passage en milieu essentiel E6, a donc été sélectionné pour la suite des expérimentations.
Définition des concentrations de vecteurs d’expression
Nous avons comparé 3 différentes concentrations du plasmide pSPgRNA multiplex GMT 20 afin d’établir les meilleures conditions de surexpression des gènes d’intérêt dans les cellules de type iPS.
Dans cette première expérimentation, nous avons comparé les 5 groupes suivant :
a) Contrôle : 5pg SP-dCas9-VPR + 5 pg pSPgRNA vide ;
b) Gata : 5 pg SP-dCas9-VPR + 3 pg de chacun des pSPgRNA Gata-1 à Gata-4 ;
c) GMT1 : 10 pg SP-dCas9-VPR + 10 pg pSPgRNA multiplex GMT ;
d) GMT2 : 20 pg SP-dCas9-VPR + 20 pg pSPgRNA multiplex GMT ;
e) GMT3 : 30 pg SP-dCas9-VPR + 30 pg pSPgRNA multiplex GMT.
L’expression des gènes Gata4 et Mef2c a été mesurée par qRT-PCR 4 et 8 jours après la transfection des cellules souches pluripotentes confluentes à 70-80% (Figure 5). On observe un effet du vecteur pSPgRNA multiplex GMT dose-dépendant, la transfection de 20 pg et 30 pg des plasmides étant associée à une augmentation plus importante et homogène de l’expression des gènes cibles, notamment 8 à 10 fois plus importante que la condition contrôle (vide) et 3 fois plus importante que la condition GMT1.
En revanche, la condition GMT3, associée à l’augmentation la plus importante d’expression, montre une différence limitée avec la condition GMT2. Ainsi les conditions d’utilisation du vecteur pSPgRNA multiplex GMT et du plasmide SP-dCas9-VPR à la dose de 200 ng/pL (20 pg dans un volume de 100 pL) et en ratio 3 :1 (ratio molaire) est retenue par la suite.
Effet sur la surexpression GMT
Dans cette expérimentation, les iPSC ont été nucléofectées selon le protocole préalablement établi. Deux conditions ont été comparées :
a) Vide : 5 pg SP-dCas9-VPR + 5 pg pSPgRNA vide ;
b) GMT : 20 pg SP-dCas9-VPR + 20 pg pSPgRNA multiplex GMT.
Les cellules ont été conservées en milieu mTesrl pendant 48 heures, puis placées en milieu E6. Une partie des cellules a été lysée 48 heures plus tard (soit à J4 après la nucléofection) pour contrôler l’augmentation d’expression des gènes cibles dans la manipulation (Figure 6A). Une autre partie des cellules a été maintenue pendant 12 jours (soit jusqu’à J14 après la nucléofection) en milieu E6, afin d’observer l’apparition de cellules de type cardiomyocytes.
A l’issue de ces 14 jours, les cellules ont été lysées et l’expression de la troponine T cardiaque (cTnT, encodée par le gène TNNT2) a été mesurée par qRT-PCR (Figure 6B), montrant une augmentation d’environ 33% de l’expression de cTnT par rapport à la condition contrôle.
Exemple 6 : Optimisation de l’effet GMT par combinaison à une approche pharmacologique
Nous avons testé l’effet de deux molécules pharmacologiques utilisées dans la différenciation des iPSC pour induire la transformation mésodermique. Le premier (CEHR90021) est un inhibiteur de la glycogen synthase kinase 3 ou GSK3 ; et le second (IWP-2) est un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.
Dans les protocoles connus de différenciation d’iPSC en cardiomyocytes, ces molécules sont utilisées successivement afin de pouvoir manipuler des voies de signalisation clé de la cardiogenèse. La molécule CHIR90021 est appliquée dans les 3 premiers jours pour amorcer la différenciation des cellules pluripotentes puis la molécule IWP-2 est appliquée pendant 2 jours (de J3 à J5) pour induire la différenciation vers les progéniteurs cardiaques.
Compte-tenu des différences liées à la nucléofection des iPSC et de la nécessité de les réensemencer après cette nucléofection, nous avons décidé de respecter une fenêtre de
48 heures pendant laquelle les cellules sont remises en milieu mTesrl sans stimulation pharmacologique (selon les conditions décrites dans l’exemple précédent).
