CN111925998A - 模拟SARS-CoV-2感染的系统及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种模拟SARS‑CoV‑2感染的系统及其制备方法与应用。所述系统包括含有SARS‑CoV‑2的S蛋白及报告基因的假病毒以及宿主细胞；所述宿主细胞过表达人ACE2基因，并表达胞内信号缺失型CD19基因。该系统不需要BSL‑3级别实验室即可进行SARS‑CoV‑2相关的中和抗体以及药物筛选等研究，降低实验成本；并且过表达人ACE2的细胞可以通过胞内信号缺失的CD19标签被磁珠分选和富集，缩短了细胞系建模时间并且节约大量建模成本。

Description

模拟SARS-CoV-2感染的系统及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种模拟SARS-CoV-2感染的 系统及其制备方法与应用。
背景技术
在开展疾病防治的研究工作中，如寻找病原体的受体、研究该病原体的致 病机理，以及寻找抗体、研制疫苗和筛选对抗药物时，往往需要利用该疾病的 病原体进行研究。在传染病的研究，尤其是烈性传染病的研究中，直接研究病 原体具有极大的危险性，不适于迅速开展大规模的药物筛选和科学实验。因此 在传染病的研究中，假病毒技术是一种非常有效的研究手段。已有不少成功制 备假病毒的报道，如HIV、Marburg和Ebola病毒等。
目前对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的研究主要依赖活病毒体外培养。已 知新型冠状病毒肺炎具有高度传染性，且病死率较高，直接用SARS-CoV-2冠 状病毒开展研究具有相当大的危险性，且需要苛刻的实验条件。因此研制 SARS-CoV-2冠状病毒的假病毒感染模型非常必要和亟待解决的问题。
发明内容
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种模拟SARS-CoV-2感染的系统，其包括含有SARS-CoV-2 的S蛋白及报告基因的假病毒以及宿主细胞；
所述宿主细胞过表达人ACE2基因，并表达胞内信号缺失型CD19基因。
本发明还涉及如上所述的模拟SARS-CoV-2感染的系统的构建方法，包括：
a)获取所述假病毒以及所述宿主细胞；
所述假病毒为由表达报告基因的慢病毒质粒、SARS-CoV-2S蛋白辅助质粒、 psPAX三质粒包装得到的以S蛋白作为表面衣壳糖蛋白的病毒；
所述宿主细胞转染有慢病毒载体，所述慢病毒载体上含有人ACE2基因-2A 短肽基因-胞内信号缺失型CD19基因的基因表达盒；
b)用所述假病毒转导所述宿主细胞。
本发明还涉及如上所述的模拟SARS-CoV-2感染的系统在SARS-CoV-2中 和抗体评价、中和性单克隆抗体抗原表位筛选、抗病毒药物的高通量筛选以及 疫苗制备中的应用。
本发明的有益效果为：
1)不需要BSL-3级别实验室即可进行SARS-CoV-2相关的中和抗体以及药 物筛选等研究，降低实验成本；
2)过表达人ACE2的细胞可以通过胞内信号缺失的CD19标签(tCD19标 签)被磁珠分选和富集，无需挑取单克隆，也不需要利用抗性基因进行筛选， 也不需要流式细胞仪等昂贵设备，与以往的技术相比极大地缩短了细胞系建模 时间并且节约大量建模成本；
3)冠状病毒假病毒没有传染能力以及复制能力，可以避免实验人员被感染 的风险；
4)假病毒含有报告基因，有利于迅速开展大规模的药物筛选和科学实验。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将 对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见 地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来 讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中ACE2-tCD19过表达载体结构示意图；
图2为本发明一个实施例中过表达ACE2-tCD19细胞系通过磁珠分选被迅 速富集实验结果图；
图3为本发明一个实施例中新冠S蛋白辅助载体结构示意图；
图4为本发明一个实施例中SARS-CoV2假病毒的感染水平通过报告基因检 测结果图；
图5为本发明一个实施例中SARS-CoV2假病毒特异性感染表达ACE2的细 胞系的结果图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。 提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显 而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。 例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中， 来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修 改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显 而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而 非意在限制本发明更广阔的方面。
除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及 领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分 子生物学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规 步骤。
本发明涉及一种模拟SARS-CoV-2感染的系统，其包括含有SARS-CoV-2 的S蛋白及报告基因的假病毒以及宿主细胞；
所述宿主细胞过表达人ACE2基因，并表达胞内信号缺失型CD19基因。
假病毒(pseudovirus)是病毒衣壳蛋白或者包膜蛋白包裹携带有报告基因的 异源核酸形成的类似于真病毒的具有感染性的病毒颗粒，由于被包裹的核酸不 具有复制形成病毒的全部核酸序列的能力，所以假病毒只有一轮的感染力，操 作比较安全。假病毒体系的特点是克服了传统方法的缺陷，使检测技术更安全、 简便、快速、高通量，而且使一些本身很难培养的病毒也能采用培养的方法进 行检测。
