CN110684745A - 可用于转导真核细胞的基于病毒的载体组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供高滴度和纯度的病毒载体组合物，以及用于生产所述组合物的方法。本发明的方法包括多种特征，例如在无血清培养基中生产病毒载体颗粒，和在转导生产细胞后的多个收获步骤，其提供了增强的所述病毒载体的生产。本发明的病毒载体组合物，由于它们的高滴度和纯度，使在靶细胞转导后通常发生的有害的表型变化如转导细胞的亚群的损失，和对转导细胞的增殖、分化、重编程或功能性的影响减到最少。

Description

可用于转导真核细胞的基于病毒的载体组合物

本申请是申请日为2012年7月26日，标题为“可用于转导真核细胞的基于病毒的载体组合物”的中国专利申请201280047202.0的分案申请。

本申请要求2011年7月27日提交的美国临时专利申请序号61/512,289的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及高滴度和纯度的病毒载体组合物，以及用于生产所述组合物的方法，和所述病毒载体组合物用于真核细胞的转导的用途。本发明的方法包括多种特征，例如在无血清培养基中生产病毒载体颗粒，其提供了增强的所述病毒载体的生产。本发明的病毒载体组合物，由于它们的高滴度和纯度，使在靶细胞转导通常后发生有害的表型变化，如转导细胞的亚群的损失，和对转导细胞的增殖、生存力和分化的影响减到最少。

背景技术

对于药物发现中的体外应用，在体内和离体的临床测定法以及对于基因治疗，基于病毒的载体的使用已经成为至关重要的递送方法。病毒载体可以分为两个主要类别：将其本身插入受体基因组中的整合载体，以及通常形成染色体外的遗传元件的非整合型载体。整合载体如γ-逆转录病毒载体(RV)和慢病毒载体(LV)是稳定遗传的。非整合载体，例如腺病毒载体(ADV)和腺相关病毒(AAV)载体很快地从快速分裂的细胞丢失。影响具体载体选择的一些因素，包括其包装容量、其宿主范围、其基因表达模式、其转导效率，和其引发免疫反应的能力(如果需要重复施用或转导，这是特别成问题的)。这些参数的一些可以调整或控制。一个参数是使用高度浓缩而且还高度纯化的载体，以允许有效的细胞转导，并避免由于载体本身之外的内容物而导致的特异性细胞应答。

目前用于生产和浓缩基于病毒的载体的方法对于保存载体完整性和批次质量不是最佳的。事实上，小规模的实验批次通常通过基于超速离心或在即用型中心单元(central units)上离心的简单方法进行浓缩。本文提及的这些批次，如批次A-血清(A-S)和B-血清(B-S)，和用于生产这些批次的方法，描述于图4A。那些方法也浓缩细胞碎片、膜片段和由生产细胞分泌的和来自包含血清的培养基的蛋白，并且不适于在良好生产规范(GMP)下生产载体批次。这些批次中的一个主要缺点是：当使用低或中等的感染复数(M.O.I.)时，它们不能允许一些非增殖细胞(如神经细胞、巨噬细胞或造血干细胞)的可重复的方式的高转导效率。虽然采用更高的M.O.I.是达到高转导水平的线索，但是通常科学家们专注于载体假型(pseudotyping)或转导方案优化，以提高转导效率(Janssens等，2003)。然而，由于这样的批次B-S诱导细胞毒性(Selvaggi等，1997；Reiser，2000；Baekelandt等，2003)，使用这种类型的产品B-S的转导效率的结果总是在转导水平和对靶细胞的毒性之间的平衡。此外，通过经典技术浓缩的发表的逆转录病毒或慢病毒载体的另一个缺点是所转导的干细胞，尤其是对造血干细胞，在转导后不能在分化途径向下进展。

Merten等(2010)使用基于多个基于膜和层析步骤的下游方法，但具有使用含10%血清的培养基的生产方法，这是Merten等的方法和根据本发明开发的方法之间的重要区别。本发明提供使用表现出高纯度水平的逆转录病毒或慢病毒载体的用于细胞转导的组合物和方法。这样的组合物和方法对干细胞分化成特化细胞没有不利影响。

生产步骤对最终浓缩产品有很大的影响，因为它提供了随后进行浓缩和纯化步骤的起始材料。例如，可在具有或没有血清，有或没有丁酸钠诱导的情况下进行生产，并且上清液可以在转染48h后收获一次或在转染64h和88h后收获两次(Cooper等，2011)。这样的收获时间的主要缺点是没有考虑到载体颗粒半衰期。这些条件对初始污染物(DNA和/或蛋白污染物)的含量和粗上清液的毒性含量水平有很大的影响。必须测量这些成分以表征对应生产、纯化和浓缩的每个批次，即本发明的批次A、B、C和D。与本发明相反，Cooper等没有通过测量初始污染物及其在浓缩和/纯化加工后的去除来表征初始产品和纯化的最终产物(参见图19)。

本发明提供了最终纯化的基于RNA的病毒载体组合物，相比于存在于无血清细胞培养基中的基于粗RNA的病毒载体的组合物，其包含小于2％的初始蛋白污染物和小于70至90％之间的初始的DNA污染物，所述组合物能够转导真核细胞而不显著影响细胞生存力。

本发明提供了纯化的基于RNA的病毒载体组合物，相比于存在于无血清细胞培养基中的基于粗RNA的病毒载体的组合物，其包含小于2％的初始蛋白污染物和小于30 %的初始的DNA污染物，所述组合物能够转导真核细胞而不影响细胞生存力。

本申请人在本文中证明，这些参数的每一个(血清、丁酸钠诱导和载体收获时间)修饰对靶细胞诱导差异的毒性水平的初始粗载体上清液组合物。

发明内容

本发明提供高滴度和纯度的病毒载体组合物(也称为病毒载体颗粒)，以及用于生产所述组合物的方法。本发明的病毒载体组合物，由于它们的高滴度和纯度，使在靶细胞转导后通常发生的有害的表型变化减到最少。

本发明提供了纯化的基于RNA的病毒载体组合物，相比于存在于无血清细胞培养基中的基于粗RNA的病毒载体的组合物(粗批次A)，其包含小于2％的初始蛋白污染物和小于70%至多达98.8%的DNA污染物。所述组合物能够转导真核细胞而不影响细胞生存力，或所述组合物转导真核细胞而不影响细胞生存力。

在本发明的一个实施方案中，提供了纯化的基于RNA的病毒载体组合物，其中相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，去除的DNA污染物占60-99%之间，并且相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，去除的蛋白污染物占55-100%之间。因此，本发明提供纯化的基于RNA的病毒载体组合物，相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，其包括少于40%的DNA污染物，并且相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，其包括少于45%的蛋白污染物。

在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了纯化的基于RNA的病毒载体组合物，其中相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，去除的DNA污染物占60-75%之间，并且相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，去除的蛋白污染物占55-65%之间(批次B)。因此，本发明提供纯化的基于RNA的病毒载体组合物，相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，其包括25%-40%的DNA污染物，并且相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，其包括35%-45%的蛋白污染物。这种纯化的基于RNA的病毒载体组合物还可以用于转导永生化的细胞系而不影响它们的生存力。

在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了纯化的基于RNA的病毒载体组合物，其中相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，去除的DNA污染物占70-90%之间，并且相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，去除的蛋白污染物占多达98% (批次C)。因此，本发明提供纯化的基于RNA的病毒载体组合物，相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，其包括10%-30%的DNA污染物，并且相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，其包括少于2%的蛋白污染物。这种纯化的基于RNA的病毒载体组合物可以用于转导真核细胞、原代和干细胞而不影响它们的生存力。

在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了纯化的基于RNA的病毒载体组合物，其中相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，去除的DNA污染物占多达98.8%，并且相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，去除的蛋白污染物占多达99.9% (批次D)。因此，本发明提供纯化的基于RNA的病毒载体组合物，相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，其包括少于2%，优选1.2%的DNA污染物，并且相比存在于基于粗RNA的病毒载体组合物中的初始污染物，其包括少于1%，优选0.1%的蛋白污染物。这种纯化的基于RNA的病毒载体组合物也可以用于体内注射。

在本发明的具体实施方案中，所述基于粗RNA的病毒载体是其中物理颗粒/转导单元(PP/TU)包含在100：1至多达900：1之间，优选200：1至多达900：1之间的病毒载体。在本发明的又另一个实施方案中，通过基于超离心或在即用型中心单元上的离心的简单方法浓缩的，所述基于浓缩RNA的病毒载体是其中物理颗粒/转导单位(PP/TU)包含在100：1至多达600：1之间，优选200：1至多达600：1之间的病毒载体。更进一步，所述基于RNA的载体是基于浓缩且纯化的RNA的载体，其中所述物理颗粒/转导单位(PP/TU)包含在100:1至多达400:1之间。所述基于RNA的载体，因为它们的高滴度和纯度，对细胞增殖、生存力和/或细胞(例如干细胞)的分化能力几乎没有或没有影响。本文所述的方法提供用于跟踪PP/TU比例从粗批次A到批次C和D的发展并且保证其降低或保持稳定的方式。所述比例升高可以证明浓缩方法损害载体颗粒。

本发明进一步提供，但不限于，包含在保藏的细菌宿主中的病毒DNA构建体，且所述细菌宿主以保藏号CNCM I-4487 (pEnv)、CNCM I-4488 (pHIV-Gag/Pol)或CNCM I-4489(pLV.EF1.GFP)保藏在CNCM保藏中心。本发明还提供了插入在载体中的病毒来源的纯化的核苷酸序列，其用于生产根据本发明的基于RNA的载体，所述核苷酸序列是包含在以保藏号CNCM I-448、CNCM I-4488或CNCM I-4489保藏在CNCM保藏中心的三个重组宿主的任一中的插入物。

根据本发明生产的这种基于RNA的病毒载体能够转导真核靶细胞，用于将目的核酸(转基因)转移到所述细胞中。本发明还提供了用于制备修饰的真核细胞的方法，其中通过根据本发明的纯化的基于RNA的病毒载体组合物转导所述细胞而不影响它们的生存力。该转导方法可以用于例如用于药物发现的体外应用，在体内和离体的临床测定法和用于基因治疗。本发明的组合物尤其良好地适用于转导需要高M.O.I. (感染复数)的细胞。

本发明的方法包括多种特征，例如在无血清培养基中生产基于RNA的病毒载体颗粒，其提供了增强的所述病毒载体的生产。在本发明的一个实施方案中，本发明的方法包括：

(i) 转染生产细胞，所述细胞经过修饰以补充在病毒载体所基于的RNA病毒基因组中的缺失，并且在合适的条件下所述培养生产细胞，以允许基于RNA的病毒载体颗粒的生产，其中所述转染后的培养在无血清培养基中进行；和

(ii) 收集包含所述基于RNA的病毒载体颗粒的上清液。优选地，根据本发明的生产方法不包括丁酸钠诱导步骤。

在本发明的实施方案中，包含基于RNA的病毒载体颗粒的上清液可以在转染后的特定时间间隔收集，所述特定时间间隔取决于所述载体颗粒在37℃的半衰期，其通常是约8-10个小时，取决于所用的生产细胞类型和培养基(Le Doux等，1999)。优选地，所述上清液收集通过以特定时间间隔的的多个步骤(包含在3-6个之间，例如4个步骤)进行。所述时间间隔有利地等于所述载体颗粒在37℃的半衰期的约两倍。此步骤保护载体颗粒免于在生产步骤期间在细胞培养基中降解，和免于导致载体颗粒废物释放在上清液中。

本发明的方法可以进一步任选地包括切向超滤的步骤，其包含上清液的渗滤步骤。在本发明的又另一个实施方案中，在切向超滤渗滤步骤后，本发明的方法可以进一步包括离子交换层析步骤，进行该步骤以进一步浓缩和纯化病毒载体颗粒。

在本发明的具体实施方案中，所述超滤在聚砜中空纤维滤芯(cartridges)上操作。可以在收集上清液后和在超滤步骤之前(如果有的话)进行通过离心的澄清。该离心后获得的截留液可以进一步用能够降解污染性核酸的酶，如核酸酶处理。这些酶包括但不限于Benzonase (核酸酶)或DNA酶。产品回收后，可以通过添加例如DMEM和通过形成盐梯度的分离，在离子交换柱上进一步纯化所述病毒载体颗粒。

