CN107624131B - 包含至少两种衣壳化的非病毒rna的逆转录病毒颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于将非病毒RNA转移进靶细胞中的逆转录病毒系统,且更具体地涉及能够递送多种RNA的逆转录病毒颗粒。更具体地,它涉及包含从Gag多蛋白衍生出的蛋白、包膜蛋白、任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA的逆转录病毒颗粒,所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列,每种衣壳化序列被引入从Gag多蛋白衍生出的蛋白中和/或整合酶中的结合结构域识别。
Description
本发明涉及用于将非病毒RNA转移进靶细胞中的逆转录病毒系统,且更具体地涉及能够递送多种RNA的逆转录病毒颗粒。本发明还涉及包含这些逆转录病毒颗粒的组合物、用于生产它们的试剂盒、与其有关的制备方法、以及所述颗粒和组合物的用途。
将多种RNA引入靶细胞中是研究和开发中的一项重大挑战,如在基因治疗中。
从病毒衍生出的载体的应用已经变成基因转移的一项重要方法。目前,病毒载体分成两大类:
- 整合载体,其将自身整合进接受者基因组中,和
- 非整合载体,其经常形成染色体外遗传元件。
整合载体诸如γ-逆转录病毒载体(RV)和慢病毒载体(LV)会稳定地整合。非整合载体诸如腺病毒(ADV)载体和腺伴随病毒(AAV)载体从快速分裂的细胞中迅速地消除。一些影响特定载体的选择的因素包括它的衣壳化能力、它的宿主或靶细胞范围、它的基因表达谱、它的转导效率和它的引起免疫应答的能力,如果需要重复转导的话,这是特别有问题的。
某些应用需要使用非整合载体,诸如在基因治疗中或在众多体外、离体和体内应用中。作为例子,可以举例以下:
● 诱导专门细胞重新程序化为多能细胞,以及诱导干细胞或多能细胞分化成专门细胞,
● 同时在靶细胞中表达抗原或蛋白(无论是否有毒),
● 表达基因工程系统例如诸如CRE或TALEN蛋白或CRISPR系统,或任意其它需要蛋白或RNA表达的系统。
一种用于将RNA引入靶细胞中的方式采用以属于逆转录病毒科(Retroviridae)(也通过名称反转录病毒科或RNA病毒来命名)的病毒为基础的病毒载体。实际上,在它的复制周期过程中,逆转录病毒科的病毒具有将它的由RNA构成的基因组转化成双链DNA的能力,所述双链DNA将整合进靶细胞的基因组中。该逆转录病毒科的具体例子是γ-逆转录病毒和慢病毒。
逆转录病毒的复制周期包括通过结合膜受体而识别靶细胞(或宿主)的第一阶段。该识别阶段导致在与膜融合以后逆转录病毒进入宿主细胞中。逆转录病毒RNA然后通过逆转录病毒编码的逆转录酶复制成双链DNA,然后整合进宿主细胞的基因组中。该病毒基因组然后象宿主细胞的所有其它基因一样被宿主细胞转录。该基因组编码能够产生其它病毒的所有蛋白和序列。
更具体地,三种基因是所有逆转录病毒共有的:gag、pol和env。
Gag是编码多蛋白的基因,通过切割从该多蛋白衍生出的蛋白是在复制后参与病毒组装的结构蛋白。这些结构蛋白更具体地是基质蛋白(MA)、衣壳蛋白(CA)和核衣壳蛋白(NC)。
Pol是编码整合酶、逆转录酶和蛋白酶的基因。
Env是编码包膜糖蛋白的基因。
这三种基因因而使得可能将逆转录病毒RNA复制成双链DNA,将该DNA整合进宿主细胞的基因组中,然后产生新合成的逆转录病毒的结构:包膜、衣壳和核衣壳蛋白。但是,为了使新合成的逆转录病毒是完整的,必须将逆转录病毒RNA的两种拷贝衣壳化进这些结构中的每一种内。逆转录病毒RNA的两个拷贝向所述结构中的这种衣壳化,通过核衣壳蛋白对逆转录病毒RNA的拷贝携带的被称作Psi(因“包装信号”而得名)的衣壳化序列的识别来完成。
当将从逆转录病毒衍生出的病毒载体用于基因治疗目的时,编码gag、pol和/或env的区域的至少部分在衣壳化系统和用于表达目标序列的系统之间解离。例如,编码gag和pol的序列由衣壳化质粒携带,从而反向提供生产病毒载体所必需的蛋白。衣壳化序列象目标序列一样由独立系统携带,以便使得逆转录病毒是非复制的。
但是,在某些情况下,目标RNA序列向宿主细胞的基因组中的随机整合可以中断开放阅读阶段并阻断重要基因的表达。此外,对于某些应用,诸如细胞的重新程序化或干细胞的分化,推荐短暂地进行目标序列的瞬时表达。
申请WO2007/072056描述了一种病毒载体系统,其包含env、gag、任选的gag/pol以及含有异源衣壳化信号的RNA序列,所述异源衣壳化信号被与gag或与gag/pol结合的对应RNA结合结构域识别。该系统在所述申请中被描述为是非整合的和能够瞬时表达。
但是,这样的系统的效率是有限的。具体地,为了使靶细胞表达通过这些系统转移的目标RNA,通常必须向细胞中引入该目标RNA的几个拷贝且因此使用高MOI(代表“感染复数”)。MOI对应于引入的载体系统的数目与要感染的细胞的数目之比。高MOI实际上使得可能通过对相同细胞进行几次感染而将目标RNA的几个拷贝引入细胞中。尽管可能实现转移的目标RNA的表达水平,但是,高MOI的应用也导致一定程度的毒性,因为所述细胞遭受多次感染。
因此,仍然需要更有效的且更低毒性的病毒载体系统。
发明人的工作已经能够生产载体系统,其能够在单次感染中将几种目标RNA递送进同一个细胞中。
本发明因而涉及一种逆转录病毒颗粒,其包含来自Gag多蛋白的蛋白、包膜蛋白、任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA,所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列,每种衣壳化序列被引入所述来自Gag多蛋白的蛋白中和/或所述整合酶中的结合结构域识别。
根据本发明的逆转录病毒颗粒使得可能通过单次感染将至少2种、优选3种非病毒RNA引入细胞中。这样的颗粒向细胞中的引入可以通过体内、体外或离体方法完成。
“来自Gag多蛋白的蛋白”是指从Gag多蛋白的切割产生的任何蛋白。更具体地,它是核衣壳蛋白、基质蛋白(例如,在从MoMuLV型鼠病毒衍生出的逆转录病毒颗粒中)或对γ-逆转录病毒特异性的p12蛋白。
“包膜蛋白”是指任何包膜蛋白,包括假型化包膜蛋白。作为例子,可能举例Ampho包膜蛋白、嗜亲性包膜蛋白、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)的包膜蛋白、猫免疫缺陷病毒(FIV)的包膜蛋白、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)的包膜蛋白、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)的包膜蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)的包膜蛋白、麻疹病毒(MV)的包膜蛋白、Gibbon白血病病毒(GalV)的包膜蛋白、猫内源病毒(RD114)的蛋白或水疱性口炎病毒(VSV-G)的包膜蛋白。更具体地,所述包膜蛋白是Ampho包膜蛋白、嗜亲性包膜蛋白、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)的包膜蛋白、猫免疫缺陷病毒(FIV)的包膜蛋白、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)的包膜蛋白、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)的包膜蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)的包膜蛋白、麻疹病毒(MV)的包膜蛋白、Gibbon白血病病毒(GalV)的包膜蛋白或水疱性口炎病毒(VSV-G)的包膜蛋白。因而可以将包膜蛋白修饰成靶向某些细胞类型或某些应用(表面受体作为包膜蛋白的用途)。
也可能用抗体、糖脂和/或特定配体修饰包膜蛋白以便靶向特定受体和/或细胞类型。
优选地,所述包膜蛋白是VSV-G蛋白。
“整合酶”是指由pol基因编码的酶蛋白,其能够在逆转录病毒的复制以后将逆转录病毒DNA整合进受所述逆转录病毒感染的细胞的DNA中。
“衣壳化序列”是指被结合结构域特异性地识别的RNA基序(三维结构和序列)。优选地,所述衣壳化序列是茎-环基序。更优选地,逆转录病毒颗粒的衣壳化序列是细菌噬菌体MS2或噬菌体PP7的RNA茎-环基序,例如诸如分别从序列ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(SEQ ID No. 1)或(ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID No. 5)产生的序列。所述茎-环基序和更具体地细菌噬菌体MS2的RNA茎-环基序或噬菌体PP7的RNA茎-环基序,可以单独使用或重复数次,优选地2-25次,更优选地2-18次,例如6-18次。
“结合结构域”是指特异性地结合与目标RNA序列连接的衣壳化序列的蛋白的整体或部分。更具体地,它是特异性地结合衣壳化序列的、由三维结构限定的蛋白,无论是否是突变体。优选地,所述结合结构域是异源结构域。更优选地,所述结合结构域是细菌噬菌体MS2、噬菌体PP7或Qβ噬菌体的外壳蛋白,HK022原噬菌体的nun蛋白,U1A蛋白,或hPum蛋白。
更优选地,所述结合结构域是细菌噬菌体MS2或噬菌体PP7的外壳蛋白。
更优选地,当所述结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白时,其序列是自装配缺陷的,这是由于氨基酸67-75的缺失(PCPΔFG)(Chao等人. 2008)。优选地,噬菌体PP7的外壳蛋白序列针对人细胞经过密码子优化,即选择DNA的碱基以编码优选地存在于人物种中的氨基酸。
“每个序列”是指,所述衣壳化序列可以是相同的或不同的,取决于那些衣壳化序列是否被相同或不同的结合结构域识别。实际上,根据本发明的逆转录病毒颗粒可以包含一个或几个结合结构域。当引入几个结合结构域时,这些可以是在Gag多蛋白中和/或在整合酶中。
所述结合结构域不仅能够识别衣壳化序列,而且能够实现所述颗粒中带有衣壳化序列的RNA(或在本发明情况下,与衣壳化序列连接的非病毒RNA)的衣壳化。
“衣壳化”是指将RNA包装在病毒颗粒的病毒衣壳中。应当指出,在本发明中,非病毒RNA的衣壳化由非病毒衣壳化信号(尤其是Psi以外)的识别完成。
“目标序列”表示编码呈现用户兴趣的功能的序列。更具体地,由两种衣壳化的非病毒RNA中的每一种携带的目标序列可以是相同的或不同的。
使用根据本发明的颗粒,可能将相同或不同的非病毒RNA转移进靶细胞中。
由于衣壳化的RNA是非病毒的,这些RNA不存在由pol基因编码的蛋白所识别的位点。
这是因为,这些非病毒RNA不参与逆转录病毒的复制周期的早期步骤,即:
- 逆转录酶将单链病毒RNA复制成双链DNA;
- 通过整合酶对LTR末端的识别实现双链DNA成熟和细胞质整合前复合物成熟为细胞核整合前复合物。
由pol基因编码的这些病毒蛋白(反转录酶,整合酶)因而在所述颗粒中是任选的,且pol基因因而可以存在或被部分地或完全地删除。优选地,pol基因是存在的或被部分地删除。
应当指出,根据本发明的逆转录病毒颗粒包含病毒的和非病毒的遗传物质:
- gag基因,其可以是病毒的或嵌合的。更具体地,当向其中引入一个或多个结合结构域时,gag基因是嵌合的。
- 任选的pol基因,其可以是病毒的或嵌合的。由于pol基因编码几种酶,与那些酶有关的序列可以被完全地或部分地删除,是存在的和无功能的,或者是存在的和有功能的。更具体地,当向所述整合酶中引入一个或多个结合结构域时,pol基因是嵌合的。
- 至少两种非病毒RNA,每种非病毒RNA是目标序列和衣壳化序列的载体。更具体地,这些非病毒RNA不含任何病毒序列。
更具体地,根据本发明的逆转录病毒颗粒使得可能在靶细胞中引入RNA,所述RNA能够诱导:
● 对于所述靶细胞而言内源性的或外源性的一种或多种目标编码序列的转移,
● 一种或多种非编码RNA诸如能够诱导对基因表达的影响(例如通过shRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA或circRNA)的RNA的转移。
● 信使RNA类型或其它类型(miRNA等)的细胞RNA、病毒RNA的亚基因组复制子(VHC等)或完整病毒RNA基因组的转移。
● 对于所述靶细胞而言内源性的或外源性的编码或非编码序列的同时表达,
● 参与通过基因工程系统(例如CRISPR系统)对靶细胞的基因组修饰。
有利地,根据本发明的逆转录病毒颗粒包含核衣壳蛋白、包膜蛋白、任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA,所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列,每种衣壳化序列被引入所述核衣壳蛋白中和/或引入所述整合酶中的结合结构域识别。
“核衣壳蛋白”是指由gag基因编码的结构蛋白NC。当将结合结构域引入核衣壳蛋白中时,该蛋白则是源自嵌合gag基因的嵌合蛋白。
当将结合结构域引入整合酶中时,所述整合酶则是源自嵌合pol基因的嵌合蛋白。
“嵌合蛋白”是指包含几个组合的不同蛋白序列的重组蛋白。
根据第一个实施方案,在根据本发明的逆转录病毒颗粒中,将结合结构域引入核衣壳蛋白中,且至少两种非病毒衣壳化RNA通过它们的RNA序列来区分。
该第一个实施方案会实现目标RNA的早期瞬时表达,没有在靶细胞的基因组中的任何相关整合事件。
实际上,使根据该第一个实施方案的颗粒与靶细胞接触后,逆转录病毒颗粒的膜和靶细胞的膜将组合并使所述颗粒的内容物能够释放进所述靶细胞中。RNA然后释放进细胞质中,且细胞机制使那些RNA能够直接翻译成蛋白,即没有额外步骤诸如反转录、易位进细胞核中或整合进靶细胞的基因组中。
更具体地,所述至少两种非病毒RNA具有相同的衣壳化序列。在该情况下,所述至少两种非病毒衣壳化RNA通过它们的目标RNA序列彼此区分开,即在所述两种非病毒衣壳化RNA中包含的目标RNA序列是不同的。“不同”表示这样的目标序列:它们是不同的,或具有并非源自自发突变或由操作人员无意地选择的突变的差异。
可替换地,所述至少两种非病毒RNA具有两种不同的衣壳化序列。这些至少两种衣壳化序列然后被至少两种不同的结合结构域识别,这些结构域中的至少一种被引入在核衣壳蛋白中。在该情况下,所述至少两种非病毒衣壳化RNA可以包含相同或不同的目标序列。
可能衣壳化至少两种非病毒RNA,优选地三种非病毒RNA。
根据第一个实施方案的特定实施方案,将第二个结合结构域引入根据本发明的逆转录病毒颗粒的核衣壳蛋白中。
作为例子,当所述第一结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白时,所述第二个结合结构域可以是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白,或者当所述第一结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白时,所述第二个结合结构域可以是噬菌体PP7的外壳蛋白。
在该情况下,至少两种非病毒衣壳化RNA带有不同的衣壳化序列,每种衣壳化序列分别对应于引入核衣壳蛋白中的第一个和第二个结合结构域。
更具体地,当将三种非病毒RNA衣壳化时:
- 所述衣壳化的非病毒RNA中的至少两种存在于与第一结合结构域对应的相同衣壳化序列中,并且仅仅通过它们的目标RNA序列彼此区分开,
-第三种衣壳化的非病毒RNA可以带有相同或不同的衣壳化序列。当所述衣壳化序列是不同时,这可以对应于引入核衣壳蛋白中的第二个结合结构域。
还可以将其它结合结构域引入核衣壳蛋白中。
除了引入核衣壳蛋白中的一个或多个结合结构域以外,也可能将结合结构域引入整合酶中。
所述整合酶则是源自嵌合pol基因的嵌合蛋白。
优选地,当将结合结构域引入整合酶中时,所述整合酶序列在C-端结构域处突变以便插入结合结构域序列。更优选地,所述整合酶序列在C-端结构域处突变从而引入细菌噬菌体MS2或噬菌体PP7的外壳蛋白的序列。
在该情况下,所述至少两种非病毒衣壳化RNA可以带有不同的衣壳化序列,每种衣壳化序列分别对应于引入核衣壳蛋白中和整合酶中的结合结构域。
更具体地,当将三种非病毒RNA衣壳化时:
- 所述衣壳化的非病毒RNA中的至少两种存在于与第一结合结构域对应的相同衣壳化序列中,并且仅仅通过它们的目标RNA序列彼此区分开,
-第三种衣壳化的非病毒RNA带有不同的衣壳化序列,其对应于引入整合酶中的第二个结合结构域。
