ES2856901T3 - Partícula retrovírica que contiene al menos dos ARN no víricos encapsidados diferentes - Google Patents

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Abstract

Partícula retrovírica que contiene una proteína procedente de la poliproteína Gag, una proteína de envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no víricos diferentes encapsidados, conteniendo cada uno de los ARN no víricos diferentes encapsidados, una secuencia de ARN de interés unida a una secuencia de encapsidación, siendo reconocida cada secuencia de encapsidación por un dominio de unión introducido en la proteína procedente de la poliproteína Gag.

Description

DESCRIPCIÓN
Partícula retrovírica que contiene al menos dos ARN no víricos encapsidados diferentes
La presente invención se refiere a un sistema retrovírico de transferencia de ARN no vírico a células diana y, más especialmente, a una partícula retrovírica que puede suministrar múltiples ARN. La invención también se refiere a composiciones que contienen dichas partículas retrovíricas, a kits para la producción de las mismas, a los procesos de fabricación correspondientes, así como a los usos de las partículas y de las composiciones.
Introducir múltiples ARN en una célula diana es un reto importante tanto para la investigación y desarrollo como para la terapia génica.
La utilización de vectores derivados de virus se ha convertido en un método fundamental de transferencia de genes. Los vectores víricos se clasifican en la actualidad en dos categorías principales:
- los vectores integradores, que se integran en el genoma receptor, y
- los vectores no integradores, que constituyen normalmente un elemento genético extracromosómico.
Los vectores integradores, tales como los vectores gamma-retrovíricos (RV) y los vectores lentivíricos (LV) se integran de manera estable. Los vectores no integradores, tales como los vectores adenovíricos (VAD) y los vectores adenoasociados (VAA) se eliminan rápidamente de las células que se dividen rápidamente. Algunos factores que influyen en la elección de un vector en particular, comprenden su capacidad de encapsidación, su gama de células diana u hospedadoras, su perfil de expresión génica, su eficacia de transducción y su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria, lo que resulta ser especialmente problemático si se necesitan transducciones repetidas.
Algunas aplicaciones requieren el uso de vectores no integradores como en la terapia génica o en las numerosas aplicaciones in vitro, ex vivo e in vivo. Como ejemplos, pueden mencionarse:
• la inducción de la reprogramación de células especializadas en células pluripotentes, así como la inducción de la diferenciación de citoblastos o células pluripotentes en células especializadas,
• la expresión de antígenos o proteínas (tóxicas o no) simultáneamente en una célula diana,
• la expresión de sistemas de ingeniería del genoma tales como por ejemplo la proteína CRE, TALEN o el sistema CRlSPR, o de cualquier otro sistema que requiera una expresión de proteína o ARN.
Un medio para introducir los ARN en una célula diana utiliza vectores víricos basados en virus pertenecientes a la familia Retroviridae (también conocida como familia de Retrovirus o virus de ARN). En efecto, durante su ciclo de replicación, un virus de la familia Retroviridae tiene la capacidad de convertir su genoma, constituido por ARN, en ADN bicatenario, que se integrará en el genoma de la célula diana. Los ejemplos concretos de esta familia de Retrovirus son los gamma-retrovirus y los lentivirus.
El ciclo de replicación de un retrovirus incluye una primera fase de reconocimiento de la célula diana (u hospedadora) mediante la fijación a un receptor de membrana. Esta fase de reconocimiento finaliza, tras la fusión de membranas, con la entrada del retrovirus en la célula hospedadora. A continuación, el ARN retrovírico se copia a ADN bicatenario mediante la transcriptasa inversa, codificada por el retrovirus, y posteriormente se integra en el genoma de la célula hospedadora. Seguidamente, la célula hospedadora transcribe este genoma vírico como el resto de los genes de la célula. Este genoma codifica la totalidad de proteínas y secuencias que permiten la fabricación de otros virus.
Más particularmente, el conjunto de retrovirus tienen en común tres genes: gag, pol y env.
Gag es un gen que codifica una poliproteína, siendo las proteínas procedentes de esta poliproteína mediante escisión, proteínas estructurales implicadas en el ensamblaje de los virus durante la replicación. Estas proteínas estructurales son más específicamente la proteína de la matriz (Ma ), la proteína de la cápside (CA) y la proteína de la nucleocápside (NC).
Pol es un gen que codifica las enzimas integrasa, transcriptasa inversa y proteasa.
Env es un gen que codifica glucoproteínas de la envoltura.
De esta manera, estos tres genes permiten copiar el ARN retrovírico a un ADN bicatenario, integrar dicho ADN en el genoma de la célula hospedadora y después generar la estructura de los retrovirus neosintetizados: proteínas de la envoltura, de la cápside y de la nucleocápside. No obstante, para que los retrovirus neosintetizados estén completos, es necesario encapsidar en cada una de estas estructuras dos copias del ARN retrovírico. Esta encapsidación de dos copias del ARN retrovírico en la estructura, se efectúa mediante el reconocimiento por la proteína de la nucleocápside, de una secuencia de encapsidación denominada Psi (por "Packaging S ignal") que incluye la copia del ARN retrovírico.
Cuando un vector vírico derivado de un retrovirus se utiliza en terapia génica, al menos una parte de las regiones que codifican gag, pol y/o env, se disocia entre el sistema de encapsidación y el sistema de expresión de la secuencia de interés. Las secuencias codificantes gag y pol, por ejemplo, están incluidas en el plásmido de encapsidación que aporta en trans las proteínas necesarias para la producción de vectores víricos. Tanto la secuencia de encapsidación como la secuencia de interés están incluidas en sistemas independientes, para convertir los retrovirus en no replicantes.
No obstante, en algunos casos, la integración de la secuencia de ARN de interés en el genoma de la célula hospedadora de manera aleatoria puede interrumpir un marco abierto de lectura y bloquear la expresión de genes importantes. Asimismo, en determinadas aplicaciones, tales como la reprogramación de células o la diferenciación de citoblastos, se recomienda que la expresión transitoria de una secuencia de interés se realice de forma transitoria.
La solicitud WO2007/072056 describe un sistema de vectorización vírico que comprende env, gag, opcionalmente gag/pol, así como una secuencia de ARN que contiene una señal de encapsidación heteróloga que reconoce un dominio de unión a ARN correspondiente asociado a gag o a gag/pol. En la solicitud, este sistema se describe como no integrador y permite una expresión transitoria.
No obstante, la eficacia de dichos sistemas sigue siendo limitada. En particular, para que una célula diana exprese un ARN de interés transportado por estos sistemas, generalmente es necesario introducir en la célula varias copias de este ARN de interés y, en consecuencia, utilizar fuertes multiplicidades de infección ("multiplicidad de infección" o MOI, por las siglas del inglés Multiplicity Of Infection). La MOI corresponde a la relación entre el número de sistemas de vectorización introducido y el número de células a infectar. En efecto, una fuerte MOI permite introducir en las células varias copias del ARN de interés, permitiendo que una misma célula experimente varias infecciones. Ahora bien, aunque permite mejorar el nivel de expresión del ARN de interés transportado, la utilización de fuertes MOI, debido a las múltiples infecciones de la célula, también genera cierta toxicidad.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de sistemas de vectorización vírica que sean más eficientes y menos tóxicos.
El trabajo de los inventores ha permitido realizar un sistema de vectorización que puede suministrar varios ARN de interés a una misma célula en una sola infección.
La presente divulgación se refiere a una partícula retrovírica que contiene una proteína procedente de la poliproteína Gag, una proteína de envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no víricos encapsidados, conteniendo cada uno de los ARN no víricos encapsidados, una secuencia de ARN de interés unida a una secuencia de encapsidación, siendo reconocida cada secuencia de encapsidación por un dominio de unión introducido en la proteína procedente de la poliproteína Gag y/o en la integrasa.
La invención es tal como se define en las reivindicaciones.
La presente invención se refiere a una partícula retrovírica que contiene una proteína procedente de la poliproteína Gag, una proteína de envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no víricos diferentes encapsidados, conteniendo cada uno de los ARN no víricos diferentes encapsidados, una secuencia de ARN de interés unida a una secuencia de encapsidación, siendo reconocida cada secuencia de encapsidación por un dominio de unión introducido en la proteína procedente de la poliproteína Gag.
La partícula retrovírica de acuerdo con la invención, permite introducir en una célula al menos dos ARN no víricos diferentes, preferentemente 3, con una sola infección. La introducción dichas partículas en las células se puede realizar mediante un procedimiento in vitro o ex vivo.
Por "proteína procedente de la poliproteína Gag", se entiende cualquier proteína que resulte de la escisión de la poliproteína Gag. Más particularmente, se trata de una proteína de la nucleocápside, de una proteína de la matriz (por ejemplo, en las partículas retrovíricas derivadas de virus murinos del tipo MoMuLV) o de la proteína p12, específica de los gammaretrovirus.
Por "proteína de envoltura", se entiende cualquier proteína de la envoltura, comprendiendo una proteína de envoltura de pseudotipado. Como ejemplo, se pueden citar la proteína de envoltura anfotrópica, la proteína de envoltura ecotrópica, la proteína de envoltura del virus Moloney de la leucemia murina (MoMuLV, siglas del inglés), la proteína de envoltura del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV, siglas del inglés), la proteína de envoltura del virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV, siglas del inglés), la proteína de envoltura del virus del tumor mamario murino (MuMTV, siglas del inglés), la proteína de envoltura del virus del Sarcoma de Rous (RSV, siglas del inglés), la proteína de envoltura del virus de la rubeola (también MV por las siglas del inglés measles virus, virus del sarampión), la proteína de envoltura del virus de la leucemia de Gibbon (GalV, siglas del inglés), la proteína del virus endógeno felino (RD114) o la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (VEV-G). Más particularmente, la proteína de la envoltura es la proteína de la envoltura anfotrópica, la proteína de envoltura ecotrópica, la proteína de envoltura del virus Moloney de la leucemia murina (MoMuLV), la proteína de envoltura del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), la proteína de envoltura del virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), la proteína de envoltura del virus del tumor mamario murino (MuMTV), la proteína de envoltura del virus del Sarcoma de Rous (VSR), la proteína de envoltura del virus de la rubeola (también MV por las siglas del inglés measles virus, virus del sarampión), la proteína de envoltura del virus de la leucemia de Gibbon (GalV) o la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (VEV-G). La proteína de envoltura también se puede modificar para dirigirse a determinados tipos de células o a determinadas aplicaciones (uso de receptores de superficie como proteína de la envoltura).
Es también posible modificar la proteína de envoltura con un anticuerpo, un glucolípido y/o un ligando, en particular, para dirigirse a un receptor y/o a un tipo de célula en particular.
Preferentemente, la proteína de envoltura es la proteína VEV-G.
Por "integrasa", se entiende la proteína enzimática que codifica el gen pol, que permite la integración del ADN retrovírico en el ADN de la célula infectada por el retrovirus durante la replicación de dicho retrovirus.
Por "secuencia de encapsidación", se designa un motivo (secuencia y estructura tridimensional) del ARN reconocido específicamente por un dominio de unión. Preferentemente, la secuencia de encapsidación es un motivo tallo-bucle. Más preferentemente aún, la secuencia de encapsidación de la partícula retrovírica es el motivo tallo-bucle del ARN del bacteriófago MS2 o del fago PP7, tal como, por ejemplo, el resultante de la secuencia ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N°1) o (ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID N°5) respectivamente. El motivo tallo-bucle y, más especialmente, el motivo tallo-bucle del ARN del bacteriófago MS2 o el del ARN del fago PP7, se puede utilizar en solitario o repetirse varias veces, preferentemente de 2 a 25 veces, más preferentemente de 2 a 18 veces, por ejemplo de 6 a 18 veces.
Por "dominio de unión", se designa toda o parte de una proteína que se une específicamente a la secuencia de encapsidación unida a la secuencia de ARN de interés. Más particularmente, se trata de una proteína mutante o no, definida por una estructura tridimensional, que se une específicamente a la secuencia de encapsidación. Preferentemente, el dominio de unión es un dominio heterólogo. Más preferentemente, el dominio de unión es la proteína Coat del bacteriófago MS2, del fago PP7 o del fato Qp, la proteína nun del profago HK022, la proteína U1A o también la proteína hPum.
Más preferentemente, el dominio de unión es la proteína Coat del bacteriófago MS2 o del fago PP7.
Más preferentemente aún, cuando el dominio de unión es la proteína Coat del fago PP7, su secuencia es deficiente para el autoensamblaje, gracias a una eliminación de los aminoácidos 67 a 75 (PCPAFG) (Chao et al. 2008). Preferentemente, en las células humanas, la secuencia de la proteína Coat del fago PP7 está optimizada por codones, es decir, que las bases del ADN se han seleccionado para codificar los aminoácidos preferentemente presentes en la especie humana.
Por "cada secuencia", se entiende que las secuencias de encapsidación pueden ser iguales o diferentes, dependiendo de si un dominio de unión igual o diferente reconoce estas secuencias de encapsidación. En efecto, la partícula retrovírica de acuerdo con la invención puede contener uno o varios dominios de unión. Cuando se introducen varios dominios de unión, estos pueden estar en la poliproteína Gag.
El dominio de unión no solo permite el reconocimiento de la secuencia de encapsidación, sino también la encapsidación de los ARN que contienen la secuencia de encapsidación en la partícula (o, en el caso actual, de un ARN no vírico unido a una secuencia de encapsidación).
Por "encapsidación", se entiende el empaquetado de un ARN en la cápside vírica de una partícula vírica. Se observará que, en la presente invención, la encapsidación de los ARN no víricos se lleva a cabo por el reconocimiento de una señal de encapsidación no vírica, en particular, una que sea diferente de Psi.
Por "secuencia de interés", se entiende que es una secuencia que codifica una función de interés para el usuario. Más particularmente, la secuencia de interés incluida en cada uno de los dos ARN no víricos encapsidados puede ser igual o diferente.
Mediante las partículas de acuerdo con la invención, es posible transferir a las células diana ARN no víricos diferentes.
Al no ser víricos los ARN encapsidados, estos ARN no presentan los sitios de reconocimiento de las proteínas codificadas por el gen pol.
En efecto, estos ARN no víricos no entran en las etapas iniciales del ciclo de replicación de los retrovirus, es decir:
- La copia del ARN vírico monocatenario en ADN bicatenario mediante la transcriptasa inversa;
- La maduración del ADN vírico bicatenario mediante el reconocimiento de extremos LTR (del inglés Long Terminal Repeat, repetición terminal larga) por la integrasa y la maduración del complejo de preintegración citoplasmático a un complejo de preintegración nuclear.
Estas proteínas víricas (transcriptasa inversa, integrasa), codificadas por el gen pol son, por tanto, opcionales en la partícula y el gen pol puede, por tanto, estar presente, o parcial o totalmente eliminado. Preferentemente, el gen pol está presente, o parcialmente eliminado.
Se observará que las partículas retrovíricas de acuerdo con la invención contienen un materia genético que es al mismo tiempo vírico y no vírico:
- el gen gag, que puede ser vírico o quimérico. Más particularmente, el gen gag es quimérico porque el uno o más dominios de unión se ha(n) introducido en el mismo.
- Opcionalmente, el gen pol, que puede ser vírico o quimérico. Puesto que el gen pol codifica varias enzimas, las secuencias correspondientes a estas enzimas se pueden eliminar total o parcialmente, estar presentes y no ser funcionales, o estar presentes y ser funcionales. Más particularmente, el gen pol es quimérico porque el uno o más dominios de unión se ha(n) introducido en la integrasa.
- Al menos dos ARN no víricos diferentes, conteniendo cada ARN no vírico una secuencia de interés y una secuencia de encapsidación. Más particularmente, estos ARN no víricos están desprovistos de cualquier secuencia vírica.
Más específicamente, las partículas retrovíricas acuerdo con la invención permiten introducir en las células diana varios ARN que pueden inducir:
• La transferencia de una o más secuencias de interés codificantes endógenas o exógenas de la célula diana, • La transferencia de uno o varios ARN no codificantes como los ARN que pueden inducir un efecto sobre la expresión genética, por ejemplo, mediante ARNhc, miARN, ARNsg, ARNLnc o ARNcirc.
• La transferencia de ARN celulares, de tipo de ARN mensajeros u otros (miARN...), replicones subgenómicos de virus al ARN (VHC, etc...) o de genomas completos de virus de ARN,
• la expresión simultánea de secuencias codificantes o no codificantes endógenas, exógenas de la célula diana, • participar en la modificación del genoma de la célula diana mediante sistemas de ingeniería del genoma, por ejemplo, el sistema CRISPR.
Ventajosamente, la partícula retrovírica de acuerdo con la invención contiene una proteína de la nucleocápside, una proteína de envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no víricos diferentes encapsidados, conteniendo cada uno de los ARN no víricos diferentes encapsidados, una secuencia de ARN de interés unida a una secuencia de encapsidación, siendo reconocida cada secuencia de encapsidación por un dominio de unión introducido en la proteína de la nucleocápside.
Por "proteína de la nucleocápside", se entiende la proteína de estructura NC codificada por el gen gag. Cuando el dominio de unión se introduce en la proteína de la nucleocápside, entonces, esta proteína es una proteína quimérica, procedente de un gen gag quimérico.
Cuando el dominio de unión se introduce en la integrada, entonces, la integrasa es una proteína quimérica, procedente de un gen pol quimérico.
Por "proteína quimérica", se designa una proteína recombinante que comprende varias secuencias proteicas diferentes fusionadas.
Según una primera realización, en la partícula retrovírica de acuerdo con la invención, el dominio de unión se introduce en la proteína de la nucleocápside y los al menos dos ARN no víricos encapsidados se distinguen por su secuencia de ARN.
Esta primera realización permite una expresión temprana y transitoria de los ARN de interés, sin eventos de integración asociados en el genoma de las células diana.
En efecto, según esta primera realización, durante la puesta en contacto de una partícula con una célula diana, la membrana de la partícula retrovírica y la de la célula diana se van a fusionar y a permitir la liberación del contenido de la partícula en la célula diana. Los ARN se liberan entonces en el citoplasma y la maquinaria celular permite traducir directamente estos ARN en una o más proteínas, es decir, sin etapas adicionales tales como la transcripción inversa, la translocación al núcleo o la integración en el genoma de la célula diana.
