JP2001517433A - 非霊長類レンチウイルスベクターおよびパッケージングシステム - Google Patents
非霊長類レンチウイルスベクターおよびパッケージングシステムInfo
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ヒト細胞中で活性な非霊長類レトロウイルスベクターの発見と設計に基づき、レトロウイルスパッケージングシステム、ベクター、パッケージャブル核酸および他の特徴につき記載する。該ベクターは、ＦＩＶなど非霊長類レトロウイルスによりパッケージング可能なものであり、非分裂ヒト細胞を形質導入する。該パッケージングシステムはベクターパッケージング成分をヒト細胞中でトランスに産生し、それによって新しい病原体がヒトの集団に入り込む可能性を回避する。これらのベクターおよびパッケージング成分は、一般の遺伝子伝達ベクターの構築およびヒト遺伝子治療にとって有用である。
Description
【０００１】 連邦政府助成に関する供述 本発明は退役軍人協会供与政府助成金により、また米国立保健研究所供与研究
費番号Ｃａ６７３９４およびＡＩ３６６１２のもとで実施された。米国政府は本
発明に応分の権利を有する。
費番号Ｃａ６７３９４およびＡＩ３６６１２のもとで実施された。米国政府は本
発明に応分の権利を有する。
【０００２】 （発明の背景） 遺伝子療法は慢性感染性疾患（例えば、ＨＩＶ感染症）ならびに癌およびある
形態の先天性欠損症、例えば、酵素欠損症などを含む非感染性疾患に対する治療
法を提供する。核酸を細胞に導入する数種の方法が、生体内、生体外および試験
管内で使用されている。これらの方法は、リポソームによる遺伝子送達（デブス
およびズー（Debs and Zhu）（１９９３）ＷＯ９３／２４６４０およびＵＳＰ５
，６４１，６６２）；マンニーノおよびゴールド−フォゲライト（Mannino and
Gould-Fogerite）（１９８８）BioTechniques ６（７）：６８２〜６９１；ロー
ズ（Rose）ＵＳＰ５，２７９，８３３；ブリガム（Brigham）（１９９１）ＷＯ ９１／０６３０９；およびフェルグナー（Felgner）ら（１９８７）Proc. Natl.
Acad. Sci. USA ８４：７４１３〜７４１４）および、例えば、癌治療のための
アデノウイルス・ベクター介在遺伝子送達（例えば、チェン（Chen）ら（１９９
４）Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA ９１：３０５４〜３０５７；トン（Tong）ら
（１９９６）Gynecol. Oncol. ６１：１７５〜１７９；クレイマン（Clayman） ら（１９９５）Cancer Res. ５：１〜６；オ'マレイ（O'Malley）ら（１９９５ ）Cancer Res. ５５：１０８０〜１０８５；ホワン（Hwang）ら（１９９５）Am.
J. Respir. Cell Mol. Biol. １３：７〜１６；ハッダダ（Haddada）ら（１９ ９５）Curr. Top. Microbiol. Immunol. １９９（Pt. ３）：２９７〜３０６； アディソン（Addison）ら（１９９５）Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA ９２：８ ５２２〜８５２６；コラック（Colak）ら（１９９５）Brain Res. ６９１：７６
〜８２；クリスタル（Crystal）（１９９５）Science ２７０：４０４〜４１０ ；エルシャミ（Elshami）ら（１９９６）Human Gene Ther. ７：１４１〜１４８
；ビンセント（Vincent）ら（１９９６）J. Neurosurg. ８５：６４８〜６５４ 参照）を含む。レトロウイルスゲノムの一部として治療ポリヌクレオチド配列を
取込む複製能欠損レトロウイルスベクターは、特に単純ＭｕＬＶベクターについ
て使用されている。参照文献：ミラー（Miller）ら、Mol. Cell. Biol. １０： ４２３９（１９９０）；コルベルグ（Kolberg）J. NIH Res. ４：４３（１９９ ２）；およびコルネッタ（Cornetta）ら、Hum. Gene Ther. ２：２１５（１９９
１））。
形態の先天性欠損症、例えば、酵素欠損症などを含む非感染性疾患に対する治療
法を提供する。核酸を細胞に導入する数種の方法が、生体内、生体外および試験
管内で使用されている。これらの方法は、リポソームによる遺伝子送達（デブス
およびズー（Debs and Zhu）（１９９３）ＷＯ９３／２４６４０およびＵＳＰ５
，６４１，６６２）；マンニーノおよびゴールド−フォゲライト（Mannino and
Gould-Fogerite）（１９８８）BioTechniques ６（７）：６８２〜６９１；ロー
ズ（Rose）ＵＳＰ５，２７９，８３３；ブリガム（Brigham）（１９９１）ＷＯ ９１／０６３０９；およびフェルグナー（Felgner）ら（１９８７）Proc. Natl.
Acad. Sci. USA ８４：７４１３〜７４１４）および、例えば、癌治療のための
アデノウイルス・ベクター介在遺伝子送達（例えば、チェン（Chen）ら（１９９
４）Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA ９１：３０５４〜３０５７；トン（Tong）ら
（１９９６）Gynecol. Oncol. ６１：１７５〜１７９；クレイマン（Clayman） ら（１９９５）Cancer Res. ５：１〜６；オ'マレイ（O'Malley）ら（１９９５ ）Cancer Res. ５５：１０８０〜１０８５；ホワン（Hwang）ら（１９９５）Am.
