CN110229814A

CN110229814A - 改进的向导rna

Info

Publication number: CN110229814A
Application number: CN201810182456.2A
Authority: CN
Inventors: 王皓毅; 穆伟; 唐娜; 程晨
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2018-03-06
Filing date: 2018-03-06
Publication date: 2019-09-13

Abstract

本发明涉及基因编辑领域。具体而言，本发明涉及用于基因编辑的改进的向导RNA，以及利用所述改进的向导RNA进行基因编辑的方法和系统。

Description

改进的向导RNA

技术领域

背景技术

规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)-相关(Cas)系统是各种细菌和古细菌中的适应性免疫系统(Barrangou等，2007；Terns and Terns，2011)。最常用的化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)II型CRISPR-Cas9系统，由Cas9核酸酶和两个短的RNA(CRISPRRNA(crRNA) 和反式激活的CRISPR RNA(tracrRNA))组成。tracrRNA和crRNA可以通过任意的茎环连接形成单向导RNA(sgRNA)，其长度大约100个核苷酸(Jinek等，2012)。在sgRNA的指导下，由Cas9蛋白和sgRNA组成的复合物可以在特定的基因组基因座产生DNA双链断裂(DSB)。CRISPR-Cas9系统已被应用于编辑多种生物的基因组(Cong等，2013；Gratz 等，2013；Hwang等，2013；Jiang等，2013；Mali等，2013；Wang等，2013)。除了可以将表达Cas9蛋白和sgRNA的质粒常规转染到各种细胞系中以进行基因编辑(Cong等， 2013；Ran等，2013；Mali等，2013)，还可直接递送由Cas9蛋白和sgRNA组成的核糖核蛋白(RNP)(Cas9-sgRNARNP)，其显示出更高的效率和更低的脱靶效应(Kim等，2014； Sung等，2014；Zuris等，2015)，特别是在人原代细胞如T细胞(Hendel等，2015；Schumann 等，2015；Hultquist等，2016)。

CRISPR-Cas9介导的基因编辑对进一步改善细胞疗法具有很大的潜力，并且人原代细胞(如人CD34⁺造血干细胞和祖细胞(HSPC)和T细胞)的基因编辑对于研究这些细胞类型中的基因功能很重要。CRISPR-Cas9介导的HSPC中BCL11A和HBB基因的编辑对于治疗β地中海贫血和镰刀型细胞贫血症显示出很大的希望(Canver等，2015；Dever等， 2016)。CRISPR-Cas9介导的T细胞和嵌合抗原受体(CAR)T细胞的基因编辑已经在许多研究中被评估(Schumann等，2015；Mandal等，2014；Poirot等，2015；Liu等，2016；Ren 等，2017；Ren等，2017；Zhang等，2017)。

然而，之前的研究表明使用CRISPR-Cas9RNP进行的多基因编辑阻碍了CAR-T细胞的增殖(Liu等，2016)。也有报道说Cas9/hCD45sg1RNP处理的人HSPC与Cas9蛋白处理的对照相比具有较低的细胞数目(Gundry等，2016)。因此，由于CRISPR-Cas9基因编辑对人原代细胞和CAR-T细胞潜在的负面影响，建立一种简单的方法以消除这些不利影响是必要的。

此外，为了提高CRISPR基因编辑系统的性能，已经探索了对sgRNA的各种修饰。化学修饰(如2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)或2'-O-甲基3'thioPACE(MSP))已显示增强siRNA的稳定性(Deleavey和Damha，2012；Eckstein，2014)，其也被应用于sgRNA以及crRNA和tracRNA(Hendel等，2015；Rahdar等，2015)，并提高了基因编辑效率。然而，用这些修饰合成长RNA寡核苷酸是具有挑战性且昂贵的。由于目前RNA合成技术的长度限制，难以产生具有额外RNA序列或结构如SAM结构的sgRNA。因此，进一步建立一种简单且经济的方法以提高sgRNA的稳定性，从而提高CRISPR基因编辑系统的效率是必要的。

本发明通过提供改进的用于基因编辑的向导RNA特别是单向导RNA，克服了上述问题。

发明概述

在一方面，本发明提供一种分离的向导RNA(gRNA)，其中所述gRNA：

1)包含5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构；或

2)通过体外转录产生，且所述体外转录产生的gRNA的5’末端磷酸基团被去除。

在一些实施方案中，其中相对于不具有5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构的gRNA，所述具有5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构的gRNA在细胞中具有更长的半衰期。在一些实施方案中，其中相对于具有5’末端磷酸基团的gRNA，所述5’末端磷酸基团被去除的 gRNA具有降低的细胞毒性。在一些实施方案中，所述gRNA是sgRNA。

在另一方面，本发明提供一种产生gRNA例如sgRNA的方法，所述方法包括：

步骤a)，通过体外转录或化学合成产生gRNA；和

步骤b)，其包括b1)给所述gRNA添加5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构，或

b2)去除所述体外转录产生的gRNA的5’末端磷酸基团。

在一些实施方案中，其中步骤b2)中通过磷酸酶处理去除所述体外转录产生的gRNA 的5’末端磷酸基团。在一些实施方案中，其中所述磷酸酶是碱性磷酸酶，例如细菌碱性磷酸酶(BAP)、虾碱性磷酸酶(SAP)、小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)或分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)。

在另一方面，本发明提供一种用于修饰细胞基因组中至少一个靶序列的基因编辑系统，其包含：

1)CRISPR效应蛋白，或包含编码CRISPR效应蛋白的核苷酸序列的表达构建体；和

2)本发明的gRNA或通过本发明的方法产生的gRNA，其中所述gRNA设计为靶向所述靶序列。

在另一方面，本发明提供一种产生经修饰的细胞的方法，所述细胞基因组中至少一个靶序列被修饰，所述方法包括将本发明的基因编辑系统导入所述细胞。

在一些实施方案中，所述细胞是人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫、鸡、鸭、或鹅的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人原代细胞，例如胚胎干细胞、造血干细胞和祖细胞(HSPC)、T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是TCR-T细胞或CAR-T 细胞，例如包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域的TCR-T细胞或CAR-T细胞。在一些实施方案中，通过选自磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射的方法将所述基因编辑系统导入所述细胞。

在另一方面，本发明提供一种经修饰的细胞，其由本发明上述方法产生。

在另一方面，本发明提供一种治疗有需要的对象中的疾病的方法，包括向所述对象递送有效量的本发明的基因编辑系统以修饰所述对象中与所述疾病相关的基因。在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，所述疾病选自肿瘤、炎症、帕金森病、心血管疾病、阿尔茨海默病、自闭症、药物成瘾、年龄相关性黄斑变性、精神分裂症和遗传性疾病。

在另一方面，本发明提供本发明的基因编辑系统在制备用于治疗有需要的对象中的疾病的药物组合物中的用途，其中所述基因组编辑系统用于修饰所述对象中与所述疾病相关的基因。在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，所述疾病选自肿瘤、炎症、帕金森病、心血管疾病、阿尔茨海默病、自闭症、药物成瘾、年龄相关性黄斑变性、精神分裂症和遗传性疾病。

在另一方面，本发明提供一种用于治疗有需要的对象中的疾病的药物组合物，其包含本发明的基因编辑系统和药学可接受的载体，其中所述基因编辑系统用于修饰所述对象中与所述疾病相关的基因。在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，所述疾病选自肿瘤、炎症、帕金森病、心血管疾病、阿尔茨海默病、自闭症、药物成瘾、年龄相关性黄斑变性、精神分裂症和遗传性疾病。

在另一方面，本发明还提供用于产生本发明的gRNA的试剂盒，其包含RNA体外转录试剂、RNA化学合成试剂、5’加帽试剂、3’多聚腺苷酸化试剂、和/或磷酸酶。

在另一方面，本发明还提供试剂盒，其包含本发明的gRNA或通过本发明的方法产生的gRNA或本发明的基因编辑系统。

附图说明

图1示出5'帽子和3'聚腺苷酸修饰的sgRNA增强其在人K562细胞系中的稳定性。图1A表示CT修饰的sgRNA的示意结构；图1B表示将10μg未修饰或CT修饰的AAVS1 sgRNA电穿孔至200万个K562细胞中，通过qPCR在不同时间点测量sgRNA的量，并且将Ru6B设定为内参。以平均值±标准差作图，每组实验三个重复。