还可以将其它结合结构域引入整合酶中。
有利地,根据本发明的逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。
优选地,在这样的慢病毒颗粒中:
- 结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白,
- 所述非病毒RNA的衣壳化序列是MS2的茎-环序列,
- 核衣壳蛋白是属于嵌合Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC),所述NC序列在第二个锌指处突变以便插入细菌噬菌体MS2的外壳蛋白序列。
有利地:
- 包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSV-G蛋白。
- 衣壳化序列包含MS2茎-环序列的2-25个重复,优选地所述茎-环序列的6-18个重复,更优选地10-14个、例如12个重复。优选地,所述茎-环序列是以下的:ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(SEQ ID No.°1)。
或者,优选地,在这样的慢病毒颗粒中:
- 结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白,
- 所述非病毒RNA的衣壳化序列是PP7的茎-环序列,
- 核衣壳蛋白是属于嵌合Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC),所述NC序列在第二个锌指处突变以便插入PP7细菌噬菌体的外壳蛋白序列。
有利地:
- 包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSV-G蛋白。
- 衣壳化序列包含PP7茎-环序列的2-25个重复,优选地所述茎-环序列的2-18个重复,更优选地2-12个、例如6个重复。优选地,所述茎-环序列是以下的:ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID No.°5)。
任选地,如果第一结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白,那么引入整合酶中的第二个结合结构域可以是噬菌体PP7的外壳蛋白,或者如果第一结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白,那么引入整合酶中的第二个结合结构域可以是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白。
根据第二个实施方案,本发明涉及一种逆转录病毒颗粒,其包含来自Gag多蛋白的蛋白(优选核衣壳蛋白)、包膜蛋白、整合酶和至少两种非病毒衣壳化RNA,所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列,每种衣壳化序列被引入所述整合酶中的结合结构域识别,且任选地,被引入来自Gag多蛋白的蛋白(优选核衣壳蛋白)中的结合结构域识别。
该第二个实施方案会实现目标RNA的瞬时表达,没有在靶细胞的基因组中的任何相关整合事件。
优选地,在该第二个实施方案中,整合酶序列在C-端结构域处突变以便插入结合结构域序列。
有利地,所述结合结构域是异源结构域。更具体地,所述结合结构域是噬菌体PP7或Qβ噬菌体的细菌噬菌体MS2的外壳蛋白、HK022原噬菌体的nun蛋白、U1A蛋白或hPum蛋白。
优选地,整合酶序列在C-端结构域处突变从而引入细菌噬菌体MS2或噬菌体PP7的外壳蛋白的序列。
所述至少两种非病毒RNA可以是或不是存在于相同衣壳化序列中。
类似地,所述至少两种非病毒衣壳化RNA可以是或不是存在于相同目标RNA序列中。
优选地,所述至少两种非病毒衣壳化RNA通过它们的目标RNA序列彼此区分开,即在所述两种非病毒衣壳化RNA中包含的目标RNA序列是不同的。
更具体地,所述至少两种非病毒RNA存在于相同衣壳化序列中,后者被引入所述整合酶中的结合结构域识别。
可能衣壳化至少两种非病毒RNA,优选地三种非病毒RNA。
根据第二个实施方案的特定实施方案,将第二个结合结构域引入根据本发明的逆转录病毒颗粒的整合酶中。
作为例子,当第一结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白时,第二个结合结构域可以是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白,或当第一结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白时,第二个结合结构域可以是噬菌体PP7的外壳蛋白。
在该情况下,至少两种非病毒衣壳化RNA带有不同的衣壳化序列,每种衣壳化序列分别对应于引入整合酶中的第一个和第二个结合结构域。
更具体地,当将三种非病毒RNA衣壳化时:
- 衣壳化的非病毒RNA中的至少两种存在于与第一结合结构域对应的相同衣壳化序列中,这两种非病毒RNA可能通过它们的目标RNA序列彼此区分开,
-第三种衣壳化的非病毒RNA可以带有相同或不同的衣壳化序列。当衣壳化序列不同时,这可以对应于引入整合酶中的第二个结合结构域。
还可以将其它结合结构域引入整合酶中。
除了引入整合酶中的一个或多个结合结构域以外,也可能将结合结构域引入核衣壳蛋白中。
所述核衣壳蛋白则是源自嵌合gag基因的嵌合蛋白。
在该情况下,至少两种非病毒衣壳化RNA可以带有不同的衣壳化序列,每种衣壳化序列分别对应于引入整合酶中和引入核衣壳蛋白中的结合结构域。
更具体地,当将三种非病毒RNA衣壳化时:
- 衣壳化的非病毒RNA中的至少两种存在于与引入所述整合酶中的第一结合结构域对应的相同衣壳化序列中,这两种非病毒RNA可能通过它们的目标RNA序列彼此区分开,
- 第三种衣壳化的非病毒RNA带有不同的衣壳化序列,其对应于引入核衣壳蛋白中的第二个结合结构域。
还可以将其它结合结构域引入核衣壳蛋白中。
有利地,根据本发明的逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。
当逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒时,可能短暂地表达目标RNA,没有在靶细胞、特别是静止细胞的基因组中的任何相关整合事件。
实际上,除了它在整合反应本身中的作用以外,整合酶(IN)参与逆转录病毒的复制周期的不同步骤,诸如病毒颗粒的形态发生、反转录和整合前复合物(PIC)的入核转运。
更具体地,在慢病毒中,整合酶含有使它能够借助于PIC定位在细胞核中的核定位序列(NLS)。因此,当慢病毒的整合酶携带的结合结构域执行非病毒RNA的衣壳化时,衣壳化的非病毒RNA将被运输进靶细胞的细胞核中。实际上,使根据该第二个实施方案的慢病毒颗粒与靶细胞接触后,所述颗粒的膜和靶细胞的膜将组合并使所述衣壳的内容物能够释放进所述靶细胞中。RNA然后由整合酶负责,所述整合酶通过PIC将使RNA能够输入细胞核中。该负责对于某些应用而言是特别有利的,诸如在静止细胞中的表达。在除了慢病毒以外的逆转录病毒颗粒的情况下,整合酶不含有这些NLS,且因此被发现位于细胞质中。但是,可能向这类整合酶中加入NLS序列,以便诱导整合酶的核定位并从而诱导由该整合酶负责的RNA的核定位。
该负责对于CRISPR系统而言也是特别有用的,所述CRISPR系统需要RNA向导,所述RNA向导变得与靶细胞的基因组特异性地杂交。一旦杂交,这些RNA向导会引导内切核酸酶(Cas9),所述内切核酸酶将实现靶细胞基因组的特定基因座的修饰。
更具体地,在这样的慢病毒颗粒中:
- 所述结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白,
- 所述非病毒RNA的衣壳化序列是MS2的茎-环序列,
- 整合酶是嵌合酶蛋白,其序列已经在C-端结构域处突变以便插入细菌噬菌体MS2的外壳蛋白序列。
或者,更具体地,在这样的慢病毒颗粒中:
- 所述结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白,
- 所述非病毒RNA的衣壳化序列是PP7的茎-环序列,
- 整合酶是嵌合酶蛋白,其序列已经在C-端结构域处突变以便插入噬菌体PP7的外壳蛋白序列。
任选地,如果第一结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白,那么引入核衣壳中的第二个结合结构域可以是噬菌体PP7的外壳蛋白,或者如果第一结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白,那么引入整合酶中的第二个结合结构域可以是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白。
实际上,整合酶(IN)由三个不同的功能结构域组成,每个是必不可少的以确保完全整合反应。N-端结构域含有锌指型基序,其稳定IN的折叠结构并增加该酶的催化活性。IN的中央结构域含有该酶的催化活性所属的DDE氨基酸基序。该控制结构域也参与在逆转录病毒DNA的每个末端处保守的核苷酸序列的识别。C-端结构域是逆转录病毒科中最低保守的。它具有结合DNA的活性,且是3’末端的成熟反应(为了链转移)所必不可少的。除了它在整合反应本身中的作用以外,IN参与逆转录病毒的复制周期的不同步骤,诸如病毒颗粒的形态发生、反转录和整合前复合物的入核转运。
如Petit等人(1999; J. Virol. P5079-5088)所述,外源序列在IN的C-端中的插入不会扰乱靶细胞的生产和转导步骤,而在N-端中的相同插入不会实现转导事件的检测。
因而已经将逆转录病毒颗粒修饰成含有与整合酶蛋白组合的细菌噬菌体MS2的外壳蛋白(参见图I)或噬菌体PP7的外壳蛋白(参见图XXXVII)。修饰p8.74衣壳化质粒(编码整合酶蛋白的pol基因的载体)以便通过组装PCR在整合酶的C-端中插入编码外壳蛋白的序列。将p8.74质粒通过PCR线性化,然后将通过PCR预先扩增的外壳序列直接端对端地或通过添加接头克隆在整合酶的C-端。
有利地:
- 包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSV-G蛋白。
- 衣壳化序列包含MS2和/或PP7的茎-环序列的2-25个重复,根据引入的结合结构域,优选地所述茎-环序列的2-18个重复, 更优选地2-18个重复,诸如6-18个重复,更优选地,对于MS2的茎-环序列,10-14个、例如12个重复。
- 优选地,当所述结合结构域是MS2的外壳蛋白时,所述茎-环序列是以下的:ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID No.1),和/或当所述结合结构域是PP7的外壳蛋白时,所述茎-环序列是以下的:ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ IDNo.5)。
在下述实施例中更详细地描述了根据本发明的慢病毒颗粒的几个实施例:
- MS2RLP或MS2 (NC)-RLP 12X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入核衣壳中将带有细菌噬菌体MS2的茎-环基序的RNA衣壳化(重复12次)而形成的慢病毒颗粒,
- MS2 (NC)-RLP 2X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入核衣壳中将带有细菌噬菌体MS2的茎-环基序的RNA衣壳化(重复2次)而形成的慢病毒颗粒,
- MS2 (NC)-RLP 6X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入核衣壳中将带有细菌噬菌体MS2的茎-环基序的RNA衣壳化(重复6次)而形成的慢病毒颗粒,
- MS2 (IN)-RLP 2X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入整合酶中将带有细菌噬菌体MS2的茎-环基序的RNA衣壳化(重复2次)而形成的慢病毒颗粒,
- MS2 (IN)-RLP 6X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入整合酶中将带有细菌噬菌体MS2的茎-环基序的RNA衣壳化(重复6次)而形成的慢病毒颗粒,
- MS2 (IN)-RLP 12X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入整合酶中将带有细菌噬菌体MS2的茎-环基序的RNA衣壳化(重复12次)而形成的慢病毒颗粒,
- PP7 (NC)-RLP 2X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入核衣壳中将带有噬菌体PP7的茎-环基序的RNA衣壳化(重复2次)而形成的慢病毒颗粒,
- PP7 (NC)-RLP 6X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入核衣壳中将带有噬菌体PP7的茎-环基序的RNA衣壳化(重复6次)而形成的慢病毒颗粒,
- PP7RLP或PP7 (NC)-RLP 12X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入核衣壳中将带有噬菌体PP7的茎-环基序的RNA衣壳化(重复12次)而形成的慢病毒颗粒,
- PP7 (IN)-RLP 2X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入整合酶中将带有噬菌体PP7的茎-环基序的RNA衣壳化(重复2次)而形成的慢病毒颗粒,
- PP7 (IN)-RLP 6X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入整合酶中将带有噬菌体PP7的茎-环基序的RNA衣壳化(重复6次)而形成的慢病毒颗粒,
- PP7 (IN)-RLP 12X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入整合酶中将带有噬菌体PP7的茎-环基序的RNA衣壳化(重复12次)而形成的慢病毒颗粒。
优选地,由衣壳化RNA形成的慢病毒颗粒带有细菌噬菌体MS2或PP7噬菌体的茎-环基序,重复2-25次,更优选地2、6或12次。
更优选地,根据本发明的颗粒选自MS2 (NC)-RLP 12X、PP7 (NC)-RLP 6X、PP7(NC)-RLP 2X、MS2 (IN)-RLP 12X、PP7 (IN)-RLP 6X和PP7 (IN)-RLP 2X。
本发明还涉及包含根据本发明的颗粒的组合物。
更具体地,根据本发明的组合物是浓缩的组合物。有利地,还纯化所述组合物。根据在申请WO2013/014537中描述的方法,可以浓缩和纯化这些组合物。
通常,相对于粗制上清液,根据本发明的组合物包含小于30%的DNA污染物和小于45%的蛋白污染物。更具体地,相对于粗制上清液,根据本发明的组合物包含小于30%的DNA污染物和小于2%的蛋白污染物。
“粗制上清液”表示,澄清以后包含根据本发明的逆转录病毒颗粒的细胞培养物上清液。这样的澄清步骤更具体地在下面在制备根据本发明的颗粒的方法中描述。当将上清液的收获完成几次时,粗制上清液则对应于收集、组合(或“合并”)、然后澄清的所有上清液。
任选地,相对于粗制上清液,根据本发明的组合物包含小于1%的DNA污染物和小于1%的蛋白污染物。
本发明也涉及用于生产根据本发明的颗粒的试剂盒和用于制备那些试剂盒的方法。
更具体地,本发明涉及用于生产根据本发明的颗粒的试剂盒,其包含:
(i) 包含至少一种目标序列的表达质粒,在该序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或整合酶的衣壳化质粒,其为嵌合的,包含使衣壳化序列能被识别的结合结构域,和
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒。
这样的试剂盒还可以包含在所述试剂盒中所含的质粒的使用说明书。
更具体地,当所述试剂盒涉及根据第一个实施方案的颗粒时,该试剂盒包含:
(i) 包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒,每种RNA序列包含目标序列,在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒。