本发明的方法提供了纯化的基于RNA的病毒载体颗粒的制品，其中所述去除的DNA污染物占存在于初始的无血清培养基的该污染物的70-99％之间，并且去除的细胞蛋白污染物占包含在初始的无血清培养基中的细胞蛋白的50-99.9％之间，并且其中PP/TU比例包含在100至900之间。批次的质量随着比例PP/TU降低而增加。这意味着对于有效颗粒过量的物理颗粒，对转导的效率和转导细胞的表型具有负面影响。如使用本文在材料和方法中所述方法所计算，高于1000的PP/TU比例，被认为是可接受的上限。

本发明的方法进一步提供了纯化的基于RNA的病毒载体颗粒的制品，其中所述去除的DNA污染物占存在于初始的无血清培养基中的该污染物含量的多达71％，并且去除的细胞蛋白污染物占存在于初始的无血清培养基中的该污染物含量的多达56％，并且其中所述PP/TU比例包含在100和600之间。

本发明的方法导致生产出纯化的基于RNA的病毒载体颗粒，所述载体颗粒能够转导真核靶细胞，而不影响所述细胞的生存力，其在体外增殖的能力，或其在分化途径向下发展的能力(例如，当转导干细胞时)。这样的纯化的基于RNA的病毒载体颗粒在细胞的无血清系统中生产，并且它们可用于体外转导真核靶细胞，所述细胞适于注射到宿主体内。这样的真核细胞包括，例如永生化的细胞、原代细胞、干细胞或诱导的多能干细胞。

因此，本发明提供了制备遗传修饰的真核细胞的方法，其特征在于使真核细胞与根据本发明的基于RNA的病毒载体组合物接触的步骤。该方法可以进一步包括从无血清细胞培养基上清液中分离遗传修饰的真核细胞。当生产病毒载体颗粒时以及当转导细胞例如干细胞或原代细胞(其可以需要特定的培养基和/或血清)时，无血清培养基是重要的。实际上，存在/缺少血清、丁酸钠诱导或载体收获时间中的每个参数，都可以影响初始粗载体上清液组合物，并且从而导致对转染细胞的差异的毒性水平。本发明进一步提供修饰的真核细胞，其中所述细胞通过根据本发明的纯化的基于RNA的病毒载体组合物转导而不影响其生存力。

附图说明

图1：载体生产图解。使用包装和表达质粒转染生产细胞以在细胞上清液中生产非复制性慢病毒载体。

图2：包含在细菌宿主中的病毒DNA构建体，所述细菌宿主以保藏号CNCM I-4487、CNCM I-4488或CNCM I-4489保藏在CNCM。图2A：带有gag和pol基因的质粒。图2B：表达包膜的辅助质粒。图2C：转基因表达质粒。

图3A：永生化细胞系的细胞转导测定。将每孔50,000个细胞接种于24孔微孔板(Corning CellBind 24孔微孔板)并与表达GFP的慢病毒载体混合。使用从10至100的M.O.I.范围，在4µg/mL polybren的存在下，在1mL的总体积中，在37℃/5% CO₂下过夜，以确定最佳的转导条件。在过夜孵育后，将上清液替换为新鲜培养基。转导后3天，转导的细胞通过流式细胞术分析。图3B：原代细胞的细胞转导测定。将每孔50,000个细胞接种于24孔微孔板(Corning CellBind 24孔微孔板)并与表达GFP的慢病毒载体混合。使用从10至100的M.O.I.范围，在4µg/mL polybren的存在下，在以1mL的总体积中，在37℃/5% CO₂下过夜，以确定最佳的转导条件。在过夜孵育后，将上清液替换为新鲜培养基。转导后3天，转导的细胞通过流式细胞术分析。

图4A：根据现有技术方法，使用血清的常规载体生产方法。图4B：根据通过SDS-PAGE凝胶分析的FCS比例的蛋白概况的评价。将15µg的病毒上清液的总蛋白加载到SDS-PAGE凝胶上。总蛋白通过在280nm的分光光度法定量。图4C：用于评价蛋白概况的批次滴度的总结。(1) 通过流式细胞术确定转导单位(TU)。(2) 通过HIV-p24 ELISA定量物理颗粒(PP)以确定PP/TU比例。(3) 通过在280nm的分光光度法定量总蛋白。

图5A：本发明的病毒载体浓缩和纯化方法。不同方法按顺序(从A至D对应批次A至D的获得)以符合靶细胞的浓缩和纯化的要求：永生化的细胞(A)、原代和干细胞(C)和体内注射(D)。图5B：经过超离心和在中心单元上的离心的无血清生产的载体的SDS-PAGE凝胶(B)。泳道1：3x10⁵ TU的超离心的批次。泳道2&3：分别为3x10⁵ TU & 3x10⁶ TU的在中心单元上离心的批次。图5C：通过SDS-PAGE凝胶分析的纯化方法的表现。泳道1：3x10⁵ TU的使用即用型离心单元的超滤批次(策略B)。泳道2：3x10⁶ TU的使用即用型离心单元的超滤批次(策略B)。泳道3：3x10⁵ TU的使用中空纤维的超滤批次(策略C)。泳道4：3x10⁵ TU的使用中空纤维随后是使用即用型离心单元的另外的浓缩步骤的超滤批次。泳道5：3x10⁶ TU的使用中空纤维随后是使用即用型离心单元的另外的浓缩步骤的超滤批次。泳道6：3x10⁵ TU的层析批次(策略D)。泳道7：3x10⁶ TU的随后使用即用型离心单元的另外的浓缩步骤的层析批次。泳道8：15x10⁶ TU的随后使用即用型离心单元的另外的浓缩步骤的层析批次。

图6：取决于本发明的纯化策略的剩余杂质。取决于所使用的浓缩和纯化技术，浓缩和纯化策略显示不同的杂质去除概况。从A至D，剩余杂质(蛋白、DNA和非生物性病毒载体(PP))降低以达到FDA对于体内注射的纯化要求(D)。

图7：取决于纯化策略，纯化的生物活性的逆转录病毒载体相比杂质的比活性。病毒颗粒及其污染物环境通过比活性表示。比活性是每毫克总蛋白(以TU/mg表示)，或每微克残留DNA (以TU/µg表示)的载体的生物活性，从而给出了病毒载体在其环境中的活性的量度。随着载体的环境中污染物减少，比活性增加。

图8：取决于本发明的纯化策略的物理颗粒/转导单位比例(PP/TU)。在后期载体生产阶段可以出现的一些缺陷，导致非感染性病毒载体的产生。缺乏任何生物活性的那些物理颗粒具有与生物活性颗粒的几乎相同的物理-化学性质，导致难以在浓缩-纯化方法过程中将其消除。

图9：取决于本发明的纯化策略，纯化的生物活性的逆转录病毒载体相比杂质的纯化水平。所述纯化水平表示存在于病毒载体环境中的病毒载体和杂质(例如蛋白或DNA)之间的纯化比例。随着进入最终回收产品的剩余杂质的减少，从批次A至批次D的四个批次的纯化水平增加。

图10：使用非整合型慢病毒载体(NILV)和整合型慢病毒载体(ILV)的IMR90细胞转导。将每孔50,000个细胞接种到24孔微孔板并与5至200的M.O.I.的慢病毒载体混合，在4µg/mL polybren的存在下，在1mL的总体积中，在37℃/5% CO₂中过夜。在过夜孵育后，将上清液替换为新鲜培养基。转导后6天，通过FACS分析确定GFP表达。图10A：以提高的M.O.I.使用表达GFP的ILV和NILV转导的IMR90细胞的百分比。图10B：以提高的M.O.I.使用表达GFP的ILV和NILV转导的IMR90细胞中的荧光强度。

图11：在293T细胞和使用三种用于慢病毒生产的质粒转染的293T细胞中的LDH测定。

图12A：用表达GFP的慢病毒载体(ILV)转导后5天的包皮细胞中的GFP表达。批次以A、B、C和D字母表示。将每孔50,000个细胞接种到24孔微孔板并与40和150的M.O.I.的慢病毒载体混合，在4µg/mL polybren的存在下，在1mL的总体积中，在37℃/5% CO₂下过夜。在过夜孵育后，将上清液替换为新鲜培养基。转导后5天，固定细胞。图12B：用表达GFP的慢病毒载体(ILV)转导后11天的包皮细胞中的GFP表达。批次以A、B、C和D字母表示。将每孔50,000个细胞接种到24孔微孔板并与40和150的M.O.I.的慢病毒载体混合，在4µg/mL polybren的存在下，在1mL的总体积中，在37℃/5% CO₂下过夜。在过夜孵育后，将上清液替换为新鲜培养基。转导后11天，固定细胞。图12C：用表达GFP的慢病毒载体(ILV)转导后11天通过FACS测量的包皮细胞中的GFP表达。批次以A、B、C和D字母表示。包皮细胞在96孔板中转导并在一天后转导。11天后，通过FACS测量所有靶细胞中的GFP强度。

图13：转导后11天的细胞生存力。包皮细胞在96孔板中转导并在一天后转导。

图14A：在用批次B转导后11天，通过MTT测定测量的细胞增殖。包皮细胞在96孔板中转导并在一天后用批次B转导。5天后在所有孔中细胞传代至第三代，并且在11天后进行MTT测定。图14B：在用批次A、B、C和D转导后11天，通过MTT测定测量的细胞增殖。包皮细胞在96孔板中转导并在一天后用B批次转导。11天后，进行MTT测定。图14C：相比批次B，在用其它批次转导后11天，通过MTT测定测量的细胞增殖。包皮细胞在96孔板中转导并在一天后用批次B转导。11天后，进行MTT测定。

图15A：在用携带空盒而不含cDNA的慢病毒载体(rLV-EF1)以M.O.I. 40或M.O.I.150转导后48小时的包皮细胞生长。批次B和C的rLV-EF1来源于相同的粗收获物。图15B：用于转录组分析的rLV-EF1批次B和C的表征。(1) 通过qPCR确定转导单位(TU)。(2) 使用Quant-iT试剂盒PicoGreen dsDNA试剂盒(Life Technologies)定量残留DNA。(3) 通过在280 nm的分光光度法定量总蛋白。(4) 通过HIV-p24 ELISA定量物理颗粒(PP)以确定PP/TU比例。

图16A：散点图，表示相比于未转导细胞，在以M.O.I. 150的rLV-EF1批次B转导的细胞中差异表达，并且相比于未转导细胞，在以M.O.I. 150的rLV-EF1批次C转导的细胞中未受影响的一组探针。X轴表示对于未转导的(NT)细胞的标准化强度，并且Y轴表示对于转导的(T)细胞的标准化强度。很轻的灰色调线是表示-1.5、1和1.5倍变化值的倍数变化线。图16B：测线图，表示在强度值的基线转化后，如图16A中所示的同一组探针。图16C：散点图，表示相比于未转导细胞，在以M.O.I. 40的rLV-EF1批次B转导的细胞中差异表达，并且相比于未转导细胞，在以M.O.I. 40的rLV-EF1批次C转导的细胞中未受影响的一组探针。X轴表示对于未转导的(NT)细胞的标准化强度，并且Y轴表示对于转导的(T)细胞的标准化的强度。很轻的灰色调线是表示-1.5、1和1.5倍变化值的倍数变化线。图16D：测线图，表示在强度值的基线转化后，如图16C中所示的同一组探针。

图17A：在血清的存在下，使用携带空盒的慢病毒载体(rLV-EF1)以M.O.I. 40和M.O.I. 150转导后48小时的包皮细胞。图17B：用于转录组分析的批次B-S的rLV-EF1的表征。(1) 通过qPCR确定转导单位(TU)。(2) 使用Quant-iT试剂盒PicoGreen dsDNA试剂盒(Life Technologies)定量残留DNA。(3) 通过在280 nm的分光光度法定量总蛋白。(4) 通过HIV-p24 ELISA定量物理颗粒(PP)以确定PP/TU比例。