图2示出K562细胞中不同修饰的sgRNA结构的稳定性。图2A表示不同修饰的 sgRNA的示意结构，SLII：登革热病毒sfRNA的茎环II，SLIV：登革热病毒sfRNA的茎环IV，3'SL：登革热病毒sfRNA的3'端的茎环，Poly A：55个连续的A碱基；图2B表示200万个K562细胞用10μg体外转录的具有所示结构的AAVS1sgRNA电穿孔，通过qPCR在不同时间点测量sgRNA的量，并且将Ru6B设定为内参。以平均值±标准差作图，每组实验三个重复。

图3示出CT修饰的sgRNA能够在人K562细胞系和原代CD3⁺T细胞中进行有效的基因编辑。图3A与图3B分别表示在K562细胞系和经刺激的原代T细胞中通过PCR 扩增子的TIDE测序测量的基因破坏，以10μg/百万个细胞递送未修饰或CT修饰的 sgRNA，Cas9由体外转录的mRNA表达，通过TIDE分析测量K562细胞被诱导的基因破坏。图3C表示CT修饰的sgRNA在K562细胞中介导的靶向切割的特异性。不同位点的插入缺失频率通过TIDE测序检测。以电转细胞基因编辑效率的平均值±标准差作图，每组实验三个重复。

图4示出在K562和原代CD3⁺细胞所示位点由Surveyor法测量的基因编辑效率。图4A表示在K562细胞中基因编辑效率。用10μg Cas9mRNA和10μg图中所示AAVS1 sgRNA结构电穿孔100万个K562细胞；图4B表示用10μg Cas9mRNA和10μg靶向 VEGFA、EMX1和HBB的所述sgRNA修饰电穿孔100万个K562细胞；图4C表示在原代T细胞中的基因编辑效率。将10μgCas9mRNA和带有不同修饰的10μg AAVS1 sgRNA递送到100万个激活的人原代CD3⁺T细胞中。

图5示出CT修饰的sgRNA增强K562细胞系和原代T细胞的内源基因激活。图5A表示用10μg所示OCT4sgRNA库和10μg dCas9-P65HSF1mRNA或1μg dCas9-P65HSF1编码质粒电穿孔100万个K562细胞，48h后，用qPCR检测内源OCT4 mRNA水平，以GAPDH作为内参。以电转细胞的基因表达水平的平均值±标准差作图，每组实验三个重复。图5B表示用10μg所示KLF4或NANOG sgRNA库和10μg dCas9-P65HSF1mRNA电穿孔100万个K562细胞，48后，用qPCR检测内源KLF4 或NANOG的mRNA水平，以GAPDH作为内参。以电转细胞的基因表达水平的平均值±标准差作图，每组实验三个重复。图5C表示用10μg所示的OCT4或FOXP3sgRNA 库和10μgdCas9-P65HSF1mRNA将300万人原代T细胞核转染，以GAPDH作为内参， RT-PCR检测靶基因的mRNA水平。以电转细胞的基因表达水平的平均值±标准差作图，每组实验三个重复。

图6示出CT修饰有助于K562细胞系和原代T细胞中的多基因激活。图6A表示用10μg dCas9-P65HSF1mRNA和10μg靶向KLF4、OCT4和NANOG位点的sgRNA库电穿孔100万个K562细胞，用GAPDH作为内参通过qPCR测量每种内源基因的mRNA 水平。以电转细胞的基因表达水平的平均值±标准差作图，每组实验三个重复。图6B表示以平均荧光强度表示的内源FOXP3的蛋白质水平，用10μg dCas9-P65HSF1mRNA 和10μg所示的FOXP3sgRNA库电穿孔300万个人原代T细胞后48小时测量蛋白质水平；图6C表示激活的内源FOXP3蛋白的动力学，在转染后的指定时间点检测内源 FOXP3的蛋白质水平。

图7示出人原代T细胞最佳内源基因激活平台。图7A表示CT修饰的基因激活平台的示意性结构；图7B表示用10μg dCas9-P65HFS1mRNA、5μg MS2-P65HSF1mRNA 和5μg所示OCT4sgRNA库电穿孔300万个激活的人原代CD3⁺T细胞，qPCR检测内源OCT4mRNA水平，以GAPDH作为内参。以电转细胞的基因表达水平的平均值±标准差作图，每组实验三个重复。图7C表示将CT-Tetra平台、CT-2xMS2平台和与CT 修饰的OCT4sgRNA库联合的dCas9-P65mRNA以所示量分别递送到300万个激活的人原代CD3⁺T细胞中，以GAPDH作为内参，RT-PCR检测内源OCT4的mRNA水平。以电转细胞的基因表达水平的平均值±标准差作图，每组实验三个重复。

图8示出CT修饰的sgRNA结构提高了CRISPR-Cas9系统的工作效率图8A表示 CT修饰的Tetra sgRNA和2xMS2sgRNA增强了其基因编辑能力，靶向AAVS1位点的 10μg Cas9mRNA和10μg所示修饰的sgRNA被递送到100万个K562细胞中，并通过 surveyor法测定基因编辑能力；图8B表示CT-Tetra平台在激活内源基因方面的最佳配合比率，将300万个经刺激的人原代CD3+ T细胞用30μg总量的RNA电穿孔， dCas9-p65HSF1mRNA、MS2-P65HSF1mRNA和CT修饰的四聚体OCT4sgRNA库的比例为2：1：1或1：1：2，qPCR检测内源OCT4的mRNA水平，GAPDH作为内参。以电转细胞的基因表达水平的平均值±标准差作图，每组实验三个重复。图8C表示将 CT-Tetra、CT-2xMS与CT修饰的OCT4sgRNA分别和dCas9-P65mRNA以所示量递送至300万个激活的人原代CD3⁺T细胞中，48小时后，以细胞存活数目的平均值±标准差作图，每组实验三个重复。

图9示出Cas9-sgRNA RNP在人CD34⁺HSPC中引起严重的细胞死亡和干性降低。图9A、B、C表示用所示RNP电穿孔的人CD34⁺HSPC的细胞活力(A)、CD34表达(B) 和集落形成单位(C)，细胞计数和FACS分别在电穿孔后48小时测量细胞数量和CD34 表达，对于集落形成单位(CFU)测定，在电穿孔后立即接种相同数量的活细胞，在两周后对集落形成的数目和谱系分化进行计数和分析。使用来自两个供体的细胞进行实验。误差棒代表两个生物重复的标准差。

图10示出IVT sgRNA在人类CD34⁺HSPC中引起严重的细胞死亡和干细胞性减少，并降低CD3⁺T细胞的细胞活力。图10A、B、C表示用所示样品电穿孔的人原代HSPC 的细胞活力(A)、CD34表达(B)和集落形成单位(C)，通过细胞计数和FACS分别在电穿孔后48小时测量细胞活性和CD34表达，对于集落形成单位(CFU)测定，在电穿孔48 小时后接种相同数量的活细胞，对菌落数目和谱系分化进行计数并在两周后分析，在A、 B、C中，在来自两个供体的HSPC中进行实验，误差棒代表两个生物重复的SD；图10D表示用不同量的靶向AAVS1基因座和OCT4启动子区的IVT sgRNA电穿孔CD3⁺T 细胞后的细胞存活。在电穿孔48小时后，通过台盼蓝染色细胞计数统计细胞存活率。* P<0.05，**P<0.01，P值采用非配对t检验，与对照组比较。

图11示出IVT sgRNA在人原代CD3⁺T细胞和HSPC中诱导I型IFN产生，导致细胞死亡。图11A和B表示电穿孔后CD3⁺T细胞中的IFIT1表达(A)和IFN I产生(B)，靶向所示部位的不同量的IVT sgRNA和RNP被递送到CD3⁺T细胞中，RT-PCR和ELISA 分别检测培养细胞中IFIT1的mRNA表达水平和上清液中IFN浓度(平均值±标准差， n＝3)；图11C表示在用靶向所示位点的RNP电穿孔后的HSPC中I型IFN产生。

图12示出IFN-α导致人原代细胞死亡。图12A表示具有不同IFNI浓度的T细胞培养基中CD3⁺T细胞的细胞活力(平均值±标准差，n＝3)；图12B和C表示与不同浓度的IFN共培养后，HSPC的细胞活力(B)和CD34表达(C)(平均值±标准差，n＝3)。

