WO2014092090A1 - ウイルスベクター産生細胞及びベクターの製造方法 - Google Patents

ウイルスベクター産生細胞及びベクターの製造方法 Download PDF

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WO2014092090A1
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nucleic acid
transcriptional activator
antitoxin
acid encoding
toxin
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PCT/JP2013/083111
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克行 百々
泰広 川野
蝶野　英人
峰野　純一
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タカラバイオ株式会社
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to the production of a viral vector carrying a nucleic acid encoding a toxin, particularly to a cell used for the production of a retroviral vector. Furthermore, the present invention relates to a method for producing a viral vector carrying a toxin-encoding nucleic acid, particularly a method for producing a retroviral vector, using the cell.
  • a method of administering a protein (toxin) that exhibits toxicity to cells has been used.
  • a method for delivering a toxin using a viral vector has been devised in order to exhibit toxicity only to target cells.
  • a viral vector carrying a nucleic acid encoding a toxin has a problem that a sufficient titer cannot be obtained because the toxin is expressed during the virus production process and exhibits cytotoxicity.
  • a method for solving such a problem a method for preventing the toxicity of toxins in cells has been proposed.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • barnase which is a ribonuclease belonging to the genus Bacillus
  • barstar activity is inhibited by co-expressing Barstar, and cytotoxicity is thereby inhibited.
  • Non-Patent Document 2 A method of avoiding (Patent Document 1) and a method using a cell expressing a mutant elongation factor EF-2 having resistance to diphtheria toxin (Non-Patent Document 2) are known in the production of a viral vector carrying diphtheria toxin.
  • a method for co-expressing anti-toxin MazE and a toxin expression cassette are arranged in the direction opposite to the transcription direction of the retroviral vector.
  • a method of producing a viral vector by suppressing the expression of a toxin gene in a production cell Patent Document 2.
  • the present inventors diligently studied to obtain a higher-titer virus vector in the production of a virus vector carrying a nucleic acid encoding a toxin.
  • it has an antitoxin expression cassette, and the expression cassette encodes an expression control region having a sequence corresponding to a transcriptional activator binding region and an antitoxin operably connected to the expression control region.
  • a virus vector carrying a nucleic acid encoding a toxin can be obtained at a high titer by creating and using a cell characterized by containing a nucleic acid, and the present invention was completed.
  • the present invention is [1] a cell having the ability to produce a viral vector carrying a nucleic acid encoding a toxin, comprising an anti-toxin expression cassette, wherein the expression cassette comprises transcriptional activity.
  • An expression regulatory region having a sequence corresponding to an activator binding region, and a nucleic acid encoding an antitoxin operably connected to the expression regulatory region, [2]
  • a transcription activator expression cassette is further included, and the expression cassette contains an expression regulatory region and a nucleic acid encoding a transcriptional activator operably connected to the expression control region.
  • a nucleic acid encoding an antitoxin and a nucleic acid encoding a transcriptional activator are operably connected to an expression regulatory region having a sequence corresponding to a single transcriptional activator binding region, [2 Or the cell according to [3], [5] The cell according to any one of [1] to [4], wherein the transcriptional activator is Tat of an immunodeficiency virus, [6] The cell according to any one of [1] to [5], wherein the transcriptional activator binding region is a transactivation response element of an immunodeficiency virus, [7] The cell according to any one of [1] to [6], wherein the toxin is a prokaryotic-derived toxin and the antitoxin is an antitoxin corresponding to the toxin, [8] The cell according to
  • a method for producing a viral vector carrying a nucleic acid encoding a toxin comprising the step of culturing the cell according to any one of [1] to [9] and the culture obtained by the step A method comprising obtaining a viral vector
  • a method for producing a cell having the ability to produce a viral vector carrying a nucleic acid encoding a toxin A method comprising the step of introducing the nucleic acid described in the following (1) to (3) into a cell: (1) an expression control region having a sequence corresponding to a transcriptional activator binding region, and a nucleic acid encoding an antitoxin operably connected to the expression control region; (2) a nucleic acid encoding a protein required for viral vector production; and (3)
  • a nucleic acid encoding an antitoxin and a nucleic acid encoding a transcriptional activator are operably connected to an expression regulatory region having a sequence corresponding to a single transcriptional activator binding region.
  • coli-derived endoribonuclease MazF and the antitoxin is E. coli-derived MazE.
  • the viral vector is a retroviral vector
  • An antitoxin expression cassette on a chromosome the expression cassette having a sequence corresponding to a transcriptional activator binding region, and an antitoxin operably connected to the expression control region
  • a cell according to [22], [24] The cell according to any one of [20] to [23], wherein the transcriptional activator is Tat of an immunodeficiency virus, [25]
  • the cell according to any one of [20] to [25], wherein the antitoxin is an antitoxin corresponding to a prokaryotic-derived toxin, [27]
  • the cell according to [26], wherein the antitoxin is Escherichia coli-derived MazE. About.
  • the present invention provides a cell having the ability to efficiently produce a viral vector carrying a nucleic acid encoding a toxin (hereinafter referred to as the cell of the present invention). Furthermore, a method for producing a viral vector carrying a nucleic acid encoding a toxin using the cell of the present invention and a method for producing the cell of the present invention are provided. Furthermore, the cell which has the expression cassette of an antitoxin used for this invention on a chromosome is provided. By using the cell of the present invention, it is possible to produce a viral vector carrying a nucleic acid encoding a toxin, particularly a retroviral vector, with a higher titer than before without complicated operations.
  • the viral vector produced by the production method of the present invention is very useful for infectious diseases, treatment and prevention of cancer, inhibition of virus growth in virus-infected cells, and the like.
  • a viral vector refers to a recombinant viral particle that has been modified to have a region for removing pathogenicity and introducing a foreign gene based on a natural virus or the like.
  • virus vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, vaccinia virus vectors, herpes virus vectors, retrovirus vectors, etc.
  • retrovirus vectors are used for basic gene therapy research and gene transfer in clinical applications. Examples are increasing. In such an example, a replication-defective virus vector with very low concern about unlimited gene transfer is used.
  • Retrovirus is a generic term for viruses belonging to the family Retroviridae, and has a single-stranded RNA in the genome and a life cycle that converts genomic RNA into DNA in the host cell.
  • a retrovirus infects a host cell, it converts the genome into double-stranded DNA by its own reverse transcriptase and incorporates it into the genomic DNA of the host cell.
  • This state is called a provirus, which is transmitted to the next generation cells and has the property of constantly expressing genes in the provirus. Therefore, the target gene delivered using a replication-defective retrovirus vector can be expected to be stably expressed in the target cell for a long period of time.
  • the retroviridae is further classified into an oncovirus subfamily, a lentivirus subfamily, a spumavirus subfamily, and an orthoretrovirus subfamily.
  • retroviruses derived from the Oncovirus subfamily and Lentivirus subfamily are used as viral vectors.
  • an oncoretrovirus vector a vector based on Moloney murine leukemia virus (MMLV) and the like
  • MMLV Moloney murine leukemia virus
  • HIV-1 human immunodeficiency virus type 1
  • HIV-2 simian immunodeficiency virus
  • HIV-1 When HIV-1 is used as a viral vector, HIV-1 is a causative virus of AIDS (Acquired Immunity Syndrome), and thus high safety has been demanded. However, in recent years, modified genes related to pathogenicity have been deleted. Furthermore, since the promoter site in the 3 ′ LTR has been deleted, safety is increased and practical use is progressing.
  • the viral vector produced by the cell of the present invention is not particularly limited as long as it can deliver a toxin-encoding gene to the target cell, but a replication-defective retrovirus vector, particularly a lentiviral vector is preferable. is there.
  • a pseudo-type vector refers to a viral vector having an envelope protein (Env) that has a different origin from Gag and Pol.
  • Pseudotype vectors include vesicular stomatitis virus (VSV), gibbon leukemia virus (GaLV), feline endogenous virus RD114, mouse leukemia virus (Ecotropic-env, Amphotropic-env, 10A1-env etc.), coccivirus (Cocal)
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • GaLV gibbon leukemia virus
  • RD114 feline endogenous virus
  • Ecotropic-env Ephetropic-env
  • Amphotropic-env, 10A1-env etc. coccivirus
  • Onvoletrovirus vectors and lentivirus vectors having a chimeric envelope combining Env or a plurality of envelopes are exemplified.
  • a transient production cell is a nucleic acid construct carrying a nucleic acid encoding a protein necessary for virus vector production (ie, virus particle formation) and RNA encapsulated in the virus particle. Is a cell that has acquired the ability to produce a retrovirus by transiently introducing a nucleic acid construct carrying a nucleic acid that supplies a nucleic acid into any cell.
  • Arbitrary cells include HEK293 cells (ATCC CRL-1573), 293T cells (ATCC CRL-11268), 293F cells, 293FT cells (all manufactured by Life Technologies), G3T-hi cells (Takara Bio). (Manufactured by company: International Publication No. 06/035829 pamphlet) and the like.
  • a constitutive production cell refers to a cell (packaging cell) in which a nucleic acid encoding a protein essential for virus particle formation has been previously introduced into a chromosome and has the ability to produce the protein (packaging cell).
  • packaging cells known packaging cells such as PG13 (ATCC CRL-10686), PA317 (ATCC CRL-9078), GP + E-86 and GP + envAm-12 (US Pat. No. 5,278,056), Psi-Crip [Proceedings of the American Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 85, pp. 6460-6464 (1988)] can also be used.
  • a cell in which a part or all of the nucleic acid encoding the protein necessary for virus vector production is previously integrated into the chromosome is prepared, and the RNA encapsulated in the virus particle and the deficiency
  • a viral vector can also be prepared by transiently transfecting a nucleic acid encoding a protein necessary for production of a viral vector.
  • the protein necessary for the production of the viral vector is not particularly limited as long as it is necessary for the production of a desired viral vector.
  • retroviral vectors include (A) Gag-Pol, (B) Env, and the like.
  • a nucleic acid construct that supplies (C) Tat, (D) Rev, and other accessory proteins may be used as necessary.
  • RNA encapsulated in virus particles include packaging signals for encapsulating in virus particles and RNA having an LTR for introduction into the target cell genome. These nucleic acid constructs can preferably be supplied as plasmids or viral vectors.
  • a nucleic acid that supplies RNA encapsulated in virus particles of a retrovirus vector can be prepared using a known plasmid.
  • known plasmids include, for example, replication-defective oncoretrovirus vectors such as MFG and ⁇ -SGC (WO 92/07943), pBabe (Nucleic Acids Research), Vol. 18, Vol. 3587-3596 (1990)], pLXSN Retroviral Vector (Clontech), pDON-AI-2 DNA, pDON-5 DNA, pMEI-5 DNA (above, Takara Bio), or a modified plasmid of these Etc. are exemplified.
  • replication-defective lentiviral vectors examples include plasmids disclosed in International Publication No. 00/66759, pLVSIN series (Takara Bio), pLVX series (Clontech), and modified plasmids thereof.
  • the in the plasmid used here a part or all of the U3 promoter derived from immunodeficiency virus may be replaced with a chimeric promoter.
  • an inducible expression system can also be used. That is, only when a virus vector is produced, a virus vector can be produced by producing a nucleic acid encapsulated in the protein or virus particle in a cell.
