CN109312308A - 通过使用核酸酶来进行人神经干细胞的基因组编辑 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，经遗传修饰的人神经干细胞，和包含所述经遗传修饰的人神经干细胞的药用组合物。特别地，所述方法涉及使用由DNA核酸酶，例如TALEN、ZFN或CRISPR/Cas介导的基因组编辑。还提供了相关的试剂盒。本发明还提供了用于通过使用经遗传修饰的人神经干细胞来在人受试者中预防或治疗神经变性疾病或神经病学损伤的方法。

Description

通过使用核酸酶来进行人神经干细胞的基因组编辑
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年4月14日提交的美国临时专利申请号62/322,652(其内容特此通过提及而以其整体合并入本文)的优先权权益。
技术领域
本发明涉及用于产生经遗传修饰的神经干细胞的方法。
关于在联邦政府资助的研究和开发之下所做发明的权利的声明
本发明是用由国家卫生研究院(National Institutes of Health)所给予的在批准号R01 AI120766和R01 AI097320之下的政府资助而做出的。政府具有本发明中的某些权利。
发明背景
用经改造的核酸酶进行基因组编辑是一项用于在本质上修饰任何目的基因组序列的突破性技术(Porteus等人,Nature Biotechnology 23,967-973(2005))。该技术利用经改造的核酸酶来产生位点特异性双链断裂(DSB)，随后为通过内源性细胞修饰机制来解决DSB。结果可以是通过致突变非同源末端连接(NHEJ)的在特定位点处的突变，这在断裂位点处产生插入或缺失(in/del)；或者是通过使用外源引入的供者模板的同源重组(HR)的基因组序列的精确改变(Hendel等人,Trends in Biotechnology 33,132-140(2015))。
对该平台的一项最近的主要增添是成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统，其由RNA-指导的核酸酶(Cas)和短指导RNA(sgRNA)构成(Jinek等人,Science 337,816-821(2012)；Mali等人,Science 339,823-826(2013)；Cong等人,Science 339,819-823(2013)；Hsu等人,Cell 157,1262-1278(2014))。所述指导RNA由两个称为CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的RNA组成，它们典型地被融合在嵌合的单一指导RNA(sgRNA)中。用于基因组编辑的sgRNA可以由100个核苷酸(nt)组成，其中在5’末端处的20nt通过沃森-克里克碱基配对与靶DNA序列杂交，并且指导Cas核酸内切酶去切割靶基因组DNA。
不幸的是，使用CRISPR/Cas系统以及其他由核酸酶介导的技术的基因组编辑仍然是低效的，尤其是在初级细胞例如人神经干细胞中。因此，在本领域中仍然存在对于可以用于遗传修饰初级细胞(包括人神经干细胞)的基于基因组编辑的组合物和方法的需要。本发明满足了该需要，并且还提供了额外的优势。
神经干细胞例如在美国申请公开号2001/0044122、2003/0109039、2004/0137535，美国专利号7037719，以及Uchida等人,Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(26):14720-14725中作了讨论。
在本文中所提及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容特此通过提及而以其整体合并入本文。
发明简述
本发明提供了用于产生经遗传修饰的(即基因组经编辑的)人神经干细胞的方法，所述方法包括：
向分离的人神经干细胞中引入：
(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；和(ii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和
(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。
本发明还提供了通过本发明的方法所产生的经遗传修饰的人神经干细胞。本发明还提供了经遗传修饰的人神经干细胞，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒，其中所述转基因盒位于安全港基因之内。还提供了药用组合物，其包含本发明的经遗传修饰的人神经干细胞和在药学上可接受的承载体。
本发明还提供了用于在有此需要的人受试者中预防或治疗神经变性疾病或神经病学损伤的方法，所述方法包括：向所述人受试者施用有效量的本发明的药用组合物以防止或减轻神经变性疾病或神经病学损伤的一个或多个症状。
本发明还提供了试剂盒，其包含：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；和(ii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列；和(c)分离的人神经干细胞。
本发明还提供了本发明的经遗传修饰的人神经干细胞或者通过本发明的方法所产生的经遗传修饰的人神经干细胞在鉴定或开发潜在的治疗性分子的方法中的用途。这可以涉及筛选小分子或生物分子以鉴定作用于人神经干细胞或其分化子代的潜在的治疗性分子。在本发明的一个实施方案中，所述潜在的治疗性分子为促进人神经干细胞和/或人神经干细胞的分化子代的增殖和/或生存力的分子。
本发明还提供了本发明的经遗传修饰的人神经干细胞或者通过本发明的方法所产生的经遗传修饰的人神经干细胞在研究中的用途。研究应用包括进入神经干细胞的基本生物学的基础生物学研究和旨在潜在疗法的应用研究。
从下面的详细描述和附图中，本发明的其他目标、特征和优点对于本领域技术人员来说将会是明显的。
附图简述
图1A和1B显示，使用经改造的核酸酶例如TALEN或CRISPR，经由同源重组将GFP转基因插入到IL2Rγ座位中。图1A提供了RFLP数据。图1B显示，在IL2Rγ座位处，CRISPR/Cas9刺激比TALEN更高频率的基因编辑。
图2A-2C显示了通过使用经改造的核酸酶例如CRISPR/Cas9和TALEN来将GFP转基因靶向整合到神经干细胞(NSC)中。图2A提供了示例性IL2Rγ-GFP供者模板的示意图。图2B显示了在核转染(nucleofection)后的长期培养中GFP+细胞的稳定表达。图2C显示，大约2-4％的经历基因组编辑(如本文中所描述的)的NSC是GFP阳性的和CD133阳性的。
图3描绘了克隆衍生的GFP阳性的经遗传修饰的NSC(GM-NSC)。
图4A和4B显示了源自经分选和经扩展的GFP+GM-NSC的少突胶质细胞。图4A显示了GFP+GM-NSC。图4B显示了源自表达GFP和髓鞘碱性蛋白(MBP)的GM-NSC的少突胶质细胞。将GM-NSC直接移植到幼年shi/shi-id突变型小鼠脑的小脑中。在移植后8周处理脑切片。更高的放大倍数揭示，人细胞的子代分化成具有髓鞘的成熟的成髓鞘少突胶质细胞，这表明在基因组编辑之后保持了分化潜力。
图5图解说明了通过使用基于质粒的CRISPR/Cas9系统和具有经化学修饰的sgRNA的基于RNA的系统而产生的INDEL的百分比，靶向在IL2Rγ座位处。
图6A-6C显示，通过使用具有经化学修饰的sgRNA的基于RNA的系统来递送CRISPR/Cas9平台产生比基于质粒的系统更多的GFP+GM-NSC，靶向在IL2Rγ座位处。图6A显示了通过使用基于质粒的系统而产生的GFP+细胞的百分比。图6B显示了通过使用具有经化学修饰的sgRNA的基于RNA的系统而产生的GFP+细胞的百分比。图6C提供了所测试的系统的比较。
图7提供了在本文中所描述的基因组编辑方法的一个示例性实施方案的示意性图示。
图8显示了在长期培养(在核转染后大约168天)后在经纯化的GM-NSC中UbC-GalC-2A-eGFP转基因的稳定表达，靶向在IL2Rγ座位处。如所示的，通过FACS来富集GM-NSC。
图9A和9B图解说明了将UbC-GalC-2A-eGFP转基因靶向整合到安全港基因IL2Rγ中。图9A提供了示例性IL2Rγ-UbC-GalC-2A-eGFP供者模板的示意图。图9B显示了靶向整合位点的PCR分析。所预期的关于靶向整合的扩增子大小为2355个碱基。
图10A-10F显示了携带UbC-GalC-2A-eGFP靶向转基因的GM-NSC。将经由CRISPR进行修饰的NSC经由FACS进行纯化以选择出GFP+细胞(图10A)。扩展所分选出的GFP+细胞(图10B)，并且大多数是关于神经干细胞标志物Sox2来说阳性的(图10C)。将经由TALEN进行修饰的NSC经由FACS进行纯化以选择出GFP+细胞(图10D)。扩展所分选出的GFP+细胞，并且它们保持GFP+(图10D)。大多数经扩展的GFP+细胞也是关于Sox2来说阳性的(图10F)。
图11A-11E图解说明了CD8+GFP+GM-NSC的分离和纯化。图11A提供了示例性IL2Rγ-UbC-GFP-2A-CD8供者模板的示意图。图11B显示了在核转染后第6次传代时在选择之前CD8+和GFP+细胞的百分比。图11C显示了在MACS CD8选择之后CD8+和GFP+细胞的百分比。使CD8+GFP+GM-NSC在体外分化成少突胶质细胞。图11D提供了GM-NSC细胞衍生性少突胶质细胞的图像。图11E显示了分化成神经元细胞(双皮层蛋白)和星形胶质细胞(GFAP)的细胞的百分比。
图12A-12C图解说明了CD19+GFP+GM-NSC的分离和纯化。图12A提供了示例性IL2Rγ-GFP-2A-经截短的CD19供者模板的示意图。图12B显示了在核转染后第40天在CD19选择之后GFP+细胞的百分比。图12C显示，在选择之前，大多数细胞是CD19-阴性的、GFP-阴性的。图12D显示，在MACS CD19选择之后，大多数细胞是CD19+和GFP+的。
图13A-13F显示了CD8+GFP+GM-NSC的分离和纯化。图13A提供了示例性IL2Rγ-UbC-GFP-2A-CD8供者模板的示意图。图13B显示了在选择之前CD8+和GFP+细胞的百分比。图13C显示了在选择之后CD8+和GFP+细胞的百分比。图13D显示了通过MACS CD8选择柱的CD8-阴性和GFP-阳性细胞的百分比。图13E显示，高百分比的经CD8选择的细胞也是GFP+的。图13F显示，90％的经CD8选择的GM-NSC是GFP+的。
图14A-14C显示了在移植到少突胶质细胞突变型shiverer小鼠中之后GM-NSC的移入、迁移和分化成产生髓鞘质的少突胶质细胞。产生将GFP与CD8分隔开的双顺反子IL2RGHR盒，用它靶向NSC。图14A显示，用CD8微珠对GM-NSC进行MACS选择。然后，将GM-NSC移植到8周龄的幼年shiverer-id小鼠中。双侧移植靶向脑室下区(SVZ)的细胞。图14B显示了用人特异性mAb SC121进行染色的小鼠脑的切片。在移植后12周时进行的SC121染色证明了在RMS中的GM-NSC广泛迁移至嗅球和白质束(包括胼胝体、穹窿伞和小脑中的那些)。图14C显示了用抗-GFP抗体进行染色的小鼠脑切片。所移植的GM-NSC继续在小鼠中表达GFP转基因。稳健的GFP转基因表达与SC121染色是相似的。矢状脑切片显示，所移植的细胞存在于SVZ中。另外，在嘴侧迁移流(RMS：rostral migratory stream)、胼胝体和皮层中检测到正在迁移的人细胞。
图15A-15F显示了携带UbC-GalC-T2A-tCD19转基因(靶向在IL2Rγ座位处)的CD19+GM-NSC。通过使用MACS CD19选择微珠来纯化表达细胞表面标志物CD19的GM-NSC。在图15A-15C(选择前——图15A；选择后——图15B；扩展——图15C)中显示了通过使用基于质粒的sgRNA/CRISPR核酸酶而产生的GM-NSC的流式细胞术。在图15D-15F(选择前——图15D；选择后——图15E；扩展——图15F)中显示了通过使用MSP sgRNA与Cas9mRNA而产生的GM-NSC的流式细胞术。
图16显示了靶向在NSC中的IL2RG座位的CRISPR/Cas9-介导的同源重组(HR)。通过使用Cas9(剪刀)产生双链断裂(DSB)和供给同源供者模板(具有围绕待插入的转基因的侧翼800bp臂)来靶向IL2RG座位用于同源重组(HR)。在HR后，IL2RG cDNA被敲入至内源起始密码子，具有驱动下游GFP的UbC启动子，以评估在人NSC中HR的效率。IL2RG外显子显示在黑框中。
图17A-17B显示了靶向在NSC中的HBB座位(图17A)和CCR5座位(图17B)的CRISPR/Cas9-介导的同源重组(HR)。图17A显示，通过经由Cas9(剪刀)在外显子1中产生DSB和供给UbC-GFP同源供者模板来靶向HBB座位。通过使用In(黑色)-Out(红色)引物组的PCR(881bp)来鉴定具有整合的等位基因。图17B显示，如上面所描述的那样，在外显子3中靶向CCR5座位。使用In(黑色)-Out(红色)，PCR鉴定出经整合的(1200bp)等位基因。对于所有In-OutPCR的上样对照为野生型CCR5等位基因。
图18显示，在所有三个所测试的座位处，Cas9(作为mRNA)和经化学修饰的sgRNA诱导出比质粒递送更多的INDEL。用1μg的编码Cas9和对于IL2RG、HBB或CCR5来说特异性的sgRNA的质粒(px330)对NSC进行电穿孔。关于“全部RNA”实验，将Cas9作为mRNA(5μg)进行递送，并且递送具有末端化学修饰(包含2′-O-甲基,3′-硫代磷酸酯(MS)或2′-O-甲基,3′-硫代PACE(MSP))的座位特异性sgRNA(10μg)。在培养7天后，收获gDNA，进行PCR以扩增目的区域，并且使用Tracking of Indels by Decomposition(TIDE)软件来计算INDEL。(N＝2-14)，**p<0.01，Student T-检验。
图19显示，使用CRISPR-Cas9组分的质粒或全部RNA递送，在NSC中所有3个座位均顺从于HR。如上面所描述的那样，用2μg的HR供者或2μg的HR和座位特异性CRISPR组分对NSC进行核转染。座位特异性HR供者质粒具有至少400bp的位于UbC-GFP侧翼的同源性，以评估HR效率。使细胞生长至少30天直至附加型HR供者在增殖期间通过稀释而丢失，以确证整合到IL2RG、HBB和CCR5座位中的盒的稳定表达。显示了代表性的FACS标绘图，其强调了用位点特异性核酸酶的HR供者的稳定整合。
图20显示，用CRISPR的质粒递送在IL2RG、HBB和CCR5座位处靶向NSC在培养至少30天后分别导致2.8％、4.1％和2.4％GFP+NSC的平均值。从如上面所进行的所有靶向IL2RG、HBB和CCR5的实验中所获得的HR频率。(N＝3-7)，*p<0.05，Student T-检验。
图21显示，虽然用模拟品或仅供者样品未检测到PCR扩增，但是当用CRISPR和同源供者对NSC进行共电穿孔时，中靶整合是明显的，这确证了在所期望的座位处的HR。在培养后第30天时从实验组中收获gDNA，以在DNA水平上评价HR供者的位点特异性整合。In/OutPCR产物的琼脂糖凝胶电泳确证了在位点特异性核酸酶存在下HR供者的中靶整合。
图22A-22B显示了通过用CD8α的磁性激活细胞分选术(MACS：magnetic activatedcell sorting)选择来富集GM-NSC。产生双顺反子IL2RG HR盒，其经由T2A肽基序将GFP与CD8α分隔开，以允许IL2RG-靶向的NSC的稳健的磁珠富集。用2μg的HR供者和1μg的编码Cas9和sgRNA的质粒对NSC进行核转染。使细胞生长30天，以允许附加型HR供者在NSC增殖期间稀释完。在靶向后第6次传代时通过使用CD8微珠技术来选择细胞。代表性的FACS标绘图(图22A)显示了在电穿孔后第30天时在富集之前(左)和在使用磁性激活细胞分选术(MACS)CD8微珠技术进行富集后30天时(右)具有双顺反子GFP-T2A-CD8盒的稳定整合的NSC群体。在电穿孔后将GM-NSC培养九次传代，同时在每次细胞传代，就GFP表达进行分析(图22B)。
图23A-23B显示了通过用经截短的CD19(tCD19)的磁性激活细胞分选术(MACS)选择来富集GM-NSC。产生双顺反子IL2RG HR盒，其经由T2A肽基序将GFP与经截短的CD19(tCD19)分隔开，以允许IL2RG-靶向的NSC的稳健的磁珠富集。用2μg的HR供者和1μg的编码Cas9和sgRNA的质粒对NSC进行核转染。使细胞生长30天，以允许附加型HR供者在NSC增殖期间稀释完。代表性的FACS标绘图(图23A)显示了在电穿孔后第30天时在富集之前具有双顺反子GFP-T2A-tCD19盒的稳定整合的NSC群体(左)，和通过使用MACS CD19微珠技术的经富集的GM-NSC群体(右)。将GM-NSC培养9次传代，同时就GFP表达进行分析(图23B)。
图24显示了在MACS选择之前(经靶向的)和之后(经富集的)，使用双顺反子供者盒在IL2Rγ座位处被靶向的GM-NSC的频率。N＝3。
图25A-25C显示，GM-NSC保持其NSC特征。将经扩展的/经MACS富集的具有双顺反子GFP-T2a-tCD19盒的GM-NSC就细胞表面标志物CD133(PE)和CD19(APC)进行染色，并且通过FACS CD19 vs GFP(图25A)、CD19 vs CD133(图25B)来进行分析；备选地，将细胞就CD19(APC)进行染色，渗透化，固定，和然后就SOX2(PE)再次进行染色(图25C)。
图26A-26C显示，GM-NSC在体内保持迁移、NSC标志物和三谱系分化潜力(以位点适当的方式)。用双顺反子IL2RγHR盒(GFP-T2A-CD8)靶向NSC，然后用CD8磁珠进行MACS选择，并且进行双侧移植，靶向新生shi/shi-id或shi/+杂合id小鼠脑的SVZ。共聚焦图像(图26A-26C)：用抗-GFP(绿色)和抗-Sox2(红色)以及Hoechst 33345复染(蓝色)进行染色的海马齿状回，其揭示了GM-NSC进行迁移并且保持NSC标志物Sox 2(箭头)(图26A)；在纹状体白束束中的抗-GFP(绿色)，抗-人GFAP，SC123(红色)和DAPI复染(蓝色)(图26B)；在嗅球中的抗-GFP(绿色)，抗-双皮层蛋白(DCX)，SC123(红色)和DAPI复染(蓝色)(图26C)。
图27A-27C显示了GM-NSC的少突胶质细胞分化潜力。将GM-NSC直接移植到幼年shi/shi-id突变型小鼠脑的小脑中。在移植后8周处理脑切片。在移植后8周时用人特异性SC121 mAb进行的免疫染色证明了在小脑白质束内GM-NSC的广泛迁移(图27A)。用抗-GFP对姊妹切片进行的免疫过氧化物酶染色揭示了与SC121染色相似的转基因表达的分布(图27B)。用抗-GFP(绿色)和抗-MBP(红色)的小脑白束的共聚焦图像证明了连续的GFP表达和髓鞘质产生(图27C)。如所显示的那样指明了注射位点。
图28显示了使用HR供者来将GALC(IL2RG cDNA-UbC-GALC-T2A-tCD19)敲入到IL2Rγ座位中，和还使用tCD19选择盒来使得稳健的基于MACS的富集成为可能。通过使用Cas9(剪刀)产生双链断裂(DSB)和供给同源供者模板(具有围绕待插入的转基因的侧翼800bp臂)来靶向IL2Rγ座位用于同源重组(HR)。在HR后，IL2RγcDNA被敲入至内源起始密码子，随后为具有GALC-T2A-tCD19的由UbC驱动的盒，其用于GalC酶的过表达和使用CD19 MACS选择来进行的经靶向的细胞的富集。
图29A-29B显示了稳定地整合的GALC构建体。如先前所描述的那样，用Cas9 mRNA、MSP IL2RγsgRNA和GALC-T2A-tCD19 HR供者构建体对NSC进行核转染。代表性的FACS标绘点图强调了稳定地整合的GALC构建体，其通过在核转染后30天时在富集tCD19+细胞之前(图29A)和之后(图29B)的tCD19表达来测量。
图30显示了GALC盒中靶整合到IL2Rγ座位中。在电穿孔后第30天时从实验组中收获gDNA，以在DNA水平上评价GALC供者的整合。In/Out PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示了在位点特异性核酸酶存在下HR供者的中靶整合。
图31显示，GALC NSC过表达功能性酶。在来自下列实验组的细胞蛋白质裂解物上进行GalC酶测定法：未编辑的NSC、克拉伯病患者成纤维细胞、GALC GM-NSC(两次不同的实验)。GalC酶活性以pmol/分钟/mg(标准化至未编辑的NSC)来给出。N＝3，两次独立的生物学实验，*p<0.05，Student T-检验。
图32A-32B显示，GALC GM-NSC保留了其NSC生物学特征。用人特异性mAb SC121进行的免疫过氧化物酶染色(棕色)检测到人细胞移入到小脑中的白质之中(图32A)。用抗-MBP对姊妹切片进行的免疫过氧化物酶染色(棕色)揭示了所移植的GM-NSC的相似的分布(图32B)。
图33A-33D显示了CRISPR与Talen系统之间的比较。用CRISPR/Cas9系统或TALEN对(其被设计成识别人IL2RG座位)对500,000个NSC进行电穿孔(质粒递送)。在靶向后七天，收获gDNA，用叠盖住经切割的位点的引物通过PCR来扩增IL2RG等位基因，并且运行TIDE来分析INDEL频率(图33A)。(N＝4-7)，*p<0.05，Student T-检验。如上面所描述的那样，用Cas9mRNA和MSP sgRNA或TALEN对(以mRNA进行递送)对NSC进行电穿孔，然后通过TIDE软件就INDEL来分析IL2RG等位基因(图33B)。(N＝2-5)，*p<0.05，Student T-检验。用IL2RG经改造的核酸酶连同具有IL2RG同源性臂的UbC-GFP供者模板一起对NSC进行电穿孔。在靶向后30天，收获细胞以用于FACS GFP分析(图33C)。(N＝4-6)。用IL2RG经改造的核酸酶连同IL2RG同源供者模板(其旨在在同源重组后引入AfIII限制位点)一起对NSC进行电穿孔。在靶向后7天，收获gDNA，然后扩增IL2RG等位基因以产生1.6kb产物。用AfIII消化经扩增的等位基因并走PAGE凝胶。如下来计算HR等位基因的数目：((经消化的等位基因/经消化的等位基因)+未消化的等位基因)。(图33D)(N＝4-6)，Student T-检验。
发明详述
I.引言
本发明部分地基于这样的发现：基因组编辑技术提高了人神经干细胞的治疗潜力。神经干细胞(NSC)具有这样的治疗潜力，其用于尚未满足的具有“一次干预，终生影响”的对于神经病学病症的医学需求。例如，HuCNS-细胞(StemCells,Inc.)是经高度纯化的源自胎儿脑的人中枢神经系统干细胞群体，其具有有着多种作用机制的生物学NSC活性，其通过整体迁移和位点适当地分化成成熟的神经元、星形胶质细胞和产生髓鞘质的少突胶质细胞来提供神经保护、髓鞘化和视网膜保存。已在四个I/II期临床试验中测试了NSC，具有关于安全性、供者细胞存活和/或初步效力的有希望的结果。基因组编辑技术中的最新进展，即TALEN和CRISPR/Cas9平台，加速了对于产生用于细胞疗法的经遗传编辑的(GM)细胞的机会，这最终拓宽了NSC的治疗潜力，例如通过充当神经保护性蛋白质的小型工厂以克服血脑屏障。NSC和分离NSC的方法例如描述在美国专利申请公开号2001/0044122、2003/0109039和2004/0137535 A1；以及美国专利号7,037,719中。
如在本文中所描述的，本发明人靶向了在NSC中的“安全港(safe harbor)座位”，例如CCR5、IL2Rγ和HBB，以用于GFP盒的同源重组(HR)，通过诱导位点特异性双链断裂(DSB)，连同同源质粒供者模板一起。GM-NSC展示出稳健的长期GFP表达，并且重要的是，通过in-out PCR的基因组分析确证了中靶整合。经截短的CD19使得能够以>90％纯化出GM-NSC群体。进一步地，将CRISPR平台以“全部RNA”系统(具有经化学修饰的sgRNA)进行递送显著地改善了DSB的频率，其随后将HR靶向率改善至CRISPR的质粒递送的两倍。最重要的是，将GM-NSC移植到少突胶质细胞突变型shiver小鼠中显示，GM-NSC进行迁移并且分化成产生髓鞘质的少突胶质细胞，与未经遗传修饰的NSC相当，这表明GM-NSC保留了其NSC特征。GM-NSC的自我更新和整体迁移特性表明，GM-NSC可以充当用于连续递送蛋白质的小型工厂以拓宽治疗选项，因为这些蛋白质不能跨过血脑屏障。总之，在本文中所描述的研究的成功提供了用于可移植性GM-NSC(其使得能够治疗一组关于脑、脊髓和眼睛的神经变性病症和损伤)的方法、组合物和试剂盒。
II.总则
施行本发明采用分子生物学领域中的常规技术。公开了在本发明中使用的一般性方法的基础文本包括Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版,2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人,编者,1994)。
对于核酸，大小以千碱基(kb)、碱基对(bp)或核苷酸(nt)给出。单链DNA和/或RNA的大小可以以核苷酸给出。这些是从琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、从经测序的核酸或从发表的DNA序列推导出的估计值。对于蛋白质，大小以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数目给出。蛋白质大小从凝胶电泳、从经测序的蛋白质、从衍生的氨基酸序列或从发表的蛋白质序列进行估计。
无法商购获得的寡核苷酸可以化学合成，例如按照首次由Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Lett.22:1859-1862(1981)描述的固相亚磷酰胺三酯法，使用自动合成仪，如在Van Devanter等人,Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中所描述的。寡核苷酸的纯化通过使用任何本领域认可的策略，例如非变性丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换高效液相色谱法(HPLC)(如在Pearson和Reanier,J.Chrom.255:137-149(1983)中所描述的)来进行。
III.定义
除非另外特别指出，在本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。另外，任何与在本文中所描述的方法或材料相似或相等的方法或材料可以在本发明的实施中使用。为了本发明的目的，定义下列术语。
在本文中所使用的术语“a”、“an”或“the”不仅包括具有一个成员的方面，而且也包括具有多于一个成员的方面。例如，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数所指事物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“细胞”包括多个此类细胞，和提及“试剂”包括对于本领域技术人员已知的一种或多种试剂的提及，等等。
术语“人神经干细胞”是指从人来源获得或从人来源的细胞衍生的具有自我更新和多谱系分化特性的神经谱系的细胞。类似地，术语“人神经干细胞”是指经纯化的具有自我更新和多谱系分化特性的细胞群体。神经干细胞能够对称地或不对称地进行分裂。当对称地进行分裂时，神经干细胞进行分裂以形成两个子神经干细胞或两个定向祖先，虽然除非另外说明，对称分裂在本文中是指对称的自我更新；当不对称地进行分裂时，神经干细胞进行分裂以形成一个子神经干细胞和一个定向祖先(例如，神经元或神经胶质祖先)。特别地，神经干细胞具有产生中枢神经系统的三种主要成熟类型的细胞的能力：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。典型地，人神经干细胞具有移入、增殖、迁移和/或分化(以位点特异性方式)的能力。人神经干细胞可以以转录因子Sox1和Sox2的表达为特征。另外，人神经干细胞典型地表达特征性的细胞表面标志物。此类标志物包括CD133、CD49f、CD29和CD15。因此，可以基于此类标志物或此类标志物的组合的表达来分离人神经干细胞，例如CD133+CD24-/low细胞。原则上，任何在人神经干细胞上特异性地表达的标志物，或者人神经干细胞的特征性标志物的任何组合，可以在人神经干细胞的分离中使用。
人神经干细胞可以源自人胚胎、胎儿或成人来源，或者可以通过使用已知技术而源自其他细胞类型，包括胚胎干(ES)细胞和经诱导的多潜能干(iPS)细胞。人神经干细胞也可以通过直接重编程而源自体细胞群体，例如成纤维细胞。在一些实施方案中，人神经干细胞源自体干细胞或多潜能干细胞。人神经干细胞包括源自人中枢神经系统(包括胎儿脊髓和胎儿脑组织)的细胞。例如，人神经干细胞可以是通过使用在Uchida等人,Proc NatlAcad Sci USA,2000,97(26):14720-14725中所描述的方法而从人脑组织中直接分离出的人中枢神经系统干细胞。
人神经干细胞可以是这样的培养物，其以贴壁培养物(包括单层培养物，在包覆有底物的组织培养平板上)，以悬浮培养物，或者作为细胞的自粘附复合体，其形成称为神经球的聚簇。
术语“初级人神经干细胞”是指从人组织中分离出的人神经干细胞，或以培养物进行维持的人神经干细胞的子代。典型地，初级人神经干细胞保留了最初从人组织中分离的细胞的特征，并且可以区别于永生化细胞系。