Más particularmente, los al menos dos ARN no víricos presentan la misma secuencia de encapsidación. En ese caso, los al menos dos ARN no víricos encapsidados se distinguen por su secuencia de ARN de interés, es decir, que las secuencias de ARN de interés comprendidas en los dos ARN no víricos encapsidados son diferentes. Por "diferentes", se entiende que son secuencias de interés que no son idénticas o que tienen una diferencia que no es resultado de una mutación espontánea o no seleccionada deliberadamente por el manipulador.
Como alternativa, los al menos dos ARN no víricos presentan dos secuencias de encapsidación diferentes. Estas al menos dos secuencias de encapsidación se reconocen, entonces, por al menos dos dominios de unión diferentes, introduciéndose al menos uno de estos dominios en la proteína de la nucleocápside. En ese caso, los al menos dos ARN no víricos encapsidados pueden contener secuencias de interés iguales o diferentes.
Es posible encapsidar al menos dos ARN no víricos, preferentemente tres ARN no víricos.
De acuerdo con una realización particular de la primera realización, se introduce un segundo dominio de unión en la proteína de la nucleocápside de la partícula retrovírica de acuerdo con la invención.
Como ejemplo, el segundo dominio de unión puede ser la proteína "Coat" del bacteriófago MS2 cuando el primer dominio de unión es la proteína "Coat" del fago PP7 o el segundo dominio de unión puede ser la proteína "Coat" del fago PP7 cuando el primer dominio de unión es la proteína "Coat" del bacteriófago MS2.
En ese caso, al menos dos ARN no víricos encapsidados contienen secuencias de encapsidación diferentes, correspondiendo cada secuencia de encapsidación respectivamente al primer y al segundo dominio de unión introducido en la proteína de la nucleocápside.
Más particularmente, cuando tres ARN no víricos se han encapsidado:
- al menos dos de los ARN no víricos encapsidados presentan la misma secuencia de encapsidación correspondiente al primer dominio de unión y se distinguen únicamente por su secuencia de ARN de interés, - el tercer ARN no vírico encapsidado puede llevar una secuencia de encapsidación igual o diferente. Cuando la secuencia de encapsidación es diferente, esta puede corresponder a un segundo dominio de unión introducido en la proteína de la nucleocápside.
En la proteína de nucleocápside también pueden introducirse otros dominios de unión.
De acuerdo con la presente divulgación, además del uno o más dominios de unión introducidos en la proteína de la nucleocápside, también es posible introducir un dominio de unión en la integrasa.
Entonces, la integrasa es una proteína quimérica, procedente de un gen pol quimérico.
Preferentemente, cuando el dominio de unión se introduce en la integrasa, la secuencia de la integrasa se ha mutado en el dominio del extremo C para insertar la secuencia del dominio de unión. Más preferentemente aún, la secuencia de la integrasa se ha mutado en el dominio del extremo C para introducir el de la proteína "Coat" del bacteriófago MS2 o del fago PP7.
En ese caso, los al menos dos ARN no víricos encapsidados pueden llevar secuencias de encapsidación diferentes, correspondiendo cada secuencia de encapsidación a los dominios de unión introducidos en la proteína de la nucleocápside y en la integrasa, respectivamente.
Más particularmente, cuando tres ARN no víricos se han encapsidado:
- al menos dos de los ARN no víricos encapsidados presentan la misma secuencia de encapsidación correspondiente al primer dominio de unión y se distinguen únicamente por su secuencia de ARN de interés, - el tercer ARN no vírico encapsidado lleva una secuencia de encapsidación diferente, correspondiente a un segundo dominio de unión introducido en la integrasa.
En la integrasa también pueden introducirse otros dominios de unión.
Ventajosamente, la partícula retrovírica de acuerdo con la invención es una partícula lentivírica.
Preferentemente, en una partícula lentivírica de ese tipo:
- el dominio de unión es la secuencia de la proteína "Coat" del bacteriófago MS2,
- la secuencia de encapsidación de los ARN no víricos es una secuencia tallo-bucle de MS2,
- la proteína de la nucleocápside es la proteína de la nucleocápside (NC) del VIH que pertenece a la poliproteína Gag, quimérica, estando la secuencia de NC mutada en el segundo dedo de cinc para insertar la secuencia de la proteína "Coat" del bacteriófago MS2.
Ventajosamente:
- La proteína de envoltura es la proteína VEV-G que codifica la proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular.
- La secuencia de encapsidación contiene de 2 a 25 repeticiones de la secuencia tallo-bucle de MS2, preferentemente, de 6 a 18 repeticiones de la secuencia tallo-bucle, aún más preferentemente de 10 a 14, por ejemplo, 12 repeticiones. Preferentemente, la secuencia tallo-bucle es la siguiente: ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N°1).
O, preferentemente, en una partícula lentivírica de ese tipo:
- el dominio de unión es la secuencia de la proteína "Coat" del fago PP7,
- la secuencia de encapsidación de los ARN no víricos es una secuencia tallo-bucle de PP7,
- la proteína de la nucleocápside es la proteína de la nucleocápside (NC) del VIH que pertenece a la poliproteína Gag, quimérica, estando la secuencia de NC mutada en el segundo dedo de cinc para insertar la secuencia de la proteína "Coat" del fago PP7.
Ventajosamente:
- La proteína de envoltura es la proteína VEV-G que codifica la proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular.
- La secuencia de encapsidación contiene de 2 a 25 repeticiones de la secuencia tallo-bucle de PP7, preferentemente, de 2 a 18 repeticiones de la secuencia tallo-bucle, aún más preferentemente de 2 a 12, por ejemplo, 6 repeticiones. Preferentemente, la secuencia tallo-bucle es la siguiente: ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N°5).
Opcionalmente, de acuerdo con la presente divulgación, el segundo dominio de unión introducido en la integrasa puede ser la proteína Coat del fago PP7 si el primer dominio de unión es la proteína Coat del bacteriófago MS2, o el segundo dominio de unión introducido en la integrasa puede ser la proteína Coat del bacteriófago MS2 si el primer dominio de unión es la proteína Coat del fago PP7.
Según una segunda realización, que no forma parte de la presente invención, la divulgación se refiere a una partícula retrovírica que contiene una proteína procedente de la poliproteína Gag, preferentemente una proteína de la nucleocápside, una proteína de envoltura, una integrasa y al menos dos ARN no víricos encapsidados, conteniendo cada uno de los ARN no víricos encapsidados, una secuencia de ARN de interés unida a una secuencia de encapsidación, siendo reconocida cada secuencia de encapsidación por un dominio de unión introducido en la integrasa y, opcionalmente, por un dominio de unión introducido en la proteína procedente de la poliproteína, preferentemente una proteína de la nucleocápside.
Esta segunda realización permite una expresión transitoria de los ARN de interés, sin eventos de integración asociados en el genoma de las células diana.
Preferentemente, en esta segunda realización, la secuencia de la integrasa se ha mutado en el dominio del extremo C para insertar la secuencia del dominio de unión.
Ventajosamente, el dominio de unión es un dominio heterólogo. Más particularmente, el dominio de unión es la proteína Coat del bacteriófago MS2, del fago PP7 o del fato Qp, la proteína nun del profago HK022, la proteína U1A o también la proteína hPum.
Preferentemente, la secuencia de la integrasa se ha mutado en el dominio del extremo C para introducir el de la proteína "Coat" del bacteriófago MS2 o del fago PP7.
Los al menos dos ARN no víricos pueden presentar o no la misma secuencia de encapsidación.
Asimismo, los al menos dos ARN no víricos encapsidados pueden presentar o no la misma secuencia de ARN de interés.
Preferentemente, los al menos dos ARN no víricos encapsidados se distinguen por su secuencia de ARN de interés, es decir, que las secuencias de ARN de interés comprendidas en los dos ARN no víricos encapsidados son diferentes. Más particularmente, los al menos dos ARN no víricos presentan la misma secuencia de encapsidación, siendo esta reconocida por el dominio de unión introducido en la integrasa.
Es posible encapsidar al menos dos ARN no víricos, preferentemente tres ARN no víricos.
De acuerdo con una realización particular de la segunda realización, se introduce un segundo dominio de unión en la integrasa de la partícula retrovírica de acuerdo con la divulgación.
Como ejemplo, el segundo dominio de unión puede ser la proteína "Coat" del bacteriófago MS2 cuando el primer dominio de unión es la proteína "Coat" del fago PP7 o el segundo dominio de unión puede ser la proteína "Coat" del fago PP7 cuando el primer dominio de unión es la proteína "Coat" del bacteriófago MS2.
En ese caso, al menos dos ARN no víricos encapsidados contienen secuencias de encapsidación diferentes, correspondiendo cada secuencia de encapsidación respectivamente al primer y al segundo dominio de unión introducido en la integrasa.
Más particularmente, cuando tres ARN no víricos se han encapsidado:
- al menos dos de los ARN no víricos encapsidados presentan la misma secuencia de encapsidación correspondiente al primer dominio de unión, pudiéndose opcionalmente distinguir estos dos ARN no víricos por su secuencia de ARN de interés,
- el tercer ARN no vírico encapsidado puede llevar una secuencia de encapsidación igual o diferente. Cuando la secuencia de encapsidación es diferente, esta puede corresponder a un segundo dominio de unión introducido en la integrasa.
En la integrasa también pueden introducirse otros dominios de unión.
Además del uno o más dominios de unión introducidos en la integrasa, es también posible introducir un dominio de unión en la proteína de la nucleocápside.
Entonces, la proteína de la nucleocápside es una proteína quimérica, procedente de un gen gag quimérico.
En ese caso, los al menos dos ARN no víricos encapsidados pueden llevar secuencias de encapsidación diferentes, correspondiendo cada secuencia de encapsidación a los dominios de unión introducidos en la integrasa y en la proteína de la nucleocápside, respectivamente.
Más particularmente, cuando tres ARN no víricos se han encapsidado:
- al menos dos de los ARN no víricos encapsidados presentan la misma secuencia de encapsidación correspondiente al primer dominio de unión introducido en la integrasa, pudiéndose opcionalmente distinguir estos ARN no víricos por su secuencia de ARN de interés,
- el tercer ARN no vírico encapsidado lleva una secuencia de encapsidación diferente, correspondiendo a un segundo dominio de unión introducido en la proteína de la nucleocápside.
En la proteína de nucleocápside también pueden introducirse otros dominios de unión.
Ventajosamente, la partícula retrovírica de acuerdo con la divulgación es una partícula lentivírica.
Cuando la partícula retrovírica es una partícula lentivírica, es posible expresar transitoriamente los ARN de interés, sin eventos de integración asociados en el genoma de las células diana, especialmente en células quiescentes.
En efecto, además de su papel en la propia reacción de integración, la integrasa (IN) participa en diferentes etapas del ciclo de replicación de los retrovirus, tales como la morfogénesis de la partícula vírica, la transcripción inversa y la importación nuclear del complejo de preintegración (PIC, del inglés, pre-integration complex).
Más particularmente, en los lentivirus, la integrasa contiene secuencias de localización nuclear (NLS, del inglés nuclear localization sequences) que permiten su localización en el núcleo mediante el PIC. Por consiguiente, cuando la encapsidación de los ARN no víricos se realiza mediante un dominio de unión llevado por una integrasa de lentivirus, los ARN no víricos encapsidados se transportarán al núcleo de la célula diana. En efecto, según esta segunda realización, durante la puesta en contacto de una partícula lentivírica con una célula diana, la membrana de la partícula y la de la célula diana se van a fusionar y a permitir la liberación del contenido de la cápside en la célula diana. La integrasa se hace cargo posteriormente de los ARN que, mediante los PIC, permitirá la importación de los ARN al núcleo. Esta forma de hacerse cargo es especialmente interesante en determinadas aplicaciones, tales como la expresión en células quiescentes. En el caso de las partículas retrovíricas, distintas a los lentivirus, la integrasa no contiene estas NLS y por tanto se encuentra localizada en el citoplasma. No obstante, es posible añadir las secuencias NLS a este tipo de integrasa para inducir una localización nuclear de la integrasa y, por lo tanto, de los ARN de los que la integrasa se ha hecho cargo.
Esta forma de hacerse cargo también es especialmente útil para un sistema CRISPR, que utiliza guías de ARN que se acaban de hibridar específicamente con el genoma de la célula diana. Una vez hibridadas, estas guías de ARN guían una endonucleasa (Cas9), que permitirá la modificación de un locus específico del genoma de la célula diana.
Más particularmente, en una partícula lentivírica de ese tipo:
- el dominio de unión es la proteína "Coat" del bacteriófago MS2,
- la secuencia de encapsidación de los ARN no víricos es una secuencia tallo-bucle de MS2,
- la integrasa es una proteína enzimática quimérica cuya secuencia se ha mutado en el dominio del extremo C para insertar la secuencia de la proteína "Coat" del bacteriófago MS2.
O, más particularmente, en una partícula lentivírica de ese tipo:
- el dominio de unión es la proteína "Coat" del fago PP7,
- la secuencia de encapsidación de los ARN no víricos es una secuencia tallo-bucle de PP7,
- la integrasa es una proteína enzimática quimérica cuya secuencia se ha mutado en el dominio del extremo C para insertar la secuencia de la proteína "Coat" del fago PP7.
Opcionalmente, el segundo dominio de unión introducido en la nucleocápside puede ser la proteína Coat del fago PP7 si el primer dominio de unión es la proteína Coat del bacteriófago MS2, o el segundo dominio de unión introducido en la integrasa puede ser la proteína Coat del bacteriófago MS2 si el primer dominio de unión es la proteína Coat del fago PP7.
En efecto, la integrasa (IN) está compuesta por 3 dominios funcionales diferentes, cada uno de ellos indispensable para garantizar una reacción de integración completa. El dominio del extremo N contiene un motivo de tipo dedo de cinc que estabiliza la estructura plegada de la IN y aumenta la actividad catalítica de la enzima. El dominio central de la IN contiene el motivo de aminoácidos DDE al que se le atribuye la actividad catalítica de la enzima. Este dominio central también está implicado en el reconocimiento de la secuencia nucleotídica conservada en cada extremo del ADN retrovírico. El dominio del extremo C es el menos conservado entre la familia de los retrovirus. Tiene la actividad de unión con el ADN y es indispensable para las reacciones de maduración de los extremos 3' de transferencia de hebra. Además de su papel en la propia reacción de integración, la IN participa en diferentes etapas del ciclo de replicación de los retrovirus, tales como la morfogénesis de la partícula vírica, la transcripción inversa y la importación nuclear del complejo de preintegración.
Como se describe en Petit et al. (1999; J. Virol. P5079-5088), la inserción de una secuencia exógena en el extremo C de la IN no altera las etapas de producción y de transducción de las células diana, mientras que una misma inserción en el extremo N no permite la detección de un evento de transducción.
Por tanto, la partícula retrovírica se ha modificado para contener la proteína "Coat" del bacteriófago MS2 en fusión con la proteína de la integrasa (véase la Figura I) o con la proteína "Coat" del fago PP7 (véase la Figura XXXVII). El plásmido de encapsidación p8.74, que lleva el gen pol que codifica la proteína de la integrasa, se modificó para insertar la secuencia que codifica la proteína Coat en el extremo C de la integrasa mediante PCR de ensamblaje. El plásmido p8.74 se linealiza mediante PCR, y después, la secuencia Coat, previamente amplificada mediante PCR, se clona en el extremo C de la integrasa, directamente de extremo a otro, o bien mediante la adición de un enlazador (linker).
Ventajosamente:
- La proteína de envoltura es la proteína VEV-G que codifica la proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular.
- La secuencia de encapsidación contiene de 2 a 25 repeticiones de la secuencia tallo-bucle de MS2 y/o de PP7, dependiendo del dominio de unión introducido, preferentemente, de 2 a 18 repeticiones, más preferentemente de 2 a 18 repeticiones, tal como de 6 a 18 repeticiones de la secuencia tallo-bucle, más preferentemente aún para la secuencia tallo-bucle de MS2, de 10 a 14, por ejemplo, 12 repeticiones.
- Preferentemente, la secuencia tallo-bucle es la siguiente: ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N°1) cuando el dominio de unión es la proteína Coat de MS2 y/o la secuencia tallo-bucle es la siguiente: ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N°5) cuando el dominio de unión es la proteína Coat de PP7.
En los siguientes ejemplos se describen más detalladamente varios ejemplos de partículas lentivíricas de acuerdo con la invención.:
- una partícula MS2RLP o MS2 (NC)-RLP 12X es una partícula lentivírica formada por la encapsidación de los ARN que llevan el motivo tallo-bucle del bacteriófago MS2, repetido 12 veces, por la inserción de la proteína Coat del bacteriófago MS2 en la nucleocápside,
- una partícula MS2 (NC)-RLP 2X es una partícula lentivírica formada por la encapsidación de los ARN que llevan el motivo tallo-bucle del bacteriófago MS2, repetido 2 veces, por la inserción de la proteína Coat del bacteriófago MS2 en la nucleocápside,
- una partícula MS2 (NC)-RLP 6X es una partícula lentivírica formada por la encapsidación de los ARN que llevan el motivo tallo-bucle del bacteriófago MS2, repetido 6 veces, por la inserción de la proteína Coat del bacteriófago MS2 en la nucleocápside,
- una partícula PP7 (Nc )-RLP 2X es una partícula lentivírica formada por la encapsidación de los ARN que llevan el motivo tallo-bucle del fago PP7, repetido 2 veces, por la inserción de la proteína Coat del fago PP7 en la nucleocápside,
- una partícula PP7 (NC)-RLP 6X es una partícula lentivírica formada por la encapsidación de los ARN que llevan el motivo tallo-bucle del fago PP7, repetido 6 veces, por la inserción de la proteína Coat del fago PP7 en la nucleocápside,
- una partícula PP7RLP o PP7 (NC)-RLP 12X es una partícula lentivírica formada por la encapsidación de los ARN que llevan el motivo tallo-bucle del fago PP7, repetido 12 veces, por la inserción de la proteína Coat del fago PP7 en la nucleocápside.
