CN101790381B - 生产病毒疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制造含有病毒抗原的制品的方法，其包括a)在液体中用传染性的病毒接种细胞，b)所述病毒在所述细胞中增殖，c)收集所述增殖的病毒，d)灭活所述收集的病毒，以及e)用去污剂处理所述灭活的病毒，得到含有病毒抗原的制品。

Description

生产病毒疫苗的方法
技术领域
本发明涉及生产病毒疫苗的方法。
背景技术
疫苗是抗原物质的免疫原成分，例如(非传染性的)病原体如病毒、它的包膜、颗粒以及它的蛋白抗原。给药或免疫会导致受试者例如哺乳动物如人或鸟的免疫。免疫可能引起对疫苗的特定的反应和一些轻微的炎症，但是比完全活性病毒的感染的危害性要小得多，免疫正是被设计成防止此病毒的。受试者的免疫系统将调整自身以便特异性地识别疫苗的抗原，并在受试者进一步与病原体接触后很快灭活该病原体。这样通过免疫取得对抗病原体的提高的抵抗力。
为了疫苗的目的，病毒通常在合适的细胞培养基上或一般的细胞培养基上培养。在流感的情况中，通常使用含胚的鸡蛋。传染性病毒收获物被收集并被纯化，以便去除不想要的非病毒细胞成分。尤其是，在来源于鸡培养基的疫苗的情况中，对鸡/蛋的蛋白质的过敏反应在某些易感染的个体上是可能的。
病毒疫苗生产的一个基本步骤是传染性病毒的灭活。福尔马林(甲醛水溶液)在疫苗的生产中是最常使用的灭活剂。它通常作为浓度大约是37％甲醛的饱和水溶液使用。福尔马林通过将表面蛋白的伯氨基团与蛋白质或DNA上邻近的氮原子通过-CH2-键不可逆交联来灭活病毒。尤其是这些交联能引起与非病毒物质的连接，因此在活的传染性病毒上进行一些预先纯化是必需的，因为纯化前的灭活会引起病毒蛋白与杂质之间大量的不可逆的化学联接，这对于纯化操作的有效性和产品的质量是有害的。基于这个原因，在现有技术中，活的传染性病毒最初至少被部分纯化，例如通过区带超速离心，然后灭活(美国专利6,048,537)。福尔马林的灭活步骤用已建立的分析程序验证。
与福尔马林处理相补充，紫外线灭活已经被考虑并入生产过程。紫外线照射灭活用于人类疫苗以前已被证实用于非包膜和包膜的病毒(美国专利2006/0270017)。因为病毒的基因组比病毒的表面抗原更易受到紫外线的伤害，所以显示紫外线灭活对产品的生化特性或免疫性几乎没有负面影响。紫外线灭活的目标主要是核酸，相反福尔马林的目标是蛋白。
当灭活特别是反弹性的病毒家族时，科学家通过将福尔马林与紫外线灭活相结合，设法克服单独紫外线灭活或福尔马林灭活各自的局限性。
可选地，许多生产商使用以去污剂为基础的处理步骤来同时灭活活的病毒并修饰病毒。这些基于去污剂的处理破坏了流感病毒的脂质包膜，产生了裂解(部分破坏)或亚单位(完全破坏)的疫苗抗原。去污剂处理大多能减少病毒抗原的反应性，因此减少疫苗过程中不想要的副作用。去污剂处理的病毒可以进一步被灭活，例如福尔马林处理。可以在美国专利6,048,573、美国专利4,522,809和WO 02/09702中发现这些方法的例子。此方法中的缺点是病毒要在破坏步骤之前经过不同的纯化步骤，因此生产者要在几个步骤上处理活的传染性的病毒。这尤其是需要注意的，当生产对抗尤其是致命型的流感如H5N1的疫苗时。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产病毒疫苗的方法，其具有减少的需要处理传染性物质的步骤数，同时生产出反应性减小的病毒抗原。
因此本发明提供一种制造含有病毒抗原的制品的方法，其包括
a)在液体中用传染性的病毒接种细胞，
b)所述病毒在所述细胞中增殖，
c)在细胞培养物的上清液中收集所述增殖的病毒，
d)灭活所述收集的病毒，以及
e)用去污剂处理所述灭活的病毒，得到含有病毒抗原的制品。
第二个方面，提供了一种制造含有病毒抗原的制品的方法，其包括
a)收获包含传染性病毒的液体，
b)完全地灭活所述收集的病毒，
c)用去污剂处理所述灭活的病毒，以及
d)纯化所述灭活的病毒，得到含有病毒抗原的制品。
本发明的其他方面提供了由根据本发明的方法制造出来的病毒抗原制备而来的疫苗制品。
本发明的另一方面提供了提高受试者对抗病毒感染耐受性的方法，包括制造含有病毒抗原的制品和将所述制品给药于受试者。
附图说明
图1a显示在增殖后从病毒收集到灭活收获物的发明步骤的流程图。
图1b显示从灭活收获物到单价批量制品的发明步骤的后续流程图。
具体实施方式
提供了一种制造含有病毒抗原的制品的方法，其包括
a)在液体中用传染性的病毒接种细胞，
b)所述病毒在所述细胞中增殖，
c)在细胞培养物的上清液中收集所述增殖的病毒，
d)完全地灭活所述收集的病毒，以及
