CN109415415B - 用于衣壳化基因组工程系统的颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种逆转录病毒颗粒，其包含衍生自Gag聚蛋白的蛋白，包膜蛋白，任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA，所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列。各个衣壳化序列被引入到源自Gag多蛋白的蛋白质和/或整合酶中的结合结构域识别；此外，所述衣壳化非病毒RNA的至少一个所述目标序列包含编码核酸酶的部分。

Description

用于衣壳化基因组工程系统的颗粒
本发明涉及用于将非病毒RNA转移进靶细胞中的逆转录病毒系统，且更具体地涉及能够递送多种RNA的逆转录病毒颗粒。本发明还涉及包含这些逆转录病毒颗粒的组合物、用于生产它们的试剂盒、与其有关的制备方法、以及所述颗粒和组合物的用途。
将多种RNA引入靶细胞中是研究和开发中的一项重大挑战，如在基因治疗中。
从病毒衍生出的载体的应用已经变成基因转移的一项重要方法。目前，病毒载体分成两大类：
-整合载体，其将自身整合进接受者基因组中，和
-非整合载体，其经常形成染色体外遗传元件。
整合载体诸如γ-逆转录病毒载体(RV)和慢病毒载体(LV)会稳定地整合。非整合载体诸如腺病毒(ADV)载体和腺伴随病毒(AAV)载体从快速分裂的细胞中迅速地消除。一些影响特定载体的选择的因素包括它的衣壳化能力、它的宿主或靶细胞范围、它的基因表达谱、它的转导效率和它的引起免疫应答的能力，如果需要重复转导的话，这是特别有问题的。
某些应用需要使用非整合载体，诸如在基因治疗中或在众多体外、离体和体内应用中。作为例子，可以举例以下：
●诱导专门细胞重新程序化为多能细胞，以及诱导干细胞或多能细胞分化成专门细胞，
●同时在靶细胞中表达抗原或蛋白(无论是否有毒)，
●表达基因工程系统例如诸如CRE蛋白或TALEN系统或CRISPR，或任意其它需要蛋白或RNA表达的系统。
一种用于将RNA引入靶细胞中的方式采用以属于逆转录病毒科(Retroviridae)(也通过名称反转录病毒科或RNA病毒来命名)的病毒为基础的病毒载体。实际上，在它的复制周期过程中，逆转录病毒科的病毒具有将它的由RNA构成的基因组转化成双链DNA的能力，所述双链DNA将整合进靶细胞的基因组中。该逆转录病毒科的具体例子是γ-逆转录病毒和慢病毒。
逆转录病毒的复制周期包括通过固定膜受体而识别靶细胞(或宿主)的第一阶段。在膜融合以后该识别阶段导致逆转录病毒进入宿主细胞中。逆转录病毒RNA然后通过逆转录病毒编码的逆转录酶复制成双链DNA，然后整合进宿主细胞的基因组中。该病毒基因组然后象宿主细胞的所有其它基因一样被宿主细胞转录和翻译。该基因组编码能够产生其它病毒的所有蛋白和序列。
更具体地，三种基因是所有逆转录病毒共有的：gag、pol和env。
Gag是编码多蛋白的基因，通过切割从该多蛋白衍生出的蛋白是在复制后参与病毒组装的结构蛋白。这些结构蛋白更具体地是基质(MA)蛋白、衣壳(CA)蛋白和核衣壳(NC)蛋白。
Pol是编码整合酶、逆转录酶和蛋白酶的基因。
Env是编码包膜糖蛋白的基因。
这三种基因因而使得可能将逆转录病毒RNA复制成双链DNA，将该DNA整合进宿主细胞的基因组中，然后产生新合成的逆转录病毒的结构：包膜、衣壳和核衣壳蛋白。但是，为了使新合成的逆转录病毒是完整的，必须将逆转录病毒RNA的两种拷贝衣壳化进这些结构中的每一种内。逆转录病毒RNA的两个拷贝向所述结构中的这种衣壳化，通过核衣壳蛋白对逆转录病毒RNA的拷贝携带的被称作Psi(因“包装信号”而得名)的衣壳化序列的识别来完成。
当将从逆转录病毒衍生出的病毒载体用于基因治疗目的时，编码gag、pol和/或env的区域的至少一部分在衣壳化系统和用于表达目标序列的系统之间解离。例如，编码gag和pol的序列由衣壳化质粒携带，从而反向提供生产病毒载体所必需的蛋白。衣壳化序列和目标序列一样由独立系统携带，以便使得逆转录病毒是非复制的。
但是，在某些情况下，目标RNA序列向宿主细胞的基因组中的随机整合可以中断开放阅读阶段并阻断重要基因的表达。此外，对于某些应用，诸如细胞的重新程序化或干细胞的分化，推荐短暂地进行目标序列的瞬时表达。
申请WO2007/072056描述了一种病毒载体系统，其包含env、gag、任选的gag/pol以及含有异源衣壳化信号的RNA序列，所述异源衣壳化信号被与gag或与gag/pol结合的对应RNA结合结构域识别。该系统在所述申请中被描述为是非整合的和能够瞬时表达。
但是，这样的系统的效率是有限的。具体地，为了使靶细胞表达通过这些系统转移的目标RNA，通常必须向细胞中引入该目标RNA的几个拷贝且因此使用高MOI(代表“感染复数”)。MOI对应于引入的载体系统的数目与要感染的细胞的数目之比。高MOI实际上使得可能通过对相同细胞进行几次感染而将目标RNA的几个拷贝引入细胞中。尽管可能实现转移的目标RNA的表达水平，但是，高MOI的应用也导致一定程度的毒性，因为所述细胞遭受多次感染。
如上所述，这种类型的系统也对基因组工程感兴趣，特别是对于基因治疗中的应用感兴趣。
目前，将基因组工程系统引入靶细胞仍然是复杂的，并且对于成功实施上述基因组工程系统构成了主要挑战。
事实上，对于能够起作用的基因组工程系统，最少需要将能够切割DNA或核酸酶的酶引入靶细胞中。在基因治疗中的应用还需要DNA切割的特异性以精确靶向给定基因，而不会引起不希望的切割。因此，对于TALEN，锌指和CRISPR系统的使用，通常需要将识别元件引入DNA中。因此，这种系统需要将至少一种核酸酶，优选两种所述工程系统的组成元件引入转导的细胞中。
此外，这些基因组工程系统必须考虑参数，例如引入靶细胞的遗传物质的表达的持续时间和强度，以允许系统的令人满意的有效性而不诱导毒性。
目前提供这些基因组工程系统的方法主要是：
-转染DNA，
-RNA的电穿孔，和
-使用病毒载体。
然而，这些方法中的每一种都具有严重的缺点。
实际上，由于与DNA转移相关的高毒性，质粒中细菌序列的存在和/或质粒随机整合到转染细胞基因组中，DNA的转染是对原代或敏感细胞具有非常低效的方法。
就其而言，信使RNA的电穿孔是优选在原代或敏感细胞中离体使用的方法，但是由于靶细胞膜的不稳定性导致的高毒性，这在有效性方面也没有给出良好结果。
病毒载体的使用似乎是最有希望的用于增加递送的有效性、同时最小化细胞毒性方法。然而，尽管慢病毒载体是有效的工具，但它们整合到靶细胞的基因组中以提供转基因的稳定表达，这可能导致不受控制的反应。此外，可以使用整合缺陷型慢病毒载体(IDLV)以限制核酸酶的表达持续时间，但是它们不能保证完全不整合到靶细胞的基因组中。
另一种选择是将AAV腺病毒系统用于体内应用，但这种类型的工具涉及使用尺寸减小的核酸酶，因为腺病毒系统的衣壳化能力限制在4.8kb下的尺寸，与CRISPR或TALEN系统不相容(Chen，2015)。
因此，仍然需要更有效的且更低毒性的病毒载体系统。
发明人的工作已经能够生产载体系统，其能够在单次感染中将几种目标RNA递送进同一个细胞中。
本发明因而涉及一种逆转录病毒颗粒，其包含来自Gag多蛋白的蛋白、包膜蛋白、任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA，所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列，每种衣壳化序列被引入所述衍生自Gag多蛋白的蛋白中和/或所述整合酶中的结合结构域识别,和所述衣壳化非病毒RNA的至少一种所述目标序列包含编码核酸酶的部分。
根据本发明的逆转录病毒颗粒使得可能通过单次感染将至少2种、优选3种非病毒RNA引入细胞中。这样的颗粒向细胞中的引入可以通过体内、体外或离体方法完成。
“来自Gag多蛋白的蛋白”是指从Gag多蛋白的切割产生的任何蛋白。更具体地，它是核衣壳蛋白、基质蛋白(例如，在从MoMuLV型鼠病毒衍生出的逆转录病毒颗粒中)或对γ-逆转录病毒特异性的p12蛋白。
“包膜蛋白”是指任何包膜蛋白，包括假型化包膜蛋白。作为例子，可能举例Ampho包膜蛋白、嗜亲性包膜蛋白、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)的包膜蛋白、猫免疫缺陷病毒(FIV)的包膜蛋白、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)的包膜蛋白、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)的包膜蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)的包膜蛋白、麻疹病毒(MV)的包膜蛋白、Gibbon白血病病毒(GALV)的包膜蛋白、猫内源病毒(RD114)的蛋白或水疱性口炎病毒(VSV-G)的包膜蛋白。更具体地，所述包膜蛋白是Ampho包膜蛋白、嗜亲性包膜蛋白、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)的包膜蛋白、猫免疫缺陷病毒(FIV)的包膜蛋白、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)的包膜蛋白、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)的包膜蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)的包膜蛋白、麻疹病毒(MV)的包膜蛋白、Gibbon白血病病毒(GalV)的包膜蛋白或水疱性口炎病毒(VSV-G)的包膜蛋白。因而可以将包膜蛋白修饰以靶向某些细胞类型或某些应用(表面受体作为包膜蛋白的用途)。
也可能用抗体、糖脂和/或特定配体修饰包膜蛋白以便靶向特定受体和/或细胞类型。
优选地，所述包膜蛋白是VSV-G蛋白。
“整合酶”是指由pol基因编码的酶蛋白，其能够在逆转录病毒的复制以后将逆转录病毒DNA整合进受所述逆转录病毒感染的细胞的DNA中。
“衣壳化序列”是指被结合结构域特异性地识别的RNA基序(三维结构和序列)。优选地，所述衣壳化序列是茎-环基序。更优选地，逆转录病毒颗粒的衣壳化序列是细菌噬菌体MS2或噬菌体PP7的RNA茎-环基序，例如诸如分别从序列ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(SEQ ID No.1)或(ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID No.2)产生的序列。所述茎-环基序和更具体地细菌噬菌体MS2的RNA茎-环基序或噬菌体PP7的RNA茎-环基序，可以单独使用或重复数次，优选地2-25次，更优选地2-18次，例如6-18次。
“结合结构域”是指特异性地结合与目标RNA序列连接的衣壳化序列的蛋白的整体或部分。更具体地，它是特异性地结合衣壳化序列的、由三维结构限定的蛋白，无论是否是突变体。优选地，所述结合结构域是异源结构域。更优选地，所述结合结构域是细菌噬菌体MS2、噬菌体PP7或Qβ噬菌体的外壳蛋白，HK022原噬菌体的nun蛋白，U1A蛋白，或hPum蛋白。
更优选地，所述结合结构域是细菌噬菌体MS2或噬菌体PP7的外壳蛋白。
更优选地，当所述结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白时，其序列是自装配缺陷的，这是由于氨基酸67-75的缺失(PCPΔFG)(Chao等人.2008)。优选地，噬菌体PP7的外壳蛋白序列针对人细胞经过密码子优化，即选择DNA的碱基以编码优选地存在于人物种中的氨基酸。
“每个序列”是指，所述衣壳化序列可以是相同的或不同的，取决于那些衣壳化序列是否被相同或不同的结合结构域识别。实际上，根据本发明的逆转录病毒颗粒可以包含一个或几个结合结构域。当引入几个结合结构域时，这些可以是在Gag多蛋白中和/或在整合酶中。
所述结合结构域不仅能够识别衣壳化序列，而且能够实现所述颗粒中带有衣壳化序列的RNA(或在本发明情况下，与衣壳化序列连接的非病毒RNA)的衣壳化。
“衣壳化”是指将RNA包装在病毒颗粒的病毒衣壳中。应当指出，在本发明中，非病毒RNA的衣壳化由非病毒衣壳化信号(尤其是Psi以外)的识别完成。
“目标序列”表示编码呈现用户兴趣的功能的序列。更具体地，由两种衣壳化的非病毒RNA中的每一种携带的目标序列可以是相同的或不同的。
使用根据本发明的颗粒，可能将相同或不同的非病毒RNA转移进靶细胞中。
由于衣壳化的RNA是非病毒的，这些RNA不存在由pol基因编码的蛋白所识别的位点。
这是因为，这些非病毒RNA不参与逆转录病毒的复制周期的早期步骤，即：
-逆转录酶将单链病毒RNA复制成双链DNA；
-通过整合酶对LTR末端的识别实现双链病毒DNA成熟和细胞质整合前复合物成熟为细胞核整合前复合物。
由pol基因编码的这些病毒蛋白(反转录酶，整合酶)因而在所述颗粒中是任选的，且pol基因因而可以存在或被部分地或完全地删除。优选地，pol基因是存在的或被部分地删除。
应当指出，根据本发明的逆转录病毒颗粒包含病毒的和非病毒的遗传物质：
-gag基因，其可以是病毒的或嵌合的。更具体地，当向其中引入一个或多个结合结构域时，gag基因是嵌合的。
-任选的pol基因，其可以是病毒的或嵌合的。由于pol基因编码几种酶，与那些酶有关的序列可以被完全地或部分地删除，是存在的和无功能的，或者是存在的和有功能的。更具体地，当向所述整合酶中引入一个或多个结合结构域时，pol基因是嵌合的。
-至少两种非病毒RNA，每种非病毒RNA是目标序列和衣壳化序列的载体。更具体地，这些非病毒RNA不含任何病毒序列。
更具体地，根据本发明的逆转录病毒颗粒使得可能在靶细胞中引入RNA，所述RNA能够诱导：
●对于所述靶细胞而言内源性的或外源性的一种或多种目标编码序列的转移，
●一种或多种非编码RNA诸如能够诱导对基因表达的影响(例如通过shRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA或circRNA)的RNA的转移。
●信使RNA类型或其它类型(miRNA等)的细胞RNA、病毒RNA的亚基因组复制子(VHC等)或完整病毒RNA基因组的转移。
●对于所述靶细胞而言内源性的或外源性的编码或非编码序列的同时表达，
●参与通过基因工程系统(例如CRISPR系统)对靶细胞的基因组修饰。
“核酸酶”是指具有切割一条或两条DNA链的能力的酶，该核酸酶具有引发两个核苷酸的核酸的磷酸二酯键断裂的能力。
有利地，核酸酶是内切核酸酶，即它切割后者内部的DNA链。
核酸酶还可以产生粘性末端或非粘性末端。有利地，它产生粘性末端。
核酸酶可以是其天然形式(WT)，突变形式，优化形式，截短形式或敲除形式。事实上，可能的是，突变天然核酸酶以破坏其切割核酸磷酸二酯键的能力。
包衣的非病毒RNA中至少一个目标序列包含编码核酸酶的部分，即该RNA序列可以仅包含编码核酸酶的RNA序列或者编码核酸酶的RNA序列和一个或多个其他RNA序列。这些其他RNA序列可以例如编码至少一种相同或不同的蛋白质，或非编码RNA序列。
更具体地，核酸酶选自由与CRISPR系统相关的核酸酶，TALEN系统的核酸酶，锌指系统的核酸酶和格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(Nagonobacterium gregoryi Argonaute)(NgAgo)核酸酶构成的组。
CRISPR/Cas9基因组工程系统已成为具有巨大潜力的基因工程工具。它涉及两种类型的组件：
-CRISPRs(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，其特征在于一系列短直接重复(21至37个碱基对)，通过所谓的“间隔区”序列规则间隔，通常是单个，具有20至40个碱基对；
-与CRISPR系统相关的核酸酶之一，优选Cas9核酸酶(CRISPR相关蛋白9)，即用于切割具有两个活性切割区的DNA的专用酶，一个用于双螺旋的每条链。例如，化脓性链球菌使用Cas9工具检测和分解外来DNA，例如噬菌体DNA或质粒DNA的侵入。Cas9通过解开外源DNA并验证与导引RNA的约20个碱基对的长间隔区的互补性来进行该检测。如果DNA序列与导引RNA相关，则Cas9切割侵入性DNA。
该系统用于快速且容易地修饰动物和植物细胞的基因组。由于Cas9靶标的特异性，它起源于导引RNA和DNA的互补性，而不是蛋白质本身的修饰(如TALEN和锌指核酸酶)，Cas9工具可以非常简单地靶向新的DNA。
TALEN基因组工程系统使用通过DNA结合结构域(称为TALE)与具有切割DNA能力的结构域(称为TALENs)融合而产生的人工核酸酶。氨基酸序列与DNA结合结构域识别的DNA序列之间的简单关系使得合成个性化蛋白质成为可能。通过将DNA靶TALE的识别结构域与DNA切割结构域组合，可以将这些系统设计用于固定至几乎任何特定的靶DNA序列。
TAL效应子(TALE)是由黄色单胞菌属细菌天然分泌的蛋白质，其包含由重复33或34个相同氨基酸(除了非常可变的氨基酸12和13)构成的DNA结合结构域，其赋予特定核苷酸的识别。氨基酸序列和DNA识别之间的这种简单关系使得可以通过选择含有适当可变残基的重复区段的集合来产生序列的特异性DNA结合结构域。可快速设计序列的这些特异性DNA结合结构域以固定至几乎任何所需的DNA序列。
内切核酸酶Fok1的非特异性DNA切割结构域可用于构建杂交核酸酶，其已被证明在酵母，植物细胞和动物细胞中的测试中是有效的。关于TALEN的第一次研究是用Fok1的原始结构域，或者具有更高的DNA切割特异性或有效性的Fok1变体进行的。
Fok1结构域以二聚体的形式起作用，其需要两个具有DNA结合结构域的构建体，所述DNA结合结构域针对具有头对尾方向和正确间距的基因组位点。
通过将TALE结构域与DNA切割结构域(其将切割DNA链)组合，因此可以为任何DNA序列产生特异性限制酶。
锌指系统使用锌指核酸酶，并由两种蛋白质组合而成，每种蛋白质包含三个用于DNA识别和内切核酸酶Fok I的催化结构域的特异性选择的锌指。
构成锌指的氨基酸的性质将导致识别三个核苷酸的特定DNA序列。因此，通过使用各自包含三个特定锌指的两种蛋白质，对18个核苷酸的特定序列进行识别，并赋予基因组识别特异性。
使用的内切核酸酶是Fok I酶的内切核酸酶结构域，并以二聚体形式起作用。
Fok1结构域以二聚体的形式起作用，其需要两个具有DNA结合结构域的构建体，所述DNA结合结构域针对具有头对尾方向和正确间距的基因组位点。
有利地，使用两种蛋白质，每种蛋白质包含识别几个核苷酸间隔的序列的三个锌指结构。两个锌指蛋白在它们各自序列上的结合使得与它们相关的两个核酸内切酶更紧密地结合在一起。这更紧密地结合在一起允许内切核酸酶的二聚化和然后切割DNA双链。
优选地，核酸酶选自Cas9核酸酶，TALEN核酸酶和锌指核酸酶。
对于“与CRISPR系统相关的核酸酶”，可以提及作为非限制性实例的野生型Cas9核酸酶(Cas9 WT)，其突变为其两个活性位点之一(Cas9N或Cas9 Nickase)或突变因为它的两个活性位点(dCas9)，以及Cpf1核酸酶。
Cas9(CRISPR相关蛋白9)核酸酶是一种用于切割DNA的具有两个活性切割区的专用酶，每个双链螺旋一个切割区。例如，化脓性链球菌使用Cas9工具检测和分解外来DNA，例如噬菌体DNA或质粒DNA的侵入。
TALEN核酸酶(转录激活因子样效应核酸酶)通过称为TALE的DNA结合结构域和具有切割DNA能力的酶结构域(如，例如Fok1的催化结构域或Fok1的变体)的融合而产生。。
“Fok1的变体”是指任何蛋白质结构域，使得切割DNA序列5'-GGATG(N)9-3'成为可能。
锌指(锌指)系统的核酸酶是通过融合DNA结合结构域和DNA裂解催化结构域形成的锌指型人工酶，例如Fok1的催化结构域，或Fok1的变体。
根据本发明的第一种类型的逆转录病毒颗粒，至少两种衣壳化的非病毒RNA的目标序列可包含编码核酸酶的部分。
这些颗粒对于TALEN和锌指基因组工程系统特别感兴趣，其核酸酶以二聚体形式起作用。还优选地，目标序列包含编码TALEN核酸酶或锌指核酸酶的部分，更优选地用于Fok1的催化结构域或Fok1的变体。
根据第二种类型的逆转录病毒颗粒，至少两种衣壳化的非病毒RNA因其目标序列而不同。
更具体地说，在第二种类型中：
-至少一种RNA的目标序列包括编码核酸酶的部分和编码3'处的DNA识别系统的部分，和
-至少一种RNA的目标序列包括编码核酸酶的部分和编码5'处的DNA识别系统的部分。
编码目标序列的DNA识别系统的部分有利地对应于编码能够识别特定DNA序列的蛋白质的RNA。
有利地，在根据该第二类型的逆转录病毒颗粒中，目标序列包含编码FokI核酸酶的催化结构域的部分或FokI核酸酶的变体。
FokI核酸酶的该催化结构域有利地用于构建TALEN重组核酸酶和锌指核酸酶，分别用于实施TALEN或锌指基因组工程系统。
举例来说，根据本发明的逆转录病毒颗粒可包含两种具有不同目标序列的衣壳化非病毒RNA：
-第一个目标序列，包括编码FokI核酸酶的部分和编码TALE 3'处的部分，和
-第二个目标序列，包括编码FokI核酸酶的部分和编码TALE 5'处的部分；
或者，根据本发明的逆转录病毒颗粒可包含两种具有不同目标序列的衣壳化非病毒RNA：
-第一个目标序列，包括编码FokI核酸酶的部分和编码三个锌指的部分，用于识别3'处的DNA序列，和
-第二个目标序列，包括编码FokI核酸酶的部分和编码三个锌指的部分，用于识别5'处的DNA序列。
根据一个具体实施方案，在根据本发明的逆转录病毒颗粒中，至少一种衣壳化的非病毒RNA的目标序列编码核酸酶。
有利地，在该具体实施方案中，核酸酶是Cas9。
更具体地，在根据该具体实施方案的逆转录病毒颗粒中，至少两种衣壳化的非病毒RNA因其目标序列而不同，并且其他衣壳化的非病毒RNA的目标序列对应于至少一种导引RNA的识别元件。
导引RNA对应于通常包含两个识别元件的RNA序列：
-一种3至40个碱基的非编码RNA，能够通过碱基互补性与DNA和DNA的特定序列杂交
-称为“反式激活因子”(“scaffold”)的非编码RNA，其允许核酸酶固定在DNA上。
RNA序列允许特异性靶向特定的DNA切割位点。
目标序列可包含对应于一个或多个相同或不同的导引RNA的一个或多个部分。
有利地，第二衣壳化非病毒RNA的目标序列对应于导引RNA。导引RNA包括DNA识别部分和允许固定核酸酶的部分。
优选地，导引RNA是sgRNA。甚至更优选地，导引RNA是包含两次重复的衣壳化序列的嵌合sgRNA。
优选地，颗粒包含具有不同目标序列的两种RNA：
-编码Cas9核酸酶的第一个目标序列，和
-对应于导引RNA的第二个目标序列。
有利地，根据该具体实施方案的逆转录病毒颗粒还包含至少一种第三衣壳化非病毒RNA，其具有对应于导引RNA的第二识别元件或另外的导引RNA的目标序列。
有利地，颗粒包含具有不同目标序列的三种RNA：
-编码Cas9核酸酶的第一个目标序列，
-对应于导引RNA的第二个目标序列，和
-第三目标序列，其对应于与第二目标序列相同或不同的导引RNA。
有利地，根据本发明的逆转录病毒颗粒包含核衣壳蛋白、包膜蛋白、任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA，所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列，每种衣壳化序列被引入所述核衣壳蛋白中和/或引入所述整合酶中的结合结构域识别。
“核衣壳蛋白”是指由gag基因编码的结构蛋白NC。当将结合结构域引入核衣壳蛋白中时，该蛋白则是源自嵌合gag基因的嵌合蛋白。
当将结合结构域引入整合酶中时，所述整合酶则是源自嵌合pol基因的嵌合蛋白。
“嵌合蛋白”是指包含几个组合的不同蛋白序列的重组蛋白。
根据第一个实施方案，在根据本发明的逆转录病毒颗粒中，将结合结构域引入核衣壳蛋白中，且至少两种非病毒衣壳化RNA通过它们的RNA序列来区分。
该第一个实施方案会实现目标RNA的早期瞬时表达，没有在靶细胞的基因组中的任何相关整合事件。
实际上，使根据该第一个实施方案的颗粒与靶细胞接触后，逆转录病毒颗粒的膜和靶细胞的膜将组合并使所述颗粒的内容物能够释放进所述靶细胞中。RNA然后释放进细胞质中，且细胞机制使那些RNA能够直接翻译成蛋白，即没有额外步骤诸如反转录、易位进细胞核中或整合进靶细胞的基因组中。
更具体地，所述至少两种非病毒RNA具有相同的衣壳化序列。在该情况下，所述至少两种非病毒衣壳化RNA通过它们的目标RNA序列彼此区分开，即在所述两种非病毒衣壳化RNA中包含的目标RNA序列是不同的。“不同”表示这样的目标序列：它们是不同的，或具有并非源自自发突变或由操作人员无意地选择的突变的差异。
可替换地，所述至少两种非病毒RNA具有两种不同的衣壳化序列。这些至少两种衣壳化序列然后被至少两种不同的结合结构域识别，这些结构域中的至少一种被引入在核衣壳蛋白中。在该情况下，所述至少两种非病毒衣壳化RNA可以包含相同或不同的目标序列。