所述至少两种非病毒RNA序列是不同的,因为所述目标序列是不同的和/或所述衣壳化序列是不同的。
优选地,生产根据第一个实施方案的颗粒的试剂盒包含:
(i) 包含至少两种目标序列的表达质粒,在这些序列中的每一种的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
所述目标序列是不同的且所述衣壳化序列是相同的,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒。
有利地,所述试剂盒生产慢病毒颗粒。
优选地:
- 在表达质粒中,衣壳化序列包含MS2茎-环序列的2-25个重复,优选地茎-环序列的6-18个重复,更优选地10-14个、例如12个重复。有利地,所述茎-环序列是以下的:ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID No.°1)。
- 在衣壳化质粒中,所述核衣壳蛋白是属于Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC),所述NC在第二个锌指处突变以便插入细菌噬菌体MS2的外壳蛋白序列。
- 在包膜质粒中,所述包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的蛋白VSV-G。
或优选地:
- 在表达质粒中,衣壳化序列包含PP7茎-环序列的2-25个重复,优选地所述茎-环序列的2-18个重复,更优选地2-12个、例如6个重复。有利地,所述茎-环序列是以下的:ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID No. 5)。
- 在衣壳化质粒中,所述核衣壳蛋白是属于Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC),所述NC在第二个锌指处突变以便插入噬菌体PP7的外壳蛋白序列。
- 在包膜质粒中,所述包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的蛋白VSV-G。
任选地,所述试剂盒包含编码嵌合整合酶的第二个衣壳化质粒,所述嵌合整合酶包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域。第二个结合结构域可以与嵌合核衣壳蛋白的结合结构域相同或不同。
作为不同结合结构域的示例:
- 引入核衣壳中的结合结构域可以是MS2的外壳蛋白,且引入整合酶中的结合结构域可以是PP7的外壳蛋白,或者
- 引入核衣壳中的结合结构域可以是PP7的外壳蛋白,且引入整合酶中的结合结构域可以是MS2的外壳蛋白。
可以将几个结合结构域引入每个嵌合蛋白中。
可替换地,当试剂盒涉及根据第二个实施方案的颗粒时,该试剂盒包含:
(i) 包含至少一种目标序列的表达质粒,在该序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码嵌合整合酶的衣壳化质粒,所述嵌合整合酶包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒。
还提供了用于制备根据本发明试剂盒的方法。通常,用于制备根据本发明试剂盒的方法包括:
(i) 制备包含至少一种目标序列的表达质粒,在该序列的上游或下游插入衣壳化序列
(ii) 制备编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或整合酶的衣壳化质粒,其为嵌合的,包含使衣壳化序列能被识别的结合结构域,和
(iii) 制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
更具体地,当所述方法涉及指向根据第一个实施方案的颗粒的试剂盒时,它包括:
(i) 制备包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒,每种RNA序列包含目标序列,在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 制备编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
所述至少两种非病毒RNA序列是不同的,因为所述目标序列是不同的和/或所述衣壳化序列是不同的。
优选地,该方法包括:
(i) 制备包含至少两种目标序列的表达质粒,在这些序列中的每一种的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
所述目标序列是不同的且所述衣壳化序列是相同的,
(ii) 制备编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和
(iii) 制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
可替换地,当所述方法涉及指向根据第二个实施方案的颗粒的试剂盒时,该方法包括:
(i) 制备包含至少一种目标序列的表达质粒,在该序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 制备编码嵌合整合酶的衣壳化质粒,所述嵌合整合酶包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
本发明也涉及用于制备根据本发明的颗粒的方法。
这样的方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤:
(i) 包含至少一种目标序列的表达质粒,在该序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或整合酶的衣壳化质粒,其为嵌合的,包含使衣壳化序列能被识别的结合结构域,和
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒。
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
在制备根据本发明的颗粒的方法中采用的细胞是生产细胞,即这样的细胞:其一旦用带有形成逆转录病毒颗粒所必需的遗传物质的质粒转染,就能够形成所述颗粒。作为生产细胞的示例,可以举例HEK293T。
“共转染步骤”是指这样的转染步骤:其中通过使生产细胞与制备颗粒的方法的质粒集合接触来进行转染。
更具体地,当制备方法涉及生产根据第一个实施方案的颗粒时,它包括用以下质粒共转染细胞的步骤:
(i) 包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒,每种RNA序列包含目标序列,在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒,
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
所述至少两种非病毒RNA序列是不同的,因为所述目标序列是不同的和/或所述衣壳化序列是不同的。
优选地,该制备颗粒的方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤:
(i) 包含至少两种目标序列的表达质粒,在这些序列中的每一种的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
所述目标序列是不同的且所述衣壳化序列是相同的,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒,
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
可替换地,当制备方法涉及生产根据第二个实施方案的颗粒时,该方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤:
(i) 包含至少一种目标序列的表达质粒,在该序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码嵌合整合酶的衣壳化质粒,所述嵌合整合酶包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒,
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
优选地,根据在申请WO2013/014537中描述的方法完成所有用于制备根据本发明的颗粒的方法。
更具体地,在无血清培养基中培养的生产细胞上进行这些用于制备颗粒的方法,且不进行丁酸钠诱导。
有利地,在指定的时间间隔,诸如逆转录病毒颗粒的半衰期量级的时间间隔,收集上清液数次,例如3-6次。通常,以6-18h的量级的时间间隔,优选地8-16h,诸如8h、12h和/或16h,进行上清液的收获4-5次。优选地,该收获在更换细胞的培养基以后进行,该更换优选地在转染后24h进行。
用于制备根据本发明的颗粒的方法也包括在其中澄清上清液的步骤。
优选地,通过离心完成上清液的澄清。
更优选地,这些制备根据本发明的颗粒的方法还包括其中将上清液浓缩和/或纯化的步骤。
优选地,通过在离心单元上的正面超滤完成浓缩和纯化。
有利地,上清液经历一个或多个额外纯化步骤。这些纯化步骤优选地通过切向超滤和/或通过渗滤完成。更优选地,上清液经历切向超滤步骤和随后的渗滤步骤。
切向超滤有利地用聚砜中空纤维筒完成。
任选地,所述组合物然后可以经历离子交换色谱法、特别是阴离子交换色谱法的步骤。然后将在该色谱法步骤中产生的洗脱液收集,然后通过中央离心单元上的正面超滤再次浓缩。相对于粗制上清液,从这样的方法产生的组合物包含小于1%的DNA污染物和小于1%的蛋白污染物。
本发明还涉及能够通过任一种制备根据本发明的颗粒的方法得到的组合物。
通常,相对于粗制上清液,这些组合物包含小于30%的DNA污染物和小于45%的蛋白污染物。更具体地,相对于粗制上清液,根据本发明的组合物包含小于30%的DNA污染物和小于2%的蛋白污染物。
任选地,相对于粗制上清液,根据本发明的组合物包含小于1%的DNA污染物和小于1%的蛋白污染物。
最后,本发明涉及根据本发明的颗粒或根据本发明的组合物用于转导细胞的用途。
根据本发明的颗粒和组合物的应用对于转导原代细胞和永生化系以便短暂地修饰它们而言是特别有利的。所述细胞可以是哺乳动物或其它真核生物的细胞。具体地,这些细胞的转导可以在体内、在体外或离体进行。
考虑到通过举例说明给出的下述实施例,参考分别呈现的附图,将更好地理解本发明。
- 图I的简图解释了为了将结合结构域插入整合酶序列中对慢病毒衣壳化质粒p8.74的修饰,该衣壳化质粒被用于生产根据本发明的慢病毒颗粒;
- 图II呈现了表达质粒构建的不同简图,所述表达质粒带有荧光素酶(图IIa)、荧光报告物(图IIb)或CRE (图IIc)作为目标RNA序列,这些表达质粒被用于生产根据本发明的MS2RLP慢病毒颗粒;
- 图III呈现的简图解释了为了将MS2外壳结合结构域插入核衣壳序列中对慢病毒衣壳化质粒p8.74的修饰(IIIa),和由此产生的质粒构建(IIIb),该衣壳化质粒被用于生产根据本发明的MS2RLP慢病毒颗粒;
- 图IV是包膜质粒构建的简图;
- 图V呈现了整合慢病毒表达质粒构建的不同简图,所述质粒带有荧光素酶(图Va)、荧光报告物(图Vb)或CRE (图Vc)作为目标序列;
- 图VI是衣壳化质粒的构建的简图,该衣壳化质粒被用于生产整合型慢病毒载体(ILV);
- 图VII是衣壳化质粒的构建的简图,该衣壳化质粒被用于生产整合缺陷型慢病毒载体(IDLV);
- 图VIII解释了用慢病毒载体(ILV, IDLV)和根据本发明的MS2RLP慢病毒颗粒转导的HCT116细胞中的ZsGreenI的表达动力学;
- 图IX解释了用慢病毒载体(ILV, IDLV)和根据本发明的MS2RLP慢病毒颗粒转导且用荧光素酶表达质粒(pLuc)转染的HCT116细胞中的荧光素酶的表达动力学;
- 图X解释了用ILV载体和根据本发明的MS2RLP慢病毒颗粒转导包皮成纤维细胞以后荧光素酶表达的剂量效应;
- 图XI解释了根据本发明的MS2RLP慢病毒颗粒的组合物的纯度(用或不用血清生产)对包皮成纤维细胞的转导的影响;
- 图XII解释了根据本发明的MS2RLP慢病毒颗粒的组合物的纯度(用或不用血清生产)对HCT116细胞的转导的影响;
- 图XIII解释了在根据本发明的MS2RLP慢病毒颗粒和ILV载体对包皮成纤维细胞的转导时BX795的存在的影响;
- 图XIV解释了在根据本发明的MS2RLP慢病毒颗粒和ILV载体对BX795细胞的转导时BX795的存在的影响;
- 图XV、XVI和XVII解释了注射根据本发明的MS2RLP颗粒的混悬液(经过或未经过纯化)和经纯化的ILV载体的混悬液以后,在小鼠中通过体内生物发光得到的荧光素酶的表达动力学,图XV呈现了每只动物在给定的时间的照片,图XVI和XVII的图呈现了在那些时间荧光素酶表达的测量;
- 图XVIII的简图解释了HCT116-Lox-dsRed-Lox细胞中的荧光的熄灭,所述细胞用ILV载体或根据本发明的MS2RLP颗粒转导或用能够表达Cre重组酶的pCre质粒转染;
- 图XIX的简图解释了用ILV载体或根据本发明的MS2RLP颗粒转导或用pCre质粒转染以后,HCT116- Lox-dsRed-Lox细胞中的Cre DNA的拷贝数的定量;
- 图XX解释了几种RNA (RNA ZsGreenl + mCherry + mtBFP)在含有根据本发明的MS2RLP颗粒的HCT116细胞中的转移动力学;
- 图XXI呈现了几种RNA (RNA ZsGreenl + mCherry + mtBFP)在含有根据本发明的MS2RLP颗粒或IDLV载体的HCT116细胞中的转移动力学的对比;
- 图XXII解释了几种RNA (RNA ZsGreenl + mCherry + mtBFP)在含有ILV整合载体的HCT116细胞中的转移动力学;
- 图XXIII解释了在转染后48h在HCT116细胞中生产MS2(NC)-RLP-12X ZsGreenI颗粒的方法的影响;
- 图XXIV呈现了根据本发明带有荧光素酶作为目标RNA序列的表达质粒的简图,所述表达质粒用于生产MS2 (NC)-RLP 2X慢病毒颗粒,其包含MS2茎-环基序(重复2次);
- 图XXV呈现了根据本发明带有荧光素酶作为目标RNA序列的表达质粒的简图,所述表达质粒用于生产MS2 (NC)-RLP 6X慢病毒颗粒,其包含MS2茎-环基序(重复6次);
- 图XXVI呈现了根据本发明带有荧光素酶作为目标RNA序列的表达质粒的简图,所述表达质粒用于生产MS2RLP慢病毒颗粒,其包含MS2茎-环基序(重复12次);
- 图XXVII解释了根据本发明,在10pg p24/细胞的剂量,用包含MS2茎-环基序(重复2次、6次或12次)的MS2 (NC)-RLP-Luc慢病毒颗粒转导的HCT116细胞中的荧光素酶RNA的转移动力学;
- 图XXVIII呈现了为了将结合结构域插入图I所示的整合酶序列中修饰p8.74慢病毒衣壳化质粒而得到的衣壳化质粒的简图,所述衣壳化质粒被用于生产根据本发明的MS2 (IN)-RLP慢病毒颗粒;
- 图XXIX解释了根据本发明,在5pg p24/细胞的剂量,用包含MS2茎-环基序(重复2次、6次或12次)的MS2 (IN)-RLP-Luc慢病毒颗粒转导的HCT116细胞中的荧光素酶RNA的转移动力学;
- 图XXX呈现了根据本发明带有荧光素酶作为目标RNA序列的表达质粒的简图,所述表达质粒被用于生产PP7RLP慢病毒颗粒,其包含PP7茎-环基序(重复12次);
- 图XXXI呈现的简图解释了为了将外壳PP7结合结构域插入核衣壳序列中对p8.74慢病毒衣壳化质粒的修饰;
- 图XXXII呈现了the简图of the衣壳化质粒被用于生产PP7 (NC)-RLP根据本发明的慢病毒颗粒;
- 图XXXIII解释了根据本发明的PP7 (NC)-RLP-Luc 12X颗粒对HCT116细胞的转导的剂量效应;
- 图XXXIV呈现了用于生产根据本发明的PP7 (NC)-RLP 2X或PP7 (IN)-RLP 2X颗粒的、含有PP7茎-环基序(重复2次)的表达质粒的简图,所述表达质粒包含荧光素酶(图XXXIVa)或荧光报告物(图XXXIVb)的表达盒;
- 图XXXV呈现了用于生产根据本发明的PP7 (NC)-RLP 6X或PP7 (IN)-RLP 6X颗粒的、含有PP7茎-环基序(重复6次)的包含荧光素酶的表达质粒的简图;