Preferentemente, la partícula lentivírica formada por la encapsidación de los ARN lleva un motivo tallo-bucle del bacteriófago MS2 o del fago PP7, repetido de 2 a 25 veces, aún más preferentemente 2, 6 o 12 veces.
Más preferentemente aún, la partícula de acuerdo con la invención se selecciona entre MS2 (NC)-RLP 12X, PP7 (NC)-RLP 6X y PP7 (NC)-RLP 2X.
La invención también se refiere a composiciones que contienen partículas según la invención.
Más particularmente, las composiciones de acuerdo con la invención son composiciones concentradas. Ventajosamente, las composiciones también están purificadas. Estas composiciones se pueden concentrar y purificar según el procedimiento descrito en la solicitud WO2013/014537.
Normalmente, las composiciones de acuerdo con la invención contienen menos del 30 % de contaminantes del ADN y menos del 45 % de contaminantes proteicos con respecto al sobrenadante bruto. Más particularmente, las composiciones de acuerdo con la invención contienen menos del 30 % de contaminantes del a Dn y menos del 2 % de contaminantes proteicos con respecto al sobrenadante bruto.
Por "sobrenadante bruto", se entiende que es el sobrenadante de uno o más cultivos celulares, que, después su clarificación, contiene las partículas retrovíricas de acuerdo con la invención. Una etapa de clarificación de ese tipo se describe más especialmente a continuación en los procedimientos de fabricación de las partículas de acuerdo con la invención. Cuando la recuperación del sobrenadante se realiza en varias veces, el sobrenadante bruto corresponde entonces al conjunto de sobrenadantes recogidos, reunidos (o "agrupados") y posteriormente clarificado.
Opcionalmente, las composiciones de acuerdo con la invención contienen menos del 1 % de contaminantes del ADN y menos del 1 % de contaminantes proteicos con respecto al sobrenadante bruto.
La invención también se refiere a kits de producción de las partículas retrovíricas de acuerdo con la invención y a los procedimientos de fabricación de dichos kits, como se define en las reivindicaciones.
Más particularmente, la presente divulgación se refiere a un kit de producción de partículas de acuerdo con la invención, que contiene:
(i) un plásmido de expresión que contiene al menos una secuencia de interés, para la cual, antes o después de esta secuencia, se inserta una secuencia de encapsidación,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína procedente de la poliproteína Gag y/o una integrasa, quimérica, que contiene un dominio de unión que permite reconocer una secuencia de encapsidación, y, (iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
Un kit de ese tipo también puede contener un prospecto para la utilización de los plásmidos contenidos en el kit. Más específicamente, cuando el kit tiene como objeto producir partículas retrovíricas de acuerdo con la primera realización, este kit de acuerdo con la invención contiene:
(i) un plásmido de expresión que codifica al menos dos secuencias de ARN no víricas diferentes, conteniendo cada secuencia de ARN, una secuencia de interés para la cual, antes o después de esta secuencia de interés, se ha insertado una secuencia de encapsidación, o como alternativa, un primer y un segundo plásmido de expresión que codifica, cada uno de ellos, una secuencia de ARN no vírica diferente que contiene una secuencia de interés y, antes o después de dicha secuencia de interés, se ha insertado una secuencia de encapsidación,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína quimérica de la nucleocápside que contiene un dominio de unión que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y,
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
Las al menos dos secuencias de ARN no víricas son diferentes, porque las secuencias de interés son diferentes y/o porque las secuencias de encapsidación son diferentes.
Preferentemente, el kit que produce las partículas de acuerdo con la primera realización contiene:
(i) un plásmido de expresión que contiene al menos dos secuencias de interés, para las cuales, antes o después de cada una de estas secuencias, se ha insertado una secuencia de encapsidación, o como alternativa, un primer y un segundo plásmido de expresión que contiene, cada uno de ellos, una secuencia de interés antes o después de la cual se ha insertado una secuencia de encapsidación, siendo las secuencias de interés diferentes y siendo las secuencias de encapsidación iguales,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína quimérica de la nucleocápside que contiene un dominio de unión que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y,
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura. Ventajosamente, el kit produce partículas lentivíricas.
Preferentemente:
- En el plásmido de expresión, la secuencia de encapsidación contiene de 2 a 25 repeticiones de la secuencia tallobucle de MS2, preferentemente de 6 a 18 repeticiones de la secuencia tallo-bucle, aún más preferentemente de 10 a 14, por ejemplo, 12 repeticiones. Ventajosamente, la secuencia tallo-bucle es la siguiente: ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N°1).
- En el plásmido de encapsidación, la proteína de la nucleocápside es la proteína de la nucleocápside (NC) del VIH que pertenece a la poliproteína Gag, cuya NC se ha mutado en el segundo dedo de cinc para insertar la secuencia de la proteína "Coat" del bacteriófago MS2.
- En el plásmido de envoltura, la proteína de envoltura es la proteína VEV-G que codifica la proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular.
O, preferentemente:
- En el plásmido de expresión, la secuencia de encapsidación contiene de 2 a 25 repeticiones de la secuencia tallobucle de PP7, preferentemente, de 2 a 18 repeticiones de la secuencia tallo-bucle, aún más preferentemente de 2 a 12, por ejemplo, 6 repeticiones. Ventajosamente, la secuencia tallo-bucle es la siguiente: ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N°5).
- En el plásmido de encapsidación, la proteína de la nucleocápside es la proteína de la nucleocápside (NC) del VIH que pertenece a la poliproteína Gag, cuya NC se ha mutado en el segundo dedo de cinc para insertar la secuencia de la proteína "Coat" del fago PP7.
- En el plásmido de envoltura, la proteína de envoltura es la proteína VEV-G que codifica la proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular.
Opcionalmente, el kit incluye un segundo plásmido de encapsidación que codifica una integrasa quimérica que contiene un dominio de unión que permite reconocer una secuencia de encapsidación. El segundo dominio de unión puede ser igual o diferente al dominio de unión de la proteína quimérica de la nucleocápside.
Como ejemplo de dominios de unión diferentes:
- el dominio de unión introducido en la nucleocápside puede ser la proteína Coat de MS2 y el dominio de unión introducido en la integrasa puede ser la proteína Coat de PP7, o
- el dominio de unión introducido en la nucleocápside puede ser la proteína Coat de PP7 y el dominio de unión introducido en la integrasa puede ser la proteína Coat de MS2.
En cada una de las proteínas quiméricas se pueden introducir varios dominios de unión.
Como alternativa, cuando el kit, que no forma parte de la invención, tiene como objeto producir las partículas de acuerdo con la segunda realización, este kit contiene:
(i) un plásmido de expresión que contiene al menos una secuencia de interés, para la cual, antes o después de esta secuencia, se inserta una secuencia de encapsidación,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una integrasa quimérica que contiene un dominio de unión que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y,
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
También se proponen procedimientos de fabricación de los kits de acuerdo con la invención. Normalmente, un procedimiento de fabricación de un kit de acuerdo con la divulgación incluye:
(i) la preparación de un plásmido de expresión que contiene al menos una secuencia de interés, para la cual, antes o después de esta secuencia, se inserta una secuencia de encapsidación
(ii) la preparación de un plásmido de encapsidación que codifica una proteína procedente de la poliproteína Gag y/o una integrasa, quimérica, que contiene un dominio de unión que permite reconocer una secuencia de encapsidación, y
la preparación de un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
Más específicamente, cuando el procedimiento se refiere a un kit que tiene como objeto producir partículas retrovíricas de acuerdo con la primera realización, este procedimiento de acuerdo con la invención incluye:
(i) la preparación de un plásmido de expresión que codifica al menos dos secuencias de ARN no víricas diferentes, conteniendo cada secuencia de ARN, una secuencia de interés para la cual, antes o después de esta secuencia de interés, se ha insertado una secuencia de encapsidación, o como alternativa, un primer y un segundo plásmido de expresión que codifica, cada uno de ellos, una secuencia de ARN no vírica diferente que contiene una secuencia de interés, y en la que antes o después de la secuencia de interés, se ha insertado una secuencia de encapsidación,
(ii) la preparación de un plásmido de encapsidación que codifica una proteína quimérica de la nucleocápside que contiene un dominio de unión que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y,
(iii) la preparación de un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
Las al menos dos secuencias de ARN no víricas son diferentes, porque las secuencias de interés son diferentes y/o porque las secuencias de encapsidación son diferentes.
Preferentemente, este procedimiento incluye:
(i) la preparación de un plásmido de expresión que contiene al menos dos secuencias de interés, para las cuales, antes o después de cada una de estas secuencias, se ha insertado una secuencia de encapsidación, o como alternativa, de un primer y de un segundo plásmido de expresión que contiene, cada uno de ellos, una secuencia de interés antes o después de la cual se ha insertado una secuencia de encapsidación,
siendo las secuencias de interés diferentes y siendo las secuencias de encapsidación iguales,
(ii) la preparación de un plásmido de encapsidación que codifica una proteína quimérica de la nucleocápside que contiene un dominio de unión que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y
(iii) la preparación de un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
Como alternativa, cuando el procedimiento se refiere a un kit que tiene como objeto producir las partículas de acuerdo con la segunda realización, no formando parte este procedimiento de la invención, incluye:
(i) la preparación de un plásmido de expresión que contiene al menos una secuencia de interés, para la cual, antes o después de esta secuencia, se inserta una secuencia de encapsidación,
(ii) la preparación de un plásmido de encapsidación que codifica una integrasa quimérica que contiene un dominio de unión que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y,
(iii) la preparación de un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
La invención también se refiere a procedimientos de fabricación de partículas retrovíricas de acuerdo con la invención. Un procedimiento de acuerdo con la presente divulgación, incluye una etapa de cotransfección de las células con: (i) un plásmido de expresión que contiene al menos una secuencia de interés, para la cual, antes o después de esta secuencia, se inserta una secuencia de encapsidación,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína procedente de la poliproteína Gag y/o una integrasa quimérica que contiene un dominio de unión que permite reconocer una secuencia de encapsidación, y, (iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
y la recuperación del sobrenadante de las células transfectadas que contienen las partículas.
Las células empleadas en los procedimientos de fabricación de las partículas de acuerdo con la invención, son células productoras, es decir, células, que una vez transfectadas con los plásmidos que contienen el material genético necesario para la formación de las partículas retrovíricas, permiten la formación de dichas partículas. Como ejemplo de células productoras, se puede citar HEK293T.
Por "etapa de cotransfección", se entiende una etapa de transfección durante la cual la transfección se realiza poniendo en contacto las células productoras con el conjunto de los plásmidos del procedimiento de fabricación de las partículas.
Más específicamente, cuando el procedimiento de fabricación de acuerdo con la invención tiene como objeto producir partículas retrovíricas de acuerdo con la primera realización, este incluye una etapa de cotransfección de las células con:
(i) un plásmido de expresión que codifica al menos dos secuencias de ARN no víricas diferentes, conteniendo cada secuencia de ARN, una secuencia de interés para la cual, antes o después de esta secuencia de interés, se ha insertado una secuencia de encapsidación, o como alternativa, un primer y un segundo plásmido de expresión que codifica, cada uno de ellos, una secuencia de ARN no vírica diferente que contiene una secuencia de interés, y en la que antes o después de la secuencia de interés, se ha insertado una secuencia de encapsidación, (ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína quimérica de la nucleocápside que contiene un dominio de unión que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y,
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura,
y la recuperación del sobrenadante de las células transfectadas que contienen las partículas.
Las al menos dos secuencias de ARN no víricas son diferentes, porque las secuencias de interés son diferentes y/o porque las secuencias de encapsidación son diferentes.
Preferentemente, este procedimiento de fabricación de partículas incluye una etapa de cotransfección de las células con:
(i) un plásmido de expresión que contiene al menos dos secuencias de interés, para las cuales, antes o después de cada una de estas secuencias, se ha insertado una secuencia de encapsidación, o como alternativa, un primer y un segundo plásmido de expresión que contiene, cada uno de ellos, una secuencia de interés antes o después de la cual se ha insertado una secuencia de encapsidación,
siendo las secuencias de interés diferentes y siendo las secuencias de encapsidación iguales,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína quimérica de la nucleocápside que contiene un dominio de unión que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y,
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura,
y la recuperación del sobrenadante de las células transfectadas que contienen las partículas.
Como alternativa, cuando el procedimiento de fabricación tiene como objeto producir las partículas de acuerdo con la segunda realización, no formando parte este procedimiento de la invención, incluye una etapa de cotransfección de las células con:
(i) un plásmido de expresión que contiene al menos una secuencia de interés, para la cual, antes o después de esta secuencia, se inserta una secuencia de encapsidación,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una integrasa quimérica que contiene un dominio de unión que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y,
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura,
y la recuperación del sobrenadante de las células transfectadas que contienen las partículas.
Preferentemente, todos los procedimientos de fabricación de partículas retrovíricas de acuerdo con la invención, se realizan según los procedimientos descritos en la solicitud WO2013/014537.
Más particularmente, estos procedimientos de fabricación de partículas retrovíricas se realizan en células productoras cultivadas en medio sin suero y no se realiza ninguna inducción con butirato de sodio.
Ventajosamente, el sobrenadante se recoge en varias veces, por ejemplo, entre 3 y 6 veces, a intervalos de tiempo específicos, tales como a intervalos de tiempo del orden de la semivida de las partículas retrovíricas. Normalmente, la recuperación del sobrenadante se realiza en 4 a 5 veces, a intervalos de tiempo del orden de 6 a 18 h, preferentemente de 8 a 16 h, tales como 8 h, 12 h y/o 16 h. Preferentemente, esta recogida se realiza después de cambiar el medio de cultivo de las células, realizándose este cambio preferentemente 24 h después de la transfección.
Los procedimientos de fabricación de las partículas retrovíricas de acuerdo con la invención, también incluyen una etapa en la que se clarifica el sobrenadante.
Preferentemente, la clarificación del sobrenadante se realiza por centrifugación.
Más preferentemente aún, estos procedimientos de fabricación de partículas retrovíricas de acuerdo con la invención, incluyen, además, una etapa en la que el sobrenadante se concentra y/o se purifica.
Preferentemente, la concentración y la purificación se realizan mediante ultrafiltración frontal en unidades de centrifugación.
Ventajosamente, el sobrenadante se somete a una o más etapas de purificación adicionales. Estas etapas de purificación se realizan preferentemente mediante ultrafiltración tangencial y/o diafiltración. Más preferentemente aún, el sobrenadante se somete a una etapa de ultrafiltración tangencial seguida de una etapa de diafiltración.
La ultrafiltración tangencial se realiza ventajosamente en cartuchos de fibras huecas de polisulfona.
Opcionalmente, la composición se puede someter después a una etapa de cromatografía de intercambio iónico, en particular, una cromatografía de intercambio aniónico. Después, el eluido de esta etapa de cromatografía se recupera y se vuelve a concentrar mediante ultrafiltración frontal en unidades centrales de centrifugación. Una composición resultante de un procedimiento de ese tipo contiene menos del 1 % de contaminantes del ADN y menos del 1 % de contaminantes proteicos, con respecto al sobrenadante bruto.
La presente divulgación también se refiere a composiciones que se pueden obtener según uno cualquiera de los procedimientos de fabricación de partículas de acuerdo con la invención.
Normalmente, estas composiciones contienen menos del 30 % de contaminantes del ADN y menos del 45 % de contaminantes proteicos, con respecto al sobrenadante bruto. Más particularmente, las composiciones de acuerdo con la divulgación contienen menos del 30 % de contaminantes del ADN y menos del 2 % de contaminantes proteicos con respecto al sobrenadante bruto.
Opcionalmente, las composiciones de acuerdo con la divulgación contienen menos del 1 % de contaminantes del ADN y menos del 1 % de contaminantes proteicos con respecto al sobrenadante bruto.
Finalmente, la invención se refiere al uso de una partícula de acuerdo con la invención, o de una composición de acuerdo con la invención para transducir células.
El uso de las partículas y de las composiciones de acuerdo con la invención, es especialmente ventajoso para transducir células primarias y líneas inmortalizadas, para modificarlas de forma transitoria. Las células pueden ser células de mamíferos u otras células eucariotas. En particular, la transducción de estas células se puede realizar in vitro o ex vivo.