e)用去污剂处理所述灭活的病毒，得到含有病毒抗原的制品。这个步骤的重点是有可能减少在活性病毒上操作的步骤数，因此病毒在最初收获的收集后、在去污剂处理和/或任选的纯化步骤前是灭活的。
根据本发明的“病毒抗原”是病毒或病毒的一部分，可以引起受试者抗所述抗原的免疫应答。不需要在完全免疫受试者方面取得绝对的成功，但是在一定意义上应理解，增加对抗所述病毒的免疫防御或免疫应答可以减少在进一步的接触后与所述病毒相关的发病几率。这种病毒抗原可以是，例如完整的灭活病毒、裂解的病毒、修饰过的病毒、病毒蛋白尤其是表面蛋白比如血球凝集素或神经氨酸酶。“疫苗”是一种给药形式的所述疫苗抗原制品，例如用于注射、鼻腔黏膜、经皮给药。根据本发明，“纯化”涉及去除收获液体中非病毒成分的步骤。收集步骤后得到的收获液体优选澄清的上清液，其中固体的或大的杂质例如残留的完整细胞或在病毒增殖过程中裂解的受感染细胞的细胞碎片通过沉淀法例如离心法去除。因此“收集”指的是在液体中尤其是在清澈的液体中产生完整的传染性病毒的任何步骤。除了去除细胞碎片外，收集步骤还包括去除细胞生长培养基的其他固体组分的步骤，例如培养细胞的任何种类的培养基。增殖的完整病毒被释放到所述的细胞培养上清液中，从上清液中可以收集病毒。因此，在本发明的一个特定的实施方式中，收集增殖病毒的步骤包括在感染后将病毒从细胞和/或所述细胞的细胞碎片中分离出来。这种分离例如可以通过以大约2000g到3000g、直到5000g、10000g、15000g或20000g低速离心来促进分离，从液体中将可以看得见的颗粒分离出来。可选地，分离可以通过过滤来进行。在特定的优选实施方式中，比如通过选择用于病毒增殖的细胞如哺乳动物、鸟类或昆虫细胞培养，而不是胚胎卵细胞，所述的液体基本上没有尿囊素、胶原蛋白和/或白蛋白例如卵清蛋白。在本发明的特定的实施方式中，非洲绿猴肾细胞株系(VERO)细胞被用于病毒的增殖。
在收集步骤后，通过任何已知的用于病毒灭活的方法、比如在美国专利公布号2006/0270017 A1所公开的方法来灭活病毒，在此将其引入本文以供参考。尤其是，通过甲醛处理和/或紫外线照射，单独地或者组合地进行灭活。如同本申请中使用的术语“完全灭活”或“完全被灭活”，当它们涉及到病毒制品时，意味着当通过在鸡胚纤维原细胞(CEF)或非洲绿猴肾细胞株系细胞上培养来测定病毒制品时，病毒制品并不含有空斑形成单位(pfu)。
本发明方法的优势之一是减少了在传染性的病毒培养基上进行的需要特定的安全预防措施的步骤。现有技术认为，在最初收获时进行纯化步骤是必要的，以便去除或大量减少在福尔马林处理过程中可与病毒交联的非病毒蛋白或核酸。本发明克服了这个偏见，本发明显示，在病毒收集之后、在纯化之前，直接灭活实际上是可行的或甚至更有利。为了避免灭活过程中的这些副作用，含有病毒的液体或其非病毒组分优选在收集步骤过程中或之后不进一步浓缩或以低于10、9、8、7、6、5、4、3或2的倍数浓缩。优选地，在灭活步骤前维持来自于细胞培养物本身的上清液中的非病毒蛋白和/或DNA的浓度。在特定的实施方式中，在灭活过程中或在收集病毒之后的液体中，完整蛋白或非病毒蛋白的浓度在μg/ml的范围内，例如在950μg/ml、900μg/ml、850μg/ml、800μg/ml、700μg/ml、650μg/ml、600μg/ml、550μg/ml、500μg/ml、450μg/ml、400μg/ml、350μg/ml、300μg/ml、250μg/ml、200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、30μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、8μg/ml、6μg/ml、4μg/ml、3μg/ml、2μg/ml以下或在1μg/ml以下。
可以选择对灭活病毒有效的任何剂量的甲醛或紫外线照射剂量，单独的或者组合的，用于灭活。在本申请的优选的实施方式中，病毒滴度的减少归因于样品中病毒的灭活，减少量至少是大约1x105；在较优选的实施方式中，至少是大约1x107；在更优选的实施方式中，至少是大约1x1010；在最优选的实施方式中，至少是大约1x1014。
在本发明的一个优选的实施方式中，用有效浓度的福尔马林处理样品大约12至大约96个小时。在较优选的实施方式中，用有效浓度的福尔马林处理样品大约24至大约48个小时，更优选的是处理大约24至30个小时。在本发明的一个尤其优选的实施方式中，用有效浓度的福尔马林处理样品大约24至大约24.5个小时。疫苗领域的技术人员将会认识到，对于被处理的特定的疫苗菌株，需要优化福尔马林的浓度和处理时间来达到完全的灭活，无论是单独的福尔马林或是与紫外线的组合。在更进一步的实施方式中，用有效浓度的福尔马林处理样品的步骤是在大约10至大约40℃下进行的。在本申请的一个尤其优选的实施方式中，用有效浓度的福尔马林处理样品的步骤是在大约32℃下进行的。