Par la suite, nous avons dessiné 4 protocoles de stimulation pharmacologique (tous les quatre sur milieu essentiel E6) :
a) Protocole 1 dit « successif » (Chir J2 IWP2 J4) : CHIR90021 (6 μΜ) appliqué entre J2 et J4 ; IWP2 (5 pM) appliqué entre J4 et J6 ;
b) Protocole 2 dit « accéléré » (Chir J2 IWP2 J2) : CHIR90021 (6 pM) et IWP2 (5 pM) appliquées en même temps entre J2 et J4 ;
c) Protocole 3 dit « monothérapie précoce » (IWP2 J2) : IWP2 (5 pM) appliqué seul entre J2 et J4 ;
d) Protocole 4 dit « monothérapie tardive » (IWP2 J4) : IWP2 (5 pM) appliqué seul entre J4 et J6.
Ces différents protocoles ont été testés sur des cellules transfectées avec SP-dCas9-VPR + pSPgRNA multiplex GMT (ratio 3:1); et des cellules-contrôle transfectées avec SP-dCas9-VPR + pSPgRNA vide (ratio 3:1) selon les conditions préalablement décrites.
Un échantillon de cellules a été récolté à J4 pour juger de l’efficacité de l’approche GMT (iPSC en milieu mTesrl pour 48 heures puis en milieu E6 pour 48 heures) (Figure 7A). Finalement, les cellules ont été lysées 7 jours après la nucléofection et l’expression génique a été mesurée par qRT-PCR (Figure 7B).
Les résultats montrent tout d’abord une très bonne efficacité de l’approche GMT avec une surexpression d’un facteur supérieur à 10 des 3 gènes cibles Gaia4, Mef2c et Tbx5 (Figure 7A). La comparaison de l’expression de la troponine T cardiaque (cTnT) 7 jours après la nucléofection identifie l’effet synergique de la combinaison GMT/stimulation pharmacologique (Figure 7B). Dans les groupes contrôles, seul le protocole pharmacologique dit « successif » (Chir J2 IWP2 J4) est associé à une augmentation de l’expression du gène ΤΝΝΊ2 codant la troponine T cardiaque, ce qui corrobore les résultats décrits dans la littérature suite à l’application successive des deux molécules.
Cependant, cet effet est très nettement amplifié lorsque les iPSC ont été nucléofectées avec pSPgRNA multiplex GMT, comme le montre la multiplication d’un facteur 6 du niveau d’expression. Surtout, alors qu’en condition contrôle, la stimulation pharmacologique dite « accéléré» (Chir J2 IWP2 J2) n’augmente pas l’expression de TNNT2, cette même stimulation combinée au système GMT produit l’augmentation la plus importante de l’expression de TNNT2, avec une augmentation d’un facteur 57. Il faut noter que l’administration d’IWP2 seul ne se traduit pas par une augmentation d’expression de ΤΝΝΊ2 et ceci, quel que soit le temps d’administration (J2 ou J4) ou la présence ou non du système GMT.
Exemple 7 : Nouveau schéma expérimental de différenciation par approche GMT combinée à une stimulation pharmacologique
A l’issue de l’ensemble de ces expériences de mise au point, le protocole final suivant a été établi :
Les iPSC sont cultivés et mises en expansion dans un milieu mTesrl sur un lit matrigel pendant au moins 7 jours. Pour réaliser la nucléofection, les iPSC sont détachées en utilisant 0.025% Trypsin-EDTA (Promocell) et resuspendues dans 100 pL du mélange comprenant 82 pL de solution 1 et 18 pL de solution supplément du Human Stem Cell
Nucleofector® Kit 1, auquel est ajouté 20 pg de chaque plasmide SP-dCas9-VPR + pSPgRNA multiplex GMT. La nucléofection est effectuée à l’aide du Nucleofector™ 2b Device (Lonza, programme A-013).
Par la suite, les cellules nucléofectées sont rensemencées sur des plaques avec lit matrigel et maintenues pendant 48 heures en milieu mTesRl avec addition d’un inhibiteur de la
Rho-associated protein kinase ou ROCK (Y-27632, Tocris) pour prévenir leur anoïkose et de Penicillin-Streptomycin (Life technologies).