- 图XXXVI解释了在10pg p24/细胞的剂量用PP7 (NC)-RLP-Luc颗粒转导的HCT116细胞中的荧光素酶RNA的转移动力学,其中将PP7茎-环基序重复2次、6次或12次;
- 图XXXVII呈现了为了将结合结构域插入整合酶序列中对p8.74慢病毒衣壳化质粒的修饰的简图;
- 图XXXVIII呈现了通过修饰在图XXXVII中呈现的p8.74慢病毒衣壳化质粒得到的衣壳化质粒的简图,所述衣壳化质粒被用于生产根据本发明的PP7 (IN)-RLP慢病毒颗粒;
- 图XXXIX解释了根据本发明,在2.8 pg p24/细胞的剂量,用包含PP7茎-环基序(重复2次、6次或12次)的PP7 (IN)-RLP-Luc慢病毒颗粒转导的HCT116细胞中的荧光素酶RNA的转移动力学;和
- 图XL解释了PP7 (NC)-RLP 2X颗粒向HCT116细胞中转移ZsGreenl + mCherry +mtBFP RNA。
实施例1:MS2RLP慢病毒颗粒的构建
I. 设备和方法
1. 质粒构建
1.1用于生产MS2RLP慢病毒颗粒的质粒
● 目标序列的表达质粒:所述表达质粒带有启动子-目标序列-聚腺苷酸表达盒(参见图II),具有或没有RNA稳定化或内含子序列。为了将mRNA运输进慢病毒颗粒中,将MS2RNA的茎-环基序(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID No. 1)的12个重复插入在报道基因下游的表达盒内。使用的启动子可以是CMV (图IIa)或EF1 (图IIb和IIc)的启动子,但是可以使用其它启动子。所述目标序列可以是编码报道蛋白诸如天然荧火虫荧光素酶(图IIa)、绿(ZsGreenI)、红(mCherry)或蓝(mtBFP)荧光蛋白(图IIb)的DNA,或编码蛋白例如CRE蛋白(图IIc)的cDNA。所述目标序列还可以是shRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA或circRNA的序列。
● 衣壳化质粒:将慢病毒颗粒修饰成含有在核衣壳蛋白内的细菌噬菌体MS2的外壳蛋白序列,替代并替换第二个锌指结构域。根据图IIIa所示的策略修饰用于生产MS2RLP颗粒的p8.74衣壳化质粒(图III),即编码结构蛋白和功能蛋白(Gag, Pol)的基因的载体:使用该p8.74质粒通过PCR组装产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二个锌指的质粒。通过HpaI克隆用噬菌体MS2的外壳蛋白置换第二个锌指以产生p8.74ΔZF-MS2-外壳质粒。由此得到在图IIIb中所示的构造。编码Pol的序列可以在某些功能元件中缺失或突变,例如诸如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列,而不改变MS2RLP的功能。
● 包膜质粒(pENV):该质粒携带编码包膜蛋白的基因,其可以是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSVG (图IV)。
1.2用于生产整合型慢病毒载体ILV的质粒
● 目标序列的表达质粒:所述表达质粒携带启动子-目标序列表达盒(图V)。该质粒可能含有其它元件,诸如WPRE天然序列(WPRE代表土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件)或cPPT/CTS序列。通过用转基因置换逆转录病毒复制所需的病毒基因组的区域来消除病毒的致病性。
● 衣壳化质粒:将携带编码结构蛋白和功能蛋白(Gag, Pol)的基因的p8.74衣壳化质粒用于生产整合型慢病毒载体(图VI)。
● 包膜质粒(pENV):该质粒与用于生产MS2RLP慢病毒颗粒的包膜质粒相同(图IV)。
1.3用于生产整合缺陷型慢病毒载体IDLV的质粒: 突变体D64L
除了衣壳化质粒包含编码整合酶的pol序列的D64L突变以外,3个质粒与在第1.2点中描述的那些相同(图VII)。在单个氨基酸上的该突变诱导整合的抑制(Nightingale等人, 2006和Apolonia等人, 2007)。通过定位诱变将整合酶(IN)上的D64L突变引入p8.74质粒中。通过测序来验证突变。
1.4 pLuc和pCre质粒
这些表达质粒与用于生产ILV和IDLV载体(图Vb关于pLuc,图Vc关于pCre)的那些类似,直接用在转染中作为对照。
2. 批量生产
将质粒转染进细胞中以后,将上清液收获并原样使用,或根据在申请WO 2013/014537中描述的方法浓缩/纯化。
2.1慢病毒载体和慢病毒颗粒的生产
用HEK293T细胞(ATCC, CRL-11268)在10-叠CellSTACK (6360 cm²,Corning)中进行生产,所述细胞在补充了1%青霉素/链霉素和1%超谷氨酰胺(PAA)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM, Gibco, Paisley, UK)中在含有5%CO2的恒湿气氛下在37℃培养。对于血清影响研究测定,给DMEM补充10%SVF。具体地,不进行丁酸钠诱导。对于每批(MS2RLP,ILV和IDLV),转染混合物由以下三种质粒组成:
- 上述的表达质粒之一,取决于形成的对象是颗粒(MS2RLP)还是载体(ILV,IDLV),
- p8.74ΔZF外壳(MS2RLP)、p8.74 (ILV)或在位置D64L处突变的p8.74 (IDLV),和
- 带有包膜VSV-G的pENV。
用磷酸钙标准转染以后24小时,将培养物上清液用新鲜的未补充的DMEM培养基替换。将细胞在37℃/5%CO2温育。更换培养基以后,将上清液收获4次(转染后32h、48h、56h和72h)。每次收集物通过在3000g离心5min进行澄清,然后在0.45µm过滤器(Stericup,Millipore)上微滤。然后将所有收集物合并以组成粗制上清液。
2.2慢病毒载体和慢病毒颗粒的浓缩和纯化
将载体和颗粒根据以下两种方法之一浓缩和纯化:
● 方法P1涉及在离心中央单元上执行上清液的正面超滤。
● P2方法涉及执行切向超滤,然后渗滤上清液。将粗制上清液通过使用聚砜中空纤维筒的切向超滤进行浓缩和纯化。将上清液通过以连续模式在DMEM或TSSM缓冲液中渗滤处理20个透析体积(diavolume)。渗滤以后,将渗余物收集,然后通过在中央离心单元上正面超滤再次浓缩。
3. 滴定
3.1通过qPCR滴定功能颗粒
将HCT116细胞(ATCC, CCL-247)接种在96-孔平板内的100µL补充了10%SVF、100µg/mL链霉素、100 U/mL青霉素和2mM L-Gln的DMEM中,然后在37℃/5%CO2温育24h。为每种载体以及为内部校准参照物进行6次系列稀释。将细胞通过在有Polybrene®8µg/mL (Sigma)存在下系列稀释进行转导,然后在37℃/5%CO2温育3天。对于样品的每个系列,加入未转导的细胞的一个孔作为对照。接下来将细胞用胰蛋白酶处理,并在使用Nucleospin组织gDNA提取试剂盒(Macherey-Nagel)提取基因组DNA以后通过qPCR确定滴度(转导单位/mL)。将通过qPCR得到的滴度(TU/mL)用内部校准参照物归一化,预先通过FACS确定所述内部校准参照物的滴度。
3.2通过P24 Elisa试验量化物理颗粒
使用并遵循关于HIV-1 p24 ELISA试剂盒(Perkin Elmer)的推荐,在病毒上清液中直接检测p24衣壳蛋白。使捕获的p24蛋白与生物素化的多克隆抗体形成复合物,然后通过抗生蛋白链菌素-HRP过氧化物酶缀合物检测。将得到的复合物与底物邻-苯二胺-HCl(OPD)一起温育以后通过分光光度法检测,所述底物产生与捕获的p24的量直接成比例的黄色。使用微量培养板读数器Synergy H1 Hybrid (Biotek)定量每个孔的吸光度,并相对于p24蛋白校准参照范围的吸光度进行校准。从已知1pg p24蛋白对应于104个物理颗粒得到的p24蛋白浓度,计算以物理颗粒/mL表达的病毒滴度。
4. 单转导
本实施例涉及开发上面生产的慢病毒载体或慢病毒颗粒的单转导条件。
5. ZsGreenI的表达动力学
将在前一天以25000个细胞/cm2接种在24-孔板(Corning)中的HCT116细胞在有8µg/mL的Polybrene®存在下转导至100000个PP/细胞。在转导后8h和24h,将细胞用胰蛋白酶处理并通过流式细胞计量术分析以测量荧光细胞的百分比。一式三份地进行每个测定。
6. 荧光素酶的表达动力学
6.1 HCT116细胞
将HCT116细胞(ATCC, CCL-247)接种在6或24-孔平板中并在37℃/5%CO2温育24h。在有4µg/mL Polybrene存在下进行ILV或IDLV载体或MS2RLP颗粒的转导。4小时以后将转导上清液消除并用新鲜的补充的生长培养基替换。从转导后4h至24h,将细胞收获并使用试剂盒OneGlo Luciferase测定(Promega)按照供应商的推荐和使用Synergy H1 Hybrid微量培养板读数器(Biotek)分析荧光素酶的表达。一式三份地进行该试验。平行地,用pLuc质粒转染HCT116细胞。为此,使用PEI PRO®(Polyplus Transfection)用2.6µg pLuc质粒转染50000个HCT116细胞。
6.2包皮成纤维细胞
在有4µg/mL的Polybrene®存在下转导在前一天以10,000个细胞/cm2接种在6-孔板(Corning)中的包皮成纤维细胞。将细胞用MS2RLP-Luc转导至200 000和500 000PP/细胞,或用Luc整合型慢病毒载体以MOI5转导。
将用MS2RLP-Luc转导的细胞在转导后8h用胰蛋白酶处理,并传递进不透明的黑底96-孔平板内的100µL完全培养基中。将用ILV Luc转导的细胞在转导后24h用胰蛋白酶处理,并传递进不透明的黑底96-孔平板内的100µL完全培养基中。在光度计中读出之前3分钟,每孔加入100µL试剂One Glo Luciferase (Promega)进行分析。
6.3在小鼠中
通过体内生物发光进行荧光素酶的表达动力学测量。
对比了三组Balb/c雄性小鼠,第一组接受经纯化的rLV-EF1-Luc整合型慢病毒的混悬液(n=2),第二组接受根据P2方法生产的MS2RLP-Luc颗粒的混悬液(n=4),且最后一组接受根据方法P1生产的MS2RLP-Luc颗粒的混悬液(n=4)。未注射的动物充当阴性对照用于确定背景噪音。
在全身注射以后5h至24h (图XV A)和48h至168h (图XV B),进行测量。在腹膜内注射300 mg/kg de D-luciferine (Promega)以后15分钟,用Andor照相机和Solis成像软件进行荧光素酶表达的每次测量。采集时间是5分钟,并将得到的图像用ImageJ软件处理和归一化。图XV显示了每只动物在给定的时间的图像。所述图(图XVI和XVII)呈现了在这些时间以相对发光单位(RLU)计的荧光素酶表达的测量结果。
7. 颗粒的纯度对转导的影响
7.1包皮成纤维细胞
在有4µg/mL的Polybrene®存在下转导在前一天以10000个细胞/cm2接种在24-孔CellBind (Corning)中的包皮成纤维细胞。用两类上清液性质以500 000个PP/细胞转导细胞:在有血清存在下生产的批次,然后用P2方法得到;和在没有血清存在下生产的批次,然后用P2方法得到。在转导后8h,将细胞用胰蛋白酶处理,并传递进不透明的黑底96-孔平板内的100µL完全培养基中。在光度计中读出之前3分钟,每孔加入100µL试剂One GloLuciferase (Promega)进行分析。
7.2 HCT116细胞
在有4µg/mL的Polybrene®存在下转导在前一天以25000个细胞/cm2接种在24-孔CellBind (Corning)中的细胞。用两类上清液性质以100000个PP/细胞转导细胞:在有血清存在下生产的批次,然后用P1方法得到;和在没有血清存在下生产的批次,然后用P1方法得到。在转导后8h,将细胞用胰蛋白酶处理,并传递进不透明的黑底96-孔平板内的100µL完全培养基中。在光度计中读出之前3分钟,每孔加入100µL试剂One Glo Luciferase(Promega)进行分析。
8. BX795的影响
8.1包皮成纤维细胞
在有4µg/mL的Polybrene®存在下转导在前一天以10,000个细胞/cm2接种在6-孔CellBind (Corning)中的包皮成纤维细胞。将细胞转导至500000个PP/细胞(对于MS2RLP颗粒)和MOI 5(对于ILV)。在转导后8h,将细胞用胰蛋白酶处理并传递进不透明的黑底96-孔平板内的100µL完全培养基中。在光度计中读出之前3分钟,每孔加入100µL试剂One GloLuciferase (Promega)进行分析。
8.2 HCT116细胞
在有4µg/mL的Polybrene®存在下转导在前一天以25,000个细胞/cm2接种在6-孔CellBind (Corning)中的HCT116细胞。将细胞转导至100000个PP/细胞(对于MS2RLP)和MOI5(对于ILV)。在转导后8h,将细胞用胰蛋白酶处理并传递进不透明的黑底96-孔平板内的100µL完全培养基中。在光度计中读出之前3分钟,每孔加入100µL试剂One Glo Luciferase(Promega)进行分析。
9. CRE重组酶的体外表达
在第一阶段,在有4µg/mL Polybrene存在下用ILV-EF1-Lox-dsRed-Lox慢病毒载体在MOI20转导HCT116细胞(ATCC, CCL-247)。6天以后,通过以0.5个细胞/孔的比率将细胞接种在96-孔平板中,使用有限稀释来克隆该多克隆群体。基于dsRed的表达水平,通过细胞计量术(MACS Quant VYB, Miltenyi)选择HCT116-lox-dsRed-lox-clone 14单克隆系。
在第二阶段,在有4µg/mL的Polybrene®存在下用ILV-Cre载体(在MOI 5)或MS2RLP-Cre颗粒(在25个物理颗粒(Physical Particles,PP)/细胞的剂量)转导多克隆和单克隆细胞系。
将用MS2RLP-Cre颗粒或用ILV-Cre载体转导的HCT116-Lox-dsRed-Lox单克隆和多克隆细胞在37℃/5%CO2温育14天。在转导后14天,通过流式细胞计量术分析dsRed的表达。非转导细胞(NT)充当对照。一式三份地进行该测定。平行地,用pCre质粒转染HCT116-Lox-dsRed-Lox单克隆和多克隆细胞。为此,使用PEI PRO®(Polyplus Transfection)用2.6µgpCre质粒转染50000个HCT116-Lox-dsRed-Lox细胞。
从HCT116-Lox-dsRed-Lox细胞(其用ILV-Cre载体或用MS2RLP-Cre颗粒转导,或用pCRE质粒转染)提取DNA以后,通过检测Cre重组酶的短序列通过qPCR测量整合进细胞中的拷贝的数目:
gcatttctggggattgcttataacaccctgttacgtatagccgaaattgccaggatcagggttaaagatatctcacgtactgacggtgggagaat (SEQ ID No. 2)
其中使用下述qPCR寡核苷酸对:
Q-CRE-F: 5’- GCATTTCTGGGGATTGCTTA-3’(SEQ ID No. 3)
Q-CRE-R: 5’- ATTCTCCCACCGTCAGTACG-3’(SEQ ID No. 4)。
II. 结果
1. 慢病毒颗粒生产水平
第一个测定包括对比MS2RLP颗粒和IDLV或ILV载体的各自生产水平。生产每类颗粒的批次,并通过P24 Elisa试验测量颗粒的滴度。结果呈现在下面表1中:
表1:ILV和IDLV-D64L载体和MS2RLP颗粒的滴度
颗粒的类型 | 批号 | 上清液的滴度PP/mL |
MS2RLP-Luc | rV2.1A1.1740 C2 | 5.5x10<sup>11</sup> |
IDLV-Luc | rV2.1A1.1732 C2 | 3.1x10<sup>11</sup> |
ILV-Luc | rV2.1A1.2055 C2 | 6.9x10<sup>11</sup> |
这些结果表明,通过相同的切向超滤技术浓缩以后,三类颗粒以等同的滴度(PP/ml +/-)存在。因此,衣壳化修饰或整合酶的突变不会导致慢病毒颗粒的生产缺陷。
2. 在靶细胞中的表达动力学.