  • the inducible expression system a known expression system can be applied. For example, a Tet-ON system or a Tet-OFF system can be used.
  • the nucleic acid that supplies the nucleic acid encapsulated in the virus particle should be prepared by mounting a nucleic acid encoding an arbitrary toxin on the nucleic acid encapsulated in the virus particle.
  • An appropriate promoter, enhancer, terminator, or other transcription regulatory element may be inserted at an appropriate position for controlling the expression of the nucleic acid encoding the toxin.
  • constitutive promoter, inducible promoter, tissue / organ-specific promoter, tumor / disease specific A promoter or the like can be used.
  • a toxin refers to a polypeptide having some toxicity to a cell, such as suppressing a DNA replication reaction, transcription reaction, and protein synthesis reaction in the cell.
  • the toxin used in the present invention may be a wild type, and if the toxicity is maintained, one or more amino acid residues are substituted, deleted, and / or inserted in the amino acid sequence of the wild type toxin. It may be a mutant having an amino acid sequence.
  • a toxin-antitoxin toxin that is an environmental stress response function of a prokaryote or a variant thereof is exemplified.
  • the nucleic acid encoding the toxin can be isolated from a prokaryotic genome or plasmid, or can be chemically synthesized.
  • examples of toxins include, for example, Molecular Cell, Volume 12, Pages 913-920 (2003), The Journal of Biological Chemistry, Volume 279, Pages 20678-20684 (2004), The Journal of Bio. E. coli-derived endoribonuclease MazF described in Logical Chemistry, Vol. 284, pages 28746-28753 (2004), Journal of Bacteriology, Vol. 175, pages 6850-6856 (1993), respectively.
  • RNA-specific endoribonuclease activity that cleaves the RNA sequence 5'-A / CA-3 ', and degrades single-stranded RNA in the cell including RNA virus genome and mRNA. For this reason, MazF is used for the elimination of virus-infected cells and cancer cells, the inhibition of virus growth in virus-infected cells, and the like.
  • a nucleic acid encoding any of these toxins can be used.
  • a nucleic acid encoding a toxin used in the present invention a nucleic acid encoding MazF and a nucleic acid encoding a mutant functionally homologous to MazF are particularly preferably exemplified.
  • the nucleic acid encoding MazF is not particularly limited as long as it encodes the amino acid sequence of MazF (RefSec Acc. No. NP_417262).
  • an artificially synthesized sequence SEQ ID NO: 4 obtained by converting the ACA base sequence present in the nucleic acid encoding MazF into another base sequence without changing the amino acid sequence is exemplified.
  • mutant functionally homologous to MazF examples include a polypeptide comprising an amino acid sequence having a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more with respect to the amino acid sequence of MazF. Is done. Nucleic acids encoding these toxins (also referred to as toxin genes) can be isolated from the organisms that carry them, and can be chemically synthesized.
  • the antitoxin refers to a polypeptide that suppresses the toxicity of the toxin.
  • the antitoxin used in the present invention is not particularly limited as long as it is an antitoxin derived from a species different from the virus-producing cell and maintains the ability to suppress the activity of the toxin.
  • the mutant may be composed of an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, and / or inserted in the amino acid sequence of the wild-type antitoxin.
  • the above-described toxin-antitoxin antitoxin is exemplified.
  • the antitoxin against MazF is exemplified by MazE, PemK by PemI, MqsR by YgiT, ChpBK by ChpBI, and MazEsa by MazEsa.
  • MazE binds to MazF and inhibits the endonuclease activity of MazF.
  • the nucleic acid encoding antitoxin used in the present invention is particularly preferably exemplified by a nucleic acid encoding MazE of E. coli and a nucleic acid encoding a mutant functionally homologous to MazE.
  • coli is not particularly limited as long as it encodes the amino acid sequence of MazE (RefSec Acc. No. NP — 289337).
  • Examples of the mutant functionally homologous to MazE include a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more identity to the amino acid sequence of MazE. Is done. Nucleic acids encoding these antitoxins (also referred to as antitoxin genes) can be isolated from organisms carrying them and can be chemically synthesized.
  • the expression cassette refers to a nucleic acid construct containing elements necessary for expressing a target product. Specifically, it refers to a nucleic acid construct comprising an expression regulatory region including at least a promoter sequence, and a nucleic acid operably connected to the expression regulatory region and encoding a target product to be expressed.
  • “operably connected” with respect to a nucleic acid encoding an antitoxin and a nucleic acid encoding a transcriptional activator means that the antitoxin or the transcriptional activator (target product) can be expressed. It means that the nucleic acid encoding the target product is arranged at an appropriate position with respect to the expression control region.
  • the expression control region is operably arranged so as to be cis with respect to the nucleic acid encoding the target product, but does not need to be directly adjacent to the nucleic acid for expressing the target product, and IRES ( It may be arranged in a nucleic acid for expressing a plurality of target products arranged via a sequence (Internal Ribosome entry site) or a sequence encoding 2A peptide.
  • IRES It may be arranged in a nucleic acid for expressing a plurality of target products arranged via a sequence (Internal Ribosome entry site) or a sequence encoding 2A peptide.
  • a plurality of nucleic acids for expressing a target product When a plurality of nucleic acids for expressing a target product are arranged, a plurality of nucleic acids for expressing the same target product may be arranged, or a plurality of nucleic acids for expressing different target products may be arranged. .
  • the expression regulatory region refers to a region that controls the expression of the target product in the expression cassette. Specifically, it refers to a region containing a promoter.
  • the expression regulatory region may further contain various regulatory sequences involved in transcriptional regulation.
  • the promoter in the present invention is exemplified by any promoter that functions in mammalian cells, such as CMV promoter, SV40 promoter, EF-1 ⁇ promoter, CAG promoter, PGK promoter, U3 promoter, etc. Is preferably exemplified.
  • promoters in addition to these promoters, known inducible promoters, tissue / organ-specific promoters, time-specific promoters, or mutant sequences having functional equivalents thereto may be used in the present invention.
  • the promoter in the antitoxin expression cassette of the present invention is particularly preferably exemplified by a CMV promoter having high transcription efficiency.
  • a sequence corresponding to the transcriptional activator binding region is present around the promoter or in the untranslated region downstream of the transcription start point. Be placed.
  • the sequence corresponding to the transcriptional activator binding region include the base sequence of the transcriptional activator binding region, which is RNA, or the DNA sequence corresponding to the sequence.
  • the transcriptional activator binding region is a sequence that increases the transcription efficiency of the gene contained in the expression cassette by interaction (binding / separation) with a specific transcriptional activator.
  • the sequence corresponding to the transcriptional activator binding region may be used in multiple places of the expression vector or as a repetitive sequence as necessary.
  • the transcriptional activator binding region includes a transactivation response element (Trans Activation Response region, hereinafter referred to as TAR) present in the 5 ′ terminal repeat (LTR) of immunodeficiency viruses such as HIV-1, HIV-2 and SIV.
  • TAR is a region that forms a higher-order structure existing in the LTR of an immunodeficiency virus, and transcription of the immunodeficiency virus RNA is promoted when a transcriptional activator Tat (Trans Activator) is bound thereto. Therefore, in the embodiment of the present invention, the expression regulation region is constructed so that a transcriptional activator binding region is formed on mRNA generated by transcription.
  • the sequence corresponding to the transcriptional activator binding region in the present invention is particularly preferably exemplified by the sequence corresponding to HIV-1-derived TAR represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • the TAR base sequence used in the present invention may be a wild-type base sequence or a functionally homologous base sequence.
  • the functionally homologous base sequence is not particularly limited as long as it has an ability to bind to Tat, but it is 95% or more, preferably 98% or more with respect to the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. Those consisting of a base sequence having the homology of
  • a transcriptional activator is a protein having RNA binding ability, and binds to RNA alone or in the form of a dimer or complex, and the efficiency of transcription depending on the promoter is increased. It refers to a factor that works to further increase.
  • the transcriptional activator include Tat, which is a transcriptional activator of immunodeficiency viruses such as HIV-1, HIV-2, and SIV, and TRBP, which is a human-derived transactivator.
  • Tat which is a transcriptional activator of immunodeficiency viruses such as HIV-1, HIV-2 and SIV is preferably exemplified.
  • Tat is a factor that promotes transcription of immunodeficiency virus RNA by binding to TAR contained in the LTR of immunodeficiency virus. Therefore, transcription from the expression regulatory region having TAR downstream from the transcription start point is promoted by Tat.
  • Tat used in the present invention may be a wild type or a mutant.
  • the mutant is not particularly limited as long as it has the ability to bind to TAR. For example, it has 95% or more, preferably 98% or more identity to the natural HIV-1 Tat amino acid sequence. Examples include Tat variants consisting of amino acid sequences.
  • the cell of the present invention is a cell having the ability to produce a viral vector carrying a nucleic acid encoding a toxin, having an antitoxin expression cassette, and the expression cassette is a transcriptional activator binding region. And a nucleic acid encoding an antitoxin operably connected to the expression control region.
  • the above-mentioned antitoxin is an antitoxin corresponding to a toxin encoded by a nucleic acid mounted on a viral vector.
  • the cells of the present invention are prepared by preparing cells in which an antitoxin expression cassette is incorporated in the chromosome of an arbitrary cell in advance, and then encoding nucleic acids encoding RNA encapsulated in virus particles and proteins necessary for virus vector production. It can also be produced by transient transfection. Therefore, the cell in which the antitoxin expression cassette is incorporated into the chromosome is also one aspect of the present invention.
  • the expression cassette can be introduced by mounting on an appropriate vector (plasmid, virus vector, etc.).
  • the method of introducing the expression cassette into the cell is not particularly limited, but as with the introduction of other nucleic acid constructs used in the present invention, the nucleic acid construct containing the expression cassette is transiently or permanently maintained in the cell. The known introduction method is exemplified.
  • Examples of the method for introducing a nucleic acid construct include, for example, a calcium phosphate method, a lipofection method, a DEAE dextran method, a polyethyleneimine method, and an electroporation method as a plasmid introduction method.
  • a calcium phosphate method for example, a calcium phosphate method, a lipofection method, a DEAE dextran method, a polyethyleneimine method, and an electroporation method as a plasmid introduction method.
  • commercially available reagents such as TransIT (registered trademark) -293 Reagent (manufactured by Mirus), Lipofectamine 2000 Reagent (manufactured by Life Technologies), FuGene (registered trademark; manufactured by Promega) may be used.
  • a cell that retains the introduced nucleic acid construct on a chromosome can also be obtained.
  • a viral vector when used for introduction, cells may be infected by an appropriate method according to the property. It goes without saying that a commercially available kit or the like can be used for these nucleic acid introduction methods.
  • a transcriptional activator can be further artificially expressed.
  • a nucleic acid encoding a transcriptional activator is placed so that it can be expressed under the control of an appropriate promoter to produce a transcriptional activator expression cassette and introduced into the cells to be used by a known method. Just do it.
  • the transcriptional activator and antitoxin may be expressed in a single expression regulatory region.
  • a nucleic acid encoding a transcriptional activator and a nucleic acid encoding an antitoxin can be connected to a single expression control region in an operable state.