图13示出通过CIP去除IVT sgRNA的5'三磷酸完全避免有害作用。图13B和C表示CIP处理的HSPC的细胞活力(B)和集落形成能力(C)与化学合成的对应物(BCL11A sgRNA)和电穿孔模拟对照，CS代表化学合成，实验在来自两个供体的细胞中进行，误差棒代表两个生物学重复的标准差；图13D、E、F表示CIP处理改善了基因编辑的CAR-T 细胞的增殖(平均值±标准差，n＝3)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，P值采用非配对t检验，与对照组比较。DKO代表TRAC-B2M双基因敲除。

图14示出通过CIP去除IVT sgRNA的5'三磷酸避免CD3⁺T细胞中的有害作用。递送所示sgRNA或RNP后CD3⁺T细胞的IFIT1表达(A)、IFNI产生(B)和细胞活力(C、 D)(平均值±标准差，n＝3)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；通过使用比较来自指定组的值的非配对t检验来计算P值。

图15示出去除IVT sgRNA的5'三磷酸减少CAR-T细胞中I型IFN产生。图15A表示用所示的RNP电穿孔后的CAR-T细胞的IFN I产生，误差线代表三个技术性重复的标准差。

图16示出CIP处理不影响CRISPR-Cas9系统的基因编辑效率。图16A表示CIP 处理不影响HSPC中CRISPR-Cas9系统的基因编辑效率；图16B表示CIP处理不影响 CRISPR-Cas9系统在原代T细胞中的基因编辑效率，插入缺失频率通过Surveyor法来测量；图16BC表示CIP处理不影响CAR-T细胞中CRISPR-Cas9系统的基因编辑效率，靶基因的表达水平通过FACS测量。

图17示出CIP处理不影响CRISPR-Cas9在CAR-T细胞中的基因编辑效率。图17 表示通过TIDE测定的CIP处理或未处理的RNP在目标位点的基因编辑效率。

图18示出CIP处理不影响基因编辑的CAR-T细胞的功能。图18A、B、C表示基于萤光素酶的细胞杀伤检测(A)和细胞因子释放测定(B，C)评估用CIP处理或未处理的 RNP进行基因编辑的CAR-T细胞的细胞杀伤能力(平均值±标准差，n＝4)。DKO代表 TRAC-B2M双基因敲除。

发明详述

除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook et al.,“MolecularCloning:A Laboratory Manual”；Lewin,“Genes VIII”；及Roitt et al.,“Immunology”(第8版)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。

如本文所用，术语“CRISPR效应蛋白”通常指在天然存在的CRISPR系统中存在的核酸酶，以及其修饰形式、其变体(包括切口酶突变体、失活突变体)、其催化活性片段或它们与其它功能性蛋白的融合物。CRISPR效应蛋白可以通过与向导RNA(如 crRNA和任选的tracrRNA或人工gRNA(如sgRNA))一起相互作用来识别和/或切割靶核酸结构。该术语涵盖基于CRISPR系统的能够在细胞内实现基因靶向(例如基因编辑、基因靶向调控等)的任何效应蛋白。

“CRISPR效应蛋白”的实例包括Cas9核酸酶或其变体。所述Cas9核酸酶可以是来自不同物种的Cas9核酸酶，例如来自化脓链球菌(S.pyogenes)的spCas9或衍生自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的SaCas9。

所述Cas9核酸酶变体的实例包括但不限于Cas9核酸酶的高特异性变体，例如FengZhang等人的Cas9核酸酶变体eSpCas9(1.0)(包含突变K810A/K1003A/R1060A)、 eSpCas9(1.1)(包含突变K848A/K1003A/R1060A)，以及J.Keith Joung等人开发的Cas9 核酸酶变体SpCas9-HF1(包含突变N497A/R661A/Q695A/Q926A)。

所述Cas9核酸酶变体还包括Cas9切口酶(nCas9)，其中Cas9核酸酶的DNA切割结构域中的两个亚结构域(HNH核酸酶亚结构域和RuvC亚结构域)之一被失活而形成切口酶。

“CRISPR效应蛋白”的实例还可以包括Cpf1核酸酶或其变体例如高特异性变体。所述Cpf1核酸酶可以是来自不同物种的Cpf1核酸酶，例如来自Francisella novicidaU112、Acidaminococcus sp.BV3L6和Lachnospiraceae bacterium ND2006的Cpf1核酸酶。

可用的“CRISPR效应蛋白”的实例还可以包括Cas13、Cas12a、Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、 Csm6、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Csn2、Cas4、C2c1、C2c3或C2c2核酸酶或其变体。

术语“CRISPR效应蛋白”还涵盖缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶。

如本发明所用，“缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶”指的是其核酸切割结构域被突变失活的CRISPR核酸酶，包括但不限于Cas9切口核酸酶(nCas9)、核酸酶死亡的 Cas9核酸酶(dCas9)或核酸酶死亡的Cpf1核酸酶(dCpf1)。核酸酶死亡的Cas9核酸酶 (dCas9)或核酸酶死亡的Cpf1核酸酶(dCpf1)完全缺失DNA切割活性。本领域已知多种缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶。例如，同时突变Cas9的HNH核酸酶亚结构域和RuvC亚结构域(例如，包含突变D10A和H840A)使Cas9的核酸酶失去活性，成为核酸酶死亡Cas9(dCas9)。

术语“CRISPR效应蛋白”还涵盖缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶和其他功能性蛋白的融合蛋白。

例如，“CRISPR效应蛋白”还涵盖缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶和脱氨酶的融合蛋白，本文也称为“碱基编辑CRISPR效应蛋白”。

如本发明所用，“脱氨酶”是指催化脱氨基反应的酶。在本发明一些实施方式中，所述脱氨酶指的是胞嘧啶脱氨酶，其能够接受单链DNA作为底物并能够催化胞苷或脱氧胞苷分别脱氨化为尿嘧啶或脱氧尿嘧啶。在本发明一些实施方式中，所述脱氨酶指的是腺嘌呤脱氨酶，其能够接受单链DNA作为底物并能够催化腺苷或脱氧腺苷(A)形成肌苷(I)。通过使用缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶与脱氨酶的融合蛋白(“碱基编辑CRISPR效应蛋白”)，可以实现靶DNA序列中的碱基编辑，例如C至T的转换或A 至G的转换。本领域已知多种合适的接受单链DNA作为底物的胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶，例如APOBEC1脱氨酶、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)、APOBEC3G、CDA1，或者例如Nicloe M.Gaudelli等人，doi：10.1038/nature24644，2017所公开的DNA依赖型腺嘌呤脱氨酶。

术语“CRISPR效应蛋白”还涵盖缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶和转录调控蛋白的融合蛋白，本文也称为“转录调控CRISPR效应蛋白”。所述转录调控蛋白可以是转录激活蛋白或转录抑制蛋白。所述转录调控蛋白的实例包括但不限于VP64、 P65-HSF1和KRAB等。所述转录调控CRISPR效应蛋白可以在向导RNA的指导下，靶向特定调控元件如(启动子)从而调控基因转录。在称作CRISPR SAM的系统中 (Konermann，et al.Nature,2015)，转录调控CRISPR效应蛋白、MS2蛋白与转录激活蛋白或转录抑制蛋白的融合物、包含MS2发夹适体的sgRNA组合使用来调控基因表达。

术语“CRISPR效应蛋白”还可以涵盖缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶和表观遗传修饰蛋白的融合蛋白，本文也称为“表观遗传修饰CRISPR效应蛋白”。所述表观遗传修饰蛋白包括但不限于组蛋白酰基转移酶p300核心的催化结构域、Tet双加氧酶和组蛋白去甲基酶LSD1。表观遗传修饰CRISPR效应蛋白可以在向导RNA的指导下实现特定基因座的表观遗传修饰，如DNA甲基化或去甲基化。

本发明可用的其他一些“CRISPR效应蛋白”可见于例如 http://www.addgene.org/crispr/guide/。

如本文所用，“gRNA”和“向导RNA”可互换使用，指的是能够与CRISPR效应蛋白形成复合物并由于与靶序列具有一定互补性而能够将所述复合物靶向靶序列的 RNA分子。例如，在基于Cas9的基因编辑系统中，gRNA通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成，其中crRNA包含与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性地结合的序列。然而，本领域已知可以设计单向导RNA(sgRNA)，其同时包含crRNA和 tracrRNA的特征。而在基于Cpf1的基因组编辑系统中，gRNA通常仅由成熟crRNA分子构成，其中crRNA包含的序列与靶序列具有足够相同性以便与靶序列的互补序列杂交并且指导复合物(Cpf1+crRNA)与该靶序列序列特异性结合。基于所使用的CRISPR效应蛋白和待编辑的靶序列设计合适的gRNA序列属于本领域技术人员的能力范围内。本发明的gRNA可以包含本领域已知的其他用于改进其性能的结构或修饰，例如其可包含 (例如插入茎环结构中)额外的MS2发夹适体序列，使得可以被MS2蛋白结合，为基因编辑系统提供额外的功能。