可能衣壳化至少两种非病毒RNA，优选地三种非病毒RNA。
根据第一个实施方案的特定实施方案，将第二个结合结构域引入根据本发明的逆转录病毒颗粒的核衣壳蛋白中。
作为例子，当所述第一结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白时，所述第二个结合结构域可以是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白，或者当所述第一结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白时，所述第二个结合结构域可以是噬菌体PP7的外壳蛋白。
在该情况下，至少两种非病毒衣壳化RNA带有不同的衣壳化序列，每种衣壳化序列分别对应于引入核衣壳蛋白中的第一个和第二个结合结构域。
更具体地，当将三种非病毒RNA衣壳化时：
-所述衣壳化的非病毒RNA中的至少两种存在于与第一结合结构域对应的相同衣壳化序列中，并且仅仅通过它们的目标RNA序列彼此区分开，
-第三种衣壳化的非病毒RNA可以带有相同或不同的衣壳化序列。当所述衣壳化序列是不同时，这可以对应于引入核衣壳蛋白中的第二个结合结构域。
还可以将其它结合结构域引入核衣壳蛋白中。
除了引入核衣壳蛋白中的一个或多个结合结构域以外，也可能将结合结构域引入整合酶中。
所述整合酶则是源自嵌合pol基因的嵌合蛋白。
优选地，当将结合结构域引入整合酶中时，所述整合酶序列在C-端结构域处突变以便插入结合结构域序列。更优选地，所述整合酶序列在C-端结构域处突变从而引入细菌噬菌体MS2或噬菌体PP7的外壳蛋白的序列。
在该情况下，所述至少两种非病毒衣壳化RNA可以带有不同的衣壳化序列，每种衣壳化序列分别对应于引入核衣壳蛋白中和整合酶中的结合结构域。
更具体地，当将三种非病毒RNA衣壳化时：
-所述衣壳化的非病毒RNA中的至少两种存在于与第一结合结构域对应的相同衣壳化序列中，并且仅仅通过它们的目标RNA序列彼此区分开，
-第三种衣壳化的非病毒RNA带有不同的衣壳化序列，其对应于引入整合酶中的第二个结合结构域。
还可以将其它结合结构域引入整合酶中。
有利地，根据本发明的逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。
优选地，在这样的慢病毒颗粒中：
-结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白，
-所述非病毒RNA的衣壳化序列是MS2的茎-环序列，
-核衣壳蛋白是属于嵌合Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC)，所述NC序列在第二个锌指处突变以便插入细菌噬菌体MS2的外壳蛋白序列。
有利地：
-包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSV-G蛋白。
-衣壳化序列包含MS2茎-环序列的2-25个重复，优选地所述茎-环序列的6-18个重复，更优选地10-14个、例如12个重复。优选地，所述茎-环序列是以下的：ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(SEQ ID No.°1)。
或者，优选地，在这样的慢病毒颗粒中：
-结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白，
-所述非病毒RNA的衣壳化序列是PP7的茎-环序列，
-核衣壳蛋白是属于嵌合Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC)，所述NC序列在第二个锌指处突变以便插入PP7细菌噬菌体的外壳蛋白序列。
有利地：
-包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSV-G蛋白。
-衣壳化序列包含PP7茎-环序列的2-25个重复，优选地所述茎-环序列的2-18个重复，更优选地2-12个、例如6个重复。优选地，所述茎-环序列是以下的：ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(SEQ ID No.°2)。
有利地，可以优化SEQ ID No.2以促进茎环的折叠。特别地，已经发现连续插入SEQID No.2和SEQ ID No.4可能是有利的。在编码RNA的情况下，SEQ ID No.2和SEQ ID No.4(ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag)的这种交替促进折叠是特别有利的。另一方面，对于非编码RNA，PP7的每个茎环基序有利地通过连续插入茎环序列SEQ ID No.5(ggagcagacgatatggcgtcgctcc)和茎环序列SEQ ID No.6(ccagcagagcatatgggctcgctgg)获得。
任选地，如果第一结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白，那么引入整合酶中的第二个结合结构域可以是噬菌体PP7的外壳蛋白，或者如果第一结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白，那么引入整合酶中的第二个结合结构域可以是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白。
根据第二个实施方案，本发明涉及一种逆转录病毒颗粒，其包含来自Gag多蛋白的蛋白(优选核衣壳蛋白)、包膜蛋白、整合酶和至少两种非病毒衣壳化RNA，所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列，每种衣壳化序列被引入所述整合酶中的结合结构域识别，且任选地，被引入来自Gag多蛋白的蛋白(优选核衣壳蛋白)中的结合结构域识别。
该第二个实施方案会实现目标RNA的瞬时表达，没有在靶细胞的基因组中的任何相关整合事件。
优选地，在该第二个实施方案中，整合酶序列在C-端结构域处突变以便插入结合结构域序列。
有利地，所述结合结构域是异源结构域。更具体地，所述结合结构域是噬菌体PP7或Qβ噬菌体的细菌噬菌体MS2的外壳蛋白、HK022原噬菌体的Nun蛋白、U1A蛋白或hPum蛋白。
优选地，整合酶序列在C-端结构域处突变从而引入细菌噬菌体MS2或噬菌体PP7的外壳蛋白的序列。
所述至少两种非病毒RNA可以是或不是存在于相同衣壳化序列中。
类似地，所述至少两种非病毒衣壳化RNA可以是或不是存在于相同目标RNA序列中。
优选地，所述至少两种非病毒衣壳化RNA通过它们的目标RNA序列彼此区分开，即在所述两种非病毒衣壳化RNA中包含的目标RNA序列是不同的。
更具体地，所述至少两种非病毒RNA存在于相同衣壳化序列中，后者被引入所述整合酶中的结合结构域识别。
可能衣壳化至少两种非病毒RNA，优选地三种非病毒RNA。
根据第二个实施方案的特定实施方案，将第二个结合结构域引入根据本发明的逆转录病毒颗粒的整合酶中。
作为例子，当第一结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白时，第二个结合结构域可以是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白，或当第一结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白时，第二个结合结构域可以是噬菌体PP7的外壳蛋白。
在该情况下，至少两种非病毒衣壳化RNA带有不同的衣壳化序列，每种衣壳化序列分别对应于引入整合酶中的第一个和第二个结合结构域。
更具体地，当将三种非病毒RNA衣壳化时：
-衣壳化的非病毒RNA中的至少两种存在于与第一结合结构域对应的相同衣壳化序列中，这两种非病毒RNA可能通过它们的目标RNA序列彼此区分开，
-第三种衣壳化的非病毒RNA可以带有相同或不同的衣壳化序列。当衣壳化序列不同时，这可以对应于引入整合酶中的第二个结合结构域。
还可以将其它结合结构域引入整合酶中。
除了引入整合酶中的一个或多个结合结构域以外，也可能将结合结构域引入核衣壳蛋白中。
所述核衣壳蛋白则是源自嵌合gag基因的嵌合蛋白。
在该情况下，至少两种非病毒衣壳化RNA可以带有不同的衣壳化序列，每种衣壳化序列分别对应于引入整合酶中和引入核衣壳蛋白中的结合结构域。
更具体地，当将三种非病毒RNA衣壳化时：
-衣壳化的非病毒RNA中的至少两种存在于与引入所述整合酶中的第一结合结构域对应的相同衣壳化序列中，这两种非病毒RNA可能通过它们的目标RNA序列彼此区分开，
-第三种衣壳化的非病毒RNA带有不同的衣壳化序列，其对应于引入核衣壳蛋白中的第二个结合结构域。
还可以将其它结合结构域引入核衣壳蛋白中。
有利地，在根据本发明的颗粒包含核衣壳蛋白的情况下，可以将结合结构域引入核衣壳蛋白中，并且可以将第二结合结构域引入核衣壳和/或整合酶中。
优选地，根据本发明的逆转录病毒颗粒然后包含核衣壳蛋白，包膜蛋白，任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA，衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列结合的目的RNA序列，至少一个衣壳化序列是MS2噬菌体的茎-环基序(或茎-环序列)(重复12次)，该基序通过被引入核衣壳蛋白的MS2噬菌体的外壳蛋白识别。
茎环基序有利地是序列SEQ ID No.1。
举例来说，根据本发明的这种颗粒是颗粒MS2(NC)-RLP12X，如下文实施例中所述。
在该逆转录病毒颗粒中，包含MS2噬菌体的茎-环基序(重复12次)作为衣壳化序列的衣壳化非病毒RNA有利地是编码Cas9的RNA，并且第二衣壳化非病毒RNA是对应于至少一个导引RNA的识别元件或编码导引物，所述衣壳化的非病毒RNA包含作为衣壳化序列的MS2噬菌体的茎-环基序(重复2次)。
举例来说，根据本发明的这种颗粒是颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X，如下文实施例中所述。
作为另外一种选择或同时，根据本发明的逆转录病毒颗粒包含核衣壳蛋白，包膜蛋白，任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA，衣壳化的非病毒RNA(其各自包含与衣壳化序列结合的目的RNA序列)，至少一个衣壳化序列(其是PP7噬菌体的茎环基序(重复2次))，该基序被引入核衣壳蛋白中的PP7噬菌体的外壳蛋白识别。
有利地，茎环基序是序列SEQ ID No.2。或者，茎环基序是SEQ ID No.2和SEQIDNo.4的交替，特别是对于编码RNA，或SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的交替，特别是对于非编码RNA。
举例来说，当根据本发明的颗粒包含仅PP7噬菌体的茎环基序(重复2次)作为衣壳化序列时，根据本发明的这种颗粒是颗粒PP7(NC)-RLP 2X，以下实施例中描述。
举例来说，当根据本发明的颗粒同时包含MS2噬菌体的茎环基序(重复12次)并且PP7噬菌体的茎环基序(重复2次)作为衣壳化序列时，根据本发明的这样的颗粒是颗粒MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X，下面在实施例中描述。
或者，在根据本发明的逆转录病毒颗粒中，可以将结合结构域引入整合酶中，并且可以将第二结合结构域引入核衣壳和/或整合酶中。
有利地，根据本发明的逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。
当逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒时，可能短暂地表达目标RNA，没有在靶细胞、特别是静止细胞的基因组中的任何相关整合事件。
实际上，除了它在整合反应本身中的作用以外，整合酶(IN)参与逆转录病毒的复制周期的不同步骤，诸如病毒颗粒的形态发生、反转录和整合前复合物(PIC)的入核转运。
更具体地，在慢病毒中，整合酶含有使它能够借助于PIC定位在细胞核中的核定位序列(NLS)。因此，当慢病毒的整合酶携带的结合结构域执行非病毒RNA的衣壳化时，衣壳化的非病毒RNA将被运输进靶细胞的细胞核中。实际上，使根据该第二个实施方案的慢病毒颗粒与靶细胞接触后，所述颗粒的膜和靶细胞的膜将组合并使所述衣壳的内容物能够释放进所述靶细胞中。RNA然后由整合酶负责，所述整合酶通过PIC将使RNA能够输入细胞核中。该负责对于某些应用而言是特别有利的，诸如在静止细胞中的表达。在除了慢病毒以外的逆转录病毒颗粒的情况下，整合酶不含有这些NLS，且因此被发现位于细胞质中。但是，可能向这类整合酶中加入NLS序列，以便诱导整合酶的核定位并从而诱导由该整合酶负责的RNA的核定位。
该负责对于CRISPR系统而言也是特别有用的，所述CRISPR系统需要RNA导引，所述RNA导引变得与靶细胞的基因组特异性地杂交。一旦杂交，这些RNA导引会导引内切核酸酶(Cas9)，所述内切核酸酶将实现靶细胞基因组的特定基因座的修饰。
更具体地，在这样的慢病毒颗粒中：
-所述结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白，
-所述非病毒RNA的衣壳化序列是MS2的茎-环序列，
-整合酶是嵌合酶蛋白，其序列已经在C-端结构域处突变以便插入细菌噬菌体MS2的外壳蛋白序列。
或者，更具体地，在这样的慢病毒颗粒中：
-所述结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白，
-所述非病毒RNA的衣壳化序列是PP7的茎-环序列，
-整合酶是嵌合酶蛋白，其序列已经在C-端结构域处突变以便插入噬菌体PP7的外壳蛋白序列。
任选地，如果第一结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白，那么引入核衣壳中的第二个结合结构域可以是噬菌体PP7的外壳蛋白，或者如果第一结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白，那么引入整合酶中的第二个结合结构域可以是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白。
实际上，整合酶(IN)由三个不同的功能结构域组成，每个是必不可少的以确保完全整合反应。N-端结构域含有锌指型基序，其稳定IN的折叠结构并增加该酶的催化活性。IN的中央结构域含有该酶的催化活性所属的DDE氨基酸基序。该控制结构域也参与在逆转录病毒DNA的每个末端处保守的核苷酸序列的识别。C-端结构域是逆转录病毒科中最低保守的。它具有结合DNA的活性，且是3’末端的成熟反应(为了链转移)所必不可少的。除了它在整合反应本身中的作用以外，IN参与逆转录病毒的复制周期的不同步骤，诸如病毒颗粒的形态发生、反转录和整合前复合物的入核转运。
如Petit等人(1999；J.Virol.P5079-5088)所述，外源序列在IN的C-端中的插入不会扰乱靶细胞的生产和转导步骤，而在N-端中的相同插入不会实现转导事件的检测。
因而已经将逆转录病毒颗粒修饰成含有与整合酶蛋白组合的细菌噬菌体MS2的外壳蛋白(参见图I)或噬菌体PP7的外壳蛋白(参见图XXXVII)。修饰p8.74衣壳化质粒(编码整合酶蛋白的pol基因的载体)以便通过组装PCR在整合酶的C-端中插入编码外壳蛋白的序列。将p8.74质粒通过PCR线性化，然后将通过PCR预先扩增的外壳序列直接端对端地或通过添加接头克隆在整合酶的C-端。
有利地：
-包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSV-G蛋白。
-衣壳化序列包含MS2和/或PP7的茎-环序列的2-25个重复，根据引入的结合结构域，优选地所述茎-环序列的2-18个重复,更优选地2-18个重复，诸如6-18个重复，更优选地，对于MS2的茎-环序列，10-14个、例如12个重复。
-优选地，当所述结合结构域是MS2的外壳蛋白时，所述茎-环序列是以下的：ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(SEQ ID No.1)，和/或当所述结合结构域是PP7的外壳蛋白时，所述茎-环序列是以下的：ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(SEQ IDNo.2)。
在下述实施例中更详细地描述了根据本发明的慢病毒颗粒的几个实施例：
-MS2RLP或MS2(NC)-RLP 12X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入核衣壳中将带有细菌噬菌体MS2的茎-环基序的RNA衣壳化(重复12次)而形成的慢病毒颗粒，
-MS2(NC)-RLP 2X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入核衣壳中将带有细菌噬菌体MS2的茎-环基序的RNA衣壳化(重复2次)而形成的慢病毒颗粒，
-MS2RLP 12X 2X或MS2(NC)-RLP 12X 2X颗粒是通过将MS2噬菌体的外壳蛋白插入核衣壳中将至少一个带有MS2噬菌体茎环基序(重复12次)的第一RNA和至少一个带有MS2噬菌体茎环基序(重复2次)的第二RNA衣壳化而形成的慢病毒颗粒，
-MS2(NC)-RLP 6X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入核衣壳中将带有细菌噬菌体MS2的茎-环基序的RNA衣壳化(重复6次)而形成的慢病毒颗粒，
-MS2(IN)-RLP 2X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入整合酶中将带有细菌噬菌体MS2的茎-环基序的RNA衣壳化(重复2次)而形成的慢病毒颗粒，
-MS2(IN)-RLP 6X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入整合酶中将带有细菌噬菌体MS2的茎-环基序的RNA衣壳化(重复6次)而形成的慢病毒颗粒，
-MS2(IN)-RLP 12X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入整合酶中将带有细菌噬菌体MS2的茎-环基序的RNA衣壳化(重复12次)而形成的慢病毒颗粒，
-PP7(NC)-RLP 2X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入核衣壳中将带有噬菌体PP7的茎-环基序的RNA衣壳化(重复2次)而形成的慢病毒颗粒，
-PP7(NC)-RLP 6X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入核衣壳中将带有噬菌体PP7的茎-环基序的RNA衣壳化(重复6次)而形成的慢病毒颗粒，
-PP7RLP或PP7(NC)-RLP 12X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入核衣壳中将带有噬菌体PP7的茎-环基序的RNA衣壳化(重复12次)而形成的慢病毒颗粒，
-PP7(IN)-RLP 2X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入整合酶中将带有噬菌体PP7的茎-环基序的RNA衣壳化(重复2次)而形成的慢病毒颗粒，
-PP7(IN)-RLP 6X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入整合酶中将带有噬菌体PP7的茎-环基序的RNA衣壳化(重复6次)而形成的慢病毒颗粒，
-PP7(IN)-RLP 12X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入整合酶中将带有噬菌体PP7的茎-环基序的RNA衣壳化(重复12次)而形成的慢病毒颗粒,
-MS2/PP7RLP或MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X颗粒是慢病毒颗粒，通过将MS2噬菌体的外壳蛋白插入核衣壳中将带有MS2噬菌体茎环基序(重复12次)的RNA衣壳化和将PP7噬菌体的外壳蛋白插入核衣壳中将带有PP7噬菌体茎环基序(重复2次)的RNA衣壳化而形成的慢病毒颗粒。
优选地，由衣壳化RNA形成的慢病毒颗粒带有细菌噬菌体MS2或PP7噬菌体的茎-环基序，重复2-25次，更优选地2、6或12次。
更优选地，根据本发明的颗粒选自MS2(NC)-RLP 12X,MS2(NC)-RLP 12X 2X,PP7(NC)-RLP 6X,PP7(NC)-RLP 2X,MS2(IN)-RLP 12X,PP7(IN)-RLP 6X和PP7(IN)-RLP 2X,MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X。
本发明还涉及包含根据本发明的颗粒的组合物。
更具体地，根据本发明的组合物是浓缩的组合物。有利地，还纯化所述组合物。根据在申请WO2013/014537中描述的方法，可以浓缩和纯化这些组合物。
通常，相对于粗制上清液，根据本发明的组合物包含小于30％的DNA污染物和小于45％的蛋白污染物。更具体地，相对于粗制上清液，根据本发明的组合物包含小于30％的DNA污染物和小于2％的蛋白污染物。
“粗制上清液”表示，澄清以后包含根据本发明的逆转录病毒颗粒的细胞培养物上清液。这样的澄清步骤更具体地在下面在制备根据本发明的颗粒的方法中描述。当将上清液的收获完成几次时，粗制上清液则对应于收集、组合(或“合并”)、然后澄清的所有上清液。
任选地，相对于粗制上清液，根据本发明的组合物包含小于1％的DNA污染物和小于1％的蛋白污染物。
本发明也涉及用于生产根据本发明的颗粒的试剂盒和用于制备那些试剂盒的方法。
更具体地，本发明涉及用于生产根据本发明的颗粒的试剂盒，其包含：
(i)包含至少一种目标序列的表达质粒，在该序列的上游或下游插入衣壳化序列，
(ii)编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或整合酶的衣壳化质粒，其为嵌合的，包含使衣壳化序列能被识别的结合结构域，和
(iii)编码包膜蛋白的包膜质粒。
这样的试剂盒还可以包含在所述试剂盒中所含的质粒的使用说明书。
更具体地，当所述试剂盒涉及根据第一个实施方案的颗粒时，该试剂盒包含：
(i)包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒，每种RNA序列包含目标序列，在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列，或可替换地，第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列，在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列，
(ii)编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒，所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域，和，
(iii)编码包膜蛋白的包膜质粒。
所述至少两种非病毒RNA序列是不同的，因为所述目标序列是不同的和/或所述衣壳化序列是不同的。
由于质粒是DNA结构，众所周知，“包含至少两个非病毒RNA序列的表达质粒”是指编码至少两个非病毒RNA序列的表达质粒。
事实上，试剂盒的表达质粒含有通过转录获得至少一种非病毒RNA所必需的所有DNA序列。表达质粒含有至少一个启动子，接着是目标DNA序列(将转录成非病毒RNA的cDNA或DNA)和衣壳化序列(对于MS2或PP7重复基序的DNA编码实例)和任选的RNA稳定序列。
优选地，生产根据第一个实施方案的颗粒的试剂盒包含：
(i)包含至少两种目标序列的表达质粒，在这些序列中的每一种的上游或下游插入衣壳化序列，或可替换地，第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列，在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列，
所述目标序列是不同的且所述衣壳化序列是相同的，
(ii)编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒，所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域，和，
(iii)编码包膜蛋白的包膜质粒。
有利地，所述试剂盒生产慢病毒颗粒。
优选地：