  • an IRES sequence, a sequence encoding a 2A peptide, or the like can be inserted between a nucleic acid sequence encoding a transcriptional activator and a nucleic acid sequence for expressing a target product.
  • a nucleic acid sequence encoding antitoxin may be arranged upstream of these sequences, and a nucleic acid sequence encoding a transcriptional activator may be arranged downstream. The reverse is also possible.
  • the expressed transcriptional activator interacts with the transcriptional activator binding region of mRNA transcribed from the transcriptional activator expression cassette to promote transcription.
  • the amount of activator increases further, and the expression level of antitoxin increases accordingly.
  • the viral vector carrying the nucleic acid which codes a toxin more effectively can be produced by the increase in the expression level of an antitoxin.
  • a method for producing a viral vector carrying a nucleic acid encoding a toxin (A) introducing the nucleic acid according to (1) to (3) below into a cell; (1) an expression control region having a sequence corresponding to a transcriptional activator binding region, and a nucleic acid encoding an antitoxin operably connected to the expression control region, (2) a nucleic acid encoding a protein necessary for virus vector production, and (3) a nucleic acid that supplies a nucleic acid encapsulated in a virus particle, (B) culturing the cells obtained by step (a), and (c) obtaining a viral vector from the culture, The method containing is also illustrated.
  • This method may further include (4) a step of introducing a nucleic acid encoding a transcriptional activator.
  • the above nucleic acids (1) to (4) may be introduced into the cell by a nucleic acid construct containing two or more of these, or each may be introduced into the cell by a different nucleic acid construct.
  • the nucleic acid construct containing the nucleic acid (1) and the nucleic acid (4), the nucleic acid construct containing the nucleic acid (2), and the nucleic acid construct containing the nucleic acid (3) can also be introduced into a cell.
  • the order of introducing the nucleic acids (1) to (4) into the cells is not particularly limited. For example, after constructing a packaging cell by introducing the nucleic acid (2) into the cells, The nucleic acid (1), the nucleic acid (3), and the nucleic acid (4) may be introduced transiently.
  • the cells can be cultured under conditions usually used.
  • the culture is performed at a temperature of 30 to 37 ° C., a humidity of 90 to 100%, and a CO 2 concentration of 3 to 10%.
  • the culture is 30 to 37 ° C., and the culture period is 12 to 96 hours.
  • the culture of the cells of the present invention is not limited to such conditions, and may be performed under other culture conditions as long as the desired viral vector production can be achieved.
  • the culture period is not particularly limited as long as production of a desired viral vector is achieved.
  • it can also replace
  • the produced retrovirus vector is present in the culture supernatant of retrovirus-producing cells, and can be obtained by separating the cells from the culture and collecting the culture supernatant.
  • cell culture is performed by adding a new medium, and the culture supernatant is again collected from the culture, whereby the retroviral vector can be repeatedly obtained.
  • the culture supernatant is filtered as a retroviral vector solution, or is concentrated or purified by a known method and stored until an appropriate method such as freezing is used for a desired use. Can do.
  • a viral vector carrying a toxin-encoding nucleic acid having a high titer By the method for producing a viral vector of the present invention, a viral vector carrying a toxin-encoding nucleic acid having a high titer can be obtained.
  • the titer in the present specification refers to the ability of a viral vector to infect cells to be measured experimentally. Examples of the measurement of infectivity include a method in which an arbitrary cell is infected with a viral vector carrying a nucleic acid encoding a polypeptide serving as a marker, and the expression of the marker introduced into the cell is detected and quantified. . In the case of a viral vector not containing a marker, a method for measuring the number of copies of virus-derived DNA incorporated into an infected cell is exemplified.
  • the present invention also provides a viral vector obtained by the method for producing a viral vector of the present invention. Also provided are kits that combine cells and nucleic acid constructs for producing the viral vectors. Furthermore, the pharmaceutical composition which contains the viral vector obtained by the manufacturing method of this invention as an active ingredient is also provided.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition can be appropriately prepared according to the production technique of a gene vector for gene therapy.
  • the retroviral vector obtained by the production method of the present invention is concentrated and purified by a known method to obtain a purified retroviral vector, and if necessary, combined with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition can be used ex vivo on patient-derived cells or can be administered directly to the patient.
  • FIG. 1 Preparation of cell line that constantly expresses antitoxin MazE
  • Construction of MazE expression plasmid Nucleic acid encoding MazE derived from Escherichia coli at the multicloning site of plasmid pBApo-CMV Pur DNA (manufactured by Takara Bio Inc.) SEQ ID NO: 1) was inserted.
  • pBApo-CMV Pur DNA is an expression plasmid for mammalian cells carrying the CMV IE promoter and the herpes simplex virus thymidine kinase poly A signal.
  • the resulting plasmid was named pCMV-MazE.
  • This plasmid is characterized in that MazE is expressed under the control of a cytomegalovirus-derived promoter (CMV IE promoter).
  • CMV IE promoter cytomegalovirus-derived promoter
  • the cells after the introduction operation were continuously cultured in a CO 2 incubator. The day after the introduction, the culture was continued by exchanging with DMEM containing 10% FBS containing puromycin (Clontech) at a final concentration of 1 ⁇ g / mL to obtain a puromycin resistant cell population.
  • the resulting puromycin-resistant cells were diluted to 5 cells / mL and 10 cells / mL, and seeded at 100 ⁇ L per well in a 96-well microplate (manufactured by Corning) and cultured. Each well was observed on the 7th day after sowing, 12 wells having only one colony were selected, and each colony was grown to obtain 12 clones.
  • the pIRES2MazFZsG plasmid was transiently introduced into each clone. The introduction was performed in the same manner as in Reference Example 1- (2).
  • the pIRES2MazFZsG plasmid is a plasmid in which MazF and green fluorescent protein ZsGreen1 are transcribed as one mRNA via IRES.
  • a clone in which the fluorescence was observed most strongly was selected, and it was determined as a clone having the highest inhibitory effect on MazF toxicity by MazE.
  • the selected clone was named 1D5 cell.
  • coli-derived endoribonuclease MazF SEQ ID NO: 4
  • a marker expression cassette downstream of the MazF expression cassette a truncated form of low affinity receptor ( ⁇ LNGFR) under the control of a human-derived PGK promoter. , (1998)] was inserted.
  • This lentiviral vector plasmid was named pLV-U3TARMF-PL2.
  • the cells after introduction were cultured in a CO 2 incubator. The day after the introduction, the medium was removed from each well, X-VIVO15 medium (manufactured by Lonza) was added, and the culture was continued. Two days after the introduction, the culture supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m filter, and this filtrate was stored frozen at ⁇ 80 ° C. as a lentiviral vector solution.
  • MOLT-4 cells ATCC CCRL-
  • MOLT-4 cells suspended in the above-described CH-296 coated 24-well plate in RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) containing 10% FBS at 1 ⁇ 10 6 cells / mL. 1582) was added at 0.25 mL per well.
  • the lentiviral vector solution prepared in Reference Example 2- (2) was thawed, added 0.25 mL per well, and the plate was rocked and mixed well (final concentration of lentiviral vector solution: 2-fold dilution) .
  • the plate was centrifuged at 1000 ⁇ g and 32 ° C. for 30 minutes, virus infection was performed by centrifugation, and the plate was cultured in a CO 2 incubator.
  • ⁇ LNGFR is a marker of the lentiviral vector used in the present Reference Examples and Examples, and is expressed on the cell surface of infected cells. Accordingly, the ⁇ LNGFR positive rate reflects the titer of the virus vector used and is an indicator of the virus vector production ability of the virus producing cells.
  • Example 1 Potency improvement test of lentiviral vector carrying MazF gene using MazE expression plasmid with modified expression regulatory region
  • pCMVU3TAR-MazE Corresponds to U3-TAR composed of HIV-1 U3 promoter and TAR between the CMV IE promoter of pCMV-MazE prepared in Reference Example 1- (1) and the nucleic acid encoding MazE This was prepared by inserting a nucleic acid containing the sequence (SEQ ID NO: 2).
  • pCMVTAR-MazE a nucleic acid comprising a sequence corresponding to HIV-1 TAR (SEQ ID NO: 3) between the CMV IE promoter of pCMV-MazE prepared in Reference Example 1- (1) and the nucleic acid encoding MazE It was prepared by inserting.
  • the above two types of plasmids are characterized by containing an HIV-1-derived TAR to which HIV-1-derived Tat binds upstream of a nucleic acid encoding MazE.
  • Example 2 Production of Lentiviral Vector Using Transcription Activator Expression Plasmid with Modified Expression Regulatory Region
  • Construction of Tat Expression Plasmid with Modified Expression Regulatory Region The following three Tat expression plasmids were constructed.
  • pCMV-Tat A nucleic acid encoding HIV-1 Tat was inserted into the multicloning site of pBApo-CMV DNA (Takara Bio Inc.).
  • pU3TAR-Tat pCMV-Tat was digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI to remove the CMV IE promoter, and a sequence corresponding to U3-TAR composed of HIV-1 U3 promoter and TAR (SEQ ID NO: It was prepared by inserting the nucleic acid containing 2).
  • pCMVTAR-Tat A nucleic acid containing a sequence (SEQ ID NO: 3) corresponding to HIV-1 TAR was inserted downstream of the CMV IE promoter of pCMV-Tat.
  • the pU3TAR-Tat plasmid and the pCMVTAR-Tat plasmid are plasmids characterized in that an HIV-1-derived TAR is arranged upstream of a nucleic acid encoding Tat.
  • the medium was replaced with X-VIVO15 medium, and the culture was continued.
  • the culture supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m filter, and this filtrate was stored frozen at ⁇ 80 ° C. as a lentiviral vector solution.
  • the plate was rocked and mixed well (final concentration of lentiviral vector solution: 10-fold dilution), centrifuged at 1000 ⁇ g, 32 ° C. for 30 minutes to carry out infection by centrifugation, and cultured in a CO 2 incubator. The day after the infection, these cells were transferred to a 6-well plate (Corning), 2 mL of RPMI-1640 medium containing 10% FBS was added, and the culture was continued. Four days after infection, cells were harvested and washed with PBS containing 0.5% BSA (0.5% BSA / PBS).
  • the cells were suspended in 0.5% BSA / PBS, and a solution containing an APC-labeled mouse anti-human LNGFR antibody was added thereto, and the cells were labeled with the antibody. Thereafter, the cells were washed with 0.5% BSA / PBS and suspended again in 0.5% BSA / PBS. This cell solution was subjected to flow cytometry, and the ⁇ LNGFR positive rate was calculated. The results are shown in Table 6.
  • Example 2- (2) (4) Analysis of Tat expression level in virus-producing cells
  • SDS sample buffer 50 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% glycerol, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.005% bromophenol blue, 100 mM dithioitol
  • SDS sample buffer 50 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% glycerol, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.005% bromophenol blue, 100 mM dithioitol
  • This lysate was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, using an anti-HIV-1 Tat antibody (Abcam) and an anti- ⁇ -tubulin antibody (Cell Signaling Technology) for evaluation of the amount of electrophoresis between samples.
  • Western blotting was performed. SuperSignal (registered trademark) West Femto Maximum Sensitive Substrate (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was used for antibody detection, and a chemiluminescence detection device LuminoShot (registered trademark) 140 (manufactured by Takara Bio Inc.) was used. The results of Western blotting using an anti-Tat antibody are shown in FIG. Regarding western blotting using an anti- ⁇ -tubulin antibody, it was confirmed that the same level of signal was detected from all samples (data not shown).