术语“基因组编辑”是指这样的遗传工程类型，其中使用一种或多种核酸酶和/或切口酶来从靶DNA(例如细胞的基因组)中插入、替换或去除DNA。核酸酶在基因组中的所希望的位置处产生特异性的双链断裂(DSB)，并且利用细胞的内源机制去通过同源性定向修复(HDR：homology-directed repair)(例如，同源重组)或通过非同源末端连接(NHEJ：nonhomologous end joining)来修复所诱导的断裂。切口酶在基因组中的所希望的位置处产生特异性的单链断裂。在一个非限制性的实例中，可以使用两种切口酶来在靶DNA的相反链上产生两个单链断裂，由此产生平头或粘性末端。可以将任何合适的核酸酶引入到细胞中以诱导靶DNA序列的基因组编码，包括但不限于CRISPR-相关蛋白(Cas)核酸酶、锌指核酸酶(ZFN：zinc finger nuclease)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN：transcriptionactivator-like effector nuclease)、兆碱基大范围核酸酶(meganuclease)、其他核酸内切或外切酶、其变体、其片段和其组合。在特别的实施方案中，将通过同源性定向修复(HDR)(例如，同源重组)的靶DNA序列(例如，安全港基因)的由核酸酶介导的基因组编辑用于按照在本文中所描述的方法来产生经遗传修饰的人神经干细胞。
术语“DNA核酸酶”是指能够切割DNA的核苷酸亚基之间的磷酸二酯键的酶，并且可以是核酸内切酶或核酸外切酶。根据本发明，DNA核酸酶可以是经改造的(例如，可编程的或可靶向的)DNA核酸酶，其可以用于诱导靶DNA序列(例如，安全港基因)的基因组编辑。可以使用任何合适的DNA核酸酶，包括但不限于CRISPR-相关蛋白(Cas)核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、兆碱基大范围核酸酶、其他核酸内切或外切酶、其变体、其片段和其组合。
术语“双链断裂”或“DSB”是指DNA双螺旋的两条链的切断或切割。DSB可以导致在相同位置处两条链的切割，这导致“平头末端”，或者错开的切割，这导致在每个DNA片段的末端处的单链DNA区域，或“粘性末端”。DSB可以产生自一种或多种DNA核酸酶的作用。
术语“同源性定向修复”或“HDR”是指细胞中的准确地和精确地修复双链DNA断裂的机制，其使用同源模板来指导修复。HDR的最常见的形式为同源重组(HR)，其是一种其中在两个相似或相同的DNA分子之间交换核苷酸序列的遗传重组类型。
术语“核酸”、“核苷酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和以单链、双链或多链形式的其聚合物。该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA，cDNA，DNA-RNA杂合物，或者包含嘌呤和/或嘧啶碱基或其他天然的、经化学修饰的、经生物化学修饰的、非天然的、合成的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。在一些实施方案中，核酸可以包含DNA、RNA和其类似物的混合物。除非特别限制，该术语包括包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然出现的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，特定的核酸序列还隐含地包括其经保守地修饰的变体(例如，简并密码子置换)、等位基因、直向同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。特别地，简并密码子置换可以通过产生其中一个或多个所选择的(或所有的)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语“核酸”与基因、cDNA和由基因所编码的mRNA可互换使用。
术语“经修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”是指这样的核苷酸，其在核苷的含氮碱基(例如，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)或者鸟嘌呤(G))、核苷的糖部分(例如，核糖、脱氧核糖、经修饰的核糖、经修饰的脱氧核糖、六元糖类似物或开链糖类似物)和/或磷酸酯主链之中或之上包含一个或多个化学修饰(例如，取代)。
术语“基因”或“编码多肽的核苷酸序列”意指参与产生多肽链的DNA区段。所述DNA区段可以包括参与基因产物的转录/翻译和转录/翻译的调节的在编码区之前和之后的区域(前导区和非转录尾区)，以及在独个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
在本文中可互换使用的术语“安全港基因”或“安全港座位”是指允许所整合的转基因(例如外源DNA)在基因组中表达的基因组位置。在一些情况下，安全港座位允许所整合的DNA的稳定表达，对于附近或邻近的内源基因、调节元件等具有最小的影响。在一些情况下，安全港基因使得可持续性基因表达成为可能，并且可以被经改造的核酸酶所靶向，以用于在各种细胞类型(包括神经干细胞、其衍生物和其分化细胞)中进行基因修饰。安全港基因的实例包括IL2Rγ、CCR5和HBB基因。在一些情况下，可以靶向多于一个安全港基因，由此将多于一个转基因引入到经遗传修饰的细胞中。
术语“转基因”是指在基因组中的外源DNA。转基因可以包含用于细胞纯化的标志物和/或目的基因。合适的标志物是本领域中已知的，包括细胞表面标志物例如CD8、CD19和经截短的CD19，和荧光标志物例如GFP。目的基因可以由技术人员来进行选择，并且可以是编码与中枢神经系统的病症相关的蛋白质的转基因或者编码神经保护性或神经再生性蛋白质、其变体、其片段或其肽模拟物的基因。
在转基因盒的背景下，术语“盒”是指可以作为单一元件被引入和可以一起发挥作用以取得所希望的结果的遗传序列元件的组合。转基因盒可以包括与异源启动子可操作地相连接的转基因。例如，表达盒可以包含与第二多核苷酸(例如，编码序列)可操作地相连接的启动子，并且可以包括对于该第二多核苷酸来说异源的启动子，作为人为操作的结果。典型地，盒以未在自然界中发现的组合包含多核苷酸。
术语“可操作地相连接”是指两个或更多个遗传元件，例如编码序列的多核苷酸和启动子，以允许所述元件的正确的生物学功能发挥(例如启动子指引编码序列的转录)的相对位置进行放置。
术语“异源启动子”是指在自然界中不与转基因可操作地相连接的启动子。异源启动子可以是源自非人生物体的序列，或者化学合成的、任选地经修饰的启动子序列。备选地，异源启动子可以是来自天然地未与转基因一起被发现的基因座位的人序列。
术语“诱导型启动子系统”，是指对环境因素和/或外部刺激(其可以被人工控制)作出响应以便修饰转基因的表达或表达水平的启动子；或者是指元件(例如，外源启动子和额外的元件例如与分开的启动子可操作地相连接的反式激活因子)的组合。诱导型启动子系统可以对非生物因素例如氧水平或者对化学或生物学分子作出响应。在一些实施方案中，所述化学或生物学分子可以是不天然地存在于人中的分子。
当提及细胞时，术语“分离的”是指处于与细胞天然出现所处的环境不同的环境中的细胞，例如当所述细胞天然地出现在多细胞生物体中，并且将所述细胞从该多细胞生物体中移出时，所述细胞是“分离的”。分离的经遗传修饰的细胞可以存在于经遗传修饰的细胞的混合群体中，或者存在于包含经遗传修饰的细胞和没有进行遗传修饰的细胞的混合群体中。例如，分离的经遗传修饰的细胞可以在体外存在于经遗传修饰的细胞的混合群体中，或者存在于包含经遗传修饰的细胞和没有进行遗传修饰的细胞的混合体外群体中。
术语“细胞特异性启动子”是指在不同的细胞或组织类型中差异性地指引表达的启动子。表达可以存在或不存在，或者可以在不同的细胞类型中根据其发育或分化状态以不同的水平发生。例如，启动子可以优先地在神经细胞中或者在特定神经谱系的细胞中驱动转基因的表达。因此，可能的是，特异性地在神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞中，或者甚至在特定类别的神经元中表达转基因。
短语“转基因编码与中枢神经系统的遗传病症相关的蛋白质”是指编码这样的产物的基因，所述产物的存在或不存在引起或有助于中枢神经系统的遗传病症。所述遗传病症可以是常染色体隐性遗传病症，其可以通过作为转基因表达相应的突变型基因的野生型(正常的)等位基因来进行治疗。所述遗传病症可以由突变型基因引起，并且在本文中所描述的转基因可以用于治疗所述病症。短语“转基因编码神经保护性或神经再生性蛋白质”是指编码这样的产物的转基因，所述产物防止或帮助防止神经系统的病症的发展或进展，或者有助于或引起作为疾病、状况或损伤的结果而丧失的神经系统功能的恢复或部分恢复。在本文中所描述的疾病、病症或状况包括影响星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经胶质细胞、神经元、运动神经元、中间神经元、视网膜细胞等的那些。此类神经病学疾病、病症或状况可以包括帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、记忆病症、癫痫、黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性)、色素性视网膜炎、莱伯先天性黑矇、视网膜病、视神经病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、髓鞘疾病、多发性硬化、中风、脑性瘫痪、遗传性小儿脑白质营养不良(包括佩-梅病、神经细胞蜡样质脂褐素病和克拉伯病)、异染色性脑白质营养不良、泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)、脊髓损伤或创伤。在本文中所描述的疾病、病症或状况还包括创伤性脑损伤、中枢神经系统(CNS)的急性炎症、CNS的慢性炎症、局部缺血和中风。所述蛋白质可以是由从由下列各项组成的组中选择的基因所编码的蛋白质：GALC(克拉伯病)、ABCD1(肾上腺脑白质营养不良)、GFAP(亚历山大病)、CYP27A1(脑腱黄瘤病)、ARSA(异染色性脑白质营养不良)、PLP1(佩-梅病)、ASPA(卡纳万病)、EIF-2B(具有正在消失的白质的白质脑病)、PHYH(雷夫叙姆病1)、PEX7(雷夫叙姆病2)、PPT1(婴儿神经细胞蜡样质脂褐素病(NCL))、TPP1(晚期婴儿NCL)、CLN3(青少年NCL)、CLN6(成人NCL)、CLN5(芬兰晚期婴儿变异型NCL)、CLN6(晚期婴儿变异型NCL)、MSFD8(神经细胞蜡样质脂褐素病7)、CLN8(神经细胞蜡样质脂褐素病8)、CTSD(神经细胞蜡样质脂褐素病10)、UBE3A(安格尔曼综合征)、POLG(阿尔珀斯病)、TAZ(巴尔特综合征(Barth Syndrome))、GLA(法布里病)、SLC20A2(法尔氏综合征(Fahr’s syndrome))、PDE(色素性视网膜炎)、SMN1(脊髓性肌萎缩)、IKBKAP(家族性自主神经功能异常)、MeCP2(雷特综合征)、CACNA1C(蒂莫西综合征(Timothy syndrome))、ATXN3(马-约病)、RPE65(莱伯先天性黑矇)、USH2A(色素性视网膜炎)、RPGR(色素性视网膜炎)、RP2(色素性视网膜炎)、ABCA4(施塔加特病(Stargardt disease))和RS-1(X连锁性视网膜襞裂症)。
短语“转基因编码神经保护性或神经再生性蛋白质”是指编码这样的产物的转基因，所述产物防止或帮助防止神经系统的病症的发展或进展，或者有助于或引起作为疾病、状况或损伤的结果而丧失的神经系统功能的恢复或部分恢复。在某些实施方案中，所述神经保护性或神经再生性蛋白质选自由下列各项组成的组：脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-2(NT-2)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)、神经营养蛋白-6、保守型多巴胺神经营养因子(CDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、集落刺激因子(CSF)、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、neurturin、persephin、artemin、神经肽Y(NPY)、肝配蛋白、脑信号蛋白、其他神经生成因子、其他神经营养因子和其组合。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以是指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然出现的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然出现的氨基酸聚合物和非天然出现的氨基酸聚合物。如在本文中所使用的，所述术语包括其中氨基酸残基通过共价肽键相连接的任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质。
术语“变体”是指这样的生物体、株系、基因、多核苷酸、多肽或特征的形式，其偏离自然界中所出现的那种。
术语“肽模拟物”是指这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基(包括该聚合物的全部或部分)为相应的天然出现的氨基酸的人工化学模拟物。肽模拟物可以具有相对于相应的由天然出现的氨基酸组成的肽而言经改善的特性，例如稳定性或生物学活性。肽模拟物可以例如包含一个或多个D-氨基酸。
术语“载体”或“重组载体”是指重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定的多核苷酸序列在宿主细胞中进行转录的指定的核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒基因组或核酸片段的一部分。典型地，表达载体包括待转录的多核苷酸，其与启动子可操作地相连接。在该背景下，“可操作地相连接”意指两个或更多个遗传元件，例如编码序列的多核苷酸和启动子，以允许所述元件的正确的生物学功能发挥(例如启动子指引编码序列的转录)的相对位置进行放置。术语“启动子”在本文中用于是指指引核酸的转录的核酸控制序列的阵列。如在本文中所使用的，启动子包括在转录起始位点附近的必需核苷酸序列，例如，在II型聚合酶启动子的情况下，TATA元件。启动子还任选地包括远距离的增强子或阻抑物元件，其可以位于离转录起始位点几千个碱基对之多。其他可以存在于表达载体中的元件包括增强转录(例如，增强子)和终止转录(例如，终止子)的那些，以及将某些结合亲和力或抗原性赋予从表达载体产生的重组蛋白质的那些。
“重组(的)”是指经遗传修饰的多核苷酸、多肽、细胞、组织或生物体。例如，重组多核苷酸(或者重组多核苷酸的拷贝或互补物)为已经通过使用众所周知的方法进行了操作的多核苷酸。包含与第二多核苷酸(例如，编码序列)可操作地相连接的启动子的重组表达盒可以包括对于所述第二多核苷酸来说异源的启动子，作为人为操作的结果(例如，通过在Sambrook等人,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989)，或Current Protocols in MolecularBiology,第1-3卷,John Wiley&Sons,Inc.(1994-1998)中所描述的方法)。典型地，重组表达盒(或表达载体)以未在自然界中发现的组合包含多核苷酸。例如，经人为操作的限制位点或质粒载体序列可以在启动子侧翼或将启动子与其他序列分隔开。重组蛋白质为从重组多核苷酸表达出的那种，和重组细胞、组织和生物体为包含重组序列(多核苷酸和/或多肽)的那些。
术语“可选择性标志物”是指这样的基因产物，其允许表达该基因产物的细胞被从混合细胞群体中分离出来。这样的分离可以通过选择性地杀死不表达该可选择性标志物(其可以是抗生素抗性基因)的细胞来取得。备选地，所述可选择性标志物可以允许分离出表达该标志物的细胞，作为表达荧光蛋白例如GFP或者表达允许通过荧光激活细胞分选术(FACS：fluorescence-activated cell sorting)、磁性激活细胞分选术(MACS)或类似方法来分离细胞的细胞表面标志物的结果。合适的细胞表面标志物包括CD8、CD19和经截短的CD19。优选地，用于分离所希望的细胞的细胞表面标志物为非信号传导分子，例如CD1、CD2、CD8α、CD10、CD19或CD20的亚基或经截短的形式。合适的标志物和技术是本领域中已知的。
术语“可检测性标志物”是指这样的基因产物，其允许表达该基因产物的细胞被鉴定出来。这样的鉴定可以是目视鉴定，例如通过荧光蛋白的表达或者通过可以由经标记的抗体所识别的细胞表面标志物的表达。合适的标志物和技术是本领域中已知的。
术语“纯化标志物”是指提供特定细胞类型的纯化的标志物。因此，纯化标志物也可以是上面所描述的可选择性标志物，由此允许纯化出表达该标志物的细胞，例如通过抗生素选择或者通过FACS或MACS。合适的标志物和技术是本领域中已知的。用于纯化人神经干细胞的标志物包括CD133、CD49f、CD29和CD15。也可以基于标志物的组合的表达来分离人神经干细胞，例如CD133+CD24-/low细胞。原则上，任何在人神经干细胞上特异性地表达的标志物，或者人神经干细胞的特征性标志物的任何组合，可以在人神经干细胞的分离中使用。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，以是指脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人、农场动物、运动动物和宠物。还包括在体内获得的或在体外培养的生物学实体的组织、细胞和其子代。
术语“治疗”是指用于获得有益的或所希望的结果(包括但不限于治疗益处和/或预防益处)的方法。“治疗益处”意指在治疗之下的任何在治疗学上有关的在一种或多种疾病、状况或症状方面的改善或者对于一种或多种疾病、状况或症状的效应。对于预防益处，可以向处于发展出特定疾病、状况或症状的风险中的受试者，或者向报告疾病的生理学症状中的一种或多种的受试者施用所述组合物，尽管所述疾病、状况或症状可能还没有显现。
术语“有效量”或“足够量”是指足以实现有益的或所希望的结果的试剂的量。治疗有效量可以依赖于下列中的一个或多个而变动：所治疗的受试者和疾病状况，受试者的体重和年龄，疾病状况的严重度，施用方式，等等，其可以容易地由本领域中的普通技术人员来确定。具体的量可以依赖于下列中的一个或多个而变动：所选择的特定试剂，靶细胞类型，靶细胞在受试者中的位置，待遵循的按剂量给药方案，是否将它与其他化合物相组合地进行施用，施用时机，和其中携带它的物理递送系统。
术语“在药学上可接受的承载体”是指帮助将活性试剂施用至细胞、生物体或受试者的物质。“在药学上可接受的承载体”是指可以被包括在本发明的组合物中并且对于患者不引起显著的不利的毒理学效应的承载体或赋形剂。在药学上可接受的承载体的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、正常蔗糖、正常葡萄糖、细胞培养基等。本领域技术人员将会认识到，其他药用承载体在本发明中是有用的。
与参考物数值相关联的术语“大约”可以包括一系列的从那个值加或减10％的值。例如，“大约10”的这一量包括9至11的量，包括9、10或11的参考数。与参考物数值相关联的术语“大约”还可以包括一系列的从那个值加或减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值。
IV.实施方案的详细描述
如在本文中和在所附的权利要求书中所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数所指事物，除非上下文另外明确规定。应当理解，在本文中所描述的本发明的方面和变化包括由方面和变化“组成”和/或“基本上”由方面和变化“组成”。
在一个方面，本发明提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：向分离的人神经干细胞中引入：DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在基因中产生双链断裂以诱导末端连接，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：向分离的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；和(ii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。
在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
安全港座位可以是允许所整合的转基因(例如外源DNA)在基因组中表达的基因组位置。在一些情况下，所述安全港座位允许所整合的DNA的稳定表达，对于附近或邻近的内源基因、调节元件等具有最小的影响。在一些情况下，所述安全港基因使得可持续性基因表达成为可能，并且可以被经改造的核酸酶所靶向，以用于在各种细胞类型(包括神经干细胞、其衍生物和其分化细胞)中进行基因修饰。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)培养分离的人神经干细胞；2)向所述经培养的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；和(ii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，将所述神经干细胞作为细胞的自粘附复合体(例如，通过形成称为神经球的聚簇)进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在具有从由下列各项组成的组中选择的补充物的条件下进行培养：N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子和白血病抑制因子。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天中的任一个，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)分离人神经干细胞群体；2)培养所述分离的人神经干细胞：3)向所述经培养的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；和(ii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，将所述神经干细胞作为细胞的自粘附复合体(例如，通过形成称为神经球的聚簇)进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在具有从由下列各项组成的组中选择的补充物的条件下进行培养：N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子和白血病抑制因子。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天中的任一个，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)向包含人神经干细胞的人细胞群体中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；和(ii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中；2)从所述人细胞群体中分离人神经干细胞，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述分离的人神经干细胞中分离经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，将所述神经干细胞作为细胞的自粘附复合体(例如，通过形成称为神经球的聚簇)进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在具有从由下列各项组成的组中选择的补充物的条件下进行培养：N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子和白血病抑制因子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括培养分离的经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，培养时间为至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天中的任一个，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之后。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之后。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：向分离的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；和(ii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)RNA-指导的CRISPR/Cas系统(例如基于RNA的CRISPR/Cas系统)，其中所述CRISPR/Cas系统能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)培养分离的人神经干细胞；2)向所述经培养的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；和(ii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)RNA-指导的CRISPR/Cas系统(例如基于RNA的CRISPR/Cas系统)，其中所述CRISPR/Cas系统能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，将所述神经干细胞作为细胞的自粘附复合体(例如，通过形成称为神经球的聚簇)进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在具有从由下列各项组成的组中选择的补充物的条件下进行培养：N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子和白血病抑制因子。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天中的任一个，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)分离人神经干细胞群体；2)培养所述分离的人神经干细胞：3)向所述经培养的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；和(ii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)RNA-指导的CRISPR/Cas系统(例如基于RNA的CRISPR/Cas系统)，其中所述CRISPR/Cas系统能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，将所述神经干细胞作为细胞的自粘附复合体(例如，通过形成称为神经球的聚簇)进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在具有从由下列各项组成的组中选择的补充物的条件下进行培养：N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子和白血病抑制因子。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天中的任一个，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)向包含人神经干细胞的人细胞群体中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；和(ii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)RNA-指导的CRISPR/Cas系统(例如基于RNA的CRISPR/Cas系统)，其中所述CRISPR/Cas系统能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中；2)从所述人细胞群体中分离人神经干细胞，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述分离的人神经干细胞中分离经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，将所述神经干细胞作为细胞的自粘附复合体(例如，通过形成称为神经球的聚簇)进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在具有从由下列各项组成的组中选择的补充物的条件下进行培养：N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子和白血病抑制因子。