-在表达质粒中，衣壳化序列包含MS2茎-环序列的2-25个重复，优选地茎-环序列的6-18个重复，更优选地10-14个、例如12个重复。有利地，所述茎-环序列是以下的：ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(SEQ ID No.°1)。
-在衣壳化质粒中，所述核衣壳蛋白是属于Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC)，所述NC在第二个锌指处突变以便插入细菌噬菌体MS2的外壳蛋白序列。
-在包膜质粒中，所述包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的蛋白VSV-G。
或优选地：
-在表达质粒中，衣壳化序列包含PP7茎-环序列的2-25个重复，优选地所述茎-环序列的2-18个重复，更优选地2-12个、例如6个重复。有利地，所述茎-环序列是以下的：ctagaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(SEQ ID No.2)。或者，茎环序列是SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的交替，特别是对于编码RNA，或SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的交替，特别是对于非编码RNA。
-在衣壳化质粒中，所述核衣壳蛋白是属于Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC)，所述NC在第二个锌指处突变以便插入噬菌体PP7的外壳蛋白序列。
-在包膜质粒中，所述包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的蛋白VSV-G。
任选地，所述试剂盒包含编码嵌合整合酶的第二个衣壳化质粒，所述嵌合整合酶包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域。第二个结合结构域可以与嵌合核衣壳蛋白的结合结构域相同或不同。
作为不同结合结构域的示例：
-引入核衣壳中的结合结构域可以是MS2的外壳蛋白，且引入整合酶中的结合结构域可以是PP7的外壳蛋白，或者
-引入核衣壳中的结合结构域可以是PP7的外壳蛋白，且引入整合酶中的结合结构域可以是MS2的外壳蛋白。
可以将几个结合结构域引入每个嵌合蛋白中。
可替换地，当试剂盒涉及根据第二个实施方案的颗粒时，该试剂盒包含：
(i)包含至少一种目标序列的表达质粒，在该序列的上游或下游插入衣壳化序列，
(ii)编码嵌合整合酶的衣壳化质粒，所述嵌合整合酶包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域，和，
(iii)编码包膜蛋白的包膜质粒。
有利地，在根据本发明的试剂盒的表达质粒中使用的启动子是EF1，特别是当目标序列是核酸酶时，例如Cas9和U6，特别是当目标序列是至少一个导引RNA的识别元件或导引RNA时。
有利地，根据本发明的生产试剂盒可以进一步包含编码以下的第二衣壳化质粒：
-来源于野生型Gag多蛋白的蛋白质，当第一个衣壳化质粒编码来源于嵌合Gag多蛋白的蛋白质时，和/或
-野生型整合酶，当第一个衣壳化质粒编码嵌合整合酶时。
还提供了用于制备根据本发明试剂盒的方法。通常，用于制备根据本发明试剂盒的方法包括：
(i)制备包含至少一种目标序列的表达质粒，在该序列的上游或下游插入衣壳化序列
(ii)制备编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或整合酶的衣壳化质粒，其为嵌合的，包含使衣壳化序列能被识别的结合结构域，和
(iii)制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
更具体地，当所述方法涉及指向根据第一个实施方案的颗粒的试剂盒时，它包括：
(i)制备包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒，每种RNA序列包含目标序列，在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列，或可替换地，第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列，在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列，
(ii)制备编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒，所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域，和，
(iii)制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
所述至少两种非病毒RNA序列是不同的，因为所述目标序列是不同的和/或所述衣壳化序列是不同的。
优选地，该方法包括：
(i)制备包含至少两种目标序列的表达质粒，在这些序列中的每一种的上游或下游插入衣壳化序列，或可替换地，第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列，在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列，
所述目标序列是不同的且所述衣壳化序列是相同的，
(ii)制备编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒，所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域，和
(iii)制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
可替换地，当所述方法涉及指向根据第二个实施方案的颗粒的试剂盒时，该方法包括：
(i)制备包含至少一种目标序列的表达质粒，在该序列的上游或下游插入衣壳化序列，
(ii)制备编码嵌合整合酶的衣壳化质粒，所述嵌合整合酶包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域，和，
(iii)制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
本发明也涉及用于制备根据本发明的颗粒的方法。
这样的方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤：
(i)包含至少一种目标序列的表达质粒，在该序列的上游或下游插入衣壳化序列，
(ii)编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或整合酶的衣壳化质粒，其为嵌合的，包含使衣壳化序列能被识别的结合结构域，和
(iii)编码包膜蛋白的包膜质粒。
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
在制备根据本发明的颗粒的方法中采用的细胞是生产细胞，即这样的细胞：其一旦用带有形成逆转录病毒颗粒所必需的遗传物质的质粒转染，就能够形成所述颗粒。作为生产细胞的示例，可以举例HEK293T。
“共转染步骤”是指这样的转染步骤：其中通过使生产细胞与制备颗粒的方法的质粒集合接触来进行转染。
更具体地，当制备方法涉及生产根据第一个实施方案的颗粒时，它包括用以下质粒共转染细胞的步骤：
(i)包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒，每种RNA序列包含目标序列，在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列，或可替换地，第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列，在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列，
(ii)编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒，所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域，和，
(iii)编码包膜蛋白的包膜质粒，
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
所述至少两种非病毒RNA序列是不同的，因为所述目标序列是不同的和/或所述衣壳化序列是不同的。
优选地，该制备颗粒的方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤：
(i)包含至少两种目标序列的表达质粒，在这些序列中的每一种的上游或下游插入衣壳化序列，或可替换地，第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列，在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列，
所述目标序列是不同的且所述衣壳化序列是相同的，
(ii)编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒，所述嵌合核衣壳蛋白包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域，和，
(iii)编码包膜蛋白的包膜质粒，
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
可替换地，当制备方法涉及生产根据第二个实施方案的颗粒时，该方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤：
(i)包含至少一种目标序列的表达质粒，在该序列的上游或下游插入衣壳化序列，
(ii)编码嵌合整合酶的衣壳化质粒，所述嵌合整合酶包含使它可能识别衣壳化序列的结合结构域，和，
(iii)编码包膜蛋白的包膜质粒，
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
有利地，在根据本发明的制备方法中，表达质粒占共转染中使用的总质粒数量的至少50％。
在根据本发明的制造方法中，共转染步骤可以另外用编码以下的第二衣壳化质粒实施：
-来源于野生型Gag多蛋白的蛋白质，当第一个衣壳化质粒编码来源于嵌合Gag多蛋白的蛋白质时，和/或
-野生型整合酶，当第一个衣壳化质粒编码嵌合整合酶时。
有利地，第二衣壳化质粒与第一衣壳化质粒的比例在[10:90]至[60:40]的范围内，优选在[20:80]至[50:50]的范围内。
在实施例13中更全面地描述了与使用第二种衣壳化质粒相关的优点，更具体地说，与上述定义的比例相关的优点。
优选地，根据在申请WO2013/014537中描述的方法完成所有用于制备根据本发明的颗粒的方法。
更具体地，在无血清培养基中培养的生产细胞上进行这些用于制备颗粒的方法，且不进行丁酸钠诱导。
有利地，在指定的时间间隔，诸如逆转录病毒颗粒的半衰期量级的时间间隔，收集上清液数次，例如3-6次。通常，以6-18h的量级的时间间隔，优选地8-16h，诸如8h、12h和/或16h，进行上清液的收获4-5次。优选地，该收获在更换细胞的培养基以后进行，该更换优选地在转染后24h进行。
用于制备根据本发明的颗粒的方法也包括在其中澄清上清液的步骤。
优选地，通过离心完成上清液的澄清。
更优选地，这些制备根据本发明的颗粒的方法还包括其中将上清液浓缩和/或纯化的步骤。
优选地，通过在离心单元上的正面超滤完成浓缩和纯化。
有利地，上清液经历一个或多个额外纯化步骤。这些纯化步骤优选地通过切向超滤和/或通过渗滤完成。更优选地，上清液经历切向超滤步骤和随后的渗滤步骤。
切向超滤有利地用聚砜中空纤维筒完成。
任选地，所述组合物然后可以经历离子交换色谱法、特别是阴离子交换色谱法的步骤。然后将在该色谱法步骤中产生的洗脱液收集，然后通过中央离心单元上的正面超滤再次浓缩。相对于粗制上清液，从这样的方法产生的组合物包含小于1％的DNA污染物和小于1％的蛋白污染物。
本发明还涉及能够通过任一种制备根据本发明的颗粒的方法得到的组合物。
通常，相对于粗制上清液，这些组合物包含小于30％的DNA污染物和小于45％的蛋白污染物。更具体地，相对于粗制上清液，根据本发明的组合物包含小于30％的DNA污染物和小于2％的蛋白污染物。
任选地，相对于粗制上清液，根据本发明的组合物包含小于1％的DNA污染物和小于1％的蛋白污染物。
最后，本发明涉及根据本发明的颗粒或根据本发明的组合物用于转导细胞的用途。
根据本发明的颗粒和组合物的应用对于转导原代细胞和永生化系以便短暂地修饰它们而言是特别有利的。所述细胞可以是哺乳动物或其它真核生物的细胞。具体地，这些细胞的转导可以在体内、在体外或离体进行。
细胞可以用本发明的颗粒接受一次或两次连续转导。
根据本发明的颗粒用于细胞转导的使用使得有可能由于它们诱导DNA双链断裂的能力而将突变引入基因组中，细胞通过DNA修复机制对其进行响应。例如，可以通过插入为此目的引入的RNA或在细胞中可获得的RNA的非同源物末端来进行修复，所述非同源物末端用于重新连接由双链断裂产生的DNA的两个末端。
这些基因组工程系统也可用于进行基因敲除，即敲除基因的表达，或甚至根据靶向的基因诱导细胞死亡。
一旦将根据本发明的颗粒引入细胞中，它们就可以用于体内，体外或离体修饰基因组。
考虑到通过举例说明给出的下述实施例，参考分别呈现的附图，将更好地理解本发明。
-图I是说明衍生自pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X表达质粒的表达盒的示意图，其包含编码Cas9核酸酶的RNA的DNA序列，呈其野生型形式(WT)或其突变形式(N)；
-图IIa说明了修饰带有编码结构和功能蛋白(Gag，Pol)的基因的p8.74衣壳化质粒以构建p8.74ΔZF-MS2-Coat的策略；
-图IIb是衍生自p8.74ΔZF-MS2-Coat衣壳化质粒的表达盒的构建示意图，其具有被MS2噬菌体的“外壳”蛋白取代的第二个锌指，通过图IIa中所示的策略获得；
-图III是来自包膜pENV质粒的表达盒构建的示意图；
-图IV是来自pILV-EF1-Cas9-WPRE表达质粒的表达盒构建的示意图，其包含编码Cas9核酸酶的RNA序列的DNA，呈其野生型形式(WT)或其突变形式(N)；
-图Va是衍生自pILV-EF1-GFP-WPRE表达质粒的表达盒构建的示意图，其包含编码GFP的RNA的DNA；
-图Vb是来自pILV-H1-GuideU3-U6-GuideD1-WPRE表达质粒的表达盒构建的示意图，其包含编码靶向GFP序列的两个非编码RNA的DNA(在这种情况下，sgRNA＝导引RNA＝导引U3和D1)；
-图Vc是来自pILV-H1/U6-Guide-WPRE表达质粒的表达盒构建的示意图，其包含编码靶向GFP序列的非编码RNA的DNA(sgRNA＝导引RNA＝导引物)；
-图VI是来自p8.74衣壳化质粒的表达盒构建的示意图，该质粒携带编码结构和功能蛋白质的基因(Gag，Pol)；
-图VII是说明衍生自pcDNA-H1-GuideD1-MS2 2X表达质粒的表达盒的示意图，其携带编码非编码导引RNA的DNA序列，包含支架，靶向GFP的序列(sgRNA＝导引RNA)，其中MS2RNA的茎环基序的2次重复(SEQ ID No.3)被插入导引RNA下游的表达盒中；
-图VIII是说明衍生自pcDNA-H1-GuideD1Chimeric-MS2 2X表达质粒的表达盒的示意图，其携带编码靶向GFP序列(sgRNA＝导引RNA)的非编码导引RNA的DNA序列，目标-末端(Term)启动子序列表达盒，其中MS2 RNA的茎-环基序的2次重复(SEQ ID No.3)包括在嵌合导引的“支架”部分中；
-图IX说明了根据本发明的MS2(NC)-RLP 12X颗粒在转导HCT119-GFP细胞期间递送编码Cas9核酸酶切口酶的RNA的有效性；
-图X说明在转导HCT119-GFPCas9细胞后，MS2重复基序的位置对根据本发明的MS2(NC)-RLP 12X颗粒中的导引RNA的衣壳化的影响；
-图XI说明了递送导引RNA的MS2RLP颗粒的产生的有效性，这取决于它们是否使用单一或双量的带有用于转导HCT116-GFP-Cas9细胞的导引RNA的表达质粒产生；
-图XII说明了根据本发明的MS2(NC)-RLP 12X颗粒在HCT116-GFP细胞中递送CRISPR/Cas9系统(导引RNA+编码Cas9的RNA)的有效性；
-图XIIIa是说明衍生自pcDNA.EFI.PPRV.TALEN 5'.WPRE MS2(12X)的表达质粒的表达盒示意图，其包含编码由与DNA结合结构域融合的FokI核酸酶构成的TALEN核酸酶的RNA的DNA序列，TALE，识别DNA的5'链；
-图XIIIb是说明衍生自pcDNA.EFI.PPRV.TALEN 3'.WPRE MS2(12X)的表达质粒的表达盒示意图，其包含编码由与DNA结合结构域融合的FokI核酸酶构成的TALEN核酸酶的RNA的DNA序列，TALE，识别DNA的3'链；
-图XIVa是说明衍生自pILV.EF1.TALEN 5'表达质粒的表达盒的示意图，其包含编码由与DNA结合结构域融合的FokI核酸酶构成的TALEN核酸酶的RNA的DNA序列，TALE，识别DNA的5'链；
-图XIVb是说明衍生自pILV.EF1.TALEN 3'表达质粒的表达盒的示意图，其包含编码由与DNA结合结构域融合的FokI核酸酶构成的TALEN核酸酶的RNA的DNA序列，TALE，识别DNA的3'链；
-图XVa是说明来自表达质粒pcDNA.EF1.PPRV.ZFP 5'.WPRE.MS2(12X)的表达盒的示意图，其携带具有FokI核酸酶的嵌合锌指类型的DNA识别结构域，用于识别DNA的5'链；
-图XVb是说明来源于pcDNA.EF1.PPRV.ZFP 3'.WPRE.MS2(12X)表达质粒的表达盒的示意图，其携带具有FokI核酸酶的嵌合锌指型的DNA识别结构域，用于识别3'链DNA；
-图XVIa是说明来自pILV.EF1.ZFP 5'表达质粒的表达盒的构建的示意图，其带有具有FokI核酸酶的嵌合锌指类型的DNA识别结构域，用于识别DNA的5'链；
-图XVIb是来自pILV.EF1.ZFP 3'表达质粒的表达盒的构建的示意图，其带有具有FokI核酸酶的嵌合锌指类型的DNA识别结构域，用于识别DNA的3'链；
-图XVII显示衍生自表达质粒的表达盒的示意图，根据本发明，其带有用于产生慢病毒颗粒PP7(NC)-RLP 12X的荧光素酶作为目标RNA序列，包含重复12次的茎-环基序PP7；
-图XVIII显示了慢病毒p8.74衣壳化质粒的修饰示意图，以便在整合酶序列中插入结合域；
-图XIX显示了衍生自用于产生根据本发明的慢病毒颗粒PP7(IN)-RLP的衣壳化质粒的表达盒的示意图，其通过修饰图VI中所示的慢病毒p8.74衣壳化质粒获得；
-图XX说明了根据本发明的MS2(NC)-RLP 12X颗粒在HCT116-GFP细胞中递送CRISPR/Cas9系统(导引RNA+编码Cas9的RNA)的有效性；
-图XXI是来自pcDNA-U6-GuideD1Chimeric-MS2 2X-Term表达质粒的表达盒的构建示意图，其包含编码靶向GFP序列的非编码RNA的RNA(在这种情况下，sgRNA＝导引RNA＝导引D1)，取决于U6启动子；
-图XXII说明了MS2RLP颗粒在HCT116-GFP细胞中递送CRISPR/Cas9系统(导引RNA+编码Cas9的RNA)的有效性，作为启动子的功能，允许在生产细胞中转录导引RNA；
-图XXIII是衍生自pcDNA-U6-Guide_antiPD1Chimeric-MS2 2X-Term表达质粒的表达盒构建的示意图，其包含编码靶向PD1基因的非编码RNA的RNA(sgRNA＝导引RNA＝导引物)，取决于U6启动子；
-图XXIV说明了MS2RLP颗粒在将CRISPR/Cas9系统(导引RNA+编码Cas9的RNA)递送到活化的原代T淋巴细胞中以敲除PD1基因的有效性；
-图XXV显示ILV颗粒在将CRISPR/Cas9系统(导引RNA+编码Cas9的RNA)递送到活化的原代T淋巴细胞中，用于敲除PD1基因的有效性；
-图XXVI显示了MS2RLP颗粒在递送CRISPR/Cas9系统以敲除PD1基因(导引RNA+编码Cas9的RNA)对活化淋巴细胞活力的影响；
-图XXVII说明了通过MS2RLP颗粒转导后激活的淋巴细胞表型的分析，所述MS2RLP颗粒递送CRISPR/Cas9系统用于敲除PD1基因(导引RNA+编码Cas9的RNA)；
-图XXVIII是衍生自pcDNA-U6-Guide_antiCXCR4Chimeric-MS2 2X表达质粒的表达盒的构建示意图，其包含编码靶向CXCR4基因的非编码RNA的RNA(sgRNA＝导引RNA＝导引物)，取决于U6启动子；
-图XXIX显示了MS2RLP颗粒在激活的原代T淋巴细胞中递送CRISPR/Cas9系统(导引RNA+编码Cas9的RNA)用于敲除CXCR4基因的有效性；
-图XXX显示了递送CRISPR/Cas9系统的MS2RLP颗粒用于敲除CXCR4基因(导引RNA+编码Cas9的RNA)对活化的原代T淋巴细胞活力的影响；和
-图XXXI说明了通过MS2RLP颗粒转导后活化的T淋巴细胞的表型的分析，所述MS2RLP颗粒递送CRISPR/Cas9系统用于敲除CXCR4基因(导引RNA+编码Cas9的RNA)。
-图XXXII是衍生自pILV-H1/U6-GuideantiPD1-WPRE质粒的表达盒构建的示意图，其包含编码靶向PD1基因的非编码RNA的DNA序列(sgRNA＝导引RNA＝导引物)；
-图XXXIII显示了递送CRISPR/Cas9系统(导引RNA+编码Cas9的RNA)的MS2RLP颗粒剂量对HCT116克隆D2靶细胞中GFP基因的敲除的影响；
-图XXXIV是衍生自pcDNA-EF1-Cas9-PP7 2X质粒的表达盒的构建示意图，其包含编码Cas9核酸酶的RNA的DNA序列；
-图XXXV是衍生自pcDNA-U6-GuideD1Chimeric-PP7 2X质粒的表达盒的构建示意图，其包含编码靶向GFP序列(sgRNA＝导引RNA)的非编码RNA的DNA，目标末端(Term)表达盒的启动子序列(sgRNA＝导引RNA＝导引物)，取决于U6启动子，其中PP7 RNA的茎环基序的2次重复(分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.4)包含在嵌合导引的“支架”部分；
-图XXXVI说明了修饰带有编码结构和功能蛋白(Gag，Pol)的基因的p8.74衣壳化质粒构建p8.74ΔZF-PP7-Coat质粒的策略；
-图XXXVIb是衍生自p8.74ΔZF-PP7-Coat衣壳化质粒的表达盒的构建示意图，其具有的第二个锌指用PP7噬菌体的“外壳”蛋白替代，通过图XXXVIa中所示的策略获得；
-图XXXVII说明了递送CRISPR/Cas9系统的PP7RLP颗粒剂量(导引RNA+编码Cas9的RNA)对HCT116克隆D2靶细胞中GFP基因的敲除的影响；
-图XXXVIII是说明衍生自pcDNA.EF1.FluorescentReporter.MS2 12X表达质粒的表达盒的示意图，其包含编码荧光报道分子的RNA的DNA序列，然后重复12次的MS2 RNA的茎环基序(SEQ ID No.1)；
-图XXXIX是说明衍生自pcDNA.EF1.FluorescentReporter.PP7 2X表达质粒的表达盒的示意图，其包含编码荧光报道分子的RNA的DNA序列，然后重复2次PP7 RNA的茎环基序(SEQ ID No.2)；
-图XXXX是衍生自pILV-EF1-ZsGreenI-WPRE表达质粒的表达盒的构建示意图，其包含编码ZsGreenI RNA的DNA；
-图XXXXI显示用于产生MS2RLP 12X颗粒的野生型GAG-POL前体对在Jurkat细胞中RNA转移的影响，剂量为2pg p24/细胞；
-图XXXXII显示用于产生MS2RLP 12X颗粒的野生型GAG-POL前体对在Jurkat细胞中RNA转移的影响，剂量为2pg p24/细胞；
-图XXXXIII a和b说明在15s(XXXXIIIb)和1分钟(XXXXIIIa)后通过抗p24蛋白质印迹分析MS2RLP病毒颗粒的成熟；和
-图XXXXIV通过HCT116细胞中的MS2和PP7衣壳化序列，MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X颗粒用于转移衣壳化的RNA的有效性。
实施例1：根据本发明的ILV或MS2RLP颗粒转导HCT116细胞的特定克隆后编码Cas9 的RNA转移的比较
一.材料与方法
1.质粒构建
仅对于该实例，使用的Cas9是Cas9 Nickase(以突变形式)。以下实施例和除非另有说明，使用其野生型(WT)的Cas9，该方案保持不变。