  • Tat is highly expressed compared to the test conditions using pCMV-Tat (lanes 1 and 2). It became clear. From this result, it was found that the production of a high-titer MazF gene-loaded lentiviral vector under the test conditions using pCMVTAR-Tat was possible due to enhanced Tat expression in virus-producing cells. .
  • the cell of the present invention By using the cell of the present invention, it becomes possible to produce a viral vector carrying a nucleic acid encoding a higher-titer toxin than in the past. Further, by introducing an expression cassette for a transcriptional activator, a higher titer virus vector can be produced.
  • the virus vector produced using the cell of the present invention and the composition comprising the above-mentioned virus vector as an active ingredient are used in the basic research of gene therapy or clinical application, in the treatment and prevention of infectious diseases, cancer, in virus-infected cells. It is very useful for inhibiting the growth of viruses.
  • SEQ ID NO: 1 MazE coding sequence
  • SEQ ID NO: 2 Nucleic acid sequence corresponding to U3-TAR
  • SEQ ID NO: 3 Nucleic acid sequence corresponding to TAR
  • SEQ ID NO: 4 MazF coding sequence

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Abstract

　本発明は、トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターを産生する能力を有する細胞であって、アンチトキシンの発現カセットを有し、当該発現カセットが、転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域と、当該発現調節領域に動作可能に接続されたアンチトキシンをコードする核酸を含有することを特徴とする細胞、前記細胞を使用したトキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターの製造方法、前記細胞の製造方法、及び本発明に用いられる、アンチトキシンの発現カセットを染色体上に有する細胞を提供する。

Description

ウイルスベクター産生細胞及びベクターの製造方法
　本発明は、トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターの製造、特にレトロウイルスベクターの製造に使用される細胞に関する。更に前記細胞を使用した、トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターの製造方法、特にレトロウイルスベクターの製造方法に関する。
　従来、がん細胞や病原微生物が感染した細胞の排除、及び病原微生物の排除を目的として、細胞に対して毒性を発揮するタンパク質（トキシン）を投与する方法が用いられてきた。近年、標的の細胞のみに対して毒性を発揮させるために、ウイルスベクターを用いてトキシンを送達する方法が考案されている。ただしトキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターは、ウイルス産生工程中にトキシンが発現して細胞毒性を示すため、十分な力価が得られないという問題があった。このような問題の解決方法として、細胞中でのトキシンの毒性発揮を妨げる方法が提案されている。例えばヒト由来プラスミノゲンの哺乳動物細胞中での発現において、プラスミンインヒビターを共発現させることで、プラスミノゲンが活性化した産物であるプラスミンのプロテアーゼ活性を阻害し、毒性を発揮しないようにしてプラスミノゲンの発現を確保する方法（非特許文献１）や、バチルス属のリボヌクレアーゼであるバルナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ）の真核細胞中での発現において、バルスター（Ｂａｒｓｔａｒ）を共発現させることでバルナーゼ活性を阻害し、細胞毒性を回避する方法（特許文献１）、ジフテリアトキシンを搭載したウイルスベクターの製造において、ジフテリアトキシン耐性をもつ変異伸長因子ＥＦ－２を発現する細胞を用いる方法（非特許文献２）が知られている。また、大腸菌由来エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦをコードする核酸を搭載したウイルスベクターの製造において、アンチトキシンであるＭａｚＥを共発現させる方法やトキシンの発現カセットをレトロウイルスベクターの転写方向に対して逆向きに配置することによって産生細胞内でのトキシン遺伝子の発現を抑制してウイルスベクターを産生させる方法（特許文献２）が知られている。
国際公開第１９９７／３０１６２号パンフレット 国際公開第２００８／１３３１３７号パンフレット
ザ　ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２３巻、第１５２８６～１５２９２頁（１９９１） ジーン　セラピー（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１７巻、第１０６３～１０７６頁（２０１０）
　本発明の目的は、トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターの製造にあたって、煩雑な操作なく高力価のウイルスベクターを得るために使用可能な細胞、及び前記細胞を用いた高力価のウイルスベクターの製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクター製造において、より高力価なウイルスベクターを得るべく鋭意検討した。この結果、アンチトキシンの発現カセットを有し、前記発現カセットが、転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域と、前記発現調節領域に動作可能に接続されたアンチトキシンをコードする核酸を含有することを特徴とする細胞を創出し、これを用いることによって、トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターが高力価で得られることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明を概説すれば、本発明は
［１］トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターを産生する能力を有する細胞であって、アンチトキシンの発現カセットを有し、当該発現カセットが、転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域と、当該発現調節領域に動作可能に接続されたアンチトキシンをコードする核酸を含有することを特徴とする細胞、
［２］転写活性化因子の発現カセットを更に有し、当該発現カセットが、発現調節領域と、当該発現調節領域に動作可能に接続された転写活性化因子をコードする核酸を含有することを特徴とする、［１］に記載の細胞、
［３］転写活性化因子の発現カセットにおける発現調節領域が、当該転写活性化因子の結合領域に相当する配列を有する、［２］に記載の細胞、
［４］アンチトキシンをコードする核酸、及び転写活性化因子をコードする核酸が、単一の転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に動作可能に接続されている、［２］または［３］に記載の細胞、
［５］転写活性化因子が免疫不全ウイルスのＴａｔである、［１］～［４］のいずれか１つに記載の細胞、
［６］転写活性化因子結合領域が、免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列である、［１］～［５］のいずれか１つに記載の細胞、
［７］トキシンが原核生物由来のトキシンであり、かつアンチトキシンが前記のトキシンに対応するアンチトキシンである、［１］～［６］のいずれか１つに記載の細胞、
［８］トキシンが大腸菌由来エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦであり、かつアンチトキシンが大腸菌由来ＭａｚＥである、［７］に記載の細胞、
［９］ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、［１］～［８］のいずれか１つに記載の細胞、
［１０］トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターの製造方法であって、［１］～［９］のいずれか１つに記載の細胞を培養する工程及び前記工程により得られた培養物よりウイルスベクターを得る工程を包含することを特徴とする方法、
［１１］トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターを産生する能力を有する細胞の製造方法であって、
細胞に下記（１）～（３）に記載の核酸を導入する工程を含有する方法：
（１）転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域と発現調節領域に動作可能に接続されたアンチトキシンをコードする核酸；
（２）ウイルスベクター産生に必要なタンパク質をコードする核酸；及び
（３）ウイルス粒子に封入される核酸を供給する核酸、
［１２］（４）転写活性化因子をコードする核酸を導入する工程を更に含有する、［１１］に記載の方法、
［１３］転写活性化因子をコードする核酸が、当該転写活性化因子の結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に動作可能に接続されている、［１２］に記載の方法、
［１４］アンチトキシンをコードする核酸、及び転写活性化因子をコードする核酸が、単一の転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に動作可能に接続されている、［１３］に記載の方法、
［１５］転写活性化因子が免疫不全ウイルスのＴａｔである、［１１］～［１４］のいずれか１つに記載の方法、
［１６］転写活性化因子結合領域が、免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列である、［１１］～［１５］のいずれか１つに記載の方法、
［１７］トキシンが原核生物由来のトキシンであり、かつアンチトキシンが前記のトキシンに対応するアンチトキシンである、［１１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法、
［１８］トキシンが大腸菌由来エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦであり、かつアンチトキシンが大腸菌由来ＭａｚＥである、［１７］に記載の方法、
［１９］ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、［１１］～［１８］のいずれか１つに記載の方法、
［２０］アンチトキシンの発現カセットを染色体上に有し、当該発現カセットが、転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域と、当該発現調節領域に動作可能に接続されたアンチトキシンをコードする核酸を含有することを特徴とする細胞、
［２１］転写活性化因子の発現カセットを更に有し、当該発現カセットが、発現調節領域と、当該発現調節領域に動作可能に接続された転写活性化因子をコードする核酸を含有することを特徴とする、［２０］に記載の細胞、
［２２］転写活性化因子の発現カセットにおける発現調節領域が、当該転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する、［２１］に記載の細胞、
［２３］アンチトキシンをコードする核酸、及び転写活性化因子をコードする核酸が、単一の転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に動作可能に接続されている、［２１］または［２２］に記載の細胞、
［２４］転写活性化因子が免疫不全ウイルスのＴａｔである、［２０］～［２３］のいずれか１つに記載の細胞、
［２５］転写活性化因子結合領域が、免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列である、［２０］～［２４］のいずれか１つに記載の細胞、
［２６］アンチトキシンが原核生物由来のトキシンに対応するアンチトキシンである、［２０］～［２５］のいずれか１つに記載の細胞、
［２７］アンチトキシンが大腸菌由来ＭａｚＥである、［２６］に記載の細胞、
に関する。