La invención se entenderá mejor teniendo en cuenta los siguientes ejemplos proporcionados con fines ilustrativos, con referencia a las figuras, que representan, respectivamente:
- La figura I es un esquema que ilustra la modificación del plásmido de encapsidación lentivírico p8.74 para insertar un dominio de unión en la secuencia de la integrasa, utilizándose este plásmido de encapsidación para la producción de partículas lentivíricas de acuerdo con la presente divulgación;
- La figura II muestra diferentes esquemas de construcciones de un plásmido de expresión que lleva, como secuencia de ARN de interés, la luciferasa (fig. IIa), un indicador fluorescente (fig. IIb) o CRE (fig. IIc), utilizándose estos plásmidos de expresión para la producción de partículas lentivíricas MS2RLP de acuerdo con la invención; - La figura III muestra un esquema que ilustra la modificación del plásmido de encapsidación lentivírico p8.74 para insertar un dominio de unión MS2 Coat en la secuencia de la nucleocápside (IIIa) y la construcción plasmídica resultante (IIIb), utilizándose este plásmido de encapsidación para la producción de partículas lentivíricas MS2RLP de acuerdo con la invención;
- La figura IV es un esquema de construcción de un plásmido de envoltura;
- La figura V muestra diferentes esquemas de construcciones de un plásmido de expresión lentivírico integrador que lleva, como secuencia de ARN de interés, la luciferasa (fig. Va), un indicador fluorescente (fig. Vb) o CRE (fig. Vc); - La figura VI es un esquema de construcción de un plásmido de encapsidación, utilizándose este plásmido de encapsidación para la producción de vectores lentivíricos integradores (ILV, siglas del inglés integrating lentiviral vectors);
- La figura VII es un esquema de construcción de un plásmido de encapsidación, utilizándose este plásmido de encapsidación para la producción de vectores lentivíricos deficientes para la integración (IDLV, siglas del inglés integrating deficient lentiviral vectors);
- La figura VIII ilustra la cinética de expresión de ZsGreenl en células HCT116 transducidas mediante vectores lentivíricos (ILV, IDLV) y partículas lentivíricas MS2RLP de acuerdo con la invención;
- La figura IX ilustra la cinética de expresión de la luciferasa en células HCT116 transducidas mediante vectores lentivíricos (ILV, IDLV) y partículas lentivíricas MS2RLP de acuerdo con la invención y transfectadas con un plásmido de expresión de la luciferasa (pLuc);
- La figura X ilustra el efecto de la dosis sobre la expresión de la luciferasa después de la transducción de fibroblastos del prepucio (en inglés foreskin) mediante vectores ILV y partículas lentivíricas MS2RLP de acuerdo con la invención;
- La figura XI ilustra el impacto de la pureza (producción con o sin suero) de una composición de partículas lentivíricas MS2RLP de acuerdo con la invención, sobre la transducción de fibroblastos del prepucio;
- La figura XII ilustra el impacto de la pureza (producción con o sin suero) de una composición de partículas lentivíricas MS2RLP de acuerdo con la invención, sobre la transducción de células HCT116;
- La figura XIII ilustra el impacto de la presencia de BX795 durante la transducción de fibroblastos del prepucio con partículas lentivíricas MS2RLP de acuerdo con la invención y los vectores ILV;
- La figura XIV ilustra el impacto de la presencia de BX795 durante la transducción de células HCT116 con partículas lentivíricas MS2RLP de acuerdo con la invención y los vectores ILV;
- Las figuras XV, XVI y XVII, ilustran la cinética de expresión de la luciferasa mediante bioluminiscencia in vivo, en ratones, después de la inyección de una suspensión purificada o no de partículas MS2RLP de acuerdo con la invención y de una suspensión purificada de vectores ILV, la figura XV muestra fotografías de cada animal en tiempos determinados, siendo las figuras XVI y XVII gráficos que representan las mediciones de expresión de la luciferasa, a esos mismos tiempos;
- La figura XVIII es un diagrama que ilustra la extinción de la fluorescencia en células HCT116-Lox-dsRed-Lox transducidas con los vectores ILV o las partículas MS2RLP de acuerdo con la invención, o transfectadas con los plásmidos pCre, que permiten la expresión de la recombinasa Cre;
- La figura XIX es un diagrama que ilustra la cuantificación del número de copias de ADN de Cre en las células HCT116-Lox-dsRed-Lox después de la transducción con los vectores ILV o las partículas MS2RLP de acuerdo con la invención, o transfectadas con los plásmidos pCre;
- La figura XX ilustra la cinética de transferencia de varios ARN (ARN de ZsGreenl mCherry mtBFP) a las células HCT116 con las partículas MS2RLP de acuerdo con la invención;
- La figura XXI muestra una comparación entre la cinética de transferencia de varios ARN (ARN de ZsGreenl mCherry mtBFP) a las células HCT116 con las partículas MS2RLP de acuerdo con la invención o vectores IDLV; - La figura XXII ilustra la cinética de transferencia de varios ARN (ARN de ZsGreenl mCherry mtBFP) a las células HCT116 con los vectores integradores ILV;
- La figura XXIII ilustra el impacto del procedimiento de producción de las partículas MS2(NC)-RLP-12X ZsGreenl en las células HCT116, 48 h después de la transfección;
- La figura XXIV muestra el esquema del plásmido de expresión que lleva, como secuencia de ARN de interés, la luciferasa utilizada en la producción de las partículas lentivíricas MS2 (NC)-RLP 2X, que comprende el motivo tallobucle MS2 repetido 2 veces, de acuerdo con la invención;
- La figura XXV muestra el esquema del plásmido de expresión que lleva, como secuencia de ARN de interés, la luciferasa utilizada en la producción de las partículas lentivíricas MS2 (NC)-RLP 6X, que comprende el motivo tallobucle MS2 repetido 6 veces, de acuerdo con la invención;
- La figura XXV i muestra el esquema del plásmido de expresión que lleva, como secuencia de ARN de interés, la luciferasa utilizada en la producción de las partículas lentivíricas MS2RLP, que comprende el motivo tallo-bucle MS2 repetido 12 veces, de acuerdo con la invención;
- La figura XXVII muestra la cinética de transferencia del ARN de la luciferasa a células HCT116 transducidas con las partículas lentivíricas MS2 (NC)-RLP-Luc, que comprende el motivo tallo-bucle MS2 repetido 2 veces, 6 veces o 12 veces, de acuerdo con la invención, a una dosis de 10 pg de p24/célula;
- La figura XXVIII muestra un esquema del plásmido de encapsidación utilizado en la producción de las partículas lentivíricas MS2 (IN)-RLP de acuerdo con la presente divulgación, obtenido mediante la modificación del plásmido de encapsidación lentivírico p8.74 para insertar un dominio de unión en la secuencia de la integrasa, como se describe en la Figura I;
- La figura XXIX muestra la cinética de transferencia del ARN de la luciferasa a células HCT116 transducidas con las partículas lentivíricas MS2 (IN)-RLP-Luc, que comprende el motivo tallo-bucle MS2 repetido 2 veces, 6 veces o 12 veces, de acuerdo con la presente divulgación, a una dosis de 5 pg de p24/célula;
- La figura XXX muestra el esquema del plásmido de expresión que lleva, como secuencia de ARN de interés, la luciferasa utilizada en la producción de las partículas lentivíricas PP7RLP, que comprende el motivo tallo-bucle PP7 repetido 12 veces, de acuerdo con la invención;
- La figura XXXI muestra un esquema que ilustra la modificación del plásmido de encapsidación lentivírico p8.74 para insertar un dominio de unión PP7 Coat en la secuencia de la nucleocápside;
- La figura XXXII muestra el esquema del plásmido de encapsidación utilizado en la producción de las partículas lentivíricas PP7 (NC)-RLP de acuerdo con la invención;
- La figura XXXIII ilustra el efecto de la dosis de las partículas PP7 (NC)-RLP-Luc 12X de acuerdo con la invención, sobre la transducción de células HCT116;
- La figura XXXIV muestra un esquema del plásmido de expresión con el motivo tallo-bucle PP7 repetido 2 veces, que comprende el casete de expresión de la luciferasa (Figura XXXIVa) o de un indicador fluorescente (Figura XXXIVb) para la producción de las partículas PP7 (NC)-RlP 2X de acuerdo con la invención o PP7 (IN)-Rl P 2X de acuerdo con la presente divulgación;
- La figura XXXV muestra un esquema del plásmido de expresión de la luciferasa con el motivo tallo-bucle PP7 repetido 6 veces, para la producción de las partículas PP7 (NC)-RLP 6X de acuerdo con la invención o PP7 (III)-RLP 6X de acuerdo con la presente divulgación;
- La figura XXXVI muestra la cinética de transferencia del ARN de la luciferasa a células HCT116 transducidas con las partículas PP7 (NC)-RLP-Luc, cuyo motivo tallo-bucle PP7 está repetido 2 veces, 6 veces o 12 veces, a una dosis de 10 pg de p24/célula;
- La figura XXXVII muestra un esquema de la modificación del plásmido de encapsidación lentivírico p8.74 para insertar un dominio de unión en la secuencia de la integrasa;
- La figura XXXVIII muestra un esquema del plásmido de encapsidación utilizado en la producción de las partículas lentivíricas PP7 (III)-RLP de acuerdo con la presente divulgación, obtenido mediante la modificación del plásmido de encapsidación lentivírico p8.74 mostrado en la Figura XXXVII;
- La figura XXXIX ilustra la cinética de transferencia del ARN de la luciferasa a células HCT116 transducidas con las partículas lentivíricas PP7 (IN)-RLP-Luc, que comprende el motivo tallo-bucle PP7 repetido 2 veces, 6 veces o 12 veces, de acuerdo con la presente divulgación, a una dosis de 2,8 pg de p24/célula; y
- La figura XL ilustra la transferencia de los ARN de ZsGreenl mCherry mtBFP con las partículas PP7 (NC)-RLP 2X a las células HCT116.
EJEMPLO 1: Construcción de partículas lentivíricas MS2RLP
I. Material y Métodos
1. Construcciones de plásmidos
1.1 Plásmidos para la producción de partículas lentivíricas MS2RLP
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: El plásmido de expresión lleva un casete de expresión promotor-secuencia de interés-poliA (véase la Figura II) con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARNm a las partículas lentivíricas, se insertaron 12 repeticiones del motivo tallo-bucle del ARN de MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N°1) dentro de un casete de expresión después del gen indicador. El promotor utilizado puede ser el del CMV (citomegalovirus) (Figura IIa) o el del e F1 (factor de elongación 1) (Figuras IIb y IIc), aunque se pueden usar otros promotores. La secuencia de interés puede ser un ADN que codifique una proteína indicadora como la luciferasa de luciérnaga natural (Figura IIa), una proteína fluorescente verde (ZsGreenl), (Figura IIb), roja (mCherry) o azul (mtBFP), o un ADNc que codifique una proteína, por ejemplo, la proteína CRE (Figura IIc). La secuencia de interés también puede ser la de un ARNhc, un miARN, un ARNsg, un ARNLcn o un ARNcirc.
• Plásmido de encapsidación: La partícula lentivírica se modificó para contener, dentro de la proteína de la nucleocápside, en lugar del segundo dominio en dedo de Zn, la secuencia de la proteína "Coat" del bacteriófago MS2. El plásmido de encapsidación p8.74 (Figura III), que llevaba los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales(Gag, Pol), utilizado en la producción de las partículas MS2RLP, se modificó según la estrategia ilustrada en la Figura IIIa: este plásmido p8.74 se utilizó para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido desprovisto del segundo dedo de cinc de la proteína de la nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de cinc se sustituyó por la proteína Coat del fago MS2 mediante clonación de Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-MS2-Coat. De este modo se obtiene la construcción ilustrada en la Figura IIIb. La secuencia que codifica la proteína Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales, tales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT, del inglés transcriptase inverse) o la integrasa (IN) sin alterar la función de las MS2RLP.
• Plásmido de la envoltura (pENV): Este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser la VSVG que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura IV).
1.2 Plásmidos para la producción de vectores lentivíricos integradores ILV
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: El plásmido de expresión lleva un casete de expresión promotor-secuencia de interés (Figura V). Este plásmido puede contener otros elementos, tales como la secuencia natural WPRE (siglas del inglés Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element, elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota) o también la secuencia cPPT/CTS (siglas del inglés Central Polypurine Tract/Central Termination Sequence, tracto polipurínico central/secuencia de terminación central). La patogenicidad vírica se eliminó sustituyendo regiones del genoma vírico, necesarias para la replicación retrovírica, por el transgén.
• Plásmido de encapsidación: El plásmido de encapsidación p8.74, que llevaba los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), se utilizó para la producción de vectores lentivíricos integradores (Figura VI).
• Plásmido de la envoltura (pENV): Este plásmido es idéntico al plásmido de envoltura utilizado para la producción de las partículas lentivíricas MS2RLP (Figura IV).
1.3 Plásmidos para la producción de vectores lentivíricos deficientes para la integración IDLV: mutante D64L
Los 3 plásmidos son los mismos que los descritos en el punto 1.2, excepto el plásmido de encapsidación que comprende una mutación D64L de la secuencia pol que codifica la integrasa (Figura VII). Esta mutación en un solo aminoácido, induce una inhibición de la integración (Nightingale et al., 2006 y Apolonia et al., 2007). La mutación D64L en la integrasa (IN) se introdujo en el plásmido de encapsidación p8.74 por mutagénesis dirigida. La mutación se comprobó mediante secuenciación.
1.4 Plásmidos pLuc y pCre
Estos plásmidos de expresión son similares a los utilizados en la producción de los vectores ILV y IDLV (Figura Vb para pLuc y Figura Vc para pCre), utilizados directamente en transfección para el control.
2. Producciones de los lotes
Después de la transfección de los plásmidos a las células, los sobrenadantes se recogieron y se utilizaron en bruto o se concentraron/purificaron según el procedimiento descrito en la solicitud WO 2013/014537.
2.1 Producción de vectores lentivíricos y de partículas lentivíricas
Las producciones se realizaron en 10 etapas CellSTACK (6360 cm2, Corning) con células HEK293T (ATCC, CRL-11268), cultivadas en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco, Paisley, Reino Unido) complementado con penicilina/estreptomicina al 1 % y una ultraglutamina (PAA) al 1 % a 37 °C en una atmósfera húmeda con CO2 al 5 %. Para el experimento del estudio del impacto del suero, el DMEM se complementó con SBF al 10 %. En particular, no se realizó ninguna inducción con butirato de sodio. Para cada lote (MS2RLP, ILV y IDLV), la mezcla de transfección estaba compuesta por los tres plásmidos siguientes:
- Uno de los plásmidos de expresión anteriormente descritos, dependiendo de si se forma una partícula (MS2RLP) o un vector (ILV, IDLV),
- p8.74AZF Coat (MS2RLP), p8.74 (ILV) o p8.74 mutado en la posición D64L (IDLV), y
- pENV que lleva la envoltura VEV-G.
Veinticuatro (24) horas después de la transfección estándar con fosfato de calcio, el sobrenadante del cultivo se sustituyó por medio DMEM reciente no complementado. Las células se incubaron a 37 °C/ CO2 al 5 %. Después de cambiar el medio, el sobrenadante se recogió cuatro veces (32 h, 48 h, 56 h y 72 h después de la transfección). Cada recuperación se clarificó mediante centrifugación durante 5 min a 3000 g antes de microfiltrarse sobre el filtro de 0,45 |jm (Stericup, Millipore). Después, todas las recuperaciones se mezclaron para constituir el sobrenadante bruto.
2.2 Concentración y purificación de vectores lentivíricos y de partículas lentivíricas
Los vectores y las partículas se concentraron y se purificaron según uno de los dos procedimientos siguientes:
• El procedimiento P1 tiene como objeto realizar una ultrafiltración frontal del sobrenadante en unidades centrales de centrifugación.
• El procedimiento P2 tiene como objeto realizar una ultrafiltración tangencial y, a continuación, una diafiltración del sobrenadante. El sobrenadante bruto se concentró y se purificó mediante ultrafiltración tangencial utilizando cartuchos de fibras huecas de polisulfona. El sobrenadante se trató por diafiltración para 20 diavolúmenes en modo continuo frente a tampón DMEM o TSSM. Después de la diafiltración, el retenido se recuperó, y después se volvió a concentrar mediante ultrafiltración frontal en unidades centrales de centrifugación.
3. Titulación
3.1 Titulación de las partículas funcionales mediante qPCR.
Las células HCT116 (ATCC, CCL-247) se sembraron en placas de 96 pocillos en 100 j l de DMEM complementado con SBF al 10 %, 100 jg/m l de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina y L-Gln 2 mM y después se incubaron durante 24 h a 37 °C/CO2 al 5 %. Se realizaron seis diluciones en serie para cada vector, así como para un patrón interno. Las células se transdujeron con estas diluciones en serie en presencia de Polybrene® 8 jg/m l (Sigma) y después se incubaron durante tres días a 37°°C/CO2 al 5 %. Para cada serie de muestras, como control, se añadió un pocillo de células no transducidas. A continuación, las células se tripsinizaron y después de la extracción del ADN genómico, el título (Unidad de Transducción/ml) se determinó mediante qPCR (del inglés quantitative Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa, cuantitativa) utilizando el kit de extracción de ADNg tisular Nucleospin (Macherey-Nagel). El título obtenido (UT/ml) mediante qPCR se normalizó con un patrón interno cuyo título se había determinado anteriormente mediante FACS (siglas del inglés, Fluorescence-Activated Cell Sorting, clasificación de células activadas por fluorescencia).
3.2 Cuantificación de las partículas físicas mediante ensayo ELISA con p24.
La proteína p24 de la cápside, se detectó directamente en el sobrenadante vírico usando y siguiendo las recomendaciones del kit de ensayo ELISA de la proteína p24 del VIH-1 (Perkin Elmer). La proteína p24 capturada se complejó con un anticuerpo policlonal biotinilado, y después se detectó mediante estreptavidina conjugada con HRP (del inglés horseradish peroxidase, peroxidasa de rábano picante). El complejo resultante se detectó mediante espectrofotometría después de incubación con el sustrato orto-fenilendiamina-HCl (OPD) que produce una coloración amarilla que es directamente proporcional a la cantidad de proteína p24 capturada. La absorbancia de capa pocillo se cuantificó con el lector de placas Synergy H1 Hybrid (Biotek) y se calibró frente a la absorbancia de una gama patrón de proteína p24. El título vírico, expresado en partículas físicas por ml, se calculó a partir de la concentración de proteína p24 obtenida, sabiendo que 1 pg de proteína p24 corresponde a 104 partículas físicas.
4. Monotransducción
Este ejemplo tiene como objeto ajustar las condiciones de la monotransducción con los vectores lentivíricos o las partículas lentivíricas anteriormente producidos.
5. Cinética de expresión de la proteína ZsGreenl
Las células HCT116 sembradas el día anterior a 25000 células/cm2 en una placa de 24 pocilios (Corning), se transdujeron a 100000 PF/célula en presencia de 8 pg/ml de Polybrene®. Después de 8 h y 24 h de la transducción, las células se tripsinizaron y se analizaron mediante citometría de flujo para medir el porcentaje de células fluorescentes. Cada experimento se realizó por triplicado.
6. Cinética de expresión de la luciferasa
6.1 Células HCT116
Las células HCT116 (ATCC, CCL-247) se sembraron en placas de 6 o 24 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C/CO2 al 5 %. La transducción con los vectores ILV, IDLV o con las partículas MS2RLP, se realizó en presencia de 4 pg/ml de Polybrene. El sobrenadante de transducción se eliminó 4 horas después y se sustituyó por medio de cultivo reciente complementado. Después de 4 h a 24 h de la transducción, las células se recuperaron, y la expresión de la luciferasa se analizó usando el kit de ensayo de Luciferasa OneGlo (Promega) siguiendo las recomendaciones del proveedor y usando el lector de placas Synergy H1 Hybrid (Biotek). Este ensayo se realizó por triplicado. En paralelo, las células HCT116 se transfectaron con el plásmido pLuc. Para ello, 50000 células HCT116 se transfectaron con 2,6 pg del plásmido pLuc usando PEI PRO® (Polyplus Transfection).