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天中的任一个，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之后。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之后。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：向分离的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；(ii)编码可选择性标志物的核酸；和(iii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)培养分离的人神经干细胞；2)向所述经培养的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；(ii)编码可选择性标志物的核酸；和(iii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于所述可选择性标志物来分离所述经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述可选择性标志物为细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，将所述神经干细胞作为细胞的自粘附复合体(例如，通过形成称为神经球的聚簇)进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在具有从由下列各项组成的组中选择的补充物的条件下进行培养：N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子和白血病抑制因子。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天中的任一个，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)分离人神经干细胞群体；2)培养所述分离的人神经干细胞：3)向所述经培养的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；(ii)编码可选择性标志物的核酸；和(iii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于所述可选择性标志物来分离所述经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述可选择性标志物为细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物选自由CD8、CD19或其经截短的片段组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，将所述神经干细胞作为细胞的自粘附复合体(例如，通过形成称为神经球的聚簇)进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在具有从由下列各项组成的组中选择的补充物的条件下进行培养：N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子和白血病抑制因子。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天中的任一个，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)向包含人神经干细胞的人细胞群体中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；(ii)编码可选择性标志物的核酸；和(iii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中；2)从所述人细胞群体中分离人神经干细胞，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述分离的人神经干细胞中分离经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于所述可选择性标志物来分离所述经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述可选择性标志物为细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物选自由CD8、CD19或其经截短的片段组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：向分离的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；(ii)编码可选择性标志物的核酸；和(iii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)RNA-指导的CRISPR/Cas系统(例如基于RNA的CRISPR/Cas系统)，其中所述CRISPR/Cas系统能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述分离的人神经干细胞中分离经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于所述可选择性标志物来分离所述经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述可选择性标志物为细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物选自由CD8、CD19或其经截短的片段组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)培养分离的人神经干细胞；2)向所述经培养的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；(ii)编码可选择性标志物的核酸；和(iii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)RNA-指导的CRISPR/Cas系统(例如基于RNA的CRISPR/Cas系统)，其中所述CRISPR/Cas系统能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述分离的人神经干细胞中分离经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于所述纯化标志物来分离所述经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述可选择性标志物为细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物选自由CD8、CD19或其经截短的片段组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，将所述神经干细胞作为细胞的自粘附复合体(例如，通过形成称为神经球的聚簇)进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在具有从由下列各项组成的组中选择的补充物的条件下进行培养：N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子和白血病抑制因子。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天中的任一个，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)分离人神经干细胞群体；2)培养所述分离的人神经干细胞：3)向所述经培养的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；(ii)编码可选择性标志物的核酸；和(iii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)RNA-指导的CRISPR/Cas系统(例如基于RNA的CRISPR/Cas系统)，其中所述CRISPR/Cas系统能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述分离的人神经干细胞中分离经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于所述可选择性标志物来分离所述经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述可选择性标志物为细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物选自由CD8、CD19或其经截短的片段组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，将所述神经干细胞作为细胞的自粘附复合体(例如，通过形成称为神经球的聚簇)进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在具有从由下列各项组成的组中选择的补充物的条件下进行培养：N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子和白血病抑制因子。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天中的任一个，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)向包含人神经干细胞的人细胞群体中引入：(a)供者模板，其包含：(i)转基因；(ii)编码可选择性标志物的核酸；和(iii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)RNA-指导的CRISPR/Cas系统(例如基于RNA的CRISPR/Cas系统)，其中所述CRISPR/Cas系统能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中；2)从所述人细胞群体中分离人神经干细胞，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。
在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：1)向包含人神经干细胞的人细胞群体中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；(ii)编码纯化标志物的核酸；和(iii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)RNA-指导的CRISPR/Cas系统(例如基于RNA的CRISPR/Cas系统)，其中所述CRISPR/Cas系统能够在所述安全港基因中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港基因中；2)从所述人细胞群体中分离人神经干细胞，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述分离的人神经干细胞中分离经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述分离的人神经干细胞中分离经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于所述可选择性标志物来分离所述经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述可选择性标志物为细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物选自由CD8、CD19或其经截短的片段组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位选自由CCR5、IL2Rγ和HBB组成的组。在一些实施方案中，所述安全港座位为IL2Rγ。在一些实施方案中，将所述神经干细胞作为细胞的自粘附复合体(例如，通过形成称为神经球的聚簇)进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在具有从由下列各项组成的组中选择的补充物的条件下进行培养：N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子和白血病抑制因子。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天中的任一个，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之后。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之后。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，将多个转基因引入到多个安全港座位中。在一些实施方案中，将多个转基因引入到一个单一安全港座位中。在一些实施方案中，将单个转基因或多个转基因引入到非基因安全港座位中。
在本文中所描述的转基因可以编码蛋白质或功能性核酸(例如微小RNA)。在一些实施方案中，所述转基因编码与中枢神经系统的遗传病症相关的蛋白质。在一些实施方案中，所述转基因编码从由下列各项组成的组中选择的蛋白质：GALC(克拉伯病)、ABCD1(肾上腺脑白质营养不良)、GFAP(亚历山大病)、CYP27A1(脑腱黄瘤病)、ARSA(异染色性脑白质营养不良)、PLP1(佩-梅病)、ASPA(卡纳万病)、EIF-2B(具有正在消失的白质的白质脑病)、PHYH(雷夫叙姆病1)、PEX7(雷夫叙姆病2)、PPT1(婴儿神经细胞蜡样质脂褐素病(NCL))、TPP1(晚期婴儿NCL)、CLN3(青少年NCL)、CLN6(成人NCL)、CLN5(芬兰晚期婴儿变异型NCL)、CLN6(晚期婴儿变异型NCL)、MSFD8(神经细胞蜡样质脂褐素病7)、CLN8(神经细胞蜡样质脂褐素病8)、CTSD(神经细胞蜡样质脂褐素病10)、UBE3A(安格尔曼综合征)、POLG(阿尔珀斯病)、TAZ(巴尔特综合征)、GLA(法布里病)、SLC20A2(法尔氏综合征)、PDE(色素性视网膜炎)、SMN1(脊髓性肌萎缩)、IKBKAP(家族性自主神经功能异常)、MeCP2(雷特综合征)、CACNA1C(蒂莫西综合征)、ATXN3(马-约病)、RPE65(莱伯先天性黑矇)、USH2A(色素性视网膜炎)、RPGR(色素性视网膜炎)、RP2(色素性视网膜炎)、ABCA4(施塔加特病)和RS-1(X连锁性视网膜襞裂症)。在一些实施方案中，所述蛋白质由所述经遗传修饰的人神经干细胞分泌。
在一些实施方案中，所述转基因编码神经保护性或神经再生性蛋白质、其变体、其片段或其肽模拟物。在一些实施方案中，所述转基因编码从由下列各项组成的组中选择的神经保护性或神经再生性蛋白质：脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、胰岛素样生长因子2(IGF2)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-2(NT-2)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)、神经营养蛋白-6、保守型多巴胺神经营养因子(CDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、集落刺激因子(CSF)、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、neurturin、persephin、artemin、神经肽Y(NPY)、肝配蛋白、脑信号蛋白、其他神经生成因子、其他神经营养因子和其组合。在一些实施方案中，所述转基因编码神经保护性或神经再生性蛋白质，其中所述神经保护性或神经再生性蛋白质为分泌型蛋白质。在一些实施方案中，所述转基因编码Bcl-2。在一些实施方案中，所述转基因编码端粒酶。在一些实施方案中，所述转基因编码这样的蛋白质，其可以改善存活或使神经干细胞恢复活力以便利于长期存活和/或治疗性分子的发现。
在本文中所描述的转基因盒包含启动子序列，例如异源启动子，其可操作地与所述转基因相连接。在一些实施方案中，所述启动子和所述转基因位于相同的安全港基因中。在一些实施方案中，所述启动子和所述转基因位于不同的安全港基因中。在一些实施方案中，所述启动子为诱导型启动子。在一些实施方案中，所述启动子为细胞特异性启动子。在一些实施方案中，当将多个转基因引入到人神经干细胞中时，所述转基因可以由一个或多个启动子控制。在一些实施方案中，所述启动子可以是U6RNA聚合酶III启动子、转录控制元件、增强子、U6终止序列、一个或多个核定位信号等。
在一些实施方案中，将在本文中所描述的转基因盒插入到安全港座位中，从而使得所述转基因与内源启动子可操作地相连接。
在一些实施方案中，同时地引入所述转基因和所述DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列。在一些实施方案中，顺次地引入所述转基因和所述DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸酶系统为TALEN系统。在一些实施方案中，所述TALEN系统包含基于质粒的TALEN。在一些实施方案中，所述TALEN系统包含基于RNA的TALEN。
在一些实施方案中，所述核酸酶系统为CRISPR/Cas9系统。在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9系统包含基于质粒的Cas9。在一些实施方案在，所述CRISPR/Cas9系统包含基于RNA的Cas9。在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9系统包含Cas9mRNA和sgRNA。在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9系统包含蛋白质/RNA复合体，或质粒/RNA复合体，或蛋白质/质粒复合体。在一些实施方案中，提供了用于产生经遗传修饰的神经干细胞的方法，其包括在所述分离的神经干细胞中引入转基因和DNA核酸酶系统，其中将所述转基因插入到安全港座位中，并且其中所述DNA核酸酶系统包含Cas9mRNA和座位特异性sgRNA。在一些实施方案中，在引入到神经干细胞中之前，修饰所述Cas9mRNA。在一些实施方案中，在引入到神经干细胞中之前，修饰所述sgRNA。
在一些实施方案中，至少1％的所得的经遗传修饰的神经干细胞表达所述转基因。在一些实施方案中，至少0.5％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％的所得的经遗传修饰的神经干细胞表达所述转基因。
通过在本文中所描述的方法而获得的经遗传修饰的人神经干细胞展示出一种或多种有利的特性，包括保持神经干细胞的“干性(stemness)”。这是特别有意义的，鉴于在制备经遗传修饰的人神经干细胞的过程中对所述细胞进行培养(有时大规模地)并且使其经历多个操作步骤这一事实。在一些实施方案中，所得的经遗传修饰的神经干细胞能够表达SOX2。在一些实施方案中，所得的经遗传修饰的神经干细胞能够移入或迁移，当被移植到动物模型的脑中时。在一些实施方案中，所得的经遗传修饰的神经干细胞能够分化成少突胶质细胞、神经元或星形胶质细胞。在一些实施方案中，所得的经遗传修饰的神经干细胞能够分化成嗅球中的神经元谱系。在一些实施方案中，所得的经遗传修饰的神经干细胞能够自我更新，而同时长期地分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系。在一些实施方案中，所得的经遗传修饰的神经干细胞在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代期间具有上述特征中的至少一个。在一些实施方案中，所得的经遗传修饰的神经干细胞具有上述特征中的至少两个或更多个。在一些实施方案中，所得的经遗传修饰的神经干细胞在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代期间具有上述特征中的至少两个或更多个。
在一些实施方案中，所得的经遗传修饰的神经干细胞能够至少在3次传代后稳定地表达所述转基因。在一些实施方案中，所得的经遗传修饰的神经干细胞能够在至少1、2、4、5、6或7次细胞培养传代期间稳定地表达所述转基因。在一些实施方案中，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的所得的经遗传修饰的神经干细胞群体表达所述转基因。
在一些实施方案中，在本文中所描述的方法利用可选择性标志物。在一些实施方案中，所述可选择性标志物为通常不在中枢神经系统的细胞上表达的蛋白质。在一些实施方案中，所述可选择性标志物不在细胞表面上表达(例如GFP)。在一些实施方案中，所述可选择性标志物为细胞表面标志物。
在一些实施方案中，所述细胞表面标志物为CD8、CD19、CD20或其经截短的片段。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物为CD8α细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物为CD20细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物为经截短的CD8细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物为经截短的CD19细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物为经截短的CD20细胞表面标志物。在一些实施方案中，使用两种或更多种细胞表面标志物以便利于经遗传修饰的神经干细胞的选择。
在一些实施方案中，所述细胞表面标志物为趋化因子受体。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物为细胞因子受体。在一些实施方案中，所述细胞表面标志物为细胞表面酶(例如isomethy蛋白酶、金属蛋白酶或中性溶酶)和趋化因子受体。
在一些实施方案中，将所述神经干细胞作为细胞的自粘附复合体(例如，通过形成称为神经球的聚簇)进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞以贴壁培养物例如单层培养物进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在包覆有底物的组织培养平板上进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞以悬浮培养物进行培养。在一些实施方案中，将所述神经干细胞在具有从由下列各项组成的组中选择的补充物中的至少一种的条件下进行培养：N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子和白血病抑制因子。
在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养一段时间(例如30天)，在向所述神经干细胞中引入所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)之前。在一些实施方案中，所述培养时间段为至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之前。
在一些实施方案中，所述培养时间段对于所述供者模板被增殖中的神经干细胞稀释完来说是足够长的。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之后。在一些实施方案中，将所述神经干细胞培养至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代，在将所述供者模板和/或所述DNA核酸酶(或所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列)引入到所述神经干细胞中之后。
在一些实施方案中，所述神经干细胞源自人脑。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自体干细胞或多潜能干细胞，或者通过直接重编程而源自体细胞群体。在一些实施方案中，所述神经干细胞为人神经干细胞。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自妊娠中三月的人胎儿脑。在一些实施方案中，基于标志物例如CD133和CD24的组合的表达来分离所述神经干细胞。在一些实施方案中，所述神经干细胞源自CD133+CD24-/low人脑细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在本文中还提供了通过任何一种或多种在本文中所描述的方法制备的经遗传修饰的神经干细胞。下面更详细地进一步描述所述经遗传修饰的人神经干细胞。
本申请的另一个方面提供了包含转基因的经遗传修饰的人神经干细胞群体，其中所述转基因被插入到安全港座位中。
在一些实施方案中，所述经遗传修饰的人神经干细胞源自体干细胞或多潜能干细胞，或者通过直接重编程而源自体细胞群体。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞源自人脑。在一些实施方案中，基于标志物的组合的表达来分离所述经遗传修饰的神经干细胞，例如CD133+CD24-/low细胞。在一些实施方案中，基于两个或更多个从由CD133、CD24、CD49f、CD29和CD15组成的组中选择的标志物的组合的表达来分离所述神经干细胞。
在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代期间表达SOX2。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞能够分化成少突胶质细胞。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞能够分化成产生髓鞘质的少突胶质细胞。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞能够分化成神经元。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞能够分化成星形胶质细胞。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞能够分化成两种或更多种神经细胞类型，例如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞能够移入，当被移植到动物模型的脑中时。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞能够迁移，当被移植到动物模型的脑中时。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞能够分化成嗅球中的神经元谱系。在一些实施方案中，所得的经遗传修饰的神经干细胞能够自我更新，而同时长期地分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次细胞培养传代期间具有两个或更多个上面所讨论的特征，例如表达SOX2，并且展示出包括下列各项的功能中的至少一种：当被移植到动物模型的脑中时进行迁移或移入，或分化成至少一种神经细胞类型例如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
在一些实施方案中，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的所述经遗传修饰的神经干细胞群体表达所述转基因。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞能够在至少1、2、3、4、5、6、7次细胞培养传代期间稳定地表达所述转基因。
在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞进一步表达可选择性标志物。在一些实施方案，所述可选择性标志物包含不在中枢神经系统的细胞上表达的标志物。在一些实施方案中，所述可选择性标志物不在细胞表面上表达(即GFP)。
在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达细胞表面标志物，其中所述细胞表面标志物可以用作可选择性标志物。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达CD8细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达CD8α细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达CD19细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达CD20细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达经截短的CD8细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达经截短的CD19细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达经截短的CD20细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达两种或更多种细胞表面标志物。