现有技术中制备特定基因过表达的细胞株时需要引入抗性基因或挑取单细 胞或利用流式分选的方法来获得特定基因过表达的细胞株，本发明提供的方法， 由于宿主细胞表达胞内信号缺失型CD19，仅需要进行简单的磁珠分选即可获得 特定基因过表达的细胞株。此外本发明提供的假病毒可以特异性地感染表达人 ACE蛋白的细胞，但没有传染以及复制能力，因此无需在BSL-3级别的实验室 中开展相关的实验，同时也可以避免实验人员被感染的风险。
在一些实施方式中，所述胞内信号缺失型CD19基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
GMPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPG LGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKN RSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSR GPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARP VLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHL(SEQ ID NO：1)
在一些实施方式中，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVS GTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINL VRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENG TITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNR KRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLP DDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYG FQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFG RDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYST GSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNN SIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFA QVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKF NGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIAN QFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLI TGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVT YVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTV YDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQ YIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO：2)
在一些实施方式中，所述人ACE2基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQ ECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGD YEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFW TNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAV CHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLS AATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWE MKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTE AGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQ SIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVT APKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVSIWLIVFGVVMGVIVVGIVI LIFTGIRDRKKKNKARSGENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSF(SEQ ID NO：3)
报告基因可选择为本领域技术人员所熟知的代谢标记、催化型报告基因、 抗生素标记、抗生素抗性基因、除草剂抗性基因、营养缺陷型报告基因、化合 物解毒酶基因、以及糖类代谢酶选择标记基因；
在一些优选的实施方式中，为便于观察和检测，所述报告基因的表达产物 为可通过催化底物反应自身发光或产生颜色变化、或可通过催化底物反应使底 物发光或产生颜色变化、或经过激发光照射而产生发射光或产生颜色变化的物 质。此类物质较为代表性的包括荧光蛋白、荧光素酶以及LacZ。荧光蛋白和荧 光素酶都属于发光蛋白，可用照相机或类似的装置来检测荧光表达。荧光蛋白 通过吸收一种颜色的光(激发)，然后发出不同颜色(发射)的较低能量光来 起作用。相反，荧光素酶(和其他生物发光酶)通过催化底物(即荧光素)发 生化学反应而发光。与上述两种标记不同，LacZ不发光。LacZ基因的产物β- 半乳糖苷酶可以催化X-gal转化成类似于靛蓝的不透明蓝色化合物。