用携带编码以长半衰期为特征的绿色荧光蛋白(ZsGreenI)的单一类型的RNA的MS2RLP颗粒进行第一组试验。用MS2RLP颗粒得到的结果呈现在图VIII中,并表明RNA的转移可容易地检测到(直到转导后8h)。得到的结果表明通过MS2RLP慢病毒颗粒或ILV或IDLV-D64L慢病毒载体在24小时阳性HCT116细胞的可比较的百分比。阳性细胞的百分比对于MS2RLP颗粒直到8小时是可检测的,但是对于ILV和IDLV-D64L载体仅直到24小时是可检测的。这些MS2RLP颗粒因而是功能性的,就将编码序列引入细胞群体中而言具有与ILV或IDLV-D64L等同的能力。
在整合型慢病毒系统的情况下,RNA由RT逆转录。然后将cDNA转移进细胞核中,然后它整合进宿主细胞基因组中。仅直到该步骤才发生转基因的转录,然后翻译。在非整合型慢病毒系统(在IN上的突变)的情况下,RNA由RT逆转录。然后将cDNA转移进细胞核中,然后它转录成RNA,再翻译为蛋白。
因为所有这些中间步骤的缺失,仅MS2RLP颗粒能够实现转基因的早期表达。递送的RNA通过细胞机制直接翻译为蛋白。
用携带编码以短半衰期为特征的荧光素酶(Luc)的单一类型的RNA的MS2RLP颗粒进行第二组试验。用MS2RLP颗粒得到的结果呈现在图IX中,并表明荧光素酶的最佳活性也在早期检测到。
荧光素酶的表达是短暂的,并且它从8h至24h逐渐减小。相反,荧光的表达在这类动力学中保持是可检测的或甚至稳定的。这些结果必须考虑使用的报道蛋白的半衰期。显然,报道基因的检测与该半衰期成比例。它越长,与蛋白有关的活性越长。
在图X中,也可能观察到荧光素酶表达强度随在转导中使用的PP/细胞比率而变化。具体地在包皮成纤维细胞中证明了该剂量效应。
因而重要的是,能够达到高剂量的MS2RLP颗粒以应用于细胞进行转导,以便诱导能够导致生物活性的显著表达水平。颗粒的浓度作为成功的关键因素出现。在包皮成纤维细胞中,用高剂量(即500000个PP/细胞)的颗粒诱导的荧光素酶表达等同于用常规整合型慢病毒载体以5的感染复数(MOI)得到的结果。在与包皮成纤维细胞相同的条件下,通过50000、100000和200000个PP/细胞的试验剂量确定用MS2RLP颗粒转导HCT116的最适剂量。选择的剂量是100000个PP/细胞,为此得到最佳荧光素酶RNA转移。结果表明,必须随靶细胞的许可性(permissivity)采用转导方法。
通过MS2RLP-Luc颗粒的体内注射测定证实了这些结果,所述测定表明在注射以后5小时的荧光素酶表达检测。
3. MS2RLP颗粒的混悬液的生产和纯度对转导有效性的影响.
根据靶细胞类型,重要的是能够增加颗粒的剂量以便得到高数目的表达运输的RNA的细胞。通过使用经纯化的颗粒,可能增加颗粒的剂量,而不影响靶细胞的生存力,如在申请WO 2013/014537中所示。实际上,慢病毒颗粒批次的最终纯度受胎牛血清(FCS)的存在影响。
为了评价MS2RLP颗粒的混悬液的纯度对荧光素酶表达的影响,我们对比了随两类上清液批次的纯度而变化的荧光素酶表达:
- 从用血清生产的MS2RLP颗粒浓缩的上清液,
- 从不用血清生产的MS2RLP颗粒浓缩的上清液。
该研究在HCT116允许的永生化细胞上(图XII)和在原代细胞(其为更低允许性的且纤弱的包皮成纤维细胞)上(图XI)进行。
得到的结果表明,所述批次的纯度对在高剂量对纤弱原代细胞的转导的有效性具有高影响。在500000个PP/细胞,纯度的影响是显著的,因为对于不含血清的批次,荧光素酶的活性增加了几乎80%(图XI)。在有FCS存在下,相反存在发光表达的减少。
在非常顽强的HCT116永生化细胞上,纯度对荧光素酶活性的影响不是可检测的(图XII)。相反,在有血清存在下生产的批次呈现出更异质的结果,这显示与没用血清生产的批次相比弱得多的再现性。因此,该结果证明了在没有血清存在下生产颗粒批次的选择。
这些测定表明浓缩这些慢病毒颗粒以得到在细胞和组织水平与表型的诱导相容的高表达水平的必要性,且此外表明这些批次的纯度对获得转移的有效性的影响。
4. 鉴别MS2RLP颗粒的基因转移的最适条件
为了增加RNA转移的有效性,调换(transposed)Sutlu等人(2012)得到的结果以增加天然杀伤NK细胞的转导有效性。更具体地,提出以下假设:基于Toll-样受体(TLR)和/或RIG-I-样受体(RLR)的抗病毒应答可以限制某些细胞中RNA转移的有效性。为了检验该假设,在使细胞与MS2RLP颗粒接触的过程中使用了小信号传递分子TLR和RLR的抑制剂。BX795分子是BK1/IKKε复合物的抑制剂,其作为RIG-I、MDA-5和TLR3的信号传递路径的共同介质起作用。
6µM浓度的BX795分子的应用显著地增加HCT116细胞(图XIV)和包皮成纤维细胞(图XIII)的转导有效性。观察时间(对于MS2RLP颗粒为8h,对于ILV为24h)考虑了每种颗粒的功能(图VIII和IX)。象在包皮成纤维细胞中一样,在MS2RLP颗粒与BX795在HCT116细胞中的应用之间可以观察到协同效应,而BX795这两种细胞类型中与整合型慢病毒载体ILV一起诱导负面效应。该效应可以与这两类颗粒递送的RNA分子的数目的差别相关联。
5. 通过体内荧光素酶MS2RLP颗粒研究基因转移.
MS2RLP-Luc颗粒的体内注射涉及揭示转基因(在该情况下,荧光素酶)在全身性地注射的不同小鼠器官中的表达动力学。经纯化的ILV-EF1-Luc整合载体的混悬液用作阳性对照。直到注射后5h且在7天之前做出测量。静脉内施用引起注射的混悬液的稀释,并因此引起要考虑的生物发光信号的分散。因此在整个动物上做出分析,以便考虑遍布体内的信号分布。试验了在有血清存在下根据方法P1生产的MS2RLP-Luc颗粒的混悬液和根据P2方法纯化的MS2RLP-Luc颗粒的混悬液。在有血清存在下根据p2方法的MS2RLP-Luc颗粒的混悬液(其中纯化是更少的)的注射导致对于取样而言和对于注射而言的困难。实际上,在有血清存在下通过P1方法得到的MS2RLP-Luc颗粒的这种混悬液特征在于高粘度棕色混悬液,其特别难以用体内注射所用的29G针头取样。该困难在将混悬液递送进尾静脉中时产生。在有血清存在下通过P1方法得到的MS2RLP-Luc颗粒的混悬液的应用导致所述颗粒的较差施用,所述颗粒变成定位在动物的尾部区域(即在注射部位)且不会进入动物的全身循环(图XV A,组“在有血清存在下根据P1方法生产的MS2RLP-Luc”的时间H5和H8)。在有血清存在下通过P1方法得到的MS2RLP-Luc颗粒的混悬液因此不可用在体内研究中。
MS2RLP-Luc颗粒的纯化混悬液的正常施用是可能的,其在注射以后5小时引起818ULR的荧光素酶表达。该信号在8小时时仍然是可见的,然后在以后的时间消失(图XV A,XVI和XVII,“经纯化的MS2RLP-Luc”组)。生物发光信号主要存在于肝和脾中(图XV A,“经纯化的MS2RLP-Luc”组)。与此相比,在5小时时,在已经接受ILV-EF1-Luc整合型病毒载体的纯化混悬液的动物中测量的亮度不是显著的,因为反转录和整合在这些短时间是失败的。相反,在早期阶段(注射后5小时),用MS2RLP-Luc颗粒的纯化混悬液得到的信号是显著的,并达到比用ILV-EF1-Luc整合型病毒载体的纯化混悬液得到的信号高2倍的表达水平。5小时以后,MS2RLP-Luc颗粒的纯化混悬液达到与168h以后ILV-EF1-Luc整合型病毒载体的纯化混悬液的表达水平相当的表达水平(图XV B和XVI,组“经纯化的ILV-EF1-Luc”)。MS2RLP-Luc颗粒的纯化混悬液使得可能得到经优化的体内瞬时表达,其与由慢病毒转导的整合机制产生的表达水平相当。所述表达是短暂的,因为转基因没有整合进细胞的基因组中。浓缩/纯化方法因而使得可能得到在体内注射以后有效的MS2RLP颗粒的混悬液。
6. 不同颗粒的功能性的对比
通过用带有下述序列EF1-Lox-DsRed-Lox的整合型慢病毒载体转导,预先产生HCT116-Lox-dsRed-Lox细胞。得到多克隆荧光系以后,通过有限稀释得到单克隆系。应当指出,在多克隆和单克隆系中通过qPCR定量整合的Lox-DsRed-Lox序列的拷贝数目。整合的拷贝数目平均而言为6个拷贝(对于多克隆系)和13个拷贝(对于单克隆系)。
将这两个系用携带编码Cre重组酶的序列的MS2RLP颗粒转导。平行地,用携带相同Cre序列的ILV慢病毒载体转导这些HCT116-Lox-dsRed-Lox细胞。
将用MS2RLP-Cre颗粒、ILV-Cre载体转导的HCT116-Lox-dsRed-Lox单克隆和多克隆细胞在37℃/5%CO2温育14天,然后用细胞计数器分析。通过流式细胞计量术得到的荧光细胞百分比的定量结果呈现在图XVIII中。结果表明,在与MS2RLP-Cre颗粒发生接触的多克隆和单克隆群体内,荧光实际上已经消失。实际上,荧光细胞的百分比从100%达到小于10%。所述结果对于ILV-Cre整合载体(15%减少)以及在pCre质粒的转染条件下(没有减少)具有低得多的有效性。
验证了通过MS2RLP-Cre颗粒、通过ILV-Cre载体或通过pCre质粒向HCT116细胞中转移编码CRE重组酶的核酸以后的整合事件。为此目的,我们在与ILV载体、MS2RLP颗粒或编码CRE蛋白的质粒发生接触的HCT116-Lox-dsRed-Lox细胞中定量了由不同类型的颗粒和质粒携带的基因组的残余拷贝的数目。为此目的,在转导以后6和14天制备野生型和经修饰的HCT116细胞的DNA的整体,并通过qPCR测量编码CRE重组酶的DNA。
在图XIX中呈现的结果表明,对于整合型慢病毒载体,整合事件的数目是在6天每个细胞4个拷贝。该数目与使用的感染复数(MOI)相一致。转染对照显示在6天高数目的DNA拷贝,其对应于存在于细胞中的质粒的检测,然后Cre DNA的拷贝在14天完全消失,因为所述质粒没有整合进靶细胞的基因组中。
对于MS2RLP颗粒,没有检测到整合事件。实际上,由于表达不依赖于逆转录酶或LTR末端,这些颗粒会将RNA递送到靶细胞内,其被直接翻译成蛋白,或被蛋白带到细胞核中且不产生任何DNA物质。
实施例2:用MS2RLP颗粒通过单次转导转移几种不同RNA
I. 设备和方法
1. 单-和三-转导
使用能够转移实现单一蛋白(ZsGreenI、mCherry或mtBFP)的表达的单一类型RNA或转移实现几种不同蛋白(ZsGreenI + mCherry + mtBFP)的表达的几类RNA的MS2RLP颗粒或IDLV载体进行本实施例。
在下述条件下生产MS2RLP颗粒和非整合型慢病毒载体IDLV:
- 除了衣壳化和包膜质粒以外,通过用编码ZsGreenI或mCherry或mtBFP的单一表达质粒(如在实施例1中所述)转染HEK293T细胞来生产颗粒,
- 除了衣壳化和包膜质粒以外,通过用以等摩尔量加入的分别编码ZsGreenI、mCherry和mtBFP的三种表达质粒转染HEK293T细胞来生产颗粒,表达质粒的总量等同于使用单一表达质粒用于颗粒生产的表达质粒的总量,
如下用MS2RLP颗粒转导HCT116细胞:
- 用3类MS2RLP颗粒ZsGreenI、mCherry或mtBFP独立地转导。
- 用编码ZsGreenI、mCherry和mtBFP的三种表达质粒产生的颗粒同时地单-转导。
平行地,如下用IDLV载体转导HCT116细胞:
- 用3类IDLV载体ZsGreenI、mCherry或mtBFP独立地转导。
- 用编码ZsGreenI、mCherry和mtBFP的三种表达质粒产生的IDLV载体同时地单-转导。
通过流式细胞计量术定量荧光细胞的百分比。
将HCT116细胞(ATCC, CCL-247)接种进96-孔平板中并在37℃/5%CO2温育24h。在有4µg/mL Polybrene存在下进行MS2RLP颗粒或IDLV载体的转导。在转导后不同的时间(8h、24h和48h),将细胞收获,并通过细胞计量术(Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec)定量表达ZsGreenI、mCherry和the mtBFP的细胞的百分比。以6µM的浓度使用细胞防御机制抑制剂BX795 (InvivoGen)。一式三份地进行每个测定。
II. 结果
1. 用MS2RLP颗粒在单次转导中转移几种不同RNA的能力
下述测定的目的是证实MS2RLP颗粒将几种不同RNA转移进靶细胞中从而使得可能减少靶细胞的转导次数的能力。因而,在单次转导中转移几种不同RNA(而不是必须每种RNA物质执行一次转导)变成可能。为此,我们在实施例1定义的最适条件下制备了三个经纯化的MS2RLP颗粒批次,即根据在申请WO 2013/014537中描述的方法在没有血清存在下生产的经纯化的批次。在MS2RLP颗粒的生产阶段中,与衣壳化和包膜质粒一起以等摩尔量同时使用三类编码荧光报告物的质粒(ZsGreenI、mCherry和mtBFP),以便得到包含几种不同类型的RNA的MS2RLP颗粒批次。然后在有BX795存在下转导HCT116细胞,并在转导后8h、24h和48h观察不同RNA的转移。
图XX解释了在两种不同剂量(100000个PP/细胞和300000个PP/细胞)用MS2RLP颗粒单次转导HCT116细胞以后,或在300000个PP/细胞的最终剂量根据实施例1生产的表达ZsGreenI或mCherry或mtBFP的MS2RLP颗粒的三个同时转导以后,绿色、红色和蓝色的三-荧光细胞的比例。
与实施例1的结果(其表明可能检测在8小时单一荧光或发光蛋白的表达)相比,在100000个PP/细胞的剂量,三种荧光在转导后8h的表达不是可检测的。但是,48%的细胞在转导后24h是三-荧光的。该三-荧光细胞比例增加,以在转导后48h达到60%。结果因而表明,MS2RLP颗粒能够在靶细胞的单次转导中运输和转移至少3类RNA。
每个细胞的颗粒的最适剂量的确定是重要的,因为观察到MS2RLP颗粒的剂量的增加会导致三-荧光细胞的数目的减少(图XX, 300000个PP/细胞),尤其是转导后48小时。精确而言,如果在300000个PP/细胞时三-荧光细胞的比例在转导后8h (5%的三-荧光细胞)稍微大于在100000个PP/细胞时,三-荧光细胞的比例在转导后24h开始下降,从48%达到40%的三-荧光细胞。在使用的两种剂量之间转移有效性的这种差异都在转导后48h较大:实际上,对于300000个PP/细胞的剂量观察到43%的三-荧光细胞,与此相比,对于100000个PP/细胞的剂量观察到60%的三-荧光细胞。