本发明人令人惊奇地发现，通过给向导RNA(gRNA)添加5’帽(5’-cap)结构和3’多聚腺苷酸(3’polyA)尾结构(本文中也称作CT修饰，Cap&Tail modification)，可以显著增加 gRNA在细胞内的稳定性，从而提高基因靶向和/或基因编辑的效率。

因此，在一个方面，本发明提供一种分离的向导RNA(gRNA)，所述gRNA包含5’ 帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构。在一些实施方案中，所述向导RNA是单向导 RNA(sgRNA)。

如本文所用，对于RNA而言的“5’帽”包括存在于天然mRNA上的5’帽结构以及其类似物。天然mRNA上的5’帽结构是指甲基化鸟苷酸经焦磷酸与RNA的5'末端核苷酸相连，形成5',5'-三磷酸连接(5',5'-triphosphate linkage)。5’帽通常有三种类型 (m7G5'ppp5'Np、m7G5'ppp5'NmpNp、m7G5'ppp5'NmpNmpNp)，分别称为O型、I型和 II型。O型指末端核苷酸的核糖未甲基化，I型指末端一个核苷酸的核糖甲基化，II型指末端两个核苷酸的核糖均甲基化。本发明所述5’帽结构还包括例如可通过 mMESSAGE mMACHINE T7ULTRATranscription Kit(Thermo Fisher)向RNA添加的5’ 帽结构。

如本文所用，“3’多聚腺苷酸尾”是指RNA的3’端额外的由多个(例如大约50-250个)腺苷酸组成的序列。

本发明所述具有5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构(CT修饰)的gRNA，相对于不具有CT修饰的gRNA，在细胞中具有更长的半衰期，例如长至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。例如，在导入细胞后，所述CT修饰的gRNA可以可检测地存在至少1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约15、至少约20个小时。

在一些实施方案中，所述gRNA是体外转录产生的。在另一些实施方案中，所述gRNA是化学合成产生的。

如本发明所用，gRNA的“体外转录”意指在体外通过RNA聚合酶以包含gRNA 编码核酸序列的表达构建体为模板合成gRNA。在所述表达构建体中，所述gRNA编码核酸序列与合适的启动子可操作地连接。所述表达构建体包括但不限于线性核酸分子、质粒等。

在一些实施方案中，所述体外转录使用噬菌体聚合酶和对应的启动子进行。在一些具体实施方案中，所述体外转录使用T7聚合酶和T7启动子进行。

相应地，在另一方面，本发明还提供一种产生gRNA的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过体外转录或化学合成产生gRNA；和

b)给gRNA添加5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构。

在一些实施方案中，在体外转录过程中给gRNA添加5’帽结构和/或3’多聚腺苷酸尾结构。在一些实施方案中，在体外转录产生gRNA之后，给所述gRNA添加5’帽结构和/或3’多聚腺苷酸尾结构，例如通过化学修饰或酶促反应添加。在一些实施方案中，在化学合成过程中给gRNA添加5’帽结构和/或3’多聚腺苷酸尾结构。在一些实施方案中，在化学合成产生gRNA之后，给所述gRNA添加5’帽结构和/或3’多聚腺苷酸尾结构，例如通过化学修饰或酶促反应添加。

本领域技术人员已知多种可用于向RNA添加5’帽结构和/或3’多聚腺苷酸尾结构的手段，这些均可应用于本发明。例如，可以通过mMESSAGE mMACHINE T7ULTRATranscription Kit(Thermo Fisher)获得具有5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构的gRNA。

此外，本发明人还意外地发现，当使用体外转录的向导RNA(gRNA)进行基因编辑时，体外转录(特别是使用噬菌体聚合酶的体外转录)产生的gRNA会对细胞的存活或功能有负面影响。例如，体外转录产生的gRNA在单独或和CRISPR核酸酶如Cas9核酸酶一起导入CD34⁺HSPC，会导致严重细胞死亡和干性降低，而导入CD3⁺T细胞则会导致细胞活力降低(实施例2.1)。令人惊奇的是，当用磷酸酶处理体外转录的gRNA后，这种负面影响可以被避免。不期望受任何理论束缚，认为体外转录的gRNA由于携带5’ 磷酸基团而激活细胞先天免疫系统，诱导I型IFN尤其是IFN-α的释放，进而导致细胞死亡。

因此，在另一方面，本发明提供一种分离的向导RNA(gRNA)，所述gRNA通过体外转录产生，且其中所述体外转录产生的gRNA的5’末端磷酸基团被去除。所述体外转录如上定义。

在一些实施方案中，所述向导RNA是单向导RNA(sgRNA)。

本发明体外转录产生的gRNA的5’末端磷酸基团可以通过本领域已知的任何方法去除。例如，合适地可以通过磷酸酶处理去除所述体外转录产生的gRNA的5’末端磷酸基团。

如本发明所用，“磷酸酶”是能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。优选地，本发明所述磷酸酶能够以核酸分子(DNA或RNA分子)为底物，将核酸分子5’末端的磷酸基团去除。本领域常用的去除核酸分子5’末端的磷酸基团的磷酸酶包括但不限于碱性磷酸酶，例如所述磷酸酶选自细菌碱性磷酸酶(BAP)、虾碱性磷酸酶(SAP)、小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)。

在一些实施方案中，相对于具有5’末端磷酸基团的gRNA，本发明所述分离的gRNA具有降低的细胞毒性，例如，细胞毒性被降低约10％、约20％、约30％、约40％、约 50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多。在一些实施方案中，所述细胞是人原代细胞。在一些具体实施方案中，所述细胞是造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem progenitorcell,HSPC)。在一些具体实施方案中，所述细胞是T细胞例如CAR-T细胞。在一些实施方案中，所述细胞毒性是细胞先天免疫系统激活导致的。在一些实施方案中，所述细胞毒性是I型IFN(例如IFN-α)介导。在一些具体实施方案中，所述细胞毒性是细胞死亡或细胞干性降低。

a)体外转录产生gRNA，和

b)去除所述体外转录产生的gRNA的5’末端磷酸基团。

在一些实施方案中，所述向导RNA是单向导RNA(sgRNA)。

在一些实施方案中，其中通过磷酸酶处理去除所述体外转录产生的gRNA的5’末端磷酸基团。在一些实施方案中，其中所述磷酸酶是碱性磷酸酶。在一些实施方案中，所述磷酸酶选自细菌碱性磷酸酶(BAP)、虾碱性磷酸酶(SAP)、小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)。

在一些实施方案中，其中与具有5’末端磷酸基团的gRNA相比，所述方法产生的gRNA具有降低的细胞毒性。在一些实施方案中，所述细胞是人原代细胞。在一些具体实施方案中，所述细胞是造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem progenitor cell,HSPC)。在一些具体实施方案中，所述细胞是T细胞例如CAR-T细胞。在一些实施方案中，所述细胞毒性是细胞先天免疫系统激活导致的。在一些实施方案中，所述细胞毒性是I型 IFN(例如IFN-α)介导。在一些具体实施方案中，所述细胞毒性是细胞死亡或细胞干性降低。

在另一方面，本发明提供本发明的gRNA或根据本发明的方法产生的gRNA在基因编辑中的用途。例如，所述基因编辑用于修饰细胞基因组中至少一个靶序列。

1)CRISPR效应蛋白或包含编码CRISPR效应蛋白的核苷酸序列的表达构建体；和

2)本发明的gRNA或根据本发明的方法产生的gRNA，其中所述gRNA设计为靶向所述靶序列。

“基因组”如本文所用不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质体)中的细胞器DNA。

本文所述“修饰细胞基因组中的靶序列”包括在所述gRNA引导下，CRISPR效应蛋白靶向至所述靶序列，导致所述靶序列功能发生改变，例如：所述靶序列中一或多个核苷酸的取代、缺失或添加(例如使用各种CRISPR核酸酶或其变体，或“碱基编辑 CRISPR效应蛋白”)；或者所述靶序列甲基化状态的改变(例如使用“表观遗传修饰 CRISPR效应蛋白”)；或者如果所述靶序列是转录调控区，其控制的基因表达发生改变 (例如使用“转录调控CRISPR效应蛋白”)。值得注意的是，在一些情况下，靶序列本身并没有发生改变(例如经甲基化修饰，或被转录调控CRISPR效应蛋白靶向)，然而在本文也涵盖在基因编辑的范围内。