本发明的一个优选的实施方式包括用有效浓度的福尔马林处理样品，其中福尔马林的有效浓度的范围优选从大约0.01％至大约1％(w/w)，较优选从大约0.01％至大约0.1％，更优选在大约0.025％和大约0.1％之间，其中当使用37％的福尔马林溶液来调节有效浓度时，大约0.025％和大约0.1％各自对应于大约92mg/l和大约368mg/l的福尔马林。在本申请中，术语“紫外线”指的是具有100至400nm波长的紫外线辐照。紫外线可以选自由UV C(100至280nm)、UV B(280至320nm)、以及UV A(320至400nm)所组成的组。像那些插入进DNA并且被紫外线激活的光敏剂，例如补骨脂素，可以被用来增加紫外线辐射的灭活效果。在本发明的一个优选的实施方式中，紫外线是具有大约100至大约280nm波长的UV C。在本发明的一个更优选的实施方式中，紫外线的波长大约从240至290nm。在本发明的一个尤其优选的实施方式中，大约85％或更多的紫外线的波长大约是254nm。
紫外线的发射可能是连续形式的紫外线发射，例如水银灯技术；或脉冲紫外线，例如单频激光技术。理想的紫外线强度可能通过组合两个或更多的灯而产生。本发明的主题包括紫外线的任何有效剂量，即，优选当和福尔马林处理组合起来时安全地灭活给定的病毒的紫外线的任何剂量。免疫领域的技术人员会认识到，紫外线的波长和照射需要针对特定的被处理病毒株进行优化，以便能达到完全灭活，无论是单独的紫外线或与福尔马林处理组合。有效的剂量取决于为这个领域所熟知的多种因素，例如紫外线灭活室的物理参数比如灯和室的大小和直径、含病毒的培养基与紫外线源之间的距离、室内材料的光吸收和反射性质。出于同样的原因，UV C光的波长和强度以及病毒暴露于紫外线下的接触时间对于有效剂量也是很关键的。此外，有效剂量也受病毒本身、含病毒的培养基以及它们的光吸收性质的影响。优选地，有效剂量足以杀死至少99.99％的样品所含病毒，更优选灭活病毒至在哺乳动物或鸟类细胞培养检验上没有检测出活性病毒的水平，或完全灭活。在一个优选的使用UV C光的实施方式中，含病毒的样品暴露于范围在约5至约200mJ/cm2之间的有效剂量。在一个优选的实施方式中，有效剂量范围在约20至约100mJ/cm2之间，在其它优选的实施方式中，有效剂量范围在约40至约90mJ/cm2之间。在一个优选的实施方式中，有效剂量减少了初始病毒滴定度的1x105。在批量疫苗灭活中，有效剂量应是足以消除初始化学(福尔马林)灭活步骤之后可能存在的任何残留的活病毒。如实施例所述，这可以通过非常灵敏的哺乳动物细胞培养感染检验例如在实施例1.3中所述的Vero细胞培养检验法来测定。
在灭活后，纯化病毒抗原。纯化优选通过超速离心进行，例如在约100000g的范围内，比如50000g、60000g、70000g、80000g、或90000g，或直到200000g、180000g、160000g、140000g、120000g、或110000g。超速离心方法在本领域中是为人们所熟知的，并被用在病毒疫苗的常规生产中，例如在美国专利6,048,537中的描述，将此引入本文以作参考。优选地，超速离心是在离心过程中自身建立起的蔗糖密度梯度中进行的。在特定的优选实施方式中，蔗糖梯度是通过使用约42％至55％(w/w-％)蔗糖(或本领域中任何适合的碳水化合物或糖)溶液形成的。对于超速离心，可能使用连续流动离心。在超速离心后各组分的参数取决于使用的病毒株的特性。峰值蓄积液(peak pool)组分的收集参数针对每个病毒株单独地被评估和确定，并在约46-50％至34-38％的蔗糖范围之内。优选非病毒物质通过密度分离被去除(例如这步中完整的灭活病毒)。细胞膜碎片，包括脂质体和蛋白质，每个都有特征性的特定密度。作为蛋白质、核酸以及包膜病毒中的膜特征性组分的病毒可以通过它们特定的密度而被从非病毒物质中纯化出来。尤其是，完整病毒抗原可以从不完整的病毒部分中被纯化出来，或反之亦然。
纯化灭活病毒的这个步骤包括从病毒中至少部分地去除溶解性的非病毒物质。尤其是溶解性的非病毒物质包括来自于原细胞培养基或培养物中细胞的细胞蛋白或细胞核酸。非病毒物质，包括不完整的病毒部分，优选减少至少20％的量，优选在纯化过程中至少减少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或至少90％。
在特定的优选实施方式中，收集的液体用核酸酶处理来降解寄主细胞中的核酸。这样的核酸酶例如可以是benzonase。