图18：测线图，表示相比未转导(NT)，使用rLV-EF1批次B-S有特异性差异，并且相对NT，使用rLV-EF1批次B和C (在M.O.I. 40和150)未受影响的一组探针。在表示数据之前，对强度值应用基线转化。在批次B-S M.O.I. 150的情况下，根据其标准化强度，对线进行着色。

图19：使用现有技术浓缩方法(对应批次B的获得)和本发明中所述方法(A、C和D)所获得的本发明的相关产品的性能的概况。此图表总结了本发明中所述的取决于浓缩和纯化方法的批次特征。方法B (对应批次B的获得)代表现有技术方法的状况。使用来自此方法的载体转导产生细胞生存力和增殖问题。C和D是本发明开发的方法(对应所获得的批次C和D)，以解决在使用来自方法B (对应批次B的获得)的载体转导后观察到的细胞生存力缺陷。在该表中，批次A被认为是对所有百分比数据(方法回收率、蛋白和DNA去除)的参照。批次A被认为是优化的批次，原因是它在无血清培养基中生产，没有丁酸钠诱导并在基于对目的病毒颗粒特异性的半衰期的不同时间收获。

图20：在所有批次A、B、C和D中污染物和滴度，以及功效的测量。

图21：收获时间、丁酸钠诱导对转染的生产细胞和所获得的粗载体组合物的影响。

具体实施方式

本发明提供用于生产高滴度和纯度的病毒载体组合物(本文也称为病毒载体颗粒)的新方法。如本文所述，已开发了用于载体生产和浓缩的新方法(图5A)。所述方法首先基于在无血清培养基中真核细胞的瞬时转染，其导致称为批次A的粗批次的生产(图5A)，相比用血清生产的批次(如图4中所述的批次A-S)，其展示高品质的性能。这种粗上清液(批次A)是优化的，因为其生产没有丁酸钠诱导，无血清并且在转染后取决于载体颗粒在37℃的半衰期的特定时间收集，取决于生产细胞类型和培养基，该半衰期为约8小时(Le Doux等，1999)。生产步骤之后可以是通过超滤浓缩和通过离子交换层析纯化载体颗粒，并且分别导致本文称为批次C或D的批次，并且其展示高比例的蛋白和DNA去除(图19和20)。可以获得用于小和大规模应用的产品，批次C和D，并且允许有效地转导，而如通过现有可用方法测量，对细胞生存力和增殖没有显著影响。这种有效转导需要如本文提供的，用于有效的载体生产、浓缩和纯化，同时保持载体潜能而不引入可干扰靶细胞分裂和代谢的细胞和培养基内容物的方法(图5A)。

本发明的用于生产基于RNA的病毒载体的方法包括：

(i) 转染生产细胞，所述细胞经过修饰以补充在载体所基于的基于RNA的病毒基因组中的缺失，并且在合适的条件下培养，以允许基于RNA的病毒载体颗粒的生产，其中所述转染后的培养在无血清培养基中进行；和

(ii) 收集包含所述基于RNA的病毒载体颗粒的上清液。

取决于载体颗粒在37℃的半衰期，所述收集可以以顺序方式(in a sequentialmanner)进行，其中进行中间收获。这与现有技术相反；在现有技术中，例如，在转染后，经典地通过两步进行载体收获，如Cooper等(2011)和Merten等(2010)所述。在本发明的一个实施方案中，在转染生产细胞后的72小时过程中可以进行几次收获。在本发明的非限制性实施方案中，取决于转染方法和生产细胞系，在转染后可以进行3-6次之间的载体收获。在本发明的具体实施方案中，在转染生产细胞后以特定间隔进行四次收获。所述收获间的间隔时间基于在生产细胞系的培养基中在37℃的载体半衰期。所获得的规律间隔时间是在所需要的粗载体功能滴度(>10⁶ TU/ml)和能够在转染的细胞中诱导毒性的污染物的存在之间的平衡。

在本发明的方法中，使用目的病毒载体转染生产细胞。病毒载体经设计以在导入靶宿主细胞后，在体内或体外表达插入病毒核酸的目的核酸(本文也称为转基因)。这种向靶宿主细胞的导入可以用于，例如，在药物发现或基因治疗应用中。

转染定义为故意将核酸导入细胞的方法。该术语严格地用于在真核细胞中的非病毒方法。在将gag-pol和env表达质粒转染生产细胞以在上清液中获得病毒载体时，在病毒载体生产过程中使用转染。转导定义为故意将核酸导入细胞的方法。该术语用于在真核细胞中的基于病毒方法。从生产细胞收获病毒载体并且与真核细胞接触以获得最终转导的细胞。

在本发明的优选实施方案中，所述病毒载体基于属于逆转录病毒(Retroviridiae)科的病毒，其包括包膜的RNA病毒，包括例如慢病毒(LV)和γ-逆转录病毒(RV)载体。所述纯化方法的开发需要准确的载体的物理、化学和生物性质的知识。逆转录病毒载体源自属于逆转录病毒科的病毒，其包括具有复杂大分子结构的包膜RNA病毒，具有约150nm的流体动力学直径(Salmeen等，1975)。由于尺寸大，所述病毒颗粒具有低扩散性(10^-8cm²/s)；通过蔗糖密度梯度超离心确定，其密度为约1.15-1.16 g/cm³ (Coffin等，1997)。它们由60-70%蛋白、30-40%脂质(来源于生产细胞的质膜)、2-4%碳水化合物和1% RNA组成(Andreadis等，1999)。逆转录病毒颗粒由两个相同拷贝的单链正义RNA，以及整合酶和逆转录酶组成，包含在由脂质双层膜包围的蛋白衣壳内。脂质双分子层上散布着糖蛋白的突出物。逆转录病毒载体是在广泛的pH值内带负电荷的颗粒，因为它们的等电点出现在非常低的pH值。包膜蛋白和脂质双分子层可能是在病毒表面的负电荷的主要贡献者(Rimai等，1975)。

待转染的生产细胞的类型将取决于已经选择用于实施本发明的病毒载体。这些细胞包括任何容易转染的哺乳动物细胞，例如，如293T或HeLa细胞。在本发明优选的实施方案中，当使用源自逆转录病毒科的病毒载体，例如γ-逆转录病毒载体(RV)和慢病毒载体(LV)时，可以使用293T细胞。将与目的病毒载体结合使用的细胞类型是本领域技术人员已知的。

生产细胞经工程化以瞬时或稳定地表达任何病毒蛋白，其中所述病毒蛋白的表达对于病毒载体的组装和包装导入病毒颗粒是必需的。在本发明的实施方案中，逆转录病毒载体，包括慢病毒载体，由细胞系生产，所述细胞系经工程化以表达所述载体(其编码转基因)和辅助构建体(编码病毒蛋白)，如图1中所述。为了尽量减少重组事件和复制型逆转录病毒的生产，可将逆转录病毒基因组序列分成三个不同的构建体(图2A-C)。

第一个构建体，gag-pol载体，编码结构蛋白和病毒酶。分别地，gag编码基质蛋白(MA)、衣壳(CA)和核蛋白(NC)结构，并且pol编码反转录酶(RT)和整合酶(IN)酶类。最优选地，病毒gag和pol基因源自逆转录病毒，优选慢病毒，并且最优选源自HIV。

第二个构建体，env载体，编码包膜蛋白，从所述包膜蛋白通过二硫键衍生出表面(SU)和跨膜(TM)组分。TM组分通过跨膜区段锚定，并且无法从载体去除而不将其破坏(Coffin等，1997)。env基因可以源自任何病毒，包括逆转录病毒。env可以是双嗜性包膜蛋白，其允许转导人和其它物种的细胞，或可以是单嗜性包膜蛋白，其仅能够转导小鼠和大鼠细胞。另外，可以期望通过将包膜蛋白与抗体或用于靶向特定细胞类型的受体的特定配体连接来靶向重组病毒。例如，通过将目的序列(包括调节区)连同另一个基因(其编码在特定靶细胞上受体的配体)插入病毒载体，所述载体现在是靶特异性的。可以通过例如，插入糖脂或蛋白，将逆转录病毒载体制成靶特异性的。经常通过使用靶向逆转录病毒载体的抗体实现靶向。本领域技术人员将明白，或可以无需过度实验即可容易地确定实现将逆转录病毒载体递送到特异性靶的特定方法。源自逆转录病毒的env基因的实例包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)。也可以使用其它env基因，例如水疱性口炎病毒(VSV)(蛋白G)。

提供病毒env核酸序列的载体连接到调节序列，例如启动子或增强子。优选地，所述调节序列是病毒启动子。所述调节序列可以是任何真核启动子或增强子，包括，例如莫洛尼鼠白血病病毒启动子-增强子元件，人巨细胞病毒增强子(如在示例性实施例中所使用)。在某些情况下，如莫洛尼鼠白血病病毒启动子-增强子元件，这些启动子-增强子元件位于LTR序列内或与其相邻。

第三个构建体，转基因载体，提供了对于病毒的生命周期的所需的顺式作用病毒序列(图2C)。这样的序列包括psi包装序列、反转录信号、整合信号、病毒启动子、增强子和多腺苷酸化序列。这种第三载体还含有用于将转移到靶细胞的异源核酸序列的克隆位点。合适的载体的示意图显示在图2C中，使用GFP作为转基因，但其可以替换为任何目的基因或序列，例如shRNA (短发夹RNA)或miRNA (微小RNA)。

这个构建体可以包含其它表达元件，如野生型WPRE序列(Zufferey等，1999)，cPPT/CTS元件(Manganini等，2002)。使用编码β-内酰胺酶的基因选择用这些质粒转化的细菌，以产生质粒。用这些质粒转染生产细胞后，转录从真核启动子(RSV U3)起始到多聚腺苷酸化位点(HIV1 R)并且不包括编码β-内酰胺酶的基因。β-内酰胺酶蛋白或其相应的RNA都没有在生产细胞中表达，或被包被到载体颗粒中。

通过使用转基因替换逆转录病毒复制所需的基因组区域消除病毒致病性。这保证了包装到逆转录病毒载体的基因组只编码转基因和对于包装和反转录所需的序列。

三个逆转录病毒构建体的分离允许具有来自其它病毒的表面蛋白的逆转录病毒载体的假型化(pseudotyping)，从而扩大了病毒嗜性。在非限制性实施方案中，如本文中所述的逆转录病毒载体，已经用水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)假型化(Clapham，P.等，1984)。用VSV-G蛋白假型化的逆转录病毒载体经由与广泛分布的质膜的脂质组分相互作用进入细胞，从而允许非常广谱的转导(Verhoeyen等，2004和Yee等，1994)。由于包膜结构的改变，假型化可对逆转录病毒载体的生产和纯化具有很大的影响，从而影响在下游方法中使用的逆转录病毒载体的物理-化学膜性质。

生产细胞可以用载体构建体，根据本领域技术人员熟知的标准技术进行转染。这样的技术包括，例如，磷酸钙技术、DEAE-葡聚糖技术、电穿孔、基于渗透性休克的方法、显微注射或基于使用脂质体的方法。在本发明的优选实施方案中，可以用钙沉淀法转染细胞。当293T细胞是所选择的生产细胞时，这样的方法是优选的，但也可使用等效的细胞。

转染后，将细胞在无血清培养基中孵育足够的时间，以允许有效的病毒颗粒生产。无血清培养基被定义为用于哺乳动物细胞培养的基本上不含源自动物的血清的生长培养基。无血清培养基是本领域熟知的(Bruner等，2010)。转染后的培养时间将取决于多种因素的组合，包括例如，所用的病毒载体的类型和所选择的生产细胞系。在转染后的时间间隔期间，即孵育时间，可以进行多次载体收获。在本发明的优选实施方案中，可以进行4次载体收获。为了确定最有生产力的孵育条件，可以进行小批量实验，以确定用于生成滴度最高和最纯批次的病毒颗粒的最佳条件。

含有病毒载体颗粒的初始培养物上清液在本文中称为批次A。本发明的方法可以进一步包括批次A产品的切向超滤渗滤步骤，用于病毒载体颗粒的进一步纯化。这样的超滤渗滤步骤是一种类型的膜过滤，其中静水压力向液体施加相对半透膜的压力。悬浮固体和高于膜截止分子量的溶质被截留，而水和低于膜截止分子量的溶质穿过膜。在本发明的优选实施方案中，超滤技术使用聚砜中空纤维滤芯，通过切向流超滤进行。该技术允许监测和调整压力，以保证维持载体完整性和生存力。这样的步骤提供用于载体颗粒的浓缩，并且充当用于从所收集的批次去除初始污染物(如宿主细胞蛋白和核酸)的纯化步骤。这样的批次在本文中称为批次C。