1.1用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2-(NC)-RLP12X的质粒
·用于目标序列的表达质粒
表达质粒携带具有或不具有内含子序列或RNA稳定序列的表达盒(图I)。为了输送RNA进入慢病毒颗粒，MS2 RNA(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag，SEQ ID No.1)的茎-环基序的12次重复已经被插入Case 9酶序列的表达盒下游。使用的启动子是EF1启动子(图I)，但也可以使用其他启动子。目标质粒是编码Cases9蛋白的RNA的DNA(图I)，呈它的野生型(WT)或它的突变形式(N)，例如切口酶。
·衣壳化质粒：
将慢病毒颗粒修饰为在核衣壳蛋白内，而不是第二锌指结构域中，包含噬菌体MS2“外壳”蛋白的序列。p8.74衣壳化质粒，携带编码结构和功能的蛋白(GAG，POL)的基因，用于生产MS2RLP颗粒，被根据图IIa所示的策略修饰：该p8.74质粒用于通过装配PCR产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二锌指的质粒。通过HpaI克隆将第二个锌指用噬菌体MS2“外壳”蛋白取代，以产生质粒p8.74ΔZF-MS2-Coat。这给出了图IIb中所示的结构。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变，例如如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列，而不改变MS2RLP的功能。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒携带编码包膜蛋白的基因，该蛋白可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
这些质粒用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2-(NC)-RLP12X。更特别地，这些质粒用于产生MS2RLP-Cas912X慢病毒颗粒。
1.2用于产生整合型慢病毒载体ILV的质粒
1.2.1.用于产生对照整合型慢病毒载体ILVCas9的质粒
·用于目标序列的表达质粒
表达质粒携带表达盒(图IV)。该质粒可含有其他元件，如天然WPRE序列(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Elément)或cPPT/CTS序列。通过取代转基因逆转录病毒复制所需的病毒基因组区域来消除病毒致病性。使用的启动子是EF1启动子，但也可以使用其他启动子。质粒的目标序列是编码Cas9蛋白的RNA的DNA(图IV)，呈其野生形式(WT)或其突变形式(N)。
·衣壳化质粒：
携带编码结构和功能蛋白(Gag，Pol)的基因的衣壳化质粒p8.74用于产生整合型慢病毒载体(图VI)。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒与用于产生慢病毒MS2RLP颗粒的包膜质粒相同(图III)。
1.2.2.用于产生ILV-GFP整合型慢病毒载体的质粒，用于产生靶细胞HCT1 16-GFP Clone D2
·用于目标序列的表达质粒：
表达质粒携带表达盒(图Va)。该质粒可含有其他元件，如天然WPRE序列(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Elément)或cPPT/CTS序列。通过取代转基因逆转录病毒复制所需的病毒基因组区域来消除病毒致病性。使用的启动子是EF1启动子，但也可以使用其他启动子。目标序列是GFP荧光蛋白(图Va)。
·衣壳化质粒：
携带编码结构和功能蛋白(Gag，Pol)的基因的衣壳化质粒p8.74用于产生整合型慢病毒载体(图VI)。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒与用于产生慢病毒MS2RLP颗粒的包膜质粒相同(图III)。
1.2.3.用于产生整合型慢病毒载体ILV-H1-GuideU3-U6-GuideD1的质粒，用于产 生靶细胞HTC116-GFPClone D2-H1-GuideU3-U6-GuideD1
·用于目标序列的表达质粒
该表达质粒携带如图Vb所述的表达盒。该质粒可含有其他元件，如天然WPRE序列(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Elément)或cPPT/CTS序列。通过取代转基因逆转录病毒复制所需的病毒基因组区域来消除病毒致病性。使用的启动子是H1和U6，但也可以使用其他启动子。目标序列是靶向GFP序列的两种非编码RNA，下文称为导引U3和导引D1(sgRNA＝导引RNA)(图Vb)。
·衣壳化质粒：
携带编码结构和功能蛋白(Gag，Pol)的基因的衣壳化质粒p8.74用于产生整合型慢病毒载体(图VI)。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒与用于产生慢病毒MS2RLP颗粒的包膜质粒相同(图III)。
2.批量生产慢病毒颗粒和慢病毒载体
在生产细胞上转染质粒后，收获上清液，并根据申请WO2013/014537中描述的下述方法之一以原料或浓缩/纯化方式使用。
2.1慢病毒颗粒和慢病毒载体的产生
用HEK293T细胞(ATCC,CRL-11268)在10-叠CellSTACK(6360cm2,Corning)中进行生产，所述细胞在补充了1％青霉素/链霉素和1％超谷氨酰胺(PAA)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM,Gibco,Paisley,UK)中在含有5％CO2的恒湿气氛下在37℃培养。对于每批(MS2-(NC)-RLP 12X和ILV)，转染混合物由以下三种质粒组成：
-上述的表达质粒之一，取决于形成的对象是颗粒(MS2-(NC)-RLP 12X)还是载体(ILV)，
-p8.74ΔZF外壳(MS2-(NC)-RLP 12X)或p8.74(ILV)
-带有包膜VSV-G的pENV。
更特别地，对于批次MS2RLP-Cas9 12X，转染混合物由以下三种质粒组成：
-表达质粒pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X(其表达盒如图I所示)
-p8.74ΔZF-MS2 Coat质粒(其表达盒如图IIb所示)
-携带包膜VSV-G的质粒pENV(其表达盒如图III所示)。
更具体地，对于批次ILV-GFP，ILV-H1-GuideU3-U6-GuideDI或ILV-Cas9，转染混合物由以下三种质粒组成：
-分别地，表达质粒plLV EF1-GFP-WPRE(包括表达盒如图Va所示)或pILV-H1-GuideU3-U6-GuideD1-WPRE(包括表达盒如图Vb所示)或pILV-EF1-Cas9-WPRE(其表达盒如图IV所示)，
-质粒p8.74(其表达盒如图VI所示)，
-携带包膜VSV-G的质粒pENV(其表达盒如图III所示)。
质粒的各自比例如下：40％表达质粒，30％质粒p8.74(或p8.74ΔZF)，30％质粒pENV。
用磷酸钙标准转染以后24小时，将培养物上清液用新鲜的未补充的DMEM培养基替换。将细胞在37℃/5％CO2温育。更换培养基以后，将上清液收获4次(转染后32h、48h、56h和72h)。每次收集物通过在3000g离心5min进行澄清，然后在0.45μm过滤器(Millipore)上微滤。然后将所有收集物合并以组成粗制上清液。
2.2慢病毒载体和慢病毒颗粒的浓缩和纯化
将载体和颗粒根据以下两种方法之一浓缩和纯化：
●方法P1涉及在离心中央单元上执行上清液的正面超滤。
●P2方法涉及执行切向超滤，然后渗滤上清液。将粗制上清液通过使用聚砜中空纤维筒的切向超滤进行浓缩和纯化。将上清液通过以连续模式在DMEM或TSSM缓冲液中渗滤处理20个透析体积(diavolume)。渗滤以后，将渗余物收集，然后通过在中央离心单元上正面超滤再次浓缩。
对于实施例1，收获上清液并根据方法P1浓缩/纯化使用。
3.滴定批量慢病毒颗粒和慢病毒载体
3.1通过qPCR滴定功能颗粒
将HCT116细胞(ATCC,CCL-247)接种在96-孔平板内的100μL补充了10％SVF、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素和2mM L-Gln的DMEM中，然后在37℃/5％CO2温育24h。为每种载体以及为内部校准参照物进行6次系列稀释。将细胞通过在有8μg/mL(Sigma)存在下系列稀释进行转导，然后在37℃/5％CO2温育3天。对于样品的每个系列，加入未转导的细胞的一个孔作为对照。接下来将细胞用胰蛋白酶处理，并在使用Nucleospin组织gDNA提取试剂盒(Macherey-Nagel)提取基因组DNA以后通过qPCR确定滴度(转导单位/mL)。将通过qPCR得到的滴度(TU/mL)用内部校准参照物归一化，预先通过FACS确定所述内部校准参照物的滴度。
3.2通过P24 Elisa试验量化物理颗粒
使用并遵循关于HIV-1p24 ELISA试剂盒(Perkin Elmer)的推荐，在病毒上清液中直接检测p24衣壳蛋白。使捕获的p24蛋白与生物素化的多克隆抗体形成复合物，然后通过抗生蛋白链菌素-HRP过氧化物酶缀合物检测。将得到的复合物与底物邻-苯二胺-HCl(OPD)一起温育以后通过分光光度法检测，所述底物产生与捕获的p24的量直接成比例的黄色。使用微量培养板读数器Synergy H1 Hybrid(Biotek)定量每个孔的吸光度，并相对于p24蛋白校准参照范围的吸光度进行校准。从已知1pg p24蛋白对应于104个物理颗粒得到的p24蛋白浓度，计算以物理颗粒/mL表达的病毒滴度。
4.通过根据本发明的慢病毒颗粒MS2-(NC)-RLP12X产生靶细胞和转导该实施例旨在表明可以通过非整合型MS2RLP颗粒转移编码Cas9核酸酶的RNA，并且在RNA转移结束，产生双链DNA断裂，允许敲除目标基因。
4.1靶细胞HCT116-GFP Clone D2
靶细胞HCT116-GFPClone D2是通过在8μ微克/毫升存在下用表达GFP的整合慢病毒载体(ILV)在MOI20转导HCT116细胞(ATCC，CCL 247)而获得。仅含有一个编码GFP的DNA拷贝的靶单克隆系的HCT116-GFPClone D2是通过HCT116-GFP多克隆系的限制稀释(从表达质粒制备，如图Va)和通过量化PCR定量GFP序列的整合拷贝数来筛选克隆得到。
4.2靶细胞HCT116-GFP CloneD2-GuideU3-H1-U6-GuideD1和通过根据本发明的 MS2-(NC)-RLP 12X慢病毒颗粒转导
将HCT116-GFPClone D2靶细胞以25000细胞/cm2接种在24-孔平板内在37℃/5％CO2温育24小时。首先，在MOI40在8微克/毫升存在下，细胞被载体ILV-H1-GuideU3-U6-GuideD1(从图Vb所示表达质粒制备)转导。4小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。
用ILV-H1-GuideU3-U6-GuideD1转导后1周，HCT116-GFPCloneD2-H1-GuideU3-U6-GuideD2靶细胞在MOI40通过ILV-EF1-Cas9载体转导(从图IV所示表达质粒制备)或通过MS2RLP-Cas9颗粒转导，剂量为10pg p24/细胞，在8μg/mL存在下。在MS2RLP颗粒的情况下，细胞防御机制抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。4小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。在D14后-转导，回收细胞并通过细胞计量法(MacsQuant VYB，Miltenyi Biotec)定量表达GFP的细胞的百分比。
II.结果
这个实验的目的是通过使用ILV-Cas9载体或MS2RLP-Cas9 12X颗粒转导靶细胞HCT116-GFP-CloneD2-GuideU3-H1-U6-GuideD1比较编码cases9的RNA的转移有效性。首先，在图IX中显示的结果表明，非转导(NT)的HCT116细胞不是荧光的(<0.4％的GFP阳性细胞)，而99％的靶细胞的HCT116-GFP-CloneD2-H1-GuideU3-U6-GuideD1是荧光的。只有13％的由载体ILV-cases9转导的靶细胞HCT116-GFP-CloneD2-H1-GuideU3-U6-GuideD1还是荧光。当靶细胞HCT116-GFP-CloneD2-H1-GuideU3-U6-GuideD1由MS2RLP-cases9 12X颗粒转导，观察到荧光细胞数量减少了约57％。这表明57％的细胞已经经受在其基因组中GFP序列的敲除。所述含有12次重复的茎-环序列的MS2-(NC)-RLP 12X颗粒因此对于编码cases9核酸酶的mRNA的转移是有效的，和从而使基因组实施编辑。
实施例2比较MS2重复单元在转导HCT116细胞的第二特定克隆后在MS2(NC)-RLP 2X颗粒中衣壳化导引RNA的位置
一.材料与方法
1.质粒构建
1.1用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2-(NC)-RLP 2X的质粒
·用于目标序列的表达质粒
表达质粒携带如图VII或VIII所示的具有或不具有内含子序列或RNA稳定序列的表达盒。为了输送RNA进入慢病毒颗粒，MS2 RNA(对于常规导引D1，ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag，SEQ ID No.1；对于嵌合导引D1，ggccaacatgaggatcacccatgtctgcagggccSEQ ID No.3)的茎-环基序的2次重复已经被插入导引RNA的表达盒下游(常规导引D1，如图VII)，或被包含在导引的支架部分中(嵌合导引D1，如图VIII)。使用的启动子是H1启动子，但也可以使用其他启动子，例如U6启动子。使用RNA pol III依赖型启动子，如H1或U6，需要存在转录终止信号(末端(Term))。目标序列是靶向GFP序列的非编码RNA(sgRNA＝导引RNA)。
·衣壳化质粒：
将慢病毒颗粒修饰为在核衣壳蛋白内，而不是第二锌指结构域中，包含噬菌体MS2“外壳”蛋白的序列。p8.74衣壳化质粒，携带编码结构和功能的蛋白(GAG，POL)的基因，用于生产MS2RLP2X颗粒，被根据图IIa所示的策略修饰：该p8.74质粒用于通过装配PCR产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二锌指的质粒。通过HpaI克隆将第二个锌指用噬菌体MS2“外壳”蛋白取代，以产生质粒p8.74ΔZF-MS2-Coat。这给出了图IIb中所示的结构。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变，例如如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列，而不改变MS2RLP 2X的功能。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒携带编码包膜蛋白的基因，该蛋白可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
这些质粒用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2-(NC)-RLP12X。更特别地，这些质粒用于产生MS2RLP-GuideD1Classical 2X和MS2RLP-GuideD1Chimeric 2X慢病毒颗粒。
1.2用于产生整合型慢病毒载体ILV的质粒
1.2.1.用于产生对照整合型慢病毒载体LV-GuideD1的质粒
·用于目标序列的表达质粒
表达质粒携带如图Vc所示的表达盒。该质粒可含有其他元件，如天然WPRE序列(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Elément)或cPPT/CTS序列。通过取代转基因逆转录病毒复制所需的病毒基因组区域来消除病毒致病性。使用的启动子是H1或U6，但也可以使用其他启动子。目标序列是导引(图Vc)。
·衣壳化质粒：
携带编码结构和功能蛋白(Gag，Pol)的基因的衣壳化质粒p8.74用于产生整合型慢病毒载体(图VI)。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒与用于产生慢病毒MS2RLP颗粒的包膜质粒相同(图III)。
1.2.2.用于产生ILV-GFP整合型慢病毒载体的质粒，用于产生靶细胞HCT116-GFP Clone D2
根据与实施例1相同的方法制备这些质粒。
1.2.3用于生产ILV-Cas9整合型慢病毒载体的质粒，用于制备靶细胞HCT116-GFP Clone D2-EF1-Cas9WT
根据与实施例1相同的方法制备这些质粒。
批量生产慢病毒颗粒和慢病毒载体
如实施例1中所述制备慢病毒颗粒和慢病毒载体，并被根据如实施例1中所述方法P1浓缩和纯化。
更具体地，对于MS2RLP-GuideD1 Classic 2X和MS2RLP-GuideD1 Chimeric 2X批次，转染混合物由以下三种质粒组成：
-表达质粒pcDNA-H1-GuideD1-MS2 2X(其表达盒如图VII所示)或质粒pcDNA-H1-GuideD1Chimeric-MS2 2X(其表达盒如图VIII所示)，
-p8.74ΔZF-MS2 Coat质粒(其表达盒如图IIb所示)
-携带包膜VSV-G的质粒pENV(其表达盒如图III所示)。
所用质粒的比例与实施例1的相同。
3.滴定批量慢病毒颗粒和慢病毒载体
如实施例1中所述，滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体。
4.通过根据本发明的慢病毒颗粒MS2-(NC)-RLP 2X产生靶细胞和转导该实施例旨在确定用于在MS2RLP颗粒中导引RNA衣壳化的MS2重复的茎-环基序位置是否赋予用于敲除靶基因的颗粒的有效性。
4.1靶细胞HCT116-GFP Clone D2
通过与实施例1相同的方法制备该克隆。
4.2靶细胞HCT116-GFP cloneD2-Cas9和通过根据本发明的MS2-(NC)-RLP 2X慢病 毒颗粒转导
将HCT116-GFPCloneD2-Cas9细胞以25000细胞/cm2接种在24-孔平板内在37℃/5％CO2温育24小时。首先，在MOI40在8微克/毫升存在下，细胞被ILV-Cas9载体转导。4小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。
用ILV-Cas9载体转导后1周，HCT116-GFPCloneD2-Cas9靶细胞通过递送抗-GFP导引RNA(常规的或嵌合的)的MS2(NC)-RLP 2X颗粒转导，剂量为10pg p24/细胞，或在MOI40通过ILV-GuideD1载体在8μg/mL存在下转导。在MS2RLP颗粒的情况下，细胞防御机制抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。4小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。通过MS2RLP-guides-MS2 2X在D14后-转导，回收细胞并通过细胞计量法(MacsQuant VYB，Miltenyi Biotec)定量表达GFP的细胞的百分比。
I.结果
这个实验的目的是比较MS2重复单元在转导HCT116细胞的第二特定克隆后在MS2(NC)-RLP 2X颗粒中衣壳化导引RNA的位置。首先，在图X中显示的结果表明，非转导(NT)的HCT116细胞不是荧光的(<0.16％的GFP阳性细胞)，而多于99％的靶细胞的HCT116-GFPCloneD2是荧光的。只有13％的由载体ILV-GuideD1转导的靶细胞HCT116-GFPCloneD2-Cas9还是荧光。当靶细胞HCT116-GFP cloneD2-Cas9由MS2RLP 2X-Guide颗粒转导，对于运输常规导引的MS2RLP-GuideD1Classical 2X，观察到荧光细胞数量非常少地减少了2％，和对于运输嵌合导引的MS2RLP-GuideD1Chimeric 2X，观察到荧光细胞数量较大地降低约10％。因此，重复基序MS2的位置影响MS2RLP 2X颗粒的有效性。如果消失(extinction)百分比保持适中，结果表明MS2RLP 2X颗粒允许转移导引RNA，和从而进行基因组编辑。
实施例3：在MS2(NC)-RLP 2X颗粒中携带导引RNA的表达质粒的单量或双量对于转导HCT116细胞的第二克隆的影响
一.材料与方法
1.质粒构建
1.1用于生产慢病毒载体ILV的质粒
1.1.1质粒，用于生产用于制备靶细胞HCT116-GFPClone D2-EF1-Cas9的ILV- cases9整合型慢病毒载体
这些质粒根据与实施例1相同的方法的制备
1.1.2质粒，用于产生靶细胞HCT116-GFPClone D2的ILV-GFP整合型慢病毒载体
根据与实施例1相同的方法制备这些质粒。
1.1.3质粒，用于生产对于导引(ILV-GuideD1)的对照整合型慢病毒载体
根据与实施例2相同的方法制备这些质粒。
1.2质粒，用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 2X
根据与实施例1相同的方法制备这些质粒。更具体地，使用用于生产慢病毒颗粒MS2RLP-GuideD1 Chimeric 2X的质粒。
2.批量生产慢病毒颗粒和慢病毒载体
2.1慢病毒颗粒和慢病毒载体的产生
用HEK293T细胞(ATCC,CRL-11268)在10-叠CellSTACK(6360cm2,Corning)中进行生产，所述细胞在补充了1％青霉素/链霉素和1％超谷氨酰胺(PAA)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM,Gibco,Paisley,UK)中在含有5％CO2的恒湿气氛下在37℃培养。MS2RLP2X颗粒通过下述三种质粒转染：
-上述的表达质粒之一，使用单量或双量，取决于是否形成颗粒(MS2-(NC)-RLP2X)或单量整合型载体(ILV)，
-p8.74△ZF Coat(MS2-(NC)-RLP 2X)或p8.74(ILV)，
-带有包膜VSV-G的pENV。
更特别地，MS2RLP-GuideD1Chimeric 2X慢病毒颗粒通过下述三种质粒转染：
-表达质粒pcDNA-H1-GuideD1Chimeric-MS2 2X(其表达盒如图VIII所示)，使用单量或双量，
-p8.74△ZF Coat-MS2 Coat(其表达盒如图IIb所示)
-携带包膜VSV-G的pENV(其表达盒如图III所示)。
质粒的各自比例如下：40％表达质粒，30％质粒p8.74ΔZF，30％质粒pENV，60％表达质粒，20％质粒p8.74或p8.74ΔZF，20％质粒pENV，在产生包含单个表达质粒的情况下，其量是2倍。
用磷酸钙标准转染以后24小时，将培养物上清液用新鲜的未补充的DMEM培养基替换。将细胞在37℃/5％CO2温育。更换培养基以后，将上清液收获4次(转染后32h、48h、56h和72h)。每次收集物通过在3000g离心5min进行澄清，然后在0.45μm过滤器(Millipore)上微滤。然后将所有收集物合并以组成粗制上清液。
如实施例1中所述产生ILV-Cas9慢病毒载体。
如实施例1中所述产生ILV-GFP慢病毒载体。
如实施例2中所述产生ILV-GuideD1慢病毒载体。
2.2慢病毒颗粒和慢病毒载体的浓缩和纯化
根据实施例1中描述的方法P1浓缩和纯化载体和颗粒。
3.滴定批量慢病毒颗粒和慢病毒载体
如实施例1中所述滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体。
4.通过根据本发明的慢病毒颗粒MS2-(NC)-RLP 2X产生靶细胞和转导
该实施例旨在比较MS2(NC)-RLP 2X颗粒用于敲除靶基因的有效性，颗粒使用单量或双量的携带guideD1Chimeric RNA的表达质粒，在表达Cas9酶的HCT116-GFP cloneD2-EF1-Cas9细胞中包含的靶向编码GFP的序列。
4.1HCT1 16-GFP克隆D2靶细胞
根据与实施例1相同的方法制备该克隆。
4.2靶细胞HCT116-GFP cloneD2-Cas9和通过根据本发明的MS2-(NC)-RLP 2X慢病 毒颗粒转导