平行地,进行了用根据实施例1分别生产的MS2RLP颗粒批次对HCT116细胞的三个同时转导。对于每类荧光使用的剂量是100000个PP/细胞,即300000个PP/细胞的总剂量。结果表明,通过携带仅一种RNA物质的颗粒的三个同时转导得到的三-荧光细胞的百分比小于通过携带3种RNA的颗粒的单次转导诱导的结果。实际上,在转导后8h检测到仅7%的三-荧光细胞,然后在转导后24h检测到20%的三-荧光细胞,即用在100000个PP/细胞的单次转导得到的水平的仅42%和用在300000个PP/细胞的单次转导得到的水平的仅50%;且最后在转导后48h检测到23%的三-荧光细胞,即用在100000个PP/细胞的单次转导得到的百分比的38%和用在300000个PP/细胞的单次转导得到的百分比的54%。综上所述,三-转导不会得到与用三个同时转导得到的那些一样高的三色细胞的百分比。
不同类型的RNA在同批MS2RLP颗粒的单次转导中的转移能力的揭示,代表与这些不同RNA向靶细胞中的同时转移相比显著的增益。MS2RLP颗粒的这种新性质(其直接导致要执行的转导次数的优化)使得不会通过过大的转导次数以及通过使细胞与过大数量的颗粒接触而损害靶细胞的生存力成为可能。
2. 与IDLV载体的对比
用另一类颗粒平行地再现了与上面第1点相同的测定:由于在整合酶编码序列(IDLV)上的位置64中的突变而成为整合缺陷型的病毒载体。
图XXI解释了与在300000个PP/细胞的总剂量用根据实施例1生产的表达ZsGreenI或mCherry或mtBFP的IDLV载体对HCT116细胞的三次转导相比,用3种表达质粒ZsGreenI、mCherry和mtBFP产生的MS2RLP颗粒对HCT116细胞的单次转导以后,绿色、红色和蓝色的三-荧光细胞的比例。
在与MS2RLP颗粒相同的条件下生产IDLV载体,以便使得可能在与MS2RLP颗粒所用的相同剂量执行单次转导。在100000个PP/细胞剂量的单次转导以后24h,在使用IDLV载体的情况下三-荧光细胞的比例稍微大于用MS2RLP颗粒得到的结果(分别是56%和48%)。在100000个PP/细胞的剂量在单次转导以后48h证实了该趋势(分别是80%和60%)。
在转导后24h,IDLV载体对HCT116细胞的单次转导产生的三色细胞百分比等同于用IDLV载体三-转导以后得到的结果。该趋势在转导后48h保持稳定,2种转导方法之间具有最小差异(三-转导的71%相对于单次转导的81%)。因而,与用MS2RLP颗粒得到的结果不同,用3种表达质粒生产的IDLV载体不能在它们转导时实现三色细胞百分比相对于三-转导的显著增加。MS2RLP颗粒的该优点可能通过它们与IDLV或ILV(它们严格地衣壳化仅2种分子)相比衣壳化更多RNA分子的能力来解释。因而,促进了3种不同转基因的表达,因为它不需要几种慢病毒颗粒对相同细胞的转导。
此外应当指出,在三次转导的情况下或在单-转导的情况下,在转导后8h三-荧光细胞的百分比仅对于300000个PP/细胞的IDLV载体是可检测的。相反,在300000个PP/细胞,MS2RLP颗粒使得三-荧光细胞在转导后8h可被检测到(图XX)。
在IDLV载体的三次单-转导的情况下,在三次转导以后24h和48h三-荧光细胞的比例(分别是60%和70%的三-荧光细胞)稍微大于100000个PP/细胞的MS2RLP颗粒的单次转导的情况(分别是三-荧光细胞的48%和60%)。重要的是,对于比MS2RLP颗粒的最适剂量大3倍的IDLV载体所用剂量,注意到该转移差异是大约20%。
此外,IDLV颗粒(尽管是整合缺陷型)不会使得避免在靶细胞的基因组中的残余整合成为可能(Nightingale等人, 2006和Apolonia等人, 2007)。因此,残余整合事件的可能性随着使用的IDLV颗粒的剂量增加。通过它们的性质,MS2RLP颗粒的应用因此不能通过残余整合的完全缺失来避免该约束,无论使用的整合。
3. 与ILV载体的对比
图XX和XXII显示了在使得观察三-转导相对于单次转导的定量效应成为可能的条件(不饱和条件)下,MS2RLP颗粒和ILV载体的转导特性,它们是两种病毒RNA分子的衣壳化的特征。
ILV载体对HCT116细胞的转导,在转导后24h观察(图XXII)
用ILV载体在MOI5对细胞的三-转导(包括使用不同载体批次,各自编码不同的荧光蛋白)(最终MOI=3*5=15)使得可能得到7.5%的表达三种颜色的细胞。与此相比,在相同剂量(MOI15)的单次转导使得可能得到仅0.8%的表达三种颜色的细胞。由于表达三种颜色的细胞的百分比因而在三-转导和单次转导之间下降,因此单次转导不是使用ILV的最佳适用方法。
在其它剂量证实了该差异。在MOI20用载体对细胞的三-转导(包括使用不同载体批次,各自编码不同的荧光蛋白)(最终MOI=3*20=60)使得可能得到几乎75%的表达三种颜色的细胞,而在MOI 60的单次转导,仅38%的细胞表达三种颜色。
即使将使用的ILV剂量增加至超过最适剂量,例如增加至MOI120,ILV的单次转导不会使得达到在MOI120的三-转导中得到的表达三种颜色的细胞的百分比成为可能(61.7%相对于83.3%),也不会使得达到在MOI 60的三-转导中得到的表达三种颜色的细胞的百分比成为可能(61.7%相对于75.6%)。
使用的MOI 5、10、20、60能够在不饱和的转导条件运行,使得测量实际转导差异成为可能。
MS2RLP颗粒对HCT116细胞的转导,在转导后24h观察(图XX)
MS2RLP颗粒对细胞的三-转导(包括使用不同载体批次,各自编码不同的荧光蛋白,对于每批MS2RLP颗粒,在10pg/细胞的剂量)(最终剂量=3*10pg=30pg/细胞)使得可能得到20%的表达三种颜色的细胞。关于在相同剂量(30pg/细胞)用MS2RLP颗粒对细胞的单次转导,这使得可能得到表达三种颜色的细胞的数目的两倍,即40%。由于表达三种颜色的细胞的百分比因而在三-转导和单次转导之间翻倍,所述单次转导因此是使用MS2RLP颗粒的最佳适应方法。该结果与用ILV载体得到的结果相反。
MS2RLP颗粒因而表现出与使用ILV载体得到的结果不同的转导特性,这通过载体或颗粒的形成模式的差异来解释。实际上,MS2RLP颗粒与ILV载体的差异在于它们对于非病毒RNA的异源募集系统。在ILV整合型慢病毒载体的情况下,由Psi序列介导的衣壳化系统的募集将颗粒中RNA病毒分子的数目限制为2。我们的定量MS2RLP慢病毒颗粒中的RNA分子的数目的结果估计,平均而言,6个RNA分子被衣壳化进MS2RLP颗粒中。这些差别衣壳化可以解释ILV和MS2RLP之间对多个序列的转导的差异。
此外,对于在10pg/细胞(其为最适使用剂量)在单次转导中的MS2RLP颗粒,得到48%的表达三种颜色的细胞,而在大3倍剂量(即30pg/细胞)的三-转导中,得到仅20%的表达三种颜色的细胞,即少2.5倍的表达三种颜色的细胞。
综上所述,这些最后的结果表明,仅MS2RLP颗粒能够基于颗粒的单一组合物将超过2种RNA引入靶细胞中,这是在转导或注射后的短时间(5-8小时),没有诱导整合事件。
实施例3: 在实施例1中描述的、根据方法P1或P2生产的MS2RLP-ZsGreen颗粒对
HCT116细胞的转导有效性的对比
I. 设备和方法
使用能够转移单一类型的RNA从而允许在单一蛋白(ZsGreenI)上表达的MS2RLP颗粒完成本实施例。
如下生产颗粒:除了衣壳化和包膜质粒以外,用编码ZsGreenI的单一表达质粒转染HEK293T细胞(如在实施例1中所述),并遵循在实施例1中描述的生产方法P1或P2。
将HCT116细胞(ATCC, CCL-247)以5000个细胞/cm2接种在96-孔平板中并在37℃/5%CO2温育24h。
在有4µg/mL的Polybrene®存在下用不同量的MS2RLP颗粒/细胞((10、20和30pgp24/细胞)进行MS2RLP颗粒的转导。在转导后48h,将细胞收获并通过细胞计量术(MacsQuant VYB, Miltenyi Biotec)定量表达ZsGreenI的细胞的百分比以及荧光强度。以6µM的浓度使用细胞防御机制抑制剂BX795 (InvivoGen)。一式三份地进行每个测定。
II. 结果
该测定的目的是对比根据方法P1或P2生产的MS2RLP-ZsGreen颗粒对HCT116细胞的转导的有效性。在图XXIII中呈现的结果表明,生产方法不会影响RNA转移能力,因为无论使用哪种生产方法,转导的细胞的百分比是相同的。但是,仅转基因的表达受生产方法影响。实际上,纯化的颗粒使得可能得到目标蛋白的最高表达水平,无论使用的MS2RLP颗粒的剂量。
实施例4:通过修饰核衣壳构建MS2RLP慢病毒颗粒和关于MS2 RNA的茎-环基序的
重复数目的试验
I. 设备和方法
1. 质粒构建
● 目标序列的表达质粒:所述表达质粒带有启动子-目标序列-聚腺苷酸表达盒(参见图II),具有或没有RNA稳定化或内含子序列。为了将mRNA运输进慢病毒颗粒中,将MS2RNA的茎-环基序(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID No. 1)的几个重复插入在报道基因下游的表达盒内:
- 2个重复(图XXIV)
- 6个重复(图XXV)
- 12个重复(图XXVI
选择的目标序列是天然荧火虫荧光素酶的序列。
● 衣壳化质粒:衣壳化质粒是在实施例1中描述的质粒(图IIIb)。
● 包膜质粒(pENV):衣壳化质粒是在实施例1中描述的质粒(图IV)。
2. 慢病毒颗粒的生产、浓缩/纯化和滴定
如在实施例1中所述生产慢病毒颗粒,并如在实施例1中所述根据方法P1浓缩和纯化。
3. 荧光素酶的表达动力学
将HCT116细胞(ATCC, CCL-247)接种在96-孔平板中并在37℃/5%CO2温育24h。在有4µg/mL的Polybrene®存在下在100 000个PP/细胞(10pg p24/细胞)的剂量进行MS2RLP2X、6X、12X颗粒的转导。4小时以后将转导上清液消除并用新鲜的补充的生长培养基替换。在转导后4h、8h、24h、32h和48h,将细胞收获并使用试剂盒OneGlo Luciferase测定(Promega)按照供应商的推荐和使用Synergy H1 Hybrid微量培养板读数器(Biotek)分析荧光素酶的表达。一式三份地进行每个试验。用未转导的HCT116细胞进行对照。
II. 结果
结果呈现在图XXVII中。该测定的目的是证实可能减少表达质粒上的MS2序列的重复基序的数目,而不影响要递送的RNA的表达水平。荧光素酶的表达动力学呈现出从4h至8h发光信号的增加,从而表明在具有短寿命的蛋白的情况下,较早地达到最大表达,无论重复的MS2序列的基序的数目。8h以后,荧光素酶的活性下降,直到在48h它达到与在转导后4h相同的水平(10 000至20 000 URL)。带有MS2序列的2和6个重复基序的构建表明随时间相同的荧光素酶表达谱。但是,带有MS2序列的12个重复基序的构建对荧光素酶的表达比带有2或6个重复基序的构建高30%。因此,MS2RLP颗粒可有效地递送RNA,无论使用的重复基序的数目。根据应用,将必须修改MS2基序的重复的数目。
实施例5:通过修饰荧光素酶构建MS2RLP慢病毒颗粒和关于MS2 RNA的茎-环基序
的重复数目的试验
I. 设备和方法
1. 质粒构建
● 目标序列的表达质粒:所述表达质粒带有启动子-目标序列-聚腺苷酸表达盒(参见图II),具有或没有RNA稳定化或内含子序列。为了将mRNA运输进慢病毒颗粒中,将MS2RNA的茎-环基序(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID No. 1)的几个重复插入在报道基因下游的表达盒内:
- 2个重复(图XXIV)
- 6个重复(图XXV)
- 12个重复(图XXVI
使用的启动子可以是CMV (图IIa)或EF1 (图IIb)的启动子,但是可以使用其它启动子。所述目标序列可以是编码报道蛋白诸如天然荧火虫荧光素酶(图IIa)、绿(ZsGreenI)、红(mCherry)或蓝(mtBFP)荧光蛋白(图IIb)的DNA,或编码蛋白例如CRE蛋白(图IIc)的cDNA。所述目标序列还可以是shRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA或circRNA的序列。
● 衣壳化质粒:将慢病毒颗粒修饰成含有在整合酶内的细菌噬菌体MS2的外壳蛋白序列。根据图I所示的策略修饰用于生产MS2RLP颗粒的p8.74衣壳化质粒(图VI),即编码结构蛋白和功能蛋白(Gag, Pol)的基因的载体:使用该p8.74质粒通过PCR组装产生这样的质粒:在其上面噬菌体MS2的外壳蛋白与整合酶的C-端结构域合并。通过HpaI克隆得到的该合并使得可能产生直链外壳(Linear Coat)p8.74-POL-MS2质粒(图XXVIII)。如此得到的构建如图I (p8.74.IN-外壳)所示。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变,例如诸如编码逆转录酶(RT)的序列。
● 包膜质粒(pENV):该质粒携带编码包膜蛋白的基因,其可以是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSVG (图IV)。
2. 慢病毒颗粒的生产、浓缩/纯化和滴定
如在实施例1中所述,根据P1方法生产慢病毒颗粒。
3. 荧光素酶的表达动力学
将HCT116细胞(ATCC, CCL-247)接种在96-孔平板中并在37℃/5%CO2温育24h。在有8µg/mL的Polybrene®存在下在5pg p24/细胞的剂量进行根据P1方法生产的MS2(IN)-RLP2X、6X、12X颗粒的转导。4小时以后将转导上清液消除并用新鲜的补充的生长培养基替换。在转导后4h、8h、24h、32h和48h,将细胞收获并使用试剂盒OneGlo Luciferase测定(Promega)按照供应商的推荐和使用Synergy H1 Hybrid微量培养板读数器(Biotek)分析荧光素酶的表达。一式三份地进行该试验。用未转导的HCT116细胞进行对照。
