JP6895391B2 - 少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルス性rnaを含む、レトロウイルス粒子 - Google Patents
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Description
―受容者のゲノム中にそれ自体を組み込む、組み込みベクター(integrating vectors)、並びに
―通常、染色体外遺伝エレメントを形成する、非組み込みベクター。
例として、以下のものが挙げられる:
・多能性細胞に特殊化した細胞の再プログラミングの誘導、並びに、幹細胞又は多能性細胞の特殊化細胞への分化の誘導、
・標的細胞における同時の、抗原又はタンパク質の発現(毒性か否か)、
・遺伝子工学システムの発現、例えばCRE若しくはTALENタンパク質又はCRISPRシステム、あるいはタンパク質又はRNA発現を必要とする任意の他のシステム。
―逆転写酵素による二本鎖DNAへの一本鎖ウイルスRNAのコピー;
―インテグラーゼによるLTR末端の認識による二本鎖DNAの成熟、及び、細胞質プレインテグレーション複合体(pre-integration complex)の核プレインテグレーション複合体への成熟、
に関与しないためである。
―gag遺伝子、これはウイルス性又はキメラであってもよい。より具体的には、結合ドメイン又はドメイン(複数)がその中に導入される場合、gag遺伝子はキメラである。
―任意により、pol遺伝子、これはウイルス性又はキメラであってもよい。pol遺伝子がいくつかの酵素をコードする場合、それらの酵素に関連する配列は完全に又は部分的に欠失しており、存在しかつ非機能的であるか、あるいは、存在しかつ機能的であってもよい。より具体的には、結合ドメイン又はドメイン(複数)がインテグラーゼに導入される場合、pol遺伝子はキメラである。
―少なくとも2つの非ウイルス性RNA、各非ウイルス性RNAは目的の配列及びカプシド形成配列のキャリアである。より具体的には、これら非ウイルス性RNAはいかなるウイルス配列も含まない。
・標的細胞への、内因性又は外因性である1又は複数の目的のコーディング配列の転移。
・例えばshRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA又はcircRNAによる、遺伝子発現に対する影響を誘導することができるRNAのような、1又は複数の非コーディングRNAの転移。
・細胞RNA、メッセンジャーRNAタイプ又は他のタイプ(miRNA等)、ウイルスRNAのサブゲノムレプリコン(VHC等)あるいは完全ウイルスRNAゲノムの転移。
・標的細胞への内因性又は外因性であるコーディング又は非コーディング配列の同時発現。
・遺伝子工学システム、例えばCRISPRシステムによる標的細胞のゲノム修飾への関与。
―カプシド形成された非ウイルス性RNAの少なくとも2つが、第1の結合ドメインに対応する同一のカプシド形成配列を提示し、かつ単にそれらの目的のRNA配列によって互いに区別され、
―第3のカプシド形成された非ウイルス性RNAは、同一又は異なるカプシド形成配列を有してもよい。カプシド形成配列が異なる場合、これは、ヌクレオカプシドタンパク質に導入された第2の結合ドメインに対応し得る。
―カプシド形成された非ウイルス性RNAの少なくとも2つが、第1の結合ドメインに対応する同一のカプシド形成配列を提示し、かつ単にそれらの目的のRNA配列によって互いに区別され、
―第3のカプシド形成された非ウイルス性RNAは、インテグラーゼに導入された第2の結合ドメインに対応する異なるカプシド形成配列を有する。
―結合ドメインは、バクテリオファージMS2のコートタンパク質であり、
―非ウイルス性RNAのカプシド形成配列は、MS2のステム−ループ配列であり、
―ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラGagポリタンパク質に属するHIVのヌクレオカプシドタンパク質(NC)であって、そのNC配列は、バクテリオファージMS2のコートタンパク質配列を挿入するために、第2のジンクフィンガーで突然変異している。
―エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−Gタンパク質である。
―カプシド形成配列は、MS2ステム−ループ配列の2〜25の反復、好ましくはステム−ループ配列の6〜18の反復、さらにより好ましくは10〜14、例えば12の反復を含む。好ましくは、当該ステム−ループ配列は、以下:ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(配列番号1)である。
―結合ドメインは、ファージPP7のコートタンパク質であり、
―非ウイルス性RNAのカプシド形成配列は、PP7のステム−ループ配列であり、
―ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラGagポリタンパク質に属するHIVのヌクレオカプシドタンパク質(NC)であって、そのNC配列は、PP7バクテリオファージのコートタンパク質配列を挿入するために、第2のジンクフィンガーで突然変異している。
―エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−Gタンパク質である。
―カプシド形成配列は、PP7ステム−ループ配列の2〜25の反復、好ましくはステム−ループ配列の2〜18の反復、さらにより好ましくは2〜12、例えば6の反復を含む。好ましくは、ステム−ループ配列は、以下:ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(配列番号5)である。
―カプシド形成された非ウイルス性RNAの少なくとも2つが、第1の結合ドメインに対応する同一のカプシド形成配列を提示し、これら2つの非ウイルス性RNAはおそらく、それらの目的のRNA配列によって互いに区別可能であり、
―第3のカプシド形成された非ウイルス性RNAは、同一又は異なるカプシド形成配列を有してもよい。カプシド形成配列が異なる場合、これはインテグラーゼに導入された第2の結合ドメインに対応し得る。
―カプシド形成された非ウイルス性RNAの少なくとも2つが、インテグラーゼに導入された第1の結合ドメインに対応する同一のカプシド形成配列を提示し、これら2つの非ウイルス性RNAがおそらく、それらの目的のRNA配列によって互いに区別可能であり、
―第3のカプシド形成された非ウイルス性RNAが、ヌクレオカプシドタンパク質に導入された第2の結合ドメインに対応する、異なるカプシド形成配列を有する。
―結合ドメインは、バクテリオファージMS2のコートタンパク質であり、
―非ウイルス性RNAのカプシド形成配列は、MS2のステム−ループ配列であり、
―インテグラーゼは、キメラ酵素タンパク質であり、その配列は、バクテリオファージMS2コートタンパク質配列を挿入するために、C−末端ドメインで突然変異している。
―結合ドメインは、ファージPP7のコートタンパク質であり、
―非ウイルス性RNAのカプシド形成配列は、PP7のステム−ループ配列であり、
―インテグラーゼは、キメラ酵素タンパク質であり、その配列は、ファージPP7のコートタンパク質配列を挿入するために、C−末端ドメインで突然変異している。
―エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質のためのVSV−Gタンパク質コーディングである。
―カプシド形成配列は、導入される結合ドメインに従って、MS2の及び/又はPP7のステム−ループ配列の2〜25の反復を含み、好ましくは2〜18の反復、より好ましくは2〜18の反復、例えばステム−ループ配列の6〜18の反復、さらにより好ましくはMS2のステム−ループ配列について、10〜14、例えば12の反復を含む。
―好ましくは、結合ドメインがMS2のコートタンパク質である場合、ステム−ループ配列は、以下:ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(配列番号1)であり、及び/又は、結合ドメインがPP7のコートタンパク質である場合、ステム−ループ配列は、以下:ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(配列番号5)である。