在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达细胞表面标志物，其中所述细胞表面标志物为趋化因子受体。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达细胞表面标志物，其中所述细胞表面标志物为细胞因子受体。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达细胞表面标志物，其中所述细胞表面标志物为细胞表面酶(例如，isomethy蛋白酶或金属蛋白酶或中性溶酶)和趋化因子受体。
在一些实施方案中，所述安全港基因为IL2Rγ。在一些实施方案中，所述安全港基因为CCR5。在一些实施方案中，所述安全港基因为HBB。在一些实施方案中，使用两个或更多个安全港基因来插入一个或多个转基因。在一些实施方案中，两个或更多个安全港基因选自由IL2Rγ、CCR5和HBB组成的组。
在一些实施方案中，所述转基因包含启动子序列。在一些实施方案中，转基因包含异源启动子。在一些实施方案中，将所述异源启动子与转基因可操作地相连接。在一些实施方案中，将所述异源启动子与转基因可操作地相连接，其中所述异源启动子和所述转基因位于相同的安全港基因中。在一些实施方案中，将所述异源启动子与转基因可操作地相连接，其中所述异源启动子和所述转基因位于不同的安全港基因中。在一些实施方案中，所述供者模板的异源启动子包含诱导性型启动子系统。在一些实施方案中，所述供者模板的异源启动子包含细胞特异性启动子。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞包含一个或多个转基因，其包含一个或多个启动子。在一些实施方案中，所述启动子可以是U6RNA聚合酶III启动子、转录控制元件、增强子、U6终止序列、一个或多个核定位信号等。
在一些实施方案中，将在本文中所描述的转基因盒插入到所述安全港座位中，从而使得所述转基因与内源启动子可操作地相连接。
在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达转基因，其中所述转基因编码与中枢神经系统的遗传病症相关的蛋白质。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达从由下列各项组成的组中选择的基因：GALC(克拉伯病)、ABCD1(肾上腺脑白质营养不良)、GFAP(亚历山大病)、CYP27A1(脑腱黄瘤病)、ARSA(异染色性脑白质营养不良)、PLP1(佩-梅病)、ASPA(卡纳万病)、EIF-2B(具有正在消失的白质的白质脑病)、PHYH(雷夫叙姆病1)、PEX7(雷夫叙姆病2)、PPT1(婴儿神经细胞蜡样质脂褐素病(NCL))、TPP1(晚期婴儿NCL)、CLN3(青少年NCL)、CLN6(成人NCL)、CLN5(芬兰晚期婴儿变异型NCL)、CLN6(晚期婴儿变异型NCL)、MSFD8(神经细胞蜡样质脂褐素病7)、CLN8(神经细胞蜡样质脂褐素病8)、CTSD(神经细胞蜡样质脂褐素病10)、UBE3A(安格尔曼综合征)、POLG(阿尔珀斯病)、TAZ(巴尔特综合征)、GLA(法布里病)、SLC20A2(法尔氏综合征)、PDE(色素性视网膜炎)、SMN1(脊髓性肌萎缩)、IKBKAP(家族性自主神经功能异常)、MeCP2(雷特综合征)、CACNA1C(蒂莫西综合征)、ATXN3(马-约病)、RPE65(莱伯先天性黑矇)、USH2A(色素性视网膜炎)、RPGR(色素性视网膜炎)、RP2(色素性视网膜炎)、ABCA4(施塔加特病)和RS-1(X连锁性视网膜襞裂症)。在一些实施方案中，所述蛋白质由所述经遗传修饰的人神经干细胞分泌。
在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达编码神经保护性或神经再生性蛋白质、其变体、其片段或其肽模拟物的转基因。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达编码从由下列各项组成的组中选择的神经保护性或神经再生性蛋白质的转基因：脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、胰岛素样生长因子2(IGF2)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-2(NT-2)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)、神经营养蛋白-6、保守型多巴胺神经营养因子(CDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、集落刺激因子(CSF)、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、neurturin、persephin、artemin、神经肽Y(NPY)、肝配蛋白、脑信号蛋白、其他神经生成因子、其他神经营养因子和其组合。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达编码神经保护性或神经再生性蛋白质的转基因，其中所述神经保护性或神经再生性蛋白质为分泌型蛋白质。在一些实施方案中，所述转基因编码Bcl-2。在一些实施方案中，所述转基因编码端粒酶。在一些实施方案中，所述转基因编码这样的蛋白质，其可以改善存活或使神经干细胞恢复活力以便利于长期存活和/或治疗性分子的发现。
在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞表达两个或更多个转基因。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞产生从转基因产生的RNA。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞产生从转基因产生的siRNA。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞产生从一个转基因产生的RNA，并且将另一个转基因表达为蛋白质。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞产生从一个转基因产生的siRNA，并且将另一个转基因表达为蛋白质。
在一些实施方案中，可以向人受试者中施用所述经遗传修饰的神经干细胞以防止或减轻神经变性疾病或神经病学损伤的一个或多个症状。在一些实施方案中，可以向人受试者施用所述经遗传修饰的神经干细胞以防止或减轻神经变性疾病的一个或多个症状，其中所述神经变性疾病选自由下列各项组成的组：脑白质营养不良、神经细胞蜡样质脂褐素病、年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化和视网膜变性疾病。
在一些实施方案中，所述经遗传修饰的人神经干细胞具有两个或更多个(例如，3、4、5、6、7或更多个)上面所讨论的特征。
A.由核酸酶介导的基因组编辑
本发明包括使用DNA核酸酶例如经改造的(例如，可编程的或可靶向的)DNA核酸酶来诱导靶DNA序列(例如，安全港基因)的基因组编码。可以使用任何合适的DNA核酸酶，包括但不限于CRISPR-相关蛋白(Cas)核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、兆碱基大范围核酸酶、其他核酸内切或外切酶、其变体、其片段和其组合。
在一些实施方案中，编码DNA核酸酶的核苷酸序列存在于重组表达载体中。在某些情况下，所述重组表达载体为病毒构建体，例如重组腺伴随病毒构建体、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体等。例如，病毒载体可以基于痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺伴随病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒等。反转录病毒载体可以基于鼠白血病病毒，脾坏死病毒，和源自反转录病毒例如劳斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒、乳腺肿瘤病毒等的载体。有用的表达载体是本领域技术人员已知的，并且许多是商购可得的。作为例子，对于真核宿主细胞提供下列载体：pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40。然而，可以使用任何其他载体，如果它与宿主细胞相容。例如，有用的包含编码Cas9多肽的核苷酸序列的表达载体是从例如Addgene、Life Technologies、Sigma-Aldrich和Origene商购可得的。
依赖于所使用的靶细胞/表达系统，可以在所述表达载体中使用许多转录和翻译控制元件中的任一个，包括启动子、转录增强子、转录终止子等。有用的启动子可以源自病毒，或任何生物体，例如原核或真核生物体。合适的启动子包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(LTR)启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV即时早期启动子区(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、人U6小核启动子(U6)、增强型U6启动子、人H1启动子(H1)等。
在其他实施方案中，编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列作为RNA(例如mRNA)存在。所述RNA可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法来产生。作为非限制性的实例，所述RNA可以化学合成或在体外转录。在某些实施方案中，所述RNA包含编码Cas核酸酶例如Cas9多肽或其变体的mRNA。例如，所述Cas9mRNA可以通过模板DNA序列例如包含Cas9开放阅读框(ORF)的线性化质粒的体外转录来产生。可以为了在哺乳动物系统中进行表达而对所述Cas9ORF进行密码子优化。在一些情况下，所述Cas9mRNA编码具有N-末端和/或C-末端核定位信号(NLS)的Cas9多肽。在其他情况下，所述Cas9mRNA编码C-末端HA表位标签。在另外其他情况下，使所述Cas9mRNA加帽，多腺苷酸化，和/或用5-甲基胞苷进行修饰。Cas9mRNA是从例如TriLink BioTechnologies、Sigma-Aldrich和Thermo Fisher Scientific商购可得的。
1.CRISPR/Cas系统
CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats))/Cas(CRISPR-相关蛋白)核酸酶系统是基于细菌系统的经改造的核酸酶系统，其可以用于基因组工程。它基于许多细菌和古细菌的适应性免疫应答的一部分。当病毒或质粒侵入细菌时，侵入者的DNA的区段通过“免疫”应答而被转变成CRISPR RNA(crRNA)。然后，所述crRNA通过具有部分互补性的区域与称为tracrRNA的另一种类型的RNA相联合，以指导Cas(例如，Cas9)核酸酶至在靶DNA中的与所述crRNA同源的区域(称为“原间隔子(protospacer)”)。Cas(例如，Cas9)核酸酶在由包含在所述crRNA转录物之内的20-核苷酸指导序列所指定的位点处切割所述DNA以在双链断裂处产生平头末端。Cas(例如，Cas9)核酸酶需要crRNA和tracrRNA两者以用于位点特异性DNA识别和切割。现在已改造了该系统，从而使得可以将crRNA和tracrRNA组合成一个分子(“单一指导RNA”或“sgRNA”)，并且可以改造单一指导RNA的crRNA等价部分以指导Cas(例如，Cas9)核酸酶靶向任何所希望的序列(参见例如，Jinek等人(2012)Science 337:816-821；Jinek等人(2013)eLife 2:e00471；Segal(2013)eLife2:e00563)。因此，可以改造CRISPR/Cas系统，以在细胞的基因组中的所希望的靶标处产生双链断裂，并且利用细胞的内源机制去通过同源性定向修复(HDR)或通过非同源末端连接(NHEJ)来修复所诱导的断裂。
在一些实施方案中，所述Cas核酸酶具有DNA切割活性。所述Cas核酸酶可以指引在靶DNA序列中的某个位置处的一条或两条链的切割。例如，所述Cas核酸酶可以是具有一个或多个失活的催化结构域的切口酶，其切割靶DNA序列的单链。
Cas核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物、其变体、其突变体和其衍生物。存在三种主要的Cas核酸酶类型(I型、II型和III型)，和10种亚型，包括5种I型、3种II型和2种III型蛋白质(参见例如，Hochstrasser和Doudna,Trends BiochemSci,2015:40(1):58-66)。II型Cas核酸酶包括Cas1、Cas2、Csn2和Cas9。这些Cas核酸酶是本领域技术人员已知的。例如，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)野生型Cas9多肽的氨基酸序列例如在NBCI参考序列编号NP_269215中阐明，和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)野生型Cas9多肽的氨基酸序列例如在NBCI参考序列编号WP_011681470中阐明。在本发明中有用的CRISPR-相关核酸内切酶公开在例如美国申请公开号2014/0068797、2014/0302563和2014/0356959中。
Cas核酸酶，例如Cas9多肽，可以源自各种各样的细菌物种，包括但不限于非典型韦荣氏球菌(Veillonella atypical)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、龈沟产线菌(Filifactor alocis)、穆尔氏单杆菌(Solobacterium moorei)、尖锐粪球菌(Coprococcus catus)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、杜尔登氏嗜胨菌(Peptoniphilus duerdenii)、三冈氏链杆菌(Catenibacterium mitsuokai)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、无害利斯特氏菌(Listeria innocua)、假中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)、肠氨基酸球菌(Acidaminococcus intestine)、齿龈奥尔森氏菌(Olsenella uli)、北原氏酒球菌(Oenococcus kitaharae)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、大芬戈尔德氏菌(Finegoldia magna)、运动枝原体(Mycoplasma mobile)、鸡败血枝原体(Mycoplasma gallisepticum)、羊肺炎枝原体(Mycoplasma ovipneumoniae)、犬枝原体(Mycoplasma canis)、关节液枝原体(Mycoplasmasynoviae)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、长真杆菌(Eubacterium dolichum)、棒状乳杆菌极曲亚种(Lactobacilluscoryniformis subsp.Torquens)、多养型泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、嗜粘蛋白阿克曼斯氏菌(Akkermansia muciniphila)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)、微小难捉微菌(Elusimicrobium minutum)、盐水硝酸盐还原菌(Nitratifractor salsuginis)、球状发丝圆形菌(Sphaerochaeta globus)、产琥珀酸丝状杆菌产琥珀酸亚种(Fibrobactersuccinogenes subsp.Succinogenes)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、闪烁普雷沃氏菌(Prevotella micans)、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、少食胺单胞菌(Aminomonaspaucivorans)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、待定的海粉红螺菌(CandidatusPuniceispirillum marinum)、红纹蚯蚓蚓肾杆菌(Verminephrobacter eiseniae)、蒲桃罗尔斯通氏菌(Ralstonia syzygii)、芝氏沟鞭藻源玫瑰杆菌(Dinoroseobacter shibae)、固氮螺菌属(Azospirillum)、汉堡硝化杆菌(Nitrobacter hamburgensis)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、产琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes)、空肠弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacter jejuni subsp.Jejuni)、鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、Acidovorax ebreus、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、食洗涤化学品小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、肠罗斯伯里氏菌(Roseburia intestinalis)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、多杀巴斯德氏菌多杀亚种(Pasteurella multocida subsp.Multocida)、沃兹沃思厌氧生物实验室萨特氏菌(Sutterella wadsworthensis)、变形菌(proteobacterium)、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、人粪副萨特氏菌(Parasutterella excrementihominis)、产琥珀酸沃林氏菌和新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)。
“Cas9”是指RNA-指导的双链DNA结合性核酸酶蛋白或切口酶蛋白。野生型Cas9核酸酶具有两个功能结构域，例如RuvC和HNH，其切割不同的DNA链。Cas9可以在基因组DNA(靶DNA)中诱导双链断裂，当这两个功能结构域都有活性时。所述Cas9酶可以包含源自属于由下列各项组成的组的细菌的Cas9蛋白的一个或多个催化结构域：棒杆菌属(Corynebacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、军团菌属(Legionella)、密螺旋体属(Treponema)、产线菌属(Filifactor)、真杆菌属(Eubacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、枝原体属(Mycoplasma)、拟杆菌属(Bacteroides)、Flaviivola、黄杆菌属(Flavobacterium)、发丝圆形菌属(Sphaerochaeta)、固氮螺菌属(Azospirillum)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、硝酸盐还原菌属(Nitratifractor)和弯曲杆菌属(Campylobacter)。在一些实施方案中，所述Cas9是融合蛋白质，例如，所述两个催化结构域源自不同的细菌物种。
Cas9核酸酶的有用的变体可以包括单一的无活性催化结构域，例如RuvC-或HNH-酶或者切口酶。Cas9切口酶仅具有一个有活性的功能结构域，并且可以仅切割靶DNA的一条链，由此产生单链断裂或切口。在一些实施方案中，具有至少D10A突变的突变型Cas9核酸酶为Cas9切口酶。在其他实施方案中，具有至少H840A突变的突变型Cas9核酸酶为Cas9切口酶。在Cas9切口酶中存在的突变的其他实例包括但不限于N854A和N863A。双链断裂可以通过使用Cas9切口酶来引入，如果使用至少两种靶向相反的DNA链的DNA靶向性RNA。双切口的所诱导的双链断裂可以通过NHEJ或HDR来进行修复(Ran等人,2013,Cell,154:1380-1389)。该基因编辑策略偏爱HDR，并且降低在脱靶DNA位点处的indel突变的频率。Cas9核酸酶或切口酶的非限制性实例描述在例如美国专利号8,895,308、8,889,418和8,865,406以及美国申请公开号2014/0356959、2014/0273226和2014/0186919中。可以为了靶细胞或靶生物体而对所述Cas9核酸酶或切口酶进行密码子优化。
在一些实施方案中，所述Cas核酸酶可以是包含RuvC1和HNH核酸酶结构域的两个沉默突变(D10A和H840A)的Cas9多肽，其被称为dCas9(Jinek等人,Science,2012,337:816-821；Qi等人,Cell,152(5):1173-1183)。在一个实施方案中，来自酿脓链球菌的dCas9多肽在位置D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、A987或其任何组合处包含至少一个突变。此类dCas9多肽和其变体的描述提供在例如国际专利公开号WO2013/176772中。所述dCas9酶可以包含在D10、E762、H983或D986处的突变，以及在H840或N863处的突变。在一些情况下，所述dCas9酶包含D10A或D10N突变。此外，所述dCas9酶可以包括H840A、H840Y或H840N。在一些实施方案中，本发明的dCas9酶包含D10A和H840A；D10A和H840Y；D10A和H840N；D10N和H840A；D10N和H840Y；或D10N和H840N置换。所述置换可以是保守的或非保守的置换以使得所述Cas9多肽是在催化上无活性的并且能够与靶DNA相结合。
对于基因组编辑方法，所述Cas核酸酶可以是Cas9融合蛋白，例如包含与dCas9相连接的IIS型限制酶FokI的催化结构域的多肽。所述FokI-dCas9融合蛋白(fCas9)可以使用两种指导RNA来与靶DNA的单链相结合以产生双链断裂。
在一些实施方案中，所述Cas核酸酶可以是具有减少的脱靶效应和稳健的中靶切割的高保真性或特异性增强型Cas9多肽变体。具有经改善的中靶特异性的Cas9多肽变体的非限制性实例包括描述在Slaymaker等人,Science,351(6268):84-8(2016)中的SpCas9(K855A)、SpCas9(K810A/K1003A/R1060A)[也称为eSpCas9(1.0)]和SpCas9(K848A/K1003A/R1060A)[也称为eSpCas9(1.1)]变体，和描述在Kleinstiver等人,Nature,529(7587):490-5(2016)中的SpCas9变体，其包含下列突变中的一个、两个、三个或四个：N497A、R661A、Q695A和Q926A(例如，SpCas9-HF1包含所有四个突变)。
2.锌指核酸酶(ZFN)
“锌指核酸酶”或“ZFN”是FokI的切割结构域与包含3个或更多个锌指基元的DNA识别结构域之间的融合物。两个独个ZFN以精确的方向和间距在DNA中的特定位置处的异二聚体化导致在该DNA中的双链断裂。在一些情况下，ZFN将切割结构域融合至每个锌指结构域的C-末端。为了允许这两个切割结构域二聚体化并切割DNA，这两个独个ZFN结合DNA的相反链，其中它们的C-末端相隔一定的距离。在一些情况下，在锌指结构域和切割结构域之间的连接体序列需要每个结合位点的5’边缘被分隔开大约5-7bp。在本发明中有用的示例性ZFN包括但不限于描述在Urnov等人,Nature Reviews Genetics,2010,11:636-646；Gaj等人,Nat Methods,2012,9(8):805-7；美国专利号6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185、6,479,626；以及美国申请公开号2003/0232410和2009/0203140中的那些。
ZFN可以在靶DNA中产生双链断裂，这导致DNA断裂修复，其允许引入基因修饰。DNA断裂修复可以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)而发生。在HDR中，可以提供包含位于靶DNA的位点侧翼的同源性臂的供者DNA修复模板。
在一些实施方案中，ZFN为锌指切口酶，其可以是经改造的ZFN，其诱导位点特异性单链DNA断裂或切口，如此导致HDR。锌指切口酶的描述见于例如Ramirez等人,Nucl AcidsRes,2012,40(12):5560-8；Kim等人,GenomeRes,2012,22(7):1327-33。
3.TALEN
“TALEN”或“TAL-效应子核酸酶”是经改造的转录激活因子样效应子核酸酶，其包含DNA结合性串联重复的中心结构域、核定位信号和C-末端转录激活结构域。在一些情况下，DNA结合性串联重复包含33-35个氨基酸的长度，并且在位置12和13处包含两个高变氨基酸残基，其可以识别一个或多个特异的DNA碱基对。TALEN可以通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域相融合来产生。例如，可以将TALE蛋白与核酸酶例如野生型或经突变的FokI核酸内切酶或者FokI的催化结构域相融合。已产生了几个对于FokI的突变以用于将其用在TALEN中，它们例如改善了切割特异性或活性。可以改造此类TALEN以结合任何所希望的DNA序列。
TALEN可以用于通过在靶DNA序列中产生双链断裂(其接着经历NHEJ或HDR)来产生基因修饰。在一些情况下，提供单链供者DNA修复模板以促进HDR。
TALEN和其用于基因编辑的用途的详细描述见于例如美国专利号8,440,431、8,440,432、8,450,471、8,586,363和8,697,853；Scharenberg等人,Curr Gene Ther,2013,13(4):291-303；Gaj等人,Nat Methods,2012,9(8):805-7；Beurdeley等人,Nat Commun,2013,4:1762；和Joung和Sander,Nat Rev Mol Cell Biol,2013,14(1):49-55。
4.兆碱基大范围核酸酶
“兆碱基大范围核酸酶”是切点罕见核酸内切酶或归巢核酸内切酶，其可以是高度特异性的，识别长度从至少12个碱基对开始变动，例如长度从12至40个碱基对或从12至60个碱基对进行变动的DNA靶位点。兆碱基大范围核酸酶可以是模块式DNA结合性核酸酶，例如任何这样的融合蛋白，其包含至少一个核酸内切酶催化结构域和至少一个DNA结合结构域或指定核酸靶序列的蛋白质。所述DNA结合结构域可以包含至少一个识别单链或双链DNA的基元。所述兆碱基大范围核酸酶可以是单体的或二聚体的。
在一些情况下，所述兆碱基大范围核酸酶是天然出现的(在自然界中发现的)或野生型的；和在其他情况下，所述兆碱基大范围核酸酶是非天然的、人工的、经改造的、合成的、经合理设计的或人造的。在某些实施方案中，本发明的兆碱基大范围核酸酶包括I-CreI兆碱基大范围核酸酶、I-CeuI兆碱基大范围核酸酶、I-MsoI兆碱基大范围核酸酶、I-SceI兆碱基大范围核酸酶、其变体、其突变体和其衍生物。
有用的兆碱基大范围核酸酶和其在基因编辑中的应用的详细描述见于例如Silva等人,Curr Gene Ther,2011,11(1):11-27；Zaslavoskiy等人,BMC Bioinformatics,2014,15:191；Takeuchi等人,Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(11):4061-4066；和美国专利号7,842,489、7,897,372、8,021,867、8,163,514、8,133,697、8,021,867、8,119,361、8,119,381、8,124,36和8,129,134。
B.用于HDR的供者模板