在本发明的又另一个实施方案中，在切向超滤和/或渗滤步骤后，本发明的方法可以进一步包括离子交换层析步骤，可以进行该步骤以进一步浓缩和纯化病毒载体颗粒。这样的批次在本文中称为批次D。

本发明涉及批次A的组合物在容许性(permissive)的永生化细胞系(例如HCT116)上的应用。进一步地，本发明涉及批次C或D的组合物在基因治疗应用中的应用，证实了与如图4中所述批次B-S的现有技术的产品相比，由于载体的制备条件或细胞培养的条件，其不诱导或轻微诱导细胞表型的变化。如本文所述，对无血清的粗批次使用超滤不仅允许浓缩载体颗粒，而且还允许通过从收集的批次去除多于70%的初始污染物(如宿主细胞蛋白质和用于转染的DNA)而将其纯化(图20和图21)。由于下游浓缩和纯化步骤直接受到载体生产过程中细胞培养方法改变的影响，优选的是，细胞培养和浓缩/纯化步骤是并行进行的。从生产细胞的培养基中去除血清对超滤和层析步骤具有强烈影响，因为初始蛋白和DNA内容物在使用或不施用血清生产的粗批次中是完全不同的。Merten等(2010)使用基于多个基于膜和层析步骤的下游方法，但具有使用含10%血清的培养基的生产方法，这是根据本发明开发的方法与Merten等(2010)的现有技术方法之间的重要区别。在Merten等(2010)的粗上清液中，初始总蛋白浓度为约6mg/ml，而在无血清的本发明中是0.14mg/ml，相差40倍。如本文中所述的，分别在超滤和层析分离后，在批次C和D中的蛋白最终浓度小于0.061mg/ml和0.01mg/ml，而在对用血清生产的批次进行多个基于膜和层析的步骤后，其达到1.5mg/ml的平均值(Merten等，2010)，分别相差25和150倍。

粗批次中缺少血清可以解释在本发明和使用这些方法对病毒或载体纯化的初步研究(Grzenia等，2008)中获得的载体浓度和污染物去除中得到的差异。Grzenia等观察到因为某些较小的损坏的病毒颗粒和病毒片段有可能沉积在膜表面上而产生的难题。纯化的效率似乎在于膜的截止分子量、离子强度、跨膜压(TMP)和载体大小之间的平衡。本发明证明，可以干扰纯化方法的另一个参数基于可以影响从粗批次去除宿主DNA和蛋白的初始培养基内容物。如本文所述，细胞培养、浓缩和纯化步骤的组合可允许病毒颗粒(如基于慢病毒或逆转录病毒的颗粒)的高回收率，其与高纯度相关。根据本发明生产的具有高质量水平的载体，允许iPS (诱导的多能干细胞)的生成而没有由于血清内容物或培养基污染物而对重编程过程中的细胞增殖的影响，如WO 2007/09666和WO 2009/13971中所公开。

本发明基于在本发明方法的每个步骤后(对应于批次A、C和D的获得)，与物理颗粒(PP)或能够转导细胞的生物颗粒(TU)的颗粒定量相关的蛋白和DNA含量的研究，与常规使用的现有技术浓缩方法(对应批次B的获得)的比较。平行地评价了转导细胞中的毒性和增殖，以确定浓缩和纯化方法对细胞的表型影响。

本发明提供了含有可用于转导细胞的高滴度和高度纯化的病毒颗粒的组合物。本发明的组合物提供当需要使用大的培养基体积或高感染复数(M.O.I.)时，用于转导精致的或脆弱的细胞(如原代细胞和干细胞)的方式。因此，该组合物适合用于非整合型慢病毒载体(NILV)对精致且脆弱的细胞的应用，这通常需要高M.O.I.转导。

本发明证实，用于药物开发和基因治疗应用的基于病毒的颗粒的有效生产，需要开发稳健的浓缩操作和纯化步骤，以及使用合适培养基以培养细胞，并重新悬浮将用于转导细胞的载体批次。如本文所证明，靶细胞转导效率不仅依赖于细胞类型(永生化的，原代和干细胞)，或起源的组织，还依赖于载体的特性(滴度、纯度水平、蛋白和DNA含量)。

逆转录病毒载体制品不仅由病毒颗粒本身限定，也通过它们接近的环境限定，影响最终病毒载体制品的质量水平，并且如本文所证实的，影响转导水平和细胞生存力。

逆转录病毒载体是在含有蛋白和DNA污染物的DNA培养基中的蛋白、脂类和RNA的复杂大分子装配物。因此，对这样的环境的评价会是困难的。大部分困难来自在出芽过程中，生产细胞成分(主要是蛋白)在脂质双分子层内和病毒颗粒内的掺入。所有这些特性大大地提高了确定在上清液中的哪些样品成分与载体相关，并且哪些成分实际上是污染物的难度。最相关的上清液污染物是(i) 非感染性的物理颗粒(PP)，(ii) 细胞或病毒蛋白，和(iii) DNA。

蛋白杂质是在逆转录病毒载体上清液中最丰富的污染物。它们大多来自于生产细胞蛋白分泌，并且胁迫蛋白的比例在进行无血清方法时增加。逆转录病毒载体在出芽过程中掺入宿主细胞蛋白，使污染物和载体相关蛋白之间的区别变得复杂。在本研究中，所述病毒颗粒和它们的蛋白环境通过它们的比活性表示。比活性是每毫克总蛋白的载体生物活性(以TU/mg表示)，因此给出了在细胞培养基组合物中病毒载体活性的量度。在如本发明中所述的纯化过程中，比活性随污染物减少而增加。

在逆转录病毒载体上清液中也发现了DNA污染物。关于核酸污染的关注来自于在靶细胞中细胞转化事件，以及在体内治疗中细胞炎症的可能性。污染DNA极限通常取决于转导目标和应用。污染DNA的不同来源是宿主生产细胞和来自于在逆转录病毒载体的生产中使用的瞬时转染的质粒。因此，可以在纯化方法中引入DNA酶(例如来自德国Merck的Benzonase®)以降低DNA污染。细胞培养基中的病毒颗粒和它们DNA通过它们的比活性表示。比活性是每微克残留DNA的载体生物活性(以TU/µg表示)。如先前所述，在如本发明中所述的纯化过程中，比活性随污染物减少而增加。

如同野生型病毒，并非制品中所有生产的病毒颗粒都是感染性的。事实上，一些缺陷出现在载体生产阶段的后期。通常，颗粒装配、壳体化、病毒RNA包装或出芽可导致一些实体上的异常。因此，通常与感染性载体一同产生没有RNA链，具有破坏的衣壳蛋白或不存在衣壳蛋白，或具有缺失包膜蛋白的病毒颗粒。那些没有任何生物活性的物理颗粒具有与生物活性颗粒的几乎相同的物理-化学性质，导致难以将其消除。根据本发明，物理颗粒对感染性或转导颗粒的比例(PP/TU)如果包含在下列之间，则认为该比例是优化的：

900：1和200：1，对于粗批次A，优选小于600；

600：1和200：1，对于批次C，优选300：1或更少；

400：1和100：1，对于批次D，优选小于300：1。

如对于方法B所观察到的(对应批次B的获得)，浓缩步骤之前和之后PP/TU比例的增加，意味着该方法破坏了载体颗粒。由于多个原因，此比例代表纯度的相关指数。首先，其给出了粗上清液中载体状态的描述，并且其演变显示了用于浓缩和纯化载体的方法对它们完整性的影响。随着其增加，该方法破坏颗粒。虽然很多研究获得了大于1000或更高的比例，但在本发明中描述的方法中，粗滴度显示PP/TU比例包含在500和900之间。Merten等(2010)在包含10%血清并且转染后收获两次(各24小时)的批次中给出了2333的比例。此数值按照下述公式计算：

PP/TU= (4.9x10⁴ ng P24/ml x10⁷ PP/ng P24) / 4.3x10³ IG/ml，如Merten等(2010)中的计算。一纳克的P24表示10⁷ PP，并且Merten等提供了在整合的基因组中计算的每毫升有效的滴度。此更高的比例证明一些载体在37℃下的生产阶段中降解，并且血清内容物增强了这种载体降解。这种差异突出了血清和收获时间是使用显示小于900:1的PP/TU的适宜批次开始浓缩和提纯步骤的关键点。在本发明优选的实施方案中，第一次收获时间在转染后24小时和36小时之间。任何后续的收获可以在前面收获后12小时完成。具有更高比例的粗批次在浓缩和纯化步骤后不导致所需的最终产品。

包含现有技术中描述的载体的组合物包含污染物，其可以对靶细胞表型具有有害影响，并且可以影响由所述逆转录病毒载体制品转导的靶细胞表达或高表达目的转基因的能力。这些表型的变化可以在转导后发生，并且可影响转导的细胞中的细胞增殖或细胞生存力。本发明提供几个稳健和可升级的纯化方法，允许与精致且难控制的靶细胞以及体内临床前实验要求相容的，污染蛋白和DNA浓度以及物理颗粒对感染性颗粒的比例的显著下降。

实施例

提供下面的实施例以帮助更好地理解本发明，尽管本发明不限于这些实施例。

材料和方法

质粒构建。为了生产重组病毒粒子或重组逆转录病毒，使用了三种载体。第一载体提供了编码病毒gag和pol基因的核酸(图2A)。如上文所讨论的，这些序列分别编码组特异性抗原和反转录酶，(以及成熟和反转录所必需的整合酶和蛋白酶-酶类)。第二载体提供了编码病毒包膜(env)的核酸(图2B)。第三载体提供了病毒的生命周期所需的顺式作用病毒序列(图2C)。这个第三载体还含有用于将转移到目标细胞的异源核酸序列的克隆位点。合适的载体的示意图示于图2C中，使用GFP作为转基因，但可以将其替换为任何目的基因或序列，例如shRNA或miRNA。

病毒载体制造方法。细胞系和培养条件。病毒载体使用人胚肾(HEK293T)细胞系生产。人结肠癌(HCT116；ATCC N°CCL-247)粘附细胞系用于感染性颗粒的定量。所有细胞由美国典型培养物保藏中心(ATCC)提供并且在补充10% FCS (胎牛血清(fetal calf serum)或胎牛血清(fetal bovine serum，FBS))、1%青霉素/链霉素和1%超谷氨酰胺(ultraglutamine (PAA))的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM, Gibco, Paisley, UK)中，在37℃，在空气中5% CO₂的潮湿气氛中培养。对于病毒载体上清液的生产，DMEM仅补充1%青霉素/链霉素和1%超谷氨酰胺(PAA)。

病毒载体生产。病毒载体生产在10层CellSTACK (6320cm²，Corning)中进行。HEK293T细胞以9.5x10³个活细胞/cm²接种在补充有10% FCS、1%青霉素/链霉素和1%超谷氨酰胺(PAA)的DMEM中，并放置在37℃，空气中5% CO₂的潮湿气氛中。接种后4天，在转染细胞前，弃去上清液并替换为补充有1%青霉素/链霉素和1%超谷氨酰胺(PAA)不含FCS的新鲜DMEM。

三重转染混合物由下列三种质粒组成：pENV、pGagPol、pLV-EF1-GFP。使用无菌水将最终浓度调整到40mg/ml-1。然后在软校验(soft checking)下将CaCl₂ (2.5M)滴加到质粒-水混合物中以达到500mM的终浓度。然后，将所获得的混合物滴加到等体积的Hepes缓冲的盐水(HBS 2X)中，并在室温孵育20分钟。孵育后，将转染的混合物添加到细胞培养基，并在37℃在空气中5% CO₂的潮湿气氛中孵育24小时。

转染后24小时，弃去上清液并且替换为无补充的新鲜DMEM，并且将细胞在37℃在空气中5% CO₂的潮湿气氛中孵育。培养基交换后，收集几次上清液(转染后32h、48h、56h和72h)。添加一些新鲜且无补充的培养基，并且在进一步收获前，将细胞在37℃在空气中5%CO₂的潮湿气氛中孵育。