将HCT116-GFP Clone D2细胞以25000cells/cm2个细胞接种在24-孔平板内在37℃/5％CO2温育24小时。首先，在MOI40在8微克/毫升存在下，细胞被载体ILV-Cas9(这些载体如实施例中所示制备)转导。4小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。用ILV-Cas9转导后1周，HCT116-GFPCloneD2-Cas9细胞通过递送嵌合导引D1(使用单量或双量表达质粒生产)的MS2RLP颗粒转导或通过ILV-GuideD1载体转导，剂量为10pgp24/细胞，在8μg/mL存在下。在MS2(NC)-RLP 2X颗粒的情况下，细胞防御机制抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。4小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。在D14后-转导，回收细胞并通过细胞计量法(Macs Quant VYB，Miltenyi Biotec)定量表达GFP的细胞的百分比。
II.结果
该实验的目的是比较使用单量或双量表达质粒生产的递送导引RNA的颗粒MS2RLP的制备。首先，在图XI中显示的结果表明，非转导的(NT)HCT116细胞不是荧光的(<0.2％GFP阳性细胞)，而靶细胞HCT116-GFPCloneD2的99％以上的是荧光的。由载体ILV-GuideD1转导的靶细胞HCT116-GFPCloneD2-cases9的小于9％还是荧光的。当靶细胞HCT116-GFPCloneD2-Cas9由MS2RLP-GuideD1Chimeric 2X转导时，对于运输单剂量表达质粒产生的嵌合导引的MS2RLP 2X颗粒，观察到荧光细胞数量减少6％。对于运输用双量表达质粒产生的嵌合导引的MS2RLP 2X颗粒，这种降低加倍(13％的阴性HCT116-GFP CloneD2-Cas9靶细胞)。用于产生MS2RLP 2X颗粒的双倍剂量表达质粒可能因此改善了guideD1 RNA的衣壳化率，因此在GFP序列敲除方面具有更好的效率。
实施例4：MS2RLP颗粒对在HCT116-GFP细胞中递送CRISPR/Cas9系统(导引RNA+编码Cas9的RNA)的有效性
一.材料与方法
1.质粒构建
1.1用于产生根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X的质粒
其表达盒在实施例1(图I，的pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X)中所示的表达质粒和在实施例2(图VIII，的pcDNA-H1-GuideDI Chimerique-MS2 2X)中所示的表达质粒被用来共衣壳化，相同MS2RLP12X-2X颗粒，编码cases9的RNA和靶向GFP序列的导引RNA整合入靶细胞基因组(HCT1 16-GFP CloneD2)。
·衣壳化质粒：
将慢病毒颗粒修饰为在核衣壳蛋白内，而不是第二锌指结构域中，包含噬菌体MS2“外壳”蛋白的序列。p8.74衣壳化质粒，携带编码结构和功能的蛋白(GAG，POL)的基因，用于生产MS2RLP 12X-2X颗粒，被根据图IIa所示的策略修饰：该p8.74质粒用于通过装配PCR产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二锌指的质粒。通过HpaI克隆将第二个锌指用噬菌体MS2“外壳”蛋白取代，以产生质粒p8.74ΔZF-MS2-Coat。这给出了图IIb中所示的结构。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变，例如如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列，而不改变MS2RLP的功能。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒携带编码包膜蛋白的基因，该蛋白可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
这些质粒用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2-(NC)-RLP12X和2X(或MS2RLP12X 2X)。更特别地，这些质粒用于产生MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1Chimeric 2X慢病毒颗粒。
1.2.用于产生靶细胞生成的ILV-GFP慢病毒载体的质粒HCT1 16-GFP Clone D2根据与实施例1相同的方法制备这些质粒。
2.批量生产慢病毒颗粒和慢病毒载体
在生产细胞上转染质粒后，收获上清液，并根据申请WO2013/014537中描述的前述方法P1或P2之一以原料或浓缩/纯化方式使用。
2.1慢病毒颗粒的产生
用HEK293T细胞(ATCC,CRL-11268)在10-叠CellSTACK(6360cm2,Corning)中进行生产，所述细胞在补充了1％青霉素/链霉素和1％超谷氨酰胺(PAA)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM,Gibco,Paisley,UK)中在含有5％CO2的恒湿气氛下在37℃培养。
通过转染以下四种质粒进行MS2(NC)-RLP 12X-2X颗粒的生产：
-上述两种质粒，pcDNA-H1-GuideD1Chimeric-MS2 2X质粒(图VIII)的用量是pcDNA-EF1-Cas9-MS212X质粒的两倍；
-p8.74ΔZF-MS2-Coat；
-带有包膜VSV-G的pENV。
更具体地，MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1Chimeric 2X慢病毒颗粒通过转染以下四种质粒产生：
-上述两种质粒，pcDNA-H1-GuideD1Chimeric-MS2 2X质粒(表达盒在图VIII示出)的用量是pcDNA-EF1-Cas9-MS212X质粒(其表达盒如图I)的两倍
-p8.74ΔZF-MS2-Coat(其表达盒如图IIb所示)；
-带有包膜VSV-G的pENV(其表达盒如图III所示)。
用磷酸钙标准转染以后24小时，将培养物上清液用新鲜的未补充的DMEM培养基替换。将细胞在37℃/5％CO2温育。更换培养基以后，将上清液收获4次(转染后32h、48h、56h和72h)。每次收集物通过在3000g离心5min进行澄清，然后在0.45μm过滤器(Millipore)上微滤。然后将所有收集物合并以组成粗制上清液。
因此，该产物包含两种表达质粒，衣壳化质粒和包膜质粒。使用的质粒比例为：
-33％编码导引的表达质粒，
-17％编码Cas9的表达质粒(编码导引的表达质粒的量是编码Cas9的表达质粒的表达质粒的量的双倍，
-25％质粒p8.74ΔZF，和
-25％质粒pENV。
如实施例1中所述产生ILV-GFP慢病毒载体。
2.2慢病毒颗粒和慢病毒载体的浓缩和纯化
根据实施例1中描述的方法P1浓缩和纯化颗粒和载体。
3.通过ELISAp24测试滴定物理颗粒
使用并遵循关于HIV-1p24 ELISA试剂盒(Perkin Elmer)的推荐，在病毒上清液中直接检测p24衣壳蛋白。使捕获的p24蛋白与生物素化的多克隆抗体形成复合物，然后通过抗生蛋白链菌素-HRP过氧化物酶缀合物检测。将得到的复合物与底物邻-苯二胺-HCl(OPD)一起温育以后通过分光光度法检测，所述底物产生与捕获的p24的量直接成比例的黄色。使用微量培养板读数器Synergy H1 Hybrid(Biotek)定量每个孔的吸光度，并相对于p24蛋白校准参照范围的吸光度进行校准。从已知1pg p24蛋白对应于104个物理颗粒得到的p24蛋白浓度，计算以物理颗粒/mL表达的病毒滴度。
如实施例1中所述滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体。
4.根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X产生靶细胞和转导这个实施例的目的是表明，有可能共衣壳化，在相同的MS2RLP 2X-12X颗粒中，相同MS2RLP12X-2X颗粒，编码cases9的RNA和靶向GFP序列的导引RNA整合入靶细胞基因组中，然后通过MS2RLP-Cas912X-GuideD1Chimeric 2X颗粒将这些不同的RNA转移到靶细胞HCT116-GFP cloneD2中。RNA转移结束时，CRISPR/Cas9系统必须是功能性的并产生双链DNA断裂，允许敲除靶基因，和从而将GFP+细胞转化为GFP-细胞，使用同一种用于转移CRISPR/Cas9系统的2种成分的工具。
4.1HCT116-GFP cloneD2靶细胞
根据与实施例1相同的方法制备该克隆。
4.2根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X转导HCT116-GFP CloneD2靶细 胞
将HCT116-GFPClone D2靶细胞以25000cells/cm2个细胞接种在24-孔平板内在37℃/5％CO2温育24小时。通过递送Cas9和嵌合导引D1两者的MS2RLP 12X-2X颗粒转导HCT116-GFPCloneD2细胞，剂量为10pg p24/细胞，在8μg/mL存在下。在MS2RLP12X-2X颗粒的情况下，细胞防御机制抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。4小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。在第一次转导后6天，以相同条件下进行第二次转导(图XX)。最终，在第一次转导后12天，以相同条件下进行第二次转导(图XII)。在最后一次转导后14天，回收细胞并通过细胞计量法(Macs Quant VYB，Miltenyi Biotec)定量表达GFP的细胞的百分比。
II.结果
该实验的目的是研究，通过在靶细胞中测试CRISPR/cases9系统的功能性，经由MS2RLP 12X 2X颗粒同时转移编码cases9RNA和导引RNA的可能性。首先，在图XII中显示的结果表明，非转导的(NT)HCT116细胞不是荧光的(<0.2％GFP+细胞)，而靶细胞HCT116-GFPCloneD2的96％以上的是荧光的。当用递送完整CRISPR/Cas9系统的MS2(NC)-RLP 12X-2X颗粒转导靶细胞时，在第三次转导细胞后14天观察到荧光细胞数量减少38％。因此，GFP基因的敲除为约38％，使用递送Cas9核酸酶和抗GFP导引两者的MS2RLP 12X 2X颗粒。因此，与只有在转导时加入两批分别转运Cas9核酸酶RNA和导引RNA的颗粒时相比(图XII和图XI)，当通过分别表达核酸酶和导引RNA的两种表达质粒种类的共转染产生的单批MS2RLP颗粒而转导靶细胞时，通过CRISPR/Cas9系统的靶基因的消失效率提高了3倍。
在图XX中呈现的结果表明，非转导的(NT)HCT116细胞不是荧光的(<0.2％GFP+细胞)，而靶细胞HCT116-GFPCloneD2的99％以上的是荧光的。当靶细胞用递送全CRISPR/cases9系统的MS2(NC)-RLP 12X 2X颗粒转导靶细胞时，第二转导细胞后14天，观察到，荧光细胞的数目减少57％。因此，用递送编码Cas9核酸酶和抗GFP导引的RNA的MS2RLP 12X-2X颗粒敲除约57％的GFP基因。作为提醒，发现当Cas9组成型表达并且导引RNA由MS2RLP颗粒提供时，表达GFP的细胞百分比降低12.8％(图XI)。因此，当在两次转导后递送编码Cas9的RNA和导引RNA的MS2RLP颗粒时，表达GFP的细胞百分比较低为五分之一(图XX)。两次转导后仍然表达GFP的细胞与MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1Chimeric 2X颗粒的三次转导相比的分析表明，经过两次转导(57％有效性，图XX)后，CRISPR系统似乎比三次转导后更有效(38％有效性，图XII)。这种差异可以通过以下事实来解释：当CRISPR系统被递送到靶细胞(HCT116-GFPCloneD2)中时，它将在靶序列的水平上产生双链DNA的断裂，即编码蛋白质GFP的序列，也是非特异性的其他序列。事实上，CRISPR系统具有一定程度的非特异性切割，称为“脱靶效应”，允许产生也经历DNA修复系统的双链DNA断裂(NHEJ系统，用于非同源末端连接)，就像具体产生的双链DNA断裂一样。CRISPR系统递送到靶细胞中越多，它将显示越多的“脱靶效应”，在同一靶细胞中将产生双链DNA断裂。该系统达到NHEJ系统饱和的极限，和DNA不再被修复。在这种情况下，基因组DNA的非修复诱导转导细胞的死亡。这是在MS2RLP-Cas912X-GuideD1Chimeric 2X颗粒转导3次的细胞中观察到的。事实上，转导三次的细胞最终死于培养瓶中。因此，未被转导的细胞，因此未受到允许蛋白质GFP消失的CRISPR系统的影响，对于转导三次的细胞具有增殖优势，这解释了为什么表达GFP的细胞水平是通过MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1Chimeric 2X颗粒在三次转导后比两次转导后更高。
总之，根据基因组编辑的有效性，和根据细胞类型，这些MS2RLP 12X 2X颗粒在一次或两次转导后仅使用一批颗粒标记为共同递送CRISPR/Cas9系统的最佳工具。
实施例5用于TALEN系统的根据本发明的慢病毒颗粒
在基因组编辑策略中使用TALEN系统要求使用在产生的双链DNA断裂位点(TALEN5')的上游固定的第一TALEN，以及在产生的双链DNA断裂位点(TALEN 3')的下游固定的第二TALEN。
图XIIIa显示了表达质粒，其允许产生表达TALEN的MS2RLP 12X颗粒，所述TALEN固定在产生的双链DNA断裂的上游(5'侧)。
图XIIIb显示了表达质粒，其允许产生表达TALEN的MS2RLP 12X颗粒，所述TALEN固定在产生的双链DNA的断裂的下游(3'侧)。
图XIVa显示了表达质粒，其允许产生表达TALEN的整合型颗粒ILV，所述TALEN固定在产生的双链DNA断裂的上游(5'侧)。
图XIVb显示了表达质粒，其允许产生表达TALEN的整合型颗粒ILV，所述TALEN固定在产生的双链DNA的断裂的下游(3'侧)。
实施例6：根据本发明的用于锌指核酸酶系统的慢病毒颗粒
在基因组编辑策略中使用锌指核酸酶系统需要使用固定在产生的双链DNA(ZFP5')断裂位点上游的第一锌指，以及第二锌指。固定在产生的双链DNA(ZFP 3')的断裂位点的下游。
图XVa显示表达质粒，其允许产生表达锌指的MS2RLP 12X颗粒，所述锌指固定在产生的双链DNA的断裂的上游(5'侧)。
图XVb显示了表达质粒，其允许产生表达锌指的MS2RLP 12X颗粒，所述锌指固定在产生的双链DNA的断裂的下游(3'侧)。
图XVIa显示了表达质粒，其允许产生表达锌指的整合型颗粒ILV，其固定在产生的双链DNA断裂的上游(5'侧)。
图XVIb显示了表达质粒，其允许产生表达锌指的整合型颗粒ILV，其固定在产生的双链DNA的断裂的下游(3'侧)。
实施例7通过整合酶的修饰构建慢病毒颗粒PP7(IN)-RLP
一.材料与方法
1.质粒构建
·用于目标序列的表达质粒
表达质粒携带具有或不具有内含子序列或RNA稳定序列的表达盒(参见图XVII)。为了输送mRNA进入慢病毒颗粒，PP7 RNA(ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQID No.2)的茎-环基序的12次重复已经被插入报告基因的表达盒下游(图XVII)。
使用的启动子可以是CMV或EF1的启动子(图XVII)，但也可以使用其他启动子。目标序列可以是编码报道蛋白的DNA，如天然萤火虫荧光素酶(图XVII)，绿色(ZsGreenl)，红色(mCherry的)或蓝色(mtBFP)荧光蛋白，或编码的蛋白质的cDNA，例如CRE蛋白质。目标序列也可以是shRNA，miRNA，sgRNA，LncRNA或circRNA的序列。
·衣壳化质粒：
将慢病毒颗粒修饰为在整合酶内含有噬菌体PP7“外壳”蛋白质的序列。p8.74衣壳化质粒，携带编码结构和功能的蛋白(GAG，POL)的基因，用于生产颗粒PP7(IN)-RLP，其被根据图XVIII所示的策略修饰：此p8.74质粒用于通过装配PCR产生质粒，在该质粒上PP7噬菌体的Coat蛋白与整合酶的C末端结构域融合。通过HpaI克隆获得的这种融合使得可以产生P8.74-POL-PP7 Coat质粒。由此获得图XIX中所示的结构。编码序列的Pol可以在某些功能元件中缺失或突变，例如编码逆转录酶(RT)的序列。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒携带编码包膜蛋白的基因，该蛋白可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
2.慢病毒颗粒的生产，浓缩/纯化和滴定
根据方法P1，如实施例1中所述制备慢病毒颗粒。
3.荧光素酶表达动力学
将HCT116细胞(ATCC，CCL-247)接种在96孔板中并在37℃/5％CO2下温育24小时。根据方法P1产生的PP7(IN)-RLP-Luc 12X颗粒的转导，在8μg/mL Polybrene存在下进行，剂量为2.8pg p24/细胞。4小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。在转导后4小时，8小时，24小时，32小时和48小时，回收细胞并使用OneGlo荧光素酶测定试剂盒(Promega)按照供应商的建议并使用Synergy H1 Hybrid读板器(Biotek)分析荧光素酶表达。该测定一式三份进行。未转导的HCT116细胞用作对照。
II.结果
可以用整合酶中的PP7-Coat将RNA转运到慢病毒颗粒中。在8小时达到最大荧光素酶表达。8小时后，荧光素酶活性降低。因此，PP7(IN)-RLP颗粒可以递送RNA。
实施例8：MS2RLP颗粒在将CRISPR/Cas9系统(导引RNA+编码Cas9的RNA)递送到HCT116-GFP细胞中随启动子(其允许在生产细胞中转录导引RNA)变化的有效性
一.材料与方法
1.质粒构建
1.1用于产生根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 12X和2X的质粒
其表达盒在实施例1(图I，的pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X)中所示的表达质粒和如图XXI所示的表达质粒pcDNA-U6-GuideD1 Chimeric-MS2 2X被用来共衣壳化，相同MS2RLP12X-2X颗粒，在U6启动子控制下，编码cases9的RNA和靶向GFP序列的导引RNA整合入靶细胞基因组(HCT1 16-GFPCloneD2)。
·衣壳化质粒：
将慢病毒颗粒修饰为在核衣壳蛋白内，而不是第二锌指结构域中，包含噬菌体MS2“外壳”蛋白的序列。p8.74衣壳化质粒，携带编码结构和功能的蛋白(GAG，POL)的基因，用于生产MS2RLP 12X-2X颗粒，被根据图IIa所示的策略修饰：该p8.74质粒用于通过装配PCR产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二锌指的质粒。通过HpaI克隆将第二个锌指用噬菌体MS2“外壳”蛋白取代，以产生质粒p8.74ΔZF-MS2-Coat。这给出了图IIb中所示的结构。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变，例如如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列，而不改变MS2RLP的功能。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒携带编码包膜蛋白的基因，该蛋白可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
更特别地，这些质粒用于产生MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1Chimeric 2X慢病毒颗粒。
1.2.用于产生靶细胞生成的ILV-GFP慢病毒载体的质粒HCT1 16-GFP Clone D2
根据与实施例1相同的方法制备这些质粒。
2.批量生产慢病毒颗粒和慢病毒载体
在生产细胞上转染质粒后，收获上清液，并根据申请WO2013/014537中描述的前述方法P1或P2之一以原料或浓缩/纯化方式使用。
2.1慢病毒颗粒的产生
用HEK293T细胞(ATCC,CRL-11268)在10-叠CellSTACK(6360cm2,Corning)中进行生产，所述细胞在补充了1％青霉素/链霉素和1％超谷氨酰胺(PAA)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM,Gibco,Paisley,UK)中在含有5％CO2的恒湿气氛下在37℃培养。
通过转染以下四种质粒进行MS2(NC)-RLP 12X-2X颗粒的生产：
-上述两种质粒，pcDNA-H1-GuideD1Chimeric-MS2 2X质粒(表达盒在图VIII示出)的用量是pcDNA-EF1-Cas9-MS212X质粒(其表达盒如图I)的两倍
-p8.74ΔZF-MS2-Coat(其表达盒如图IIb所示)；
-带有包膜VSV-G的pENV(其表达盒如图III所示)。
用磷酸钙标准转染以后24小时，将培养物上清液用新鲜的未补充的DMEM培养基替换。将细胞在37℃/5％CO2温育。更换培养基以后，将上清液收获4次(转染后32h、48h、56h和72h)。每次收集物通过在3000g离心5min进行澄清，然后在0.45μm过滤器(Millipore)上微滤。然后将所有收集物合并以组成粗制上清液。
如实施例4中所述制备MS2(NC)-RLP 12X 2X慢病毒颗粒。
如实施例1中所述产生ILV-GFP慢病毒载体。
2.2慢病毒颗粒和慢病毒载体的浓缩和纯化
根据实施例1中描述的方法P1浓缩和纯化颗粒和载体。
3.通过ELISAp24测试滴定物理颗粒
使用并遵循关于HIV-1p24 ELISA试剂盒(Perkin Elmer)的推荐，在病毒上清液中直接检测p24衣壳蛋白。使捕获的p24蛋白与生物素化的多克隆抗体形成复合物，然后通过抗生蛋白链菌素-HRP过氧化物酶缀合物检测。将得到的复合物与底物邻-苯二胺-HCl(OPD)一起温育以后通过分光光度法检测，所述底物产生与捕获的p24的量直接成比例的黄色。使用微量培养板读数器Synergy H1 Hybrid(Biotek)定量每个孔的吸光度，并相对于p24蛋白校准参照范围的吸光度进行校准。从已知1pg p24蛋白对应于104个物理颗粒得到的p24蛋白浓度，计算以物理颗粒/mL表达的病毒滴度。
如实施例1中所述滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体。
4.根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X产生靶细胞和转导
这个实施例的目的是表明，有可能共衣壳化，在相同的MS2RLP 2X-12X颗粒中，相同MS2RLP12X-2X颗粒，编码cases9的RNA和靶向GFP序列的导引RNA整合入靶细胞基因组中，然后通过MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1Chimeric 2X颗粒将这些不同的RNA转移到靶细胞HCT116-GFP cloneD2中。RNA转移结束时，CRISPR/Cas9系统必须是功能性的并产生双链DNA断裂，允许敲除靶基因，和从而将GFP+细胞转化为GFP-细胞，使用同一种用于转移CRISPR/Cas9系统的2种成分的工具。
4.1 HCT116-GFP cloneD2靶细胞
根据与实施例1相同的方法制备该克隆。
4.2根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X转导HCT116-GFP CloneD2靶细 胞