在本发明的进一步的实施方式中，用于细胞培养和病毒增殖的细胞可以是原始细胞或任何适合生产病毒的培养细胞系。可用细胞的例子包括：哺乳动物细胞(例如CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO(非洲绿猴肾细胞株系)、HELA(宫颈癌细胞)、或perC6细胞)，鸟类细胞(例如鸡胚纤维原细胞，或来自鸟类的连续细胞系)以及昆虫细胞(例如sf9细胞)。在特定的优选实施方式中，细胞呈细胞培养物形式。发明方法允许进行有效的纯化，包括裂解物质，无论潜在的以前灭活试剂的交联特性如何。与蛋培养的病毒相反，来源于细胞培养的病毒有更高的初始纯度，并且不含白蛋白和胶原蛋白，这代表了福尔马林处理的收获物纯化的一个重要优势。最终的产品的改进剂型没有絮凝作用，不需要任何稳定剂例如生育酚或聚乙二醇单十二醚。
在本发明中，待被灭活的病毒选自包膜DNA或RNA病毒，是具有单链或双链(DNA)基因组、致敏或抗致敏、连续的或片断的病毒。在本发明的优选实施方式中，病毒选自由包膜病毒组成的组，包括黄病毒、外衣病毒、逆转录病毒、冠状病毒、线状病毒、棒状病毒、布尼亚病毒、正粘病毒、副粘病毒、沙粒病毒、肝DNA病毒、疱疹病毒以及痘病毒。在其它优选实施方式中，病毒是黄病毒、冠状病毒、正粘病毒或外衣病毒。特别优选的是包膜病毒，例如流感，包括流感A、B或C株、西尼罗以及罗斯河病毒(RRV)。在本发明的其它优选实施方式中，病毒选自由包膜RNA病毒组成的组，包括黄病毒、外衣病毒、逆转录病毒、冠状病毒、线状病毒、棒状病毒、布尼亚病毒、正粘病毒、副粘病毒以及沙粒病毒。在特定的优选实施方式中，病毒选自正粘病毒，例如流感病毒株：流感病毒株可能有血凝素(hemaglutianin)和神经氨酸酶表面蛋白的不同组合。在另一个特定的优选实施例中，病毒选自外衣病毒，例如甲病毒属如罗斯河病毒(RRV)。另一组用作批量病毒溶液的优选病毒组是冠状病毒，包括与严重急性呼吸综合症(SARS)相关的病毒。另一组优选的病毒组是黄病毒，包括日本脑炎、虱传脑炎(TBE)、登革热病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒以及出血热病毒。另一优选的病毒组是痘病毒，包括正痘病毒(如牛痘或变更牛痘安卡拉病毒)和禽痘病毒。
在进一步的实施方式中，被纯化的病毒被进一步地加工。在纯化后，进一步的步骤包括稀释被纯化的病毒，尤其是在蔗糖超速离心后，以便稀释预期是含有约40％蔗糖的粘稠的峰值蓄积液组分。将被纯化的病毒匀浆化，另外用核酸酶处理、压滤和/或超/渗滤。在本发明的实施方式中，病毒用去污剂处理进行修饰来产生修饰的完整病毒或裂解病毒疫苗。病毒脂质包膜的修饰是通过用去污剂例如Triton X100以使病毒尤其是病毒脂质包膜不稳定或分解的适合浓度增溶来进行的。去污剂处理至少部分地去除所述病毒的膜。优选去污剂的浓度通过例如渗滤或色谱方法来去除。在去污剂处理步骤中使用的去污剂包括离子型(阳离子、阴离子、两性离子)去污剂或非离子型去污剂。合适的去污剂包括吐温组去污剂(例如吐温80)，以及Triton组去污剂(例如Triton 100)。
可选地，病毒抗原制品可以通过额外的甲醛处理或添加稳定剂来进一步稳定化，例如使用如WO 02/097072 A2所公开的去污剂，将其引入本文以作参考。这些去污剂举例来说是适合稳定HA蛋白的去污剂，例如吐温80、Triton X100、脱氧胆酸盐、聚乙二醇单十二醚和生育酚。人们认为表面蛋白是通过细胞膜成分与去污剂的复合微胶束而溶解的。
在特定的优选的实施方式中，病毒被进一步加工成裂解病毒，所述加工包括以下的任何一个步骤：稀释、匀浆化、核酸酶处理、压滤、超/渗滤、增溶、渗滤、用甲醛处理来稳定、稀释、超/渗滤、(去污剂)稳定剂添加、第二次匀浆化和灭菌过滤。
在其他特定的优选实施方式中，病毒被进一步加工成修饰过的病毒制品，所述加工包括以下任何一个步骤：稀释、匀浆化、核酸酶处理、压滤、去污剂处理、超/渗滤、稳定剂添加、第二次匀浆化和灭菌过滤。尤其是进行去污剂稳定化，将去污剂引入至包膜病毒的病毒膜中来增加完整病毒的稳定性，这样就修饰了病毒。
在另外的实施方式中，病毒被处理成亚单位疫苗，包括单个病毒亚单位或病毒蛋白尤其是诸如血凝素或神经氨酸酶的表面蛋白的分离。分离可以是例如通过亲和纯化和/或色谱方法比如离子交换色谱法来进行的。
令人惊讶的是，本发明的方法适合工业规模生产病毒抗原疫苗。因此优选灭活或任何其它步骤例如接种、增殖、收集或纯化进行的量或产物的量是：包含病毒或病毒抗原的液体的量至少是0.5L、1L、2L、3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L、10L、12L、14L、16L、18L、20L、25L、30L、35L、40L、60L、80L、100L、120L、140L、160L、180L、200L。
在进一步方面，本发明也提供了用于生产包含病毒抗原的制品的方法，其包括