II. 结果
结果呈现在图XXIX中。该测定的目的是证实可能将RNA转移进慢病毒颗粒中并将MS2-外壳转移进整合酶中,并减少表达质粒上的MS2序列的重复基序的数目,而不影响要递送的RNA的表达水平。较早地达到荧光素酶的最大表达,无论MS2序列的重复基序的数目。直到4h且在24h之前得到荧光素酶表达动力学的最强发光信号。24h以后,荧光素酶活性降低直到它达到比在4/8/24h时的该条件弱2-4倍的信号。MS2(IN)-RLP颗粒因而使得可能递送RNA,无论MS2序列的重复基序的数目。
实施例6:PP7(NC)-RLP慢病毒颗粒的构建和关于PP7RLP颗粒对HCT116细胞的转导
的剂量效应的试验
I. 设备和方法
1. 质粒构建
1.1用于生产PP7(NC)-RLP Luc 12X慢病毒颗粒的质粒
● 目标序列的表达质粒:所述表达质粒带有启动子-目标序列-聚腺苷酸表达盒(参见图XXX),具有或没有RNA稳定化或内含子序列。为了将mRNA运输进慢病毒颗粒中,将PP7 RNA的茎-环基序(ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID No. 5)的12个重复插入在报道基因下游的表达盒内。
使用的启动子可以是CMV或EF1的启动子(图XXX),但是可以使用其它启动子。所述目标序列可以是编码报道蛋白诸如天然荧火虫荧光素酶(图IIa)、绿(ZsGreenI)、红(mCherry)或蓝(mtBFP)荧光蛋白(图IIb)的DNA,或编码蛋白例如CRE蛋白(图IIc)的cDNA。所述目标序列还可以是shRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA或circRNA的序列。
● 衣壳化质粒:将慢病毒颗粒修饰成含有在核衣壳蛋白内的细菌噬菌体PP7的外壳蛋白序列,替代并替换第二个锌指结构域。根据图XXXI所示的策略修饰用于生产PP7RLP颗粒的p8.74衣壳化质粒,即编码结构蛋白和功能蛋白(Gag, Pol)的基因的载体:使用该p8.74质粒通过PCR组装产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二个锌指的质粒。通过HpaI克隆用噬菌体PP7的外壳蛋白置换第二个锌指以产生p8.74ΔZF-PP7-外壳质粒。由此得到在图XXXII中所示的构造。编码Pol的序列可以在某些功能元件中缺失或突变,例如诸如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列,而不改变PP7RLP的功能。
● 包膜质粒(pENV):该质粒携带编码包膜蛋白的基因,其可以是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSVG (图IV)。
1.2用于生产MS2(NC)-RLP Luc 12X慢病毒颗粒的质粒
使用的质粒与在实施例1中使用的那些相同。
2. 慢病毒颗粒的生产、浓缩/纯化和滴定
如在实施例1中所述,根据P1方法生产慢病毒颗粒。
3. PP7(NC)-RLP-Luc颗粒的剂量效应
将HCT116细胞(ATCC, CCL-247)接种在96-孔平板中并在37℃/5%CO2温育24h。在有8µg/mL的Polybrene®存在下,在0-20pg p24/细胞的范围内的剂量,进行根据P1方法生产的PP7(NC)-RLP-Luc-12X颗粒的转导。在转导后4h,将细胞收获并使用试剂盒OneGloLuciferase测定(Promega)按照供应商的推荐和使用Synergy H1 Hybrid微量培养板读数器(Biotek)分析荧光素酶的表达。一式三份地进行该试验。用未转导的HCT116细胞进行对照。
II. 结果
结果呈现在图XXXIII中。该测定的目的是,在第一阶段,观察PP7细菌噬菌体的RNA/蛋白相互作用系统是否能够实现形成RLP颗粒的RNA衣壳化。在第二阶段,该测定使得可能确定用于PP7(NC)-RLP颗粒的最佳实验条件。
图XXXIII表明,直到1pg p24/细胞的剂量,强烈地检测到荧光素酶活性。PP7(NC)-RLP的剂量增加越多,荧光素酶活性越高。此外,相对于在与PP7(NC)-RLP相同的剂量使用的MS2(NC)-RLP载体,荧光素酶活性信号是非常高地可比较的。
该测定表明,对于PP7序列的12个重复基序,通过PP7细菌噬菌体的外壳蛋白得到的RNA衣壳化系统与源自细菌噬菌体MS2的系统同样好地运行,并且为了得到目标蛋白的非常高表达,可以采用10pg p24/细胞的剂量。
实施例7: PP7(NC)-RLP慢病毒颗粒的构建和PP7 RNA的茎-环基序的重复数目的
试验
I. 设备和方法
1. 质粒构建
1.1用于生产PP7(NC)-RLP慢病毒颗粒的质粒
● 目标序列的表达质粒:所述表达质粒带有启动子-目标序列-聚腺苷酸表达盒(参见图XXX),具有或没有RNA稳定化或内含子序列。为了将mRNA运输进慢病毒颗粒中,将PP7 RNA的茎-环基序(ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID No. 5)的几个重复插入在报道基因下游的表达盒内。
- 2个重复(图XXXIVa)
- 6个重复(图XXXV)
- 12个重复(图XXX)
使用的启动子可以是CMV或EF1的启动子(图XXX),但是可以使用其它启动子。所述目标序列可以是编码报道蛋白诸如天然荧火虫荧光素酶(图XXXIVa)、绿(ZsGreenI)、红(mCherry)或蓝(mtBFP)荧光蛋白(图XXXIVb)的DNA,或编码蛋白例如CRE蛋白的cDNA。所述目标序列还可以是shRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA或circRNA的序列。
● 衣壳化质粒:将慢病毒颗粒修饰成含有在核衣壳蛋白内的细菌噬菌体PP7的外壳蛋白序列,替代并替换第二个锌指结构域。根据图XXXI所示的策略修饰用于生产PP7RLP颗粒的p8.74衣壳化质粒,即编码结构蛋白和功能蛋白(Gag, Pol)的基因的载体:该p8.74质粒用于通过PCR组装产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二个锌指的质粒。通过HpaI克隆用噬菌体PP7的外壳蛋白置换第二个锌指以产生p8.74ΔZF-PP7-外壳质粒。由此得到在图XXXII中所示的构造。编码Pol的序列可以在某些功能元件中缺失或突变,例如诸如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列,而不改变PP7RLP的功能。
● 包膜质粒(pENV):该质粒携带编码包膜蛋白的基因,其可以是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSVG (图IV)。
1.2用于生产MS2(NC)-RLP Luc 12X慢病毒颗粒的质粒
使用的质粒与在实施例1中使用的那些相同。
2. 慢病毒颗粒的生产、浓缩/纯化和滴定
如在实施例1中所述,根据P1方法生产慢病毒颗粒。
3. 荧光素酶的表达动力学
将HCT116细胞(ATCC, CCL-247)接种在96-孔平板中并在37℃/5%CO2温育24h。在有8µg/mL的Polybrene®存在下,在10pg p24/细胞的剂量进行根据P1方法生产的PP7(NC)-RLP-Luc-2X、6X、12X颗粒的转导。4小时以后将转导上清液消除并用新鲜的补充的生长培养基替换。在转导后4h、8h、24h、32h和48h,将细胞收获并使用试剂盒OneGlo Luciferase测定(Promega)按照供应商的推荐和使用Synergy H1 Hybrid微量培养板读数器(Biotek)分析荧光素酶的表达。一式三份地进行该试验。用未转导的HCT116细胞进行对照。
II. 结果
结果呈现在图XXXVI中。该测定的目的是,在几个给定的时间,证实PP7序列的重复基序的数目的改变对衣壳化能力和因而对RNA向靶细胞中的转移的影响。包含PP7基序(重复2次、6次或12次)的PP7(NC)-RLP颗粒能够相应地转移RNA,其与包含MS2基序12次的MS2(NC)-RLP颗粒得到的结果相当。PP7(NC)-RLP颗粒因而可有效地递送RNA,无论使用的重复基序的数目。根据应用的类型,因此可以改造重复数目。结果表明,在测定的条件下,包含PP7基序(重复2次或6次)的PP7(NC)-RLP颗粒能够比使用包含MS2基序12次的MS2(NC)-RLP颗粒得到的结果更有效地转移RNA。荧光素酶的表达动力学呈现出从4h至8h发光信号的增加,从而表明在具有短寿命的蛋白的情况下,较早地达到最大表达,无论重复的PP7序列的基序的数目。24h以后,荧光素酶活性减少,直到在32h和48h它达到比在转导后8h的条件弱4-5倍的发光信号。
实施例8:通过修饰整合酶构建PP7(IN)-RLP慢病毒颗粒和关于PP7 RNA的茎-环基
序的重复数目的试验
I. 设备和方法
1. 质粒构建
● 目标序列的表达质粒:所述表达质粒带有启动子-目标序列-聚腺苷酸表达盒(参见图XXX),具有或没有RNA稳定化或内含子序列。为了将mRNA运输进慢病毒颗粒中,将PP7 RNA的茎-环基序(ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID No. 5)的几个重复插入在报道基因下游的表达盒内。
- 2个重复(图XXXIVa)
- 6个重复(图XXXV)
- 12个重复(图XXX)
使用的启动子可以是CMV或EF1的启动子(图XXX),但是可以使用其它启动子。所述目标序列可以是编码报道蛋白诸如天然荧火虫荧光素酶(图XXXIVa)、绿(ZsGreenI)、红(mCherry)或蓝(mtBFP)荧光蛋白(图XXXIVb)的DNA,或编码蛋白例如CRE蛋白(图XXXIVc)的cDNA。所述目标序列还可以是shRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA或circRNA的序列。
● 衣壳化质粒:将慢病毒颗粒修饰成含有在整合酶内的细菌噬菌体PP7的外壳蛋白序列。根据图XXXVII所示的策略修饰用于生产PP7(IN)-RLP颗粒的p8.74衣壳化质粒,即编码结构蛋白和功能蛋白(Gag, Pol)的基因的载体:该p8.74质粒用于通过PCR组装产生这样的质粒:在其上面噬菌体PP7的外壳蛋白与整合酶的C-端结构域合并。通过HpaI克隆得到的该合并使得可能产生外壳p8.74-POL-MS2质粒。如此得到的构建如图XXXVIII所示。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变,例如诸如编码逆转录酶(RT)的序列。
● 包膜质粒(pENV):该质粒携带编码包膜蛋白的基因,其可以是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSVG (图IV)。
2. 慢病毒颗粒的生产、浓缩/纯化和滴定
如在实施例1中所述,根据P1方法生产慢病毒颗粒。
3. 荧光素酶的表达动力学
将HCT116细胞(ATCC, CCL-247)接种在96-孔平板中并在37℃/5%CO2温育24h。在有8µg/mL的Polybrene®存在下在2.8 pg p24/细胞的剂量完成根据P1方法生产的PP7(IN)-RLP-Luc-2X、6X、12X颗粒的转导。4小时以后将转导上清液消除并用新鲜的补充的生长培养基替换。在转导后4h、8h、24h、32h和48h,将细胞收获并使用试剂盒OneGloLuciferase测定(Promega)按照供应商的推荐和使用Synergy H1 Hybrid微量培养板读数器(Biotek)分析荧光素酶的表达。一式三份地进行该试验。用未转导的HCT116细胞进行对照。
II. 结果
结果呈现在图XXXIX中。该测定的目的是,证实可能将RNA运输进在整合酶中具有PP7-外壳的慢病毒颗粒中,并在几个给定的时间证实PP7序列的重复基序的数目的改变对衣壳化能力和因而对RNA向靶细胞中的转移的影响。在8h达到荧光素酶的最大表达,无论PP7序列的重复基序的数目。8h以后,荧光素酶活性减少,无论PP7序列的重复基序的数目,并且不同重复基序数目之间的荧光素酶活性的差异不是统计上显著的。PP7(IN)-RLP颗粒因此能够递送RNA。
实施例9:通过PP7RLP颗粒的单次转导转移几种不同RNA
I. 设备和方法
1. 单-和三-转导
使用能够转移单一类型的RNA(其能够表达单一蛋白(ZsGreenI、mCherry或mtBFP))或转移几类RNA(其能够表达几种不同蛋白(ZsGreenI + mCherry + mtBFP))的PP7RLP颗粒或ILV载体进行本实施例。
在下述条件下生产PP7RLP颗粒和整合型慢病毒载体ILV:
- 除了衣壳化和包膜质粒以外,通过用编码ZsGreenI或mCherry或mtBFP的单一表达质粒(如在实施例1中所述)转染HEK293T细胞来生产颗粒,
- 除了衣壳化和包膜质粒以外,通过用以等摩尔量加入的分别编码ZsGreenI、mCherry和mtBFP的三种表达质粒转染HEK293T细胞来生产颗粒,表达质粒的总量等同于使用单一表达质粒用于颗粒生产的表达质粒的总量。
如下用PP7RLP颗粒转导HCT116细胞:
- 用3类PP7RLP颗粒ZsGreenI、mCherry或mtBFP独立地转导,或用3类PP7RLP颗粒同时共转导。
- 用编码ZsGreenI、mCherry和mtBFP的三种表达质粒产生的颗粒同时地单-转导。
平行地,如下用ILV载体转导HCT116细胞:
- 用3类ILV载体ZsGreenI、mCherry或mtBFP独立地转导,或用3类ILV颗粒同时共转导。
- 用编码ZsGreenI、mCherry和mtBFP的三种表达质粒产生的ILV载体同时地单-转导。
通过流式细胞计量术定量荧光细胞的百分比。