―MS2RLP又はMS2(NC)−RLP 12X粒子は、ヌクレオカプシドにおけるバクテリオファージMS2のコートタンパク質の挿入によって、12回反復した、バクテリオファージMS2のステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―MS2(NC)−RLP 2X粒子は、ヌクレオカプシドにおけるバクテリオファージMS2のコートタンパク質の挿入によって、2回反復した、バクテリオファージMS2のステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―MS2(NC)−RLP 6X粒子は、ヌクレオカプシドにおけるバクテリオファージMS2のコートタンパク質の挿入によって、6回反復した、バクテリオファージMS2のステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―MS2(IN)−RLP 2X粒子は、インテグラーゼにおけるバクテリオファージMS2のコートタンパク質の挿入によって、2回反復した、バクテリオファージMS2のステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―MS2(IN)−RLP 6X粒子は、インテグラーゼにおけるバクテリオファージMS2のコートタンパク質の挿入によって、6回反復した、バクテリオファージMS2のステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―MS2(IN)−RLP 12X粒子は、インテグラーゼにおけるバクテリオファージMS2のコートタンパク質の挿入によって、12回反復した、バクテリオファージMS2のステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―PP7(NC)−RLP 2X粒子は、ヌクレオカプシドにおけるファージPP7のコートタンパク質の挿入によって、2回反復した、ファージPP7のステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―PP7(NC)−RLP 6X粒子は、ヌクレオカプシドにおけるファージPP7のコートタンパク質の挿入によって、6回反復した、ファージPP7のステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―PP7RLP又はPP7(NC)−RLP 12X粒子は、ヌクレオカプシドにおけるファージPP7のコートタンパク質の挿入によって、12回反復した、ファージPP7のステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―PP7(IN)−RLP 2X粒子は、インテグラーゼにおけるファージPP7のコートタンパク質の挿入によって、2回反復した、ファージPP7のステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―PP7(IN)−RLP 6X粒子は、インテグラーゼにおけるファージPP7のコートタンパク質の挿入によって、6回反復した、ファージPP7のステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
―PP7(IN)−RLP 12X粒子は、インテグラーゼにおけるファージPP7のコートタンパク質の挿入によって、12回反復した、ファージPP7のステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子である。
(i)少なくとも1つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
(ii)カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、キメラである、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質及び/又はインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、キットに関する。
(i)少なくとも2つの異なる非ウイルス性RNA配列を含む発現プラスミドであって、各RNA配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第1及び第2の発現プラスミド、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。
(i)少なくとも2つの目的の配列を含み、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第1及び第2の発現プラスミド、
当該目的の配列が異なっており、かつ当該カプシド形成配列が同一であり、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。
―発現プラスミドにおいて、カプシド形成配列は、MS2ステム−ループ配列の2〜25の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の6〜18の反復、さらにより好ましくは10〜14、例えば12の反復を含む。有利には、ステム−ループ配列は、以下:ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(配列番号1)である。
―カプシド形成プラスミドにおいて、ヌクレオカプシドタンパク質はGagポリタンパク質に属するHIVのヌクレオカプシドタンパク質(NC)であって、そのNCは、バクテリオファージMS2のコートタンパク質配列を挿入するために、第2のジンクフィンガーで突然変異している。
―エンベローププラスミドにおいて、エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするタンパク質VSV−Gである。
―発現プラスミドにおいて、カプシド形成配列は、PP7ステム−ループ配列の2〜25の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の2〜18の反復、さらにより好ましくは2〜12、例えば6の反復を含む。有利には、ステム−ループ配列は、以下:ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(配列番号5)である。
―カプシド形成プラスミドにおいて、ヌクレオカプシドタンパク質は、Gagポリタンパク質に属するHIVのヌクレオカプシドタンパク質(NC)であって、そのNCは、ファージPP7のコートタンパク質配列を挿入するために、第2のジンクフィンガーで突然変異している。
―エンベローププラスミドにおいて、エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするタンパク質VSV−Gである。
―ヌクレオカプシドに導入される結合ドメインは、MS2のコートタンパク質であってもよく、かつインテグラーゼに導入される結合ドメインは、PP7のコートタンパク質であってもよく、あるいは
―ヌクレオカプシドに導入される結合ドメインは、PP7のコートタンパク質であってもよく、かつインテグラーゼに導入される結合ドメインは、MS2のコートタンパク質であってもよい。
(i)少なくとも1つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。
(i)少なくとも1つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
(ii)カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、キメラである、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質及び/又はインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミドを調製し、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
(i)少なくとも2つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第1及び第2の発現プラスミド、を調製し、
当該目的の配列が異なっており、かつ当該カプシド形成配列が同一であり、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードする、カプシド形成プラスミドを調製し、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
(i)少なくとも1つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミドを調製し、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
(i)少なくとも1つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