将HCT116-GFPClone D2靶细胞以25000cells/cm2个细胞接种在24-孔平板内在37℃/5％CO2温育24小时。通过递送Cas9和嵌合导引D1两者的MS2RLP 12X-2X颗粒转导HCT116-GFPCloneD2细胞，剂量为10pg p24/细胞，在8μg/mL存在下。在MS2RLP12X-2X颗粒的情况下，细胞防御机制抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。4小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。在第一次转导后6天，以相同条件下进行第二次转导(图XX)。最终，在第一次转导后12天，以相同条件下进行第二次转导(图XII)。在最后一次转导后14天，回收细胞并通过细胞计量法(Macs Quant VYB，Miltenyi Biotec)定量表达GFP的细胞的百分比。
II.结果
该实验的目的是评估启动子的作用，该启动子允许表达导引RNA以产生MS2RLP颗粒，同时递送编码Cas9的RNA和导引RNA。
在这个实施例中，测试了两个启动子：H1和U6。
首先，图XXII中显示的结果显示，非转导的(NT)HCT116细胞不是荧光的(<0.1％的GFP+细胞)，而超过99％的HCT116-GFP cloneD2靶细胞是荧光的。当细胞第二次转导后14天，用递送完整的CRISPR/Cas9系统的MS2(NC)-RLP 12X 2X颗粒转导靶细胞时，在从带有H1启动子的质粒开始产生颗粒的情况下，荧光细胞数量减少46.2％，在从带有U6启动子的质粒开始产生颗粒的情况下，荧光细胞数量减少81.9％。因此，在两次转导后从带有U6启动子的质粒开始产生的MS2RLP 12X 2X颗粒观察到GFP基因的最强敲除为约81.9％。因此，当从带有U6启动子的质粒开始产生颗粒时，与从带有H1启动子的质粒开始产生颗粒相比，表达GFP的细胞的百分比几乎低2倍。总之，用于产生要在MS2RLP颗粒中衣壳化的导引RNA的启动子的性质对递送CRISPR/Cas9系统的MS2RLP颗粒的有效性具有影响。
实施例9：MS2RLP颗粒在将CRISPR/Cas9系统(导引RNA+编码Cas9的RNA)递送到活化的原代T淋巴细胞中以敲除PD1基因的有效性
一.材料与方法
1.质粒构建
1.1用于产生根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X的质粒
其表达盒在实施例1(图I，的pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X)中所示的表达质粒和如图XXIII所示的表达质粒pcDNA-U6-Guide_antiPD1Chimeric-MS2 2X被用来共衣壳化，相同MS2RLP12X-2X颗粒，在U6启动子控制下，编码cases9的RNA和靶向GFP序列的导引RNA整合入原代T淋巴细胞基因组中。
·衣壳化质粒：
将慢病毒颗粒修饰为在核衣壳蛋白内，而不是第二锌指结构域中，包含噬菌体MS2“外壳”蛋白的序列。p8.74衣壳化质粒，携带编码结构和功能的蛋白(GAG，POL)的基因，用于生产MS2RLP 12X-2X颗粒，被根据图IIa所示的策略修饰：该p8.74质粒用于通过装配PCR产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二锌指的质粒。通过HpaI克隆将第二个锌指用噬菌体MS2“外壳”蛋白取代，以产生质粒p8.74ΔZF-MS2-Coat。这给出了图IIb中所示的结构。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变，例如如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列，而不改变MS2RLP的功能。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒携带编码包膜蛋白的基因，该蛋白可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
这些质粒用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X。更特别地，这些质粒用于产生MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1Chimeric 2X慢病毒颗粒。
1.2用于产生根据本发明的慢病毒对照颗粒MS2-(NC)-RLP12X的质粒
根据与实施例1所述相同的方法制备这些质粒。更特别是，这些质粒用于制备MSXLR-Cas912X慢病毒颗粒，如实施例1的1.1段所述。
1.3用于产生对照慢病毒载体ILVCas9+guideantiPD1的质粒
·用于目标序列的表达质粒
表达质粒携带如图IV所示的表达盒，和如图XXXII所示的表达盒。该质粒可含有其他元件，如天然WPRE序列(Woodchuck Hepatitis Virus PosttranscriptionalRegulatory Elément)或cPPT/CTS序列。通过取代转基因逆转录病毒复制所需的病毒基因组区域来消除病毒致病性。使用的启动子是EF1启动子，但也可以使用其他启动子。质粒的目标序列是编码Cas9蛋白的RNA的DNA(图IV)，呈其野生形式(WT)或其突变形式(N)。
对于第二质粒，使用的启动子是U6或H1，但也可以使用其他启动子。目标序列是抗PD1导引(图XXXII)。
·衣壳化质粒：
携带编码结构和功能蛋白(Gag，Pol)的基因的衣壳化质粒p8.74用于产生整合型慢病毒载体(图VI)。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒与用于产生慢病毒MS2RLP颗粒的包膜质粒相同(图III)。
2.批量生产慢病毒颗粒和慢病毒载体
在生产细胞上转染质粒后，收获上清液，并根据申请WO2013/014537中描述的前述方法P1或P2之一以原料或浓缩/纯化方式使用。
2.1慢病毒颗粒的产生
用HEK293T细胞(ATCC,CRL-11268)在10-叠CellSTACK(6360cm2,Corning)中进行生产，所述细胞在补充了1％青霉素/链霉素和1％超谷氨酰胺(PAA)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM,Gibco,Paisley,UK)中在含有5％CO2的恒湿气氛下在37℃培养。
通过转染以下四种质粒进行MS2(NC)-RLP 12X-2X颗粒的生产：
-上述两种质粒，pcDNA-U6-Guide_antiPD1Chimeric-MS2 2X质粒(表达盒在图XXIII示出)的用量是pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X质粒(其表达盒如图I)的两倍
-p8.74ΔZF-MS2-Coat(其表达盒如图IIb所示)；
-带有包膜VSV-G的pENV(其表达盒如图III所示)。
根据实施例4中描述的方法制备MS2(NC)-RLP 12X 2X颗粒。
更具体地，这些质粒用于产生慢病毒颗粒MS2RLP-Cas9 12X-GuideantiPD1Chimeric2X。
用磷酸钙标准转染以后24小时，将培养物上清液用新鲜的未补充的DMEM培养基替换。将细胞在37℃/5％CO2温育。更换培养基以后，将上清液收获4次(转染后32h、48h、56h和72h)。每次收集物通过在3000g离心5min进行澄清，然后在0.45μm过滤器(Millipore)上微滤。然后将所有收集物合并以组成粗制上清液。
如实施例4中所述制备MS2(NC)-RLP 12X 2X慢病毒颗粒。
表达CRISPR/cases9系统(导引RNA+cases9)的对照慢病毒ILV的生产、纯化和滴定在与实施例1相同的条件下根据方法P2进行。
2.2慢病毒颗粒的浓缩和纯化
根据实施例1中描述的方法P2浓缩和纯化颗粒和载体。
3.通过ELISAp24测试滴定物理颗粒
使用并遵循关于HIV-1p24 ELISA试剂盒(Perkin Elmer)的推荐，在病毒上清液中直接检测p24衣壳蛋白。使捕获的p24蛋白与生物素化的多克隆抗体形成复合物，然后通过抗生蛋白链菌素-HRP过氧化物酶缀合物检测。将得到的复合物与底物邻-苯二胺-HCl(OPD)一起温育以后通过分光光度法检测，所述底物产生与捕获的p24的量直接成比例的黄色。使用微量培养板读数器Synergy H1 Hybrid(Biotek)定量每个孔的吸光度，并相对于p24蛋白校准参照范围的吸光度进行校准。从已知1pg p24蛋白对应于104个物理颗粒得到的p24蛋白浓度，计算以物理颗粒/mL表达的病毒滴度。
如实施例1中所述滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体。
4.通过根据本发明的MS2(NC)-RLP 12X 2X慢病毒颗粒制备靶细胞和转导这个实施例的目的是表明，有可能共衣壳化编码cases9的RNA和靶向PD1基因序列的导引RNA，在相同的MS2RLP 2X-12X颗粒中，然后通过MS2(NC)-RLP 12X 2X颗粒将这些不同的RNA转移到靶细胞中，活化原代T淋巴细胞。RNA转移结束时，CRISPR/Cas9系统必须是功能性的并产生双链DNA断裂，允许敲除靶PD1基因，使用同一种用于转移CRISPR/Cas9系统的2种成分的工具。
4.1靶细胞，活化的原代T淋巴细胞的制备
靶细胞即T淋巴细胞由外周血样品制备。通过Ficoll梯度离心分离来自外周血的单核细胞，然后在T75烧瓶中在37℃/5％CO2下粘附2小时。回收悬浮细胞，并使用磁珠(PanT细胞分离试剂盒，Miltenyi Biotec)通过阴性选择纯化T淋巴细胞。将纯化的T淋巴细胞在37℃/5％CO2下活化24小时(Human T-Activator CD3/CD28，ThermoFisher)。
4.2转导靶细胞，活化的原代T淋巴细胞
靶细胞，活化的原代T淋巴细胞，以1 000 000细胞/cm2接种在24-孔平板内，并通过递送Cas9和导引的MS2RLP 12X 2X颗粒转导，或通过仅递送Cas9的MS2RLP 12X颗粒(阴性对照)转导，在8μg/mL存在下，使用不同剂量(0.1；0.5；1或5pg p24/细胞)，或通过通过递送Cas9和导引的ILV颗粒转导(阳性对照)，使用不同剂量(MOI)5,10,25,50)。在MS2RLP 12X 2X和MS2RLP 12X颗粒的情况下，细胞防御机制抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。
4小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。48小时后，在与第一次相同的条件下进行第二次转导。在第二次转导后4天，回收细胞，并在用抗PD1抗体(MiltenyiBiotec)免疫标记细胞后，通过细胞计量法(Macs Quant VYB，Miltenyi Biotec)定量表达PD1的细胞的百分比。
通过在细胞的FACS分析之前添加Viobility TM可固化染料(Miltenyi Biotec)来分析生存力，并且通过用抗TCR和抗CD25抗体(Miltenyi Biotec)对细胞进行免疫标记来进行淋巴细胞的表型分型。
结果
该实验的目的是评估由MS2RLP颗粒递送的CRISPR/Cas9系统用于敲除原代细胞的内源基因(例如活化的原代T淋巴细胞中的PD1基因)的有效性(图XXIV)。
PD1基因在肿瘤环境中受到特别关注，因为PD1表达的消失允许免疫系统识别肿瘤细胞。
当细胞用递送完整CRISPR/Cas9系统的MS2(NC)-RLP 12X 2X颗粒转导时，第二次转导后4天，表达蛋白质PD1的细胞数量减少的数量，在第一剂量(0.1pg p24/细胞)的情况下为31％，在第二剂量(0.5pg p24/细胞)的情况下为60％，在第三剂量(1pg p24/细胞)的情况下为75％，在第四剂量(5pg p24/细胞)的情况下为86％。同时，仅表达Cas9的MS2RLP用作PD1基因敲除的阴性对照。结果显示，无论使用何种剂量的递送CRISPR/Cas9系统的MS2RLP 12X 2X颗粒，表达PD1蛋白的细胞百分比都是稳定的。
图XXV显示ILV颗粒在与用于使用MS2RLP 12X 2X颗粒递送CRISPR/Cas9系统的条件相当的条件下递送CRISPR/Cas9系统以敲除PD1基因的有效性。在使用的最高MOI(MOI50)下，42％的细胞表达PD1基因，而在最高剂量的MS2RLP(5pg p24/细胞)，仅有14％的细胞表达PD1基因。因此，MS2RLP颗粒是递送CRISPR/Cas9系统并允许有效敲除内源性靶标的最佳工具。
图XXIV和XXV是从作为原代细胞的活化的人T淋巴细胞的转导获得的，因此对于任何操作都是敏感和微妙的。图XXVI说明在用递送CRISPR/Cas9系统的MS2RLP 12X-2X颗粒进行第一次和第二次转导后T淋巴细胞活力的测量。图XXVI允许确定递送CRISPR/Cas9系统的MS2RLP 12X 2X颗粒的最佳剂量，对应于1pg p24/细胞，以获得PD1基因的有效敲除(图XXIV，75％敲除PD1基因)不影响活化的T淋巴细胞的活力。
图XXVII说明了在用递送CRISPR/Cas9系统的MS2RLP 12X-2X颗粒进行第二次转导后，通过测量TCR和CD25活化标记物的表达来分析T淋巴细胞的表型。结果显示，无论使用何种剂量的MS2RLP颗粒，表达TCR和CD25的细胞百分比都是稳定的。
总之，图XXIV，XXVI和XXVII显示MS2RLP颗粒是递送CRISPR/Cas9系统的最佳工具(导引RNA+编码Cas9的RNA)，同时保留转导的T淋巴细胞的活力和表型。
实施例10：MS2RLP颗粒在将CRISPR/Cas9系统(导引RNA+编码Cas9的RNA)递送到活化的原代T淋巴细胞中以敲除CXCR4基因的有效性
一.材料与方法
1.质粒构建
1.1用于产生根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X的质粒
其表达盒在实施例1(图I，的pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X)中所示的表达质粒和如图XXIII所示的表达质粒pcDNA-U6-Guide_antiPD1Chimeric-MS2 2X被用来共衣壳化，相同MS2RLP12X-2X颗粒中，在U6启动子控制下，编码cases9的RNA和靶向CXCR4基因的导引RNA整合入原代T淋巴细胞基因组中。
·衣壳化质粒：
将慢病毒颗粒修饰为在核衣壳蛋白内，而不是第二锌指结构域中，包含噬菌体MS2“外壳”蛋白的序列。p8.74衣壳化质粒，携带编码结构和功能的蛋白(GAG，POL)的基因，用于生产MS2RLP 12X-2X颗粒，被根据图IIa所示的策略修饰：该p8.74质粒用于通过装配PCR产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二锌指的质粒。通过HpaI克隆将第二个锌指用噬菌体MS2“外壳”蛋白取代，以产生质粒p8.74ΔZF-MS2-Coat。这给出了图IIb中所示的结构。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变，例如如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列，而不改变MS2RLP的功能。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒携带编码包膜蛋白的基因，该蛋白可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
这些质粒用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X。更特别地，这些质粒用于产生MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1Chimeric 2X慢病毒颗粒。
1.2用于产生根据本发明的慢病毒对照颗粒MS2-(NC)-RLP12X的质粒
根据与实施例1所述相同的方法制备这些质粒。更特别是，这些质粒用于制备MSXLR-Cas9 12X慢病毒颗粒，如实施例1的1.1段所述。
2.批量生产慢病毒颗粒
在生产细胞上转染质粒后，收获上清液，并根据申请WO2013/014537中描述的前述方法P1或P2之一以原料或浓缩/纯化方式使用。
2.1慢病毒颗粒的产生
用HEK293T生产细胞(ATCC,CRL-11268)在10-叠CellSTACK(6360cm2,Corning)中进行生产，所述细胞在补充了1％青霉素/链霉素和1％超谷氨酰胺(PAA)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM,Gibco,Paisley,UK)中在含有5％CO2的恒湿气氛下在37℃培养。
通过转染以下四种质粒进行MS2(NC)-RLP 12X-2X颗粒的生产：
-上述两种质粒，pcDNA-U6-Guide_antiPD1Chimeric-MS2 2X质粒(表达盒在图XXVIII示出)的用量是pcDNA-EF1-Cas9-MS2 12X质粒(其表达盒如图I)的两倍；
-p8.74ΔZF-MS2-Coat；
-带有包膜VSV-G的pENV。
根据实施例4中描述的相同方法制备MS2(NC)-RLP 12X 2X颗粒。所使用的质粒的比例与实施例4相同。
更具体地，这些质粒用于生产慢病毒颗粒MS2RLP-Cas9 12X-GuideantiPD1Chimeric2X。
用磷酸钙标准转染以后24小时，将培养物上清液用新鲜的未补充的DMEM培养基替换。将细胞在37℃/5％CO2温育。更换培养基以后，将上清液收获4次(转染后32h、48h、56h和72h)。每次收集物通过在3000g离心5min进行澄清，然后在0.45μm过滤器(Millipore)上微滤。然后将所有收集物合并以组成粗制上清液。
如实施例1中所述制备对照慢病毒颗粒MS2-(NC)RLP 12X。
2.2慢病毒颗粒的浓缩和纯化
根据实施例1中描述的方法P2浓缩和纯化颗粒和载体。
3.通过ELISAp24测试滴定物理颗粒
使用并遵循关于HIV-1p24 ELISA试剂盒(Perkin Elmer)的推荐，在病毒上清液中直接检测p24衣壳蛋白。使捕获的p24蛋白与生物素化的多克隆抗体形成复合物，然后通过抗生蛋白链菌素-HRP过氧化物酶缀合物检测。将得到的复合物与底物邻-苯二胺-HCl(OPD)一起温育以后通过分光光度法检测，所述底物产生与捕获的p24的量直接成比例的黄色。使用微量培养板读数器Synergy H1(Biotek)定量每个孔的吸光度，并相对于p24蛋白校准参照范围的吸光度进行校准。从已知1pg p24蛋白对应于104个物理颗粒得到的p24蛋白浓度，计算以物理颗粒/mL表达的病毒滴度。
4.通过根据本发明的MS2(NC)-RLP 12X 2X慢病毒颗粒制备靶细胞和转导
这个实施例的目的是表明，有可能共衣壳化编码cases9的RNA和靶向CXCR4基因序列的导引RNA，在相同的MS2RLP 2X-12X颗粒中，然后通过MS2(NC)-RLP 12X 2X颗粒将这些不同的RNA转移到靶细胞中，活化原代T淋巴细胞。RNA转移结束时，CRISPR/Cas9系统必须是功能性的并产生双链DNA断裂，允许敲除靶CXCR4基因，使用同一种用于转移CRISPR/Cas9系统的2种成分的工具。
4.1制备靶细胞，活化的原代T淋巴细胞
靶细胞即T淋巴细胞由外周血样品制备。通过Ficoll梯度离心分离来自外周血的单核细胞，然后在T75烧瓶中在37℃/5％CO2下粘附2小时。回收悬浮细胞，并使用磁珠(PanT细胞分离试剂盒，Miltenyi Biotec)通过阴性选择纯化T淋巴细胞。将纯化的T淋巴细胞在37℃/5％CO2下活化24小时(Human T-Activator CD3/CD28，ThermoFisher)。
4.2转导靶细胞，活化的原代T淋巴细胞
靶细胞，活化的原代T淋巴细胞，以1 000 000细胞/cm2接种在96-孔平板内，并通过递送Cas9和导引的MS2RLP 12X 2X颗粒转导，或通过仅递送Cas9的MS2RLP 12X颗粒(阴性对照)转导，在8μg/mL存在下，使用不同剂量(0.1；0.5；1或5pg p24/细胞)。在MS2RLP 12X 2X和MS2RLP 12X颗粒的情况下，细胞防御机制抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。
4小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。48小时后，在与第一次相同的条件下进行第二次转导。在第二次转导后4天，回收细胞，并在用抗CXCR4抗体(Miltenyi Biotec)免疫标记细胞后，通过细胞计量法(Macs Quant VYB，MiltenyiBiotec)定量表达CXCR4的细胞的百分比。
通过在细胞的FACS分析之前添加Viobility TM可固化染料(Miltenyi Biotec)来分析存活率，并且通过用抗TCR和抗CD25抗体(Miltenyi Biotec)对细胞进行免疫标记来进行淋巴细胞的表型分型。
II.结果
该实验的目的是评估由MS2RLP颗粒递送的CRISPR/Cas9系统敲除原代细胞的内源基因(例如活化的原代T淋巴细胞中的CXCR4基因)的有效性(图XXIX)。
CXCR4基因是目标靶标，因为其在CD4+T淋巴细胞中的表达的消失允许阻断HIV-1病毒的感染。
当细胞用递送完整CRISPR/Cas9系统的MS2(NC)-RLP 12X 2X颗粒转导时，第二次转导后4天，表达CXCR4蛋白的细胞数量减少的数量，在第一剂量(0.1pg p24/细胞)的情况下为92％，在第二剂量(0.5pg p24/细胞)的情况下为97％，在第三剂量的情况下(1pg p24/细胞)为98％，在第四剂量(5pg p24/细胞)的情况下为99％。
同时，仅表达Cas9的MS2RLP用作敲除CXCR4基因的阴性对照。结果显示表达CXCR4蛋白的细胞百分比是稳定的，无论仅递送Cas9蛋白的MS2RLP 12X颗粒剂量如何。
图XXX和XXXI是从作为原代细胞的活化的人T淋巴细胞的转导获得的，因此对于任何操作都是敏感和微妙的。图XXX说明在用递送CRISPR/Cas9系统的MS2RLP 12X-2X颗粒进行第一次和第二次转导后T淋巴细胞活力的测量。观察到，无论使用何种剂量，用MS2RLP12X 2X颗粒进行的转导都不会改变T淋巴细胞的活力。
递送CRISPR/Cas9系统的MS2RLP 12X 2X颗粒的最佳剂量相当于5pg p24/细胞，并且可以有效敲除CXCR4基因(图XXIX，99％敲除CXCR4基因)不影响活化T淋巴细胞的活力。
图XXXI说明了通过测量TCR和CD25活化标记物的表达，在用递送CRISPR/Cas9系统的MS2RLP 12X 2X颗粒第二次转导以敲除CXCR4基因后T淋巴细胞表型的分析。结果显示，无论使用何种剂量的MS2RLP颗粒，表达TCR和CD25的细胞百分比都是稳定的。
总之，图XXIX，XXX和XXXI显示MS2RLP颗粒是递送CRISPR/Cas9系统的最佳工具(导引RNA+编码Cas9的RNA)，同时保留转导的T淋巴细胞的活力和表型。
实施例11：在HCT116-GFP细胞中递送CRISPR/Cas9系统的MS2RLP颗粒(导引RNA+编码Cas9的RNA)的剂量效应
一.材料与方法
1.质粒构建
1.1用于产生根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X的质粒
根据与实施例8相同的方法制备这些质粒。更具体地，这些质粒用于生产慢病毒颗粒MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1 Chimeric 2X。
1.2用于生成HCT1 16-GFP Clone D2靶细胞用于产生ILV-GFP慢病毒载体的质粒
根据与实施例1相同的方法制备这些质粒。
2.批量生产慢病毒颗粒和慢病毒载体
在生产细胞上转染质粒后，收获上清液，并根据申请WO2013/014537中描述的前述方法P1或P2之一以原料或浓缩/纯化方式使用。
2.1慢病毒颗粒和慢病毒载体的产生
根据实施例4中描述的方法制备MS2RLP 12X 2X慢病毒颗粒。
如实施例1中所述产生ILV-GFP慢病毒载体。
2.2慢病毒颗粒和慢病毒载体的浓缩和纯化
根据实施例1中描述的方法P1浓缩和纯化慢病毒颗粒和慢病毒载体。
3.批量滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体
根据实施例1中描述的方法滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体。
4.通过根据本发明的MS2(NC)-RLP 12X 2X慢病毒颗粒制备靶细胞和转导
该实施例旨在表明，在靶细胞中递送CRISPR/Cas9系统的MS2RLP 12X 2X颗粒在基因组编辑方面具有剂量效应。在RNA转移结束时，CRISPR/Cas9系统应具有功能并产生双链DNA断裂，并转化GFP+细胞至GFP-细胞，允许使用同一工具以转移CRISPR/Cas9系统的2种成分。
4.1 HCT116-GFP cloneD2靶细胞