6.2 Fibroblastos del prepucio
Fibroblastos del prepucio, sembrados el día anterior a 10000 células/cm2 en una placa de 6 pocillos (Corning), se transdujeron en presencia de 4 pg/ml de Polybrene®. Las células se transdujeron a 200000 y 500000 PF/célula con las MS2RLP-Luc, o a una MOI de 5 con un vector lentivírico integrador Luc.
Les células transducidas con las MS2RLP-Luc se tripsinizaron 8 h después de la transducción y se transfirieron a una placa de 96 pocillos, de fondo negro opaco en 100 pl de medio completo. Las células transducidas con las ILV Luc se tripsinizaron 24 h después de la transducción y se transfirieron a una placa de 96 pocillos, de fondo negro opaco en 100 pl de medio completo. Tres (3) minutos antes de la lectura con el luminómetro, se añadieron 100 pl de reactivo One Glo Luciferase (Promega) a cada pocillo a analizar.
6.3 En ratones
Se realizaron mediciones de cinética de expresión de la luciferasa mediante bioluminiscencia in vivo.
Se compararon tres grupos de ratones Balb/c macho, un primer grupo recibió una suspensión del vector lentivírico de tipo integrador rLV-EF1-Luc purificado (n=2), un segundo grupo recibió una suspensión de partículas MS2RLP-Luc (n=4) producidas según el procedimiento P2, un último grupo recibió una suspensión de partículas MS2RLP-Luc (n=4) producidas según el procedimiento P1. Un animal no inyectado sirvió como control negativo para la determinación del ruido de fondo.
Las mediciones se realizaron de 5 h a 24 h (Figura XV A) y de 48 h a 168 h (Figura XV B) después de la inyección sistémica. Cada medición de la expresión de la luciferasa se realizó 15 minutos después de la inyección intraperitoneal de 300 mg/kg de D-luciferina (Promega) con una cámara Andor, y el programa informático de adquisición de imágenes Solis. El tiempo de adquisición fue de 5 minutos y las imágenes resultantes se trataron y se normalizaron con el programa informático ImageJ. La figura XV muestra las imágenes de cada animal en tiempos determinados. Las gráficas (Figuras XVI y XVII) representan las medidas de la expresión de la luciferasa, en unidades relativas de luminiscencia (URL) a estos mismos tiempos.
7. Impacto de la pureza de las partículas para la transducción
7.1 Fibroblastos del prepucio
Fibroblastos del prepucio sembrados el día anterior a 10000 células/cm2 en una placa de 24 pocillos CellBind (Corning), se transdujeron en presencia de 4 pg/ml de Polybrene®. Las células se transdujeron a 500000 PF/célula con dos calidades distintas de sobrenadantes: lote producido en presencia de suero y posteriormente obtenido según el procedimiento P2 frente al lote producido sin suero y posteriormente obtenido según el procedimiento P2. Ocho (8) horas después de la transducción, las células se tripsinizaron y se transfirieron a una placa de 96 pocillos, de fondo negro opaco en 100 pl de medio completo. Tres (3) minutos antes de la lectura con el luminómetro, se añadieron 100 pl de reactivo One Glo Luciferase (Promega) a cada pocillo a analizar.
7.2 Células HCT116
Las células sembradas el día anterior a 25000 células/cm2 en una placa de 24 pocilios CelIBind (Corning), se transdujeron en presencia de 4 pg/ml de Polybrene®. Las células se transdujeron a 100000 PF/célula con dos calidades distintas de sobrenadantes: lote producido en presencia de suero y posteriormente obtenido según el procedimiento P1 frente al lote producido sin suero y posteriormente obtenido según el procedimiento P1. Ocho (8) horas después de la transducción, las células se tripsinizaron y se transfirieron a una placa de 96 pocillos, de fondo negro opaco en 100 pl de medio completo. Tres (3) minutos antes de la lectura con el luminómetro, se añadieron 100 pl de reactivo One Glo Luciferase (Promega) a cada pocillo a analizar.
8. Influencia de BX795
8.1 Fibroblastos del prepucio
Fibroblastos del prepucio sembrados el día anterior a 10000 células/cm2 en una placa de 6 pocillos CellBind (Corning), se transdujeron en presencia de 4 pg/ml de Polybrene®. Las células se transdujeron a 500000 PF/célula para las partículas MS2RLP, y a una MOI de 5 para las ILV. Ocho (8) horas después de la transducción, las células se tripsinizaron y se transfirieron a una placa de 96 pocillos, de fondo negro opaco en 100 pl de medio completo. Tres (3) minutos antes de la lectura con el luminómetro, se añadieron 100 pl de reactivo One Glo Luciferase (Promega) a cada pocillo a analizar.
8.2 Células HCT116
Células HCT116 sembradas el día anterior a 25000 células/cm2 en una placa de 6 pocillos CellBind (Corning), se transdujeron en presencia de 4 pg/ml de Polybrene®. Las células se transdujeron a 100000 PF/célula para las partículas MS2RLP, y a una MOI de 5 para las ILV. Ocho (8) horas después de la transducción, las células se tripsinizaron y se transfirieron a una placa de 96 pocillos, de fondo negro opaco en 100 pl de medio completo. Tres (3) minutos antes de la lectura con el luminómetro, se añadieron 100 pl de reactivo One Glo Luciferase (Promega) a cada pocillo a analizar.
9. Expresión in vitro de la recombinasa CRE
En primer lugar, células HCT116 (ATCC, CCL-247) se transdujeron con el vector lentivírico ILV-EF1-Lox-dsRed-Lox a una MOI de 20 en presencia de 4 pg/ml de Polybrene. Seis días después, esta población policlonal se clonó mediante dilución limitante sembrando las células en una placa de 96 pocillos a razón de 0,5 células por pocillo. La línea monoclonal HCT116-lox-dsRed-lox-clon 14, se seleccionó mediante citometría (MACS Quant VYB, Miltenyi), basándose en el nivel de expresión de la dsRed.
En un segundo momento, las líneas de células policlonales y monoclonales se transdujeron con los vectores ILV-Cre a una MOI de 5 o con las partículas MS2RLP-Cre a una dosis de 25 Partículas Físicas (PF)/célula, en presencia de 4 pg/ml de Polybrene®.
Las células policlonales y monoclonales HCT116-Lox-dsRed-Lox transducidas con las partículas MS2RLP-Cre o con los vectores ILV-Cre, se incubaron a 37 °C/CO2 al 5 % durante 14 días. Catorce (14) días después de la transducción, la expresión de la dsRed se analizó mediante citometría de flujo. Las células no transducidas (NT) sirven como control. Este experimento se realizó por triplicado. En paralelo, las células policlonales y monoclonales HCT116-Lox-dsRed-Lox se transfectaron con el plásmido pCre. Para ello, 50000 células HCT116-Lox-dsRed-Lox se transfectaron con 2,6 pg del plásmido pCre usando PEI PRO ® (Polyplus Transfection).
Después de la extracción del ADN de las células HCT116-Lox-dsRed-Lox transducidas con los vectores ILV-Cre o con las partículas MS2RLP-Cre, o transfectadas con el plásmido pCRE, el número de copias integradas en las células se midió con qPCR mediante la detección de una secuencia corta de la recombinasa Cre: gcatttctggggattgcttataacaccctgttacgtatagccgaaattgccaggatcagggttaaagatatctca cgtactgacggtgggagaat (SEQ ID N°2) con el siguiente par de oligonucleótidos de qPCR:
Q-CRE-F: 5-GCATTTCTGGGGATTGCTTA-3' (SEQ ID N°3)
Q-CRE-R: 5'-ATTCTCCCACCGTCAGTACG-3' (SEQ ID N°4).
II. Resultados
1. Niveles de producción de partículas lentivíricas
Los primeros experimentos consistieron en comparar los respectivos niveles de producción de las partículas MS2RLP, de los vectores IDLV o ILV. Se produjeron lotes de cada tipo de partículas, y los títulos de las partículas se midieron con un ensayo Elisa de p24. Los resultados se presentan en la Tabla 1 siguiente:
T l 1: Tí l l v r ILV IDLV-D 4L l r í l M 2RLP
Figure imgf000020_0001
Estos resultados muestran que los tres tipos de partículas presentan títulos equivalentes (PF/ml /-) después de la concentración mediante la misma técnica de ultrafiltración tangencial. Las modificaciones de encapsidación o la mutación de la integrasa no conducen, por lo tanto, a un déficit de producción de partículas lentivíricas.
2. Cinética de expresión en las células diana.
Se realizó una primera serie de ensayos con partículas MS2RLP que llevaban un solo tipo de ARN que codificaba una proteína fluorescente verde (ZsGreenl) caracterizada por un tiempo de semivida largo. Los resultados obtenidos con las partículas MS2RLP se presentan en la figura VIII y muestran que la transferencia de los ARN se detectó de forma temprana (8 h después de la transducción). Los resultados obtenidos muestran un porcentaje de células HCT116 positivas comparable a las 24 horas para las partículas lentivíricas MS2RLP o los vectores lentivíricos ILV o IDLV-D64L. El porcentaje de células positivas es detectable desde las 8 horas para las para partículas MS2RLP, pero solamente a partir de las 24 horas para los vectores ILV e IDLV-D64L. Por tanto, estas partículas MS2RLP son funcionales y muestran una capacidad equivalente a la de un ILV o un IDLV-D64L para introducir una secuencia codificante en una población de células.
En el caso de un sistema lentivírico integrador, los ARN se retrotranscribieron con la RT. En este caso, el ADN se translocó al núcleo antes de su integración en el genoma de la célula hospedadora. Sólo en esta etapa tiene lugar la transcripción y después la traducción del transgén. En el caso de un sistema lentivírico no integrador (mutación en la IN), los ARN se retrotranscribieron con la RT. En ese caso, el ADN se translocó al núcleo antes de transcribirse a ARN y traducirse después a una proteína.
Sólo las partículas MS2RLP permiten una expresión temprana del transgén, debido a la ausencia de cualquier etapa intermedia. El ARN suministrado se traduce directamente en una proteína a través de la maquinaria celular.
Se realizó una segunda serie de ensayos con partículas MS2RLP que llevaban un solo tipo de ARN que codificaba la luciferasa (Luc) caracterizada por un tiempo de semivida corto. Los resultados obtenidos con las partículas MS2RLP se presentan en la Figura IX y muestran que la actividad óptima de la luciferasa también se detecta de forma temprana.
La expresión de la luciferasa es transitoria, ya que disminuye progresivamente de 8 h a 24 h. Por el contrario, la expresión de la fluorescencia permanece detectable incluso estable en este tipo de cinética. Estos resultados deben tener en cuenta el tiempo de semivida de la proteína indicadora utilizada. Es evidente que la detección del gen indicador es proporcional a este tiempo de semivida. Cuanto más largo sea este último, mayor será la actividad relacionada con la proteína.
En la Figura X, también se puede observar que la intensidad de expresión de la luciferasa varía en función de la relación PF/célula utilizada durante la transducción. Este efecto de la dosis se demuestra especialmente en los fibroblastos del prepucio.
Por lo tanto, es importante poder alcanzar dosis elevadas de partículas MS2RLP a aplicar a las células a transducir, para inducir un nivel de expresión significativo que se pueda traducir en una actividad biológica. La concentración de partículas parece ser un factor clave del éxito. En los fibroblastos del prepucio, la expresión de la luciferasa inducida con partículas a una dosis elevada, es decir, 500000 PF/célula, es equivalente a la obtenida con vectores lentivíricos integradores clásicos a una multiplicidad de infección (MOI) de 5. La determinación de la dosis óptima para la transducción de las HCT116 con las partículas MS2RLP, se realizó en las mismas condiciones que para los fibroblastos del prepucio, comprobando las dosis de 50000, 100000 y 200000 PF/célula. La dosis elegida es de 100000 PF/célula, para la cual se obtiene la mejor transferencia del ARN de la luciferasa. Estos resultados demuestran que el método de transducción debe adaptarse en función de la permisividad de las células diana.
Estos resultados se confirmaron mediante experimentos de inyección in vivo de partículas MS2RLP-Luc que mostraron una detección de la expresión de la luciferasa, 5 horas después de la inyección.
3. Impacto de la producción y de la pureza de la suspensión de partículas MS2RLP sobre la eficacia de transducción.
Dependiendo del tipo de diana celular, es importante poder aumentar la dosis de las partículas para obtener un número importante de células que expresen los ARN transportados. Es posible aumentar la dosis de las partículas sin alterar la viabilidad de las células diana utilizando partículas purificadas, como se muestra en la solicitud WO 2013/014537. En efecto, la pureza final del lote de partículas lentivíricas se ve afectada por la presencia de suero bovino fetal (SBF).
Para evaluar el impacto de la pureza de la suspensión de partículas MS2RLP sobre la expresión de la luciferasa, los autores compararon la expresión de la luciferasa en función de la pureza de dos tipos de lotes de sobrenadante:
- Un sobrenadante concentrado a partir de partículas MS2RLP producidas con suero,
- Un sobrenadante concentrado a partir de partículas MS2RLP producidas sin suero.
Este estudio se realizó al mismo tiempo en células inmortalizadas y permisivas HCT116 (Figura XII) y en células primarias menos permisivas y delicadas, los fibroblastos del prepucio (Figura XI).
Los resultados obtenidos demuestran que la pureza del lote tiene un impacto importante sobre la eficacia de transducción de células primarias delicadas a una dosis elevada. A 500000 PF/célula, el efecto de la pureza es considerable ya que la actividad de la luciferasa aumenta casi un 80 % con el lote producido sin suero (Figura XI). En cambio, en presencia de SBF, hay una disminución de la expresión de la luminiscencia.
En células inmortalizadas HCT116 muy resistentes, el impacto de la pureza no es detectable sobre la actividad de la luciferasa (Figura XII). En cambio, el lote producido en presencia de suero, muestra resultados más heterogéneos, lo que muestra una reproducibilidad mucho más baja que con el lote producido sin suero. Este resultado justifica, por lo tanto, la elección de producir los lotes de partículas en ausencia de suero.
Estos experimentos demuestran, por una parte, la necesidad de concentrar estas partículas lentivíricas para obtener un nivel de expresión importante compatible con la inducción de un fenotipo celular y tisular y, por otra, el impacto de la pureza de estos lotes sobre la eficacia de la transferencia de genes.
4. Identificación de las condiciones óptimas para la transferencia de genes mediante las partículas MS2RLP.
Para aumentar la eficacia de la transferencia de ARN, se aplicaron los resultados obtenidos por Sutlu et al. (2012) para aumentar la eficacia de la transducción de los linfocitos citolíticos naturales NK (del inglés Natural Killer). Más particularmente, se propuso la hipótesis de que las respuestas antivíricas basadas en el receptor de tipo Toll (TLR, Toll-like receptor) y/o de tipo RIG-I (RLR), podrían limitar la eficacia de la transferencia de ARN a determinadas células. Para probar esta hipótesis, se utilizó un inhibidor de moléculas pequeñas de señalización TLR y RLR durante la puesta en contacto de las células con las partículas MS2RLP. La molécula BX795 es un inhibidor del complejo TBK1/IKKe, que actúa como mediador común en las rutas de señalización de RIG-I, MDA-5 y TLR3.
El uso de la molécula BX795 a una concentración de 6 pM aumentó considerablemente la eficacia de transducción de las células HCT116 (Figura XIV) y de los fibroblastos del prepucio (Figura XIII). Los tiempos de observación (8 h para las partículas MS2RLP, 24 h para los ILV) tienen en cuenta el funcionamiento de cada partícula (Figuras VIII y IX). Se puede observar un efecto sinérgico entre las partículas MS2RLP y el uso de BX795 tanto en las células HCT116 como en los fibroblastos del prepucio, mientras que BX795 induce un efecto negativo con los vectores lentivíricos integradores ILV en estos dos tipos de células. Este efecto puede estar relacionado con un diferencial del número de moléculas de ARN suministradas por estos dos tipos de partículas.
5. Estudio de la transferencia de genes mediante las partículas MS2RLP de la luciferasa in vivo.
La inyección in vivo de partículas MS2RLP-Luc tiene como objeto poner de manifiesto la cinética de expresión de un transgén, en este caso, de la luciferasa, en los diferentes órganos de ratones inyectados por vía sistémica. Como control positivo se utilizó una suspensión purificada de vectores integradores ILV-EF1-Luc. Las mediciones se realizaron a partir de las 5 h y hasta 7 días después de la inyección. La administración intravenosa genera una dilución de la suspensión inyectada y, por lo tanto, una difusión de la señal de bioluminiscencia que debe tenerse en cuenta. Por lo tanto, los análisis se realizan en la totalidad del animal para tener en cuenta la distribución de la señal en todo el organismo. Se sometieron a ensayo una suspensión de partículas MS2RLP-Luc producidas según el procedimiento P1 en presencia de suero y una suspensión de partículas MS2RLP-Luc purificada según el procedimiento P2. La inyección de la suspensión de partículas MS2RLP-Luc, según el procedimiento P1 en presencia de suero, en el que la purificación es menos exhaustiva, provocó dificultades tanto en el muestreo como en la inyección. En efecto, esta suspensión de partículas MS2RLP-Luc, obtenida mediante el procedimiento P1 en presencia de suero, se caracteriza por una suspensión de color marrón de viscosidad elevada que es especialmente difícil de extraer con una aguja de 29G utilizada para inyecciones in vivo. Esta dificultad aparece en el momento de suministrar la suspensión en la vena de la cola. El uso de la suspensión de partículas MS2RLP-Luc obtenida mediante un procedimiento P1 en presencia de suero, tiene como consecuencia una mala administración de las partículas que se encuentran localizadas en la zona caudal del animal (es decir, en el lugar de inyección) y que no pasan a la circulación general del animal (Figura XV A), tiempo H5 y H8 del grupo "MS2RLP-Luc producidas según el procedimiento P1 en presencia de suero"). Por lo tanto, la suspensión de partículas MS2RLP-Luc obtenida mediante un procedimiento P1 en presencia de suero, no se puede utilizar en el ámbito de estudios in vivo.