每次收获物通过在3000g离心5分钟澄清，然后通过0.45µm孔径无菌滤器单元(Stericup，Millipore)微滤。然后，将整组收获物混合以提供粗收获物。

LDH细胞毒测定。还使用LDH细胞毒性测定试剂盒II (PromoKine)测量由编码慢病毒载体(lentivector)颗粒的质粒转染后从293T生产细胞释放的LDH酶(乳酸脱氢酶)。293T细胞上清液用作“低对照”，同时通过细胞裂解液裂解293T细胞，以代表“高水平对照”。然后，根据制造商的方案，对作为样品的每个粗上清液回收物进行LDH测定，以评估293T细胞在不同慢病毒载体生产过程期间的死亡率。LDH细胞毒性测定试剂盒II利用WST试剂(水溶性四唑)用于检测从损伤的细胞释放的LDH。该测定使用酶偶联反应；LDH氧化乳酸以生成NADH，NADH然后与WST反应以产生黄色。然后，用分光光度计(Glomax MultiDetectionSystem，Promega reference)在450nm光密度定量LDH活性。对于每个测试的粗上清液以单次(simplicate)重复该测定。

病毒载体浓缩和纯化。粗收获物的浓缩和纯化首先通过切向流超滤使用聚砜中空纤维滤芯进行。然后，以连续模式渗滤，将上清液相对DMEM或TSSM缓冲液渗滤20倍渗滤体积。一旦进行渗滤，回收截留液并进一步在一次性超滤单元上浓缩。

然后，通过添加终浓度72U/ml的Benzonase (250U/µl)和终浓度1µM的MgCl₂ (1.0mM)，使用benzonase处理中空纤维过滤(HFF)截留液，然后在37℃孵育20分钟。

然后，使用AKTA提纯器系统(GE Healthcare)，通过离子交换层析(IEX)在Sartobind Q75 (Sartorius)一次性膜上进一步纯化经过HFF后的材料。离子交换膜用5倍柱体积的无补充的DMEM(或TSSM)以2ml/min平衡。然后，使用进样环路将病毒上清液以2ml/min加载到膜上。收集通流物。将以下分步梯度应用到AKTA系统上：0M、0.5M、1.2M和2MNaCl。将洗脱级分(elution pic，用1.2M NaCl分步梯度收集)立即10X稀释到下列缓冲液中：20mM Tris + 1.0% w/v蔗糖 + 1.0% w/v甘露醇，pH7.3，并进一步在一次性超滤单元上浓缩。

使用qPCR的功能性颗粒定量。进行转导单位滴定测定，如下所述。将HCT116细胞以每孔12500细胞和250µL补充有10% FCS；1%青霉素/链霉素和1%超谷氨酰胺的DMEM上清液(完全培养基)接种到96孔板上。24小时后，对于每个载体样品和rLV-EF1-GFP内部标准品用完全培养基进行5次连续稀释。在8µg/mL Polybrene® (Sigma)的存在下，通过这些连续稀释物转导细胞。对于每个样品系列，添加一孔未转导的细胞用作对照。转导后3天，用胰蛋白酶处理细胞，并且每份细胞沉淀用250µL PBS重悬。然后，将100μL细胞悬浮液置于比色皿中，并且使用Versafluor (Biorad)测量以RFU (相对荧光单位)计的荧光强度。使用内部标准品(其滴度先前通过FACS确定)，通过转导单位/ml (TU/mL)确定滴度。

通过p24 ELISA测定的物理颗粒定量。使用Perkin Elmer提供的HIV-1 p24 ELISA试剂盒，直接对病毒上清液进行p24核心抗原检测。根据供应商的说明使用该试剂盒。使用针对HIV-1 p24的生物素化多克隆抗体，随后使用链霉亲和素-HRP (辣根过氧化物酶)缀合物，使捕获的抗原形成复合物。通过与邻苯二胺-HCl (OPD) (其产生与捕获的p24的量成正比的黄颜色)一起孵育，检测所得的复合物。使用微孔板读数器确定每个微孔板的孔的吸光度，并且相对HIV-1 p24抗原标准曲线标定。从p24的量计算在每毫升物理颗粒中表达的病毒滴度，已知1pg的p24对应10⁴个物理颗粒。

残留DNA定量。根据供应商的说明，使用Quant-iT试剂盒PicoGreen dsDNA试剂和试剂盒(Life Technologies)确定在每个样品中残留DNA的量。使用稀释在样品稀释缓冲液(DMEM或TSSM)中的质粒完成校准曲线。该反应本身包括在96孔板中，将25µl样品与25µl TE缓冲液和50µl的PicoGreen®染料的工作溶液混合。然后，避光孵育反应5分钟以允许染料结合双链DNA。然后，在读板器上在435/535 nm的激发/发射下测量样品的荧光。

总蛋白定量。每个样品中的蛋白的总量使用DCTM蛋白试剂盒(Biorad)确定，其方法衍生自Lowry法。根据供应商的说明使用该试剂盒。使用稀释在样品稀释缓冲液(DMEM或TSSM)中的BSA完成校准曲线。该测定是基于蛋白与碱性酒石酸铜溶液和福林试剂反应。如同Lowry测定，导致显色有两个步骤：在碱性介质中蛋白和铜之间的反应和后续的通过铜处理的蛋白对福林试剂的还原。

SDS-PAGE凝胶电泳。样品在95℃在“样品缓冲液4X”(Biorad)和“还原剂20X”(Biorad)中变性5分钟。变性后，将样品置于“Criterion XT Bis-Tris 4-12%凝胶”(Biorad)的孔中。将分子量标记物“Precision Plus Protein Dual Color Standard”置于样品旁边。在“XT MOPS缓冲液”(Biorad)中进行迁移。迁移后，将凝胶用水清洗多次，随后，用“Biosafe Coomassie Stain”(Biorad)染色。最终，进行多次水清洗以获得所期望的对比度。

细胞转导。细胞培养。人胚肺成纤维细胞系(IMR90)从美国典型培养物保藏中心(N°CCL-186)获得并且在补充10%胎牛血清(FCS；Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；Gibco，Carlsbad，CA，USA)中，在37℃，在包含5% CO₂的潮湿空气培养箱中培养。

使用病毒载体转导IMR90细胞。在转导前24小时，IMR90细胞以50000个细胞/孔接种在6孔板中。然后，用TU标准化的携带eGFP的慢病毒载体以从5至200的不同M.O.I.转导细胞。5小时后去除转导上清液。在转导后6天，收获细胞并且通过流式细胞术分析eGFP表达。

细胞增殖测定。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT；Sigma)比色染料还原法测量细胞增殖。将IMR90细胞以每孔1.5x10³个细胞的密度接种到96孔板中的包含10% FCS的DMEM中。将细胞培养24小时，随后，使用不同纯化水平的病毒载体，对于每个病毒载体以40和150的M.O.I.转导细胞。转导后5或14天，向每孔中添加20µl在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT；5 mg/ml；Sigma)，并在37℃培养另外2.5小时。然后，弃去培养基并且将深蓝色结晶溶解在各孔中100μl的二甲亚砜(DMSO)中。然后，将各孔均质化，随后使用分光光度平板读数器(GlomaxMultiDetection System，Promega)测量在560nm的光密度(OD)。对于每个测试的病毒载体一式三份重复增殖测定。

LDH细胞毒性测定。LDH细胞毒性测定试剂盒II (PromoKine)用于测量从转导后的细胞释放的LDH酶(乳酸脱氢酶)。将人成纤维细胞以每孔1.5x10³个细胞的密度接种到96孔板中的包含10% FCS的DMEM中，并且然后血清限于2% FCS进行24小时。然后，使用不同纯化水平的病毒载体，对于每个病毒载体以40和150的M.O.I.转导细胞。转导后6天，按照制造商的方案进行LDH测定。LDH细胞毒性测定试剂盒II利用WST试剂(水溶性四唑)用于检测从损伤的细胞释放的LDH。该测定使用酶偶联反应；LDH氧化乳酸以生成NADH，NADH然后与WST反应以生成黄色。然后，用分光光度计(Glomax MultiDetection System, Promegareference)在450nm光密度定量LDH活性。对于每个测试的病毒载体一式三份重复该测定。

用于微阵列分析的空盒载体生产。生产不同纯度的无cDNA的携带空盒的慢病毒载体(rLV-EF1)用于微阵列研究。rLV-EF1载体的批次B和C从相同的粗收获物纯化。在10%胎牛血清(BIOWEST)的存在下完成额外的生产以生成批次B，下文中称为批次B-S。

包皮细胞的培养。人包皮成纤维细胞从美国典型培养物保藏中心(N°CRL-2097)获得并且在补充10%胎牛血清(BIOWEST)、1%青霉素/链霉素(PAA)和2mM谷氨酰胺(PAA)的EMEM(Earl氏最小必需培养基，GIBCO)中培养。在37℃在5% CO₂的存在下保持细胞，并以5000个细胞/cm²每周传代两次。本发明不限于原代细胞，例如人包皮成纤维细胞。

用于转录组分析的包皮细胞的转导。在转导前24小时，将人包皮成纤维细胞以5000个细胞/cm²接种到T25培养瓶中。在Polybrene® (Sigma)的存在下，使用批次B、C和B-S的rLV-EF1载体以M.O.I. 40和150以5mL的终体积转导细胞，一式四份。未转导的对照仅接受4µg/mL Polybrene®。约16小时后，去除转导上清液。在转导后54小时，用胰蛋白酶处理细胞，用1xPBS清洗，离心并且将沉淀保持在-80℃。转导后48小时，获取图像。

RNA提取。根据制造商的说明，使用TRIZol® Plus RNA纯化系统(LifeTechnologies)从细胞沉淀中提取总RNA样品。使用Nanodrop 1000分光光度计(NanodropTechnologies)确定总RNA浓度和纯度。使用Agilent 2100 Bioanalyzer (AgilentTechnologies, USA)检查RNA质量和完整性，并且使其符合Agilent微阵列的要求。

DNA微阵列实验。根据制造商的方案，在Biochips Platform of Genopole，University of Toulouse, INSA, UPS, INP, CNRS & INRA (法国图卢兹)进行微阵列实验。简而言之，添加来自用于质量控制检查的单色RNA Spike-In试剂盒(AgilentTechnologies)的外源RNA的稀释物后，使用Agilent Low Input Quick Amp试剂盒将100ng总RNA转化为cRNA，扩增并进行花菁3-标记。将1650ng花菁3-标记的cRNA在65℃，10rpm下杂交17小时，以杂交到Agilent全人基因组寡核苷酸微阵列4x44K第2版，其包含靶向27958个基因的44000个探针。将杂交的阵列清洗，并在Agilent高分辨率扫描仪G2505C上扫描杂交的阵列，并且使用Feature Extraction 10.10 (Agilent Technologies)分析图像。在基于Feature Extraction QC报告的质量控制后，每个条件下保留3或4个重复。

微阵列数据统计学分析。来自Feature Extraction的原始数据集导入GeneSpring® GX 12软件(Agilent Technologies)并使用第75百分位方法标准化。然后，在导入Feature Extraction数据时，通过归因于GeneSpring®的旗标值(flag value，对于每个探针，下列旗标之一受影响：“检测的”、“未检测的”或“妥协的”)过滤探针。保留检测到的并在至少一个条件下在多于60％的重复中未被妥协的探针(消除未检测到的或妥协的点)。使用强度值向所有样品的中值的基线转化，以用于测线图表示。这意味着，对于每个探针，计算来自所有样品的log加和值的中值，并从每个样品减去该中值。为了鉴定在每种条件和对照条件之间差异表达的探针，进行具有Benjamini-Hochberg多重检验校正的独立的t检验，并且校正的p值< 0.05。对于上调和下调的探针，保留具有≥1.5的倍数变化(FC)绝对值的探针作为差异表达的探针。具有<1.3的倍数变化绝对值的探针被认为是非差异的。