A J2, le milieu est changé et remplacé par du Essential E6 (Life technologies) avec supplémentation en CHIR90021 (6 pM) and IWP2 (5 pM).
A J4, les cellules sont remises en milieu de différenciation Essential E6 sans molécules 15 pharmacologiques.
Ce protocole a été testé sur deux lignées d’iPSC différentes (lignées 31.3 et 5.5) et la différenciation en cardiomyocytes a été monitorée par microscopie (Figure 8A), par immunofluorescence (résultats non montrés) et en fonction du niveau d’expression de cTnT mesuré par cytométrie (Figure 8B-C).
L’immunofluorescence est réalisée 7 jours après nucléofection. Les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde (Sigma-Aldrich, #HT5O12-1CS) pendant 10 minutes à température ambiante puis perméabilisées et les sites antigéniques aspécifiques sont bloqués pendant 45 minutes dans un tampon de blocage (PBS contenant 2% BSA et 0.5% Triton-X-100). Les cellules sont ensuite incubées avec un anticorps anti-cTnT (rabbit polyclonal anti-cardiac Troponin T antibody Abcam, #ab45932 ; dilution 1/500). Puis les cellules sont lavées 3 fois au PBS et incubées 45 minutes à température ambiante avec l’anticorps secondaire couplé au fluorochrome Alexa Fluor 488 (dilution 1/1000) et du DAPI (dilution 1/1000). Les images sont acquises au microscope à épifluorescence (Nikon Epifluorescence Microscope).
La cytométrie est réalisée en parallèle de l’immunofluorescence. Les cellules sont détachées et dissociées utilisant 0.025% Trypsin-EDTA (Promocell) puis centrifugées 5 minutes à 200 g. Les cellules sont ensuite fixées avec du paraformaldéhyde (Sigma-Aldrich, #HT5O12-1CS) pendant 10 minutes à température ambiante, puis perméabilisées avec un mélange méthanol-eau 90/10 (v:v) froid pendant 15 minutes à 4°C. Les cellules sont lavées 3 fois avec du PBS puis incubées pendant 45 minutes à l’obscurité avec l’anticorps anti-cTnT (Anti-cardiac Troponin T-APC, recombinant human IgGl mouse rat, clone REA400 MiltenyiBiotec, #130-106-689) ou l’isotype contrôle interne (CTL-I APC, Monoclonal REA Control (I) antibody human, clone
REA293 MiltenyiBiotec, #130-104-615). Les cellules sont lavées et resuspendues dans du PBS contenant 0.5% BSA. Les cellules sont analysées par le MACSQuant® Analyzer 10 (MiltenyiBiotec, #130-096-343) et les résultats retraités à l’aide du logiciel FlowJo.
Les résultats montrent une formation accélérée et massive de cellules exprimant cTnT dans les conditions combinant le système GMT et l’addition pharmacologique de
CHIR90021 et IWP2 pendant 2 jours (entre J2 et J4 après nucléofection). Ces résultats sont observés dès le 7eme jour après nucléofection. Les résultats sont reproduits dans deux lignées d’iPSC différentes (Figure 8B-C), démontrant la reproductibilité entre lignées de l’approche.
Claims (9)
- REVENDICATIONS1. Procédé in vitro ou ex vivo de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes, lesdites cellules souches pluripotentes n’étant pas des cellules5 souches embryonnaires humaines, ledit procédé comprenant une étape d’activation d’au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi Gata4, Mef
- 2c et/ou Tbx5,- dans lequel ladite étape d’activation utilise un système dérivé du système CRISPR/Cas9, dans lequel la protéine Cas9 est dépourvue d’activité10 endonucléase et possède une activité de transactivation ;- et dans lequel ladite étape d’activation comprend l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARN guide spécifique (ARNgs) complémentaire de la région promotrice du gène dudit au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque.15 2. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape d’activation comprend l’introduction dans les cellules souches pluripotentes d’un vecteur permettant l’expression d’une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase.20
- 3. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules souches pluripotentes expriment de manière stable une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase.