　本発明により、トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターを効率よく産生する能力を有する細胞（以下、本発明の細胞と記載する）が提供される。更に、本発明の細胞を用いた、トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターの製造方法、及び本発明の細胞の製造方法が提供される。また更に、本発明に用いられる、アンチトキシンの発現カセットを染色体上に有する細胞が提供される。本発明の細胞を使用することにより、トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターを、煩雑な操作なく従来に比べて高い力価で製造することが可能となる。本発明の製造方法により製造されたウイルスベクターは、感染症、がんの治療や予防、ウイルス感染細胞におけるウイルスの増殖阻害などに非常に有用である。
抗Ｔａｔ抗体を用いたウェスタンブロッティング結果を示す図である。
　本明細書においてウイルスベクターとは、天然のウイルス等を基に病原性を取り除き、外来遺伝子を導入するための領域を備えるように改変された組換えウイルス粒子を指す。ウイルスベクターとしては、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が例示され、中でも、レトロウイルスベクターが遺伝子治療の基礎研究や臨床応用における遺伝子導入の利用例が増加している。このような例では無制限な遺伝子導入の懸念がごく低い複製能欠損型のウイルスベクターが用いられている。
　レトロウイルスとは、レトロウイルス科に属するウイルスの総称で、一本鎖ＲＮＡをゲノムに持ち、宿主細胞内でゲノムＲＮＡをＤＮＡに変換する生活環を有するウイルスである。レトロウイルスは、宿主細胞に感染すると自身の持つ逆転写酵素によってゲノムを二本鎖ＤＮＡに変換し、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込む。この状態をプロウイルスといい、プロウイルスは次世代の細胞に伝播され、プロウイルス中の遺伝子を恒常的に発現させる性質を持つ。従って複製能欠損型のレトロウイルスベクターを用いて送達された目的遺伝子は標的細胞中で長期間安定に発現することが期待できる。
　レトロウイルス科は、更にオンコウイルス亜科、レンチウイルス亜科、スプマウイルス亜科、及びオルソレトロウイルス亜科に分類されている。中でもオンコウイルス亜科やレンチウイルス亜科由来のレトロウイルスがウイルスベクターとして用いられている。例えば、オンコレトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に基づくベクター等、レンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１、以下ＨＩＶ－１）やＨＩＶ－２、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に基づくベクター等が挙げられる。ＨＩＶ－１をウイルスベクターに用いるに当たっては、ＨＩＶ－１がＡＩＤＳ（Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の原因ウイルスであるため、高い安全性が求められてきたが、近年、病原性にかかわる修飾遺伝子が削除され、更に３’ＬＴＲ内のプロモーター部位が削除されたことで安全性が高まり、実用化が進んでいる。本発明の細胞により産生されるウイルスベクターとしては、トキシンをコードする遺伝子を標的細胞に送達できるものであれば特に限定はないが、複製能欠損型のレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターが好適である。
　なお、本明細書におけるウイルスベクターには、それぞれシュードタイプ化されたウイルスベクターが含まれる。シュードタイプベクターとは、ＧａｇやＰｏｌとは由来が異なるエンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）を有するウイルスベクターのことを指す。シュードタイプベクターとしては、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４、マウス白血病ウイルス（Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ－ｅｎｖ、Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ－ｅｎｖ、１０Ａ１－ｅｎｖなど）、球菌ウイルス（Ｃｏｃａｌ）などのＥｎｖ、あるいは複数のエンベロープを組み合わせたキメラエンベロープを有するオンコレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターが例示される。
　ウイルスベクターを産生する能力を有する細胞（ウイルス産生細胞）は主に２種類知られており、任意の細胞を材料として作製することができる。それらは１）一過性産生細胞と、２）恒常的産生細胞である。レトロウイルス産生細胞について例に挙げれば、一過性産生細胞とは、ウイルスベクター産生（すなわち、ウイルス粒子形成）に必要なタンパク質をコードする核酸を搭載した核酸構築物と、ウイルス粒子に封入されるＲＮＡを供給する核酸を搭載した核酸構築物を任意の細胞に一過性導入してレトロウイルスを産生する能力を獲得した細胞である。任意の細胞としては、トランスフェクション効率の高いＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１５７３）や２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１１２６８）、２９３Ｆ細胞、２９３ＦＴ細胞（いずれもライフテクノロジーズ社製）、Ｇ３Ｔ－ｈｉ細胞（タカラバイオ社製：国際公開第０６／０３５８２９号パンフレット）等が例示される。恒常的産生細胞とは、あらかじめウイルス粒子形成に必須なタンパク質をコードする核酸が染色体に導入され、前記タンパク質を産生する能力を恒常的に有する細胞（パッケージング細胞）に、レトロウイルスベクタープラスミド又はレトロウイルスベクターを導入してレトロウイルスを産生する能力を獲得した細胞である。パッケージング細胞として、公知のパッケージング細胞、例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－９０７８）、ＧＰ＋Ｅ－８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２（米国特許第５，２７８，０５６号）、Ｐｓｉ－Ｃｒｉｐ［米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ）、第８５巻、第６４６０～６４６４頁（１９８８）］を使用することもできる。また、トランスフェクション効率の高い任意の細胞に対してウイルスベクター産生に必要なタンパク質をコードする核酸の一部またはすべてを事前に染色体に組み込んだ細胞を作製し、ウイルス粒子に封入されるＲＮＡ及び不足しているウイルスベクター産生に必要なタンパク質をコードする核酸を一過性にトランスフェクションしてウイルスベクターを作製することもできる。
　前記のウイルスベクター産生に必要なタンパク質としては、所望のウイルスベクターの産生に必要であれば特に限定はない。レトロウイルスベクターについて例を挙げれば、（Ａ）Ｇａｇ－Ｐｏｌ、（Ｂ）Ｅｎｖなどが例示される。また、レンチウイルスベクターの場合には、必要に応じて、更に（Ｃ）Ｔａｔや（Ｄ）Ｒｅｖ、その他のアクセサリータンパク質を供給する核酸構築物を使用してもよい。また、ウイルス粒子に封入されるＲＮＡとしては、ウイルス粒子に封入されるためのパッケージングシグナル及び標的細胞ゲノムに導入されるためのＬＴＲを有するＲＮＡが例示される。これらの核酸構築物は、好適にはプラスミド若しくはウイルスベクターとして供給することができる。
　レトロウイルスベクターのウイルス粒子に封入されるＲＮＡを供給する核酸は、公知のプラスミドを用いて作製することができる。公知のプラスミドとしては、例えば、複製能欠損オンコレトロウイルスベクターについては、ＭＦＧやα－ＳＧＣ（国際公開第９２／０７９４３号パンフレット）、ｐＢａｂｅ［ヌクレイック　アシッズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１８巻、第３５８７～３５９６頁（１９９０）］、ｐＬＸＳＮ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社製）、ｐＤＯＮ－ＡＩ－２　ＤＮＡ、ｐＤＯＮ－５　ＤＮＡ、ｐＭＥＩ－５　ＤＮＡ（以上、タカラバイオ社製）など、あるいはこれらを改変したプラスミドなどが例示される。複製能欠損レンチウイルスベクターについては、国際公開第００／６６７５９号パンフレットに開示のプラスミド、ｐＬＶＳＩＮシリーズ（タカラバイオ社製）、ｐＬＶＸシリーズ（クロンテック社製）など、あるいはこれらを改変したプラスミドなどが例示される。ここで使用されるプラスミドは、免疫不全ウイルス由来のＵ３プロモーターの一部もしくは全部をキメラプロモーターに置換されていても良い。
　これらウイルスベクター産生に必要なタンパク質の発現やウイルス粒子に封入される核酸の産生方法においては、誘導発現系を使用することもできる。即ち、ウイルスベクターを製造する際にのみ、前記のタンパク質やウイルス粒子に封入される核酸を細胞内で産生させてウイルスベクターを製造することができる。ここで誘導発現系としては、公知の発現系を適用可能である。例えばＴｅｔ－ＯＮシステム、Ｔｅｔ－ＯＦＦシステムを利用することもできる。
　トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターにおいて、ウイルス粒子に封入される核酸を供給する核酸は、前記のウイルス粒子に封入される核酸に、任意のトキシンをコードする核酸を搭載して作製することができる。そして前記のトキシンをコードする核酸の発現の制御のため、適当なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターやその他の転写調節要素が適切な位置に挿入されていても良い。ウイルスベクターによってトキシンをコードする核酸が導入された細胞、組織等での効果的なトキシンの発現のために、例えば、恒常的プロモーター、誘導性プロモーター、組織・器官特異的プロモーター、腫瘍・疾病特異的プロモーター等を利用することができる。
　本明細書においてトキシンとは、細胞中のＤＮＡ複製反応や転写反応、タンパク質合成反応を抑制する等、細胞に対して何らかの毒性を有するポリペプチドのことを指す。本発明に用いられるトキシンとしては、野生型であってもよく、毒性が維持されたものであれば野生型のトキシンが有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は挿入されてなるアミノ酸配列からなる変異体であっても良い。例えば、原核生物の持つ環境ストレス応答機能であるトキシン―アンチトキシン系のトキシンやその変異体が例示される。この場合、前記トキシンをコードする核酸は原核生物のゲノムやプラスミドより単離することができ、また、化学的に合成することができる。トキシンとしては、例えば、モレキュラー　セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ）、第１２巻、第９１３～９２０頁（２００３）、ザ　ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー、第２７９巻、第２０６７８～２０６８４頁（２００４）、ザ　ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー、第２８４巻、第２８７４６～２８７５３頁（２００４）、ジャーナル　オブ　バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１７５巻、第６８５０～６８５６頁（１９９３）にそれぞれ記載された、大腸菌由来エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦ、ＰｅｍＫ、ＭｑｓＲ、ＣｈｐＢＫ、黄色ブドウ球菌由来エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦｓａ［ジャーナル　オブ　バクテリオロジー、第１８９巻、第８８７１－８８７９頁］等が挙げられる。ＭａｚＦは、ＲＮＡ配列５’－Ａ／ＣＡ－３’を切断する一本鎖ＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を有し、ＲＮＡウイルスのゲノムやｍＲＮＡを含む細胞内の一本鎖ＲＮＡを分解する。このことから、ＭａｚＦは、ウイルス感染細胞やがん細胞の排除、ウイルス感染細胞中のウイルスの増殖阻害等に利用されている。本発明には、例えばこれらのトキシンのいずれかをコードする核酸を使用することができる。本発明に使用されるトキシンをコードする核酸としては、ＭａｚＦをコードする核酸、及びＭａｚＦと機能的に相同な変異体をコードする核酸が特に好適に例示される。ＭａｚＦをコードする核酸としては、ＭａｚＦのアミノ酸配列（ＲｅｆＳｅｃ　Ａｃｃ．　Ｎｏ．　ＮＰ＿４１７２６２）をコードするものであれば特に限定はない。例えば、ＭａｚＦをコードする核酸中に存在するＡＣＡの塩基配列を、アミノ酸配列を変化させることなしに他の塩基配列に変換した人工合成配列（配列番号４）が例示される。また、ＭａｚＦと機能的に相同な変異体としては、ＭａｚＦのアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが例示される。これらのトキシンをコードする核酸（トキシン遺伝子とも言う）は、それらを保有する生物から単離することができ、また、化学的に合成することができる。