结果

在不同细胞类型上的细胞转导效率。当需要稳定的基因过表达或沉默时，所进行的第一个测定是选择所需感染复数(M.O.I.)以获得最佳的基因调整。并非所有细胞对逆转录病毒或慢病毒载体都表现出相同的容许性(permissivity)。使用增加量的表达GFP的慢病毒载体转导靶细胞，以确定细胞完全转导的条件并鉴定相应的基因表达水平。在图3A和3B中，观察到随着M.O.I.增加，首先转导细胞的数目增加到靶细胞的95-100%，并且其次GFP的表达水平增强。在永生化的细胞系中，在原代细胞中，和在干细胞中观察到此现象。此结果显示用慢病毒载体对所有测试的细胞的基因递送的剂量效应，以及对于一种细胞类型所用的M.O.I.不能转用到另一种细胞类型。每个细胞类型需要特定的M.O.I.。

慢病毒载体滴度定量。通常病毒的滴度，并且特别是基于慢病毒的载体的滴度，依赖于用于滴定的方法和细胞。能够实现从细胞进入到基因整合和基因表达的转导途径的步骤的载体颗粒的定量依赖于载体本身和细胞特征。

关于用于载体滴定的细胞，因为证明了所有细胞类型的容许性是不等价的，重要的是保证靶细胞易于成为容许性的，如图3A和3B中显示。另一点是必须容易地监测转导效率，用于对任何转基因和载体随时间的可靠定量。这里，在每个滴定实验中，在使用根据上述材料和方法的载体的连续稀释物转导HCT116之后，通过FACS (表示为每ml转导单位的数目，TU/ml)和qPCR (表示为每ml整合的基因组的数目，IG/ml)对标准的表达GFP的慢病毒载体以效率单位进行定量。这两个结果给出了用于转导的有效颗粒的相对数量，但取决于PCR本身和用于扩增的靶序列，它们各自的绝对数没有给出相同滴度。这些数据显示在不存在标准化方法的情况下，难以基于功能性滴度精确地比较这些不同的方法，所述标准化方法应当包括具有已知滴度的参考批次和确定的靶细胞类型。

平行地，使用P24 ELISA试剂盒量化总颗粒的测定，以估计总载体颗粒，即使是那些不含有任何基因组RNA和/或不含包膜蛋白的颗粒。两个滴度都是有用的，以确定反映总颗粒的物理颗粒PP与给出真实转导能力的生物滴度之间的比例。这个比例给出了载体纯度和完整性的估计。使用另一比例反映载体完整性或感染性，并且表示为每ng P24 (1ng P24对应10⁷ PP)的IG数。

病毒载体生产方法。根据本发明，使用标准磷酸钙程序，通过向293T细胞的三重转染，生产基于逆转录病毒和慢病毒的载体。在转染后24小时(Sena-esteves等，2004)，使用无血清培养基清洗细胞，并且在24小时后收集病毒上清液并过滤。现有技术的载体通常在包含血清的培养基中生产，并通过超离心或在由不同供应商提供的中心单元上的离心浓缩。在本发明中，取决于表达载体构建体，在图5A中称作批次A的粗批次显示约10⁶ TU/ml的平均滴度。在本文所述浓缩步骤后，滴度达到高达例如10⁷-10⁸ TU/ml。通过这些标准方法生产的这些小规模批次显示几个缺点。首先，由于这些简单方法的受限的容量，难以放大规模。其次，所述方法限于浓缩并且不允许培养基内容物的显著去除。为了避免蛋白和血清成分的存在，根据本发明的方法，在将批次A进行超滤和/或层析以浓缩和纯化载体批次之前，在无血清培养基中收获载体上清液。这是重要的，因为在一些情况下，载体需要以高M.O.I.在体外和体内使用，尤其对于非整合型慢病毒载体(图10A和10B)。

血清对载体滴度的影响。本发明提供了用于在无血清培养基中生产高滴度的病毒上清液的优化的稳健方法。通过使用标准磷酸钙方法，通过在0、5和10% FCS (胎牛血清)中的293T细胞中的瞬时三重转染，生产慢病毒载体rLV-EF1-GFP。EF1α (人延伸因子1α)启动子是普遍存在的强启动子。收获病毒上清液并且将15µg总蛋白加载到SDS-PAGE凝胶上以分析总蛋白含量。结果显示无血清生产的粗上清液包含较低量的蛋白，与血清的缺少直接相关。平行地，确定含血清和无血清的情况下PP和TU之间的比例。证明在所有条件下滴度(TU/mL)和PP/TU比例保持稳定。总之，无血清生产逆转录病毒载体没有降低载体生产效率(图4C)，但是降低了样品的总蛋白含量(图4B和图19)。

细胞感染后载体颗粒的顺序收获。本发明描述了对于转染的生产细胞的诱导毒性的比较，其是否依赖于丁酸钠的诱导(转染后18小时)以及在转染后72小时期间的收获的数目。这些实验显示在任何粗上清液中功能性滴度高于10⁶ TU/ml，并且强调了上清液收获的数目和丁酸钠诱导对所导致的生产细胞毒性的强烈影响。在一方面，申请人注意到，回收的数量和是否用丁酸钠诱导对粗上清液的滴度具有的影响小，对于通过5个步骤收获的无丁酸钠诱导的病毒载体生产，转导单位的生产改进2倍(参见图21，TU/生产)。另一方面，在无丁酸钠诱导且无血清的情况下生产，通过根据载体颗粒半衰期调整的多个步骤收获的粗上清液中释放的总DNA浓度是最低的，相比于用丁酸钠诱导且收获时间固定在转染后64小时和88小时的生产下降7倍。这些结果通过直接对粗上清液进行的LDH细胞毒性测定得到证实，并显示在无丁酸钠诱导且无血清的情况下生产，通过根据载体颗粒半衰期调整的多个步骤收获粗上清液时，转染细胞的裂解是有限的。同时，在粗上清液中的总DNA浓度和细胞毒性水平通过丁酸钠诱导和收获时间固定在转染后64小时和88小时而提高，显示细胞裂解在这些生产条件下增强。当仅通过在细胞洗涤后40小时和64小时的两个步骤收获无丁酸钠诱导的粗上清液时，所诱导的毒性达到82％和48％，但使用中间收获时，对转染细胞的毒性不超过30％，对于前三次收获的平均值为13.3%，并且对于最后一次收获为16.4％ (图21)。因此，通过以规律间隔的多个(包括在3个和6个之间)步骤实现的粗上清液的回收，是获得所请求保护的纯化的基于RNA的病毒载体组合物的起始点。在转染后的特定时间进行不同收获，所述特定时间与载体颗粒在37℃的半衰期相关，所述半衰期是约8小时，取决于生产细胞类型和细胞培养基(Le Doux等，1999)。通过与载体半衰期相关的多个步骤的收获，无丁酸钠诱导且无血清，是生产粗上清液，即根据本发明的批次A的最佳条件。这些结果强调初始粗上清液组合物在很大程度上受到生产方法本身的影响，并且这个起始组合物在毒性方面对转染的靶细胞具有很大影响。

载体浓缩和纯化。根据本发明的方法包括两种类型的浓缩和/或纯化批次(C和D)，与无血清生产方法相关(对应批次A的获得)。这些方法与基于超速离心法或在中心单元上的离心法的标准和常用浓缩方法(对应于批次B的获得)进行比较。不同批次对应不同的纯化策略，从没有纯化到基于超滤和层析的几个纯化步骤。四种纯化方法在污染物去除方面具有递增的品质(图6和7)。

对应于获得批次A的方法A：此类批次不包括任何纯化步骤并且对应澄清后的收获物。此类批次通常展示一种或多种下列特征：(i)约10⁶ TU/ml的平均最终滴度，取决于表达质粒构建体(图19)；高达650ng/ml的平均最终DNA污染物浓度；(iii)高达200µg/ml的平均最终蛋白污染物浓度；和(iv)包含500和900之间或更低的平均最终PP/TU比例(图19和20)。

当所需的工作M.O.I.可以较低时，使用此方法生产的病毒载体适合用于转导一些容许性的永生化的细胞系。在对其它批次的污染物去除表征研究中，将这个批次用作参照(即，这个批次的污染物代表100%的生产方法杂质)(图19和图6)。所有下列数据与此参照粗批次相关。因为无血清和丁酸钠诱导，以及基于病毒颗粒特异性的半衰期选择的不同收获时间，批次A是优化的批次。

对应于获得批次B的方法B：此方法对应于已经经过浓缩步骤的澄清后收获物(无血清培养基)，所述浓缩通过使用即用型离心单元的超滤进行。此浓缩的批次以与如图4A中相同但无血清的方法产生。此类批次通常展示一种或多种下列特征：(i)最终载体滴度在1x10⁷-1x10⁸ TU/ml之间；(ii)相比批次A，根据本发明的有效载体的方法回收率在约47%；(iii)相比批次A的浓缩系数为95 (图20)；(iv)相比批次A，DNA去除为约71%的初始污染物；(v)相比批次A，蛋白去除为约56%的初始污染物(图6)；和(vi)在约500或更多的平均最终PP/TU (图8)。此比例比从粗批次获得的那些增加，表明这些浓缩方法在方法本身期间破坏了病毒颗粒，即使无血清也是如此。此现象在血清的存在下被放大。

相比先前发表的使用包含血清的粗批次的基于病毒的载体，有利地生产这种产品。其显示与在文献中描述的使用超离心(图5B)的产品相同的特征。该方法的优点是当转导细胞所需要滴度比通过方法A所提供的滴度更高时，浓缩逆转录病毒载体颗粒。此方法基于使用基于即用型离心单元的超滤技术的粗收获的浓缩或基于超离心。在粗上清液中无血清生产的两种产品在加载到SDS-PAGE凝胶上后均展示相同的蛋白概况(图5B)。使用例如胎牛血清(FCS)，用这些技术浓缩的载体的蛋白概况显示于图4B，并且揭示了拖尾的条带，其中特定的病毒蛋白无法通过其大小或通过其低强度区分。此结果促使本发明人使用此方法B，对无血清生产的载体批次进行浓缩，以能够比较下游浓缩和纯化方法对独立于血清的存在的载体颗粒本身的结果。

对于在中心单元上的离心，操作模式是通过通常的流过滤，使用利用离心力用于压力设置。因此，该技术不允许压力监测，所述压力检测是对于载体完整性和生存力的关键点。此技术中使用的膜的类型相比其它膜的类型增加非特异性吸附。因此，不仅载体，而且杂质也被浓缩。事实上，达到了低纯化水平(对于DNA和蛋白分别在1和3之间，以及1和2之间)(参见图9作为实例)。平行地，此方法对于生物活性的逆转录病毒载体非常有破坏性，如通过从方法A (在图8的实验中在200和350之间)到方法B (在图8的实验中，至多达650)增加的PP/TU比例所示。尽管PP/TU比例的如此增加，但这些基于超离心或在中心单元上的超滤的现有技术方法在文献中大量使用。当所需的工作M.O.I.需要是高M.O.I.时，此方法B适于转导永生化的细胞系，但不适于转导脆弱的和原代细胞或干细胞，所述细胞可以进行具有功能性表型需要的分化或重编程过程。

在这里认为，在缺少基于离子强度、pH和压力的受控操作条件下进行超滤不会允许有效的分离，即使对于大小差别少一个数量级的蛋白质也是如此。此最后一点是关键的，并且强调由于慢病毒载体的巨大尺寸(120nm)，理想的超滤步骤将不仅浓缩载体颗粒，还通过去除污染物(例如宿主细胞蛋白和DNA)而将其纯化。因此，已开发了下列称为C的方法以提高批次A的滴度，同时保持批次的质量和纯度。

对应于获得批次C的方法C：此方法对应已经经过浓缩和渗滤步骤的澄清后收获物(无血清培养基)，所述浓缩和渗滤通过使用中空纤维的超滤进行。此类批次通常展示一种或多种下列特征：(i) 最终滴度在1x10⁷-1x10⁸ TU/ml之间；(ii) 相比批次A，根据本发明的有效载体的方法回收率在约69%；(iii) 浓缩系数为约25，且但通常在20到40之间(图20和图21)；(iv)相比批次A，DNA去除为约82%的初始污染物(从70%到90%)；(v)相比批次A，蛋白去除高达98%的初始污染物(图9)；和(vi)在200和600之间的平均最终PP/TU比例(图8)。