在本文中提供了供者模板(例如，重组供者修复模板)，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；和(ii)两个位于所述转基因盒侧翼并且在DNA核酸酶(例如，Cas9核酸酶)切割位点的任一侧处与安全港基因的部分同源的同源性臂。所述供者模板可以进一步包含可选择性标志物、可检测性标志物和/或纯化标志物。
在一些实施方案中，所述同源性臂具有相同的长度。在其他实施方案中，所述同源性臂具有不同的长度。所述同源性臂可以为至少大约10个碱基对(bp)，例如，至少大约10bp、15bp、20bp、25bp、30bp、35bp、45bp、55bp、65bp、75bp、85bp、95bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、950bp、1000bp、1.1千碱基(kb)、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2.0kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3.0kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4.0kb或更长。所述同源性臂可以为大约10bp至大约4kb，例如，大约10bp至大约20bp，大约10bp至大约50bp，大约10bp至大约100bp，大约10bp至大约200bp，大约10bp至大约500bp，大约10bp至大约1kb，大约10bp至大约2kb，大约10bp至大约4kb，大约100bp至大约200bp，大约100bp至大约500bp，大约100bp至大约1kb，大约100bp至大约2kb，大约100bp至大约4kb，大约500bp至大约1kb，大约500bp至大约2kb，大约500bp至大约4kb，大约1kb至大约2kb，大约1kb至大约2kb，大约1kb至大约4kb，或大约2kb至大约4kb。
可以将所述供者模板克隆到表达载体中。可以使用对于本领域普通技术人员来说已知的常规的基于病毒或非病毒的表达载体。
C.DNA靶向性RNA
在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括向人神经干细胞中引入指导核酸，例如DNA靶向性RNA(例如，单一指导RNA(sgRNA)或双指导核酸)，或者编码所述指导核酸(例如，DNA靶向性RNA)的核苷酸序列。
所述DNA靶向性RNA(例如，sgRNA)可以包含与靶DNA内的特定序列(例如指导序列)互补的第一核苷酸序列，和含有与DNA核酸酶(例如，Cas9核酸酶)或其变体相互作用的蛋白质结合序列(支架序列或tracrRNA)的第二核苷酸序列。DNA靶向性RNA的指导序列(“第一核苷酸序列”)可以在5’末端处包含大约10至大约2000个核酸，例如，大约10至大约100个核酸，大约10至大约500个核酸，大约10至大约1000个核酸，大约10至大约1500个核酸，大约10至大约2000个核酸，大约50至大约100个核酸，大约50至大约500个核酸，大约50至大约1000个核酸，大约50至大约1500个核酸，大约50至大约2000个核酸，大约100至大约500个核酸，大约100至大约1000个核酸，大约100至大约1500个核酸，大约100至大约2000个核酸，大约500至大约1000个核酸，大约500至大约1500个核酸，大约500至大约2000个核酸，大约1000至大约1500个核酸，大约1000至大约2000个核酸，或1500至大约2000个核酸，其可以通过使用RNA-DNA互补性碱基配对来指引DNA核酸酶(例如，Cas9核酸酶)至靶DNA位点(例如，安全港基因序列)。在一些实施方案中，DNA靶向性RNA的指导序列在5’末端处包含大约100个核酸，其可以通过使用RNA-DNA互补性碱基配对来指引DNA核酸酶(例如，Cas9核酸酶)至靶DNA位点(例如，安全港基因序列)。在一些实施方案中，所述指导序列在5’末端处包含20个核酸，其可以通过使用RNA-DNA互补性碱基配对来指引DNA核酸酶(例如，Cas9核酸酶)至靶DNA位点(例如，安全港基因序列)。在其他实施方案中，所述指导序列包含少于20个，例如19、18、17、16、15或更少个与靶DNA位点(例如，安全港基因序列)互补的核酸。所述指导序列可以包括17个核酸，其可以指引DNA核酸酶(例如，Cas9核酸酶)至靶DNA位点(例如，安全港基因序列)。在一些情况下，所述指导序列在靶向区的5’末端处在互补性区域中包含大约1至大约10个核酸错配。在其他情况下，所述指导序列在靶向区的3’末端处在最后大约5至大约12个核酸处在互补性区域中不包含错配。
DNA靶向性RNA的蛋白质结合性支架序列(“第二核苷酸序列”)可以包含两个互补的核苷酸序列段，其相互杂交以形成双链RNA双链体(dsRNA双链体)。所述蛋白质结合性支架序列可以为大约30个核酸至大约200个核酸，例如，大约40个核酸至大约200个核酸，大约50个核酸至大约200个核酸，大约60个核酸至大约200个核酸，大约70个核酸至大约200个核酸，大约80个核酸至大约200个核酸，大约90个核酸至大约200个核酸，大约100个核酸至大约200个核酸，大约110个核酸至大约200个核酸，大约120个核酸至大约200个核酸，大约130个核酸至大约200个核酸，大约140个核酸至大约200个核酸，大约150个核酸至大约200个核酸，大约160个核酸至大约200个核酸，大约170个核酸至大约200个核酸，大约180个核酸至大约200个核酸，或大约190个核酸至大约200个核酸。在某些方面，所述蛋白质结合序列可以为大约30个核酸至大约190个核酸，例如，大约30个核酸至大约180个核酸，大约30个核酸至大约170个核酸，大约30个核酸至大约160个核酸，大约30个核酸至大约150个核酸，大约30个核酸至大约140个核酸，大约30个核酸至大约130个核酸，大约30个核酸至大约120个核酸，大约30个核酸至大约110个核酸，大约30个核酸至大约100个核酸，大约30个核酸至大约90个核酸，大约30个核酸至大约80个核酸，大约30个核酸至大约70个核酸，大约30个核酸至大约60个核酸，大约30个核酸至大约50个核酸，或大约30个核酸至大约40个核酸。
在一些实施方案中，所述DNA靶向性RNA(例如，sgRNA)是其经截短的形式，其包含具有更短的与靶DNA序列的互补性区(例如，长度少于20个核苷酸)的指导序列。在某些情况下，所述经截短的DNA靶向性RNA(例如，sgRNA)通过减少脱靶效应而提供经改善的DNA核酸酶(例如，Cas9核酸酶)特异性。例如，经截短的sgRNA可以包含具有17、18或19个与靶DNA序列的互补核苷酸(例如，17-18、17-19或18-19个互补核苷酸)的指导序列。参加例如，Fu等人,Nat.Biotechnol.,32(3):279-284(2014)。
所述DNA靶向性RNA可以通过使用上面所描述的基于网络的软件中的任一个来进行选择。作为非限制性的实例，关于选择DNA靶向性RNA的考虑可以包括关于待使用的Cas9核酸酶的PAM序列，和用于使脱靶修饰最小化的策略。工具，例如CRISPR Design Tool，可以提供用于制备DNA靶向性RNA、用于评估靶标修饰效率和/和用于评估在脱靶位点处的切割的序列。
所述DNA靶向性RNA可以通过本领域中普通技术人员已知的任何方法来产生。在一些实施方案中，将编码所述DNA靶向性RNA的核苷酸序列克隆到表达盒或表达载体中。在某些实施方案中，所述核苷酸序列通过PCR来产生并被包含在表达盒中。例如，可以PCR扩增编码所述DNA靶向性RNA的核苷酸序列并将其附加至启动子序列，例如U6RNA聚合酶III启动子序列。在其他实施方案中，将编码所述DNA靶向性RNA的核苷酸序列克隆到包含启动子(例如U6RNA聚合酶III启动子序列)和转录控制元件、增强子、U6终止序列、一个或多个核定位信号等的表达载体中。在一些实施方案中，所述表达载体是多顺反子或双顺反子的，并且还可以包括编码荧光蛋白、表位标签和/或抗生素抗性标志物的核苷酸序列。在双顺反子表达载体的某些情况下，通过使用编码自切割肽(例如病毒2A肽)的序列来将编码例如荧光蛋白的第一核苷酸序列连接至编码例如抗生素抗性标志物的第二核苷酸序列。病毒2A肽(包括口蹄疫病毒2A(F2A)、马鼻炎A病毒2A(E2A)、猪捷申病毒-1 2A(P2A)和明脉扁刺蛾(Thoseaasigna)病毒2A(T2A))具有高的切割效率，从而使得可以从相同的RNA转录物上同时地然而分开地表达两种蛋白质。
用于表达所述DNA靶向性RNA的合适的表达载体是从Addgene、Sigma-Aldrich和Life Technologies商购可得的。所述表达载体可以是包括荧光蛋白mCherry的pLQ1651(Addgene目录号51024)。其他表达载体的非限制性实例包括pX330、pSpCas9、pSpCas9n、pSpCas9-2A-Puro、pSpCas9-2A-GFP、pSpCas9n-2A-Puro、CRISPR NucleaseOFP载体、CRISPR Nuclease OFP载体等。
在某些实施方案中，所述DNA靶向性RNA(例如，sgRNA)是化学合成的。DNA靶向性RNA可以通过使用经2’-O-硫羰基氨基甲酸酯保护的核苷亚磷酰胺来合成。方法描述在例如Dellinger等人,J.American Chemical Society 133,11540-11556(2011)；Threlfall等人,Organic&Biomolecular Chemistry 10,746-754(2012)；和Dellinger等人,J.AmericanChemical Society 125,940-950(2003)中。
在特别的实施方案中，所述DNA靶向性RNA(例如，sgRNA)是经化学修饰的。作为非限制性的实例，所述DNA靶向性RNA是经修饰的sgRNA，其包含与安全港基因序列的一部分互补的第一核苷酸序列(例如，指导序列或crRNA)和与Cas多肽相互作用的第二核苷酸序列(例如，支架序列或tracrRNA)。
不被任何特定的理论所束缚，当用于基于CRISPR的基因组编辑(例如同源重组)时，包含一个或多个化学修饰的sgRNA相比于相应的未修饰的sgRNA而言可以增加经修饰的sgRNA的活性、稳定性和特异性和/或降低其毒性。经修饰的sgRNA的非限制性优点包括更大的递送入靶细胞中的轻易性、增加的稳定性、增加的活性持续时间和减小的毒性。作为CRISPR/Cas9系统的一部分的在本文中所描述的经修饰的sgRNA提供了相比于其未修饰的序列等价物而言更高的中靶基因组编辑(例如，同源重组)的频率，经改善的活性和/或特异性。
所述指导序列的一个或多个核苷酸和/或所述支架序列的一个或多个核苷酸可以是经修饰的核苷酸。例如，长度为大约20个核苷酸的指导序列可以具有1个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个经修饰的核苷酸。在一些情况下，所述指导序列包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个经修饰的核苷酸。在其他情况下，所述指导序列包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20或更多个经修饰的核苷酸。所述经修饰的核苷酸可以位于所述指导序列的任何核酸位置处。换言之，所述经修饰的核苷酸可以在所述指导序列的第一个和/或最后一个核苷酸处或附近，和/或在中间的任何位置处。例如，对于长度为20个核苷酸的指导序列，所述一个或多个经修饰的核苷酸可以位于所述指导序列的核酸位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19和/或位置20处。在某些情况下，所述指导序列的大约10％至大约30％，例如，大约10％至大约25％，大约10％至大约20％，大约10％至大约15％，大约15％至大约30％，大约20％至大约30％，或25％至大约30％可以包含经修饰的核苷酸。在其他情况下，所述指导序列的大约10％至大约30％，例如大约10％、大约11％、大约12％、大约13％、大约14％、大约15％、大约16％、大约17％、大约18％、大约19％、大约20％、大约21％、大约22％、大约23％、大约24％、大约25％、大约26％、大约27％、大约28％、大约29％或大约30％可以包含经修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，所述经修饰的核苷酸位于所述指导序列的5’-末端处(例如，在5’-末端处的末端核苷酸)或5’-末端附近(例如，在5’-末端处的末端核苷酸的1、2、3、4或5个核苷酸之内)，和/或位于所述指导序列之内的内部位置处。
在一些实施方案中，所述经修饰的sgRNA的支架序列包含一个或多个经修饰的核苷酸。例如，长度为大约80个核苷酸的支架序列可以具有1个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、76、77、78、79或80个经修饰的核苷酸。在一些情况下，所述支架序列包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个经修饰的核苷酸。在其他情况下，所述支架序列包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20或更多个经修饰的核苷酸。所述经修饰的核苷酸可以位于所述支架序列的任何核酸位置处。例如，所述经修饰的核苷酸可以在所述支架序列的第一个和/或最后一个核苷酸处或附近，和/或在中间的任何位置处。例如，对于长度为大约80个核苷酸的支架序列，所述一个或多个经修饰的核苷酸可以位于所述序列的核酸位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35、位置36、位置37、位置38、位置39、位置40、位置41、位置42、位置43、位置44、位置45、位置46、位置47、位置48、位置49、位置50、位置51、位置52、位置53、位置54、位置55、位置56、位置57、位置58、位置59、位置60、位置61、位置62、位置63、位置64、位置65、位置66、位置67、位置68、位置69、位置70、位置71、位置72、位置73、位置74、位置75、位置76、位置77、位置78、位置79和/或位置80处。在一些情况下，所述支架序列的大约1％至大约10％，例如，大约1％至大约8％，大约1％至大约5％，大约5％至大约10％，或大约3％至大约7％可以包含经修饰的核苷酸。在其他情况下，所述支架序列的大约1％至大约10％，例如大约1％、大约2％、大约3％、大约4％、大约5％、大约6％、大约7％、大约8％、大约9％或大约10％可以包含经修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，所述经修饰的核苷酸位于所述支架序列的3’-末端处(例如，在3’-末端处的末端核苷酸)或3’-末端附近(例如，在3’-末端的1、2、3、4或5个核苷酸之内)，和/或位于所述支架序列之内的内部位置处。
在一些实施方案中，所述经修饰的sgRNA包含一个、两个或三个从所述指导序列的5’-末端处(例如，在5’-末端处的末端核苷酸)或5’-末端附近(例如，在5’-末端处的末端核苷酸的1、2、3、4或5个核苷酸之内)开始的连续或不连续的经修饰的核苷酸，和一个、两个或三个从所述支架序列的3’-末端处(例如，在3’-末端处的末端核苷酸)或3’-末端附近(例如，在3’-末端的1、2、3、4或5个核苷酸之内)开始的连续或不连续的经修饰的核苷酸。
在一些情况下，所述经修饰的sgRNA包含一个在所述指导序列的5’-末端处(例如，在5’-末端处的末端核苷酸)或5’-末端附近(例如，在5’-末端处的末端核苷酸的1、2、3、4或5个核苷酸之内)的经修饰的核苷酸，和一个在所述支架序列的3’-末端处(例如，在3’-末端处的末端核苷酸)或3’-末端附近(例如，在3’-末端的1、2、3、4或5个核苷酸之内)的经修饰的核苷酸。
在其他情况下，所述经修饰的sgRNA包含两个从所述指导序列的5’-末端处(例如，在5’-末端处的末端核苷酸)或5’-末端附近(例如，在5’-末端处的末端核苷酸的1、2、3、4或5个核苷酸之内)开始的连续或不连续的经修饰的核苷酸，和两个从所述支架序列的3’-末端处(例如，在3’-末端处的末端核苷酸)或3’-末端附近(例如，在3’-末端的1、2、3、4或5个核苷酸之内)开始的连续或不连续的经修饰的核苷酸。
在另外其他情况下，所述经修饰的sgRNA包含三个从所述指导序列的5’-末端处(例如，在5’-末端处的末端核苷酸)或5’-末端附近(例如，在5’-末端处的末端核苷酸的1、2、3、4或5个核苷酸之内)开始的连续或不连续的经修饰的核苷酸，和三个从所述支架序列的3’-末端处(例如，在3’-末端处的末端核苷酸)或3’-末端附近(例如，在3’-末端的1、2、3、4或5个核苷酸之内)开始的连续或不连续的经修饰的核苷酸。
在特别的实施方案中，所述经修饰的sgRNA包含三个在所述指导序列的5’-末端处的连续的经修饰的核苷酸，和三个在所述支架序列的3’-末端处的连续的经修饰的核苷酸。
所述sgRNA的经修饰的核苷酸可以包括在核糖(例如，糖)基团、磷酸酯基团、核碱基或其任何组合中的修饰。在一些实施方案中，所述在核糖基团中的修饰包含在核糖的2’位置处的修饰。
在一些实施方案中，所述经修饰的核苷酸包括2’氟-阿糖核酸、三环-DNA(tc-DNA)、肽核酸、环己烯核酸(CeNA)、锁定核酸(LNA)、乙烯桥连核酸(ENA)、二氨基磷酸酯吗啉代或其组合。
经修饰的核苷酸或核苷酸类似物可以包括糖经修饰的和/或主链经修饰的核糖核苷酸(即，包括对于磷酸-糖主链的修饰)。例如，可以修饰天然或自然RNA的磷酸二酯键以包括氮或硫杂原子中的至少一个。在一些主链经修饰的核糖核苷酸中，与邻接核糖核苷酸相连接的磷酸酯基团可以被经修饰的基团，例如硫代磷酸酯基团替换。在优选的糖经修饰的核糖核苷酸中，2’部分为选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或ON的基团，其中R为C1-C6烷基、烯基或炔基，并且卤素为F、Cl、Br或I。
在一些实施方案中，所述经修饰的核苷酸包含糖修饰。糖修饰的非限制性实例包括：2′-脱氧-2′-氟-寡核糖核苷酸(2′-氟-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸、2′-氟-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸)、2′-脱氧-2′-脱氨寡核糖核苷酸(2′-氨基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸、2′-氨基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸)、2′-O-烷基寡核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-C-烷基寡核糖核苷酸(2′-O-甲基胞苷-5′-三磷酸、2′-甲基尿苷-5′-三磷酸)、2′-C-烷基寡核糖核苷酸和其异构体(2′-阿糖胞苷-5′-三磷酸、2′-阿糖尿苷-5′-三磷酸)、叠氮基三磷酸(2′-叠氮基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸、2′-叠氮基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸)以及其组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的sgRNA包含一个或多个2'-氟、2'-氨基和/或2'-硫代修饰。在一些情况下，所述修饰为2'-氟-胞苷、2'-氟-尿苷、2'-氟-腺苷、2'-氟-鸟苷、2'-氨基-胞苷、2'-氨基-尿苷、2'-氨基-腺苷、2'-氨基-鸟苷、2,6-二氨基嘌呤、4-硫代尿苷、5-氨基-烯丙基-尿苷、5-溴-尿苷、5-碘-尿苷、5-甲基-胞苷、核糖胸苷、2-氨基嘌呤、2′-氨基-丁酰基-芘-尿苷、5-氟-胞苷和/或5-氟-尿苷。
存在有超过96种在哺乳动物RNA上发现的天然出现的核苷修饰。参见例如，Limbach等人,Nucleic Acids Research,22(12):2183-2196(1994)。核苷酸和经修饰的核苷酸和核苷的制备是本领域中众所周知的，例如从美国专利号4,373,071、4,458,066、4,500,707、4,668,777、4,973,679、5,047,524、5,132,418、5,153,319、5,262,530和5,700,642中。众多适合于用于在本文中所描述的用途的经修饰的核苷和经修饰的核苷酸是商购可得的。所述核苷可以是天然出现的核苷的类似物。在一些情况下，所述类似物为二氢尿苷、甲基腺苷、甲基胞苷、甲基尿苷、甲基假尿苷、硫代尿苷、脱氧胞苷和脱氧尿苷。
在一些情况下，在本文中所描述的经修饰的sgRNA包括核碱基经修饰的核糖核苷酸，即包含至少一个非天然出现的核碱基而不是天然出现的核碱基的核糖核苷酸。可以掺入到经修饰的核苷和经修饰的核苷酸中的经修饰的核碱基的非限制性实例包括：m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5-甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2-硫代尿苷)、Um(2′-O-甲基尿苷)、m1A(1-甲基腺苷)、m2A(2-甲基腺苷)、Am(2-1-O-甲基腺苷)、ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)、i6A(N6-异戊烯基腺苷)、ms2i6A(2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷)、io6A(N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷)、ms2io6A(2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷)、g6A(N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷)、t6A(N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷)、ms2t6A(2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷)、m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷)、hn6A(N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基腺苷)、ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基腺苷)、Ar(p)(2′-O-核糖基腺苷(磷酸))、I(肌苷)、m11(1-甲基肌苷)、m′Im(1,2′-O-二甲基肌苷)、m3C(3-甲基胞苷)、Cm(2T-O-甲基胞苷)、s2C(2-硫代胞苷)、ac4C(N4-乙酰基胞苷)、f5C(5-甲酰基胞苷)、m5Cm(5,2-O-二甲基胞苷)、ac4Cm(N4-乙酰基-2T-O-甲基胞苷)、k2C(赖胞苷)、m1G(1-甲基鸟苷)、m2G(N2-甲基鸟苷)、m7G(7-甲基鸟苷)、Gm(2′-O-甲基鸟苷)、m22G(N2,N2-二甲基鸟苷)、m2Gm(N2,2′-O-二甲基鸟苷)、m22Gm(N2,N2,2′-O-三甲基鸟苷)、Gr(p)(2′-O-核糖基鸟苷(磷酸))、yW(怀丁苷)、o2yW(过氧怀丁苷)、OHyW(羟基怀丁苷)、OHyW*(修饰不足的羟基怀丁苷)、imG(怀俄苷)、mimG(甲基鸟苷)、Q(辫苷)、oQ(环氧辫苷)、galQ(半乳糖基-辫苷)、manQ(甘露糖基-辫苷)、preQo(7-氰基-7-脱氮鸟苷)、preQi(7-氨甲基-7-脱氮鸟苷)、G(古嘌苷)、D(二氢尿苷)、m5Um(5,2′-O-二甲基尿苷)、s4U(4-硫代尿苷)、m5s2U(5-甲基-2-硫代尿苷)、s2Um(2-硫代-2′-O-甲基尿苷)、acp3U(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷)、ho5U(5-羟基尿苷)、mo5U(5-甲氧基尿苷)、cmo5U(尿苷5-羟基乙酸)、mcmo5U(尿苷5-羟基乙酸甲基酯)、chm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷)、mchm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷甲基酯)、mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)、mcm5Um(5-甲氧基羰基甲基-2-O-甲基尿苷)、mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷)、nm5s2U(5-氨甲基-2-硫代尿苷)、mnm5U(5-甲基氨甲基尿苷)、mnm5s2U(5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷)、mnm5se2U(5-甲基氨甲基-2-硒代尿苷)、ncm5U(5-氨甲酰基甲基尿苷)、ncm5Um(5-氨甲酰基甲基-2′-O-甲基尿苷)、cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)、cnmm5Um(5-羧甲基氨甲基-2-L-O-甲基尿苷)、cmnm5s2U(5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷)、m62A(N6,N6-二甲基腺苷)、Tm(2′-O-甲基肌苷)、m4C(N4-甲基胞苷)、m4Cm(N4,2-O-二甲基胞苷)、hm5C(5-羟甲基胞苷)、m3U(3-甲基尿苷)、cm5U(5-羧甲基尿苷)、m6Am(N6,T-O-二甲基腺苷)、m62Am(N6,N6,O-2-三甲基腺苷)、m2′7G(N2,7-二甲基鸟苷)、m2′2′7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)、m3Um(3,2T-O-二甲基尿苷)、m5D(5-甲基二氢尿苷)、f5Cm(5-甲酰基-2′-O-甲基胞苷)、m1Gm(1,2′-O-二甲基鸟苷)、m′Am(1,2-O-二甲基腺苷)、irino甲基尿苷)、tm5s2U(5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷)、imG-14(4-脱甲基鸟苷)、imG2(异鸟苷)、或ac6A(N6-乙酰基腺苷)、次黄嘌呤、肌苷、8-氧代-腺嘌呤、其7-取代的衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤、7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、经取代的7-脱氮嘌呤、7-脱氮-7-取代的嘌呤、7-脱氮-8-取代的嘌呤和其组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的sgRNA的磷酸酯主链被改变。所述经修饰的sgRNA可以包括一个或多个硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(例如，N3’-P5’-氨基磷酸酯(NP))、2’-O-甲氧基-乙基(2’MOE)、2’-O-甲基-乙基(2’ME)和/或甲基膦酸酯键。在某些情况下，磷酸酯基团变化为硫代磷酸酯、2’-O-甲氧基-乙基(2’MOE)、2’-O-甲基-乙基(2’ME)、N3’-P5’-氨基磷酸酯(NP)等。
在特别的实施方案中，所述经修饰的核苷酸包含2’-O-甲基核苷酸(M)、2’-O-甲基,3’-硫代磷酸酯核苷酸(MS)、2’-O-甲基,3’-硫代PACE核苷酸(MSP)或其组合。
在一些情况下，所述经修饰的sgRNA包括一个或多个MS核苷酸。在其他情况下，所述经修饰的sgRNA包括一个或多个MSP核苷酸。在另外其他情况下，所述经修饰的sgRNA包括一个或多个MS核苷酸和一个或多个MSP核苷酸。在进一步的情况下，所述经修饰的sgRNA不包括M核苷酸。在某些情况下，所述经修饰的sgRNA包括一个或多个MS核苷酸和/或一个或多个MSP核苷酸，并且进一步包括一个或多个M核苷酸。在某些其他情况下，MS核苷酸和/或MSP核苷酸是存在于所述经修饰的sgRNA中的唯一的经修饰的核苷酸。
应当注意的是，可以将在本文中所描述的修饰之中的任何修饰进行组合，并且将其掺入到所述经修饰的sgRNA的指导序列和/或支架序列中。
在一些情况下，所述经修饰的sgRNA还包括结构修饰例如茎环，例如M2茎环或四核苷酸环。
所述经化学修饰的sgRNA可以与任何CRISPR-相关的或RNA-指导的技术一起进行使用。如在本文中所描述的，所述经修饰的sgRNA可以充当关于任何Cas9多肽或其变体(包括任何经改造的或人造的Cas9多肽)的指导。所述经修饰的sgRNA可以在分离的细胞中或在体内(例如，在动物中)靶向DNA和/或RNA分子。
D.用于产生基因经修饰的神经干细胞的转基因盒