进一步地，荧光蛋白可以选择绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋 白、橙色荧光蛋白或红色荧光蛋白。绿色荧光蛋白可以采用常见的GFP，也可 以采用经过改造后的GFP基因，例如增强型GFP基因EGFP等；蓝色荧光蛋白 可以选自EBFP、Azuritc、TagBFP等；黄色荧光蛋白可以选自EYFP、Ypct、PhiYFP 等；橙色荧光蛋白可以选自mKO、mOrange、mBanana等；红色荧光蛋白可以 选自TagRFP、mRuby、mCherry、mKate等。在一些具体的实施方式中，所述 报告基因选自荧光蛋白基因(特别是GFP)和/或荧光素酶基因。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为人类细胞系。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为人肺腺癌细胞株，例如PC9、H1299、 A549、HCC827、H1975、SPC-A1、BEAS-2B细胞系。
在一些具体实施方式中，所述宿主细胞为H1299细胞。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述的模拟SARS-CoV-2感染 的系统的构建方法，包括：
a)获取所述假病毒以及所述宿主细胞；
所述假病毒为由表达报告基因的慢病毒质粒、SARS-CoV-2S蛋白辅助质粒、 psPAX三质粒包装得到的以S蛋白作为表面衣壳糖蛋白的病毒；
所述宿主细胞转染有慢病毒载体，所述慢病毒载体上含有人ACE2基因-2A 短肽基因-胞内信号缺失型CD19基因的基因表达盒；
b)用所述假病毒转导所述宿主细胞。
2A短肽发现于多种病毒当中，长度一般为18～22氨基酸。在C端编码一个 高度保守的共有基序(Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-//-Pro)剪切位点位于 Gly-//-Pro之间。剪切的原理是2A的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空 间排阻，阻止Gly和Pro之间形成肽键，但是核糖体依然可以继续下游的翻译， 整个过程不需要其他蛋白酶的参与。
将本发明的假病毒包装载体共转染真核细胞，收集细胞培养上清，可得到 假病毒。
所述转染的方法可以是磷酸钙转染法、脂质体转染法、电转染法等。
在本发明的实施方案中，所述真核细胞例如选自HEK293、HEK293T、HEK293FT等细胞。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2S蛋白辅助质粒中含有spike基因和 调节该基因转录的CMV启动子，所述CMV启动子和spike基因之间还连接有 β-globin intron。
β-globin intron在载体中可以提高真核基因的表达。
在一些实施方式中，所述慢病毒载体为pWPXLd载体。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述的模拟SARS-CoV-2感染 的系统在SARS-CoV-2中和抗体评价、中和性单克隆抗体抗原表位筛选、抗病 毒药物的高通量筛选以及疫苗制备中的应用。
假病毒感染模型的建立将为研究SARS-CoV-2病毒的侵染机理，寻找抗病 毒的药物，研究抗病毒的中和抗体和疫苗提供了新的简便的实验方法。
利用这一模型研究SARS-CoV-2病毒侵染宿主细胞的全过程和阻断这一过 程的途径，从而为大规模的体外药物筛选提供简便安全的方法。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
人ACE2蛋白过表达质粒的构建
如图1所示，过表达基因包括人ACE2基因、2A短肽基因、胞内信号缺失 型CD19基因(tCD19基因)，构建步骤包括：
(1)通过基因合成获得过表达质粒所需各区域DNA，包括：人ACE2基因、 2A短肽基因、tCD19基因；
(2)通过PCR、酶切、重组等步骤将所需要的上述合成的基因片段克隆到 含有绿色荧光蛋白的表达载体中。
PCR：
用TOYOBO的KOD OneTM PCR Master Mix对含有重组基因的PUC57 (PUC57-CAR)载体进行PCR扩增，PCR体系见下表：
Figure BDA0002530951520000071
Figure BDA0002530951520000081
PCR扩增的反应条件如下：
Figure BDA0002530951520000082
酶切：
用Thermo的FD MSSI(货号FD1344)和FD BcuI(FD1253)处理pWPXLd 载体，酶切体系见下表：
pWPXLd载体酶切体系
Figure BDA0002530951520000083
酶切处理2h之后，取20ul的载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取大小 约为10000bp的片段再用Magen的HiPure Gel Pure Micro Kit对其进行回收。
同源重组：采用Vazyme Biotech的ClonExpress的同源重组试剂盒进行同 源重组反应，体系见下表：
Figure BDA0002530951520000084
37℃孵育30min后迅速放在冰面上5min，随后加入Trans1-T1感受态20ul 静置30min后42℃热激90s后涂板。
实施例2
人ACE2基因过表达载体慢病毒包装
(1)在10cm培养皿中培养293T细胞，培养基为：DMEM高糖培养基 +10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)；
(2)待培养皿中的293T细胞密度达80％时，更换培养基：DMEM高糖培 养基+1％FBS+1％双抗；
(3)更换培养基培养2小时后，开始步骤(4)；
(4)取500μL的opti-DMEM至15mL离心管中，并且加入7.2μL浓度为 10μg/μL PEI(线性聚乙烯亚胺)，轻微混匀后，静置5min；
(5)取500μL的opti-DMEM至15mL离心管中，取目的质粒9μg、pMD2.G 辅助质粒3μg、psPAX 12μg，加入到离心管中，混匀；
(6)待步骤(4)完成后，将步骤(5)的溶液与之混合，颠倒混匀，静置 20min；
(7)将步骤(6)中的溶液全部加到步骤(2)中的细胞中，孵育6h之后， 更换新鲜的培养基7mL：DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(8)分别在更换培养基后24h收集上清，更换新鲜的培养基7mL：DMEM 高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(9)24h后再次收集上清，更换新鲜的培养基7mL：DMEM高糖培养基 +1％FBS+1％双抗；