在此，比例PP/TU在批次A和C之间保持稳定，显示获得批次C的方法没有如同其对于来自方法B的批次(对应所获得的批次B)所做的那样破坏病毒颗粒(图8)。

该方法的优点是将来自澄清的粗收获的逆转录病毒载体颗粒的浓缩和纯化组合。与用于批次B的浓缩技术相比，该技术对逆转录病毒载体的破坏较少。在获得批次C的方法中使用的超滤技术与用于获得批次B的技术非常不同。事实上，在获得批次C的方法中使用的方法基于使用中空纤维使用超滤技术对粗收获的浓缩。此技术的操作模式通过切向流过滤，使用泵压用于压力设置。根据本领域技术人员的教导，该技术允许监测和调整压力用于维持载体完整性和生存力。例如，在所有的过程中，入口流载体上清液必须维持在低水平，并且跨膜压力必须低和完全稳定。相比用于获得批次B的方法，此技术中使用的膜的类型不增加非特异性吸附。因此，这种更温和的方法允许与高杂质去除相关的高载体回收率。此外，使用此技术获得的低剪切力允许PP/TU比例从对于澄清的粗收获物(批次A)获得的PP/TU比例降低到约300或低于(参见，例如图8)。这种破坏性较小的技术允许强力去除大部分杂质(相比批次A，分别为初始DNA和蛋白污染物的82%和98%)，并且允许提高纯化水平，相比批次B对于DNA和蛋白分别从1.7增加到4，和从1.1增加到32 (图9)。因此，在回收率、杂质去除和有益浓缩系数(20)之间的良好妥协，使得通过此方法生产的逆转录病毒载体成为转导精致的细胞(如原代细胞或干细胞)的良好工具，即使当需要高工作M.O.I.时也是如此。

对应于获得批次D的方法D：此获得批次D的方法包括用于获得通过浓缩步骤增强的批次C的方法的步骤，然后任选地通过使用即用型离心单元的超滤、benzonase处理和基于层析的纯化进行富集。此类批次通常展示一种或多种下列特征：(i)最终滴度在1x10⁷-1x10⁸ TU/ml之间；(ii)相比批次A，(根据本发明的纯化的病毒DNA载体)方法回收率在约12%；(iii) 浓缩系数为约7 (5至10之间) (图20)；(iv)相比批次A，DNA去除为约98.8%的初始污染物(从80-99%)；(v)相比批次A，蛋白去除为约99.9%的初始污染物(从80-99%)(图6)；和(vi)平均最终PP/TU比例在100和400之间(图8)。

该方法D的优点是达到对于体内注射的要求，具有至少90%和至多达99.9%的初始污染物的蛋白去除，以及至少90%和至多达99.9% 98.7%的初始污染物的DNA去除(图6)。IEX(离子交换)层析步骤允许生物活性和非活性颗粒的分离，以达到迄今所述的少于300的最低PP/TU比例(参见，例如图8)。此高纯化导向的方法允许将蛋白的纯化水平从20-40提高到120-160 (参见例如图9)。此方法显示本文所述所有方法的最高比活性，意味着使用此纯化方法，杂质的去除是最有效的(参见，例如图7)。根据方法D生产的逆转录病毒载体从而适用于体内注射到哺乳动物或动物中。

使用即用型单元的额外的浓缩(如方法B中所用)可以添加到方法C和D的末端，以增加最终滴度。但是，这种额外的浓缩步骤可以导致PP/TU比例的增加，因为即用型离心单元对于载体是破坏性的，这是由于因所述单元的化学性质而导致的对支持物的非特异性吸附。

如本文所述，已经根据用于获得批次A至D的方法生产了逆转录病毒载体。已对批次制品进行了比较，以评价转导对细胞毒性、生存力和增殖的后果。如果逆转录病毒载体将用于永生化细胞系的转导或用于动物体内注射，这样的比较是重要的(图20和图6-9)。

用显示不同的浓度和纯度水平的载体的细胞转导。即使慢病毒载体是递送基因或shRNA进入动物或哺乳动物细胞的最有效的手段，有几个问题仍然是使用这样的载体的障碍，包括基因递送的再现性、细胞生存力或毒性、剂量效应监测或在永生化细胞、原代细胞和干细胞中获得的结果之间的同质性。事实上，如在图3中所述，基因转移效率需要特定的开发，以确定关于实验目标和靶细胞适用的M.O.I.。一些细胞(U937，原代淋巴细胞，造血干细胞，THP1)比需要其它细胞(293T，DA0Y，HCT116)更高的M.O.I.。很常见地，原代细胞比永生化细胞的容许性低，但是一些建成的细胞如THP1、Jurkat或U937的确需要高于50的M.O.I.。由于慢病毒载体的诱导的毒性，这些M.O.I.被视为难以应用(Yamada等，2003)。用非整合型慢病毒载体(NILV)的转导强调了此问题，这是由于它们需要高M.O.I.以有效转导靶细胞的事实，如图10所示。事实上，NILV载体需要40的M.O.I.以转导63%的靶细胞，而ILV以10的M.O.I.转导100%的靶细胞。此外，用NILV，必须使用150的M.O.I.以达到相比于在M.O.I. 5的ILV相同水平的表达。人或动物造血干细胞的有效转导也需要高M.O.I.以将它们重新植入人或动物，用于基因治疗或动物模型开发。原代细胞也需要在高M.O.I.转导，从而在适宜的水平表达靶基因以逆转表型或疾病。本发明的目的是发现在靶细胞中的表达水平和所获得的细胞生存力之间的最佳平衡。如本文所证明，降低浓缩的载体上清液中的蛋白和DNA含量是保护细胞抵抗细胞阻滞和死亡的方式。这对于用ILV和NILV向iPS的细胞重编程也是重要的考虑，以避免重编程过程中污染物的干扰。

本发明提供了对这些问题的解决方案，并带来了关于此明显毒性的补充信息。已使用或不使用额外纯化步骤生产了具有不同浓缩级别的慢病毒载体。已根据所使用的不同方法实现了载体浓缩，所述方法基于通常使用的技术(如图4A中阐释，基于超离心或使用中心单元的离心)或切向流过滤(如图5A中的阐释)。超离心或在中心单元中的离心浓缩了慢病毒载体，并且还浓缩了来自于产生病毒的细胞的培养基的细胞碎片、膜片段和蛋白。下面所述数据显示浓缩的批次B和C均导致相同的转导效率并且诱导非常不同的细胞表型后果。

粗载体组合物。在对293T细胞进行三重-转染以在没有血清的情况下生产重组逆转录病毒或慢病毒载体时，这些细胞停止生长并可以在上清液中分泌胁迫蛋白和毒性成分。图11显示产生病毒的细胞在三重-转染后展示高LDH生产率。此结果强调，在载体生产期间，在培养基中存在由生产细胞分泌的毒性蛋白。当用于转导靶细胞时，尤其在精致的原代细胞中，在粗制备物中和在浓缩的批次中的这种不希望的材料可诱导细胞扰动，并且可以在体内施用后导致在实验动物模型中的免疫原性反应。如图21所示，此粗载体组合物清楚地受到转染后载体收获的数目和时间的影响。在24小时的间隔收获载体上清液而不考虑载体半衰期时，载体收获物的LDH效应增大。当例如，如图21所述，以12-16小时的间隔重复4次收获时，LDH效应低于30%，但当载体收获以24小时的间隔重复时，分别达到80%和48%。因此，通过多个收集步骤(包括3-6次收集之间)以特定间隔进行的粗上清液的回收，提供了用于获得纯化的基于RNA的病毒载体组合物(即回收的粗上清液)的方法。选择在转染后特定时间的多个收集步骤，这取决于载体颗粒在37℃的半衰期，其是约8小时，取决于生产细胞类型和细胞培养基(Le Doux等，1999)。因此，除了在载体生产过程中无血清之外，该基于在载体生产过程的收获的时间和次数的第二参数允许生产高质量的粗起始材料，其最大限度地减少蛋白浓缩和细胞毒性。在此，证明图5A中总结的步骤的组合能够减少靶细胞中的不期望的效果。此方法包括无血清培养基、顺序收获和超滤。

纯度对细胞转导效率的影响。研究了在转导后几天，对原代细胞、包皮细胞(ATCC-CRL-2097)的载体转导效果。生产了上面描述的称为批次A、B、C和D的四个批次，并且用于以分别为40和150的中等和高M.O.I.转导靶细胞，以评价载体本身和载体环境的渐变效果。首先，检查细胞以确定是否它们可以表达报告基因GFP并且将在转导后5和11天的使用不同批次的GFP表达的结果分别展示在图12A和12B中。这些数据显示，使用所有批次的所有转导的细胞均以高水平表达GFP报告基因。然后，GFP表达水平看起来独立于纯化级别。一旦载体进入活的靶细胞，转导途径不受限制并且转基因表达是有效的。平行地，这些图片显示在所有孔中的细胞数目非常不同，即使在转导前两天铺板相同数目的细胞。

纯度对细胞增殖和生存力的影响。在转导后6和11天，观察使用所有载体类型转导的细胞。在每种情况下，以M.O.I. 40和150对包皮细胞进行相同的实验，以评价所获得的细胞质量。如图13中所示，可见载体纯度对细胞生存力的影响，因为用批次B转导的细胞的数目表示仅6%的在相同条件下用批次C转导的细胞的数目。这一结果通过使用比色MTT测定而得到证实，所述比色MTT测定评估转导后靶细胞的生存力和增殖率。图14A显示使用批次B的细胞转导诱导了与所用M.O.I.成正比的生长迟缓。在M.O.I. 40和150分别观察到40%和70%的生长阻滞。此生长阻滞可以解释之前观察的用批次B转导后细胞的低数量。事实上，在转导后细胞培养11天后包括一次传代，结果显示细胞的数目很大程度上受到在M.O.I. 40和150的批次B的影响，但在M.O.I. 40，当用批次C或D转导细胞时，细胞数量是稳定的。在更高的M.O.I.，细胞数量受到的影响程度小于用B批次的情况。在批次C和D之间没有观察到显著的差异，表明对于体外实验，在超滤后达到的纯化水平足以包含细胞免于细胞生长阻滞。在图14B和14C中，测定了使用批次A、B、C和D转导的细胞的增殖率，并且证实批次C保护细胞免于先前观察到的生长阻滞。用批次B-S的细胞转导显示与在使用批次B转导细胞时获得的相比，放大的细胞停滞，强调无血清和超滤的组合是关键的。

纯度对细胞转录组的影响。为了根据纯度水平并且独立于任何转基因评价载体转导效果，使用rLV-EF1 (无cDNA)批次B和C以M.O.I. 40和150转导包皮成纤维细胞，所述批次B和C衍生自相同的粗收获物，并且其特征总结在图15B中。如图15A所示，在转导后观察细胞48小时。相比未转导的细胞，以M.O.I. 40用批次B转导的细胞可见轻微的生长迟缓，但以相同M.O.I.的批次C转导后没有明显的生长差异。在M.O.I. 150，相比未转导的细胞，使用批次B可见强的增殖停滞，而使用批次C仅观察到可观察的中度生长迟缓。为了探讨在转录水平的基本变化，在转导后54小时收集这些细胞。提取RNA并用于进行允许几乎所有人转录物的定量的Agilent全人基因组微阵列。将来自用rLV-EF1批次B和C以M.O.I. 40和150转导细胞的RNA水平与来自未转导细胞的RNA进行比较。统计学分析后，对于每次比较，保留上调或下调1.5倍或更多的探针。通过使这些数据交叉，可对于每个M.O.I.鉴定出批次B相对未转导细胞的差异表达的一组基因，所述基因对于批次C相对未转导的细胞未被影响。这两组基因在散点图和轮廓图上表示，对于M.O.I. 150在图16A和B中，且对于M.O.I. 40在图16C和D中。如所证明的，在批次B转导细胞中相对未转导细胞的所选基因的转录水平变化在M.O.I. 150比在M.O.I. 40 (其中变化是轻微的)更明显。这些数据显示，当使用不同纯度水平的载体时，对转导细胞的转录组的不同影响。