根据与实施例1相同的方法制备该克隆。
4.2根据本发明的慢病毒颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X转导HCT116-GFP CloneD2靶细 胞
将HCT116-GFP Clone D2靶细胞以25000细胞/cm2接种在24-孔平板内在37℃/5％CO2温育24小时。通过递送Cas9和嵌合导引D1两者的MS2RLP-Cas9 12X-GuideD1Chimeric2X颗粒转导HCT116-GFPCloneD2细胞，使用不同剂量(0.1；0.5；1或5pg p24/细胞)，在8μg/mL存在下。在MS2RLP 12X 2X颗粒的情况下，细胞防御机制抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。5小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。在第一次转导后6天，以相同条件下进行第二次转导(图XXXIII)。在最后一次转导后7天，回收细胞并通过细胞计量法(Macs Quant VYB，Miltenyi Biotec)定量表达GFP的细胞的百分比。
II.结果
该实验的目的是，以不同浓度同时传送编码case9的RNA和导引RNA并测量通过第一转导(图XXXIII，T1阳性细胞％)和第二转导(图XXXIII，T2％阳性细胞)在HCT116CloneD2中的GFP的消失，研究本发明的MS2RLP 12X 2X颗粒诱导基因组编辑方面的剂量效应。
首先，在图XXXIII呈现的结果表明，靶细胞HCT116-GFPCloneD2是100％荧光的，而非转导的(NT)HCT116细胞不是荧光的。当用递送完整CRISPR/cases9系统的MS2RLP 12X 2X颗粒转导细胞时，在细胞第二次转导后7天(图XXXIII，％T2阳性细胞)，荧光细胞的数目减少，观察到剂量效应。无论p24/细胞剂量如何(0.5,1,5或10)，在第二次转导后观察到比第一次转导后更强的GFP的消失。
在第二次转导后，对于0.5μgp24/细胞的剂量，GFP基因敲除约为33％，对于1pg/细胞的剂量，GFP基因敲除约为39％，对于5μgp24/细胞的剂量，GFP基因敲除为约58％，最后对于10μgp24/细胞的剂量，GFP基因敲除为约65％。因此，与第一次转导相比，第二次转导使得可以增加GFP敲除的有效性。MS2RLP 12X 2X颗粒的剂量越高，GFP的敲除越大。
实施例12：PP7RLP颗粒在HCT116-GFP细胞中递送CRISPR/Cas9系统(导引RNA+编码Cas9的RNA)的有效性
一.材料与方法
1.质粒构建
1.1.用于产生根据本发明的慢病毒颗粒PP7(NC)-RLP 2X的质粒
在本实施例中，颗粒PP7(NC)-RLP将被称为2X PP7(NC)-RLP 2X 2X，因为它们包含两个不同系列的PP7系列基序的的茎-环基序(1ST系列的基序：SEQ ID No.2然后SEQ IDNo.4和2nae系列基序：SEQ ID No.5然后SEQ ID No.6)。
·用于目标序列的表达质粒:
第一表达质粒携带具有或不具有内含子序列或RNA稳定序列的表达盒(如图XXXIV)(pcDNA-EF1-Cas9-PP7 2X)。为了输送mRNA进入慢病毒颗粒，PP7RNA(ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID No.2and ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag SEQ ID No.4)的茎-环基序的2次重复已经被插入Case9酶序列的表达盒下游(图XXXIV)。使用的启动子是EF1启动子(图XXXIV)，但也可以使用其他启动子。目标质粒序列是编码Cases9蛋白的RNA的DNA(图XXXIV)，呈它的野生型(WT)或它的突变形式(N)。
第二表达质粒携带具有或不具有内含子序列或RNA稳定序列的表达盒(如图XXXV)(pcDNA-U6-GuideD1Chimeric-PP7 2X)。为了输送导引RNA进入慢病毒颗粒，PP7RNA(ggagcagacgatatggcgtcgctcc SEQ ID No.5and ccagcagagcatatgggctcgctgg SEQ IDNo.6)的茎-环基序的2次重复已经被插入在表达盒中在导引的支架部分中(嵌合导引，图XXXV)。使用的启动子是U6，但也可以使用其他启动子，如H1。使用RNA pol III依赖型启动子，如H1或U6，需要存在转录终止信号(末端(Term))。目标序列是靶向GFP序列的非编码RNA(sgRNA＝导引RNA)。
在相同的颗粒PP7RLP 2X中，使用这些表达质粒来共衣壳化编码cases9的RNA和靶向GFP序列的导引RNA，整合入靶细胞的基因组中(HCT1 16-GFPCloneD2)。
·衣壳化质粒：
将慢病毒颗粒修饰为在核衣壳蛋白内，而不是第二锌指结构域中，包含噬菌体MS2“外壳”蛋白的序列。p8.74衣壳化质粒，携带编码结构和功能的蛋白(GAG，POL)的基因，用于生产MS2RLP2X颗粒，被根据图XXXVIa所示的策略修饰：该p8.74质粒用于通过装配PCR产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二锌指的质粒。通过HpaI克隆将第二个锌指用噬菌体MS2“外壳”蛋白取代，以产生质粒p8.74ΔZF-MS2-Coat。这给出了图XXXVIb中所示的结构。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变，例如如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列，而不改变MS2RLP 2X的功能。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒携带编码包膜蛋白的基因，该蛋白可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
更具体地，这些质粒用于生产慢病毒颗粒PP7RLP Cas9 2X-GuideD1 Chimeric2X。
1.2质粒，用于产生整合型慢病毒载体ILV，用于产生靶细胞HCT1 16-GFPcloneD2
根据与实施例1相同的方法制备这些质粒。
2.批量生产慢病毒颗粒和慢病毒载体
在生产细胞上转染质粒后，收获上清液，并根据申请WO2013/014537中描述的下述方法之一以原料或浓缩/纯化方式使用。
2.1慢病毒颗粒和慢病毒载体的产生
用HEK293T细胞(ATCC,CRL-11268)在10-叠CellSTACK(6360cm2,Corning)中进行生产，所述细胞在补充了1％青霉素/链霉素和1％超谷氨酰胺(PAA)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM,Gibco,Paisley,UK)中在含有5％CO2的恒湿气氛下在37℃培养。
PP7(NC)-RLP 2X 2X颗粒，优选地，PP7RLP-Cas9 2X-GuideD1 Chimeric 2X是通过转染以下4种质粒而制备的：
-上述两种质粒，pcDNA-U6-GuideD1Chimeric-PP7 2X质粒(表达盒在图XXXV示出)的用量是pcDNA-EF1-Cas9-PP7 2X质粒(其表达盒如图XXXIV)的两倍
-p8.74ΔZF-MS2-Coat(其表达盒如图XXXVIb所示)；
-带有包膜VSV-G的pENV(其表达盒如图III所示)。
PP7(NC)-RLP 2X 2X颗粒根据实施例4中描述的方法制备。用磷酸钙标准转染以后24小时，将培养物上清液用新鲜的未补充的DMEM培养基替换。将细胞在37℃/5％CO2温育。更换培养基以后，将上清液收获4次(转染后32h、48h、56h和72h)。每次收集物通过在3000g离心5min进行澄清，然后在0.45μm过滤器(Millipore)上微滤。然后将所有收集物合并以组成粗制上清液。
如实施例1中所述产生ILV-GFP慢病毒载体。
2.2慢病毒颗粒的浓缩和纯化
根据实施例1中描述的方法P1浓缩和纯化慢病毒颗粒和载体。
3.批量滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体
根据实施例1中描述的方法滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体。
4.通过根据本发明的PP7(NC)-RLP 2X 2X慢病毒颗粒制备靶细胞和转导该实施例旨在表明，在靶细胞中递送CRISPR/Cas9系统的PP7RLP颗粒在基因组编辑方面具有剂量效应。在RNA转移结束时，CRISPR/Cas9系统应具有功能并产生双链DNA断裂，并转化GFP+细胞至GFP-细胞，允许使用同一工具以转移CRISPR/Cas9系统的2种成分。
4.1 HCT116-GFP cloneD2靶细胞
根据与实施例1相同的方法制备该克隆。
4.2根据本发明的慢病毒颗粒PP7(NC)-RLP 2X 2X转导HCT116-GFP CloneD2靶细 胞
将HCT116-GFP Clone D2靶细胞以25000细胞/cm2接种在24-孔平板内在37℃/5％CO2温育24小时。通过递送Cas9和嵌合导引D1两者的MS2RLP 12X-2X颗粒转导HCT116-GFPCloneD2靶细胞，在8μg/mL存在下，使用不同剂量(0.1；0.5；1或5pg p24/细胞)。在PP7RLP 12X 2X颗粒的情况下，细胞防御机制抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。17小时后除去转导上清液，并用新鲜的补充培养基替换。在第一次转导后6天，在与第一次相同的条件下进行第二次转导(图XXXVII)。在最后的转导后7天，回收细胞，通过细胞计量法(Macs Quant VYB，Miltenyi Biotec)定量表达GFP的细胞的百分比。
II.结果
该实验的目的是，以不同浓度同时传送编码case9的RNA和导引RNA并测量通过第一转导(图XXXVII，％T1阳性细胞)和第二转导(图XXXVII，％T2阳性细胞)在HCT116CloneD2中的GFP的消失，研究本发明的PP7RLP颗粒诱导基因组编辑上的剂量效应。
首先，在图XXXVII呈现的结果表明，非转导的(NT)HCT116细胞不是荧光的，而100％靶细胞HCT116-GFPCloneD2是荧光的。当用递送完整CRISPR/cases9系统的PP7RLP 2X颗粒转导HCT116 CloneD2细胞时，在细胞第一次和第二次转导靶细胞后7天(图XXXVII，％T2阳性细胞)，荧光细胞的数目减少，观察到剂量效应。无论p24/细胞剂量如何(0.5,1,5或10)，在第二次转导后观察到比第一次转导后更强的GFP的消失。
在第二次转导后，对于0.5μgp24/细胞的剂量，GFP基因敲除约为33％，对于1pg/细胞的剂量，GFP基因敲除约为54％，对于5μgp24/细胞的剂量，GFP基因敲除为约85％，最后对于10μgp24/细胞的剂量，GFP基因敲除为约75％。因此，与第一次转导相比，第二次转导使得可以增加GFP敲除的有效性。PP7RLP颗粒的剂量越高，GFP的敲除越大，在5pg p24/细胞的剂量下达到最大的消失效果。此外，PP7RLP颗粒具有如实施例4中所述的“脱靶效应”，PP7RLP颗粒剂量在5pg p24/细胞至10μgp24/细胞之间。因此，所使用的剂量和转导数量是考虑PP7RLP颗粒在递送完整CRISPR/Cas9系统中的有效性的重要因素。
与MS2RLP颗粒相比，PP7RLP颗粒在HCT116-GFPCloneD2靶细胞中产生更高的GFP消失百分比(分别为图XXXVII和图XXII)。在每个颗粒的最佳剂量下，注意到对于5pg p24/细胞的PP7RLP颗粒，GFP基因的敲除为约85％，而对于10pg p24/细胞的MS2RLP颗粒为约82％，或者比PP7RLP颗粒高出两倍剂量。PP7RLP颗粒的有效性使得优化CRISPR/Cas9 RNA转移成为可能，特别是在可能对几种转导敏感的精细原代细胞中。总之，这些PP7RLP颗粒标记作为共递送CRISPR/Cas9系统的最佳工具，其使用单一类型的颗粒。
实施例13：野生型GAG-POL前体对MS2RLP-ZsGreen112X颗粒的产生的影响，以优化有效的MS2RLP-CRISPR/Cas9颗粒(导引RNA+编码Cas9的RNA)
一.材料与方法
1.质粒构建
1.1用于产生根据本发明的慢病毒颗粒MS2RLP 12X的质粒
·用于目标序列的表达质粒
表达质粒携带具有或不具有内含子序列或RNA稳定序列的表达盒(图I)。为了输送RNA进入慢病毒颗粒，MS2 RNA(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag，SEQ ID No.1)的茎-环基序的12次重复已经被插入ZsGreenl蛋白的序列的表达盒下游。使用的启动子是EF1启动子(图I)，但也可以使用其他启动子。目标质粒是编码ZsGreenl蛋白的RNA的DNA。
·衣壳化质粒：
第一衣壳化质粒是p8.74衣壳化质粒，其表达盒如图IIb中所示，通过根据实施例1图IIa所示的策略修饰p8.74衣壳化质粒以在核衣壳蛋白内(而不是第二锌指结构域中)包含噬菌体MS2“外壳”蛋白的序列。
第二种衣壳化质粒是质粒p8.74，其携带编码野生结构和功能蛋白(Gag，Pol)的基因，如图VI所示。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒携带编码包膜蛋白的基因，该蛋白可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
更具体地，这些质粒用于生产MS2RLP-ZsGreen12X慢病毒颗粒。
1.2用于产生ILV-ZsGreenl整合慢病毒载体的质粒
·用于目标序列的表达质粒:
表达质粒携带表达盒(图XXXXI)。该质粒可含有其他元件，如天然WPRE序列(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Elément)或cPPT/CTS序列。通过取代转基因逆转录病毒复制所需的病毒基因组区域来消除病毒致病性。使用的启动子是EF1启动子，但也可以使用其他启动子。质粒的目标序列是编码ZsGreen1蛋白的RNA的DNA。
p8.74衣壳化质粒，其携带编码结构和功能蛋白(Gag，Pol)的基因，被用于生产整合型慢病毒载体(图VI)。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒与用于生产MS2RLP慢病毒颗粒的包膜质粒相同(图III)。
2.批量生产慢病毒颗粒和慢病毒载体
2.1慢病毒颗粒的产生
用HEK293T细胞(ATCC,CRL-11268)在10-叠CellSTACK(6360cm2,Corning)中进行生产，所述细胞在补充了1％青霉素/链霉素和1％超谷氨酰胺(PAA)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM,Gibco,Paisley,UK)中在含有5％CO2的恒湿气氛下在37℃培养。
通过转染以下四种质粒进行MS2RLP 12X颗粒的生产：
-上述表达质粒，其表达盒如图XXXVIII所示；
-p8.74ΔZF-MS2-Coat；(表达盒在图IIb中示出)和质粒p8.74(表达盒在图VI中示出)，使用两种衣壳化质粒的四种不同比率，分别为[100％-0％]；[90％-10％][80％-20％]和[50％-50％]；
-带有包膜VSV-G的pENV(其表达盒如图III所示)。
MS2RLP ZsGreenl 12X慢病毒颗粒如实施例1所述制备，即具有以下质粒的相应比例：40％表达质粒，30％p8.74质粒(或P8.74ΔZF)，30％质粒pENV(比例[100％-0％])。
更具体地，质粒的各自比例如下：
-比例[90％-10％]：40％表达质粒，27％质粒p8.74ΔZF，3％质粒p8.74，30％质粒pENV；
-比例[80％-20％]：40％表达质粒，24％质粒p8.74ΔZF，6％质粒p8.74，30％质粒pENV；
-比例[50％-50％]：40％表达质粒，15％质粒p8.74ΔZF，15％质粒p8.74，30％质粒pENV。
在制备用于转移完整CRISPR/Cas9系统的颗粒MS2(NC)-RLP 12X 2X的情况下，如实施例8中所述制备颗粒。更具体地，质粒的各自比例如下：33％的编码导引的表达质粒，17％的编码Cas9的表达质粒(编码导引的表达质粒的量相对于编码Cas9的表达质粒的量的2倍)，25％的质粒p8.74ΔZF，25％的质粒pENV(比例[100％-0％])，
更具体地，质粒的各自比例如下：
-比例[90％-10％]：40％表达质粒，22.5％质粒p8.74ΔZF，2.5％质粒p8.74，30％质粒pENV；
-比例[80％-20％]：40％表达质粒，20％质粒p8.74ΔZF，5％质粒p8.74，30％质粒pENV
-比例[50％-50％]：40％表达质粒，12.5％质粒p8.74ΔZF，12.5％质粒p8.74，30％质粒pENV。
更具体地，这些质粒用于产生MS2RLP-ZsGreen112X慢病毒颗粒。
产生含有EF1-ZsGreen1表达盒的ILV-ZsGreen1整合型慢病毒载体作为对照。
对于ILV-ZsGreenl批次，转染混合物由以下三种质粒组成：
-表达质粒，表达盒如图XXXX所示
-质粒p8.74(其表达盒如图VI所示)
-携带包膜VSV-G的质粒pENV(其表达盒如图III所示)。
用磷酸钙标准转染以后24小时，将培养物上清液用新鲜的未补充的DMEM培养基替换。将细胞在37℃/5％CO2温育。更换培养基以后，将上清液收获4次(转染后32h、48h、56h和72h)。每次收集物通过在3000g离心5min进行澄清，然后在0.45μm过滤器(Millipore)上微滤。然后将所有收集物合并以组成粗制上清液。
2.2慢病毒颗粒的浓缩和纯化
根据实施例1中描述的方法P1浓缩和纯化慢病毒颗粒和慢病毒载体。
3.批量滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体
根据实施例1中描述的方法滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体。
4.通过根据本发明的慢病毒颗粒MS2RLP 12X的靶细胞的制备和转导
Jurkat靶细胞(ATCC TIB-152)被以200,000细胞/mL接种在96孔板中，以两个剂量(2和10微克的p24/细胞)通过MS2RLP 12X颗粒转导，或在MOI40通过对照慢病毒载体ILV-ZsGreen1转导，在4μg/mL存在下，然后在37℃/5％CO2下温育。对于MS2RLP 12X颗粒，细胞防御机制的抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。5小时后取出转导上清液，并用新鲜补充的培养基替换。在转导后24小时，回收靶细胞，并通过细胞计量法(MacsQuant VYB，Miltenyi Biotec)定量表达ZsGreen1的细胞的百分比。
5.通过抗p24 Western blot分析MS2RLP病毒颗粒的成熟
在用生产MS2RLP 12X颗粒的质粒转染生产细胞(HEK293T)后48小时，回收培养物上清液，然后按照方法P1浓缩，如实施例1所述，并通过定量p24蛋白滴定，如实施例1所述。在SDS-PAGE 4/12％变性凝胶上，质粒p8.74ΔZF-MS2-Coat/p8.74以每种比例条件加载相量15ng的p24，然后在MOPS1X缓冲剂中200V下迁移1小时。转移到尼龙膜上后，蛋白质与抗p24抗体[clone39/5.4A，Abcam]杂交。使用PierceTM Fast Western Blot Kit，ECLSubstrate(Pierce)开发的Western blot。通过放射自显影胶片上的化学发光使条带可视化。
II.结果
本实施例中是为了表明，有可能通过提高生产颗粒期间前体的GAG的成熟，提高MS2RLP颗粒的功能性，通过对生产MS2RLP 12X颗粒的概念证明。所述p8.74ΔZF-MS2质粒允许含有噬菌体外壳蛋白的前体表述来代替在核衣壳蛋白的第二锌指的GAG的前体表达。当切割成三种蛋白质(基质蛋白，Capside蛋白和核衣壳蛋白)时，这种外壳蛋白可能会破坏GAG前体成熟。这三种蛋白质对病毒颗粒的结构至关重要。
在生产MS2RLP-ZsGreen112X颗粒期间，除了p8.74ΔZF-MS2-Coat衣壳化质粒之外，通过p8.74质粒供应野生型GAG前体可以在GAG前体表达时增强GAG前体的成熟。由于p8.74ΔZF-MS2质粒，因此增加了MS2RLP颗粒的功能。
本实验的目的是评估p8.74质粒在MS2RLP 12X颗粒的生产细胞中共转染时的影响，同时制备p8.74ΔZF-MS2-Coat衣壳质粒，可以改善GAG前体的成熟，从而使最终的颗粒对靶细胞的转导更具功能性。
在该实施例中，测试了四种比例的p8.74ΔZF-MS2-Coat/p8.74衣壳化质粒：100/0；90/10；80/20和50/50。表达ZsGreenI的整合载体ILV用作对照。以两个量的p24/ml转导细胞：2μgp24/细胞(图XXXXI)和10μgp24/细胞(图XXXXII)。
首先，图XXXXI中显示的结果表明，对于未转导的细胞，荧光细胞的百分比非常接近0，而MS2RLP-ZsGreenI 12X颗粒转导的细胞荧光率超过99％，无论使用的衣壳化质粒比例如何。值得注意的是，ZsGreenI的荧光强度随着p8.74质粒量的增加而增加。由50％p8.74ΔZF-MS2-Coat衣壳化质粒和50％p8.74质粒产生的MS2RLP-ZsGreenI 12X颗粒转导的细胞的荧光强度为7.76，而仅用p8.74ΔZF-MS2-Coat衣壳化质粒产生的颗粒MS2RLP-ZsGreenI12X转导的细胞的荧光强度为为3.5。
图XXXXII显示了转导细胞百分比的相同结果。关于荧光强度，随着p8.74质粒的量增加，荧光强度增加，如图XXXXI所示。用50％p8.74ΔZF-MS2-Coat衣壳化质粒和50％p8.74质粒产生的MS2RLP-ZsGreenI 12X颗粒转导的细胞的荧光强度为60.67，而仅用p8.74ΔZF-MS2-Coat衣壳化质粒产生的MS2RLP-ZsGreenI 12X颗粒转导的细胞的荧光强度是11.48。
这意味着在剂量为2pg和10pg p24/细胞时，当用50％的p8.74ΔZF-MS2-Coat衣壳化质粒和50％的p8.74质粒产生颗粒时，获得的荧光分别是仅用p8.74ΔZF-MS2-Coat质粒产生的颗粒的荧光的两倍和五倍。
使用p8.74质粒生产MS2RLP颗粒，在与p8.74ΔZF-MS2-Coat质粒共转染中，因此提高了MS2RLP-ZsGreenI 12X颗粒功能的改善，优化了MS2RLP颗粒。
图XXXXIII通过在含有颗粒的生产上清液中搜索p24蛋白，以生物化学术语显示MS2RLP-ZsGreenI 12X颗粒的成熟。它对应于通过抗p24蛋白质印迹(Western blet)分析病毒上清液，在放射自显影胶片的两个曝光时间，一分钟(图XXXXIIIa)和十五秒(图XXXXIIIb)。
对于源自HIV的整合型慢病毒颗粒，仅用p8.74质粒作为衣壳化质粒产生，p24蛋白在四个水平上可检测到：
-在p160蛋白前体(GAG-POL)中
-在p55蛋白前体(GAG)中，
-处于成熟蛋白质状态(p24)，
-在成熟过程中的其他中间蛋白质前体(p160至p55之间，以及p55至p24之间)。
如果正常发生成熟，则应在成熟状态(p24)中检测到比在蛋白质前体(p160，p55)或中间蛋白质前体状态下更大量的p24蛋白。事实上，病毒颗粒的成熟发生在生产细胞释放颗粒之后。换句话说，在它们的生产过程中，颗粒在生产细胞的表面发芽(bud)，然后以未成熟颗粒的状态从细胞中释放出来。只有在上清液中的颗粒释放后，GAG-POL和GAG蛋白质前体才会成熟为确定的蛋白质。
在源自HIV的MS2RLP 12X颗粒的情况下，仅用p8.74ΔZF-MS2-Coat质粒作为衣壳化质粒产生，p24蛋白在四个水平上是可检测的：
-在p172蛋白前体(GAGΔZF-MS2-Coat-POL)中
-在p67蛋白前体(GAGΔZF-MS2-Coat)中，
-处于成熟蛋白质状态(p24)，
-在成熟过程中的其他中间蛋白质前体中(p172至p67之间，以及p67至p24之间)。
在该MS2RLP-ZsGreenI 12X颗粒中，每种前体重于12kDa，这对应于插入核衣壳蛋白的第二锌指中的MS2噬菌体的外壳蛋白的尺寸。