La suspensión purificada de partículas MS2RLP-Luc pudo administrarse normalmente, y produce una expresión de la luciferasa de 818 URL 5 horas después de la inyección. Esta señal es siempre visible a las 8 horas, y después desaparece en un momento posterior (Figuras XV A, XVI y XVII), grupo "MS2RLP-Luc purificada"). La señal de bioluminiscencia se encuentra principalmente en el hígado y el bazo (Figura XV A), grupo "MS2RLP-Luc purificada"). Por comparación, a las 5 horas, la luminiscencia medida en los animales que habían recibido la suspensión purificada de vectores víricos integradores ILV-EF1-Luc, no es significativa porque la transcripción inversa y la integración son abortivas para estos tiempos cortos. En cambio, en una fase temprana (5 horas después de la inyección), la señal obtenida con la suspensión purificada de partículas MS2RLP-Luc, es significativa y ha alcanzado un nivel de expresión dos veces mayor que la señal obtenida con la suspensión purificada de vectores víricos integradores ILV-EF1-Luc. La suspensión purificada de partículas MS2RLP-Luc alcanzó, al cabo de 5 horas, un nivel de expresión equivalente al de la suspensión purificada de vectores víricos integradores ILV-EF1-Luc al cabo de 168 h (Figuras XV B y XVI) grupo "ILV-EF1-Luc purificada"). La suspensión purificada de partículas MS2RLP-Luc permite obtener in vivo una expresión transitoria optimizada y equivalente a un nivel de expresión resultante de un mecanismo integrador de transducción lentivírica. La expresión es transitoria debido a la no integración del transgén en el genoma de las células. Por tanto, el procedimiento de concentración/purificación permite obtener suspensiones de partículas MS2RLP eficaces después de la inyección in vivo.
6. Comparación de la funcionalidad de diferentes partículas
Las células HCT116-Lox-dsRed-Lox se generaron previamente mediante transducción con un vector lentivírico integrador que llevaba la siguiente secuencia: EF1-Lox-DsRed-Lox. Tras obtener una línea fluorescente policlonal, se obtuvo una línea monoclonal por dilución limitante. Se debe observar que el número de copias integradas de la secuencia Lox-DsRed-Lox se cuantificó mediante qPCR en las líneas policlonal y monoclonal. El número medio de copias integradas es de 6 para la línea policlonal y de 13 para la línea monoclonal.
Estas dos líneas se transdujeron con partículas MS2RLP que llevaban la secuencia que codificaba la enzima recombinasa Cre. En paralelo, estas células HCT116-Lox-dsRed-Lox se transdujeron con vectores lentivíricos ILV que llevaban la misma secuencia Cre.
Las células policlonales y monoclonales HCT116-Lox-dsRed-Lox transducidas con las partículas MS2RLP-Cre, y los vectores ILV-Cre, se incubaron a 37 °C/CO2 al 5 % durante 14 días antes del análisis con el citómetro. Los resultados de cuantificación del porcentaje de células fluorescentes mediante citometría de flujo se presentan en la Figura XVIII. Los resultados muestran una casi desaparición de la fluorescencia entre las poblaciones policlonal y monoclonal que se habían puesto en contacto con las partículas MS2RLP-Cre. En efecto, el porcentaje de células fluorescentes pasó del 100 % a menos del 10 %. El resultado es mucho menos eficaz con los vectores integradores ILV-Cre (15 % de disminución) así como en la condición de transfección del plásmido pCre (ninguna disminución).
Los eventos de integración después de la transferencia de ácidos nucleicos que codifican la recombinasa CRE en las células HCT116 mediante las partículas MS2RLP-Cre, mediante los vectores ILV-Cre o mediante los plásmidos pCre, se han verificado. Con este objetivo, los inventores cuantificaron el número de copias residuales del genoma contenido en los diferentes tipos de partículas y plásmidos, en las células HCT116-Lox-dsRed-Lox puestas en contacto con los vectores ILV, las partículas MS2RLP o los plásmidos que codificaban la proteína CRE. Con este objetivo, los ADN totales de las células HCT116 silvestres y modificadas se prepararon 6 y 14 días después de la transducción, y el ADN que codificaba la recombinasa CRE se midió con una qPCR.
Los resultados presentados en la Figura XIX muestran que, con los vectores lentivíricos integradores, el número de eventos de integración es de 4 copias por célula al cabo de 6 días. Este número es coherente con la multiplicidad de infección (MOI) utilizada. El control de la transfección muestra un gran número de copias de ADN a los 6 días, lo que corresponde a la detección del plásmido presente en las células, después de la desaparición total de las copias de ADN Cre a los 14 días, debido a la ausencia de integración del plásmido en el genoma de las células diana.
Con las partículas MS2RLP, no se detectó ningún evento de integración. En efecto, puesto que la expresión no depende de la transcriptasa inversa ni de los extremos LTR, estas partículas suministran el ARN dentro de las células diana, que se traduce directamente en proteínas, o bien es transportado por una proteína en el núcleo de las células y no genera ninguna especie de ADN.
EJEMPLO 2: Transferencia de varios ARN diferentes mediante transducción única con partículas MS2RLP
I. Material y Métodos
1. Monotransducción y tritransducción
Este ejemplo se realizó utilizando partículas MS2RLP o vectores IDLV que permiten la transferencia de un solo tipo de ARN que permite la expresión de una sola proteína (ZsGreenl, mCherry o mtBFP), o la transferencia de varios tipos de ARN que permiten la expresión de varias proteínas diferentes (ZsGreenl mCherry mtBFP).
Las partículas MS2RLP y los vectores lentivíricos no integradores IDLV se produjeron en las siguientes condiciones:
- Las partículas se produjeron mediante transfección de células HEK293T con un solo plásmido de expresión que codificaba las proteínas ZsGreenl o mCherry o mtBFP (como se describe en el ejemplo 1), además de los plásmidos de encapsidación y de la envoltura,
- las partículas se produjeron mediante transfección de células HEK293T con tres plásmidos de expresión que codificaban, respectivamente, las proteínas ZsGreenl, mCherry y mtBFP, añadidos en una cantidad equimolar, para una cantidad total de plásmidos de expresión equivalente a la cantidad total de plásmidos de expresión utilizada para una producción de partícula con un solo plásmido de expresión, además de los plásmidos de encapsidación y de la envoltura.
Las células HCT116 se transdujeron con las partículas MS2RLP, es decir:
- por transducción con los 3 tipos de partículas MS2RLP ZsGreenl, mCherry o mtBFP, independientemente, - por monotransducción con las partículas producidas con los tres plásmidos de expresión que codifican las proteínas ZsGreenl, mCherry y mtBFP simultáneamente.
En paralelo, las células HCT116 se transdujeron con vectores IDLV, es decir:
- por transducción con los 3 tipos de vectores IDLV ZsGreenl, mCherry o mtBFP, independientemente,
- por monotransducción con los vectores IDLV producidos con los tres plásmidos de expresión que codifican las proteínas ZsGreenl, mCherry y mtBFP simultáneamente.
El porcentaje de células fluorescentes se cuantificó mediante citometría de flujo.
Las células HCT116 (ATCC, CCL-247) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C/CO2 al 5 %. La transducción con las partículas MS2RLP o con los vectores IDLV, se realizó en presencia de 4 pg/ml de Polybrene. En diferentes momentos después de la transducción (8 h, 24 h y 48 h), las células se recuperaron y el porcentaje de células que expresaban las proteínas ZsGreenl, mCherry y mtBFP, se cuantificó mediante citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec). Se utilizó un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (InvivoGen), a una concentración de 6 pM. Cada experimento se realizó por triplicado.
II. Resultados
1. Capacidad para transferir varios ARN diferentes en una sola transducción con partículas MS2RLP
El objetivo de los siguientes experimentos es demostrar la capacidad de las partículas MS2RLP para transferir varios ARN diferentes al interior de células diana, permitiendo así reducir el número de transducciones a las células diana. De este modo, es posible transferir diversos ARN diferentes en una sola transducción en lugar de tener que realizar una transducción por especie de ARN. Para ello, los autores generaron lotes purificados de partículas MS2RLP, según las condiciones óptimas definidas en el ejemplo 1, es decir, lotes purificados, producidos sin suero, según el procedimiento descrito en la solicitud WO 2013/014537. Durante la fase de producción de las partículas MS2RLP, se utilizaron tres tipos de plásmidos que codificaban indicadores fluorescentes, simultáneamente en cantidad equimolar (ZsGreenl, mCherry y mtBFP), con los plásmidos de encapsidación y de la envoltura, para obtener un lote de partículas MS2RLP que incluyese varios tipos de ARN diferentes. Después, las células HCT116 se transdujeron en presencia de BX795, y la transferencia de los diferentes ARN se observó al cabo de 8, 24 y 48 horas después de la transducción.
La Figura XX ilustra la proporción de células trifluorescentes de color verde, rojo y azul, después de una sola transducción de células HCT116 con partículas MS2RLP a dos dosis diferentes (100000 PF/célula y 300000 PF/célula), o después de tres transducciones simultáneas de partículas MS2RLP que expresan las proteínas ZsGreenl o mCherry o mtBFP producidas según el ejemplo 1, a una dosis final de 300000 PF/célula.
A diferencia de los resultados del ejemplo 1, que muestran que es posible detectar la expresión de una sola proteína fluorescente o luminiscente a las 8 horas, la expresión de las tres fluorescencias 8 h después de la transducción no es detectable, a una dosis de 100000 PF/célula. En cambio, el 48 % de las células son trifluorescentes a las 24 h después de la transducción. Esta proporción de células trifluorescentes aumenta, hasta el 60 % a las 48 h después de la transducción. Por lo tanto, los resultados muestran que las partículas MS2RLP, pueden transportar y transferir al menos 3 tipos de ARN en una sola transducción de células diana.
La determinación de la dosis óptima de partículas por célula es importante, ya que se observa que el aumento de la dosis de partículas MS2RLP se traduce en una disminución del número de células trifluorescentes (Figura XX, 300 000 PF/célula) en particular 48 horas después de la transducción. En efecto, si la proporción de células trifluorescentes a 300000 PF/célula es ligeramente mayor a las 8 h después de la transducción (5 % de células trifluorescentes) que a 100000 PF/célula, la proporción de células trifluorescentes comienza a disminuir a 24 h después de la transducción, pasando de un 48 % a un 40 % de células trifluorescentes. Esta diferencia de eficacia de transferencia entre las dos dosis utilizadas es incluso más importante a las 48 h después de la transducción: en efecto, se observa un 43 % de células trifluorescentes para la dosis de 300000 PF/célula frente a un 60 % de células trifluorescentes para la dosis de 100000 PF/célula.
En paralelo, se realizaron tres transducciones simultáneas de células HCT116 con lotes de partículas MS2RLP producidas individualmente según el ejemplo 1. La dosis utilizada fue de 100000 PF/células para cada tipo de fluorescencia, es decir, una dosis total de 300000 PF/célula. Los resultados muestran que el porcentaje de células trifluorescentes obtenido para tres transducciones simultáneas de partículas que llevan solamente una especie de ARN, es menos importante que el inducido por una sola transducción con partículas que llevan las 3 especies de ARN. En efecto, solamente el 7 % de células trifluorescentes se detectaron a las 8 h después de la transducción, después, un 20 % de células trifluorescentes a las 24 h después de la transducción, es decir, solamente un 42 % del nivel obtenido con la transducción única a 100000 PF/célula y un 50% del nivel obtenido con la transducción única a 300 000 PF/célula; y finalmente un 23 % de células trifluorescentes a las 48 h después de la transducción, es decir, un 38 % del porcentaje obtenido con la transducción única a 100000 PF/célula y un 54 % del porcentaje obtenido con la transducción única a 300000 PF/célula. En conclusión, la tritransducción no permite conseguir porcentajes de células tricoloreadas tan elevados como los obtenidos con las tres transducciones simultáneas.
La puesta de manifiesto de la capacidad de transferencia de diferentes tipos de ARN en una sola transducción de un mismo lote de partículas MS2RLP, representa una mejora significativa respecto de la transferencia simultánea de estos ARN diferentes a células diana. Esta novedosa propiedad de las partículas MS2RLP, que tiene como consecuencia directa la optimización del número de transducciones a realizar, permite que la viabilidad de las células diana no se vea comprometida tanto por un exceso de transducción como por el contacto de las células con demasiadas partículas.
2. Comparación con un vector IDLV
Los mismos experimentos del punto 1 anterior se reprodujeron con otro tipo de partículas en paralelo: un vector vírico deficiente para la integración (IDLV) debido a una mutación en la posición 64 de la secuencia que codifica la integrasa.
La Figura XXI ilustra la proporción de células trifluorescentes de color verde, rojo y azul, después de una sola transducción de células Hc T116 con partículas MS2RLP producidas con los 3 plásmidos de expresión ZsGreenl, mCherry y mtBFP, en comparación con tres transducciones de células HCT116 con vectores IDLV que expresan las proteínas ZsGreen o mCherry o mtBFP producidos según el ejemplo 1, a una dosis total de 300000 PF/célula.
Los vectores IDLV se produjeron en las mismas condiciones que las partículas MS2RLP para permitir una transducción única, a la misma dosis que la utilizada para las partículas MS2RLP. Veinticuatro (24) horas después de la transducción única a una dosis de 100000 PF/célula, la proporción de células trifluorescentes es ligeramente mayor en el caso de utilizar los vectores IDLV con respecto a la obtenida con las partículas MS2RLP (resp. 56 % y 48 %). Esta tendencia se confirmó 48 h después de la transducción única a una dosis de 100000 PF/célula (resp. 80 % y 60 %).
Veinticuatro (24) horas después de la transducción, la transducción única de las células HCT116 con los vectores IDLV se traduce en un porcentaje de células tricoloreadas equivalente al obtenido después de la tritransducción con vectores IDLV. Esta tendencia permanece estable 48 h después de la transducción, con una diferencia mínima entre los dos procedimientos de transducción (71 % para la tritransducción frente a un 81 % para la transducción única). Por lo tanto, a diferencia de los resultados obtenidos con las partículas MS2RLP, los vectores IDLV producidos con 3 plásmidos de expresión, no permiten un aumento significativo del porcentaje de células tricoloreadas durante su transducción, en comparación con una tritransducción. Probablemente, Esta ventaja de las partículas MS2RLP se explica por su capacidad para encapsidar más las moléculas de ARN que los IDLV o ILV (que solamente encapsidan estrictamente 2 moléculas). De esta forma, se facilita la expresión de tres transgenes diferentes ya que no se requiere la transducción de una misma célula con varias partículas lentivíricas.
Además, se observará que el porcentaje de células trifluorescentes a las 8 h después de la transducción no es detectable con los vectores IDLV a 300000 PF/célula en el caso de las tres transducciones o en el de la monotransducción. A 300000 PF/célula, las partículas MS2RLP permiten, por el contrario, detectar células trifluorescentes a las 8 h después de la transducción (Figura XX).
En el caso de tres monotransducciones con vectores IDLV, la proporción de células trifluorescentes es ligeramente mayor a las 24 h y 48 h después de las tres transducciones (resp. 60 % y 70 % de células trifluorescentes) que en el caso de una transducción única de partículas MS2RLP a 100000 PF/célula (resp. 48% y 60% de células trifluorescentes). Es importante destacar que esta diferencia de transferencia es de aproximadamente un 20 % para una dosis utilizada por los vectores IDLV 3 veces superior a la dosis óptima de partículas MS2RLP.
Asimismo, aunque las partículas IDLV sean deficientes para la integración, no permiten liberarse de las integraciones residuales en el genoma de las células diana (Nightingale et al., 2006 y Apolonia et al., 2007). Por ello, la probabilidad de eventos de integración residual aumenta con la dosis de partículas IDLV utilizada. El uso de partículas MS2RLP, por su naturaleza, permite así liberarse de esta limitación debido a la ausencia total de integración residual, independientemente de la dosis utilizada.
3. Comparación con un vector ILV
Las Figuras XX y XXII muestran los perfiles de transducción de partículas MS2RLP y de vectores ILV, que son característicos de la encapsidación de dos moléculas de ARN vírico, en condiciones que permiten ver un efecto cuantitativo de la tritransducción frente a. transducción única (condiciones no saturantes).
Transducción de células HCT116 con vectores ILV, observación 24 h después de la traducción (Figura XXII)
La tritransducción de células con vectores ILV a una MOI de 5 que implica la utilización de lotes de vectores diferentes que codifican, cada uno de ellos, una proteína fluorescente diferente (MOI final=3*5=15), permite obtener un 7,5 % de células que expresan los 3 colores. En comparación, la transducción única con la misma dosis (MOI de 15) solo permite obtener un 0,8 % de células que expresan los 3 colores. Por lo tanto, el porcentaje de células que expresan los 3 colores disminuye entre la tritransducción y la transducción única, por lo que la transducción única no es el procedimiento más adecuado para el uso de los ILV.
Esta diferencia se confirmó con otras dosis. La tritransducción de células con vectores que implica la utilización de lotes de vectores diferentes que codifican, cada uno de ellos, una proteína fluorescente diferente a una MOI de 20 (MOI final=3*20=60) permite obtener casi un 75 % de células que expresan los 3 colores mientras que con una transducción única a una MOI de 60, solamente el 38 % de las células expresan los 3 colores.
Incluso si la dosis de ILV utilizada se aumenta por encima de la dosis óptima, por ejemplo, una MOI de 120, la transducción única de ILV no permite alcanzar el porcentaje de células que expresan los 3 colores obtenido con la tritransducción a una MOI de 60 (61,7 % frente a 75,6 %).
Las MOI utilizadas de 5, 10, 20, 60 permiten ponerse en condiciones de transducción no saturantes permitiendo medir las diferencias de transducciones eficaces.