a)获取含有传染性病毒的液体，
b)完全灭活所述收集的病毒，
c)用去污剂处理所述灭活的病毒，
d)纯化所述灭活的病毒，得到包含病毒抗原的制品。当然使用含有传染性病毒的液体本身也是可能的，病毒来自于上述任何细胞的上清液，用于灭活、去污剂处理、以及纯化。优选所述包含传染性病毒的液体是从细胞培养物中获得的。
在特定的优选实施方式中，病毒抗原，尤其是裂解病毒或经过修饰的病毒抗原，通过添加有效剂量的吐温80来被稳定，尤其优选吐温80的浓度为约0.125％，比如高于0.01％、0.05％或0.4％，以及低于0.6％、0.5％、0.4％、0.3％或0.2％。因此，本发明在进一步的方面也提供了通过添加吐温80来稳定病毒抗原的方法。根据本发明，发现去污剂吐温80溶解病毒膜没有Triton X100有效，但是吐温80是目前最具生物相容性的、并且能存在于疫苗制品中。稳定病毒抗原的有效剂量优选低于在使用高浓度的Triton X100如0.5％的裂解病毒增溶步骤中用于增溶病毒膜的剂量。在其它实施方式中，病毒抗原不含稳定剂。在特定的实施方式中，通过在裂解和纯化步骤前将病毒收获物完全灭活的步骤，提供了生产的裂解疫苗。令人惊讶的是，用福尔马林处理和紫外线处理的灭活步骤并不影响随后的去污剂处理和纯化步骤。
在进一步的实施方式中，提供了包含一种或多种疫苗抗原的疫苗或药物组合物。该药物组合物可进一步包括药物载体和/或佐剂。这些药物载体举例来说是稳定性盐、乳化剂、增溶剂或渗透压调节剂、悬浮剂、增稠剂、维持生理氧化还原电势的氧化还原剂成分。优选佐剂包括铝盐、微乳液、脂质颗粒、和/或被用来增加免疫应答的寡核苷酸。本发明的进一步的方面是提供药物组合物或包含抗原的作为疫苗的制品。疫苗可以用来例如注射作为预防与病毒相关的疾病的方法。在特定的优选实施方式中，组合物或疫苗包含不止一个抗原，如2、3、4、5、6、7或8个抗原，尤其是不同病毒株、亚型或类型例如流感A和流感B的抗原，尤其选自以下抗原中的一种或多种：人的H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7亚型的抗原，猪流感H1N1、H1N2、H3N1和H3N2亚型的抗原，狗或马流感H7N7、H3N8亚型的抗原或鸟H5N1、H7N2、H1N7、H7N3、H13N6、H5N9、H11N6、H3N8、H9N2、H5N2、H4N8、H10N7、H2N2、H8N4、H14N5、H6N5、H12N5亚型的抗原。
合适的佐剂可以选自：矿物胶、氢氧化铝、表面活性剂、溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇类、聚阳离子或油乳剂例如油包水或水包油或其组合。当然，佐剂的选择取决于有目的的使用。例如，毒性可能取决于受试的生物体，可以从无毒至高毒性间变化。
本发明的组合物或疫苗的另一个优选实施方式进一步包括缓冲物质。本领域的技术人员可以选择缓冲物质来建立根据本发明的组合物溶液中的生理条件。像pH和离子强度以及离子含量的性质可以按需要来选择。
根据本发明进一步的优选组合物或疫苗，包含药物可接受的载体。
术语“载体”指的是稀释剂，例如水、盐、赋形剂或可以给药组合物的介质。作为固体成分，药物组合物中的载体可以包括：粘合剂，例如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮或聚乙烯吡咯酮)、黄蓍胶、白明胶、淀粉、乳糖或单水乳糖；崩解剂，例如褐藻酸、玉米淀粉以及类似物；润滑剂或表面活性剂，例如硬脂酸镁或月桂基磺酸钠；助流剂，例如硅胶；甜味剂，例如蔗糖或糖精。
还提供了提高受试者对病毒感染的耐受性的方法，包括生产包含一种或多种不同病毒抗原的制品，并且将如上所述包含一种或多种病毒抗原的制品给药于受试者。制品优选是疫苗。也预期提供按本发明制备的病毒抗原作为疫苗，或者通过将所述病毒抗原给药于受试者以提高受试者对病毒感染的耐受性。
实施例
实施例1：传染性病毒的灭活
在Vero细胞培养物中生产三种不同的流感株：两种A型病毒株--广岛病毒株(HR，H3N2)和新喀里多尼亚病毒株(NC，H1N1)，以及B型病毒株--马来西亚病毒株(MA)。在病毒增殖后，传染性的病毒收获物在纯化之前按照图1a所示流程被灭活。
1.1.福尔马林灭活
用福尔马林处理的第一个灭活步骤是在不含细胞的、传染性单价病毒收获物、即通过离心澄清后的生物反应器中的收获物上进行的。在30至34℃下收集后，在30至34℃下用约0.9至约1.1U/ml Benzonase处理单价病毒收获物4至8个小时。然后在32+/-2℃下用≤92mg/l的福尔马林处理24至24.5个小时。
1.2.紫外线灭活