(ii)カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、キメラである、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質及び/又はインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を細胞にコトランスフェクトし、そして、
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取する、ステップ、
を含む。
(i)少なくとも2つの異なる非ウイルス性RNA配列を含む発現プラスミドであって、各RNA配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第1及び第2の発現プラスミド、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド,
を細胞にコトランスフェクトし、そして、
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取する、ステップ、
を含む。
(i)少なくとも2つの目的の配列を含み、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第1及び第2の発現プラスミド、
当該目的の配列が異なっており、かつ当該カプシド形成配列が同一であり、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を細胞にコトランスフェクトし、そして
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取する、ステップ、
を含む。
(i)少なくとも1つの目的の配列を含み、当該配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を細胞にコトランスフェクトし、そして
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取する、ステップ、
を含む。
I.装置及び方法
1.プラスミド構築
1.1 MS2RLPレンチウイルス粒子の生産のためのプラスミド
目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、RNA安定化又はイントロン配列の有無に関わらず、プロモーター−目的の配列−ポリA発現カセットを有する(図II参照)。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、MS2 RNAのステム−ループモチーフの12の反復(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号1)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した。使用されるプロモーターは、CMV(図IIa)又はEF1(図IIb及びIIc)のプロモーターであってもよいが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然のホタルルシフェラーゼ(図IIa)、緑色(ZsGreenI)、赤色(mCherry)又は青色(mtBFP)蛍光タンパク質(図IIb)をコードするDNA、あるいはタンパク質、例えばCREタンパク質(図IIc)をコードするcDNAであり得る。目的の配列はまた、shRNA、miRNA、sgRNA、LncRNAの配列又はcircRNAの配列であってもよい。
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、プロモーター−目的の配列発現カセットを運ぶ(図V)。このプラスミドは、WPRE天然配列(ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element)を意味するWPRE)又はcPPT/CTS配列のような、他のエレメントを含んでもよい。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって除去される。
3のプラスミドは、カプシド形成プラスミドがインテグラーゼをコードするpol配列のD64L突然変異を含む以外は、ポイント1.2に記載したものと同一である(図VII)。単一アミノ酸上のこの突然変異は、組み込みの阻害を誘導する(Nightingaleら、2006及びApoloniaら、2007)。インテグラーゼ(IN)上でのD64L突然変異は、部位特異的突然変異誘発によってp8.74プラスミドに導入された。突然変異は配列決定によって確認した。
これらの発現プラスミドは、対照のためにトランスフェクションに直接使用された、ILV及びIDLVベクターの生産のために使用されたものと同様である(pLucについて図Vb、及びpCreについて図Vc)。
細胞へのプラスミドのトランスフェクション後に、上清を採取し、粗生成物で、又は国際特許出願第2013/014537号に記載の方法に従って濃縮/精製して、使用した。
5%CO2で湿潤雰囲気下、37℃で、1%ペニシリン/ストレプトマイシン及び1%ウルトラグルタミン(ultraglutamine)(PAA)で補充した、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM、Gibco、ペイズリー、UK)で培養した、HEK293T細胞(ATCC、CRL−11268)を用いて、10−スタックのCellSTACK(6360cm2、Corning)で、生産を行う。血清影響試験アッセイのために、DMEMを10%SVFで補充する。特に、酪酸ナトリウムによる誘導は行わない。各バッチについて(MS2RLP、ILV及びIDLV)、トランスフェクション混合物は、以下の3つのプラスミドから構成される:
―形成されるものが粒子(MS2RLP)であるかベクター(ILV、IDLV)であるかに応じて、上述の発現プラスミドの1つ、
―p8.74ΔZFCoat(MS2RLP)、p8.74(ILV)、又は位置D64L(IDLV)で突然変異したp8.74、並びに
―エンベロープVSV−Gを有するpENV。
ベクター及び粒子を以下の2つの方法に従って濃縮及び精製する:
・方法P1は、遠心分離中央ユニットでの上清の正面限外濾過の実施を対象とする。
・P2方法は、上清の接線限外濾過、次に透析濾過の実施を対象とする。粗上清を、ポリスルホン中空繊維カートリッジの使用による接線限外濾過によって、濃縮及び精製する。上清を、DMEM又はTSSM緩衝液に対して連続モードで20ダイアボリューム(diavolumes)での透析濾過によって処理する。透析濾過後に、保持液を回収し、次に中央遠心分離ユニットでの正面限外濾過によって再度濃縮する。
3.1 qPCRによる機能性粒子の滴定
HCT116細胞(ATCC、CCL−247)を、10%SVF、100μg/mLのストレプトマイシン(Stretomycin)、100U/mLのペニシリン及び2mMのL−Glnで補充した、100μLのDMEM中の96−ウェルプレートに播種し、次に37℃/5%CO2に24時間インキュベートする。各ベクターについて、並びに内部キャリブレーション参照について6連希釈を行う。細胞を、Polybrene(登録商標)8μg/mL(Sigma)の存在下で連続希釈によって形質導入し、次に、37℃/5%CO2で3日間インキュベートする。試料の各シリーズについて、1つのウェルの非形質導入細胞を対照として加える。細胞を次にトリプシン処理し、Nucleospin tissue gDNA抽出キット(Macherey-Nagel)を用いてゲノムDNAの抽出後に、力価(形質導入ユニット(Transduction Unit)/mL)をqPCRによって決定する。qPCRによって得られた力価(TU/mL)を、その力価がFACSによって予め決定された内部キャリブレーション参照によって正規化する。
HIV−1 p24 ELISAキット(Perkin Elmer)を用いて推奨に従って、ウイルス上清中にp24カプシドタンパク質を直接検出する。捕捉されたp24タンパク質をビオチン化ポリクローナル抗体と複合体化し、次にストレプトアビジン−HRPペルオキシダーゼコンジュゲートによって検出する。得られた複合体を、捕捉されたp24の量に直接比例する黄色の発色を生じる基質オルト−フェニレンジアミン−HCl(OPD)とのインキュベーション後に、分光光度法によって検出する。各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダーSynergy H1 Hybrid(Biotek)を用いて定量化し、p24タンパク質キャリブレーション参照範囲の吸光度に対して較正する。mL当たりの物理的粒子で発現されたウイルス力価を、1pgのp24タンパク質が104個の物理的粒子に対応することを知って得られたp24タンパク質濃縮物から計算する。