(10)24h后收集上清，并且丢弃细胞；
(11)培养基上清收集完毕后，将上清2500g离心0.5小时后取离心上清， 用0.45μm过滤器过滤，得到慢病毒，备用。
实施例3
人ACE2-tCD19过表达慢病毒转导H1299细胞株
(1)将培养皿中的H1299细胞用0.25％胰酶消化5分钟，加入培养基终止 消化并收集细胞悬液，置于15ml离心管中300g离心5min，弃去上清后用3mL 新鲜培养基重悬(培养基为：1640培养基+5％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100× 青霉素-链霉素混合溶液))；
(2)对细胞进行计数，将1×106H1299细胞悬接种在6孔板中，每孔加入 1mL培养基(培养基为：1640培养基+5％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100× 青霉素-链霉素混合溶液))；
(3)将包装好的过表达慢病毒载体加入到6孔板中，每孔9mL；
(4)取10μL polybrene加入到每个孔中；
(5)培养12h后更换新鲜培养基5mL(培养基为：1640培养基+5％FBS (胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；
(6)72小时后弃去6孔板中的培养基，加入0.25％胰酶1ml，消化5分钟 后加入3ml培养基终止消化(培养基为：1640培养基+5％FBS(胎牛血清)+1％ 双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；
收集细胞悬液，300g离心5分钟后弃去上清，加入2ml pH 7.4的PBS重悬， 利用tCD19分选磁珠将细胞进行纯化；富集的结果如图2所示。
收集纯化后的细胞，取100ul进行流式检测，剩余细胞加入6ml培养基进行 扩大培养。
实施例4
SARS-CoV-2假病毒包装
(1)在10cm培养皿中培养293T细胞，培养基为：DMEM高糖培养基 +10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)；
(2)待培养皿中的293T细胞密度达80％时，更换培养基：DMEM高糖培 养基+1％FBS+1％双抗；
(3)更换培养基培养2小时后，开始步骤(4)；
(4)取500μL的opti-DMEM至15mL离心管中，并且加入7.2μL浓度为 10μg/μL PEI(线性聚乙烯亚胺)，轻微混匀后，静置5min；
(5)取500μL的opti-DMEM至15mL离心管中，取表达绿色荧光蛋白或 荧光素酶质粒9μg、SARS-CoV-2S蛋白辅助质粒15μg、psPAX 12μg，加入到 离心管中，混匀；
其中所述表达绿色荧光蛋白或荧光素酶质粒为将绿色荧光蛋白或荧光素酶 克隆到pWPXLd载体(厂家：addgene，货号：12258)获得的；
所述辅助质粒通过将SPIKE蛋白克隆到pMD2.G载体(厂家：addgene，货 号：12259)获得。
ARS-CoV-2S蛋白辅助质粒结构示意图如图3所示；
(6)待步骤(4)完成后，将步骤(5)的溶液与之混合，颠倒混匀，静置 20min；
(7)将步骤(6)中的溶液全部加到步骤(2)中的细胞中，孵育6h之后， 更换新鲜的培养基7mL：DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(8)分别在更换培养基后24h收集上清，更换新鲜的培养基7mL：DMEM 高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(9)24h后再次收集上清，更换新鲜的培养基7mL：DMEM高糖培养基 +1％FBS+1％双抗；
(10)24h后收集上清，并且丢弃细胞；
(11)培养基上清收集完毕后，将上清2500g离心0.5小时后取离心上清， 用0.45μm过滤器过滤，得到假病毒原液，备用；
(12)将假病毒原液置于30KD超滤管中，5000rcf离心20分钟后收集浓 缩液；
(13)利用AKTA pure快速蛋白纯化系统将浓缩液纯化即可获得纯化 SARS CoV-2假病毒。
SARS-CoV2假病毒的感染水平可以通过报告基因检测，如图4所示。
实施例5
表达荧光素酶的SARS-CoV-2假病毒感染ACE2-tCD19细胞系
(1)将培养皿中过表达ACE2-tCD19的H1299细胞用0.25％胰酶消化5分 钟，加入培养基终止消化并收集细胞悬液，置于15ml离心管中300g离心5min， 弃去上清后用3mL新鲜培养基重悬(培养基为：1640培养基+5％FBS(胎牛血 清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；
(2)对细胞进行计数，将5×104H1299细胞悬接种在白底96孔板中，每孔 加入200uL培养基(培养基为：1640培养基+5％FBS(胎牛血清)+1％双抗 (100×青霉素-链霉素混合溶液))；
(3)将纯化好的带有荧光素酶基因的SARS-CoV-2假病毒加入到过表达 ACE2-tCD19的H1299细胞中；
(4)培养12h后更换新鲜培养基1mL(培养基为：1640培养基+5％FBS (胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；
(5)72小时后吸去96孔板中的培养基100ul，加用pH7.4磷酸盐缓冲液 稀释好的荧光素酶底物100ul，静置3分钟后用酶标仪进行荧光强度检测。
实施例6
表达绿色荧光蛋白的SARS-CoV-2假病毒感染ACE2-tCD19细胞系
(1)将培养皿中过表达ACE2-tCD19的H1299细胞用0.25％胰酶消化5分 钟，加入培养基终止消化并收集细胞悬液，置于15ml离心管中300g离心5min， 弃去上清后用3mL新鲜培养基重悬(培养基为：1640培养基+5％FBS(胎牛血 清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；
(2)对细胞进行计数，将1×105H1299细胞悬接种在24孔板中，每孔加入 1mL培养基(培养基为：1640培养基+5％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100× 青霉素-链霉素混合溶液))；
(3)将纯化好的带有绿色荧光蛋白基因的SARS-CoV-2假病毒加入到过表 达ACE2-tCD19的H1299细胞中，每孔50ul；