- 4. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre25 avant, concomitamment et/ou après ladite étape d’activation, la mise en contact desdites cellules souches pluripotentes avec au moins un agent pharmacologique de différenciation, de préférence au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.
- 5. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant :a) l’introduction dans lesdites cellules souches pluripotentes d’au moins un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARN guide spécifique (ARNgs) dirigé contre la région promotrice du gène dudit au moins un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque ;b) avant, concomitamment et/ou après l’étape a), l’expression dans lesdites cellules souches pluripotentes d’une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase ;c) la culture desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de maintenance ; etd) le transfert desdites cellules souches pluripotentes dans un milieu de différenciation, de préférence dans un milieu de différenciation supplémenté d’au moins un agent pharmacologique de différenciation, de préférence d’au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou d’au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.
- 6. Un vecteur permettant l’expression d’au moins un ARN guide spécifique (ARNgs), ledit ARN guide étant complémentaire d’au moins 80% de la région promotrice du gène d’un facteur de transcription spécifique du tissu cardiaque, de préférence sélectionné parmi Gata4, Mef2c et/ou Tbx5.
- 7. Le vecteur selon la revendication 6, comprenant au moins une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NOs : 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, et/ou 17, de préférence les séquences SEQ ID NOs : 10,11, 12 13, 14, 15, 16 et 17.
- 8. Une composition comprenant un vecteur selon la revendication 6 ou 7.
- 9. Un kit comprenant :- un vecteur selon la revendication 6 ou 7 ou une composition selon la revendication 8 ;- une lignée de cellules souches pluripotentes exprimant de manière stable une protéine Cas9 modifiée ou un vecteur exprimant une protéine Cas9 modifiée, ladite protéine Cas9 modifiée comprenant au moins un domaine transactivateur et étant dépourvue de domaine nucléase, lesdites cellules souches n’étant pas des cellules souches embryonnaires humaines ; et- optionnellement, au moins un agent pharmacologique de différenciation, de préférence, au moins un inhibiteur de la protéine GSK3 et/ou au moins un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt.1/7AsciiMyoDl
............................ φ CD CL ï-< (0 M -a» Ό E «Λ <O k. M C U. ÎD c « O Φ O, O Q <o (Λ Cl. C C s O wi Q VPR
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1660531A FR3058160A1 (fr) | 2016-10-28 | 2016-10-28 | Procede de differenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes |
| PCT/FR2017/052974 WO2018078301A1 (fr) | 2016-10-28 | 2017-10-27 | Procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1660531A FR3058160A1 (fr) | 2016-10-28 | 2016-10-28 | Procede de differenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes |
| FR1660531 | 2016-10-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR3058160A1 true FR3058160A1 (fr) | 2018-05-04 |
Family
ID=59070699
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR1660531A Withdrawn FR3058160A1 (fr) | 2016-10-28 | 2016-10-28 | Procede de differenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR3058160A1 (fr) |
| WO (1) | WO2018078301A1 (fr) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020069334A1 (fr) * | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Andre Terzic | Fabrication et utilisation de cellules cardiopoïétiques |
| CN113710258A (zh) * | 2019-03-15 | 2021-11-26 | 华盛顿大学 | Prpf31基因表达敲低提高体外分化的人细胞的存活 |
| WO2020209800A2 (fr) * | 2019-04-11 | 2020-10-15 | Agency For Science, Technology And Research | Procédé de modification d'un état de différenciation d'une cellule |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014078414A1 (fr) * | 2012-11-13 | 2014-05-22 | Joseph Wu | Production définie chimiquement de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes |
| WO2014197748A2 (fr) * | 2013-06-05 | 2014-12-11 | Duke University | Édition et régulation géniques à guidage arn |