本実施例は、レンチウイルスベクター又は上記で生産されたレンチウイルス粒子によるモノ形質導入のための条件の開発に関する。
24−ウェルプレート(Corning)に25000細胞/cm2で前日に播種したHCT116細胞を、8μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で100000PP/細胞に形質導入する。形質導入後8時間及び24時間で、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーによって分析して、蛍光細胞のパーセンテージを測定する。各アッセイを三連で実施する。
6.1 HCT116細胞
HCT116細胞(ATCC、CCL−247)を6又は24−ウェルプレートに播種し、37℃/5%CO2で24時間インキュベートする。ILV若しくはIDLVベクター又はMS2RLP粒子による形質導入を、4μg/mLのPolybreneの存在下で行う。形質導入上清を4時間後に除去し、新鮮な補充した増殖培地で置き換える。形質導入後4時間〜24時間で、細胞を採取し、供給者の推奨に従ってキットOneGloルシフェラーゼアッセイ(Promega)を使用して、及びSynergy H1 Hybridマイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して、ルシフェラーゼの発現を分析する。この試験は三連で実施される。並行して、HCT116細胞をpLucプラスミドでトランスフェクトする。このために、50000個のHCT116細胞を、PEI PRO(登録商標)(Polyplus Transfection)を用いて、2.6μgのpLucプラスミドでトランスフェクトする。
6−ウェルプレート(Corning)中に10,000細胞/cm2で前日に播種した包皮線維芽細胞を、4μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で形質導入する。細胞を、MS2RLP−Lucにより200000及び500000PP/細胞に、又はLuc組み込みレンチウイルスベクターによりMOI5で、形質導入した。
イン・ビボでの生物発光によるルシフェラーゼについての発現動態測定を行った。
7.1 包皮線維芽細胞
24−ウェルCellBind(Corning)中に10000細胞/cm2で前日に播種した包皮線維芽細胞を、4μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で形質導入する。細胞を、2種類の品質の上清:血清の存在下で生産され、次にP2方法で得られたバッチ、に対して、血清を含まずに生産され、次にP2方法で得られたバッチ、を用いて、500000PP/細胞で形質導入した。形質導入後8時間に、細胞をトリプシン処理し、不透明な黒底96−ウェルプレートの100μLの完全培地中に移す。ルミノメーターでの読み取りの3分前に、100μLの試薬One Gloルシフェラーゼ(Promega)をウェル毎に添加して、分析する。
24−ウェルCellBind(Corning)中に25000細胞/cm2で前日に播種した細胞を、4μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で形質導入する。細胞を、2種類の品質の上清:血清の存在下で生産され、次にP1方法で得られたバッチ、に対して、血清を含まずに生産され、次にP1方法で得られたバッチ、を用いて、100000PP/細胞で形質導入した。形質導入後8時間に、細胞をトリプシン処理し、不透明な黒底96−ウェルプレートの100μLの完全培地中に移す。ルミノメーターでの読み取りの3分前に、100μLの試薬One Gloルシフェラーゼ(Promega)をウェル毎に添加して、分析する。
8.1 包皮線維芽細胞
6−ウェルCellBind(Corning)中に10,000細胞/cm2で前日に播種した包皮線維芽細胞を、4μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で形質導入する。細胞を、MS2RLP粒子について500000PP/細胞、及びILVについてMOI 5に形質導入した。形質導入後8時間で、細胞をトリプシン処理し、不透明な黒底96−ウェルプレートの100μLの完全培地中に移す。ルミノメーターでの読み取りの3分前に、100μLの試薬One Gloルシフェラーゼ(Promega)をウェル毎に添加して、分析する。
6−ウェルCellBind(Corning)中に25,000細胞/cm2で前日に播種したHCT116細胞を、4μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で形質導入する。細胞を、MS2RLPについて100000PP/細胞、及びILVについてMOI 5に形質導入した。形質導入後8時間で、細胞をトリプシン処理し、不透明な黒底96−ウェルプレートの100μLの完全培地中に移す。ルミノメーターでの読み取りの3分前に、100μLの試薬One Gloルシフェラーゼ(Promega)をウェル毎に添加して、分析する。
第1のフェーズでは、HCT116細胞(ATCC、CCL−247)を、4μg/mLのPolybreneの存在下でMOI20で、ILV−EF1−Lox−dsRed−Loxレンチウイルスベクターによって形質導入する。6日後、このポリクローナル集団を、ウェル当たり0.5細胞の比率で96−ウェルプレートに細胞を播種することによる限界希釈を用いてクローニングする。HCT116−lox−dsRed−lox−clone 14モノクローナル株を、dsRedの発現レベルに基づいて、サイトメトリーによって選択した(MACS Quant VYB、Miltenyi)。
gcatttctggggattgcttataacaccctgttacgtatagccgaaattgccaggatcagggttaaagatatctcacgtactgacggtgggagaat(配列番号2)
以下の対のqPCRオリゴヌクレオチドを有する:
Q−CRE−F: 5’− GCATTTCTGGGGATTGCTTA−3’(配列番号3)
Q−CRE−R: 5’− ATTCTCCCACCGTCAGTACG−3’(配列番号4)、
を検出することによって、qPCRにより測定する。
1.レンチウイルス粒子生産レベル
第1のアッセイは、MS2RLP粒子及びIDLV又はILVベクターのそれぞれの生産レベルを比較することからなる。各タイプの粒子のバッチを生産し、粒子の力価をP24 Elisa試験によって測定した。結果を以下の表1に示す:
試験の第1シリーズは、長い半減期を特徴とする緑色蛍光タンパク質(ZsGreenI)をコードするシングルタイプのRNAを運ぶMS2RLP粒子を用いて行われた。MS2RLP粒子により得られた結果を図VIIIに提示し、RNAの転移が(形質導入後8時間のように)早期に検出されることを示している。得られた結果は、MS2RLPレンチウイルス粒子、あるいはILV又はIDLV−D64Lレンチウイルスベクターによって24時間で、同程度のパーセンテージの陽性HCT116細胞を示す。陽性細胞のパーセンテージは、MS2RLP粒子について8時間の時点で、ただしILV及びIDLV−D64Lベクターについては24時間の時点で検出可能である。したがって、これらMS2RLP粒子は機能的であり、コーディング配列を細胞集団内に導入するためのILV又はIDLV−D64Lの能力と同等の能力を示す。
標的細胞タイプに従って、運ばれたRNAを発現する多数の細胞を得るために、粒子の用量を増加できることが重要である。国際特許出願第2013/014537号に示されたように、精製された粒子を用いて標的細胞の生存率に影響することなく粒子の用量を増加することが可能である。実際のところ、レンチウイルス粒子のバッチの最終純度は、ウシ胎児血清(FCS)の存在によって影響を受ける。
―血清を用いて生産したMS2RLP粒子から濃縮した上清、
―血清を含まずに生産したMS2RLP粒子から濃縮した上清。
RNA転移の有効性を高めるために、ナチュラルキラーNK細胞の形質導入有効性を高める、Sutluら(2012)によって得られた結果を置き換えた。より具体的には、Toll様受容体(TLR)及び/又はRIG−I様受容体(RLR)に基づく抗ウイルス応答が、特定の細胞におけるRNA転移の有効性を制限し得る、という仮説を立てた。この仮説を試験するために、MS2RLP粒子を細胞に接触させて配置する間に、小さなシグナル伝達分子のTLR及びRLRの阻害剤を使用した。BX795分子はBK1/IKKε複合体の阻害剤であり、それはRIG−I、MDA−5、及びTLR3のシグナル伝達経路における共通のメディエーターとして作用する。