血清对细胞转录组的影响。为了评价在有血清生产后载体培养基组合物的影响在10%血清的存在下生产rLV-EF1载体(无cDNA)，并且使用方法B浓缩，获得批次B-S，其特征总结在图17B中。使用这个批次以M.O.I. 40和M.O.I. 150转导包皮细胞。如图17A所示，在转导后观察细胞48小时。批次B-S转导后，相比未转导细胞，可见生长阻滞。此生长阻滞在更高的M.O.I.相比M.O.I. 40更强。显著地，在批次B-S转导后可以观察到聚集体，并且其体积随M.O.I.增加。这些细胞在转导后54小时收集用于RNA提取和微阵列杂交。令人惊讶地，注意到，在胰蛋白酶处理过程中，用批次B-S转导的细胞比用批次B或C转导的细胞或未转导细胞更难以剥离。使用Agilent全人基因组微阵列对来自用批次B-S以中等或更高M.O.I.转导的细胞的RNA水平与来自未转导细胞的RNA进行比较。统计学分析后，对于每次比较，保留上调或下调1.5倍或更多的探针。为了鉴定与使用血清生产的载体相关的探针，本发明人选择了使用批次B-S(以M.O.I. 40和150)相对未转导的条件差异表达，且使用批次B和C (以M.O.I. 40和150)未被影响的探针。相应组的基因显示在如图18中所示的测线图中。这些数据证实了使用有血清生产的批次的转导的存在对转导细胞的转录组的影响对转导细胞的转录组的影响。

纯度对细胞转录组的影响。为了根据纯度水平并且独立于任何转基因评价载体转导效果，使用无cDNA的病毒载体(rLV-EF1)批次B和C以M.O.I. 40和150转导包皮成纤维细胞，所述批次B和C衍生自相同粗收获物。如图15A所示，在转导后观察细胞48小时。以M.O.I.40用批次B可见轻微的生长迟缓，但以相同M.O.I.使用批次C没有生长差异。在M.O.I. 150，用批次B可见强的增殖停滞，而本发明人对批次C仅观察到中度生长迟缓。为了探讨在转录水平的基本变化，在转导后54小时收集这些细胞。提取RNA并用于进行允许几乎所有人转录物的定量的Agilent全人基因组微阵列。将来自用无cDNA的病毒载体(rLV-EF1)批次B和C以M.O.I. 150转导细胞的RNA水平与来自非转导细胞的RNA进行比较。统计学分析后，对于每次比较，保留上调或下调1.5倍或更多的探针。如图16A-16D(散点图M.O.I.40和M.O.I.150)，通过使这些数据交叉，对于每个M.O.I.可以鉴定用批次B一组差异表达的基因，所述基因对于用批次C未被影响。

目前，复杂大分子结构如病毒和载体的下游处理是本领域中的主要挑战之一，特别是当对抗性细胞或使用非整合型慢病毒载体需要高M.O.I.时。在这些情况下，对于给定数量的靶细胞，达到高M.O.I.只有两种可能：提高添加到靶细胞的粗上清液的体积，如果可能的话；或者将所述载体上清液浓缩。很多时候，科学家避免使用高M.O.I.，因为他们担心整合到靶基因组DNA中的载体拷贝数太多。取决于靶细胞，生产细胞提供的污染物的作用其实不是可预测的。通常，相比存在于包含载体的培养基中的污染物，使用者更多地将所观察到的毒性归于载体本身。

研究了获得高质量逆转录病毒和慢病毒载体的步骤组合的应用性。对合适的操作条件进行了初步测试和优化，以载体回收和，以及，在对靶细胞的作用方面的产品品质作为目标。如图11所示，无血清载体生产显示相同水平的粗生产而不破坏滴度，但导致生产细胞中的一些毒性。超滤也验证为用于逆转录病毒上清液的浓缩和部分纯化的良好的方法。如所示，不仅对于粗载体上清液浓缩，而且对于在超滤或阴离子交换层析步骤之后的纯化载体的浓缩，在中心单元上的超滤或超离心都是无效的方法。事实上，为了增加载体滴度，将批次C和D进行在中心单元上的离心并且观察到PP/TU的比例增加，显示其可能由于载体对膜的非特异性吸附而影响逆转录病毒感染性。此处选择的和描述为方法C的超滤方法是基于使用中空纤维使用超滤技术对粗收获物的浓缩。此技术的操作模式通过切向流过滤，使用泵压用于压力设置。该技术允许监测和控制压力，这是对于维持载体完整性和生存力的重点。相比对于批次B使用的膜，此技术中使用的膜的类型不增加非特异性吸附。出人意料的是，确定了工作压力、温度和流速是成功的超滤方法的关键点。在本发明的一个实施方案中，所述流速包括在400和600ml/min之间并且TMP (跨膜压力)在6和9psi之间。

因此，用于转导靶细胞的慢病毒载体的浓缩和纯化包括规模放大和安全性之外的关键参数：细胞转导后的生存力和细胞状态。载体上清液必须被认为是载体本身和细胞污染物例如宿主细胞蛋白和DNA (其可以诱导对靶细胞的破坏作用)的混合。本文包括的是限定能够转导靶细胞而不影响细胞生存力和增殖的载体的其它参数：

(i) 对于粗批次，在300和900之间的平均PP/TU比例。此比例在浓缩步骤过程中的增加是对载体破坏的指标，并且预示存在可以干扰转导和靶细胞生存力的载体碎片；

(ii) 相比批次A，在浓缩后，DNA去除为约82%的初始污染物，并且总是在70%和99%之间；和

(iii) 相比在无血清培养基中生产的批次A，在浓缩后，蛋白去除多达90%的初始污染物。

基于血清在生产细胞的培养基中的使用(其诱导不同于方法A的产品组成)，鉴定为显示临床应用所需特征的载体的产品(Merten等，2010)不同于产品A、C和D。事实上，蛋白组成和比例PP/TU在它们的条件下在浓缩前分别比在批次A中高25和5倍。两个参数均对下游浓缩/纯化方法具有影响，因为在它们的条件下，在浓缩后，最终蛋白浓度比在本发明的批次C和D中高150倍。其它专用于临床基因治疗试验的批次的分析在文献中已经描述，但是没有在PP/TU和污染物含量及其在生存力和增殖方面对靶细胞的影响之间建立联系。

批次C和D的产品能够在100％的转导细胞中达到高表达效率，并在中等M.O.I.具有低于30％的毒性，且在高M.O.I.具有低于40％的毒性，但在相同的培养条件下，产品B导致比批次C低2倍的细胞增殖。(图13和14)。用批次A对细胞增殖获得的结果相比用批次B获得的那些结果是等效的，可能由于用粗批次达到这些M.O.I.需要的体积大。

蛋白和DNA去除在本文中分别通过DNA和蛋白比活性表示，其理想地高于10⁷ TU/µg DNA和10⁹ TU/mg蛋白，以防止靶细胞生存力或增殖的丧失。因此，应当关注宿主细胞蛋白去除。例如，对应批次B的获得的方法B允许仅56%的宿主蛋白的去除，而方法C去除98%的初始蛋白。因此，即使宿主细胞蛋白似乎经过所有的膜，但可由于在膜上的非特异性吸附和随后的膜结垢而导致差的蛋白去除。然后，在具有载体的回收级分中发现这些污染蛋白。

本文所述结果可以解释科学家不愿使用高M.O.I.和通常的载体批次B，由于经常观察到细胞毒性，尤其当使用原代或干细胞时。但是，有时低或中等M.O.I.不足以导致高水平的转导效率，如在图3A和3B中对造血干细胞所证实的。转导途径的早期步骤可在一些靶细胞受到限制，导致低整合的载体拷贝数并且从而需要高M.O.I.和调整的批次C或D。

此毒性在细胞转导后消除了靶细胞亚群或抑制细胞分化。本发明显示使用浓缩的并且纯化的载体可以绕开这些关键缺点。显然，超速离心和在即用型单元上的离心(批次B)是不适宜的，因为它们诱导对靶细胞的破坏作用。使用基于超滤的方法(批次C)需要初步的技术开发，但是允许适用于细胞完整性和增殖的高质量批次。并且，此技术容易升级以用于大规模生产。如本文所证明，来自培养基的污染物的确对原代精致的细胞产生影响。当批次C载体用在功能性测定中用于基因靶验证或用于药物筛选时，对于永生化细胞系也可以考虑此方面。在生理或代谢方面，所选择的对浓缩的但没有充分纯化的载体批次具有抗性的转导细胞不代表正常细胞群体。另一个真正产生的问题在于，在遗传修饰的永生化细胞和原代模型中观察到的缺乏基因功能或药物作用的重现性，即使是在使用相同的慢病毒工具进行转导时也是如此。

因此，本发明的产品通过以转导单位表示的载体和物理颗粒之间的比例和培养基组成的重要性得到验证，其限制了对原代和干细胞增殖和生存力的影响，或对这些细胞的代谢的影响，从而允许基因功能和细胞分化的可重现的研究。

根据本发明的结果显示了载体及其培养基在用于基因治疗、体外和体内基因靶验证、药物筛选或治疗性诊断(theragnostic)的靶细胞中，以及在考虑细胞完整性以研究基因或分子效应或其组合的各个领域中的关键作用。

Claims (16)

1.纯化的基于RNA的病毒载体组合物，相比如存在于无血清细胞培养基中的基于粗RNA的病毒载体的组合物，其包含小于2％的初始蛋白污染物和小于70%至多达90%，优选小于30%的初始DNA污染物，所述组合物能够转导真核细胞而不影响细胞生存力。

2.权利要求1的基于RNA的病毒载体组合物，其中所述基于粗RNA的病毒载体是其中物理颗粒/转导单位(PP/TU)包括在100：1至多达900：1之间，优选100：1至多达600：1之间，更优选100：1至多达400：1之间的病毒载体。

3.权利要求1或2的基于RNA的病毒载体，其中所述病毒载体对细胞增殖、生存力和/或细胞的能力，例如干细胞分化或例如原代细胞重编程为多能细胞的能力，具有很少至没有影响。

4.包含在细菌宿主中的病毒DNA构建体，所述细菌宿主以保藏号CNCM I-4487或CNCMI-4488或CNCM I-4489保藏在CNCM保藏中心。

5.权利要求1至3中任一项的基于RNA的病毒载体的用途，其用于转导真核靶细胞以将目的核酸(转基因)转移到所述细胞中。

6.用于制备修饰的真核细胞的方法，其中通过根据权利要求1-3中任一项的纯化的基于RNA的病毒载体组合物转导所述细胞而不影响它们的生存力。

7.用于生产基于RNA的逆转录病毒颗粒的方法，其包括：

(i) 转染生产细胞，所述细胞经过修饰以补充在病毒载体所基于的RNA病毒基因组中的缺失，并且在合适的条件下培养所述生产细胞，以允许病毒载体颗粒的生产，其中所述转染后的培养在无血清培养基中进行；

(ii) 收集包含所述基于RNA的病毒载体颗粒的上清液。

8.权利要求7的方法，其不包括丁酸钠诱导的步骤。

9.权利要求7或8的方法，其中所述上清液收集通过以特定时间间隔的包括在3个和6个之间的多个步骤进行。

10.权利要求7-9中任一项的方法，其中在所述上清液收集之后，通过离心澄清。

11.权利要求7-10中任一项的方法，其进一步包括切向超滤和渗滤的步骤，所述超滤优选在聚砜中空纤维滤芯上操作。

12.权利要求7-11中任一项的方法，其进一步包括离子交换层析的步骤。

13.可通过根据权利要求7-12中任一项的方法获得的纯化的基于RNA的病毒载体组合物。

14.权利要求13的基于RNA的病毒载体组合物，其中去除的DNA污染物占70至99％之间，优选多达71%的存在于初始无血清培养基的这种污染物，并且去除的细胞蛋白污染物占50至99.9％之间，优选多达56%的包含在初始无血清培养基中的细胞蛋白，并且其中所述PP/TU比例包括100：1至900：1之间，优选100：1和600：1之间。

15.制备遗传修饰的真核细胞的方法，其包括使真核细胞接触权利要求1-3，13或14中任一项的基于RNA的病毒载体组合物。

16.修饰的真核细胞，其中所述细胞通过根据权利要求1-3，13或14中任一项的基于纯化的RNA的病毒载体组合物转导而不影响其生存力。

Images