用福尔马林灭活病毒的许多灭活试验是使用具有65W紫外灯的灭活室和薄层室进行的。虽然当用每小时100升的流速三次循环时，能够证明完全灭活单价病毒收获物，但是这个装置不能在线测定紫外线信号。用于生产流感病毒的Vero细胞培养基含有不同的有机化合物是造成紫外线信号吸收的原因。因此，这个系统装配了110W灯，允许在处理单价病毒收获物的过程中能连续监控紫外线信号。
福尔马林处理的单价流感巴拿马病毒株收获物被用作灭活的模型底物。对于采用薄层紫外线技术的连续灭活，使用了装配有VISA灯(110W)的WEDECO VISA系统(德国)。紫外线薄层室是不锈钢1.4435装置，带有30mm直径的石英管。校准过的紫外线传感器能在线监控紫外线信号。紫外线薄层室在室温下以每小时240+/-10升的流速运转。流速条件通过校准过的流量计来控制。单价收获物暴露于10次紫外线循环。每次循环后，紫外线处理的20升的单价收获物被移出，并且被进一步使用连续超速离心通过蔗糖梯度纯化来纯化。
1.3安全性检验
标准Vero安全性检验室用于灭活流感株残留感染性的非常严格的质量检验。此检验也可应用于其他病毒。单价批量产品，即蔗糖梯度离心和超滤-渗滤后的纯化病毒抗原，被加到5个Roux扁瓶中(4ml/个扁瓶)。在Vero培养基中32℃下孵育7天后，获得细胞培养物、集中并加到5个Roux扁瓶中(10ml/个扁瓶)。在另一个32℃下孵育7天的步骤后，获得细胞培养物、集中、并被用于红血球凝集素(HA)检验。
HA-检验基于如下事实：流感病毒能用它们的表面蛋白红血球凝集素来结合红血球。此检验在无菌环境中进行。用具有确定的HA滴度的流感病毒悬浮液作为阳性对照，0.9％的氯化钠溶液作为阴性对照。将50μl以1∶2稀释在0.9％氯化钠溶液中的待检验的样品放入96孔板的一个孔中。将50μl的含有鸡红细胞的溶液加入每个孔中。随后，孔板在室温下孵育30至45分钟。然后目测红血球凝聚，其中如果5个含有相同样品的孔不显示任何红血球凝聚，则样品通过HA检验。
实施例2：超速离心纯化
在流感病毒抗原的纯化过程中，单价收获物(MVH)通过离心来浓缩。在用蔗糖水溶液形成的蔗糖梯度的基础上，连续流动离心步骤被应用于Vero细胞培养物培养的病毒疫苗的生产。使用的离心机型号配有预澄清器。使用20mM Tris-缓冲液中约42％和55％(w/w)的蔗糖溶液形成的密度梯度的小规模实验在不同的离心条件下进行。此外，没有预澄清器、但是增加g-离心力的超速离心也是提高产量的有用的手段。
单价流感病毒收获物(MVH)被用于比较研究。单价流感病毒收获物用实验室离心机型号RK-6在35,000rpm下通过连续超速离心被纯化。
实施例3：纯化/处理
对于流感候选疫苗，三种不同的流感株按照实施例2所述的方法通过超速离心被纯化和收集。抗原产量在各峰值蓄积液中是不同的。新喀里多尼亚流感株含有最低的抗原产量，接着是广岛流感株，最后是马来西亚流感株。蛋白含量在马来西亚流感株中最高，在广岛流感株中最低。来自于马来西亚流感株和新喀里多尼亚流感株的峰值蓄积液中的SRD(单辐射免疫扩散试验(HA-定量))对总蛋白量的比值是相当的，但是在广岛流感株中较高(表1)。
表1：峰值收集液的分析结果
  HR05/61   MA04/61   NC99/51
  流感株   广岛   马来西亚   新喀里多尼亚
重量(ml(g)) 840.4(1000) 420.2(500.1) 420.2(500)
SRD(μg/ml) 246.2 426.6 194.9
Bradford测定的蛋白浓度(μg/ml) 487 1495 764
SRD/蛋白比值 0.51 0.28 0.26
ELISA测定的VERO蛋白浓度(μg/ml) 6.2 19.7 18.9
进一步的处理如下总述：
3.1.峰值蓄积液的稀释
用TBS缓冲液稀释峰值蓄积液3倍，来减少蔗糖浓度用于减少粘性。
3.2.第一次匀浆化峰值蓄积液
用高压匀浆器“NS 1001L Panda”(Niro Soavi S.p.A.)处理稀释的峰值蓄积液。病毒悬浮液在800巴的压力下通过匀浆器3次。这个压力通过破坏病毒聚集体足以改善随后的处理步骤。
3.3.添加Benzonase
Benzonase，大肠杆菌中产生的重组核酸酶，以3U/ml的最终浓度被加到病毒悬浮液中来降解来源于细胞的DNA。
3.4.压滤
添加Benzonase后，进行0.22μm的压滤，使得在随后的孵育过程中病毒悬浮液不含有外来的生物体例如细菌。孵育在32℃下过夜进行。
3.5.超滤/渗滤
在Benzonase孵育完成后，超滤/渗滤通过30kD悬浮通道超滤膜(Pall)在过滤面积0.1m2的小规模和0.5m2的中试规模下进行。超滤滞留液(ultraretentate)使用10个滞留液体积的TBS(Tris缓冲盐溶液)+0.008％Triton X100(w/w)来渗滤。