MS2RLP−Luc粒子のイン・ビボでの注入は、全身注入した様々なマウス器官における導入遺伝子、本件の場合はルシフェラーゼの、発現動態を明らかにすることを対象とする。精製したILV−EF1−Luc組み込みベクターの懸濁液を陽性対照として使用する。測定を注入後5時間及び7日までの時点で行う。静脈内投与は、注入された懸濁液の希釈、従って、考慮すべき生物発光シグナルの分散を引き起こす。それゆえ、全身のシグナルの分布を考慮するために、分析は動物全体に対して行う。血清の存在下で方法P1に従って生産されたMS2RLP−Luc粒子の懸濁液、及びP2方法に従って精製したMS2RLP−Luc粒子の懸濁液を試験する。精製がより低い血清の存在下でのp2方法に従ったMS2RLP−Luc粒子の懸濁液の注入は、サンプリング及び注入の両方に困難をもたらした。実際のところ、血清の存在下でP1方法によって得られたMS2RLP−Luc粒子のこの懸濁液は、高い粘度の褐色懸濁液を特徴とし、イン・ビボ注入に使用される29G針でのサンプリングが特に困難である。この困難は、懸濁液の尾静脈への送達時に発生する。血清の存在下でP1方法によって得られたMS2RLP−Luc粒子の懸濁液の使用は、動物の尾部領域に(すなわち注入部位に)局在するようになり、かつ動物の全身循環を通過しない、粒子の貧しい投与をもたらした(図XV A)、H5及びH8時間のグループ「血清の存在下でP1方法に従って生産されたMS2RLP−Luc」)。それゆえ、血清の存在下でP1方法によって得られたMS2RLP−Luc粒子の懸濁液は、イン・ビボ研究には使用することができない。
HCT116−Lox−dsRed−Lox細胞を、前もって、以下の配列:EF1−Lox−DsRed−Lox、を有するレンチウイルスベクターを組み込むことによる形質導入によって、生成した。ポリクローナル蛍光株を得た後に、モノクローナル株を限界希釈によって得た。組み込まれたLox−DsRed−Lox配列のコピー数は、ポリクローナル及びモノクローナル株におけるqPCRによって定量化されることに留意すべきである。組み込まれたコピー数は、平均でポリクローナル株について6、及びモノクローナル株について13コピーである。
I.装置及び方法
1.モノ−及びトリ−形質導入
本実施例は、単一タンパク質(ZsGreenI、mCherry又はmtBFP)の発現を可能にするシングルタイプのRNAの転移、又はいくつかの異なるタンパク質(ZsGreenI+mCherry+mtBFP)の発現を可能にするいくつかのタイプのRNAの転移のいずれかを可能にする、MS2RLP粒子又はIDLVベクターを用いて行う。
―カプシド形成及びエンベローププラスミドに加えて、(実施例1に記載のように)ZsGreenI、又はmCherry、又はmtBFPのいずれかをコードする単一発現プラスミドによる、HEK293T細胞のトランスフェクションによって、粒子を生産する、
―カプシド形成及びエンベローププラスミドに加えて、単一発現プラスミドでの粒子生産に使用される発現プラスミドの総量と同等の、発現プラスミドの総量のために、等モル量で加えた、ZsGreenI、mCherry及びmtBFPをそれぞれコードする3つの発現プラスミドによる、HEK293T細胞のトランスフェクションによって、粒子を生産する。
―独立してMS2RLP粒子ZsGreenI、mCherry又はmtBFPの3タイプでの形質導入により、
―ZsGreenI、mCherry及びmtBFPを同時にコードする3つの発現プラスミドを用いて生産された粒子でのモノ−形質導入により。
―独立してIDLVベクターZsGreenI、mCherry又はmtBFPの3つのタイプでの形質導入により、
―同時にZsGreenI、mCherry及びmtBFPをコードする3つの発現プラスミドを用いて生産されたIDLVベクターでのモノ−形質導入により。
1.MS2RLP粒子での単一形質導入におけるいくつかの異なるRNAを転移する能力
以下のアッセイの目的は、いくつかの異なるRNAを標的細胞に転移させるMS2RLP粒子の能力を実証し、従って標的細胞に対する形質導入の数の削減を可能にすることである。したがって、RNA種ごとに1つの形質導入を行うようにさせるよりもむしろ、単一形質導入でいくつかの異なるRNAを転移させることを可能にする。このために、本発明者らは、実施例1で定義した最適条件下でMS2RLP粒子の3つの精製バッチを生成した、すなわち国際特許出願第2013/014537号に記載の方法に従って血清を含まずに生産した精製バッチを生成した。MS2RLP粒子の生産フェーズにおいて、いくつかの異なるタイプのRNAを含むMS2RLP粒子のバッチを得るために、カプシド形成及びエンベローププラスミドと共に、蛍光レポーターをコードする3つのタイプのプラスミドを等モル量で同時に使用した(ZsGreenI、mCherry及びmtBFP)。次に、HCT116細胞をBX795の存在下で形質導入し、異なるRNAの転移を形質導入後8時間、24時間及び48時間で観察する。
上記ポイント1と同一のアッセイを、並行して別のタイプの粒子:インテグラーゼコーディング配列(IDLV)上の位置64における突然変異による組み込み欠損である、ウイルスベクター、で再現した。
図XX及びXXIIは、トリ−形質導入、対、単一形質導入の定量的影響を確認することを可能にする条件(非飽和条件)における、2つのウイルスRNA分子のカプシド形成の特徴である、MS2RLP粒子及びILVベクターについての形質導入プロファイルを示す。
異なる蛍光タンパク質をそれぞれコードする異なるベクターのバッチの使用を含むMOI5でのILVベクターによる細胞のトリ−形質導入は(MOI最終=3*5=15)、3色発現細胞の7.5%を得ることを可能にする。比較として、同一の用量(MOI15)での単一形質導入は、3色を発現するわずか0.8%の細胞を得ることを可能にする。したがって、3色発現細胞のパーセンテージはトリ−形質導入と単一形質導入との間で減少するので、それゆえ、単一形質導入はILVの使用に最も適合した方法ではない。
MS2RLP粒子の各バッチについて10pg/細胞の用量で異なる蛍光タンパク質をそれぞれコードする異なるベクターのバッチの使用を含む、MS2RLP粒子による細胞のトリ−形質導入(最終用量=3*10pg=30pg/細胞)は、3色発現細胞の20%を得ることを可能にする。同一の用量(30pg/細胞)でのMS2RLP粒子による細胞の単一形質導入に関して、これは3色発現細胞の2倍の数、すなわち40%を得ることを可能にする。したがって、3色発現細胞のパーセンテージはトリ−形質導入と単一形質導入との間で2倍になるので、それゆえ、単一形質導入はMS2RLP粒子の使用に最も適合した方法である。この結果はILVベクターにより得られた結果の反対である。
I.装置及び方法
本実施例は、単一タンパク質(ZsGreenI)に対する発現を認めるシングルタイプのRNAの転移を可能にするMS2RLP粒子を用いて実行する。
本アッセイの目的は、方法P1又はP2に従って生産されたMS2RLP−ZsGreen粒子によるHCT116細胞の形質導入の有効性を比較することである。図XXIIIに示された結果は、どの生産方法が使用されても形質導入された細胞のパーセンテージは同一であるため、RNA転移能力は生産方法による影響を受けないことを示している。しかしながら、導入遺伝子の発現のみが生産方法による影響を受ける。実際のところ、精製された粒子は、MS2RLP粒子のどの用量が使用されても、目的のタンパク質の最も高い発現レベルを得ることを可能にする。
I.装置及び方法
1.プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、RNA安定化又はイントロン配列の有無に関わらず、プロモーター−目的の配列−ポリA発現カセットを有する(図II参照)。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、MS2 RNAのステム−ループモチーフのいくつかの反復(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号1)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した:
―2の反復(図XXIV)
―6の反復(図XXV)
―12の反復(図XXVI)
レンチウイルス粒子を実施例1に記載のように生産し、実施例1に記載のように方法P1に従って濃縮及び精製する。