在一些实施方案中，本发明的基因编辑系统还可用于定点敲入外源多核苷酸序列。例如，本发明的基因编辑系统还可以包含含有待敲入的外源多核苷酸序列的核酸分子，所述核酸分子中在待敲入的外源多核苷酸序列两侧的序列与靶序列两侧的序列具有足以指导同源重组的序列相同性。

如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在细胞或生物体中或在体外表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体。本发明的“表达构建体”可包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。“调控序列”和 “调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

本发明可使用的启动子的实例包括但不限于聚合酶(pol)I、pol II或pol III启动子。 pol I启动子的实例包括鸡RNA pol I启动子。pol II启动子的实例包括但不限于巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV-LTR)启动子和猿猴病毒40 (SV40)立即早期启动子。pol III启动子的实例包括U6和H1启动子。可以使用诱导型启动子如金属硫蛋白启动子。启动子的其他实例包括T7噬菌体启动子、T3噬菌体启动子、β-半乳糖苷酶启动子和Sp6噬菌体启动子。

在另一方面，本发明提供了一种产生经修饰的细胞的方法，所述细胞基因组中至少一个靶序列被修饰，所述方法包括将本发明的基因编辑系统导入所述细胞。本发明还涵盖通过此方法产生的经遗传修饰的细胞及其用途。

可通过本发明的系统进行基因编辑的细胞优选是真核生物细胞，包括但不限于，哺乳动物细胞如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫；家禽如鸡、鸭、鹅的细胞。优选地，所述细胞是人细胞，包括但不限于人胚胎干细胞、造血干细胞/祖细胞、T细胞(例如CAR-T细胞)。所述细胞可以是原代细胞，也可以是细胞系。

可用于将本发明的基因编辑系统导入细胞的方法包括但不限于：磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射等。

在一些实施方式中，所述方法在体外进行。例如，所述细胞是分离的细胞。在一些实施方式中，所述细胞是CAR-T细胞。在一些实施方式中，所述细胞是干细胞，如胚胎干细胞、造血干细胞/祖细胞。

在另一些实施方式中，所述方法还可以在体内进行。例如，所述细胞是生物体内的细胞，可以通过例如病毒介导的方法将本发明的系统体内导入所述细胞。例如，所述细胞可以是患者体内的肿瘤细胞。

在本发明中，细胞基因组中的所述靶序列可以位于基因组的任何位置，例如位于功能基因如蛋白编码基因内，或者例如可以位于基因表达调控区如启动子区或增强子区，从而实现对所述基因功能修饰或对基因表达的修饰。

在一些优选的实施方式中，所述细胞是T细胞，例如是包含外源T细胞受体(TCR)的T细胞(TCR-T细胞)，或者是包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(CAR-T细胞)。在一些实施方式中，所述TCR或CAR包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域。通过本发明的基因编辑系统，可以减少或消除T细胞中免疫抑制性蛋白的表达，从而增强其生物学活性例如抗肿瘤活性。

在另一方面，本发明还提供经修饰的生物体，其包含通过本发明的方法产生的经修饰的细胞或其后代。

如本文所用，“生物体”包括适于基因编辑的任何生物体，优选真核生物。生物体的实例包括但不限于，哺乳动物如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫；家禽如鸡、鸭、鹅。

在另一方面，本发明还涵盖本发明的基因组编辑系统在疾病治疗中的应用。

通过本发明的基因组编辑系统对疾病相关基因进行修饰，可以实现疾病相关基因的上调、下调、失活、激活或者突变纠正等，从而实现疾病的预防和/或治疗。例如，本发明中靶序列可以位于疾病相关基因的蛋白编码区内，或者例如可以位于基因表达调控区如启动子区或增强子区，从而可以实现对所述疾病相关基因功能修饰或对疾病相关基因表达的修饰。

“疾病相关”基因是指与非疾病对照的组织或细胞相比，在来源于疾病影响的组织的细胞中以异常水平或以异常形式产生转录或翻译产物的任何基因。在改变的表达与疾病的出现和/或进展相关的情况下，它可以是以异常高的水平被表达的基因；它可以是以异常低的水平被表达的基因。疾病相关基因还指具有一个或多个突变或直接负责或与一个或多个负责疾病的病因学的基因连锁不平衡的遗传变异的基因。转录的或翻译的产物可以是已知的或未知的，并且可以处于正常或异常水平。

因此，在另一方面，本发明还提供一种治疗有需要的对象中的疾病的方法，包括向所述对象递送有效量的本发明的基因编辑系统以修饰与所述疾病相关的基因。

在仍另一方面，本发明还提供本发明的基因编辑系统在制备用于治疗有需要的对象中的疾病的药物组合物中的用途，其中所述基因组编辑系统用于修饰与所述疾病相关的基因。

在仍另一方面，本发明还提供用于治疗有需要的对象中的疾病的药物组合物，其包含本发明的基因编辑系统和药学可接受的载体，其中所述基因编辑系统用于修饰与所述疾病相关的基因。在一些实施方式中，所述对象是哺乳动物，例如人。

所述疾病的实例包括但不限于肿瘤、炎症、帕金森病、心血管疾病、阿尔茨海默病、自闭症、药物成瘾、年龄相关性黄斑变性、精神分裂症、遗传性疾病等。

在仍另一方面，本发明还包括试剂盒，所述试剂盒可用于本发明的用途或方法。例如，所述试剂盒包含用于产生本发明的gRNA的试剂(例如RNA体外转录试剂、RNA 化学合成试剂、RNA5’加帽试剂和/或3’多聚腺苷酸化试剂、和/或用于去除核酸5’端磷酸基团的试剂例如磷酸酶等)和/或本发明的gRNA和/或根据本发明的方法产生的gRNA 和/或本发明的基因编辑系统和/或本发明的药物组合物。试剂盒一般还包括表明试剂盒内容物的预期用途和/或使用方法的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。

实施例

下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。

实施例1：5'加帽和3'polyA加尾的sgRNA提高CRISPR-Cas9系统的效率

材料和方法

人T细胞分离和培养

新鲜脐带血(UCB)得自北京脐血库(北京，中国)得到知情同意的健康志愿者供体，外周血单个核细胞(PBMC)用Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)通过密度梯度离心分离。使用EasySep人T细胞富集试剂盒(Stemcell Technologies)分离CD3⁺T细胞，根据制造商的说明书，用CD3/CD28Dynabead以珠比T细胞为1:1的比率活化和扩增。将UCB 衍生的CD3⁺T细胞在补充有5％(v/v)热灭活胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和1mM 丙酮酸钠并存在100IU/mL重组人IL-2的X-vivo15培养基(Lonza)中培养。使用台盼蓝 (Thermo FisherScientific)排除计数活细胞并由Countess II(Life)计算。所有细胞在37℃、 5％CO₂环境中培养。

细胞培养和电穿孔

将K562细胞维持在补充有10％FBS、100mg/ml链霉素和100单位/ml青霉素的 RPMI1640(Gibico)中。用4D-Nucleofector X电转仪(程序FF120，Lonza)和SF细胞系 4D-Nucleofector试剂盒(Lonza)电穿孔K562细胞。核转染的条件为：100μl溶液、100 万个细胞、10μg体外转录的sgRNA和10μg Cas9mRNA。在电穿孔之前，用CD3/CD28 Dynabead(Invitrogen111.31D)活化T细胞三天。使用Lonza Nucleofector 4D(程序EO115， Lonza)和P3原代细胞4D-Nucleofector试剂盒(Lonza)对T细胞进行电穿孔。电穿孔的条件为：100μl溶液、100万个细胞或300万个细胞、10μg未修饰的sgRNA或10μg CT 修饰的sgRNA、5μg的dCas9-P65HSF1mRNA和5μg的MS2-p65HSF1mRNA。所有细胞在37℃、5％CO₂环境中培养。