(4)培养12h后更换新鲜培养基1mL(培养基为：1640培养基+5％FBS (胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；
(5)72小时后弃去24孔板中的培养基，加入0.25％胰酶1ml，消化5分钟 后加入3ml培养基终止消化(培养基为：1640培养基+5％FBS(胎牛血清)+1％ 双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))；
(6)收集细胞悬液，300g离心5分钟后弃去上清，加入1ml pH 7.4的PBS 重悬，取100ul进行流式检测。
流式结果如图5所示，SARS-CoV2假病毒特异性感染表达ACE2的细胞系， 而对野生型1299细胞几乎无感染性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对 上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技 术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。
序列表
<110> 广州再生医学与健康广东省实验室
<120> 模拟SARS-CoV-2感染的系统及其制备方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 314
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 1
Gly Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro
1 5 10 15
Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly
20 25 30
Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr
35 40 45
Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys
50 55 60
Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala
65 70 75 80
Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr
85 90 95
Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp
100 105 110
Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser
115 120 125
Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly
130 135 140
Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp
145 150 155 160
Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro
165 170 175
Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala
180 185 190
Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val
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210 215 220
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225 230 235 240
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Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His
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275 280 285
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<211> 1273
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 2
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65 70 75 80
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165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
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195 200 205
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Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
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Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
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Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
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485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
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<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 3