用于产生基因经修饰的神经干细胞的转基因盒可以是如在本文中关于本发明的任何方面所描述的。所述盒可以包含下列中的一个或多个：启动子，例如U6RNA聚合酶III启动子，转录控制元件，增强子，U6终止序列，一个或多个核定位信号等。在一些实施方案中，所述盒是多顺反子或双顺反子的，并且还可以包括编码荧光蛋白、表位标签和/或抗生素抗性标志物的核苷酸序列。在双顺反子盒的某些情况下，通过使用编码自切割肽(例如病毒2A肽)的序列来将编码例如荧光蛋白的第一核苷酸序列连接至编码例如抗生素抗性标志物的第二核苷酸序列。病毒2A肽(包括口蹄疫病毒2A(F2A)、马鼻炎A病毒2A(E2A)、猪捷申病毒-12A(P2A)和明脉扁刺蛾病毒2A(T2A))具有高的切割效率，从而使得可以从相同的RNA转录物上同时地然而分开地表达两种蛋白质。示例性的盒包括报道盒，其包含驱动GFP表达的泛素C启动子。备选地，已产生了通过自切割2A肽分隔开的双顺反子盒构建体，由此提供了在位于所述2A肽的上游和下游的两个转基因之间的高的切割效率。这些构建体包括：(1)UbC-GFP-2A-CD8(用于纯化经遗传修饰的人神经干细胞的CD8α细胞表面标志物)；(2)UbC-GFP-2A-tCD19(用于纯化经遗传修饰的人神经干细胞的经截短的细胞表面标志物)；(3)UbC-GalC-2A-tCD19(具有经截短的CD19的用于克拉伯病的治疗性酶构建体)或UbC-GalC-2A-eGFP；和(4)UbC-TPP1-2A-CD8(具有CD8α的用于LINCL的治疗性酶构建体)。
E.用于分离和纯化基因经修饰的神经干细胞的方法
可选择性标志物、可检测性标志物、细胞表面标志物和纯化标志物，单独地或相组合地，可以用于分离和/或纯化本发明的基因经修饰的人神经干细胞。例如，编码抗生素抗性因子的可选择性标志物基因的表达提供了在相应的抗生素存在下基因经修饰的细胞的优先存活，而在培养物中存在的其他细胞将会被选择性地杀死。备选地，荧光蛋白例如GFP的表达或者通常不在神经干细胞上表达的细胞表面标志物的表达可以允许基因经修饰的神经干细胞通过荧光激活细胞分选术(FACS)、磁性激活细胞分选术(MACS)或类似方法来进行鉴定、纯化或分离。在下面的实施例中所使用的合适的细胞表面标志物为CD8、经截短的CD8、CD19和经截短的CD19，虽然其他细胞表面标志物也可以满足相同的功能。
用于分离或纯化经遗传修饰的细胞的方法描述在本文中并且是本领域中已知的。在特别的实例中，将FACS或MACS方法用于表达细胞表面标志物CD8或CD19的人神经干细胞。
用于培养或扩展经遗传修饰的细胞的方法是本领域中已知的。用于培养神经干细胞和其子代的方法是已知的，并且合适的培养基、补充物、生长因子等是已知的和商购可得的。典型地，在无血清条件下维持和扩展人神经干细胞。一种合适的培养基为Ex Vivo 15(BioWhittaker)，其具有N2补充物(GIBCO)、成纤维细胞生长因子(20ng/ml)、表皮生长因子(20ng/ml)、淋巴细胞抑制因子(10ng/ml)、神经存活因子-1(Clonetics,San Diego)和N-乙酰半胱氨酸(60μg/ml；Sigma)。备选的培养基、补充物和生长因子和/或备选的浓度可以由技术人员容易地确定，并且广泛地描述在文献中。
在一些实施方案中，可以按照本领域普通技术人员已知的标准方法来在体外扩展经分离的或经纯化的、经遗传修饰的细胞。
F.将由核酸酶介导的基因组编辑的组分引入到细胞中
用于将多肽和核酸引入到靶细胞(宿主细胞)中的方法是本领域中已知的，并且任何已知的方法可以用于将核酸酶或核酸(例如，编码所述核酸酶的核苷酸序列、DNA靶向性RNA(例如，单一指导RNA)、用于同源性定向修复(HDR)的供者模板等)引入到人神经干细胞中。合适方法的非限制性实例包括电穿孔(例如、核转染)、病毒或噬菌体感染、转染、接合、原生质体融合、脂质转染、磷酸钙沉淀、由聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、由DEAE-葡聚糖介导的转染、由脂质体介导的转染、基因枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、由纳米颗粒介导的核酸递送等。
在一些实施方案中，将DNA核酸酶系统(例如CRISPR或TALEN)引入到神经干细胞中。在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9系统包含基于质粒的Cas9。在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9系统包含Cas9mRNA和sgRNA。在一些实施方案中，在被引入到神经干细胞中之前，修饰Cas9mRNA或者sgRNA或者Cas9mRNA和sgRNA两者。在一些实施方案中，所述核酸酶系统为TALEN系统。在一些实施方案中，所述TALEN系统包含基于质粒的TALEN。在一些实施方案中，所述TALEN系统包含基于RNA的TALEN。
在一些实施方案中，可以通过使用递送系统来将由核酸酶介导的基因组编辑的组分引入到靶细胞中。在某些情况下，所述递送系统包含纳米颗粒、微颗粒(例如，聚合物微聚合物(micropolymer))、脂质体、胶束、病毒体、病毒颗粒、核酸复合物、转染试剂、电穿孔试剂(例如，使用NEON转染系统)、核转染试剂、脂质转染试剂和/或缓冲系统，其包括核酸酶组分(作为多肽或者由表达构建体所编码)和一种或多种核酸组分例如DNA靶向性RNA和/或供者模板。例如，可以将所述组分与脂质转染试剂相混合，从而使得它们被包囊或包装入阳离子亚微米水包油乳状液中。备选地，可以不用递送系统，例如作为水溶液，来递送所述组分。
制备脂质体以及将多肽和核酸包囊在脂质体中的方法描述在例如Methods andProtocols,第1卷:Pharmaceutical Nanocarriers:Methods and Protocols.(编者:Weissig).Humana Press,2009和Heyes等人(2005)J Controlled Release 107:276-87中。制备微颗粒以及包囊多肽和核酸的方法描述在例如Functional Polymer Colloids andMicroparticles第4卷(Microspheres,microcapsules&liposomes)(编者:Arshady&Guyot).Citus Books,2002和Microparticulate Systems for the Delivery ofProteins and Vaccines.(编者Cohen&Bernstein).CRC Press,1996中。
G.人神经干细胞
人神经干细胞可以是通过使用在Uchida等人,Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(26):14720-14725中所描述的方法(其中细胞表面标志物用于分离CD133+CD24-/lo NSC)从人脑组织中直接分离出的神经干细胞，也可以使用其他标志物，包括CD49f、CD29和CD15。人神经干细胞可以源自妊娠中三月的人胎儿脑。原则上，任何在人神经干细胞上特异性地表达的标志物，或者人神经干细胞的特征性标志物的任何组合，可以在人神经干细胞的分离中使用。
人神经干细胞可以源自人胚胎、胎儿或成人来源，或者可以通过使用已知技术而源自其他细胞类型，包括胚胎干(ES)细胞和经诱导的多潜能干(iPS)细胞。人神经干细胞也可以通过直接重编程而源自体细胞群体，例如成纤维细胞。在一些实施方案中，人神经干细胞源自体干细胞或多潜能干细胞。人神经干细胞包括源自人中枢神经系统(包括胎儿脊髓和胎儿脑组织)的细胞。使用从供者获得的初级神经干细胞可以是优选的，以便提供立即适合于治疗CNS病症的和直接可移植至患者的CNS的细胞。
本发明的人神经干细胞可以是自体的或同种异体的人神经干细胞。自体干细胞源自待被治疗的患者，并因此将会预期不引起来自该患者的免疫反应。然而，除了任何根据本发明的进一步的修饰外，自体干细胞可能需要进行遗传修饰或矫正以消除内在的疾病或病症。相反地，可以分离出来自健康受试者的同种异体的(即源自供者的)细胞，并进行纯化以备使用，而无需除了由本发明所提供的修饰之外的其他修饰。此类同种异体的人神经干细胞可以根据本发明进行遗传修饰，并且通过使用大规模培养方法来进行扩展，以提供可以现成使用的经验证的、安全的且一致的产品，而无需昂贵的在个体基础上的细胞的从头衍化、修饰和扩展。此类同种异体细胞可以进行制备和存库，例如通过使用标准的冷冻保存方法，以在鉴定出合适的患者时提供即用型来源。
神经干细胞(NSC)可以直接源自胚胎、成人组织、胎儿组织、多能干细胞(multipotent stem cells)或多潜能干细胞(pluripotent stem cells)(包括胚胎干细胞(ESC)或经诱导的多潜能干细胞(iPSC))。在一些情况下，所述多潜能干细胞是野生型的或经遗传修饰的。
在一些实施方案中，所述NSC获自或源自受试者(例如人受试者)的神经系统的组织，并且在体外进行培养。所述神经组织可以是正常的或患病的。在一些实施方案中，所述神经组织获自具有中枢神经系统的遗传病症的个体。在其他实施方案中，所述神经组织来自具有或被怀疑具有神经变性疾病的个体。在另外其他实施方案中，所述神经组织来自具有或被怀疑具有神经病学损伤的个体。
在其他情况下，本发明的NSC来自对称地进行分裂的神经干细胞群体，其先前以培养物进行维持。
H.用于治疗CNS的遗传病症、神经变性疾病或神经损伤的转基因
在一些实施方案中，所述供者模板的转基因编码与中枢神经系统的遗传病症相关的蛋白质。所述遗传病症可以是常染色体隐性遗传病症，其可以通过作为转基因表达相应的突变型基因的野生型(正常的)等位基因来进行治疗。所述遗传病症由突变型基因引起，并且在本文中所描述的转基因可以用于治疗所述病症。在一些实施方案中，携带所述突变型基因的NSC可以进行遗传修饰，以经由所述转基因来表达所述突变型基因的野生型等位基因。典型地，所述转基因将会属于下列三种类别之一：(1)分泌型蛋白质；(2)细胞表面酶，例如金属内肽酶(例如，中性溶酶)，以切割或消化不想要的蛋白质和/或瘢痕组织；和(3)细胞内蛋白质，例如可调节的BCL2。
用于本文中的用途的示例性转基因包括GALC(克拉伯病)、ABCD1(肾上腺脑白质营养不良)、GFAP(亚历山大病)、CYP27A1(脑腱黄瘤病)、ARSA(异染色性脑白质营养不良)、PLP1(佩-梅病)、ASPA(卡纳万病)、EIF-2B(具有正在消失的白质的白质脑病)、PHYH(雷夫叙姆病1)、PEX7(雷夫叙姆病2)、PPT1(婴儿神经细胞蜡样质脂褐素病(NCL))、TPP1(晚期婴儿NCL)、CLN3(青少年NCL)、CLN6(成人NCL)、CLN5(芬兰晚期婴儿变异型NCL)、CLN6(晚期婴儿变异型NCL)、MSFD8(神经细胞蜡样质脂褐素病7)、CLN8(神经细胞蜡样质脂褐素病8)、CTSD(神经细胞蜡样质脂褐素病10)、UBE3A(安格尔曼综合征)、POLG(阿尔珀斯病)、TAZ(巴尔特综合征)、GLA(法布里病)、SLC20A2(法尔氏综合征)、PDE(色素性视网膜炎)、SMN1(脊髓性肌萎缩)、IKBKAP(家族性自主神经功能异常)、MeCP2(雷特综合征)、CACNA1C(蒂莫西综合征)、ATXN3(马-约病)、RPE65(莱伯先天性黑矇)、USH2A(色素性视网膜炎)、RPGR(色素性视网膜炎)、RP2(色素性视网膜炎)、ABCA4(施塔加特病)和RS-1(X连锁性视网膜襞裂症)。在一些实施方案中，所述蛋白质由所述经遗传修饰的人神经干细胞分泌。
I.中枢神经系统的遗传病症、神经变性疾病、神经病学损伤和视网膜变性疾病
在本文中所描述的疾病、病症和状况包括影响星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经胶质细胞、神经元、运动神经元、中间神经元、视网膜细胞等的那些。可以通过使用在本文中所描述的组合物、试剂盒和方法来进行治疗的此类神经病学疾病、病症和状况包括帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、记忆病症、癫痫、黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性)、色素性视网膜炎、莱伯先天性黑矇、视网膜病、视神经病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、髓鞘疾病、多发性硬化、中风、脑性瘫痪、遗传性小儿脑白质营养不良(包括佩-梅病、神经细胞蜡样质脂褐素病和克拉伯病)、异染色性脑白质营养不良、泰-萨克斯病、脊髓损伤或创伤。在本文中所描述的疾病、病症和状况还包括创伤性脑损伤、中枢神经系统(CNS)的急性炎症、CNS的慢性炎症、局部缺血和中风。在本文中所描述的疾病、病症和状况还包括视网膜变性疾病。
J.用于使用GM-NSC的方法
在本文中所描述的GM-NSC对于治疗疾病来说是有用的。在一些实施方案中，提供了治疗神经变性疾病的方法，其包括向受试者施用多个包含转基因的经遗传修饰的神经干细胞，其中所述转基因被插入到安全港座位中(例如，在本文中所描述的GM-NSC细胞中的任何)。
在本文中所描述的GM-NSC对于预防疾病来说是有用的。在一些实施方案中，提供了预防神经变性疾病的方法，其包括向受试者施用多个包含转基因的经遗传修饰的神经干细胞，其中所述转基因被插入到安全港座位中(例如，在本文中所描述的GM-NSC细胞中的任何)。
可以向人受试者中施用所述经遗传修饰的人神经干细胞以防止或减轻神经变性疾病或神经病学损伤的一个或多个症状。在一些实施方案中，可以向人受试者施用所产生的经遗传修饰的神经干细胞以防止或减轻神经变性疾病的一个或多个症状，其中所述神经变性疾病选自由下列各项组成的组：脑白质营养不良、神经细胞蜡样质脂褐素病、年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化和视网膜变性疾病。
在本文中所描述的神经变性疾病或神经病学损伤包括影响星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经胶质细胞、神经元、运动神经元、中间神经元、视网膜细胞等的那些。此类神经变性疾病或神经病学损伤包括帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、记忆病症、癫痫、黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性)、色素性视网膜炎、莱伯先天性黑矇、视网膜病、视神经病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、髓鞘疾病、多发性硬化、中风、脑性瘫痪、遗传性小儿脑白质营养不良(包括佩-梅病、神经细胞蜡样质脂褐素病和克拉伯病)、异染色性脑白质营养不良、泰-萨克斯病、脊髓损伤或创伤。在本文中所描述的神经变性疾病或神经病学损伤还包括创伤性脑损伤、中枢神经系统(CNS)的急性炎症、CNS的慢性炎症、局部缺血和中风。在本文中所描述的神经变性疾病或神经病学损伤还包括视网膜变性疾病。
在一些实施方案中，所述转基因编码从由下列各项组成的组中选择的神经保护性或神经再生性蛋白质：脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、胰岛素样生长因子2(IGF2)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-2(NT-2)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)、神经营养蛋白-6、保守型多巴胺神经营养因子(CDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、集落刺激因子(CSF)、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、neurturin、persephin、artemin、神经肽Y(NPY)、肝配蛋白、脑信号蛋白、其他神经生成因子、其他神经营养因子和其组合。在一些实施方案中，所述转基因编码神经保护性或神经再生性蛋白质，其中所述神经保护性或神经再生性蛋白质为分泌型蛋白质。在一些实施方案中，所述转基因编码Bcl-2。在一些实施方案中，所述转基因编码端粒酶。在一些实施方案中，所述转基因编码这样的蛋白质，其可以改善存活或使神经干细胞恢复活力以便利于长期存活和/或治疗性分子的发现。
在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞源自待治疗或施用的相同的受试者。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的神经干细胞源自另一个(或另一些)受试者。例如，可以将来自健康受试者的同种异体的(即源自供者的)细胞进行遗传修饰，并施用到患者受试者中。
在一些实施方案中，提供了治疗神经变性疾病的方法，其包括：1)从多名受试者中分离同种异体的人神经干细胞；2)通过将转基因插入到安全港座位中来遗传修饰分离的人神经干细胞；3)扩展经遗传修饰的分离的人神经干细胞；4)向受试者施用多个所述经遗传修饰的神经干细胞。在一些实施方案中，此类同种异体的人神经干细胞可以根据本发明进行遗传修饰，并且通过使用大规模培养方法来进行扩展，以提供可以现成使用的经验证的、安全的且一致的产品，而无需昂贵的在个体基础上的细胞的从头衍化、修饰和扩展。在一些实施方案中，此类同种异体细胞可以进行制备和存库，例如通过使用标准的冷冻保存方法，以在鉴定出合适的患者时提供即用型来源。
在一些实施方案中，提供了治疗神经变性疾病的方法，其包括：1)从患者中分离人神经干细胞；2)通过将转基因插入到安全港座位中来遗传修饰分离的人神经干细胞；3)向所述患者施用多个所述经遗传修饰的神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用到所述患者中之前扩展经遗传修饰的分离的人神经干细胞。
所施用的经遗传修饰的神经干细胞的数目和施用途径依赖于不同的疾病靶标而变动。例如，为了治疗神经细胞蜡样质脂褐素病(NCL)，典型地，以直接注射到脑(即皮层下位点或侧脑室)中来施用5-10亿个神经干细胞。关于另外的细节，参见Selden等人,JNeurosurg Pediatr.2013Jun,11(6):643-52。再举一个例子，为了治疗佩-梅病(PMD)，以直接注射到脑中来施用3亿个神经干细胞。关于更多细节，参见Gupta等人,Sci TranslMed.2012Oct 10,4(155):155ra137。再举一个例子，为了治疗NCL或PMD，将2-4千万个神经干细胞直接注射到脊髓中。再举一个例子，为了治疗年龄相关性黄斑变性，经由视网膜下注射或玻璃体内注射来施用0.1-2百万个神经干细胞。
施用方法典型地涉及将本发明的基因经修饰的人神经干细胞移植到免疫抑制的受试者中。为了避免对于所移植的细胞、组织或器官的免疫应答而进行的免疫抑制是在移植外科手术和细胞疗法的领域中众所周知的，并且合适的试剂和方法是广泛可得的。免疫抑制药物可以包括糖皮质激素例如泼尼松和泼尼松龙，细胞抑制剂例如氨甲蝶呤、硫唑嘌呤和巯基嘌呤，抗体例如抗-IL-2受体抗体巴利昔单抗和达克珠单抗，作用于抑免蛋白的药物例如环孢素和其他药物(包括阿片样物质、TNF结合蛋白和麦考酚酸酯)。然后，将基因经修饰的人神经干细胞施用至对于待治疗的疾病或状况来说合适的位点，典型地脑或脊髓的预先确定的区域。
提供了药用组合物，其包含根据本发明的神经干细胞和药用承载体。
在本发明的背景下合适的在药学上可接受的承载体是已知的，并且包括帮助将活性试剂施用至细胞、生物体或受试者的物质。“在药学上可接受的承载体”是指可以被包括在本发明的组合物中并且对于患者不引起显著的不利的毒理学效应的承载体或赋形剂。在药学上可接受的承载体的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、正常蔗糖、正常葡萄糖、细胞培养基等。
本发明的神经干细胞和包含此类细胞的药用组合物可以作为单剂量或作为多剂量进行施用，例如以大约一个月、大约两个月、大约三个月、大约六个月或大约12个月的间隔施用的两个剂量。其他合适的按剂量给药时间表可以由执业医师来确定。
在本文中还提供了使用由在本文中所描述的方法所产生的GM-NSC来鉴定或开发潜在的治疗性分子的方法。例如，在一些实施方案中，提供了鉴定对于所述GM-NSC具有效应的治疗性分子的方法，其包括使所述GM-NSC与所述治疗性分子相接触和测定所述治疗性分子对于所述GM-NSC的效应。治疗性分子可以是例如用于增强自我更新、迁移或髓鞘化的药物。治疗性分子还可以是用于治疗精神病学或神经变性以及视网膜变性的药物。治疗性分子的非限制性实例包括视黄酸、丁酸钠、阿米替林、氟西汀、舍曲林、卡马西平、丙戊酸盐、KHS101、噁二唑化合物、磷酸丝氨酸、P7C3、阿托伐他汀、二甲双胍。所述方法还可以包括筛选小分子或生物学分子以鉴定参与特定信号途径的潜在的治疗性分子。信号途径的非限制性实例包括自我更新、迁移、髓鞘化和分化。
K.试剂盒
本发明还提供了试剂盒，其包含：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因(例如，与启动子例如异源启动子可操作地相连接的转基因)的转基因盒；和(ii)两个包含安全港基因的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列；和(c)分离的人神经干细胞。所述分离的神经干细胞可以是通过使用Uchida等人,Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(26):14720-14725中所描述的方法(其中细胞表面标志物用于分离CD133+CD24-/lo NSC)而从人脑组织中直接分离出的NSC。
所述DNA核酸酶如在本文中关于本发明的其他方面(即本发明的方法、细胞和/或药用组合物)所定义的。
用于将由核酸酶介导的基因组编辑的组分引入到细胞中的电穿孔试剂或其他试剂也可以被包括在本发明的试剂盒中。合适的试剂是本领域中已知的并且是商购广泛可得的。用于将所述组分递送至细胞的方法(例如电穿孔)描述在本文中并且是广泛已知的。
L.示例性的实施方案
本申请的一个方面提供了用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：向分离的人神经干细胞中引入：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因的转基因盒；和(ii)两个包含安全港座位的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在所述安全港座位中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港座位中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。
在根据上面所描述的方法的一些实施方案中，所述DNA核酸酶选自由下列各项组成的组：CRISPR-相关蛋白(Cas)多肽、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、兆碱基大范围核酸酶、其变体、其片段和其组合。
在根据上面所描述的方法中的任一个的一些实施方案中，所述分离的人神经干细胞包含初级神经干细胞。
在根据上面所描述的方法中的任一个的一些实施方案中，所述分离的人神经干细胞源自体干细胞或多能干细胞，或通过直接重编程而源自体细胞群体。
在根据上面所描述的方法中的任一个的一些实施方案中，所述转基因编码与中枢神经系统的遗传病症相关的蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质由从由下列各项组成的组中选择的基因编码：GALC(克拉伯病)、ABCD1(肾上腺脑白质营养不良)、GFAP(亚历山大病)、CYP27A1(脑腱黄瘤病)、ARSA(异染色性脑白质营养不良)、PLP1(佩-梅病)、ASPA(卡纳万病)、EIF-2B(具有正在消失的白质的白质脑病)、PHYH(雷夫叙姆病1)、PEX7(雷夫叙姆病2)、PPT1(婴儿神经细胞蜡样质脂褐素病(NCL))、TPP1(晚期婴儿NCL)、CLN3(青少年NCL)、CLN6(成人NCL)、CLN5(芬兰晚期婴儿变异型NCL)、CLN6(晚期婴儿变异型NCL)、MSFD8(神经细胞蜡样质脂褐素病7)、CLN8(神经细胞蜡样质脂褐素病8)、CTSD(神经细胞蜡样质脂褐素病10)、UBE3A(安格尔曼综合征)、POLG(阿尔珀斯病)、TAZ(巴尔特综合征)、GLA(法布里病)、SLC20A2(法尔氏综合征)、PDE(色素性视网膜炎)、SMN1(脊髓性肌萎缩)、IKBKAP(家族性自主神经功能异常)、MeCP2(雷特综合征)、CACNA1C(蒂莫西综合征)、ATXN3(马-约病)、RPE65(莱伯先天性黑矇)、USH2A(色素性视网膜炎)、RPGR(色素性视网膜炎)、RP2(色素性视网膜炎)、ABCA4(施塔加特病)和RS-1(X连锁性视网膜襞裂症)。在一些实施方案中，所述蛋白质由所述经遗传修饰的人神经干细胞分泌。
在根据上面所描述的方法中的任一个的一些实施方案中，所述转基因编码神经保护性或神经再生性蛋白质、其变体、其片段或其肽模拟物。在一些实施方案中，所述神经保护性或神经再生性蛋白质选自由下列各项组成的组：脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-2(NT-2)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)、神经营养蛋白-6、保守型多巴胺神经营养因子(CDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、集落刺激因子(CSF)、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、neurturin、persephin、artemin、神经肽Y(NPY)、肝配蛋白、脑信号蛋白、其他神经生成因子、其他神经营养因子和其组合。在一些实施方案中，所述神经保护性或神经再生性蛋白质为分泌型蛋白质。在一些实施方案中，所述转基因编码Bcl-2。在一些实施方案中，所述转基因编码端粒酶。在一些实施方案中，所述转基因编码这样的蛋白质，其可以改善存活或使神经干细胞恢复活力以便利于长期存活和/或治疗性分子的发现。
在根据上面所描述的方法中的任一个的一些实施方案中，所述供者模板保护异源启动子。在一些实施方案中，所述供者模板的所述异源启动子包含诱导型启动子或细胞特异性启动子。
在根据上面所描述的方法中的任一个的一些实施方案中，所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列包含RNA。
在根据上面所描述的方法中的任一个的一些实施方案中，所述方法进一步包括将DNA-靶向性RNA、经截短的DNA-靶向性RNA或者编码所述DNA-靶向性RNA或经截短的DNA-靶向性RNA的核苷酸序列引入到所述人神经干细胞中。在一些实施方案中，所述DNA核酸酶包含Cas多肽或编码所述Cas多肽的核苷酸序列，并且其中所述DNA-靶向性RNA包含单一指导RNA(sgRNA)或经截短的sgRNA，其包含与所述安全港座位的一部分互补的第一核苷酸序列和与所述Cas多肽相互作用的第二核苷酸序列。在一些实施方案中，所述Cas多肽包含Cas9多肽、其变体或其片段。在一些实施方案中，所述Cas多肽变体包含高保真性或特异性增强型Cas9多肽变体。在一些实施方案中，所述sgRNA或经截短的sgRNA包含一个或多个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述一个或多个经修饰的核苷酸包含在核糖基团、磷酸酯基团、核碱基或其组合中的修饰。在一些实施方案中，所述在核糖基团中的修饰包含在核糖基团的2’位置处的修饰。在一些实施方案中，所述在核糖基团的2’位置处的修饰选自由下列各项组成的组：2’-O-甲基、2’-氟、2’-脱氧、2’-O-(2-甲氧基乙基)和其组合。在一些实施方案中，所述在磷酸酯基团中的修饰包含硫代磷酸酯修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个经修饰的核苷酸选自由下列各项组成的组：2’-O-甲基核苷酸(M)、2’-O-甲基,3’-硫代磷酸酯核苷酸(MS)、2’-O-甲基,3’-硫代PACE核苷酸(MSP)和其组合。在一些实施方案中，在所述第一核苷酸序列中的核苷酸之中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个为经修饰的核苷酸，和/或在所述第二核苷酸序列中的核苷酸之中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个为经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，在所述第一核苷酸序列中的大约10％至大约30％的核苷酸为经修饰的核苷酸，和/或在所述第二核苷酸序列中的大约1％至大约10％的核苷酸为经修饰的核苷酸。
在根据上面所描述的方法中的任一个的一些实施方案中，所述安全港座位包含IL2Rγ、CCR5或HBB基因。
在根据上面所描述的方法中的任一个的一些实施方案中，所述引入包括电穿孔。
在根据上面所描述的方法中的任一个的一些实施方案中，所述供者模板进一步包含可选择性标志物。在一些实施方案中，所述可选择性标志物包含不在中枢神经系统的细胞上表达的标志物。在一些实施方案中，所述可选择性标志物为细胞表面蛋白。在一些实施方案中，所述细胞表面蛋白选自由下列各项组成的组：CD1、CD2、CD4、CD8α、CD10、CD19、CD20、其变体、其片段、其衍生物和其组合。
在根据上面所描述的方法中的任一个的一些实施方案中，所述方法进一步包括基于所述经遗传修饰的人神经干细胞对所述可选择性标志物的表达来纯化所述经遗传修饰的人神经干细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括扩展所述经纯化的经遗传修饰的人神经干细胞。
本申请的另一个方面提供了通过上面所描述的方法所产生的经遗传修饰的人神经干细胞。
本申请的另一个方面提供了药用组合物，其包含上面所描述的经遗传修饰的人神经干细胞和在药学上可接受的承载体。