HCT116細胞(ATCC、CCL−247)を96−ウェルプレートに播種し、24時間37℃/5%CO2でインキュベートする。MS2RLP2X、6X、12X粒子による形質導入を、100 000PP/細胞(10pg p24/細胞)の用量で、4μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で行う。形質導入上清を4時間後に除去し、新鮮な補充した増殖培地で置き換える。形質導入後4時間、8時間、24時間、32時間、及び48時間で、細胞を採取し、供給業者の推奨に従ってキットOneGloルシフェラーゼアッセイ(Promega)を使用して、及びSynergy H1 Hybridマイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して、ルシフェラーゼの発現を分析する。各試験を三連で実施する。対照は非形質導入HCT116細胞によって行われる。
結果を図XXVIIに示す。本アッセイの目的は、送達するRNAの発現レベルが影響を受けることなく、発現プラスミド上のMS2配列の反復モチーフの数を削減することが可能であると確認することである。ルシフェラーゼの発現動態は、4時間〜8時間に発光シグナルの増加を示し、短い半減期を有するタンパク質の場合、反復されるMS2配列のモチーフの数がいくつであっても、最大発現は早期に達成されることを示している。8時間後、ルシフェラーゼの活性は、48時間で形質導入後4時間と同一のレベルを達成するまで減少する(10000〜20000URL)。MS2配列の2及び6反復モチーフを有する構築は、経時的に同一のルシフェラーゼ発現プロファイルを示す。しかしながら、MS2配列の12反復モチーフを有する構築によるルシフェラーゼの発現は、2又は6反復モチーフを有する構築よりも30%高い。それゆえ、MS2RLP粒子は、どのような反復モチーフの数を使用しても、RNAを送達するのに有効である。用途に応じて、MS2モチーフの反復の数は適合されなければならないであろう。
I.装置及び方法
1.プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、RNA安定化又はイントロン配列の有無に関わらず、プロモーター−目的の配列−ポリA発現カセットを有する(図II参照)。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、MS2 RNAのステム−ループモチーフのいくつかの反復(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号1)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した:
―2の反復(図XXIV)
―6の反復(図XXV)
―12の反復(図XXVI)
レンチウイルス粒子を実施例1に記載のように、P1方法に従って生産する。
HCT116細胞(ATCC、CCL−247)を96−ウェルプレートに播種し、24時間37℃/5%CO2でインキュベートする。P1方法に従って生産されたMS2(IN)−RLP2X、6X、12X粒子による形質導入を5pg p24/細胞の用量で、8μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で行う。形質導入上清を4時間後に除去し、新鮮な補充した増殖培地で置き換える。形質導入後4時間、8時間、24時間、32時間、及び48時間で、細胞を採取し、供給業者の推奨に従ってキットOneGloルシフェラーゼアッセイ(Promega)を使用して、及びSynergy H1 Hybridマイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して、ルシフェラーゼの発現を分析する。この試験は三連で実施される。対照は非形質導入HCT116細胞によって行われる。
結果を図XXIXに示す。本アッセイの目的は、インテグラーゼ中にMS2−Coatを有するレンチウイルス粒子内にRNAを転移させること、並びに、送達するRNAの発現レベルが影響を受けることなく、発現プラスミド上のMS2配列の反復モチーフの数を削減することが可能であると確認することである。ルシフェラーゼの最大発現は、MS2配列の反復モチーフの数がいくつであっても、早期に達成される。ルシフェラーゼ発現動態の最も強い発光シグナルは4時間及び24時間までの時点で得られる。24時間後、ルシフェラーゼ活性は、4/8/24時間での条件よりも2〜4倍弱いシグナルに達するまで低下する。したがってMS2(IN)−RLP粒子は、MS2配列の反復モチーフの数がいくつであっても、RNAを送達することを可能にする。
I.装置及び方法
1.プラスミド構築
1.1 PP7(NC)−RLP Luc 12Xレンチウイルス粒子の生産のためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、RNA安定化又はイントロン配列の有無に関わらず、プロモーター−目的の配列−ポリA発現カセットを有する(図XXX参照)。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、PP7 RNAのステム−ループモチーフの12の反復(ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag 配列番号5)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した。
使用されたプラスミドは、実施例1で使用したプラスミドと同一である。
レンチウイルス粒子を実施例1に記載のように、P1方法に従って生産する。
HCT116細胞(ATCC、CCL−247)を96−ウェルプレートに播種し、24時間37℃/5%CO2でインキュベートする。P1方法に従って生産したPP7(NC)−RLP−Luc−12X粒子による形質導入を、0〜20pg p24/細胞の範囲の用量で、8μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で行う。形質導入後4時間で、細胞を採取し、供給業者の推奨に従ってキットOneGloルシフェラーゼアッセイ(Promega)を使用して、及びSynergy H1 Hybridマイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して、ルシフェラーゼの発現を分析する。この試験は三連で実施される。対照は非形質導入HCT116細胞によって行われる。
結果を図XXXIIIに示す。本アッセイの目的は、第1のフェーズにおいて、PP7バクテリオファージのRNA/タンパク質相互作用システムが、RLP粒子の形成時にRNAカプシド形成を可能にするか否かを確認することである。第2のフェーズにおいて、このアッセイは、PP7(NC)−RLP粒子の使用の最良の実験条件を決定することを可能にする。
I.装置及び方法
1.プラスミド構築
1.1 PP7(NC)−RLPレンチウイルス粒子の生産のためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、RNA安定化又はイントロン配列の有無に関わらず、プロモーター−目的の配列−ポリA発現カセットを有する(図XXX参照)。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、PP7RNAのステム−ループモチーフのいくつかの反復(ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag 配列番号5)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した。
―2の反復(図XXXIVa)
―6の反復(図XXXV)
―12の反復(図XXX)
使用されたプラスミドは、実施例1で使用したプラスミドと同一である。
レンチウイルス粒子を実施例1に記載のように、P1方法に従って生産する。
HCT116細胞(ATCC、CCL−247)を96−ウェルプレートに播種し、24時間37℃/5%CO2でインキュベートする。P1方法に従って生産されたPP7(NC)−RLP−Luc−2X、6X、12X粒子による形質導入を、10pg p24/細胞の用量で、8μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で行う。形質導入上清を4時間後に除去し、新鮮な補充した増殖培地で置き換える。形質導入後4時間、8時間、24時間、32時間、及び48時間で、細胞を採取し、供給業者の推奨に従ってキットOneGloルシフェラーゼアッセイ(Promega)を使用して、及びSynergy H1 Hybridマイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して、ルシフェラーゼの発現を分析する。この試験は三連で実施される。対照は非形質導入HCT116細胞によって行われる。