Transducción de células HCT116 con partículas MS2RLP, observación 24 h después de la traducción (Figura XX)
La tritransducción de células con partículas MS2RLP que implica la utilización de lotes de vectores diferentes que codifican, cada uno de ellos, una proteína fluorescente diferente a una dosis de 10pg/célula para cada lote de partículas MS2RLP (dosis final=3*10 pg=30 pg/célula), permite obtener un 20 % de células que expresan los 3 colores. En cuanto a la transducción única de células con partículas MS2RLP a la misma dosis (30 pg/célula), permite obtener el doble de células que expresan los 3 colores, es decir, un 40 %. El porcentaje de células que expresan los 3 colores se duplica entre la tritransducción y la transducción única, por lo tanto, la transducción única es el procedimiento más adecuado para el uso de partículas MS2RLP. Este resultado es el contrario al obtenido con vectores ILV.
Por lo tanto, las partículas MS2RLP muestran un perfil de transducción diferente al obtenido usando los vectores ILV lo que se explica por el diferente modo de formación de los vectores o las partículas. En efecto, las partículas MS2RLP difieren de los vectores ILV por su sistema de reclutamiento heterólogo de ARN no vírico. En el caso del vector lentivírico integrador ILV, el reclutamiento por el sistema de encapsidación mediado por la secuencia Psi, limita a 2 el número de moléculas de ARN vírico dentro de la partícula. Los resultados de cuantificación del número de moléculas de ARN en la partícula lentivírica MS2RLP estiman que, en promedio, se encapsidan 6 moléculas de ARN en la partícula MS2RLP. Estas diferencias en la encapsidación pueden explicar las diferencias de la transducción por secuencias múltiples entre ILV y MS2RLP.
Por otra parte, con las partículas MS2RLP en transducción única a 10 pg/célula, que es la dosis óptima de uso, se obtiene un 48 % de células que expresan los 3 colores, mientras que en la tritransducción una dosis 3 veces mayor (es decir, 30 pg/célula), solo se obtiene un 20 % de células que expresan los 3 colores, es decir, 2,5 veces menos células que expresan los 3 colores.
En conclusión, estos últimos resultados muestran que solamente las partículas MS2RLP pueden introducir más de dos especies de ARN en células diana a partir de una sola composición de partículas y esto en un intervalo de tiempo corto después de la transducción o la inyección (5-8 horas) sin inducir eventos de integración.
EJEMPLO 3: Comparación de la eficacia de transducción de células HCT116 con partículas MS2RLP-ZsGreen producidas según el procedimiento P1 o P2, descritos en el Ejemplo 1.
I. Material y Métodos
Este ejemplo se realizó utilizando partículas MS2RLP que permiten la transferencia de un solo tipo de ARN que permite la expresión de una sola proteína (ZsGreen).
Las partículas se produjeron mediante transfección de células HEK293T con un solo plásmido de expresión que codificaba la proteína ZsGreenl, (como se describe en el Ejemplo 1), además de los plásmidos de encapsidación y de la envoltura, y siguiendo los procedimientos de producción P1 o P2, descritos en el Ejemplo 1.
Las células HCT116 (ATCC, CCL-247) se sembraron a 25000 células/cm2 en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C/CO2 al 5 %.
La transducción con las partículas MS2RLP se realizó en presencia de 4 pg/ml de Polybrene® con diferentes cantidades de partículas MS2RLP/célula (10, 20 y 30 pg de p24/célula). Cuarenta y ocho (48) horas después de la transducción, las células se recuperaron y el porcentaje de células que expresaban la proteína ZsGreenl, así como la intensidad de la fluorescencia, se cuantificaron mediante citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec). Se utilizó un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (InvivoGen), a una concentración de 6 pM. Cada experimento se realizó por triplicado.
II. Resultados
El objetivo de este experimento es comparar la eficacia de transducción de las células HCT116 con partículas MS2RLP-ZsGreen producidas según el procedimiento P1 o P2. Los resultados presentados en la figura XXIII muestran que la capacidad de transferencia de ARN no se ve afectada por el procedimiento de producción, ya que el porcentaje de células transducidas es el mismo, independientemente del procedimiento de producción utilizado. En cambio, sólo la expresión del transgén se ve afectada por el procedimiento de producción. En efecto, las partículas purificadas permiten obtener el mayor nivel de expresión de la proteína de interés, independientemente de la dosis de partículas MS2RLP utilizada.
EJEMPLO 4: Construcción de partículas lentivíricas MS2RLP por modificación de la nucleocápside y ensayo del número de repetición del motivo tallo-bucle del ARN de MS2
I. Material y Métodos
1. Construcciones de plásmidos
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: El plásmido de expresión lleva un casete de expresión promotor-secuencia de interés-poliA (véase la Figura II) con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARNm a las partículas lentivíricas, varias repeticiones del motivo tallo-bucle del ARN de MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N°1), se insertaron dentro de un casete de expresión después del gen indicador:
- 2 repeticiones (Figura XXIV)
- 6 repeticiones (Figura XXV)
-12 repeticiones (Figura XXVI)
La secuencia de interés seleccionada es la de la luciferasa de luciérnaga natural.
• Plásmido de encapsidación: El plásmido de encapsidación es el descrito en el Ejemplo 1 (Figura IIIb).
• Plásmido de la envoltura (pENV): El plásmido de encapsidación es el descrito en el Ejemplo 1 (Figura IV).
2. Producción, concentración/purificación y titulación de las partículas lentivíricas
Las partículas lentivíricas se produjeron como se describe en el Ejemplo 1 y se concentraron y se purificaron según el procedimiento P1 tal como se describe en el Ejemplo 1.
3. Cinética de expresión de la luciferasa
Las células HCT116 (ATCC, CCL-247) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C/CO2 al 5 %. La transducción con las partículas MS2RLP2X, 6X, 12X, se realizó a una dosis de 100000 PF/célula (10 pg de p24/célula), en presencia de 4 pg/ml de Polybrene®. El sobrenadante de transducción se eliminó 4 horas después y se sustituyó por medio de cultivo reciente complementado. Después de 4, 8, 24, 32 y 48 horas de la transducción, las células se recuperaron y la expresión de la luciferasa se analizó usando el kit de ensayo de luciferasa OneGlo (Promega) siguiendo las recomendaciones del proveedor y usando el lector de placas Synergy H1 Hybrid (Biotek). Este ensayo se realizó por triplicado. El control se realizó con células HCT116 no transducidas.
II. Resultados
Los resultados se presentan en la Figura XXVII. El objetivo de este experimento es comprobar que es posible disminuir el número de motivos repetidos de la secuencia de MS2 en el plásmido de expresión sin que ello afecte al nivel de expresión del ARN que se va a suministrar. La cinética de expresión de la luciferasa muestra un aumento de la señal de luminiscencia de 4 a 8 horas, lo que demuestra que, en el caso de una proteína con una vida corta, el máximo de expresión se alcanza muy rápidamente, independientemente del número de motivos repetidos de la secuencia de MS2. Después de 8 h, la actividad de la luciferasa disminuye, hasta alcanzar el mismo nivel a las 48 h que a las 4 h después de la transducción (entre 10000 y 20000 URL). Las construcciones que llevan 2 y 6 motivos repetidos de la secuencia de MS2 muestran el mismo perfil de expresión de la luciferasa con el tiempo. En cambio, la expresión de la luciferasa con la construcción que lleva 12 motivos repetidos de la secuencia de MS2 es un 30 % más fuerte que la de las construcciones que llevan 2 o 6 motivos repetidos. Por consiguiente, las partículas MS2RLP son eficaces para suministrar los ARN independientemente del número de motivos repetidos utilizados. Dependiendo de la aplicación, deberá adaptarse el número de repeticiones del motivo MS2.
EJEMPLO 5: Construcción de partículas lentivíricas MS2RLP por modificación de la integrasa y ensayo del número de repeticiones del motivo tallo-bucle del ARN de MS2
I. Material y Métodos
I. Construcciones de plásmidos
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: El plásmido de expresión lleva un casete de expresión promotor-secuencia de interés-poliA (véase la Figura II) con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARNm a las partículas lentivíricas, varias repeticiones del motivo tallo-bucle del ARN de MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N°1), se insertaron dentro de un casete de expresión después del gen indicador:
- 2 repeticiones (Figura XXIV)
- 6 repeticiones (Figuras XXV)
-12 repeticiones (Figura XXVI)
El promotor utilizado puede ser el del CMV (Figura IIa) o el del EF1 (Figura IIb), aunque se pueden usar otros promotores. La secuencia de interés puede ser un ADN que codifique una proteína indicadora como la luciferasa de luciérnaga natural (Figura IIa), una proteína fluorescente verde (ZsGreenl), (Figura IIb), roja (mCherry) o azul (mtBFP), o un ADNc que codifique una proteína, por ejemplo, la proteína CRE (Figura IIc). La secuencia de interés también puede ser la de un ARNhc, un miARN, un ARNsg, un ARNLcn o un ARNcirc.
• Plásmido de encapsidación: La partícula lentivírica se modificó para contener, dentro de la integrasa, la secuencia de la proteína "Coat" del bacteriófago MS2. El plásmido de encapsidación p8.74 (Figura VI), que llevaba los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado en la producción de partículas MS2RLP, se modificó según la estrategia ilustrada en la Figura I: este plásmido p8.74 se utilizó para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido en el que la proteína Coat del fago MS2 está fusionada al dominio del extremo C de la integrasa. Esta fusión, obtenida mediante clonación de Hpal, permite generar el plásmido p8.74-POL-MS2 Coat lineal (Figura XXVIII). De este modo se obtiene una construcción como la que se ilustra en la Figura I (p8.74.IN-coat). La secuencia que codifica la proteína Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales, tales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT).
• Plásmido de la envoltura (pENV): Este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser la VSVG que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura IV).
2. Producción, concentración/purificación y titulación de las partículas lentivíricas
Las partículas lentivíricas se produjeron como se describe en el Ejemplo 1, según el procedimiento P1.
3. Cinética de expresión de la luciferasa
Las células HCT116 (ATCC, CCL-247) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C/CO2 al 5 %. La transducción con las partículas MS2(IN)-RLP2X, 6X, 12X producidas según el procedimiento P1, se realizó a una dosis de 5 pg de p24/célula, en presencia de 8 pg/ml de Polybrene®. El sobrenadante de transducción se eliminó 4 horas después y se sustituyó por medio de cultivo reciente complementado. Después de 4, 8, 24, 32 y 48 horas de la transducción, las células se recuperaron, y la expresión de la luciferasa se analizó usando el kit de ensayo de luciferasa OneGlo (Promega) siguiendo las recomendaciones del proveedor y usando el lector de placas Synergy H1 Hybrid (Biotek). Este ensayo se realizó por triplicado. El control se realizó con células HCT116 no transducidas.
II. Resultados
Los resultados se presentan en la Figura XXIX. El objetivo de este experimento es comprobar que es posible transportar los ARN a las partículas lentivíricas con MS2-Coat en la integrasa y disminuir el número de motivos repetidos de la secuencia de MS2 en el plásmido de expresión sin que ello afecte al nivel de expresión del ARN que se va a suministrar. El máximo de expresión de la luciferasa se alcanza muy rápidamente, independientemente del número de motivos repetidos de la secuencia de MS2. La señal de luminiscencia más fuerte de la cinética de expresión de la luciferasa se obtiene desde las 4 h y hasta las 24 h. Después de 24 h, la actividad de la luciferasa disminuye hasta alcanzar una señal de 2 a 4 veces más débil que para las condiciones a 4/8/24 h. Por lo tanto, las partículas MS2(IN)-RLP permiten suministrar ARN, independientemente del número de motivos repetidos de la secuencia de MS2.
EJEMPLO 6: Construcción de partículas lentivíricas PP7(NC)-RLP y ensayo del efecto de la dosis de las partículas PP7RLP sobre la transducción de células HCT116
I. Material y Métodos
1. Construcciones de plásmidos
1.1 Plásmidos para la producción de partículas lentivíricas PP7(NC)-RLP Luc 12X
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: El plásmido de expresión lleva un casete de expresión promotor-secuencia de interés-poliA (véase la Figura XXX) con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARNm a las partículas lentivíricas, se insertaron 12 repeticiones del motivo tallo-bucle del ARN de PP7 (ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID N°5) dentro de un casete de expresión después del gen indicador.
El promotor utilizado puede ser el del CMV o el del EF1 (Figura XXX), aunque se pueden usar otros promotores. La secuencia de interés puede ser un ADN que codifique una proteína indicadora como la luciferasa de luciérnaga natural (Figura IIa), una proteína fluorescente verde (ZsGreenl), (Figura IIb), roja (mCherry) o azul (mtBFP), o un ADNc que codifique una proteína, por ejemplo, la proteína CRE (Figura IIc). La secuencia de interés también puede ser la de un ARNhc, un miARN, un ARNsg, un ARNLcn o un ARNcirc.
• Plásmido de encapsidación: La partícula lentivírica se modificó para contener, dentro de la proteína de la nucleocápside, en lugar del segundo dominio en dedo de Zn, la secuencia de la proteína "Coat" del bacteriófago PP7. El plásmido de encapsidación p8.74, que llevaba los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado en la producción de partículas PP7RLP, se modificó según la estrategia ilustrada en la Figura XXXI: este plásmido p8.74 se utilizó para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido desprovisto del segundo dedo de cinc de la proteína de la nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de cinc se sustituyó por la proteína Coat del fago PP7 mediante clonación de Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-PP7-Coat. De este modo se obtiene la construcción ilustrada en la Figura XXXII. La secuencia que codifica la proteína Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales, tales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función de las PP7RLP.
• Plásmido de la envoltura (pENV): Este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser la VSVG que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura IV).
1.2 Plásmidos para la producción de partículas lentivíricas MS2(NC)-RLP Luc 12X
Los plásmidos utilizados son idénticos a los utilizados en el Ejemplo 1.
2. Producción, concentración/purificación y titulación de las partículas lentivíricas
Las partículas lentivíricas se produjeron como se describe en el Ejemplo 1, según el procedimiento P1.
3. Efecto de la dosis de las partículas PP7(NC)-RLP-Luc
Las células HCT116 (ATCC, CCL-247) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C/CÜ2 al 5 %. La transducción con las partículas PP7(NC)-RLP-Luc-12X, producidas según el procedimiento P1, se realizó con una dosis comprendida de 0 a 20 pg de p24/célula, en presencia de 8 pg/ml de Polybrene®. 4 h después de la transducción, las células se recuperaron, y la expresión de la luciferasa se analizó usando el kit de ensayo de luciferasa OneGlo (Promega) siguiendo las recomendaciones del proveedor y usando el lector de placas Synergy H1 Hybrid (Biotek). Este ensayo se realizó por triplicado. El control se realizó con células HCT116 no transducidas.
II. Resultados
Los resultados se presentan en la Figura XXXIII. El objetivo de este experimento es, en un primer momento, comprobar si el sistema de interacción ARN/proteína del bacteriófago PP7 permite la encapsidación del ARN durante la formación de las partículas RLP. En un segundo momento, este experimento permite determinar las mejores condiciones experimentales para el uso de las partículas PP7(NC)-RLP.
La figura XXXIII muestra que, desde la dosis de 1 pg de p24/célula, la actividad de la luciferasa se detecta fuertemente. Cuanto mayor sea la dosis de PP7(NC)-RLP, mayor será la actividad de la luciferasa. Asimismo, por comparación con el vector MS2(NC)-RLP utilizado a la misma dosis que PP7(NC)-RLP, la señal de la actividad de la luciferasa es muy comparable.
Este experimento muestra que con 12 motivos repetidos de la secuencia PP7, el sistema de encapsidación de los ARN con la proteína Coat del bacteriófago PP7 funciona tan bien como el sistema procedente del bacteriófago MS2, y que para obtener una expresión muy fuerte de la proteína de interés, se puede poner una dosis de 10 pg de p24/célula.
EJEMPLO 7: Construcción de partículas lentivíricas PP7(NC)-RLP y ensayo del número de repeticiones del motivo tallo-bucle del ARN de Pp7
I. Material y Métodos
1. Construcciones de plásmidos
1.1 Plásmidos para la producción de partículas lentivíricas PP7(NC)-RLP
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: El plásmido de expresión contiene un casete de expresión promotor-secuencia de interés-poliA (véase la Figura XXX) con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARNm a las partículas lentivíricas, varias repeticiones del motivo tallo-bucle del ARN de PP7 (ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID N°5), se insertaron dentro de un casete de expresión después del gen indicador:
- 2 repeticiones (Figura XXXIVa)
- 6 repeticiones (Figuras XXXV)
-12 repeticiones (Figura XXX)
El promotor utilizado puede ser el del CMV o el del EF1 (Figura XXX), aunque se pueden usar otros promotores. La secuencia de interés puede ser un ADN que codifique una proteína indicadora como la luciferasa de luciérnaga natural (Figura XXXIVa), una proteína fluorescente verde (ZsGreenl), (Figura XXXIVb), roja (mCherry) o azul (mtBFP), o un ADNc que codifique una proteína, por ejemplo, la proteína CRE. La secuencia de interés también puede ser la de un ARNhc, un miARN, un ARNsg, un ARNLcn o un ARNcirc.
• Plásmido de encapsidación: La partícula lentivírica se modificó para contener, dentro de la proteína de la nucleocápside, en lugar del segundo dominio en dedo de Zn, la secuencia de la proteína "Coat" del bacteriófago PP7. El plásmido de encapsidación p8.74, que llevaba los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado en la producción de partículas PP7RLP, se modificó según la estrategia ilustrada en la Figura XXXI: este plásmido p8.74 se utilizó para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido desprovisto del segundo dedo de cinc de la proteína de la nucleocápside p8.74AZF. El segundo dedo de cinc se sustituyó por la proteína Coat del fago PP7 mediante clonación de Hpal, para generar el plásmido p8.74AZF-PP7-Coat. De este modo se obtiene la construcción ilustrada en la Figura XXXII. La secuencia que codifica la proteína Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales, tales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT) o la integrasa (IN) sin alterar la función de las PP7RLP.
• Plásmido de la envoltura (pENV): Este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser la VSVG que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura IV).
1.2 Plásmidos para la producción de partículas lentivíricas MS2(NC)-RLP Luc 12X
Los plásmidos utilizados son idénticos a los utilizados en el Ejemplo 1.
2. Producción, concentración/purificación y titulación de las partículas lentivíricas
Las partículas lentivíricas se produjeron como se describe en el Ejemplo 1, según el procedimiento P1.