本申请的另一个方面提供了用于在有此需要的人受试者中预防或治疗神经变性疾病或神经病学损伤的方法，所述方法包括：向所述人受试者施用有效量的上面所描述的药用组合物。
在根据上面所描述的用于在人受试者中预防或治疗神经变性疾病或神经病学损伤的方法的一些实施方案中，所述方法用于治疗从由下列各项组成的组中选择的神经变性疾病：脑白质营养不良、神经细胞蜡样质脂褐素病、年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化和视网膜变性疾病。在一些实施方案中，所述方法用于治疗从由下列各项组成的组中选择的脑白质营养不良：克拉伯病、佩-梅病、肾上腺脊髓神经病、亚历山大病、脑腱黄瘤病、异染色性脑白质营养不良、卡纳万病、具有正在消失的白质的白质脑病、肾上腺脑白质营养不良、雷夫叙姆病和xenobefantosis。在一些实施方案中，所述方法用于治疗从由下列各项组成的组中选择的神经病学损伤：脊髓损伤、创伤性脑损伤、中枢神经系统(CNS)的急性炎症、CNS的慢性炎症、局部缺血和中风。
在根据上面所描述的用于在人受试者中预防或治疗神经变性疾病或神经病学损伤的方法中的任一个的一些实施方案中，所述经遗传修饰的人神经干细胞对于所述受试者来说是自体的。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的人神经干细胞对于所述受试者来说是同种异体的。
在根据上面所描述的用于在人受试者中预防或治疗神经变性疾病或神经病学损伤的方法中的任一个的一些实施方案中，所述施用包括通过注射或外科手术移植进行的施用。
本申请的另一个方面提供了试剂盒，其包含：(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因的转基因盒；和(ii)两个包含安全港座位的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列；和(c)分离的人神经干细胞。
在根据上面所描述的试剂盒的一些实施方案中，所述DNA核酸酶选自由下列各项组成的组：CRISPR-相关蛋白(Cas)多肽、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、兆碱基大范围核酸酶、其变体、其片段和其组合。
在根据上面所描述的试剂盒中的任一个的一些实施方案中，所述分离的人神经干细胞包含初级神经干细胞。
在根据上面所描述的试剂盒中的任一个的一些实施方案中，所述分离的人神经干细胞源自体干细胞或多能干细胞，或通过直接重编程而源自体细胞群体。
在根据上面所描述的试剂盒中的任一个的一些实施方案中，所述转基因编码与中枢神经系统的遗传病症相关的蛋白质。在一些实施方案中，所述转基因包含编码神经保护性或神经再生性蛋白质、其变体、其片段或其肽模拟物的基因。
在根据上面所描述的试剂盒中的任一个的一些实施方案中，所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列包含RNA。
在根据上面所描述的试剂盒中的任一个的一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含DNA-靶向性RNA、经截短的DNA-靶向性RNA或者编码所述DNA-靶向性RNA或经截短的DNA-靶向性RNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述DNA核酸酶包含Cas多肽或编码所述Cas多肽的核苷酸序列，并且其中所述DNA-靶向性RNA包含单一指导RNA(sgRNA)或经截短的sgRNA，其包含与所述安全港座位的一部分互补的第一核苷酸序列和与所述Cas多肽相互作用的第二核苷酸序列。在一些实施方案中，所述Cas多肽包含Cas9多肽、其变体或其片段。在一些实施方案中，所述Cas多肽变体包含高保真性或特异性增强型Cas9多肽变体。在一些实施方案中，所述sgRNA或经截短的sgRNA包含一个或多个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述一个或多个经修饰的核苷酸选自由下列各项组成的组：2’-O-甲基核苷酸(M)、2’-O-甲基,3’-硫代磷酸酯核苷酸(MS)、2’-O-甲基,3’-硫代PACE核苷酸(MSP)和其组合。
在根据上面所描述的试剂盒中的任一个的一些实施方案中，所述安全港座位包含IL2Rγ、CCR5或HBB基因。
在根据上面所描述的试剂盒中的任一个的一些实施方案中，所述供者模板进一步包含可选择性标志物。
在根据上面所描述的试剂盒中的任一个的一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含关于产生经遗传修饰的人神经干细胞的说明书。
本申请的另一个方面提供了经遗传修饰的人神经干细胞，其包含含有转基因的转基因盒，其中所述转基因盒位于安全港座位之内。
本申请的另一个方面提供了上面所描述的经遗传修饰的人神经干细胞中的任一个或者通过上面所描述的方法中的任一个所产生的经遗传修饰的人神经干细胞在鉴定或开发潜在的治疗性分子的方法中的用途。在一些实施方案中，所述潜在的治疗性分子为促进人神经干细胞和/或人神经干细胞的分化子代的增殖和/或生存力的分子。
本申请的另一个方面提供了上面所描述的经遗传修饰的人神经干细胞中的任一个或者通过上面所描述的方法中的任一个所产生的经遗传修饰的人神经干细胞在研究中的用途。
V.实施例
提供了下面的实施例以举例说明而非限制所要求保护的发明。
这些实施例显示了通过使用经改造的核酸酶例如TALEN和CRISPR/Cas9来产生经遗传修饰的人神经干细胞(GM-NSC)。通过采用同源重组到安全港座位中，将包含用于细胞纯化的标志物和目的基因的外源转基因引入到所述神经干细胞中。该实施例描述了用于产生GM-NSC的方法和用于纯化经改造的细胞的方法。这些实施例还显示，当被移植到动物模型的脑中时，经纯化的GM-NSC移入、迁移和分化成神经细胞类型。
选择了三个人基因座位用于关于在HuCNS-(生长为神经球的人神经干细胞)中的安全港的同源重组(HR)。对于使用TALEN或CRISPR/Cas 9系统的HR，已经关于血液学病症广泛地表征了这些座位：(i)IL2RG可以具有对于重症联合免疫缺陷(SCID)-X1负责的突变，(ii)HBB可以具有对于镰状细胞贫血和珠蛋白生成障碍性贫血负责的突变，和(iii)CCR5编码HIV的共同受体并且目前正在抗-HIV临床试验中被作为用于治疗性基因编辑的靶标来进行调查研究。这些座位可以充当“安全港”，其允许外源转基因稳定地基因表达入HuCNS-细胞的基因组中，而没有副作用。
A.方法
为了构建TALEN-介导的基因组编辑组合件，如以前所描述的那样(Miller等人,Nature Biotechnology,2011,29:143-148)通过使用Δ152N-末端结构域和+63C-末端结构域来合成IL2RG TALEN(GenScript)并与FokI核酸酶结构域相融合，并且如所描述的那样(Hendel等人,Cell Report,2014,dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2014.02.040)克隆到pcDNA3.1(Invitrogen)中。
为了构建CRISPR/Cas9-介导的基因组编辑组合件，通过将20bp寡核苷酸靶序列克隆到px330(Addgene质粒#42230)中来构建sgRNA表达载体，所述px330包含经人密码子优化的SpCas9表达盒和驱动该嵌合sgRNA表达的人U6启动子。用于CRISPR/Cas9系统的sgRNA合成详细描述在Hendel等人,Cell Report,2014,dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2014.02.040中。
对于靶向性载体，通过使用分离自K562细胞的基因组DNA来PCR扩增相应的座位，产生了携带大约2×800bp同源性臂的三种质粒靶向性载体。然后，通过使用标准克隆方法将同源性臂克隆到基于pBluescript SK+的大约2,900碱基对载体中。关于另外的细节，参见Hendel等人,同上；和Hendel等人,Nature Biotechnology,2015,33:985-989。在同源性臂之间，供者模板包括包含驱动GFP表达的泛素C启动子的报道盒(图2A)。备选地，产生通过自切割2A肽分隔开的双顺反子盒构建体，由此提供了在位于所述2A肽的上游和下游的两个转基因之间的高的切割效率(图8)。所述构建体包括：(1)UbC-GFP-2A-CD8(用于纯化GM-HuCNS-SC细胞的CD8α细胞表面标志物；图11A和13A)；(2)UbC-GFP-2A-tCD19(用于纯化GM-HuCNS-SC细胞的经截短的细胞表面标志物)；(3)UbC-GalC-2A-tCD19(具有经截短的CD19的用于克拉伯病的治疗性酶构建体；图12A)或UbC-GalC-2A-eGFP(图9A)；和(4)UbC-TPP1-2A-CD8(具有CD8α的用于LINCL的治疗性酶构建体)。
通过使用在Uchida等人,Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(26):14720-14725中所描述的方法从人脑组织中直接分离HuCNS-细胞。在非-GMP条件下产生HuCNS-细胞。将细胞在补充有N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子(20ng/ml)和白血病抑制因子(10ng/ml)的X-VIVO 15培养基(Lonza)中以1×105/ml的密度进行培养。通过liberase或benzyme即高度纯化的胶原酶(Roche)处理和在相同的培养基中重新铺板来使神经球进行传代。使用细胞表面标志物来分离CD133+CD24-/lo HuCNS-细胞。
通过使用核转染来将基因靶向性供者模板引入到分离的HuCNS-中。通过遵循制造商的说明书用P3Primary Cell Nucleofector试剂盒(V4XP-3032)采用Amaxa 4DNucleofector(程序CA137)经由20μL 16-孔Nucleocuvette条进行核转染(Lonza)，来用1μg编码TALEN的质粒和1-2μg供者质粒转染5×105个HuCNS-细胞的单细胞悬浮液(除非另外指明)。在核转染后，将HuCNS-细胞放入瓶中并继续培养多次传代。在一些情况下，在用在Uchida等人(同上)中所描述的胶原酶进行解离后，将所培养的HuCNS-细胞用于基因组编辑。
在800bp同源性臂之间引入AflII限制位点，由此产生限制性片段长度多肽性(RFLP：Restriction Fragment Length Polymorphism)同源重组供者。在px330质粒构建体(1μg)中递送Cas9(在CMV启动子之下)和sgRNA(在U6启动子之下)。用golden gate系统构建TALEN对，并通过质粒构建体(0.5μg每种)进行递送。用1μg的HR供者模板或者1μg的HR供者和经改造的核酸酶核转染500,000个神经干细胞。允许细胞在培养物中生长7天。收获基因组DNA，并进行In-Out PCR。分离PCR产物，并用AflII消化过夜。将消化产物在10％PAGE凝胶上走胶，并且就条带强度进行可视化。RFLP分析确证了供者模板的GFP转基因插入到IL2Rγ座位中。
使用流式细胞术来监测同源重组。在核转染后在每次传代时分析HuCNS-细胞。在Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)上测量GFP表达。在一些情况下，在每次传代时通过流式细胞术来评估转基因CD8或CD19的表达。在传代时，如上面所描述的那样解离神经球，并且遵循制造商的说明书用抗-CD8-APC或抗-CD19-APC(Miltneyi Biotec)对单细胞悬浮液进行免疫染色。
为了纯化携带GFP转基因插入的GM-HuCNS-SC细胞，使用荧光激活细胞分选术(FACS)。如上面所描述的那样解离神经球，并且在FACS Aria II(BD Bioscience)上分选GFP+细胞。
还通过磁性激活细胞分选术(MACS)来纯化GM-HuCNS-SC。为了纯化表达CD8或CD19转基因细胞表面标志物的GM-HuCNS-SC细胞，按照制造商的说明书使用人CD8微珠或CD19微珠(Milenyi Biotech)。
为了就经纯化的GM-HuCNS-SC细胞的移入、迁移、神经保护和视网膜保存进行测试，将所述细胞移植到各种免疫缺陷小鼠中。制备HuCNS-细胞的悬浮液(在1μL中的1×105个细胞，每个位点)并且双侧移植到新生或幼年shiverer-免疫缺陷(Shi-id)小鼠的胼胝体、SVZ或小脑白质中。
B.IL2RG cDNA-UbC-GFP供者模板
图2A显示了同源重组到IL2RG座位中的IL2RG cDNA-UbC-GFP同源重组供者模板的示意图。每个侧翼臂包括IL2RG基因的外显子1的大约800bp。用1μg HR供者或者用1μg HR供者和核酸酶核转染HuCNS-细胞。让细胞生长70天，并且每～10天进行FACS直至附加型HR供者被增殖中的细胞稀释完，以确证所整合的GFP盒稳定表达入IL2RG座位中。数据确证，IL2RG是在HuCNS-细胞中用于使用经改造的核酸酶的HR的合适座位。
CRISPR/Cas9刺激了在IL2Rγ座位处的更高的基因编辑频率。图1A和1B显示，CRISPR/Cas9和TALEN系统两者均以大约1-6％的频率介导同源重组(HR)。CRISPR/Cas9系统所介导的HR事件是TALEN系统的2倍。
长期稳定的GFP表达的水平(2-4％GFP)与在RFLP分析中所测定的同源重组的百分比(1.7-3％HR频率)相一致(图2B和2C)。在图3中提供了使用CRISPR/Cas9技术来进行基因编辑的GFP+HuCNS-细胞的图像。
图4A显示，携带IL2RG cDNA-UbC-GFP供者模板的HuCNS-细胞在移植后移入shiverer小鼠的脑中。图4B显示，GFP-阳性的HuCNS-细胞发展成产生髓鞘质的GM-少突胶质细胞。
C.通过使用基于RNA的CRISPR/Cas9系统来增加同源重组频率
比较了使用基于质粒的CRISPR/Cas9系统与使用基于RNA的CRISPR/Cas9系统的HuCNS-细胞的基因编辑效率。将Cas9作为mRNA进行递送，并且包括化学修饰，其包含在5′和3′末端处在三个末端核苷酸处掺入的2′-O-甲基(M)、2′-O-甲基,3′硫代磷酸酯(MS)或2′-O-甲基,3′硫代PACE(MSP)。用基于质粒和基于RNA的核酸酶核转染HuCNS-SC。在培养7天后，收获基因组DNA，并且进行PCR以扩增所靶向的区域。图5显示，基于RNA的CRISPR/Cas9系统诱导出相比于基于质粒的系统而言更多的双链断裂(INDEL)。
还通过FACS评估了HR频率。用单独的HR供者或者HR供者+经改造的核酸酶(质粒(图6A)，或者经MS修饰的RNA或经MSP MS修饰的RNA(图6B))核转染HuCNS-细胞。每10天通过FACS来分析细胞(共30天)以允许附加型HR供者稀释完。数据还显示，基于经MSP修饰的RNA的CRISPR/Cas9以大约2倍的程度增加了HR频率，相比于Cas9的质粒递送而言。MS修饰不增强HR活性，尽管它的确增加了INDEL效率。
D.IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-GFP供者模板
图7显示了示例性IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-GFP供者模板的示意图。经改造的核酸酶可以诱导双链断裂(DSB)，其可以经由供者模板通过同源性定向修复来进行修复。通过共递送核酸酶与具有座位特异性同源性臂(IL2RG特异性侧翼臂)的供者模板(泛素C启动子-半乳糖基神经酰胺酶转基因-2A-GFP转基因)，可以将供者模板插入到IL2RG座位中。
在该实验中，用1μg的单独的IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-GFP供者模板或者1μg的IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-GFP供者模板与经改造的核酸酶(CRISPR/Cas9或TALEN)的组合核转染分离的HuCNS-SC。让细胞生长70天并且每大约10天进行FACS直至附加型供者模板被增殖中的细胞稀释完，并且确证了所整合的GFP盒稳定表达入IL2RG座位中。将细胞培养56天，然后进行分选以选择出GFP阳性细胞。然后，将这些细胞分选另外的140天。
图8显示，转基因在经纯化的GM-HuCNS-SC细胞中稳定地表达，并且在长期培养物中保持GalC和GFP表达(在核转染后大约168天)。数据确证，在用于允许附加型HR供者模板稀释完的30天后，GFP-阳性细胞的分选富集了纯的经基因编辑的HuCNS-细胞的群体。
进行PCR分析以确证GalC基因被靶向整合到IL2RG座位中。正向引物位于GalC转基因中，和反向引物位于3’同源性臂的外面并且不存在于供者模板中。如此，PCR应当仅扩增所靶向的整合并且产生所预期的长度为2355个碱基的扩增子。用1μg的IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-GFP供者模板和TALEN或CRISPR/Cas9核酸酶核转染分离的HuCNS-SC细胞。将细胞培养7天并收获基因组DNA。进行In-Out PCR并将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上走胶。图9B确证了用GalC供者的由经改造的核酸酶介导的同源性定向修复。
通过流式细胞术来纯化GFP+细胞，并且进行传代以用于长期培养/扩展(持续160天)。在纯化后，监测GFP表达和Sox2表达。关于经CRISPR/Cas9改造的细胞，图10A显示，GFP表达在扩展后是稳定的并且经分选和扩展的细胞是Sox2阳性的。图10B显示了关于经TALEN改造的细胞的相似的结果。
E.IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-CD8和IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-tCD19供者模板
将上面所描述的GFP转基因用CD8或CD19(或经截短的CD19)细胞表面标志物替换。表达这些标志物的细胞可以通过使用例如CD8或CD19选择微珠来选择性地进行纯化。图11A和13A显示了示例性IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-CD8供者模板的示意图。图12A显示了示例性IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-CD8供者模板的示意图。
用1μg的IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-CD8供者模板或IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-tCD19供者模板以及TALEN或CRISPR/Cas9核酸酶核转染分离的HuCNS-SC。
在图11B(MACS选择前)和11C(MACS选择后)中显示了表达IL2RG cDNA-UbC-GALC-2A-CD8转基因的细胞的流式细胞术分析。评价了GM-HuCNS-SC细胞的分化潜力。对于体外神经元分化测定法，在没有促分裂原但补充有BDNF和GDNF的情况下将GM-HuCNS-SC细胞培养10天。GM-HuCNS-SC是多潜能的，并且能够分化成神经元(双皮层蛋白)、星形胶质细胞(GFAP)和少突胶质细胞(O4，第14天；图11D)谱系。
就细胞表面标志物CD8和GFP的表达分析了另一个表达IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-CD8转基因的细胞群体。图13B(MACS选择前)和13C(MACS选择后)显示了在选择之后CD8+、GFP+细胞的增加。图13D显示，通过CD8选择柱的细胞为CD8-、GFP-细胞。图13E显示，高百分比的经CD8选择的细胞也是GFP+的。扩展GM-HuCNS-SC细胞，并且GFP在这些细胞中是稳定的(图13F)。制备单细胞悬浮液用于移植到新生shiverer小鼠中。在移植后12周，分析小鼠的脑切片。观察到稳健的GM-HuCNS-SC细胞的移入和迁移(图14B和14C)。
在图12C(MACS选择前)和12D(MACS选择后)中显示了表达IL2RG cDNA-UbC-GALC-2A-tCD19转基因的细胞的流式细胞术分析。在纯化后，GM-HuCNS-SC细胞在长期培养/扩展期间保留了转基因表达(图12B)。
F.IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-tCD19供者模板与基于RNA的CRISPR/Cas9系统
在该实验中，用1μg的IL2RG cDNA-UbC-GalC-2A-tCD19供者模板和基于质粒的sgRNA/Cas9核酸酶或经MSP修饰的sgRNA与Cas9mRNA核转染分离的HuCNS-SC细胞。使用细胞表面标志物tCD19来纯化细胞，并且进一步扩展所选择的细胞。通过使用该纯化策略，产生了纯的CD19阳性细胞群体。在扩展后，经纯化的群体保持CD19的细胞表面表达。数据显示，相比于使用基于质粒的Cas9而言，MSP修饰增加了HDR频率。参见图15A-15F。
G.在NSC中TALEN或CRISPR/Cas9-介导的同源重组(HR)
我们首先通过使用IL2Rγ特异性TALEN对和CRISPR/Cas9系统比较了在NSC中在白介素-2受体γ链(IL2Rγ)这一NSC“安全港”座位处的基因组编辑效率。基于两个标准来对用于基因添加的神经干细胞细胞特异性安全港进行分类：1)在NSC中没有已知的或经报道的生物学功能；和2)用外源启动子在内源座位中具有足够的基因表达，这两者对于在NSC中的IL2Rγ都是真实的。为了表征所诱导的DSB的频率，我们电穿孔了编码经优化的IL2Rγ特异性TALEN对或CRISPR组分(Cas9和sgRNA)的质粒，将细胞培养7天，分离基因组DNA(gDNA)，然后分析INDEL频率。CRISPR系统产生15％INDEL的平均值，相比于使用TALEN的5％而言(图33A)。接着，我们比较了IL2RγTALEN对的mRNA递送和与经化学修饰的sgRNA一起的Cas9的mRNA递送(“全部RNA”)。用“全部RNA”CRISPR系统对NSC进行电穿孔所诱导的INDEL是TALEN的mRNA递送所诱导的5倍(图33B)。由于这两种经改造的核酸酶系统均在诱导DSB(尽管以不同的频率)，因而我们用编码同源IL2RγcDNA-UbC-GFP供者盒的质粒(图16)或引入了单核苷酸变化的质粒靶向NSC以进行HR。将所靶向的NSC培养至少30天以允许附加型供者表达稀释完，以便允许经稳定整合的盒的HR的GFP FACS分析。虽然这两种经改造的核酸酶平台的基于质粒的递送均以3.5％的NSC的平均值介导稳定的GFP表达(图33C)，但是CRISPR系统始终修饰更多的IL2Rγ等位基因(图33D)。这些数据暗示，CRISPR系统优于TALEN，并因此是用于其余在本文中所描述的研究的核酸酶。
接着，我们测试了CRISPR系统是否可以编辑两个其他的NSC“安全港”座位即趋化因子(C-C基元)受体5(CCR5)和β-珠蛋白(HBB)基因，其均尚未被报道在人神经发生期间起作用(并且这是为什么我们认为它们是在NSC中用于靶向的安全座位)。将编码Cas9以及特异于IL2Rγ、HBB和CCR5的sgRNA的质粒电穿孔到NSC中，并且在7天后提取gDNA并就INDEL频率分析等位基因。CRISPR-Cas9系统在IL2Rγ、HBB和CCR5座位处分别诱导了12％、6％和36％INDEL的平均值(图18)。与我们先前的报道相一致，递送作为mRNA Cas9和经化学修饰的sgRNA在所有三个所测试的座位处诱导了比质粒递送更多的INDEL(图18)。为了了解DSB形成是否在所有3个座位处促进HR，用编码GFP的同源DNA供者和相应的CRISPR组分(作为质粒或全部RNA进行递送)对NSC进行共电穿孔。我们的结果显示，使用CRISPR-Cas9组分的质粒或全部RNA递送，在NSC中所有3个座位均顺从于HR(图19和图17A-17B)。用CRISPR的质粒递送在IL2Rγ、HBB和CCR5座位处靶向NSC在培养至少30天后分别导致2.8％、4.1％和2.4％GFP+NSC的平均值(图20)。令人感兴趣的是，IL2RγCRISPR的全部RNA递送导致多至质粒递送的2倍的GFP+NSC。为了确定HR是否在所期望的座位处出现，通过In-Out PCR(其中一个引物结合在供者构建体的同源性臂外面，而另一个引物结合在供者盒里面)就供者构建体的中靶整合来分析gDNA，因此仅中靶整合事件可以被扩增。虽然用模拟品或仅供者样品未检测到PCR扩增，但是当用CRISPR和同源供者对NSC进行共电穿孔时，中靶整合是明显的，这确证了在所期望的座位处的HR(图21)。由于Cas9可以在不期望的基因组位置处产生DSB，因而我们调查研究了在3个所预测的IL2Rγ脱靶位点(我们先前在K562细胞中通过下一代测序(NGS：next generation sequencing)对它们进行了检定)处的脱靶DSB活性。虽然我们在IL2Rγ处检测到28％DSB活性，但是在所调查研究的脱靶位点中的任一个处看到少于0.7％的切割(表1)。总的来说，这些研究证明，CRISPR-Cas9可以在NSC中在多个“安全港”座位处介导中靶HR，而具有最少的脱靶切割。
表1：在人NSC中IL2RγCRISPR/Cas9系统的低脱靶活性。在未编辑的NSC和GM-NSC上进行IL2Rγ等位基因和三个先前所预测的脱靶位点的靶向深度测序。每一列表示来自未选择的、经CD8选择的或经tCD19选择的GM-NSC的独立的靶向实验。所有数字均是从在未编辑的NSC样品中的背景INDEL频率进行减除了的。
未选择的 经CD8选择的 经CD8选择的 经tCD19选择的
IL2Rγ 28.35 75.85 59.11 71.27
脱靶1 0 0 0.01 0
脱靶2 0 0.28 0.07 0
脱靶3 0 0 0 0.62
方法
选择了三个人基因座位用于关于在NSC(生长为神经球的人神经干细胞)中的安全港的同源重组(HR)。对于使用TALEN或CRISPR/Cas 9系统的HR，已经关于血液学病症广泛地表征了这些座位：(i)IL2Rγ可以具有对于重症联合免疫缺陷(SCID)-X1负责的突变，(ii)HBB可以具有对于镰状细胞贫血和珠蛋白生成障碍性贫血负责的突变，和(iii)CCR5编码HIV的共同受体并且目前正在抗-HIV临床试验中被作为用于治疗性基因编辑的靶标来进行调查研究。这些座位可以充当“安全港”，其允许外源转基因稳定地基因表达入NSC细胞的基因组中，而没有副作用。
为了构建TALEN-介导的基因组编辑组合件，如以前所描述的那样(Miller等人,Nature Biotechnology,2011,29:143-148)通过使用Δ152N-末端结构域和+63C-末端结构域来合成IL2RG TALEN(GenScript)并与FokI核酸酶结构域相融合，并且如所描述的那样(Hendel等人,Cell Report,2014,dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2014.02.040)克隆到pcDNA3.1(Invitrogen)中。
为了构建CRISPR/Cas9-介导的基因组编辑组合件，通过将20bp寡核苷酸靶序列克隆到px330(Addgene质粒#42230)中来构建sgRNA表达载体，所述px330包含经人密码子优化的SpCas9表达盒和驱动该嵌合sgRNA表达的人U6启动子。用于CRISPR/Cas9系统的sgRNA合成详细描述在Hendel等人,Cell Report,2014,dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2014.02.040中。
为了化学修饰sgRNA，作为mRNA来递送Cas9，并且在5′-和3′-末端两者处在三个末端核苷酸处掺入包含2′-O-甲基(M)、2′-O-甲基,3′硫代磷酸酯(MS)或2′-O-甲基,3′硫代PACE(MSP)的化学修饰，并因此是CRISPR系统的“全部RNA”递送。
对于靶向性载体，通过使用分离自K562细胞的基因组DNA来PCR扩增相应的座位，产生了携带大约2×800bp同源性臂的三种质粒靶向性载体(例如CCR5和IL2RG质粒靶向性载体)。HBB具有540bp和420bp的同源性臂。然后，通过使用标准克隆方法将同源性臂克隆到基于pBluescript SK+的大约2,900碱基对载体中。关于另外的细节，参见Hendel等人,同上；和Hendel等人,Nature Biotechnology,2015,33:985-989。在同源性臂之间，供者模板包括包含驱动GFP表达的泛素C启动子的报道盒(图2A)。备选地，产生通过自切割2A肽分隔开的双顺反子盒构建体，由此提供了在位于所述2A肽的上游和下游的两个转基因之间的高的切割效率(图8)。所述构建体包括：(1)UbC-GFP-2A-CD8(用于纯化GM-NSC的CD8α细胞表面标志物；图11A和13A)；(2)UbC-GFP-2A-tCD19(用于纯化GM-NSC的经截短的细胞表面标志物)；(3)UbC-GalC-2A-tCD19(具有经截短的CD19的用于克拉伯病的治疗性酶构建体；图12A)或UbC-GalC-2A-eGFP(图9A)；和(4)UbC-TPP1-2A-CD8(具有CD8α的用于LINCL的治疗性酶构建体)。