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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705 710 715 720
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785 790 795 800
Val Gln Thr Ser Phe
805

Claims (10)

1.一种模拟SARS-CoV-2感染的系统，其特征在于，包括含有SARS-CoV-2的S蛋白及报告基因的假病毒以及宿主细胞；
所述宿主细胞过表达人ACE2基因，并表达胞内信号缺失型CD19基因。
2.根据权利要求1所述的模拟SARS-CoV-2感染的系统，其特征在于，所述胞内信号缺失型CD19基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的模拟SARS-CoV-2感染的系统，其特征在于，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求1所述的模拟SARS-CoV-2感染的系统，其特征在于，所述人ACE2基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求1～4任一项所述的模拟SARS-CoV-2感染的系统，其特征在于，所述报告基因选自荧光蛋白基因和/或荧光素酶基因。
6.根据权利要求1～4任一项所述的模拟SARS-CoV-2感染的系统，其特征在于，所述宿主细胞为H1299细胞。
7.权利要求1～6任一项所述的模拟SARS-CoV-2感染的系统的构建方法，其特征在于，包括：
a)获取所述假病毒以及所述宿主细胞；
所述假病毒为由表达报告基因的慢病毒质粒、SARS-CoV-2S蛋白辅助质粒、psPAX三质粒包装得到的以S蛋白作为表面衣壳糖蛋白的病毒；
所述宿主细胞转染有慢病毒载体，所述慢病毒载体上含有人ACE2基因-2A短肽基因-胞内信号缺失型CD19基因的基因表达盒；
b)用所述假病毒转导所述宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的模拟SARS-CoV-2感染的系统的构建方法，其特征在于，所述SARS-CoV-2S蛋白辅助质粒中含有spike基因和调节该基因转录的CMV启动子，所述CMV启动子和spike基因之间还连接有β-globin intron。
9.根据权利要求7所述的模拟SARS-CoV-2感染的系统的构建方法，其特征在于，所述慢病毒载体为pWPXLd载体。
10.权利要求1～6任一项所述的模拟SARS-CoV-2感染的系统在SARS-CoV-2中和抗体评价、中和性单克隆抗体抗原表位筛选、抗病毒药物的高通量筛选以及疫苗制备中的应用。
CN202010518211.XA 2020-06-09 2020-06-09 模拟SARS-CoV-2感染的系统及其制备方法与应用 Pending CN111925998A (zh)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112375768A (zh) * 2020-11-16 2021-02-19 同济大学 Covid-19冠状病毒的假病毒及其制备方法和应用
CN113072625A (zh) * 2021-03-26 2021-07-06 广州市妇女儿童医疗中心 多肽、新型冠状病毒抗体的检测试纸和检测试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1482239A (zh) * 2002-09-10 2004-03-17 本元正阳基因技术股份有限公司 用于生产慢病毒载体的人重组单纯疱疹病毒
CN1552851A (zh) * 2003-06-06 2004-12-08 北京大学 Sars冠状病毒的假病毒及其制备方法和用途
US20110104130A1 (en) * 2008-03-20 2011-05-05 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
CN104830908A (zh) * 2015-06-02 2015-08-12 中国食品药品检定研究院 假病毒包装系统及其用途
CN109312308A (zh) * 2016-04-14 2019-02-05 亿阳集团美国硅谷公司 通过使用核酸酶来进行人神经干细胞的基因组编辑

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1482239A (zh) * 2002-09-10 2004-03-17 本元正阳基因技术股份有限公司 用于生产慢病毒载体的人重组单纯疱疹病毒
CN1552851A (zh) * 2003-06-06 2004-12-08 北京大学 Sars冠状病毒的假病毒及其制备方法和用途
US20110104130A1 (en) * 2008-03-20 2011-05-05 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
CN104830908A (zh) * 2015-06-02 2015-08-12 中国食品药品检定研究院 假病毒包装系统及其用途
CN109312308A (zh) * 2016-04-14 2019-02-05 亿阳集团美国硅谷公司 通过使用核酸酶来进行人神经干细胞的基因组编辑

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIAN SHANG等: "Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2", 《PNAS》 *
XIUYUAN OU等: "Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112375768A (zh) * 2020-11-16 2021-02-19 同济大学 Covid-19冠状病毒的假病毒及其制备方法和应用
CN113072625A (zh) * 2021-03-26 2021-07-06 广州市妇女儿童医疗中心 多肽、新型冠状病毒抗体的检测试纸和检测试剂盒
CN113072625B (zh) * 2021-03-26 2022-06-10 广州市妇女儿童医疗中心 多肽、新型冠状病毒抗体的检测试纸和检测试剂盒

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