细胞活力

用台盼蓝染色以测定细胞活力，然后用细胞计数器(Life technology)计数。

体外转录

合成含有T7启动子和20bp靶向序列的寡核苷酸作为正向引物(表1)。然后以px330质粒为模板扩增靶sgRNA以获得足够的DNA模板进行体外转录。回收T7-sgRNA PCR 产物，其用作体外转录的模板并使用MEGA shortscript T7试剂盒和mMESSAGE mMACHINE T7Ultra试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行CT修饰。用MEGAclear柱 (Thermo FisherScientific)纯化RNA，并用无RNase的水洗脱。

sgRNA序列： NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT T，其中连续的N代表20nt靶序列。

Surveyor测定和TIDE测序

使用Surveyor突变检测试剂盒(Integrated DNA Technologies，Inc)，通过Surveyor 法测定K562细胞系或原代T细胞中AAVS1、VEGFA、EMX1和HBB的基因组破坏水平。靶破坏的百分比通过光密度定量和计算(Guschin等，2010)。PCR产物也进行测序并使用专门设计的软件TIDE分析(可从http://tide.nki.nl获得)。表1中列出了用于扩增靶基因座和测序的PCR引物。

表1 sgRNA向导和DNA寡核苷酸的序列

实时PCR

在电穿孔后的指定时间点使用Trizol试剂(Life Technologies)提取总RNA。使用TransScript-Uni One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis Supermix试剂盒(TransGenBiotech)通过逆转录合成cDNA。通过CFX96实时检测系统(Bio-Rad)进行OCT4、KLF4、 NANOG和FOXP3的mRNA定量。管家基因GAPDH被用作内参。表1中列出了用于扩增靶基因的qPCR引物。

流式细胞术

使用CytoFLEX(Beckman Coulter Inc)进行荧光表达分析。在电穿孔后48小时、72小时和96小时收集细胞，并用小鼠抗人FOXP3-PE(3G3，Miltenyi)抗体在黑暗的冰箱中染色1小时。

结果：

1.1 5'加帽和3'聚腺苷酸化修饰提高sgRNA的稳定性

为了提高sgRNA的稳定性，根据之前发表的文献中描述的在细胞中稳定RNA的结构(Bergman等，2007；Chapman等，2014)，对sgRNA主链进行不同的修饰。为了模拟 LSM家族蛋白稳定的RNA结构(Bergman等，2007)，将5'polyA序列加到sgRNA主链 (表示为polyA-sgRNA)。受登革病毒结构(Chapman等，2014)的启发，登革病毒sfRNA3' 端的sfRNA：茎环II(SLII)、茎环IV(SLIV)和3’末端的茎环的元件加到sgRNA主链的 5'端或两端。还尝试了mRNA结构，例如通过在体外转录的sgRNA中加入5'帽子和3' polyA尾(加帽和加尾的sgRNA，称为CT修饰的sgRNA或CTsgRNA)。图1A和图2A 显示了这些不同修饰的sgRNA的示意结构。为了测试它们的稳定性，通过电穿孔将等量的具有不同修饰的AAVS1sgRNA递送到K562细胞中，然后在不同时间点通过 RT-PCR分析它们在细胞中的量(图1B和图2B)。在所有修饰形式中，只有CTsgRNA具有较好的表现。电穿孔后2小时，CT修饰的AAVS1sgRNA的残留量是未修饰的sgRNA 的3.1倍，而12小时后，未修饰的AAVS1sgRNA几乎下降到0，而CT修饰形式的量仍然在可检测水平(图1B)。其他结构并没有改善sgRNA的稳定性(图2B)。

1.2 CT修饰的sgRNA有助于提高基因编辑效率

接下来评估了CT修饰是否导致更高的基因组编辑效率。通过电穿孔方法将每个AAVS1sgRNA结构与体外转录的Cas9mRNA一起递送到K562细胞中，并通过Surveyor 法分析插入缺失频率。与改善的稳定性一致，CTsgRNA导致插入缺失频率(27.33％)显著高于对照sgRNA(11.29％)，而其他修饰的sgRNA具有低于对照的编辑效率(图4A)。在K562细胞中靶向VEGFA、EMX1和HBB基因座也获得了类似的结果(图3A和图4B)。

值得注意的是，未经修饰的AAVS1sgRNA诱导的编辑在原代T细胞中通过凝胶分析检测不到，而CTsgRNA导致编辑频率为15.23％(图4C)。我们还发现单独的5'帽和 3'polyA尾都不能在原代T细胞中诱导更高的插入缺失(图4C)。在AAVS1和HBB基因座获得了类似的结果(图3B)。

由于对sgRNA的CT修饰导致更高的中靶编辑效率，也评估其是否也影响脱靶活性。测试了三个具有明确定义的脱靶位点的sgRNA，发现与未修饰的sgRNA相比， CTsgRNA诱导了相同甚至更低的脱靶插入缺失频率(图3C)。总之，这些结果表明，CT 修饰提高sgRNA细胞内稳定性，提高基因组编辑效率，同时保持高特异性。

1.3对sgRNA的CT修饰增强K562和原代T细胞内源基因激活

接下来，使用OCT4、NANOG和KLF4作为K562细胞中的靶基因来确定CTsgRNA 对转录调控的作用。对于每个基因，将4种与转录起始位点上游200bp的启动子区结合的sgRNA用作一个库。我们将表达dCas9-P65HSF1的质粒和具有CT修饰的 OCT4sgRNA库或不具有CT修饰的OCT4sgRNA库共递送到K562细胞。具有CT修饰的OCT4sgRNA库和表达dCas9-p65HSF1的质粒能够激活内源OCT4达62.2倍，而未修饰的sgRNA库仅增加2.3倍。当使用dCas9-P65HSF1mRNA替代质粒时，CT修饰的sgRNA库能够将内源性OCT4表达增加138倍，而未修饰的sgRNA库仅增加11倍(图 5A)。类似地，CT修饰的sgRNA库在KLF4和NANOG基因座处导致显著的基因活化，而未修饰的sgRNA库具有较小影响或没有影响(图5B)。当同时应用激活所有三个基因的sgRNA库时，观察到仅在用CTsgRNA处理的样品中所有三个基因显著激活(图6A)。这些结果表明CT修饰的sgRNA增强了CRISPR-dCas9介导的K562细胞内源基因激活。

由于T细胞是人体免疫中最重要的细胞类型之一，所以也测试了CTsgRNA是否可以用于有效激活人原代T细胞中的内源基因。选择OCT4和FOXP3作为靶基因。递送未修饰的sgRNA库和dCas9-P65HSF1mRNA几乎不激活靶基因，而递送CT修饰的 sgRNA库和dCas9-P65HSF1mRNA分别诱导OCT4和FOXP3在mRNA水平提高22倍和7倍(图5C)。基于FACS分析，FOXP3阳性细胞的百分比增加近30％，平均荧光强度增加2倍以上(图6B)。由于基因激活系统是瞬时表达的，FOXP3蛋白质水平随时间下降(图6C)。

1.4优化的人原代T细胞内源基因激活平台

为了进一步改进CT修饰的sgRNA的表现并在原代T细胞中建立有效的内源基因激活平台，将CT修饰应用于之前描述的两种sgRNA结构(sgRNA1.1和 sgRNA2.0)(Konermann等，2014)，(1)sgRNA1.1：将MS2发夹适体的一个拷贝掺入到 sgRNA主链的四环(tetraloop)中，表示为Tetra sgRNA；(2)sgRNA2.0：将MS2发夹适体的2个拷贝掺入到sgRNA主链的四环和茎环2中，表示为2xMS2sgRNA。将两者表示为CT-Tetra平台或CT-2xMS2平台(图7A)。

Tetra sgRNA： NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTAAGAGCTATGCTGGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCCAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT，其中连续的N代表20nt靶序列。

2xMS2sgRNA： NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTAAGAGCTATGCTGGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCCAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTG CTTTTT，其中连续的N代表20nt靶序列。

将dCas9-P65HSF1mRNA、MS2-P65HSF1mRNA和具有不同结构的未修饰的或CT 修饰的sgRNA(OCT4Tetra sgRNA库或2xMS2sgRNA库)同时递送到原代CD3⁺T细胞中。这两种复合物的示意结构如图7A所示。未修饰的OCT4Tetra和2xMS2sgRNA不能有效激活内源OCT4。值得注意的是，CT修饰的OCT4Tetra和2xMS2sgRNA激活 OCT4表达高达60倍(图7B)。为进一步改进人原代T细胞内源基因激活，优化了不同组分的比例。dCas9-P65HSF1mRNA、MS2-P65mRNA和CT修饰的Tetra sgRNA库以 1:1:2的比率可导致CD3⁺T细胞中的最佳激活效率(图8B)。通过进一步优化所用试剂的总量，并使用CT修饰的Tetra sgRNA，在原代T细胞中实现了超过300倍的OCT4基因激活(图7C)和合理的细胞活力(图8C)。因此，由三种组分组成的CT修饰的Tetra sgRNA系统进一步提高了原代T细胞中内源基因的激活。