3. Cinética de expresión de la luciferasa
Las células HCT116 (ATCC, CCL-247) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C/CÜ2 al 5 %. La transducción con las partículas PP7(NC)-RLP-Luc-2X, 6X, 12X producidas según el procedimiento P1, se realizó a una dosis de 10 pg de p24/célula, en presencia de 8 pg/ml de Polybrene®. El sobrenadante de transducción se eliminó 4 horas después y se sustituyó por medio de cultivo reciente complementado. Después de 4, 8, 24, 32 y 48 horas de la transducción, las células se recuperaron, y la expresión de la luciferasa se analizó usando el kit de ensayo de luciferasa OneGlo (Promega) siguiendo las recomendaciones del proveedor y usando el lector de placas Synergy H1 Hybrid (Biotek). Este ensayo se realizó por triplicado. El control se realizó con células HCT116 no transducidas.
II. Resultados
Los resultados se presentan en la Figura XXXVI. El objetivo de este experimento es mostrar el impacto de las modificaciones en el número de motivos repetidos de la secuencia de PP7 sobre la capacidad de encapsidación y, por lo tanto, sobre la transferencia de ARN a las células diana, en varios momentos determinados. Las partículas PP7(NC)-RLP que comprenden el motivo PP7 repetido 2 veces, 6 veces o 12 veces, permiten la transferencia de ARN en proporciones comparables a las obtenidas con partículas MS2(NC)-RLP que comprenden el motivo MS2 12 veces. Por lo tanto, las partículas PP7(NC)-RLP son eficaces para administrar los ARN independientemente del número de motivos repetidos utilizados. Dependiendo del tipo de aplicación, deberá adaptarse el número de repeticiones, en consecuencia. Los resultados muestran que, en las condiciones experimentales, las partículas PP7(NC)-RLP que comprenden el motivo PP7 repetido 2 veces o 6 veces, permiten la transferencia de ARN de forma más eficaz que la obtenida usando las partículasMS2(NC)-RLP que comprenden el motivo MS2 repetido 12 veces. La cinética de expresión de la luciferasa muestra un aumento de la señal de luminiscencia de 4 a 8 horas, lo que demuestra que, en el caso de una proteína con una vida corta, el máximo de expresión se alcanza muy rápidamente, independientemente del número de motivos repetidos de la secuencia de PP7. Después de 24 h, la actividad de la luciferasa disminuye, hasta alcanzar a las 32 y 48 horas, una señal de luminiscencia de 4 a 5 veces menos intensa que para la condición de 8 h después de la transducción.
EJEMPLO 8: Construcción de partículas lentivíricas PP7(IN)-RLP por modificación de la integrasa y ensayo del número de repeticiones del motivo tallo-bucle del ARN de PP7
I. Material y Métodos
1. Construcciones de plásmidos
• Plásmido de expresión de una secuencia de interés: El plásmido de expresión lleva un casete de expresión promotor-secuencia de interés-poliA (véase la Figura XXX) con o sin una secuencia intrónica o estabilizadora de ARN. Para transportar los ARNm a las partículas lentivíricas, varias repeticiones del motivo tallo-bucle del ARN de PP7 (ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID N°5), se insertaron dentro de un casete de expresión después del gen indicador:
- 2 repeticiones (Figura XXXIVa)
- 6 repeticiones (Figuras XXXV)
-12 repeticiones (Figura XXX)
El promotor utilizado puede ser el del CMV o el del EF1 (Figura XXX), aunque se pueden usar otros promotores. La secuencia de interés puede ser un ADN que codifique una proteína indicadora como la luciferasa de luciérnaga natural (Figura XXXIVa), una proteína fluorescente verde (ZsGreenl), (Figura XXXIVb), roja (mCherry) o azul (mtBFP), o un ADNc que codifique una proteína, por ejemplo, la proteína CRE (Figura XXXIVc). La secuencia de interés también puede ser la de un ARNhc, un miARN, un ARNsg, un ARNLcn o un ARNcirc.
• Plásmido de encapsidación: La partícula lentivírica se modificó para contener, dentro de la integrasa, la secuencia de la proteína "Coat" del bacteriófago PP7. El plásmido de encapsidación p8.74, que llevaba los genes que codifican las proteínas estructurales y funcionales (Gag, Pol), utilizado en la producción de partículas PP7(IN)-RLP, se modificó según la estrategia ilustrada en la Figura XXXVII: este plásmido p8.74 se utilizó para generar, mediante PCR de ensamblaje, un plásmido en el que la proteína Coat del fago PP7 está fusionada al dominio del extremo C de la integrasa. Esta fusión, obtenida mediante clonación de Hpal, permite generar el plásmido P8.74-POL-PP7 Coat. De este modo se obtiene la construcción ilustrada en la Figura XXXVIII. La secuencia que codifica la proteína Pol se puede eliminar o mutar en determinados elementos funcionales, tales como, por ejemplo, la secuencia que codifica la transcriptasa inversa (RT).
• Plásmido de la envoltura (pENV): Este plásmido lleva el gen que codifica una proteína de envoltura, que puede ser la VSVG que codifica la proteína de envoltura del virus de la estomatitis vesicular (Figura IV).
2. Producción, concentración/purificación y titulación de las partículas lentivíricas
Las partículas lentivíricas se produjeron como se describe en el Ejemplo 1, según el procedimiento P1.
3. Cinética de expresión de la luciferasa
Las células HCT116 (ATCC, CCL-247) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C/CO2 al 5%. La transducción con las partículas PP7(IN)-RLP-Luc-2X, 6X, 12X producidas según el procedimiento P1, se realizó a una dosis de 2,8 pg de p24/célula, en presencia de 8 pg/ml de Polybrene. El sobrenadante de transducción se eliminó 4 horas después y se sustituyó por medio de cultivo reciente complementado. Después de 4, 8, 24, 32 y 48 horas de la transducción, las células se recuperaron, y la expresión de la luciferasa se analizó usando el kit de ensayo de luciferasa OneGlo (Promega) siguiendo las recomendaciones del proveedor y usando el lector de placas Synergy H1 Hybrid (Biotek). Este ensayo se realizó por triplicado. El control se realizó con células HCT116 no transducidas.
II. Resultados
Los resultados se presentan en la Figura XXXIX. El objetivo de este experimento es comprobar que es posible transportar los ARN a las partículas lentivíricas con PP7-Coat en la integrasa y mostrar el impacto de las modificaciones en el número de motivos repetidos de la secuencia de PP7 sobre la capacidad de encapsidación y, por lo tanto, sobre la transferencia de ARN a las células diana, en varios momentos determinados. El máximo de expresión de la luciferasa se alcanzó a las 8 h, independientemente del número de motivos repetidos de la secuencia de PP7. Después de 8 h, la actividad de la luciferasa disminuye, independientemente del número de motivos repetidos de la secuencia de PP7, y la diferencia de la actividad de la luciferasa entre los diferentes números de motivos repetidos, no es estadísticamente significativa. Por lo tanto, las partículas PP7(IN)-RLP permiten administrar los ARN.
EJEMPLO 9: Transferencia de varios ARN diferentes mediante transducción única con partículas PP7RLP
I. Material y Métodos
1. Monotransducción y tritransducción
Este ejemplo se realizó utilizando partículas PP7RLP o vectores ILV que permiten bien la transferencia de un solo tipo de ARN que permite la expresión de una sola proteína (ZsGreenl, mCherry o mtBFP), o la transferencia de varios tipos de ARN que permiten la expresión de varias proteínas diferentes (ZsGreenl mCherry mtBFP).
Las partículas PP7RLP y los vectores lentivíricos integradores ILV se produjeron en las siguientes condiciones:
- Las partículas se produjeron mediante transfección de células HEK293T con un solo plásmido de expresión que codificaba las proteínas ZsGreenl o mCherry o mtBFP (como se describe en el ejemplo 1), además de los plásmidos de encapsidación y de la envoltura,
- Las partículas se produjeron mediante transfección de células HEK293T con tres plásmidos de expresión que codificaban, respectivamente, las proteínas ZsGreenl, mCherry y mtBFP, añadidos en una cantidad equimolar, para una cantidad total de plásmidos de expresión equivalente a la cantidad total de plásmidos de expresión utilizada para una producción de partícula con un solo plásmido de expresión, además de los plásmidos de encapsidación y de la envoltura.
Las células HCT116 se transdujeron con las partículas PP7RLP, es decir:
- por transducción con los 3 tipos de partículas PP7RLP ZsGreenl, mCherry o mtBFP independientemente, o por cotransducción de los 3 tipos de partículas PP7RLP a la vez
- por monotransducción con las partículas producidas con los tres plásmidos de expresión que codifican las proteínas ZsGreenl, mCherry y mtBFP simultáneamente.
En paralelo, las células HCT116 se transdujeron con vectores ILV, es decir:
- por transducción con los 3 tipos de vectores ILV ZsGreenl, mCherry o mtBFP independientemente, o por cotransducción de los 3 tipos de partículas ILV a la vez
- por monotransducción con los vectores ILV producidos con los tres plásmidos de expresión que codifican las proteínas ZsGreenl, mCherry y mtBFP simultáneamente.
El porcentaje de células fluorescentes se cuantificó mediante citometría de flujo.
Las células HCT116 (ATCC, CCL-247) se sembraron en placas de 24 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C/CÜ2 al 5 %. La transducción con las partículas PP7RLP o con los vectores ILV, se realizó en presencia de 8 pg/ml de Polybrene®. Veinticuatro (24) horas después de la transducción, las células se recuperaron y el porcentaje de células que expresaban las proteínas ZsGreenl, mCherry y mtBFP, se cuantificó mediante citometría (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec). Se utilizó un inhibidor de los mecanismos de defensa celular, BX795 (InvivoGen), a una concentración de 6 pM. Cada experimento se realizó por triplicado.
II. Resultados
1. Capacidad para transferir varios ARN diferentes en una sola transducción con las partículas PP7RLP y comparación con el ILV
El objetivo de los siguientes experimentos es demostrar la capacidad de las partículas PP7RLP para transferir varios ARN diferentes al interior de células diana, permitiendo así reducir el número de transducciones a las células diana. De este modo, es posible transferir diversos ARN diferentes en una sola transducción en lugar de tener que realizar una transducción por especie de ARN. Para ello, se generaron lotes purificados de partículas PP7RLP según las condiciones óptimas definidas en el Ejemplo 1, es decir, lotes purificados, producidos sin suero, según el procedimiento P1 del Ejemplo 1 descrito en la solicitud WO 2013/014537. Durante la fase de producción de las partículas PP7RLP, se utilizaron tres tipos de plásmidos que codificaban indicadores fluorescentes, simultáneamente en cantidad equimolar (ZsGreenl, mCherry y mtBFP), con los plásmidos de encapsidación y de envoltura, para obtener un lote de partículas PP7RLP que incluyese varios tipos de ARN diferentes. Después, las células HCT116 se transdujeron en presencia de BX795, y la transferencia de los diferentes ARN se observó 24 h después de la transducción.
La Figura XL ilustra la proporción de células trifluorescentes de color verde, rojo y azul, después de una sola transducción de células HCT116 con partículas PP7RLP a dos dosis diferentes (10 pg de p24/célula y 30 pg de p24/célula), o después de tres transducciones simultáneas de partículas PP7RLP que expresaban las proteínas ZsGreenl o mCherry o mtBFP producidas según el Ejemplo 1, a una dosis final de 30 pg de p24/célula.
El 88 % de las células son trifluorescentes cuando se transducen a una dosis de 30 pg de p24/célula con el lote PP7RLP que contiene partículas que comprenden las 3 especies de ARN, mientras que solo el 1 % de las células son fluorescentes cuando se transducen con el lote de vectores ILV obtenido mediante cotransfección de los 3 plásmidos que contienen, cada uno de ellos, una proteína fluorescente diferente.
Por lo tanto, los resultados muestran que las partículas PP7RLP, pueden transportar y transferir al menos 3 tipos de ARN en una sola transducción de células diana. Estas partículas permiten la transferencia de múltiples ARN mucho más eficazmente que con el vector ILV.
Por tanto, la transducción de las células por medio de múltiples ARN es mucho más eficaz y sencilla con las partículas PP7RLP que con el ILV, para un resultado mayor de al menos un 70 %.
El 91 % de las células son trifluorescentes cuando se transducen simultáneamente a una dosis total de 30 pg de p24/célula con los tres lotes separados de PP7RLP, conteniendo cada uno de ellos, una sola especie de ARN. La comparación de la eficacia de la expresión simultánea de varios transgenes en monotransducción o multitransducción muestra una eficacia equivalente para el vector PP7RLP (88 % frente a 91 % respectivamente).
Por tanto, esta eficacia permite reducir la multiplicidad de infección con respecto al uso de lotes de partículas producidos independientemente. El riesgo de toxicidad celular se reduce considerablemente. Esto permite que la viabilidad de las células diana no se vea comprometida tanto por un exceso de transducción como por el contacto de las células con demasiadas partículas.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Partícula retrovírica que contiene una proteína procedente de la poliproteína Gag, una proteína de envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no víricos diferentes encapsidados, conteniendo cada uno de los ARN no víricos diferentes encapsidados, una secuencia de ARN de interés unida a una secuencia de encapsidación, siendo reconocida cada secuencia de encapsidación por un dominio de unión introducido en la proteína procedente de la poliproteína Gag.
2. Partícula retrovírica según la reivindicación 1, que contiene una proteína de la nucleocápside, una proteína de envoltura, opcionalmente una integrasa y al menos dos ARN no víricos diferentes encapsidados, conteniendo cada uno de los ARN no víricos diferentes encapsidados, una secuencia de ARN de interés unida a una secuencia de encapsidación, siendo reconocida cada secuencia de encapsidación por un dominio de unión introducido en la proteína de la nucleocápside.
3. Partícula retrovírica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que es una partícula lentivírica.
4. Partícula lentivírica según la reivindicación 3, en la que:
- el dominio de unión es la secuencia de la proteína "Coat" del bacteriófago MS2,
- la secuencia de encapsidación de los ARN no víricos es una secuencia tallo-bucle de MS2,
- la proteína de la nucleocápside es la proteína de la nucleocápside (NC) del VIH que pertenece a la poliproteína Gag, cuya NC se ha mutado en el segundo dedo de cinc para insertar la secuencia de la proteína "Coat" del bacteriófago MS2.
5. Partícula lentivírica según la reivindicación 3, en la que:
- el dominio de unión es la secuencia de la proteína "Coat" del fago PP7,
- la secuencia de encapsidación de los ARN no víricos es una secuencia tallo-bucle de PP7,
- la proteína de la nucleocápside es la proteína de la nucleocápside (NC) del VIH que pertenece a la poliproteína Gag, cuya NC se ha mutado en el segundo dedo de cinc para insertar la secuencia de la proteína "Coat" del bacteriófago PP7.
6. Composición que contiene partículas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Kit de producción de partículas retrovíricas según la reivindicación 2, 4 o 5, que contiene:
(i) un plásmido de expresión que codifica al menos dos secuencias de ARN no víricas diferentes, conteniendo cada secuencia de ARN, una secuencia de interés para la cual, antes o después de esta secuencia de interés, se ha insertado una secuencia de encapsidación, o como alternativa, un primer y un segundo plásmido de expresión que codifica, cada uno de ellos, una secuencia de ARN no vírica diferente que contiene una secuencia de interés y, antes o después de dicha secuencia de interés, se ha insertado una secuencia de encapsidación,
(ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína quimérica de la nucleocápside que contiene un dominio de unión que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y,
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
8. Kit de producción de partículas retrovíricas según la reivindicación 7, en el que las secuencias de interés son diferentes y las secuencias de encapsidación son iguales.
9. Procedimiento de fabricación de un kit de producción de partículas retrovíricas según la reivindicación 7, que contiene:
(i) la preparación de un plásmido de expresión que codifica al menos dos secuencias de ARN no víricas diferentes, conteniendo cada secuencia de ARN, una secuencia de interés para la cual, antes o después de esta secuencia de interés, se ha insertado una secuencia de encapsidación, o como alternativa, un primer y un segundo plásmido de expresión que codifica, cada uno de ellos, una secuencia de ARN no vírica diferente que contiene una secuencia de interés, y en la que antes o después de la secuencia de interés, se ha insertado una secuencia de encapsidación,
(ii) la preparación de un plásmido de encapsidación que codifica una proteína quimérica de la nucleocápside que contiene un dominio de unión que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y,
(iii) la preparación de un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura.
10. Procedimiento de fabricación según la reivindicación 9, de un kit de producción de partículas retrovíricas según la reivindicación 8, en el que las secuencias de interés son diferentes y las secuencias de encapsidación son iguales.
11. Procedimiento de fabricación de partículas retrovíricas según la reivindicación 2, 4 o 5, que incluye una etapa de cotransfección de las células con:
(i) un plásmido de expresión que codifica al menos dos secuencias de ARN no víricas diferentes, conteniendo cada secuencia de ARN, una secuencia de interés para la cual, antes o después de esta secuencia de interés, se ha insertado una secuencia de encapsidación, o como alternativa, un primer y un segundo plásmido de expresión que codifica, cada uno de ellos, una secuencia de ARN no vírica diferente que contiene una secuencia de interés, y en la que antes o después de la secuencia de interés, se ha insertado una secuencia de encapsidación, (ii) un plásmido de encapsidación que codifica una proteína quimérica de la nucleocápside que contiene un dominio de unión que permite reconocer la secuencia de encapsidación, y,
(iii) un plásmido de envoltura que codifica una proteína de envoltura,
y la recuperación del sobrenadante de las células transfectadas que contienen las partículas.
12. Procedimiento de fabricación de partículas retrovíricas según la reivindicación 11, en el que las secuencias de interés son diferentes y las secuencias de encapsidación son iguales.
13. Procedimiento de fabricación según la reivindicación 11 o 12, en el que el sobrenadante se clarifica.
14. Procedimiento de fabricación según la reivindicación 13, en el que además, el sobrenadante se concentra y/o se purifica.
15. Uso de una partícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o de una composición según la reivindicación 6, para transducir células in vitro o ex vivo.
16. Partícula retrovírica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o composición según la reivindicación 6, para su uso en terapia génica.
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