| WO2015070083A1 (fr) * | 2013-11-07 | 2015-05-14 | Editas Medicine,Inc. | Méthodes et compositions associées à crispr avec arng de régulation |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USH1963H1 (en) | 1998-01-16 | 2001-06-05 | Dresser Industries, Inc. | High pressure differential electrical connector |
-
2016
- 2016-10-28 FR FR1660531A patent/FR3058160A1/fr not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-10-27 WO PCT/FR2017/052974 patent/WO2018078301A1/fr active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014078414A1 (fr) * | 2012-11-13 | 2014-05-22 | Joseph Wu | Production définie chimiquement de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes |
| WO2014197748A2 (fr) * | 2013-06-05 | 2014-12-11 | Duke University | Édition et régulation géniques à guidage arn |
| WO2015070083A1 (fr) * | 2013-11-07 | 2015-05-14 | Editas Medicine,Inc. | Méthodes et compositions associées à crispr avec arng de régulation |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| AMI M. KABADI ET AL: "396. Multiplex CRISPR/Cas9 Genome Engineering for Directing Myogenic Cellular Differentiation", MOLECULAR THERAPY, vol. 23, May 2015 (2015-05-01), US, pages S157, XP055389298, ISSN: 1525-0016, DOI: 10.1016/S1525-0016(16)34005-9 * |
| KRISTIINA RAJALA ET AL: "Cardiac Differentiation of Pluripotent Stem Cells", STEM CELLS INTERNATIONAL, vol. 231, no. 11, 2011, pages 1753 - 12, XP055053521, ISSN: 1687-966X, DOI: 10.4061/2011/383709 * |
| SYANDAN CHAKRABORTY ET AL: "A CRISPR/Cas9-Based System for Reprogramming Cell Lineage Specification", STEM CELL REPORTS, vol. 3, no. 6, December 2014 (2014-12-01), United States, pages 940 - 947, XP055389295, ISSN: 2213-6711, DOI: 10.1016/j.stemcr.2014.09.013 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018078301A1 (fr) | 2018-05-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cao et al. | Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells | |
| Tanaka et al. | Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro | |
| US20120207744A1 (en) | Reprogramming compositions and methods of using the same | |
| US20220403390A1 (en) | Methods and compositions for reprogramming cells | |
| US20090186414A1 (en) | Methods of Generating Cardiomyocytes and Cardiac Progenitors and Compositions | |
| Umehara et al. | Efficient derivation of embryonic stem cells by inhibition of glycogen synthase kinase-3 | |
| DK2925856T3 (en) | Process for the preparation of RPE cells | |
| EP3170893B1 (fr) | Procédé d'extraction de cellules différenciées | |
| RU2730861C2 (ru) | Способ продуцирования почечных клеток-предшественников | |
| CN108138129A (zh) | 血管内皮细胞的诱导方法 | |
| AU2012343826A1 (en) | Haploid cells | |
| WO2018078301A1 (fr) | Procédé de différenciation de cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes | |
| JP2012530497A (ja) | 臍帯血からの人工多能性幹細胞の生成方法 | |
| Mengarelli et al. | Derivation of multiple cranial tissues and isolation of lens epithelium-like cells from human embryonic stem cells | |
| US20210147869A1 (en) | Reprogramming vectors | |
| Zamperone et al. | Isolation and characterization of a spontaneously immortalized multipotent mesenchymal cell line derived from mouse subcutaneous adipose tissue | |
| WO2016016572A1 (fr) | Procédé de production in vitro de progéniteurs adipocytaires et d'adipocytes | |
| EP3299450A1 (fr) | Syncytiotrophoblaste induit et procédé de préparation de cellule progénitrice de celui-ci | |
| Wang et al. | Histone demethylase KDM2B inhibits the chondrogenic differentiation potentials of stem cells from apical papilla | |
| Xiao et al. | Tuning FOXD3 expression dose-dependently balances human embryonic stem cells between pluripotency and meso-endoderm fates | |
| US20220162550A1 (en) | Induced stem cells | |
| WO2015088162A1 (fr) | Composition permettant de favoriser la différenciation des cellules souches en chondrocytes | |
| CA2647806A1 (fr) | Procede de preparation de cellules aviaires differenciees et genes impliques dans le maintien de la pluripotence | |
| CN116323917A (zh) | 人原始生殖细胞/人原始生殖细胞样细胞的维持扩增方法 | |
| FR2971792A1 (fr) | Methode in vitro pour identifier des agents modulateurs de la senescence cellulaire |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 2 |
|
| PLSC | Publication of the preliminary search report |
Effective date: 20180504 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 3 |
|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20200906 |