結果を図XXXVIに示す。本アッセイの目的は、いくつかの所与の時間で、カプシド形成能力に対する、従って標的細胞へのRNAの転移に対する、PP7配列の反復モチーフの数の改変の影響を示すことである。2回、6回又は12回反復したPP7モチーフを含むPP7(NC)−RLP粒子は、MS2モチーフを12回含むMS2(NC)−RLP粒子によって得られたものに匹敵する割合で、RNAの転移を可能にする。したがってPP7(NC)−RLP粒子は、使用された反復モチーフの数がいくつであっても、RNAの送達に効果的である。それゆえ、用途の種類に応じて、反復の数は適用され得る。結果は、アッセイの条件下で、2回又は6回反復したPP7モチーフを含むPP7(NC)−RLP粒子が、MS2モチーフを12回含むMS2(NC)−RLP粒子の使用によって得られるものよりも効果的なRNAの転移を可能にすることを示す。ルシフェラーゼの発現動態は、4時間〜8時間に発光シグナルの増加を示し、短い半減期を有するタンパク質の場合、反復されるPP7配列のモチーフの数がいくつであっても、最大発現は早期に達成されることを示している。24時間後、ルシフェラーゼ活性は、32時間及び48時間で、形質導入後8時間の条件よりも4〜5低い強度の発光シグナルを達成するまで減少する。
I.装置及び方法
1.プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、RNA安定化又はイントロン配列の有無に関わらず、プロモーター−目的の配列−ポリA発現カセットを有する(図XXX参照)。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、PP7RNAのステム−ループモチーフのいくつかの反復(ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag 配列番号5)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した。
―2の反復(図XXXIVa)
―6の反復(図XXXV)
―12の反復(図XXX)
レンチウイルス粒子を実施例1に記載のように、P1方法に従って生産する。
HCT116細胞(ATCC、CCL−247)を96−ウェルプレートに播種し、24時間37℃/5%CO2でインキュベートする。P1方法に従って生産されたPP7(IN)−RLP−Luc−2X、6X、12X粒子による形質導入を2.8 pg p24/細胞の用量で、8μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で行う。形質導入上清を4時間後に除去し、新鮮な補充した増殖培地で置き換える。形質導入後4時間、8時間、24時間、32時間、及び48時間で、細胞を採取し、供給業者の推奨に従ってキットOneGloルシフェラーゼアッセイ(Promega)を使用して、及びSynergy H1 Hybridマイクロプレートリーダー(Biotek)を使用して、ルシフェラーゼの発現を分析する。この試験は三連で実施される。対照は非形質導入HCT116細胞によって行われる。
結果を図XXXIXに示す。本アッセイの目的は、インテグラーゼ中にPP7−Coatを有するレンチウイルス粒子にRNAを輸送することが可能であると確認すること、並びに、いくつかの所与の時間で、カプシド形成能力に対する、従って標的細胞へのRNAの転移に対する、PP7配列の反復モチーフの数の改変の影響を示すことである。ルシフェラーゼの最大発現は、PP7配列の反復モチーフの数がいくつであっても、8時間で達成される。8時間後、PP7配列の反復モチーフの数がいくつであっても、ルシフェラーゼ活性は減少し、そして異なる反復モチーフの数の間でのルシフェラーゼ活性の差異は統計的に有意ではない。それゆえ、PP7(IN)−RLP粒子はRNAが送達されることを可能にする。
I.装置及び方法
1.モノ−及びトリ−形質導入
本実施例は、単一タンパク質(ZsGreenI、mCherry又はmtBFP)の発現を可能にするシングルタイプのRNAの転移、又はいくつかの異なるタンパク質(ZsGreenI+mCherry+mtBFP)の発現を可能にするいくつかのタイプのRNAの転移のいずれかを可能にする、PP7RLP粒子又はILVベクターを用いて行う。
―カプシド形成及びエンベローププラスミドに加えて、(実施例1に記載のように)ZsGreenI、又はmCherry、又はmtBFPのいずれかをコードする単一発現プラスミドによる、HEK293T細胞のトランスフェクションによって、粒子を生産する、
―カプシド形成及びエンベローププラスミドに加えて、単一発現プラスミドでの粒子生産に使用される発現プラスミドの総量と同等の、発現プラスミドの総量のために、等モル量で加えた、ZsGreenI、mCherry及びmtBFPをそれぞれコードする3つの発現プラスミドによる、HEK293T細胞のトランスフェクションによって、粒子を生産する。
―独立して3タイプのPP7RLP粒子、ZsGreenI、mCherry又はmtBFPでの形質導入により、あるいは、同一時点でPP7RLP粒子の3タイプの同時形質導入(co-transduction)により、
―同時にZsGreenI、mCherry及びmtBFPをコードする3つの発現プラスミドを用いて生産された粒子でのモノ−形質導入により。
―独立して3タイプのILVベクター、ZsGreenI、mCherry又はmtBFPでの形質導入により、あるいは、同一時点でILV粒子の3タイプの同時形質導入により、
―同時にZsGreenI、mCherry及びmtBFPをコードする3つの発現プラスミドを用いて生産されたILVベクターでのモノ−形質導入により。
1.ILVとの比較における、PP7RLP粒子での単一形質導入においていくつかの異なるRNAを転移させる能力
以下のアッセイの目的は、標的細胞内にいくつかの異なるRNAを転移させるPP7RLP粒子の能力を実証し、従って標的細胞における形質導入の数の削減を可能にすることである。したがって、RNA種ごとに1つの形質導入を行うようにするよりもむしろ、単一形質導入でいくつかの異なるRNAを転移させることを可能にする。このために、PP7RLP粒子の精製バッチを実施例1で定義した最適条件下で生成した、すなわち国際特許出願第2013/014537号に記載の実施例1の方法P1に従って血清を含まずに生産した精製バッチを生成した。PP7RLP粒子の生産フェーズにおいて、いくつかの異なるタイプのRNAを含むPP7RLP粒子のバッチを得るために、カプシド形成及びエンベローププラスミドと共に、蛍光レポーターをコードする3つのタイプのプラスミドを、等モル量で同時に使用した(ZsGreenI、mCherry及びmtBFP)。次に、HCT116細胞をBX795の存在下で形質導入し、異なるRNAの転移を形質導入後24時間で観察する。
Claims (22)
- 以下:
・Gagポリタンパク質に由来するタンパク質;
・エンベロープタンパク質;
・任意によりインテグラーゼ;及び
・少なくとも2つのカプシド形成された異なる非ウイルス性RNA、
を含む、レトロウイルス粒子であって、
当該カプシド形成された異なる非ウイルス性RNAがそれぞれ、カプシド形成(encapsidation)配列に連結された目的のRNA配列を含み、
ここで、各カプシド形成配列は、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質に導入された結合ドメインによって認識されているか、あるいは、
前記レトロウイルス粒子が、インテグラーゼを含む場合、各カプシド形成配列は、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質に及び/又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識されている、
レトロウイルス粒子。 - 以下:
・ヌクレオカプシドタンパク質;
・エンベロープタンパク質;
・任意によりインテグラーゼ;及び
・少なくとも2つのカプシド形成された異なる非ウイルス性RNA、
を含み、当該カプシド形成された異なる非ウイルス性RNAがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のRNA配列を含み、
ここで、各カプシド形成配列は、ヌクレオカプシドタンパク質に導入された結合ドメインによって認識されているか、あるいは、
前記レトロウイルス粒子が、インテグラーゼを含む場合、各カプシド形成配列は、ヌクレオカプシドタンパク質に及び/又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識されている、