实施例2：用小牛肠磷酸酶(CIP)处理IVT sgRNA可显著提高细胞存活

材料和方法

细胞系

将人293T细胞维持在补充有10％(v/v)FBS、100U/mL青霉素和链霉素的 DMEM(Gibco)中。通过慢病毒转导产生表达CD19和萤光素酶的K562细胞系，并维持在补充有10％(v/v)FBS、100U/mL青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基(Gibco)中。所有细胞系都在37℃、5％CO₂的环境中培养。

从UCB分离CD3⁺T细胞和CD34⁺造血干细胞和祖细胞

新鲜脐带血(UCB)来自北京脐血库(北京，中国)，获得自知情同意的健康志愿者供体，用人单个核细胞分离培养基1.007(北京东方华辉生物医药科技有限公司)分离单个核细胞。根据制造商的说明书，使用EasySep人T细胞富集试剂盒(Stemcell Technologies)分离T细胞，用抗CD3/抗CD28Dynabead以珠:T细胞为1:1的比率活化和扩增。T细胞在补充有5％(v/v)热灭活胎牛血清(Gibco)和300IU/mL重组人IL-2(Sino Biological Inc.) 的X-vivo15培养基(Lonza)中培养。使用人脐带血CD34阳性选择试剂盒II(StemcellTechnologies)分离造血干细胞和祖细胞，并在具有扩增补充物(Stemcell Technologies)的 StemSpan H3000培养基中培养。所有细胞在37℃、5％CO₂环境中培养。

CAR-T细胞的产生

如Liu等(2016)所述并进行微小的修改来产生并扩增CTL019CAR-T细胞。简言之，将新鲜纯化的原代CD3⁺T细胞活化24小时，然后用携带抗CD19CAR的慢病毒感染。通过将慢病毒载体与包装质粒pMD2.G、psPAX2共转染到293T细胞中并在转染后48 小时收获病毒上清液来产生慢病毒。

体外转录

使用编码T7启动子和20bp靶序列的寡核苷酸和含有sgRNA主链的寡核苷酸作为引物，扩增T7-sgRNA片段作为IVT模板。使用MEGAshortscript T7试剂盒(Thermo FisherScientific)进行体外转录。对于CIP(NEB)处理，将2U酶加入到每μg体外转录的sgRNA 中，并在37℃下进一步孵育1小时。然后用MEGAclear柱(Thermo Fisher Scientific)纯化sgRNA并用无RNase的水洗脱。

人原代细胞的电穿孔

在电穿孔之前新鲜制备Cas9和sgRNA核糖核蛋白(RNP)，所述RNP通过将6μg Cas9蛋白(深圳菲鹏生物股份有限公司提供)与6μg指定sgRNA在室温下孵育20分钟制备。将1×10⁵个细胞以200g离心5分钟，并重悬于含有所述RNP或只有sgRNA的20μl 转染缓冲液中，然后转移到电穿孔比色皿中。使用4D-Nucleofector System N(Lonza)和 P3原代细胞4D-Nucleofector X试剂盒(V4XP-3024，Lonza)，选择程序EO-115和程序 EO-100分别针对CD3⁺T细胞或CD34⁺HSPC进行所有电穿孔实验。电穿孔后，将细胞重悬于200μl预热的培养基中并转移至96孔细胞板中，并在37℃、5％CO₂的环境中孵育。

实时定量PCR

用1μg、5μg或15μg经CIP处理或未经处理的IVT sgRNA电穿孔200万个CD3⁺T 细胞。在电穿孔后24小时使用Trizol试剂(Life Technologies)提取总RNA。使用 TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix试剂盒(TransGen Biotech)通过逆转录合成cDNA。通过CFX96实时检测系统(Bio-Rad)进行IFIT1的mRNA 定量。管家基因GAPDH被用作内参。表2中列出了用于扩增靶基因的qPCR引物。

表2

流式细胞术

使用CytoFLEX(Beckman Coulter Inc)进行荧光表达分析。在电穿孔后48小时收集细胞并根据制造商的方案准备细胞。所用的抗体如下：TCRα/β-APC(IP26，Biolegend)、β2-微球蛋白(B2M)-APC(2M2，Biolegend)、CD34-PE(BD Pharmingen)。

基因编辑效率分析

使用Surveyor突变检测试剂盒(Integrated DNA Technologies，Inc)，通过Surveyor 核酸酶法测定T细胞中的TRAC、B2M、PD-1、AAVS1、BCL11A和SOX2或HSPC中的BCL11A、AAVS1、CCR5、SOX2的基因组破坏水平。目标基因编辑的百分比通过光密度定量和计算(Guschin等，2010)。在CAR-T细胞中TRAC和B2M的插入或/和缺失频率通过TIDE(通过分解追踪插入缺失)分析(Brinkman等，2014)测量。表2中列出了用于扩增靶基因座和测序的PCR引物。

细胞因子酶联免疫吸附测定(ELISA)

使用IFN-α(Biolegend)和IFN-β(PBL)ELISA试剂盒测定分泌到生长培养基中的IFN-α和IFN-β的量。在电穿孔后24小时收集所述细胞的培养基，并根据制造商的方案进行测定。效应细胞与表达肿瘤抗原的细胞(表达CD19-萤光素酶的K562细胞)以1:1 的比率(各4×10⁴个细胞)共孵育16小时后，收获效应细胞的上清液。根据制造商的方案，通过ELISA(Biolegend)评估效应细胞(CAR T细胞、KO CAR T细胞、T细胞)的细胞因子(IFN-γ、IL-2)产生。

基于萤光素酶的细胞裂解测定

通过基于萤光素酶的CTL测定的修改版本(Moon等，2014)测定基于K562-CD19- 萤光素酶细胞的细胞毒性。简言之，将K562-CD19-萤光素酶细胞和效应细胞以4×10⁵个细胞/ml的密度悬浮在RPMI 1640培养基中，然后以1：1的比率接种在白色不透明板中，并在37℃、5％CO₂孵育16小时。加入10μl Steady-Glo荧光素酶底物(Promega)， 5分钟后，通过PerkinElmer VICTOR X3记录发光。该结果表示为与单独的肿瘤细胞相比，基于荧光素酶活性的杀伤百分比(％杀伤＝100-((来自效应细胞和靶细胞共培养的孔的RLU)/(来自单独靶细胞的孔的RLU)×100))。

集落形成单位测定

将1000个活的HSPC在电穿孔后立即或48小时后悬浮于补充有2％FBS的300μlIMEM(Gibco)中，然后将细胞混合物加入到3ml H4434Methoculture^TM培养基(StemcellTechnology)中。将细胞混合并接种到6孔Smartdish(Stemcell Technology)的两个孔中，然后在37℃、饱和湿度和5％CO₂的环境中培养。两星期后收集集落数据并通过STEMvision(Stemcell Technology)分析。

结果：

2.1 IVT sgRNA在人CD34⁺HSPC中引起严重的细胞死亡和干性降低，并降低CD3⁺T细胞的细胞活力

作为在人CD34⁺HSPC中进行基因编辑的首次尝试，通过电穿孔并使用由T7聚合酶体外转录的sgRNA将Cas9-sgRNA RNP递送到HSPC中。在使用5种靶向不同位点的sgRNA的实验中，电穿孔48小时后观察到细胞数目显著减少，且存活细胞的CD34 表达降低(图9A和B)。相应地，在RNP电穿孔后HSPC的集落形成能力明显受损(图 9C)。为了鉴定导致这种效应的因素，通过电穿孔将sgRNA、Cas9蛋白或RNP分别递送到原代HSPC中。观察到在sgRNA和RNP组中细胞活力较低，而Cas9蛋白组和模拟电穿孔组的细胞存活良好(图10A)，表明sgRNA是导致细胞死亡的主要因素。同时，观察到当一些sgRNA单独或以RNP形式电穿孔时，细胞表面CD34的表达显著降低(图 10B)。将电穿孔后存活的细胞铺板用于集落形成单位(CFU)测定，发现基因编辑的HSPC 的集落形成能力显著降低(图10C)，突出显示sgRNA除了导致细胞死亡之外还降低了 HSPC的干性。