3.6.添加Triton X100用于增溶和孵育。对于病毒裂解，Triton X100被加至最终浓度是0.5％(w/w)，并在室温下孵育过夜。
3.7.渗滤II
为了去除高浓度的Triton X100，渗滤通过30kD悬浮通道超滤膜(Pall)来进行。超滤滞留液用15个滞留液体积的TBS(Tris缓冲盐溶液)来渗滤。
3.8.添加甲醛和孵育
甲醛被加到超滤滞留液/渗滤滞留液(Diaretentate)中至最终浓度是0.025％，用于抗原的稳定化。在室温下进行18-24个小时的孵育。福尔马林是约36-37％甲醛气体的饱和水溶液。
3.9.通过HPLC来确定Triton X100的浓度
随后的处理步骤由稀释步骤和进一步的超滤/渗滤组成。为了针对Triton X100(TX 100，约0.015％，250μM，在水溶液中)稀释UDR(超滤滞留液/渗滤滞留液)至低于临界胶束浓度，引入分析TX 100的测定步骤被来确定TX 100的浓度。稀释倍数取决于TX 100浓度。
3.10.对于TX 100稀释UDR至低于临界胶束浓度
含有残留TX 100约0.1-0.2％(通过HPLC确定)的超滤滞留液/渗滤滞留液用TBS稀释至最终TX 100浓度为0.008％，明显低于CMC(临界胶束浓度)。
3.11.超滤/渗滤III
超滤/渗滤通过相同的30kD悬浮通道超滤膜来进行。超滤滞留液用5个滞留液体积的TBS(Tris缓冲盐溶液)+5VC TBS+0.008％Triton X100(w/w)来渗滤。
3.12.去污剂稳定化
在TX 100浓度减少至目标水平时，吐温80被加到悬浮液中，至最终浓度是0.125％±0.025％，用于进一步的病毒抗原稳定化。这可避免由于TX 100浓度过低引起的抗原再聚集。
3.13.第二次匀浆化
进行第二次高压匀浆化步骤是为了在0.22μm过滤步骤中使得抗原损失减少。使用如3.2部分所述的相同装置中的相同匀浆器。
3.14.无菌过滤
在第二次匀浆化步骤之后，用0.22μm过滤器(Millipore)进行无菌过滤。无菌过滤的批量物质被称为单价批量(MVB)。
实施例4：结果
表2：以裂解病毒(广岛)为例的超速离心后的纯化结果
  峰值蓄积液   DIL(1∶3)   HOM1   PFIL   UDR130K   UDR230K   UDR   HOM2   MVB
  数量   g   500   1501.6   1479.8   1537.5   410.4   411.7   421.8   414.9   421.5
  光密度   OD，405nm / 0.82 0.24 0.20 0.86 0.72 0.88 0.18 0.15
  SRD(NIBSC)   μg/ml   194.9   56.7   58.1   52.9   130.9   110.3   84   86.5   74.6
  总SRD   mg   81.9   77.4   78.2   73.9   53.7   45.4   35.4   35.9   31.5
  蛋白   μg/ml   764   /   /   /   /   /   /   /   385
  总蛋白   mg   382   /   /   /   /   /   /   /   162.3
  VERO蛋白浓度   ELISA测定的μg/ml 18.9 4.5 4.4 3.8 10.8 6.3 4 5 4.7
  总VERO蛋白   ELISA测定的mg 8 6.1 5.9 5.2 4.4 2.6 1.7 2.1 2
  VERO DNA   ng/ml   /   /   /   /   /   /   /   /   0.64
  总VERODNA   μg   /   /   /   /   /   /   /   /   0.27
  TX 100   (％)   /   /   /   /   0.482   0.101   0.018   0.017   0.017
  吐温80   (％)   /   /   /   /   /   /   /   /   0.115
DIL(1∶3)：峰值蓄积液的稀释；UDR：超滤/渗滤后的超滤滞留液/渗滤滞留液；HOM-1，HOM-2：匀浆化1和2；PFIL：0.22μm压滤；MVB：单价批量
MVB中总的SRD是73mg。总Vero蛋白水平从5.2mg减少至1mg，减少了80.8％。MVB中总Vero的DNA减少至0.28μg。总蛋白从487mg减少至212mg，减少了56.5％。
在马来西亚病毒株上也能得到相似的结果：总Vero蛋白从8.3mg减少至2.4mg，从峰值蓄积液到MVB减少了大约67.5％。MVB中Vero的DNA含量是1.8μg。在纯化过程中总蛋白从748mg减少至310mg，减少了58.6％。