　本明細書においてアンチトキシンとは、前記トキシンの毒性を抑制するポリペプチドのことを指す。本発明に用いられるアンチトキシンは、ウイルス産生細胞と異なる種由来のアンチトキシンであってトキシンの活性を抑制する能力が維持されたものであれば特に限定はなく、野生型アンチトキシンであっても、野生型のアンチトキシンが有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は挿入されてなるアミノ酸配列からなる変異体であっても良い。例えば、前記のトキシン―アンチトキシン系のアンチトキシンが例示される。この場合、ＭａｚＦに対するアンチトキシンとしてはＭａｚＥ、ＰｅｍＫに対してはＰｅｍＩ、ＭｑｓＲに対してはＹｇｉＴ、ＣｈｐＢＫにしてはＣｈｐＢＩ、ＭａｚＦｓａに対してはＭａｚＥｓａが例示される。例えばＭａｚＥはＭａｚＦに結合し、ＭａｚＦのエンドヌクレアーゼ活性を阻害する。本発明に使用されるアンチトキシンをコードする核酸としては、大腸菌のＭａｚＥをコードする核酸、及びＭａｚＥと機能的に相同な変異体をコードする核酸が特に好適に例示される。大腸菌のＭａｚＥをコードする核酸としては、ＭａｚＥのアミノ酸配列（ＲｅｆＳｅｃ　Ａｃｃ．　Ｎｏ．　ＮＰ＿２８９３３７）をコードするものであれば特に限定はなく、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸が例示される。また、ＭａｚＥと機能的に相同な変異体としては、ＭａｚＥのアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが例示される。これらのアンチトキシンをコードする核酸（アンチトキシン遺伝子とも言う）は、それらを保有する生物から単離することができ、また、化学的に合成することができる。
　本明細書において発現カセットとは、目的産物を発現させるために必要な要素を含んだ核酸構築物を指す。具体的には、少なくともプロモーター配列を含む発現調節領域と、前記発現調節領域に動作可能に接続された、発現させるべき目的産物をコードする核酸とを含む核酸構築物を指す。
　本明細書において、アンチトキシンをコードする核酸、及び転写活性化因子をコードする核酸に関して「動作可能に接続された」とは、アンチトキシンまたは転写活性化因子（目的産物）が発現できるように、発現調節領域に対して適切な位置で目的産物をコードする核酸が配置されていることを意味する。一般的に、発現調節領域は目的産物をコードする核酸に対してｃｉｓになるように動作可能に配置するが、目的産物を発現させるための核酸に直接隣接している必要はなく、またＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）配列や２Ａペプチドをコードする配列等を介して配置された複数の目的産物を発現させるための核酸に配置されていても良い。目的産物を発現させるための核酸が複数配置される場合、同一の目的産物を発現させる核酸が複数配置されていても良く、また異なる目的産物を発現させるための核酸が複数配置されていても良い。
　また、本明細書において発現調節領域とは、発現カセットにおける目的産物の発現をコントロールする領域を指す。具体的には、プロモーターを含む領域を指す。発現調節領域は、更に、転写の調節に関わる各種の調節配列を含んでいても良い。本発明を特に限定するものではないが、本発明におけるプロモーターとしては、哺乳類細胞で機能する任意のプロモーターが例示され、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＰＧＫプロモーター、Ｕ３プロモーターなどが好適に例示される。これらのプロモーターの他、公知の誘導性プロモーター、組織・器官特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、又はそれらと機能的同等性を有する変異配列などを本発明に使用してもよい。本発明のアンチトキシンの発現カセットにおけるプロモーターとしては、転写効率が高いＣＭＶプロモーターが特に好適に例示される。
　本発明におけるアンチトキシンの発現カセットの発現調節領域には、転写効率を上昇させることを目的として、プロモーターの周辺や転写開始点下流の非翻訳領域に、転写活性化因子結合領域に相当する配列が配置される。ここで転写活性化因子結合領域に相当する配列としては、ＲＮＡである転写活性化因子結合領域の塩基配列もしくは前記配列に相当するＤＮＡ配列が例示される。転写活性化因子結合領域は、特定の転写活性化因子との相互作用（結合／かい離）により、その発現カセットに含まれる遺伝子の転写効率を上昇させる配列である。転写活性化因子結合領域に相当する配列は、必要に応じて発現ベクターの複数か所に、あるいは繰り返し配列として使用しても良い。前記の相互作用は転写されたＲＮＡの転写活性化因子結合領域と転写活性化因子との間で起こる。転写活性化因子結合領域としては、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２及びＳＩＶなどの免疫不全ウイルスの５’末端反復配列（ＬＴＲ）内に存在するトランス活性化応答配列（Ｔｒａｎｓ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｒｅｇｉｏｎ、以下、ＴＡＲと記載する）が例示される。ＴＡＲは、免疫不全ウイルスのＬＴＲ内に存在する高次構造を形成する領域であり、ここに転写活性化因子Ｔａｔ（Ｔｒａｎｓ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）が結合すると免疫不全ウイルスＲＮＡの転写が促進される。従って、本発明の態様においては、転写により生成したｍＲＮＡ上に転写活性化因子結合領域が形成されるよう、前記の発現調節領域が構築される。本発明における転写活性化因子結合領域に相当する配列としては、配列表の配列番号３で表されるＨＩＶ－１由来のＴＡＲに相当する配列が特に好適に例示される。また、本発明に利用されるＴＡＲの塩基配列は野生型由来の塩基配列であっても、それに機能的に相同な塩基配列であっても良い。機能的に相同な塩基配列としては、Ｔａｔとの結合能を有するものであれば特に限定はないが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列に対して９５％以上、好ましくは９８％以上の相同性を持つ塩基配列からなるものが例示される。
　本明細書において転写活性化因子とは、ＲＮＡ結合能をもつタンパク質であって、単独で、あるいは二量体や複合体を形成してＲＮＡに結合し、プロモーターに依存している転写の効率を更に上昇させるように働く因子を指す。転写活性化因子としては、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、及びＳＩＶなどの免疫不全ウイルスの転写活性化因子であるＴａｔ、ヒト由来のトランス活性化因子であるＴＲＢＰが例示される。本発明における転写活性化因子としては、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、及びＳＩＶなどの免疫不全ウイルスの転写活性化因子であるＴａｔが好適に例示される。Ｔａｔは、免疫不全ウイルスのＬＴＲに含まれるＴＡＲに結合することによって免疫不全ウイルスＲＮＡの転写を促進する因子である。したがって、転写開始点より下流にＴＡＲを有する発現調節領域からの転写は、Ｔａｔによって促進される。また、本発明に利用されるＴａｔは野生型であっても変異体であっても良い。変異体としてはＴＡＲとの結合能を有するものである限り特に限定はないが、例えば天然のＨＩＶ－１由来のＴａｔのアミノ酸配列に対して９５％以上、好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＴａｔの変異体が例示される。
　本発明では、上述のアンチトキシンの発現カセットを有するウイルス産生細胞を創出し、本発明の細胞とした。すなわち、本発明の細胞とは、トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターを産生する能力を有する細胞であって、アンチトキシンの発現カセットを有し、当該発現カセットが、転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域と、当該発現調節領域に動作可能に接続されたアンチトキシンをコードする核酸を含有することを特徴とする細胞である。前記のアンチトキシンは、ウイルスベクターに搭載される核酸にコードされるトキシンに対応するアンチトキシンである。
　また、本発明の細胞は、事前に任意の細胞の染色体にアンチトキシンの発現カセットを組み込んだ細胞を作製し、その後ウイルス粒子に封入されるＲＮＡ及びウイルスベクター産生に必要なタンパク質をコードする核酸を一過性にトランスフェクションして作製することもできる。したがって、染色体にアンチトキシン発現カセットを組み込んだ前記細胞も本発明の態様の一つである。発現カセットは、適当なベクター（プラスミドやウイルスベクター等）に搭載して導入することができる。発現カセットを細胞に導入する方法には特に限定はないが、本発明に使用する他の核酸構築物の導入と同様、発現カセットを含む核酸構築物が一過性に、あるいは恒常的に細胞に維持される公知の導入方法が例示される。
　核酸構築物の導入方法としては、例えばプラスミドの導入方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、ポリエチレンイミン法、エレクトロポレーション法などが例示される。導入には、市販の試薬、例えばＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００　Ｒｅａｇｅｎｔ（ライフテクノロジーズ社製）、ＦｕＧｅｎｅ（登録商標；プロメガ社製）等を用いても良い。ここで、核酸構築物を細胞に導入し、導入された核酸構築物をゲノムに取り込んだ細胞を選択的に増殖させることにより、導入した核酸構築物を染色体上に保持する細胞を取得することもできる。また、導入にウイルスベクターを用いる場合は、その性質に応じた適切な方法で細胞に感染させれば良い。これら核酸導入方法には市販のキットなどを使用できることは言うまでもない。
　本発明の細胞内では、更に転写活性化因子を人為的に発現させることができる。好適な態様においては、転写活性化因子をコードする核酸を、適当なプロモーター制御下に発現可能となるよう配置して転写活性化因子の発現カセットを作製し、使用する細胞に公知の方法によって導入すれば良い。なお、前記の発現カセットの発現調節領域に、更に前記の転写活性化因子の結合配列に相当する配列を有する発現カセットを用いることも本発明の一態様である。また、単一の発現調節領域で前記転写活性化因子とアンチトキシンを発現させてもよい。即ち、単一の前記発現調節領域に、転写活性化因子をコードする核酸とアンチトキシンをコードする核酸を共に動作可能な状態で接続することもできる。この場合、例えば転写活性化因子をコードする核酸配列と目的産物を発現させるための核酸配列の間に、ＩＲＥＳ配列や２Ａペプチドをコードする配列等を挿入することができる。ＩＲＥＳ配列や２Ａペプチドをコードする配列等を挿入する場合、これらの配列の上流にアンチトキシンをコードする核酸配列を、下流に転写活性化因子をコードする核酸配列を配置しても良く、またその逆であっても良い。上記のような態様においては、発現した転写活性化因子が、転写活性化因子発現カセットから転写されるｍＲＮＡの転写活性化因子結合領域に相互作用して転写を促進するため、細胞内の転写活性化因子量がより増加し、アンチトキシンの発現量もこれに応じて増加する。そして、アンチトキシンの発現量の増加により、より効果的にトキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターを産生することができる。
　したがって、本発明におけるトキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターの製造方法の一態様としては、
トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターの製造方法であって、
（ａ）細胞に下記（１）～（３）に記載の核酸を導入する工程、
（１）転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域と発現調節領域に動作可能に接続されたアンチトキシンをコードする核酸、
（２）ウイルスベクター産生に必要なタンパク質をコードする核酸、及び
（３）ウイルス粒子に封入される核酸を供給する核酸、
（ｂ）工程（ａ）によって得られた細胞を培養する工程、及び
（ｃ）培養物よりウイルスベクターを得る工程、
を含有する方法も例示される。この方法は、更に（４）転写活性化因子をコードする核酸を導入する工程を含有しても良い。上記の（１）～（４）の核酸は、これらのうち２以上を含む核酸構築物によって細胞に導入しても良いし、それぞれを異なる核酸構築物によって細胞に導入しても良い。例えば、上記の（１）の核酸及び（４）の核酸を含む核酸構築物、（２）の核酸を含む核酸構築物、及び（３）の核酸を含む核酸構築物を細胞に導入することもできる。なお、上記の（１）～（４）の核酸を細胞に導入する順序には、特に限定はない、例えば、細胞に（２）の核酸を細胞に導入してパッケージング細胞を構築した後に、（１）の核酸、（３）の核酸、及び（４）の核酸を一過性に導入しても良い。
　本発明の方法において、細胞の培養は、通常使用される条件で行うことができる。例えば温度３０～３７℃、湿度９０～１００％、ＣＯ２濃度３～１０％での培養が例示される。レトロウイルスベクター産生細胞について例を挙げれば、培養は３０～３７℃、培養期間は１２～９６時間が例示される。ただし、本発明の細胞の培養はこのような条件に限定されるものではなく、所望のウイルスベクターの産生が達成できるのであれば前記の範囲以外の培養条件で実施しても良い。培養期間も、所望のウイルスベクターの産生が達成されれば特に限定はない。また、前記工程（ｂ）において、必要に応じてウイルスベクターを得るための新たな培地に交換することもできる。例えばレトロウイルスベクターにおいては、産生されたレトロウイルスベクターはレトロウイルス産生細胞の培養上清に存在するので、培養物より細胞を分離して培養上清を回収することにより得ることができる。また、培養上清を回収した後、新たな培地を添加して細胞培養を行い、再度培養物より培養上清を回収することで、レトロウイルスベクターを繰り返し得ることができる。そして、前記の培養上清をレトロウイルスベクター液としてフィルターろ過したろ液のまま、あるいは公知の方法により濃縮もしくは精製して、適切な方法、例えば凍結して所望の用途に使用するまで保存することができる。
　本発明のウイルスベクターの製造方法により、高い力価を有する、トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターを得ることができる。本明細書中の力価とは、実験的に測定されるウイルスベクターの細胞への感染能力のことである。感染能力の測定は、例えば、任意の細胞にマーカーとなるポリペプチドをコードする核酸を搭載したウイルスベクターを感染させ、細胞内に導入されたマーカーの発現を検出し、定量する方法が例示される。また、マーカーを含まないウイルスベクターの場合には、感染細胞中に組み込まれたウイルス由来のＤＮＡのコピー数を測定する方法が例示される。