为了验证IVT sgRNA是否也可能导致T细胞死亡，将不同量的IVT sgRNA电穿孔入人原代CD3⁺T细胞。尽管当递送较低量时没有影响，但是当使用较高量的sgRNA时观察到细胞活力降低(图10D)。

2.2 IVT sgRNA激活先天免疫系统并诱导I型IFN的产生

所有测试的sgRNA对HSPC和T细胞的存活都有负面影响，表明这些IVT sgRNA 的一些共同特征是造成这种效应的原因。由于已经报道了由噬菌体聚合酶体外转录的 siRNA在5'端具有磷酸基团，其在人细胞系中激活先天免疫并诱导I型IFN产生(Kim 等，2014)，所以推测IVT sgRNA的5'三磷酸诱导I型IFN产生，其导致HSPC和T细胞的细胞死亡。

为了测试IVT sgRNA是否能够激活先天免疫系统，将靶向三个基因组基因座的不同量的IVT sgRNA电穿孔入CD3⁺T细胞，并测量IFIT1的表达水平。IFIT1是IFN的上游信号，IFIT1的上调作为免疫激活的证据可以在IFN产生增加之前观察到(Der等， 1998)。所有三种IVT sgRNA导致IFIT1表达的上调(图11A)。使用酶联免疫吸附测定 (ELISA)进一步测量用不同Cas9-sgRNA RNP电穿孔的CD3⁺T细胞的培养基中IFN-α和 IFN-β的浓度。事实上，在所有样品中均检测到用RNP电穿孔的IFN-α和IFN-β的显著释放(图11B)。一致的是，在用RNP电穿孔的HSPC的培养物中也检测到IFN-α和IFN-β 的释放(图11C)。有趣的是，不同的sgRNA导致不同量的IFN释放，这与每种sgRNA 引起的效应大致相关。例如，靶向CCR5和SOX2(-1)的sgRNA诱导较低的IFN释放(图 11C)，相应地在CD34⁺HSPC中引起更少的细胞死亡(图10A)。

2.3暴露于IFN-α导致T细胞和HSPC的死亡

为了探讨I型IFN对人原代T细胞和HSPC的影响，将不同浓度的IFN与新鲜分离的CD3⁺T细胞或HSPC细胞一起培养。发现暴露于IFN-α的CD3⁺T细胞的活力显著降低，并且降低程度与IFN-α浓度相关。然而，IFN-β对细胞活力没有明显影响(图12A)。同样地，发现HSPC的存活和CD34的表达随着IFN-α浓度的增加而急剧下降(图12B 和12C)。这些结果表明，IVTsgRNA电穿孔诱导的IFN-α释放是细胞死亡的主要原因。

2.4 IVT sgRNA的5'三磷酸诱导I型IFN的产生

为了验证sgRNA的5'三磷酸是否诱导了I型IFN的产生，使用小牛肠磷酸酶(CIP)去除了sgRNA的5'三磷酸，并且还使用化学合成的不含5'三磷酸的sgRNA(靶向BCL11A 基因座)作为对照。实际上，化学合成的sgRNA和CIP处理的sgRNA在被递送到HSPC 时不诱导IFN释放(图13A)。相应地，用CIP处理的IVT sgRNA单独或在RNP复合物中的电穿孔均导致HSPC的存活率和集落形成能力显著提高，达到与模拟电穿孔对照相当的水平(图13B和图13C)，表明CIP处理不仅提高了细胞存活率，而且保持HSPC的干性。

IVT sgRNA或RNP的CIP处理也减弱了免疫系统的激活(图14A和14B)并提高了 CD3⁺T细胞的细胞活力(补充图14C和14D)。在CTL019CAR-T细胞中进行TRAC和 B2M单基因敲除和双基因敲除，使用CIP处理的IVT sgRNA的RNP形式或未经CIP 处理的IVT sgRNA的RNP形式。结果显示CIP处理消除了IVT sgRNA的IFN I诱导(图 15A)，并显著提高了CAR-T细胞活力(图13D-F)。这些结果表明，IVT sgRNA的5'三磷酸诱导I型IFN产生，导致细胞死亡；使用CIP处理除去5'三磷酸可避免这些有害作用。

2.5 CIP处理不影响CRISPR-Cas9系统的基因编辑效率

接下来，分析了CIP处理的sgRNA在T细胞、HSPC和CAR-T细胞中的基因编辑效率。发现CIP处理不影响CRISPR-Cas9系统的基因编辑效率(图16A-C和图17)。此外，使用CIP处理的sgRNA在CTL019CAR-T细胞中进行多基因编辑不影响CAR-T 细胞的功能，包括IFN-γ和IL-2释放，以及在遇到表达CD19的癌细胞时的杀癌作用(图 18A-C)。这些结果表明CIP处理的IVT sgRNA可用于人原代细胞中进行有效的基因编辑。

Claims

1.一种分离的向导RNA(gRNA)，其中所述gRNA：

1)包含5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构；或

2.权利要求1分离的gRNA，其中相对于不包含5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构的gRNA，所述包含5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构的gRNA在细胞中具有更长的半衰期。

3.权利要求1分离的gRNA，其中相对于具有5’末端磷酸基团的gRNA，所述5’末端磷酸基团被去除的gRNA具有降低的细胞毒性。

4.权利要求1分离的gRNA，其中所述gRNA是sgRNA。

5.一种产生gRNA例如sgRNA的方法，所述方法包括：

步骤a)，通过体外转录或化学合成产生gRNA；和

步骤b)，其包括b1)给所述gRNA添加5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾结构，或b2)去除所述体外转录产生的gRNA的5’末端磷酸基团。

6.权利要求5的方法，其中步骤b2)中通过磷酸酶处理去除所述体外转录产生的gRNA的5’末端磷酸基团。

7.权利要求6的方法，其中所述磷酸酶是碱性磷酸酶，例如细菌碱性磷酸酶(BAP)、虾碱性磷酸酶(SAP)、小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)或分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)。

8.一种用于修饰细胞基因组中至少一个靶序列的基因编辑系统，其包含：

2)权利要求1-4中任一项的gRNA或通过权利要求5-7中任一项的方法产生的gRNA，其中所述gRNA设计为靶向所述靶序列。

9.一种产生经修饰的细胞的方法，所述细胞基因组中至少一个靶序列被修饰，所述方法包括将权利要求8的基因编辑系统导入所述细胞。

10.权利要求9的方法，其中所述细胞是人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫、鸡、鸭、或鹅的细胞。

11.权利要求9的方法，其中所述细胞是人原代细胞，例如胚胎干细胞、造血干细胞和祖细胞(HSPC)、T细胞。

12.权利要求9的方法，其中所述细胞是TCR-T细胞或CAR-T细胞，例如包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域的TCR-T细胞或CAR-T细胞。

13.权利要求9的方法，其中通过选自磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射的方法将所述基因编辑系统导入所述细胞。

14.一种经修饰的细胞，其由权利要求9-13任一项的方法产生。

15.一种治疗有需要的对象中的疾病的方法，包括向所述对象递送有效量的权利要求8的基因编辑系统以修饰所述对象中与所述疾病相关的基因。

16.权利要求8的基因编辑系统在制备用于治疗有需要的对象中的疾病的药物组合物中的用途，其中所述基因组编辑系统用于修饰所述对象中与所述疾病相关的基因。

17.一种用于治疗有需要的对象中的疾病的药物组合物，其包含权利要求8的基因编辑系统和药学可接受的载体，其中所述基因编辑系统用于修饰所述对象中与所述疾病相关的基因。

18.权利要求15-17的方法、用途或药物组合物，其中所述对象是哺乳动物，例如人。

19.权利要求18的方法、用途或药物组合物，其中所述疾病选自肿瘤、炎症、帕金森病、心血管疾病、阿尔茨海默病、自闭症、药物成瘾、年龄相关性黄斑变性、精神分裂症和遗传性疾病。

20.用于产生权利要求1-4中任一项的gRNA的试剂盒，其包含RNA体外转录试剂、RNA化学合成试剂、5’加帽试剂、3’多聚腺苷酸化试剂、和/或磷酸酶。

21.试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项的gRNA或通过权利要求5-7中任一项的方法产生的gRNA或权利要求8的基因编辑系统。