对于新喀里多尼亚病毒株，在纯化的最后，总Vero蛋白从峰值蓄积液的8mg减少至MVB中的2mg，减少了大约75％。MVB中总Vero的DNA含量是0.27μg。总蛋白从峰值蓄积液的382mg减少至MVB中的162mg，减少了大约57.6％。
纯化步骤是非常一致和有效的。寄主细胞的蛋白和DNA、以及处理化学物如Benzonase、蔗糖、甲醛和Triton X100的成功减少得到高度纯化的病毒制品，并且没有内毒素。所有的制品在生产后都是无菌的。三种MVB中SRD与蛋白的比值符合规定。

Claims (20)

1.一种用于制造含有病毒抗原的制品的方法，其包括
a）在液体中用传染性的包膜病毒接种细胞培养物，其中所述细胞是原始细胞或培养细胞系，
b）使所述病毒在所述细胞培养物中增殖，其中所述细胞呈细胞培养物形式，
c）收集在所述细胞培养物中增殖的病毒，
d）在病毒收集之后、在任何纯化步骤之前，直接完全地灭活从所述细胞培养物中收集的病毒，并且其中含有病毒的液体或其非病毒组分在灭活步骤之前不进一步浓缩，以及
e）在可有效地产生裂解病毒的条件下，用去污剂处理被灭活的病毒，得到含有病毒抗原的制品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，收集所述增殖的病毒的步骤包括：在感染后将病毒从所述细胞培养物的细胞和/或细胞碎片中分离出来。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灭活是通过加入甲醛进行、或者通过紫外线照射进行的。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述细胞培养物中增殖的病毒被释放在所述液体中。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，收集后用核酸酶处理被收集的病毒。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述核酸酶是benzonase。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是哺乳动物或鸟类细胞。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是上皮细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是Vero细胞。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒是正粘病毒。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒是流感病毒。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述灭活期间非病毒蛋白的浓度低于350μg/ml。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制造是以工业规模的量进行。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灭活是在至少1L含有病毒的液体上进行的。
15.一种制造含有病毒抗原的制品的方法，其包括
a）获取包含被接种在细胞中的传染性的包膜病毒的液体，其中所述细胞是原始细胞或培养细胞系，
b）在任何纯化步骤之前，灭活来自步骤a）的被收集的病毒，并且其中含有病毒的液体或其非病毒组分在灭活步骤之前不进一步浓缩，
c）在可有效地产生裂解病毒的条件下，用去污剂处理病毒，以及
d）纯化被灭活的被裂解的病毒，得到含有病毒抗原的制品。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述液体从细胞培养物中获得。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，进一步包括稳定所述病毒抗原的步骤。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，通过加入有效剂量的吐温80来稳定所述病毒抗原。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，吐温80的含量大约是0.125%。
20.通过权利要求1-19所述方法中的任何一种所获得的制品在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物用于提高受试者对病毒感染的耐受性。
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