　本発明により、本発明のウイルスベクターの製造方法により得られたウイルスベクターも提供される。また、前記のウイルスベクターを作製するための、細胞や核酸構築物を組み合わせたキットなども提供される。更に、本発明の製造方法により得られたウイルスベクターを有効成分として含有する医薬組成物も提供される。前記の医薬組成物は、遺伝子治療用ウイルスベクター製剤の製造技術に従って適宜調製することができる。例えば、本発明の製造方法により得られたレトロウイルスベクターを公知の方法で濃縮、精製することにより、精製されたレトロウイルスベクターを取得し、必要に応じて薬学的に許容される担体と組み合わせて調製することができる。前記の医薬組成物は、患者由来の細胞に対して体外で使用することもでき、もしくは患者へ直接投与することもできる。
　以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
参考例１　アンチトキシンＭａｚＥを恒常的に発現する細胞株の作製
（１）ＭａｚＥ発現プラスミドの構築
　プラスミドｐＢＡｐｏ－ＣＭＶ　Ｐｕｒ　ＤＮＡ（タカラバイオ社製）のマルチクローニングサイトに大腸菌由来のＭａｚＥをコードする核酸（配列番号１）を挿入した。ここでｐＢＡｐｏ－ＣＭＶ　Ｐｕｒ　ＤＮＡとはＣＭＶ　ＩＥプロモーター及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのポリＡシグナルを搭載する哺乳類細胞用の発現プラスミドである。得られたプラスミドはｐＣＭＶ－ＭａｚＥと命名した。このプラスミドは、サイトメガロウイルス由来のプロモーター（ＣＭＶ　ＩＥプロモーター）制御下でＭａｚＥが発現されることを特徴とする。
（２）ＭａｚＥを恒常的に発現する細胞株の作製
　以下の通り、参考例１－（１）で作製したプラスミドｐＣＭＶ－ＭａｚＥを２９３Ｔ細胞に導入しＭａｚＥを恒常的に発現する細胞株を作製した。
　６ｃｍディッシュ（岩城硝子社製）に２９３Ｔ細胞を６×１０５個播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２濃度５％）で培養した。培地は１０％ＦＢＳ（クロンテック社製）を含むＤＭＥＭ培地（シグマ・アルドリッチ社製）を用いた。２４時間後、ｐＣＭＶ－ＭａｚＥをＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３　Ｒｅａｇｅｎｔを用いてキット添付のプロトコールに従って導入した。導入操作後の細胞をＣＯ２インキュベーターでひきつづき培養した。導入の翌日、終濃度１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（クロンテック社製）を含有する１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに交換して培養を継続し、ピューロマイシン耐性の細胞集団を得た。得られたピューロマイシン耐性細胞を５個／ｍＬ、及び１０個／ｍＬになるように希釈し、９６ウェルマイクロプレート（コーニング社製）に１ウェルあたり１００μＬ播種して培養した。播種後７日目以降に各ウェルを観察し、コロニーが１個だけあるウェルを１２個選び、それぞれのコロニーを増殖させ、１２株のクローンを得た。
（３）ＭａｚＦ毒性の抑制効果の高いクローンの選択
　各クローンのＭａｚＦの毒性の抑制効果を評価するため、各クローンにｐＩＲＥＳ２ＭａｚＦＺｓＧプラスミドを一過性に導入した。導入は参考例１－（２）と同様に行った。ここでｐＩＲＥＳ２ＭａｚＦＺｓＧプラスミドとは、ＩＲＥＳを介してＭａｚＦと緑色蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ１が１つのｍＲＮＡとして転写されるプラスミドである。このプラスミドを細胞に導入すると、ＭａｚＥを発現しない２９３Ｔ細胞においては、発現したＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性によってＺｓＧｒｅｅｎ１をコードする配列を含むｍＲＮＡが５’－Ａ／ＣＡ－３’の配列で切断され、ＺｓＧｒｅｅｎ１の翻訳が低下し、それに伴って蛍光強度も低下する。一方ＭａｚＥを発現する細胞においては、ＭａｚＥがＭａｚＦに結合してＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を阻害するため、ｍＲＮＡは切断を免れ、ＺｓＧｒｅｅｎ１が翻訳されて蛍光が観察される。このような評価方法により、蛍光が最も強く観察されるクローンを選択し、それをＭａｚＥによるＭａｚＦ毒性の抑制効果が最も高いクローンとした。選択したクローンは、１Ｄ５細胞と命名した。
参考例２　ＭａｚＥによるＭａｚＦ遺伝子搭載レンチウイルスベクターの力価向上試験
（１）ＭａｚＦ遺伝子搭載レンチウイルスベクタープラスミドの構築
　レンチウイルスベクタープラスミドｐＬＶＳＩＮ－ＡｃＧＦＰ１－Ｎ１（タカラバイオ社製）を制限酵素ＣｌａＩ及びＫｐｎＩ消化して、ＡｃＧＦＰ１発現カセット及びピューロマイシンＮ－アセチル－トランスフェラーゼ発現カセットを除去した。そしてその部分に、ＨＩＶ－１のＵ３プロモーターとＴＡＲから構成されるＵ３－ＴＡＲに相当する配列（配列番号２）と大腸菌由来エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦをコードする配列（配列番号４）からなるＭａｚＦ発現カセット、前記ＭａｚＦ発現カセットの下流にマーカー発現カセットとして、ヒト由来ＰＧＫプロモーター制御下にＴｒｕｎｃａｔｅｄ　ｆｏｒｍ　ｏｆ　Ｌｏｗ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ΔＬＮＧＦＲ）［ヒューマン　ジーン　セラピー（Ｈｕｍｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、第９巻、第２２４３～２２５１頁、（１９９８）］が発現する発現カセットを挿入した。このレンチウイルスベクタープラスミドをｐＬＶ－Ｕ３ＴＡＲＭＦ－ＰＬ２と命名した。
（２）レンチウイルスベクター液の調製
　アンチトキシンＭａｚＥによるＭａｚＦ遺伝子搭載レンチウイルスベクター産生への効果を調べるため、以下の試験を行った。
　細胞培養用２５ｃｍ２フラスコ（セルバインド表面、コーニング社製）に２９３Ｔ細胞、又は１Ｄ５細胞を２．２５×１０６個播種し、ＣＯ２インキュベーターで培養した。培地は１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ社製）を含むＤＭＥＭ培地を用いた。２４時間後、２９３Ｔ細胞、又は１Ｄ５細胞に、表１に示したプラスミドからなる基本プラスミド混合物をＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３　Ｒｅａｇｅｎｔを用いてキットに添付のプロトコールに従って一過性に導入した。導入後の細胞はＣＯ２インキュベーターで培養した。導入の翌日、各ウェルから培地を取り除きＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ社製）を添加し、培養を継続した。導入の２日後、培養上清を０．４５μｍフィルターでろ過し、このろ液をレンチウイルスベクター液として－８０℃で凍結保存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（３）レンチウイルスベクター液の力価評価
　表面無処理の２４ウェルプレート（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に２０μｇ／ｍＬの組換えフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ－２９６［商品名：レトロネクチン（登録商標）；タカラバイオ社製］溶液を１ウェルあたり５００μＬ添加して４℃で一晩放置した。その後、各ウェルからＣＨ－２９６溶液を除去し、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して、ＣＨ－２９６コート２４ウェルプレートとした。
　上述のＣＨ－２９６コート２４ウェルプレートに、１×１０６個／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地（シグマ・アルドリッチ社製）に懸濁したＭＯＬＴ－４細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＲＬ－１５８２）を１ウェルあたり０．２５ｍＬ添加した。次いで、参考例２－（２）で調製したレンチウイルスベクター液を解凍し、１ウェルあたり０．２５ｍＬ添加し、プレートをロッキングしてよく混合した（レンチウイルスベクター液の終濃度：２倍希釈）。このプレートを１０００×ｇ、３２℃で３０分間遠心して、遠心によるウイルス感染を実施した後、ＣＯ２インキュベーターで培養した。感染翌日、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地を０．５ｍＬ添加し、培養を継続した。
　感染の３日後、細胞を回収して０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で洗浄し、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞を懸濁した。ここにＡＰＣ標識マウス抗ヒトＬＮＧＦＲ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を含む溶液を添加し、抗体による細胞の標識を行った。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を洗浄し、再度０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。この細胞液をフローサイトメトリーに供し、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＬＮＧＦＲ抗体による蛍光を検出し、ΔＬＮＧＦＲ陽性率を算出した。その結果を表２に示す。ここで、ΔＬＮＧＦＲは、本参考例と実施例に用いたレンチウイルスベクターのマーカーであり、感染した細胞の細胞表面に発現する。したがってΔＬＮＧＦＲ陽性率は、使用したウイルスベクターの力価を反映し、ウイルス産生細胞のウイルスベクターの産生能力の指標となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示した通り、ＭａｚＥを発現しない２９３Ｔ細胞においては、ＭａｚＦ遺伝子搭載レンチウイルスベクターの産生は確認できなかった。一方、ＭａｚＥを発現する１Ｄ５細胞では、ＭａｚＦ遺伝子搭載レンチウイルスベクターが産生されたことが判明した。そこで、更に高力価のＭａｚＦ遺伝子搭載レンチウイルスベクター産生を試みるため、以下の実施例に示すとおり、発現調節領域を改変したＭａｚＥ発現プラスミドを用いた試験を行った。
実施例１　発現調節領域を改変したＭａｚＥ発現プラスミドを用いたＭａｚＦ遺伝子搭載レンチウイルスベクターの力価向上試験
（１）発現調節領域を改変したＭａｚＥ発現プラスミドの構築
　以下の２種のＭａｚＥ発現プラスミドを構築した。
　ｉ）ｐＣＭＶＵ３ＴＡＲ－ＭａｚＥ：参考例１－（１）で作製したｐＣＭＶ－ＭａｚＥのＣＭＶ　ＩＥプロモーターとＭａｚＥをコードする核酸の間に、ＨＩＶ－１のＵ３プロモーターとＴＡＲから構成されるＵ３－ＴＡＲに相当する配列（配列番号２）を含む核酸を挿入して作製した。
　ｉｉ）ｐＣＭＶＴＡＲ－ＭａｚＥ：参考例１－（１）で作製したｐＣＭＶ－ＭａｚＥのＣＭＶ　ＩＥプロモーターとＭａｚＥをコードする核酸の間に、ＨＩＶ－１のＴＡＲに相当する配列（配列番号３）を含む核酸を挿入して作製した。
　ここで上記２種のプラスミドは、ＭａｚＥをコードする核酸の上流にＨＩＶ－１由来のＴａｔが結合するＨＩＶ－１由来のＴＡＲを含有していることを特徴とする。
（２）レンチウイルスベクター液の調製
　表１に示した基本プラスミド混合物と表３に示したＭａｚＥ発現プラスミドを混合し、１Ｄ５細胞に一過性に導入し、レンチウイルスベクター液を得た。導入とレンチウイルスベクター液の調製は、参考例２－（２）と同様の方法で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（３）レンチウイルスベクター液の力価評価
　参考例２－（３）と同様の方法で試験を行った。得られた細胞液をフローサイトメトリーに供し、ΔＬＮＧＦＲ陽性率を算出した。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　その結果、ＭａｚＥ発現プラスミドを使用した試験条件１～３において、レンチウイルスベクター液の明らかな力価向上が認められた。また、ＴＡＲを有するように発現領域を改変したＭａｚＥ発現プラスミドを使用した試験条件２、３において、より顕著に力価が上昇し、中でもｐＣＭＶＴＡＲ－ＭａｚＥプラスミドを使用した試験条件３において最も力価が上昇した。
実施例２　発現調節領域を改変した転写活性化因子発現プラスミドを用いたレンチウイルスベクターの産生
（１）発現調節領域を改変したＴａｔ発現プラスミドの構築
　以下の３種のＴａｔ発現プラスミドを構築した。
　ｉ）ｐＣＭＶ－Ｔａｔ：ｐＢＡｐｏ－ＣＭＶ　ＤＮＡ（タカラバイオ社製）のマルチクローニングサイトに、ＨＩＶ－１のＴａｔをコードする核酸を挿入して作製した。
　ｉｉ）ｐＵ３ＴＡＲ－Ｔａｔ：ｐＣＭＶ－Ｔａｔを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ消化してＣＭＶ　ＩＥプロモーターを除去し、その部分にＨＩＶ－１のＵ３プロモーターとＴＡＲから構成されるＵ３－ＴＡＲに相当する配列（配列番号２）を含む核酸を挿入して作製した。
　ｉｉｉ）ｐＣＭＶＴＡＲ－Ｔａｔ：ｐＣＭＶ－ＴａｔのＣＭＶ　ＩＥプロモーターの下流に、ＨＩＶ－１のＴＡＲに相当する配列（配列番号３）を含む核酸を挿入して作製した。
　ここで、ｐＵ３ＴＡＲ－Ｔａｔプラスミド、及びｐＣＭＶＴＡＲ－Ｔａｔプラスミドは、Ｔａｔをコードする核酸の上流にＨＩＶ－１由来のＴＡＲが配置されていることを特徴とするプラスミドである。
（２）レンチウイルスベクター液の調製