图XXXXIII在轨道上显示ILV，不同形式的蛋白质前体，p160(GAG-POL)，p55(GAG)以及完全成熟的p24蛋白。与蛋白质前体形式相比，存在大部分成熟的p24蛋白。在轨道100/0上，对应于仅用p8.74ΔZF-MS2-Coat质粒作为衣壳化质粒产生的MS2RLP-ZsGreenI 12X颗粒，前体/成熟p24蛋白的比例相对于ILV增加，表明插入了MS2噬菌体的Coat蛋白，减少了病毒颗粒的成熟。在轨道90/10,80/20和50/50上，蛋白质前体p172和p67的比例分别降低至蛋白质前体p160和p55的益处，达到轨道50/50的一个和相同的表达水平。将p8.74质粒添加到p8.74ΔZF-MS2-Coat质粒作为用于产生颗粒的衣壳化质粒导致成熟p24蛋白的比例增加(图XXXXIIIb，15秒曝光)。该结果表明，为了促进MS2RLP颗粒中蛋白质前体的成熟，除了p8.74ΔZF-MS2-Coat质粒作为用于产生颗粒的衣壳化质粒外，还必须加入至少10％的p8.74质粒。
总之，除了p8.74ΔZF-MS2-Coat质粒作为衣壳化质粒外，使用至少10％的p8.74质粒产生MS2RLP颗粒不仅可以增加前体成熟为成熟蛋白质，而且此外，可以在转导靶细胞后增加颗粒的功能性。
实施例14：由两种不同的衣壳化序列(MS2和PP7)导引的非病毒RNA的补充，以优化RLP颗粒对CRISPR系统的转移(对衣壳化RNA的类型进行调节)
一.材料与方法
1.质粒构建
1.1根据本发明的用于产生慢病毒颗粒MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X的质粒
·用于目标序列的表达质粒:
第一表达质粒带有如图XXXVIII中所述的表达盒，具有或不具有内含子序列或RNA稳定序列。为了将RNA转运到慢病毒颗粒中，将MS2 RNA(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag，SEQ ID No.1)的茎环基序的12次重复插入下述的下游的表达盒中：编码报道蛋白的RNA，例如天然萤火虫荧光素酶，绿色荧光蛋白(ZsGreenI)，红色荧光蛋白(mCherry),如图XXXVIII所示，或编码蛋白质的cDNA，例如核酸酶，例如野生型形式(WT)或突变形式(N)的Cas9蛋白。使用的启动子可以是CMV或EF1启动子(图XXXVIII)，但也可以使用其他启动子。
第二表达质粒带有如图XXXIX中所述的表达盒，具有或不具有内含子序列或RNA稳定序列。为了将mRNA转运到慢病毒颗粒中，将PP7 RNA的茎环基序的2次重复(ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID No.2和ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag SEQ ID No.4)插入下述的下游的表达盒中：编码报道蛋白的RNA，例如天然萤火虫荧光素酶，绿色荧光蛋白(ZsGreenI)，红色荧光蛋白(mCherry),如图XXXIX所示，或编码蛋白质的cDNA，例如核酸酶，例如野生型形式(WT)或突变形式(N)的Cas9蛋白。使用的启动子可以是CMV或EF1启动子(图XXXIX)，但也可以使用其他启动子。
·衣壳化质粒：
将慢病毒颗粒修饰为在核衣壳蛋白内，而不是第二锌指结构域中，包含噬菌体MS2“外壳”蛋白的序列。p8.74衣壳化质粒，携带编码结构和功能的蛋白(GAG，POL)的基因，用于生产MS2RLP2X颗粒，被根据图IIa所示的策略修饰：该p8.74质粒用于通过装配PCR产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二锌指的质粒。通过HpaI克隆将第二个锌指用噬菌体MS2“外壳”蛋白取代，以产生质粒p8.74ΔZF-MS2-Coat。这给出了图IIb中所示的结构。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变，例如如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列，而不改变MS2RLP 12X的功能。
带有编码用于产生PP7RLP 2X颗粒的结构和功能蛋白(Gag，Pol)的基因的p8.74衣壳化质粒按照图XXXVIa中所示的策略进行修饰：该p8.74质粒用于产生，通过装配PCR，缺少p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二个锌指的质粒。通过HpaI克隆将第二个锌指用PP7噬菌体的“外壳”蛋白取代，以产生p8.74ΔZF-PP7-Coat质粒。这给出了图XXXVIb中所示的构造。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变，例如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列，而不改变PP7RLP 2X的功能。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒携带编码包膜蛋白的基因，该蛋白可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
更具体地，这些质粒用于产生MS2/PP7-RLP-mCherry 1 2X-ZsGreen1 2X慢病毒颗粒。
1.2用于产生根据本发明的慢病毒对照颗粒MS2(NC)-RLP 12X的质粒
·用于目标序列的表达质粒:
表达质粒带有如图XXXVIII中所述的表达盒，具有或不具有内含子序列或RNA稳定序列。为了将RNA转运到慢病毒颗粒中，将MS2 RNA(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag，SEQ ID No.1)的茎-环基序的12次重复插入下述的下游的表达盒中：编码报道蛋白的RNA，例如天然萤火虫荧光素酶，绿色荧光蛋白(ZsGreenI)，红色荧光蛋白(mCherry),如图XXXVIII所示，或编码蛋白质的cDNA，例如核酸酶，例如野生型形式(WT)或突变形式(N)的Cas9蛋白。使用的启动子可以是CMV或EF1启动子(图XXXVIII)，但也可以使用其他启动子。
·衣壳化质粒：
将慢病毒颗粒修饰为在核衣壳蛋白内，而不是第二锌指结构域中，包含噬菌体MS2“外壳”蛋白的序列。p8.74衣壳化质粒，携带编码结构和功能的蛋白(GAG，POL)的基因，用于生产MS2RLP2X颗粒，被根据图IIa所示的策略修饰：该p8.74质粒用于通过装配PCR产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二锌指的质粒。通过HpaI克隆将第二个锌指用噬菌体MS2“外壳”蛋白取代，以产生质粒p8.74ΔZF-MS2-Coat。这给出了图IIb中所示的结构。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变，例如如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列，而不改变MS2RLP 12X的功能。
·包膜质粒(pENV)：该质粒携带编码包膜蛋白的基因，该蛋白可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
更特别地，这些质粒用于产生MS2RLP-mCherry 12X慢病毒颗粒。
1.3用于产生根据本发明的对照PP7(NC)-RLP 2X慢病毒颗粒的质粒
·用于目标序列的表达质粒:
表达质粒带有如图XXXIX中所述的表达盒，具有或不具有内含子序列或RNA稳定序列。为了将RNA转运到慢病毒颗粒中，将PP7 RNA(ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID N°2et ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag SEQ ID N°4)的茎-环基序的12次重复插入下述的下游的表达盒中：编码报道蛋白的RNA，例如天然萤火虫荧光素酶，绿色荧光蛋白(ZsGreenI)，红色荧光蛋白(mCherry),如图XXXIX所示，或编码蛋白质的cDNA，例如核酸酶，例如野生型形式(WT)或突变形式(N)的Cas9蛋白。使用的启动子可以是CMV或EF1启动子(图XXXVIII)，但也可以使用其他启动子。
·衣壳化质粒：
将慢病毒颗粒修饰为在核衣壳蛋白内，而不是第二锌指结构域中，包含噬菌体PP7“外壳”蛋白的序列。p8.74衣壳化质粒，携带编码结构和功能的蛋白(GAG，POL)的基因，用于生产PP7RLP 2X颗粒，被根据图XXXVIa所示的策略修饰：该p8.74质粒用于通过装配PCR产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二锌指的质粒。通过HpaI克隆将第二个锌指用噬菌体PP7“外壳”蛋白取代，以产生质粒p8.74ΔZF-MS2-Coat。这给出了图XXXVIb中所示的结构。Pol编码序列可以在某些功能元件中缺失或突变，例如如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列，而不改变PP7RLP 2X的功能。
·包膜质粒(pENV)：
该质粒携带编码包膜蛋白的基因，该蛋白可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
更具体地，这些质粒用于产生PP7RLP-ZsGreenI 2X慢病毒颗粒。
2.批量生产慢病毒颗粒和慢病毒载体
在生产细胞上转染质粒后，收获上清液，并根据申请WO2013/014537中描述的前述方法P1或P2之一以原料或浓缩/纯化方式使用。
2.1慢病毒颗粒的产生
用HEK293T细胞(ATCC,CRL-11268)在10-叠CellSTACK(6360cm2,Corning)中进行生产，所述细胞在补充了1％青霉素/链霉素和1％超谷氨酰胺(PAA)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM,Gibco,Paisley,UK)中在含有5％CO2的恒湿气氛下在37℃培养。
通过转染以下五种质粒产生慢病毒颗粒MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X，优选MS2/PP7-RLP-mCherry 12X-ZsGreenI 2X：
-上述两种表达质粒，包括pcDNA.EF1.mCherry.MS2 12X质粒(其表达盒如图XXXVIII所示)(50％)和pcDNA.EF1.ZsGreenI.PP7 2X质粒(其表达盒如图XXXIX所示)(50％)，以单量使用；
-p8.74ΔZF-PP7-Coat(50％)，其表达盒如图XXXVIb所示，和p8.74ΔZF-MS2-Coat(50％)，其表达盒如图IIb所示；
-带有包膜VSV-G的pENV，其表达盒如图III所示。
如实施例1中所述制备MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X慢病毒颗粒，即具有以下各自的质粒比例：40％的表达质粒，30％的p8.74质粒(或p8.74ΔZF)，30％的pENV质粒。更具体地，质粒的各自比例如下：20％的pcDNA.EF1.mCherry.MS2 12X表达质粒，20％的pcDNA.EF1.ZsGreenI.PP7 2X表达质粒，30％的p8.74ΔZF质粒，30％的pENV质粒。
在生产用于转移完整CRISPR/Cas9系统的MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X颗粒的情况下，通过实施例8中描述的方法产生颗粒。更具体地，质粒的各自比例如下：33％的编码导引的表达质粒，17％的编码Cas9的表达质粒(编码导引的表达质粒的量是编码Cas9的表达质粒的量的2倍)，25％的p8.74ΔZF质粒和25％的pENV质粒。
对照MS2(NC)-RLP 12X慢病毒颗粒，优选MS2-RLP-mCherry 12X，通过转染以下三种质粒产生：
-上述表达质粒pcDNA.EF1.mCherry.MS2 12X(其表达盒在XXXVIII中说明)；
-p8.74ΔZF-MS2-Coat，其表达盒如图IIb所示；
-带有包膜VSV-G的pENV，其表达盒如图III所示。
如实施例1中所述制备MS2(NC)-RLP 12X慢病毒颗粒。
对照PP7(NC)-RLP 2X慢病毒颗粒，优选PP7-RLP-ZsGreenI 2X，通过转染以下三种质粒产生：
-上述表达质粒pcDNA.EF1.ZsGreenI.PP7 2X(其表达盒如图XXXIX所示)；
-p8.74ΔZF-PP7-Coat，其表达盒如图XXXVIb所示；
-带有包膜VSV-G的pENV，其表达盒如图III所示。
如实施例1中所述制备PP7(NC)-RLP 2X慢病毒颗粒。
用磷酸钙标准转染以后24小时，将培养物上清液用新鲜的未补充的DMEM培养基替换。将细胞在37℃/5％CO2温育。更换培养基以后，将上清液收获4次(转染后32h、48h、56h和72h)。每次收集物通过在3000g离心5min进行澄清，然后在0.45μm过滤器(Millipore)上微滤。然后将所有收集物合并以组成粗制上清液。
2.2慢病毒颗粒的浓缩和纯化
根据实施例1中描述的方法P1浓缩和纯化慢病毒颗粒。
3.批量滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体
根据实施例1中描述的方法滴定慢病毒颗粒。
4.通过根据本发明慢病毒颗粒MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X的转导
本实施例中是使用允许递送多种类型的RNA和因此多种不同蛋白质的表达(ZsGreenl+mCherry)的MS2/PP7颗粒(NC)-RLP 12X 2X进行的。
HCT116的靶细胞(ATCC，CCL-247)被接种在24孔平板并在37℃/5％CO2温育24小时，和由颗粒MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X转导，剂量为10pg p24/细胞。
实施的对照如下：
-用慢病毒颗粒MS2RLP-mCherry 12X和PP7RLP-ZsGreen1 2X转导，剂量为各自10μgp24/细胞；
-用慢病毒颗粒MS2RLP-mCherry 12X单独转导，剂量为10pg p24/细胞；
-用慢病毒颗粒P P7RLP-ZsGreenl 2X单独转导，剂量为10pg p24/细胞。
慢病毒颗粒的转导在4μg/mL存在下进行，对于MS2/PP7(NC)-RLP 12X2X,MS2RLP-mCherry 12X和PP7RLP-ZsGreenI 2X颗粒，细胞防御机制的抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。靶细胞在转导48小时后被收集和通过细胞计量法(MacsQuant VYB，Miltenyi Biotec)定量表达ZsGreenl和mCherry的细胞的百分比。
II.结果
图XXXXIV示出通过源自HCT116靶细胞中的噬菌体MS2和PP7衣壳化序列，MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X颗粒用于转移衣壳化的RNA的有效性。该图显示，转导MS2/PP7(NC)-RLP12X 2X颗粒后，双荧光细胞的比例为97％，剂量为10pg p24/细胞，转导MS2RLP-mCherry12X和PP7RLP-ZsGreenI 2X颗粒后为98％，剂量为20pg p24/细胞。因此，使用MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X颗粒观察到大约相同的转导效率，剂量是MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X的一半。
对于单荧光蛋白，仅由MS2RLP-mCherry 12X颗粒或PP7RLP-ZsGreenI 2X颗粒转导的靶细胞具有与通过MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X颗粒转导靶细胞后获得的百分比相似的转导效率百分比。因此，结果表明，RLP颗粒能够在靶细胞的单一转导中运输和转移由两种不同系统(PP7和MS2)衣壳化的至少2种类型的RNA。
在单一转导同一批RLP中转移由两种不同的衣壳化序列MS2和PP7导引的不同类型RNA的转移能力的证明代表了对衣壳化RNA类型调节的显著增益，特别地，转移CRISPR/Cas9系统的有效性。通过用编码Cas9核酸酶的RNA和非编码导引RNA替换编码荧光报告物的RNA，这种调节可以允许使用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑应用的多样化。

Claims (19)

1.逆转录病毒颗粒，其包含：
-从Gag多蛋白衍生出的蛋白，
-包膜蛋白，
-任选的整合酶；和
-至少两种衣壳化的非病毒RNA，所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列结合的目标RNA序列，其中至少一种所述衣壳化序列是噬菌体MS2的茎-环基序或是噬菌体PP7的茎-环基序，每种衣壳化序列被引入所述从Gag多蛋白衍生出的蛋白中和/或所述整合酶中的异源结合结构域识别，其中所述至少两种衣壳化的非病毒RNA在它们的目标序列方面不同：
-所述衣壳化的非病毒RNA的目标序列中的至少一种包含编码核酸酶的部分，所述核酸酶选自由以下成员构成的组：与CRISPR系统有关的核酸酶，
-其它衣壳化的非病毒RNA的目标序列对应于导引RNA的至少一个识别元件。
2.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述核酸酶是Cas9。
3.根据权利要求1所述的逆转录病毒颗粒，其中所述颗粒进一步包含至少一个第三种衣壳化的非病毒RNA，所述第三种衣壳化的非病毒RNA具有与导引RNA的第二识别元件或与另一种导引RNA对应的目标序列。
4.根据权利要求2所述的逆转录病毒颗粒，其中所述颗粒进一步包含至少一个第三种衣壳化的非病毒RNA，所述第三种衣壳化的非病毒RNA具有与导引RNA的第二识别元件或与另一种导引RNA对应的目标序列。
5.根据权利要求1所述的逆转录病毒颗粒，所述颗粒包含：
-核衣壳蛋白，
-包膜蛋白，
-任选的整合酶；和
-至少两种衣壳化的非病毒RNA，所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与所述衣壳化序列结合的目标RNA序列，每种衣壳化序列被引入所述核衣壳蛋白中和/或所述整合酶中的异源结合结构域识别。
6.根据权利要求2所述的逆转录病毒颗粒，所述颗粒包含：
-核衣壳蛋白，
-包膜蛋白，
-任选的整合酶；和
-至少两种衣壳化的非病毒RNA，所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与所述衣壳化序列结合的目标RNA序列，每种衣壳化序列被引入所述核衣壳蛋白中和/或所述整合酶中的异源结合结构域识别。
7.根据权利要求3所述的逆转录病毒颗粒，所述颗粒包含：
-核衣壳蛋白，
-包膜蛋白，
-任选的整合酶；和
-至少两种衣壳化的非病毒RNA，所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与所述衣壳化序列结合的目标RNA序列，每种衣壳化序列被引入所述核衣壳蛋白中和/或所述整合酶中的异源结合结构域识别。
8.根据权利要求4所述的逆转录病毒颗粒，所述颗粒包含：
-核衣壳蛋白，
-包膜蛋白，
-任选的整合酶；和
-至少两种衣壳化的非病毒RNA，所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与所述衣壳化序列结合的目标RNA序列，每种衣壳化序列被引入所述核衣壳蛋白中和/或所述整合酶中的异源结合结构域识别。
9.根据权利要求5-8中的任一项所述的逆转录病毒颗粒，其中将所述异源结合结构域引入所述核衣壳蛋白中，且能将第二异源结合结构域引入所述核衣壳中和/或所述整合酶中。
10.根据权利要求1-8中的任一项所述的逆转录病毒颗粒，所述颗粒包含核衣壳蛋白、包膜蛋白、任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA，所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与所述衣壳化序列结合的目标RNA序列，至少一种所述衣壳化序列是重复12次的MS2细菌噬菌体的茎-环基序，该基序被引入所述核衣壳蛋白中的MS2细菌噬菌体的外壳蛋白识别。
11.根据权利要求10所述的逆转录病毒颗粒，其中所述衣壳化的非病毒RNA包含重复12次的MS2细菌噬菌体的茎-环基序作为衣壳化序列，其是编码Cas9的RNA，且第二种衣壳化的非病毒RNA是与导引RNA的至少一个识别元件对应或编码导引物的RNA，所述衣壳化的非病毒RNA包含重复2次的MS2细菌噬菌体的茎-环基序作为衣壳化序列。
12.根据权利要求1-8中的任一项所述的逆转录病毒颗粒，所述颗粒包含核衣壳蛋白、包膜蛋白、任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA，所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与所述衣壳化序列结合的目标RNA序列，至少一种所述衣壳化序列是重复2次的PP7细菌噬菌体的茎-环基序，该基序被引入所述核衣壳蛋白中的PP7细菌噬菌体的外壳蛋白识别。
13.根据权利要求5-8中的任一项所述的逆转录病毒颗粒，其中将所述异源结合结构域引入整合酶中，且能将第二异源结合结构域引入所述核衣壳中和/或所述整合酶中。
14.根据权利要求1-8中的任一项所述的逆转录病毒颗粒，所述逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。
15.组合物，其包含根据权利要求1-14中的任一项所述的颗粒。
16.用于生产根据权利要求1-14中的任一项所述的颗粒的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒，每种RNA序列包含目标序列，在该目标序列的上游、下游或内部插入衣壳化序列，或可替换地，第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列，在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列，至少一种衣壳化的非病毒RNA编码核酸酶，所述核酸酶选自由以下成员构成的组：与CRISPR系统有关的核酸酶，其它目标序列对应于导引RNA的至少一个识别元件，
(ii)编码从Gag多蛋白和任选地嵌合整合酶衍生出的蛋白的衣壳化质粒，所述蛋白包含允许衣壳化序列识别的结合结构域，和，
(iii)编码包膜蛋白的包膜质粒。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，所述生产试剂盒进一步包含编码以下对象的第二种衣壳化质粒：
-当所述第一种衣壳化质粒编码从嵌合的Gag多蛋白衍生出的蛋白时，从野生型Gag多蛋白衍生出的蛋白，和任选地
-当所述第一种衣壳化质粒编码嵌合整合酶时，野生型整合酶。
18.根据权利要求1-14中的任一项所述的颗粒的制备方法，所述制备方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤：
(i)包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒，每种RNA序列包含目标序列，在该目标序列的上游、下游或内部插入衣壳化序列，或可替换地，第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列，在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列，至少一种衣壳化的非病毒RNA编码核酸酶，所述核酸酶选自由以下成员构成的组：与CRISPR系统有关的核酸酶，其它目标序列对应于导引RNA的至少一个识别元件，
(ii)编码从Gag多蛋白和任选地嵌合整合酶衍生出的蛋白的衣壳化质粒，所述蛋白包含允许衣壳化序列识别的结合结构域，和，
(iii)编码包膜蛋白的包膜质粒；
和回收来自包含所述颗粒的转染细胞的上清液。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其中所述共转染的步骤此外用第二种衣壳化质粒进行，所述第二种衣壳化质粒编码：
-当所述第一种衣壳化质粒编码从嵌合的Gag多蛋白衍生出的蛋白时，从野生型Gag多蛋白衍生出的蛋白，和任选地
-当所述第一种衣壳化质粒编码嵌合整合酶时，野生型整合酶。
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