請求項1に記載のレトロウイルス粒子。 - 前記結合ドメインが、前記ヌクレオカプシドタンパク質に導入される、請求項2に記載のレトロウイルス粒子。
- 第2の結合ドメインが、前記ヌクレオカプシドタンパク質に導入される、請求項3に記載の粒子。
- 結合ドメインが、前記インテグラーゼにも導入される、請求項3又は4に記載の粒子。
- レンチウイルス粒子である、請求項2から5のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。
- −前記結合ドメインが、バクテリオファージMS2のコートタンパク質の配列であり、
−前記非ウイルス性RNAの前記カプシド形成配列が、MS2のステム−ループ配列であり、
−前記ヌクレオカプシドタンパク質が、Gagポリタンパク質に属するHIVのヌクレオカプシドタンパク質(NC)であって、そのNCが、バクテリオファージMS2のコートタンパク質配列を挿入するために第2のジンクフィンガーで変異している、
請求項6に記載のレンチウイルス粒子。 - −前記結合ドメインが、バクテリオファージPP7のコートタンパク質の配列であり、
−前記非ウイルス性RNAの前記カプシド形成配列が、PP7のステム−ループ配列であり、
−前記ヌクレオカプシドタンパク質が、Gagポリタンパク質に属するHIVのヌクレオカプシドタンパク質(NC)であって、そのNCが、バクテリオファージPP7のコートタンパク質配列を挿入するために第2のジンクフィンガーで変異している、
請求項6に記載のレンチウイルス粒子。 - 前記結合ドメインが、前記インテグラーゼに導入される、請求項1又は2に記載のレトロウイルス粒子。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の粒子を含有する組成物。
- 以下:
(i)少なくとも2つの異なる非ウイルスRNA配列を含む発現プラスミドであって、各RNA配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
(ii)Gagポリタンパク質に由来するタンパク質、及び任意によりインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミド、
ここで、前記Gagポリタンパク質に由来するタンパク質は、キメラであり、カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含むか、あるいは、
前記カプシド形成プラスミドが、インテグラーゼをコードする場合、前記Gagポリタンパク質に由来するタンパク質及び/又はインテグラーゼは、キメラであり、カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の粒子を生産するためのキット。 - 以下:
(i)少なくとも2つの異なる非ウイルス性RNA配列を含む発現プラスミドであって、各RNA配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第1及び第2の発現プラスミド、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、請求項3から8のいずれか一項に記載の粒子を生産するためのキット。 - 以下:
(i)少なくとも2つの目的の配列を含み、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第1及び第2の発現プラスミド、
当該目的の配列が異なっており、かつ当該カプシド形成配列が同一であり、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、請求項12に記載の粒子を生産するためのキット。 - 以下:
(i)少なくとも2つの異なる非ウイルスRNA配列を含む発現プラスミドであって、各RNA配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
(ii)Gagポリタンパク質に由来するタンパク質、及び任意によりインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミドを調製し、
ここで、前記Gagポリタンパク質に由来するタンパク質は、キメラであり、カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含むか、あるいは、
前記カプシド形成プラスミドが、インテグラーゼをコードする場合、前記Gagポリタンパク質に由来するタンパク質及び/又はインテグラーゼは、キメラであり、カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む、請求項11に記載のキットの製造方法。 - 以下:
(i)少なくとも2つの異なる非ウイルス性RNA配列を含む発現プラスミドであって、各RNA配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第1及び第2の発現プラスミド、を調製し、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む、請求項12に記載のキットの製造方法。 - 以下:
(i)少なくとも2つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第1及び第2の発現プラスミド、を調製し、
当該目的の配列が異なっており、かつ、当該カプシド形成配列が同一であり、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードする、カプシド形成プラスミドを調製し、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む、請求項13に記載のキットの製造方法。 - 請求項1から9のいずれか一項に記載の粒子の製造方法であって、以下:
(i)少なくとも2つの異なる非ウイルスRNA配列を含む発現プラスミドであって、各RNA配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
(ii)Gagポリタンパク質に由来するタンパク質、及び任意によりインテグラーゼをコードする、カプシド形成プラスミド
ここで、前記Gagポリタンパク質に由来するタンパク質は、キメラであり、カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含むか、あるいは、
前記カプシド形成プラスミドが、インテグラーゼをコードする場合、前記Gagポリタンパク質に由来するタンパク質及び/又はインテグラーゼは、キメラであり、カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を細胞にコトランスフェクト(co-transfecting)し、そして、
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取するステップ、
を含む、方法。 - 請求項3から8のいずれか一項に記載の粒子の製造方法であって、以下:
(i)少なくとも2つの異なる非ウイルス性RNA配列を含む発現プラスミドであって、各RNA配列が目的の配列を含み、当該目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第1及び第2の発現プラスミド、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を細胞にコトランスフェクトし、そして、
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取するステップ、
を含む、方法。 - 請求項18に記載の粒子の製造方法であって、以下:
(i)少なくとも2つの目的の配列を含み、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、第1及び第2の発現プラスミド、
当該目的の配列が異なっており、かつ当該カプシド形成配列が同一であり、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を細胞にコトランスフェクトし、そして、
前記粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を採取するステップ、
を含む、方法。 - 前記上清が清澄化される、請求項17から19のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記上清がまた、濃縮及び/又は精製される、請求項20に記載の製造方法。
- 細胞に形質導入するための、請求項10に記載の組成物。
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