将HCT116细胞(ATCC, CCL-247)接种进24 -孔平板中并在37℃/5%CO2温育24h。在有8µg/mL Polybrene存在下进行PP7RLP颗粒或ILV载体的转导。在转导后24h,将细胞收获,并通过细胞计量术(Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec)定量表达ZsGreenI、mCherry和the mtBFP的细胞的百分比。以6µM的浓度使用细胞防御机制抑制剂BX795 (InvivoGen)。一式三份地进行每个测定。
II. 结果
1. 与ILV相比在PP7RLP颗粒的单次转导中转移几种不同RNA的能力
下述测定的目的是证实PP7RLP颗粒将几种不同RNA转移进靶细胞中从而使得可能减少靶细胞的转导次数的能力。因而,在单次转导中转移几种不同RNA(而不是必须每种RNA物质执行一次转导)变成可能。为此,在实施例1定义的最适条件下制备了经纯化的PP7RLP颗粒批次,即根据在申请WO 2013/014537中描述的实施例1的方法P1在没有血清存在下生产的经纯化的批次。在PP7RLP颗粒的生产阶段中,与衣壳化和包膜质粒一起以等摩尔量同时使用三类编码荧光报告物的质粒(ZsGreenI、mCherry和mtBFP),以便得到包含几种不同类型的RNA的PP7RLP颗粒批次。然后在有BX795存在下转导HCT116细胞,并在转导后24h观察不同RNA的转移。
图XL解释了在两种不同剂量(10pg p24/细胞和30pg p24/细胞)用PP7RLP颗粒单次转导HCT116细胞以后,或在30pg p24/细胞的最终剂量根据实施例1生产的表达ZsGreenI或mCherry或mtBFP的PP7RLP颗粒的三个同时转导以后,绿色、红色和蓝色的三-荧光细胞的比例。
当在30pg p24/细胞的剂量用含有携带3种RNA物质的颗粒的PP7RLP批次转导细胞时,88%的细胞是三-荧光的,而当用3个各自含有不同荧光蛋白的批次共转染得到的ILV载体批次转导细胞时,仅1%的细胞是荧光的。
结果因而表明,PP7RLP颗粒能够在靶细胞的单次转导中运输和转移至少3类RNA。这些颗粒能够比ILV载体远远更有效地转移多种RNA。
使用PP7RLP颗粒将多种RNA向细胞的转导因而比ILV远远更有效和更简单,因为结果大了至少70%。
当在30pg p24/细胞的总剂量用3个单独PP7RLP批次(各自含有单一RNA物质)同时转导细胞时,91%的细胞是三-荧光的。在单-转导或多-转导中对几种转基因的同时表达的有效性的对比显示出PP7RLP载体的等同有效性(分别是88%相对于91%)。
该有效性因而使得可能与使用独立地生产的颗粒批次相比减少感染复数。由此显著地降低细胞毒性的风险。这使得不会通过过大的转导次数以及通过使细胞与过高数量的颗粒接触而损害靶细胞的生存力成为可能。
序列表
<110> VECTALYS
<120> 包含至少两种衣壳化的非病毒RNA的逆转录病毒颗粒
<130> B130183QTA/BT
<150> FR 1554381
<151> 2015-05-15
<150> FR 1653280
<151> 2016-04-13
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌噬菌体MS2的茎-环序列
<400> 1
ctagaaaaca tgaggatcac ccatgtctgc ag 32
<210> 2
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cre重组酶的短序列
<400> 2
gcatttctgg ggattgctta taacaccctg ttacgtatag ccgaaattgc caggatcagg 60
gttaaagata tctcacgtac tgacggtggg agaat 95
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> primer
<400> 3
gcatttctgg ggattgctta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> primer
<400> 4
attctcccac cgtcagtacg 20
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 噬菌体PP7的茎-环序列
<400> 5
ctagaaggag cagacgatat ggcgtcgctc cctgcag 37
Claims (23)
1.一种逆转录病毒颗粒,其包含来自Gag多蛋白的蛋白、包膜蛋白、任选的整合酶和至少两种衣壳化的不同的非病毒RNA,所述衣壳化的不同的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列,每种衣壳化序列被引入所述来自Gag多蛋白的蛋白中和/或引入所述整合酶中的结合结构域识别,其中至少两种衣壳化的不同的非病毒RNA中存在的目标RNA序列是不同的。
2.根据权利要求1的逆转录病毒颗粒,所述逆转录病毒颗粒包含核衣壳蛋白、包膜蛋白、任选的整合酶和至少两种衣壳化的不同的非病毒RNA,所述衣壳化的不同的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列,每种衣壳化序列被引入所述核衣壳蛋白中和/或引入所述整合酶中的结合结构域识别。
3.根据权利要求2的逆转录病毒颗粒,其中所述结合结构域被引入所述核衣壳蛋白中。
4.根据权利要求3的颗粒,其中第二个结合结构域被引入所述核衣壳蛋白中。
5.根据权利要求3或4的颗粒,其中结合结构域也被引入所述整合酶中。
6.根据权利要求2-4中的任一项的逆转录病毒颗粒,所述颗粒是慢病毒颗粒。
7.根据权利要求6的慢病毒颗粒,其中
- 所述结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白序列,
- 所述非病毒RNA的衣壳化序列是MS2的茎-环序列,
- 所述核衣壳蛋白是属于Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC),所述NC在第二个锌指处突变以便插入细菌噬菌体MS2的外壳蛋白序列。
8.根据权利要求6的慢病毒颗粒,其中
- 所述结合结构域是细菌噬菌体PP7的外壳蛋白序列,
- 所述非病毒RNA的衣壳化序列是PP7的茎-环序列,
- 所述核衣壳蛋白是属于Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC),所述NC在第二个锌指处突变以便插入细菌噬菌体PP7的外壳蛋白序列。
9.根据权利要求1或2的逆转录病毒颗粒,其中所述结合结构域被引入所述整合酶中。
10.一种组合物,其包含根据权利要求1-9中的任一项的颗粒。
11.一种用于生产根据权利要求1-9中的任一项的颗粒的试剂盒,所述试剂盒包含:
(i) 表达质粒,表达质粒包含至少两种不同的非病毒RNA序列,每种RNA序列包含目标序列,在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,其中至少两种不同的非病毒RNA中存在的目标RNA序列是不同的,
(ii) 编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或整合酶的衣壳化质粒,其为嵌合的,包含使衣壳化序列能被识别的结合结构域,和
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒。
12.一种用于生产根据权利要求3-8中的任一项的颗粒的试剂盒,所述试剂盒包含:
(i) 包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒,每种RNA序列包含目标序列,在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含不同的非病毒RNA序列,每种RNA序列包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,其中至少两种不同的非病毒RNA中存在的目标RNA序列是不同的,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒。
13.一种用于生产根据权利要求12的颗粒的试剂盒,所述试剂盒包含:
(i) 包含至少两种目标序列的表达质粒,在这些序列中的每一种的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
所述目标序列是不同的且所述衣壳化序列是相同的,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒。
14.一种制备根据权利要求11的试剂盒的方法,所述方法包括:
(i) 制备表达质粒,表达质粒包含至少两种不同的非病毒RNA序列,每种RNA序列包含目标序列,在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,其中至少两种不同的非病毒RNA中存在的目标RNA序列是不同的,
(ii) 制备编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或整合酶的衣壳化质粒,其为嵌合的,包含使衣壳化序列能被识别的结合结构域,和
(iii) 制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
15.一种制备根据权利要求12的试剂盒的方法,所述方法包括:
(i) 制备包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒,每种RNA序列包含目标序列,在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含不同的非病毒RNA序列,每种RNA序列包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,其中至少两种不同的非病毒RNA中存在的目标RNA序列是不同的,
(ii) 制备编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
16.一种制备根据权利要求13的试剂盒的方法,所述方法包括:
(i) 制备包含至少两种目标序列的表达质粒,在这些序列中的每一种的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
所述目标序列是不同的且所述衣壳化序列是相同的,
(ii) 制备编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和
(iii) 制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
17.一种制备根据权利要求1-9中的任一项的颗粒的方法,所述方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤:
(i) 表达质粒,表达质粒包含至少两种不同的非病毒RNA序列,每种RNA序列包含目标序列,在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,其中至少两种不同的非病毒RNA中存在的目标RNA序列是不同的,
(ii) 编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或整合酶的衣壳化质粒,其为嵌合的,包含使衣壳化序列能被识别的结合结构域,和
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒,
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
18.一种制备根据权利要求3-8中的任一项的颗粒的方法,所述方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤:
(i) 包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒,每种RNA序列包含目标序列,在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含不同的非病毒RNA序列,每种RNA序列包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,其中至少两种不同的非病毒RNA中存在的目标RNA序列是不同的,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒,
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
19.一种根据权利要求18所述的用于制备颗粒的方法,所述方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤:
(i) 包含至少两种目标序列的表达质粒,在这些序列中的每一种的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
所述目标序列是不同的且所述衣壳化序列是相同的,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒,
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
20.根据权利要求17-19中的任一项的制备方法,其中澄清所述上清液。
21.根据权利要求20的制备方法,其中还浓缩和/或纯化所述上清液。
22.组合物,其包含可通过根据权利要求17 -21中的任一项的方法得到的逆转录病毒颗粒。
23.根据权利要求1-9中的任一项的颗粒或根据权利要求10或22的组合物在制备用于转导细胞的组合物中的用途。
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