　細胞培養用２５ｃｍ２フラスコに、２．２５×１０６個の１Ｄ５細胞を播種し、ＣＯ２インキュベーターで培養した。培地には１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いた。２４時間後、参考例２－（２）で示したｐＣＡ－ＧＰＬＶ、ｐＲｅｖ、ｐＥ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＬＶ－Ｕ３ＴＡＲＭＦ－ＰＬ２を含むプラスミド混合物に、実施例２－（１）で作製したＴａｔ発現プラスミドを表５に示す通りに添加したプラスミド混合物を、リン酸カルシウム法により１Ｄ５細胞に一過性に導入した。導入後の細胞はＣＯ２インキュベーターで培養した。導入の７時間後、培地をＸ－ＶＩＶＯ１５培地に交換し、培養を継続した。導入の２日後、培養上清を０．４５μｍフィルターでろ過し、このろ液をレンチウイルスベクター液として－８０℃で凍結保存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（３）レンチウイルスベクター液の力価評価
　参考例２－（３）に記載の方法で調製したＣＨ－２９６コート２４ウェルプレートに、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地に１×１０６個／ｍＬとなるように懸濁したＳＵＰ－Ｔ１細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＲＬ－１９４２）を、１ウェルあたり０．２５ｍＬ添加した。そして実施例２－（２）で調製したレンチウイルスベクター液を解凍し、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地で５倍希釈した後、上述のＳＵＰ－Ｔ１細胞を播種したプレートに１ウェルあたり０．２５ｍＬ添加した。プレートをロッキングしてよく混合し（レンチウイルスベクター液の終濃度：１０倍希釈）、１０００×ｇ、３２℃で３０分間遠心して遠心による感染を実施し、ＣＯ２インキュベーターで培養した。感染翌日、これらの細胞を６ウェルプレート（コーニング社製）に移し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地を２ｍＬ添加して、培養を継続した。感染の４日後、細胞を回収して、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳ（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で洗浄した。次に、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞を懸濁し、ここにＡＰＣ標識マウス抗ヒトＬＮＧＦＲ抗体を含む溶液を添加し、抗体による細胞の標識を行った。その後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を洗浄し、再度０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。この細胞液をフローサイトメトリーに供し、ΔＬＮＧＦＲ陽性率を算出した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表に示す通り、各Ｔａｔ発現プラスミドの使用量が大きいほど、ΔＬＮＧＦＲ陽性率が高い傾向があった。また、ｐＵ３ＴＡＲ－Ｔａｔ及びｐＣＭＶＴＡＲ－Ｔａｔを使用した試験条件では、ｐＣＭＶ－Ｔａｔを使用した試験条件と比較して、明らかに高いΔＬＮＧＦＲ陽性率を示した。
（４）ウイルス産生細胞中のＴａｔ発現量解析
　試験条件１、２、６、７及び８について、実施例２－（２）で培養上清を除いた後に残ったウイルス産生細胞をＰＢＳで洗浄した後、１ｘＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ　６．８、　１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、　２％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ　（ＳＤＳ）、　０．００５％　ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ、　１００　ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を添加した。これを１．５ｍＬチューブに回収し、９５℃、５分間熱処理し、ライゼートとした。このライゼートをＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、抗ＨＩＶ－１　Ｔａｔ抗体（アブカム社製）、及びサンプル間の電気泳動量の評価用として抗α－ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（セルシグナリングテクノロジー社製）を用いてウェスタンブロッティングを行った。抗体の検出にはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）　Ｗｅｓｔ　Ｆｅｍｔｏ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、検出は化学発光検出装置ＬｕｍｉｎｏＳｈｏｔ（登録商標）１４０（タカラバイオ社製）を用いた。抗Ｔａｔ抗体を用いたウェスタンブロッティング結果を図１に示す。なお、抗α－ｔｕｂｕｌｉｎ抗体を用いたウェスタンブロッティングについては、いずれのサンプルからも同程度のシグナルが検出されていることを確認した（データ非掲載）。
　図１に示す通り、ｐＣＭＶＴＡＲ－Ｔａｔを使用した試験条件（レーン３～５）では、ｐＣＭＶ－Ｔａｔを使用した試験条件（レーン１～２）と比較して、Ｔａｔが高発現していることが明らかとなった。この結果から、ｐＣＭＶＴＡＲ－Ｔａｔを使用した試験条件で高力価のＭａｚＦ遺伝子搭載レンチウイルスベクターの産生が可能となったのは、ウイルス産生細胞中でＴａｔ発現が増強されたことによることが分かった。
　本発明の細胞を用いることにより、従来と比較して高力価のトキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターを製造することが可能となる。また、更に転写活性化因子の発現カセットを導入することで、より高力価のウイルスベクターを産生することができる。本発明の細胞を用いて製造されたウイルスベクターや前記のウイルスベクターを有効成分とする組成物は、遺伝子治療の基礎研究又は臨床応用において、感染症、がんの治療や予防、ウイルス感染細胞におけるウイルスの増殖阻害などに非常に有用である。
  SEQ ID NO:1: MazE coding sequence
  SEQ ID NO:2: Nucleic acid sequence corresponding to U3-TAR
  SEQ ID NO:3: Nucleic acid sequence corresponding to TAR
  SEQ ID NO:4: MazF coding sequence

Claims (27)

  1. 　トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターを産生する能力を有する細胞であって、アンチトキシンの発現カセットを有し、当該発現カセットが、転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域と、当該発現調節領域に動作可能に接続されたアンチトキシンをコードする核酸を含有することを特徴とする細胞。
  2. 　転写活性化因子の発現カセットを更に有し、当該発現カセットが、発現調節領域と、当該発現調節領域に動作可能に接続された転写活性化因子をコードする核酸を含有することを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
  3. 　転写活性化因子の発現カセットにおける発現調節領域が、当該転写活性化因子の結合領域に相当する配列を有する、請求項２に記載の細胞。
  4. 　アンチトキシンをコードする核酸、及び転写活性化因子をコードする核酸が、単一の転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に動作可能に接続されている、請求項２または３に記載の細胞。
  5. 　転写活性化因子が免疫不全ウイルスのＴａｔである、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞。
  6. 　転写活性化因子結合領域が、免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列である、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞。
  7. 　トキシンが原核生物由来のトキシンであり、かつアンチトキシンが前記のトキシンに対応するアンチトキシンである、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞。
  8. 　トキシンが大腸菌由来エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦであり、かつアンチトキシンが大腸菌由来ＭａｚＥである、請求項７に記載の細胞。
  9. 　ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞。
  10. 　トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターの製造方法であって、請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞を培養する工程及び前記工程により得られた培養物よりウイルスベクターを得る工程を包含することを特徴とする方法。
  11. 　トキシンをコードする核酸を搭載したウイルスベクターを産生する能力を有する細胞の製造方法であって、
    細胞に下記（１）～（３）に記載の核酸を導入する工程を含有する方法：
    （１）転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域と、当該発現調節領域に動作可能に接続されたアンチトキシンをコードする核酸；
    （２）ウイルスベクター産生に必要なタンパク質をコードする核酸；及び
    （３）ウイルス粒子に封入される核酸を供給する核酸。
  12. 　（４）転写活性化因子をコードする核酸を導入する工程を更に含有する、請求項１１に記載の方法。
  13. 　転写活性化因子をコードする核酸が、当該転写活性化因子の結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に動作可能に接続されている、請求項１２に記載の方法。
  14. 　アンチトキシンをコードする核酸、及び転写活性化因子をコードする核酸が、単一の転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に動作可能に接続されている、請求項１３に記載の方法。
  15. 　転写活性化因子が免疫不全ウイルスのＴａｔである、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　転写活性化因子結合領域が、免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列である、請求項１１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　トキシンが原核生物由来のトキシンであり、かつアンチトキシンが前記のトキシンに対応するアンチトキシンである、請求項１１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　トキシンが大腸菌由来エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦであり、かつアンチトキシンが大腸菌由来ＭａｚＥである、請求項１７に記載の方法。
  19. 　ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項１１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　アンチトキシンの発現カセットを染色体上に有し、当該発現カセットが、転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域と、当該発現調節領域に動作可能に接続されたアンチトキシンをコードする核酸を含有することを特徴とする細胞。
  21. 　転写活性化因子の発現カセットを更に有し、当該発現カセットが、発現調節領域と、当該発現調節領域に動作可能に接続された転写活性化因子をコードする核酸を含有することを特徴とする、請求項２０に記載の細胞。
  22. 　転写活性化因子の発現カセットにおける発現調節領域が、当該転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する、請求項２１に記載の細胞。
  23. 　アンチトキシンをコードする核酸、及び転写活性化因子をコードする核酸が、単一の転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に動作可能に接続されている、請求項２１または２２に記載の細胞。
  24. 　転写活性化因子が免疫不全ウイルスのＴａｔである、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の細胞。
  25. 　転写活性化因子結合領域が、免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列である、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の細胞。
  26. 　アンチトキシンが原核生物由来のトキシンに対応するアンチトキシンである、請求項２０～２５のいずれか１項に記載の細胞。
  27. 　アンチトキシンが大腸菌由来ＭａｚＥである、請求項２６に記載の細胞。
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