通过使用在Uchida等人,Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(26):14720-14725中所描述的方法从人脑组织中直接分离NSC。在非-GMP条件下产生NSC。将细胞在补充有N2、肝素、N-乙酰半胱氨酸、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子(20ng/ml)和白血病抑制因子(10ng/ml)的X-VIVO 15培养基(Lonza)中以1×105/ml的密度进行培养。通过liberase或benzyme即高度纯化的胶原酶(Roche)处理和在相同的培养基中重新铺板来使神经球进行传代。使用细胞表面标志物来分离CD133+CD24-/lo NSC。
通过使用核转染来将基因靶向性供者模板引入到分离的NSC中。通过遵循制造商的说明书用P3Primary Cell Nucleofector试剂盒(V4XP-3032)采用Amaxa 4DNucleofector(程序CA137)经由20μL16-孔Nucleocuvette条进行核转染(Lonza)，来用1μg编码TALEN的质粒和1-2μg供者质粒(除非另外指明)转染5×105个NSC细胞的单细胞悬浮液。备选地，通过遵循制造商的说明书用P3 Primary Cell Nucleofector试剂盒(V4XP-3024)采用Amaxa 4D Nucleofector(程序CA137)经由100μL Nucelocuvette进行核转染(Lonza)，来用5μg编码TALEN的质粒和5-10μg供者质粒转染2.5E6个GM-NSC(除非另外指明)。在核转染后，将NSC放入瓶中并继续培养多次传代。在一些情况下，在用在Uchida等人(同上)中所描述的胶原酶进行解离后，将所培养的NSC用于基因组编辑。
在800bp同源性臂之间引入AflII限制位点，由此产生限制性片段长度多肽性(RFLP：Restriction Fragment Length Polymorphism)同源重组供者。在px330质粒构建体(1μg)中递送Cas9(在CMV启动子之下)和sgRNA(在U6启动子之下)。用golden gate系统构建TALEN对，并通过质粒构建体(0.5μg每种)进行递送。用1μg的HR供者模板或者1μg的HR供者和经改造的核酸酶核转染500,000个神经干细胞。允许细胞在培养物中生长7天。收获基因组DNA，并进行In-Out PCR。分离PCR产物，并用AflII消化过夜。将消化产物在10％PAGE凝胶上走胶，并且就条带强度进行可视化。RFLP分析确证了供者模板的GFP转基因插入到IL2Rγ座位中。通过将经切割的等位基因(800bp)的密度除以总等位基因(未修饰的(1.6kb)和经修饰的)来定量经修饰的IL2RG等位基因的数量。
关于MiSeq runsIL2RG(ON)和前三个在计算机上预测的脱靶(OFF1-3)的靶向扩增子文库产生。如以前所报道的那样，用在深度测序MiSeq运行中所使用的测序引物来PCR扩增Cas9-sgRNA扩增子。将扩增子进行凝胶纯化，然后使其经历第二轮PCR以添加接头和独特的8bp条码以区分实验。然后，纯化加有条码的扩增子，并且以等摩尔浓度汇集。在Proteinand Nucleic Acid(PAN)Stanford Core Facility，在illumina MiSeq DNA测序仪上以2x200个循环对经纯化的文库进行测序，其中进行标引。将序列与人基因组进行比对，并且如下面所描述的那样来计算INDEL。
在计算机上预测的IL2RG sgRNA脱靶位点的MiSeq分析
通过下述方式来定量IL2RG(ON)和前三个在计算机上预测的脱靶Cas9-sgRNA位点：将来自每个样品的读取本(read)对映至这四个扩增子序列靶区域(IL2RG，OFF1-3)，并且测量在经切割的位点附近具有缺口的经对映的读取本的数目。特别地，首先通过发现在每个读取本的前70个碱基与扩增子序列之间的完全匹配，将每个读取本分配给靶区域之一。如果读取本的前70个碱基对未完全地对映至任何扩增子序列，那么就放弃该读取本。然后，通过使用具有缺省参数的EMBOSS版本6.5.7.0Needle，将每个读取本与其相应的靶扩增子序列进行比对。为了定量具有INDEL的读取本的数目，如果至少一个插入或缺失(在读取本或扩增子的比对中的“-”)出现在经CRISPR切割的位点(在指导RNA序列的碱基17和18之间)的上游或下游5bp之内，那么将每个读取本标记为经修饰的。将在给定靶位点处的总的INDEL百分比报告为相对于对映至座位的读取本的总数目而言的经修饰的对映至座位的读取本的数目，减去在未电穿孔的样品中的背景INDEL百分比。
H.通过磁性激活细胞分选术(MACS)选择来富集经遗传修饰的NSC
将GM-NSC富集和扩展至在临床上有关的可移植细胞数目将会大大地增加其可转化潜力。我们通过下述方式设计出了富集范例：建立在IL2RG处的成功HR之后的CD8的α链(CD8α)细胞表面标志物表达，并偶联以一步式磁性激活细胞分选术(MACS)富集。CD8α复合体需要α和β链的二聚体化以在细胞毒性T细胞中转导细胞内信号。要注意的是，在NSC中未曾报道过CD8α被表达或是功能性的并且单独的α链的表达应当影响，由此其仅充当选择转基因。我们产生了IL2RG HR供者构建体(IL2RG cDNA-UbC-GFP-T2A-CD8α)，其在成功靶向后将会表达多基因mRNA，而不是两个不同的GFP和CD8α蛋白。用编码Cas9和特异于IL2RG的sgRNA以及还有上面所描述的CD8αHR供者盒的质粒对NSC进行电穿孔。在电穿孔后六次细胞传代，4.67％的NSC稳定地表达GFP(图22A，左)，这与我们用GFP构建体所发现的相似(图19)。然后，使NSC经历一步式CD8α磁珠富集实验方案，其导致>90％的细胞表达GFP(图22A，右)，并且这些细胞显示出在选择后多次传代的时间段内进行扩展并且连续地表达GFP，这确证了它们是GM-NSC群体(图22B)。
除了CD8α，对于我们的基于MACS的富集实验方案我们还评价了CD19细胞表面蛋白。不同于CD8复合体，CD19是转导信号(ref)的单链分子。因此，我们产生了CD19细胞表面蛋白的经截短的形式，其中去除了细胞内信号传导结构域，因而使得CD19仅用于选择目的。再次，CD19在神经发生或胶质发生中不具有已知的作用。我们因此产生了IL2RG HR供者构建体(IL2RG cDNA-UbC-GFP-T2A-tCD19)，并且靶向NSC以在IL2RG座位处进行HR。在电穿孔后第四次传代时，3.78％的NSC稳定地表达GFP，然后使细胞经历基于MACS的tCD19富集(图23A，左)。tCD19选择导致>90％的GM-NSC的富集和扩展，这与GM-NSC的CD8选择相似(图22B、图23B和图24)。因为我们正在富集具有HR的细胞，所以我们接下来想要调查研究我们是否也正在选择具有更高频率的脱靶INDEL的GM-NSC。虽然我们观察到IL2RG INDEL的3倍富集(因为细胞是具有2x染色体的雌性)，但是在经CD8和tCD19选择的GM-NSC中脱靶INDEL都小于1％(表1)。
为了测定GM-NSC是否保持其NSC特征，我们通过tCD19选择方案将IL2RG-靶向的NSC富集至超过95％(图24)，然后分析了两种最典型的NSC标志物的表达：细胞表面基因CD133(图25A)和细胞内NSC保持转录因子SOX2(图25B)。在富集后4周的扩展之后，大于95％的NSC是CD133/CD19/GFP/SOX2阳性的，这强调了所靶向的神经球可以完全具有NSC潜力。这些数据详细说明了简化的一步式基于MACS的实验方案，其用于富集和然后扩展>90％的GM-NSC，以用于移植。
方法
使用流式细胞术来监测同源重组。在核转染后在每次传代时分析NSC细胞。在Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)上测量GFP表达。在一些情况下，在每次传代时通过流式细胞术来评估转基因CD8或CD19的表达。在传代时，如上面所描述的那样解离神经球，并且遵循制造商的说明书用抗-CD8-APC或抗-CD19-APC(MiltneyiBiotec)对单细胞悬浮液进行免疫染色。
为了纯化携带GFP转基因插入的GM-NSC，使用荧光激活细胞分选术(FACS)。如上面所描述的那样解离神经球，并且在FACS Aria II(BD Bioscience)上分选GFP+细胞。
还通过磁性激活细胞分选术(MACS)来纯化GM-NSC。为了纯化表达CD8或CD19转基因细胞表面标志物的GM-NSC，按照制造商的说明书使用人CD8微珠或CD19微珠(MilenyiBiotech)。
I.GM-NSC在体内迁移和分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞
虽然我们已经显示我们可以通过使用CRISPR/Cas9系统来靶向NSC以进行HR，但是我们还调查研究了GM-NSC是否仍然保留了先前对于未编辑的NSC所显示的其NSC生物学活性。特别地，我们用GFP盒靶向在NSC中的IL2RG座位(图16)，扩展GM-NSC，然后将它们移植到免疫缺陷小鼠中。将经CD8α纯化的GM-NSC双侧移植到新生Shi-id小鼠的脑室下区(SVZ)中，然后在12周后，通过免疫组织化学就人的经修饰的细胞的移入来分析来自相同动物的姊妹前脑切片(图14B-14C)。用人特异性mAb SC121(图14B)和GFP(图14C)进行的免疫过氧化物酶染色检测到GM-NSC移入到皮层、胼胝体中，和重要的是，显示了细胞沿着嘴侧迁移流(RMS)从SVZ迁移至嗅球(图14B-14C)。重要的是注意，转基因GFP表达与通过SC121所检测到的人细胞移入是非常相似的。因此，GM-NSC可以在SVZ/嗅觉系统中移入和迁移，与我们先前所报告的未编辑的NSC相当。
人NSC的标志性功能是其长期地在分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系同时自我更新的能力。在移植到Shi/+杂合-id小鼠中之后二十四周，在海马中检测到GFP+细胞，这暗示GM-NSC长期地保持稳健的迁移能力。另外，这些细胞中的一些在海马齿状回的粒下层(其是除了SVZ外在成年啮齿动物中的神经原性位点)中表达GM-NSC转录因子SOX2(图26A箭头)。这些数据暗示，GM-NSC迁移到该神经原性位点中，并且在体内进行扩展后保持NSC自我更新潜力。为了确证GM-NSC能够在体内分化成星形胶质细胞或神经元谱系，我们分别就星形胶质细胞和神经元标志物即胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)和双皮层蛋白(DCX)在脑切片上进行了共聚焦显微术。我们观察到在胼胝体或纹状体白质束中的被GFAP共染色的GFP阳性细胞(图26B)。进一步地，GM-NSC迁移到RMS中并且在嗅球中分化成DCX+神经元谱系(图26B)，这揭示GM-NSC迁移和分化成星形胶质细胞和神经元谱系(以位点适当的方式)。
如以前所描述的那样(Uchida STM)，在少突胶质细胞突变型shiverer-免疫缺陷小鼠(shi/shi-id)中评价了GM-NSC分化成少突胶质细胞的潜力。shi/shi-id小鼠具有在主要碱性蛋白(MBP)中的缺失，并且针对MBP的mAb不使shi/shi小鼠脑(ref)染色。在移植后八周，GM-NSC广泛地迁移在小脑的白质束之内(图27A)，并且表达转基因GFP(图27B)。免疫荧光染色揭示，被移入的白质展示出GFP和MBP的共表达(图27C)。在不同小鼠脑的更高的放大倍数下，我们观察到人GFP+细胞延伸其过程并且MBP表达位于其过程的末梢，这指示了成熟的成髓鞘少突胶质细胞(图4B)。总而言之，GM-NSC保持了其移入、迁移、自我更新和分化成3个CNS谱系(以位点适当的方式)的潜力，与先前所报告的未编辑的NSC相当。另外，GM-NSC的子代持续表达由Crispr/Cas9介导的转基因，包括成熟的成髓鞘少突胶质细胞。
方法
为了就经纯化的GM-NSC的移入、迁移、神经保护和视网膜保存进行测试，将所述细胞移植到各种免疫缺陷小鼠中。制备NSC的悬浮液(在1μL中的1×105个细胞，每个位点)并且双侧移植到新生或幼年shiverer-免疫缺陷(Shi-id)小鼠的胼胝体、SVZ或小脑白质中。
J.过表达GALC溶酶体酶的NSC在体内移入并且产生髓鞘质
溶酶体贮积症(LSD)是一组超过50种的由于溶酶体无效力而引起的遗传性单基因代谢病症。在它们之中，球状细胞脑白质营养不良或克拉伯病是由于半乳糖基神经酰胺酶(GALC)丧失(其分别引起产生髓鞘质的少突胶质细胞和施万细胞死亡)而引起的主要在中枢和周围神经系统中显现的LSD类型。已将NSC移植到NCL患者的脑中以递送缺少的酶，和移植到佩-梅病(PMD)患者中以提供产生髓鞘质的细胞。由于我们显示GM-NSC产生与未编辑的NSC相当的髓鞘质，因而我们认为过表达GALC的GM-NSC在产生足够的GALC以使得受损的产生髓鞘质的细胞的“交叉矫正”成为可能方面将会是优异的。而且，这些细胞还可以用表达“正常的”GALC的少突胶质细胞替换已经丧失的少突胶质细胞。因此，我们产生了HR供者以将GALC(IL2RG cDNA-UbC-GALC-T2A-tCD19)敲入IL2RG座位，和还敲入tCD19选择盒以使得稳健的基于MACS的富集成为可能(图28)。用“全部RNA”IL2RG CRISPR/Cas9平台和GALC HR供者对NSC进行电穿孔，其中在靶向后经至少四次传代附加型供者DNA被稀释完后具有5.17％CD19阳性的NSC(图29A)。一致地，tCD19MACS珠粒富集了>95％的GM-NSC(图29B)，并且‘In-Out’PCR确证了GALC盒中靶整合到IL2RG座位中(图30)。为了确证GALC NSC正过表达功能性酶，我们进行了体外GALC酶测定法。因此，GM-NSC所表达的GalC酶是未编辑的NSC的3-5倍和来自克拉伯病患者的成纤维细胞的10倍(图31)。接下来，我们测试了GALC GM-NSC是否保留其NSC生物学特征；因此，我们将GALC GM-NSC移植到幼年Shi-id小鼠的小脑中。免疫组织化学分析显示出GALC GM-NSC的移入和髓鞘质产生(图32A-32B)。这些数据高度暗示，GALC GM-NSC保留了其NSC生物学特征并且具有高的用于治疗克拉伯病和其他脱髓鞘性中枢神经系统病症的治疗潜力。
方法
如在R&D系统中所描述的那样(https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-galactosylceramidase-galc-protein-cf_7310-gh)，进行GALC酶测定法(Wiederschain等人,Clin Chim Acta1992)。简而言之，从未编辑的NSC、来自克拉伯病患者的成纤维细胞(GM4372成纤维细胞，对于在GALC基因中在内含子10中间附近开始的30kb缺失来说杂合的，Coriell)和两种不同的用IL2RG cDNA-UbC-GALC-T2A-tCD19供者模板(Exp1)或IL2RG cDNA-UbC-GALC-T2A-GFP(Exp2)进行修饰的GE-NSC中进行蛋白质提取。为了进行GALC酶测定法，通过下述方式来制备来自这些细胞的蛋白质提取物：收获细胞，用PBS洗涤一次，并按照制造商的说明书用M-PER蛋白质提取试剂(Thermo Scientific)进行处理。通过Bradford测定法试剂盒用范围为0.25-2.0mg/ml的BSA标准曲线(ThermoScientific)来测量蛋白质浓度。
通过将250μg或500μg蛋白质提取物(50μL)与50μL的重悬浮在50mM柠檬酸钠、125mM NaCl、0.1％X-100(pH 4.5)中的1mM 4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃型半乳糖苷底物(Sigma)相混合来进行GALC测定法。将反应体系在37℃下温育20分钟，然后用0.5M甘氨酸、0.3M NaOH(pH 10.0)来终止。通过BioTek用Gen5软件在分别为365nm和445nm的激发和发射波长下(顶部读取)以终点模式来测量GALC酶切割的荧光。通过重组人半乳糖基神经酰胺酶(rhGALC)(R&D Systems,#7310-GH)来建立关于GALC酶测定法的标准曲线，其范围为0.0375ng-1.2ng的rhGALC/反应，具有线性范围。所有测定法均通过使用三个独立的样品以三次重复来进行。GALC酶活性用未编辑的NSC来进行标准化。
虽然为了理解清晰的目的已经通过举例说明和实施例较为详细地描述了前述发明，但是本领域技术人员将会意识到，可以在所附权利要求书的范围之内施行某些变化和修改。另外，在本文中所提供的每篇参考文献通过提及而以其整体合并入本文，就如同每篇参考文献单独地通过提及而合并一样。

Claims (62)

1.用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：
向分离的人神经干细胞中引入：
(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因的转基因盒；和(ii)两个包含安全港座位的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和
(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在所述安全港座位中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港座位中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述DNA核酸酶选自由下列各项组成的组：CRISPR-相关蛋白(Cas)多肽、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、兆碱基大范围核酸酶、其变体、其片段和其组合。
3.权利要求1或2的方法，其中所述分离的人神经干细胞包含初级神经干细胞。
4.权利要求1或2的方法，其中所述分离的人神经干细胞源自体干细胞或多能干细胞，或通过直接重编程而源自体细胞群体。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述转基因编码与中枢神经系统的遗传病症相关的蛋白质。
6.权利要求5的方法，其中所述蛋白质由从由下列各项组成的组中选择的基因编码：GALC(克拉伯病)、ABCD1(肾上腺脑白质营养不良)、GFAP(亚历山大病)、CYP27A1(脑腱黄瘤病)、ARSA(异染色性脑白质营养不良)、PLP1(佩-梅病)、ASPA(卡纳万病)、EIF-2B(具有正在消失的白质的白质脑病)、PHYH(雷夫叙姆病1)、PEX7(雷夫叙姆病2)、PPT1(婴儿神经细胞蜡样质脂褐素病(NCL))、TPP1(晚期婴儿NCL)、CLN3(青少年NCL)、CLN6(成人NCL)、CLN5(芬兰晚期婴儿变异型NCL)、CLN6(晚期婴儿变异型NCL)、MSFD8(神经细胞蜡样质脂褐素病7)、CLN8(神经细胞蜡样质脂褐素病8)、CTSD(神经细胞蜡样质脂褐素病10)、UBE3A(安格尔曼综合征)、POLG(阿尔珀斯病)、TAZ(巴尔特综合征)、GLA(法布里病)、SLC20A2(法尔氏综合征)、PDE(色素性视网膜炎)、SMN1(脊髓性肌萎缩)、IKBKAP(家族性自主神经功能异常)、MeCP2(雷特综合征)、CACNA1C(蒂莫西综合征)、ATXN3(马-约病)和RPE65(莱伯先天性黑矇)。
7.权利要求5或6的方法，其中所述蛋白质由所述经遗传修饰的人神经干细胞分泌。
8.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述转基因编码神经保护性或神经再生性蛋白质、其变体、其片段或其肽模拟物。
9.权利要求8的方法，其中所述神经保护性或神经再生性蛋白质选自由下列各项组成的组：脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-2(NT-2)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)、神经营养蛋白-6、保守型多巴胺神经营养因子(CDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、集落刺激因子(CSF)、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、neurturin、persephin、artemin、神经肽Y(NPY)、肝配蛋白、脑信号蛋白、其他神经生成因子、其他神经营养因子和其组合。
10.权利要求8的方法，其中所述神经保护性或神经再生性蛋白质为分泌型蛋白质。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述供者模板包含异源启动子。
12.权利要求11的方法，其中所述供者模板的所述异源启动子包含诱导型启动子或细胞特异性启动子。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列包含RNA。
14.权利要求1至13中任一项的方法，其进一步包括将DNA-靶向性RNA、经截短的DNA-靶向性RNA或者编码所述DNA-靶向性RNA或经截短的DNA-靶向性RNA的核苷酸序列引入到所述人神经干细胞中。
15.权利要求14的方法，其中所述DNA核酸酶包含Cas多肽或编码所述Cas多肽的核苷酸序列，并且其中所述DNA-靶向性RNA包含单一指导RNA(sgRNA)或经截短的sgRNA，其包含与所述安全港座位的一部分互补的第一核苷酸序列和与所述Cas多肽相互作用的第二核苷酸序列。
16.权利要求15的方法，其中所述Cas多肽包含Cas9多肽、其变体或其片段。
17.权利要求16的方法，其中所述Cas多肽变体包含高保真性或特异性增强型Cas9多肽变体。
18.权利要求15至17中任一项的方法，其中所述sgRNA或经截短的sgRNA包含一个或多个经修饰的核苷酸。
19.权利要求18的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸包含在核糖基团、磷酸酯基团、核碱基或其组合中的修饰。
20.权利要求19的方法，其中所述在核糖基团中的修饰包含在核糖基团的2’位置处的修饰。
21.权利要求20的方法，其中所述在核糖基团的2’位置处的修饰选自由下列各项组成的组：2’-O-甲基、2’-氟、2’-脱氧、2’-O-(2-甲氧基乙基)和其组合。
22.权利要求19的方法，其中所述在磷酸酯基团中的修饰包含硫代磷酸酯修饰。
23.权利要求18的方法，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸选自由下列各项组成的组：2’-O-甲基核苷酸(M)、2’-O-甲基,3’-硫代磷酸酯核苷酸(MS)、2’-O-甲基,3’-硫代PACE核苷酸(MSP)和其组合。
24.权利要求18至23中任一项的方法，其中在所述第一核苷酸序列中的核苷酸之中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个为经修饰的核苷酸，和/或在所述第二核苷酸序列中的核苷酸之中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个为经修饰的核苷酸。
25.权利要求18至24中任一项的方法，其中在所述第一核苷酸序列中的大约10％至大约30％的核苷酸为经修饰的核苷酸，和/或在所述第二核苷酸序列中的大约1％至大约10％的核苷酸为经修饰的核苷酸。
26.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述安全港座位包含IL2Rγ、CCR5或HBB基因。
27.权利要求1至26中任一项的方法，其中所述引入包括电穿孔。
28.权利要求1至27中任一项的方法，其中所述供者模板进一步包含可选择性标志物。
29.权利要求28的方法，其中所述可选择性标志物包含不在中枢神经系统的细胞上表达的标志物。
30.权利要求28或29的方法，其中所述可选择性标志物为细胞表面蛋白。
31.权利要求30的方法，其中所述细胞表面蛋白选自由下列各项组成的组：CD1、CD2、CD4、CD8α、CD10、CD19、CD20、其变体、其片段、其衍生物和其组合。
32.权利要求28至31中任一项的方法，其进一步包括基于所述经遗传修饰的人神经干细胞对所述可选择性标志物的表达来纯化所述经遗传修饰的人神经干细胞。
33.权利要求32的方法，其进一步包括扩展所述经纯化的经遗传修饰的人神经干细胞。
34.通过权利要求1至33中任一项的方法所产生的经遗传修饰的人神经干细胞。
35.药用组合物，其包含权利要求34的经遗传修饰的人神经干细胞和在药学上可接受的承载体。
36.用于在有此需要的人受试者中预防或治疗神经变性疾病或神经病学损伤的方法，所述方法包括：向所述人受试者施用有效量的权利要求35的药用组合物。
37.权利要求36的方法，其中所述方法用于治疗从由下列各项组成的组中选择的神经变性疾病：脑白质营养不良、神经细胞蜡样质脂褐素病、年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化和视网膜变性疾病。
38.权利要求37的方法，其中所述方法用于治疗从由下列各项组成的组中选择的脑白质营养不良：克拉伯病、佩-梅病、肾上腺脊髓神经病、亚历山大病、脑腱黄瘤病、异染色性脑白质营养不良、卡纳万病、具有正在消失的白质的白质脑病、肾上腺脑白质营养不良、雷夫叙姆病和xenobefantosis。
39.权利要求36的方法，其中所述方法用于治疗从由下列各项组成的组中选择的神经病学损伤：脊髓损伤、创伤性脑损伤、中枢神经系统(CNS)的急性炎症、CNS的慢性炎症、局部缺血和中风。
40.权利要求36至39中任一项的方法，其中所述经遗传修饰的人神经干细胞对于所述受试者来说是自体的。
41.权利要求36至39中任一项的方法，其中所述经遗传修饰的人神经干细胞对于所述受试者来说是同种异体的。
42.权利要求36至41中任一项的方法，其中所述施用包括通过注射或外科手术移植进行的施用。
43.试剂盒，其包含：
(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因的转基因盒；和(ii)两个包含安全港座位的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；
(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列；和
(c)分离的人神经干细胞。
44.权利要求43的试剂盒，其中所述DNA核酸酶选自由下列各项组成的组：CRISPR-相关蛋白(Cas)多肽、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、兆碱基大范围核酸酶、其变体、其片段和其组合。
45.权利要求43或44的试剂盒，其中所述分离的人神经干细胞包含初级神经干细胞。
46.权利要求43或44的试剂盒，其中所述分离的人神经干细胞源自体干细胞或多能干细胞，或通过直接重编程而源自体细胞群体。
47.权利要求43至46中任一项的试剂盒，其中所述转基因编码与中枢神经系统的遗传病症相关的蛋白质。
48.权利要求43至46中任一项的试剂盒，其中所述转基因包含编码神经保护性或神经再生性蛋白质、其变体、其片段或其肽模拟物的基因。
49.权利要求43至48中任一项的试剂盒，其中所述编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列包含RNA。
50.权利要求43至49中任一项的试剂盒，其进一步包含DNA-靶向性RNA、经截短的DNA-靶向性RNA或者编码所述DNA-靶向性RNA或经截短的DNA-靶向性RNA的核苷酸序列。
51.权利要求50的试剂盒，其中所述DNA核酸酶包含Cas多肽或编码所述Cas多肽的核苷酸序列，并且其中所述DNA-靶向性RNA包含单一指导RNA(sgRNA)或经截短的sgRNA，其包含与所述安全港座位的一部分互补的第一核苷酸序列和与所述Cas多肽相互作用的第二核苷酸序列。
52.权利要求51的试剂盒，其中所述Cas多肽包含Cas9多肽、其变体或其片段。
53.权利要求52的试剂盒，其中所述Cas多肽变体包含高保真性或特异性增强型Cas9多肽变体。
54.权利要求51至53中任一项的试剂盒，其中所述sgRNA或经截短的sgRNA包含一个或多个经修饰的核苷酸。
55.权利要求54的试剂盒，其中所述一个或多个经修饰的核苷酸选自由下列各项组成的组：2’-O-甲基核苷酸(M)、2’-O-甲基,3’-硫代磷酸酯核苷酸(MS)、2’-O-甲基,3’-硫代PACE核苷酸(MSP)和其组合。
56.权利要求43至55中任一项的试剂盒，其中所述安全港座位包含IL2Rγ、CCR5或HBB基因。
57.权利要求43至56中任一项的试剂盒，其中所述供者模板进一步包含可选择性标志物。
58.权利要求43至57中任一项的试剂盒，其进一步包含关于产生经遗传修饰的人神经干细胞的说明书。
59.经遗传修饰的人神经干细胞，其包含含有转基因的转基因盒，其中所述转基因盒位于安全港座位之内。
60.权利要求34或59的经遗传修饰的人神经干细胞或者通过权利要求1至33中任一项的方法所产生的经遗传修饰的人神经干细胞在鉴定或开发潜在的治疗性分子的方法中的用途。
61.权利要求60的用途，其中所述潜在的治疗性分子为促进人神经干细胞和/或人神经干细胞的分化子代的增殖和/或生存力的分子。
62.权利要求34或59的经遗传修饰的人神经干细胞或者通过权利要求1至33中任一项的方法所产生的经遗传修饰的人神经干细胞在研究中的用途。
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