J. Respir. Cell Mol. Biol. １３：７〜１６；ハッダダ（Haddada）ら（１９ ９５）Curr. Top. Microbiol. Immunol. １９９（Pt. ３）：２９７〜３０６； アディソン（Addison）ら（１９９５）Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA ９２：８ ５２２〜８５２６；コラック（Colak）ら（１９９５）Brain Res. ６９１：７６
〜８２；クリスタル（Crystal）（１９９５）Science ２７０：４０４〜４１０ ；エルシャミ（Elshami）ら（１９９６）Human Gene Ther. ７：１４１〜１４８
；ビンセント（Vincent）ら（１９９６）J. Neurosurg. ８５：６４８〜６５４ 参照）を含む。レトロウイルスゲノムの一部として治療ポリヌクレオチド配列を
取込む複製能欠損レトロウイルスベクターは、特に単純ＭｕＬＶベクターについ
て使用されている。参照文献：ミラー（Miller）ら、Mol. Cell. Biol. １０： ４２３９（１９９０）；コルベルグ（Kolberg）J. NIH Res. ４：４３（１９９ ２）；およびコルネッタ（Cornetta）ら、Hum. Gene Ther. ２：２１５（１９９
１））。
【０００３】 遺伝子治療にとって最も興味をそそる標的の一つはＨＩＶ感染症である。ＨＩ
Ｖ流行の拡大は、これらウイルスの分子メカニズムおよびライフサイクル解明の
ため、世界中での懸命な努力を駆り立てている。ＨＩＶのライフサイクルは、遺
伝子治療による阻害のための多くの潜在的標的、例えば、ウイルスの侵入を阻止
するトランス優先突然変異体ｇａｇおよびｅｎｖ核酸の細胞性発現、転写とトラ
ンス活性化を阻害するＴＡＲ（ｔａｔの結合部位であり、トランス活性化に対し
一般に必要とされる）誘引物、およびＲＮＡプロセシングを阻害するＲＲＥ（Ｒ
ｅｖの結合部位、すなわち、Ｒｅｖ応答性要素；Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌ
ｅｍｅｎｔ）誘引物とトランス優性Ｒｅｖ突然変異体などを提供する。参照文献
：ローゼンブルグおよびフォウシ（Rosenburg and Fauci）（１９９３）Fundame
ntal Immunology, 第３版、ポール（編纂）、ラーベン・プレス（株）、ニュー ヨークおよびＨＩＶ感染症とＨＩＶライフサイクルの概観に関する引用文献。リ
ボザイムをコードする遺伝子治療ベクター、アンチセンス分子、誘引物遺伝子、
トランス優性遺伝子および自殺遺伝子は、レトロウイルスも含め、ユー（Yu）ら
、Gene Therapy （１９９４）１：１３〜２６に記載されている。アンチセンス およびリボザイム治療剤はＨＩＶ感染症の治療と予防にその重要性が増大してい
る。
Ｖ流行の拡大は、これらウイルスの分子メカニズムおよびライフサイクル解明の
ため、世界中での懸命な努力を駆り立てている。ＨＩＶのライフサイクルは、遺
伝子治療による阻害のための多くの潜在的標的、例えば、ウイルスの侵入を阻止
するトランス優先突然変異体ｇａｇおよびｅｎｖ核酸の細胞性発現、転写とトラ
ンス活性化を阻害するＴＡＲ（ｔａｔの結合部位であり、トランス活性化に対し
一般に必要とされる）誘引物、およびＲＮＡプロセシングを阻害するＲＲＥ（Ｒ
ｅｖの結合部位、すなわち、Ｒｅｖ応答性要素；Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌ
ｅｍｅｎｔ）誘引物とトランス優性Ｒｅｖ突然変異体などを提供する。参照文献
：ローゼンブルグおよびフォウシ（Rosenburg and Fauci）（１９９３）Fundame
ntal Immunology, 第３版、ポール（編纂）、ラーベン・プレス（株）、ニュー ヨークおよびＨＩＶ感染症とＨＩＶライフサイクルの概観に関する引用文献。リ
ボザイムをコードする遺伝子治療ベクター、アンチセンス分子、誘引物遺伝子、
トランス優性遺伝子および自殺遺伝子は、レトロウイルスも含め、ユー（Yu）ら
、Gene Therapy （１９９４）１：１３〜２６に記載されている。アンチセンス およびリボザイム治療剤はＨＩＶ感染症の治療と予防にその重要性が増大してい
る。
【０００４】 種々の遺伝子治療方法が今や癌、ＨＩＶなどの治療のために利用されているに
もかかわらず、現在遺伝子治療に用いられている送達システムには様々な制限が
ある。例えば、ＨＩＶ治療に関して、広範に使用されているマウスレトロウイル
スベクターはヒト末梢血リンパ球の形質導入（核酸の伝達）が乏しく、ＨＩＶの
貯蔵器であることが判明している単球／マクロファージなど非分裂細胞を形質導
入し得ない。ウイルスインヒビターの送達のためにより安全な新しいベクター、
特にＨＩＶ感染症の治療のために非分裂性造血幹細胞に送達し得るベクターが望
まれている。
もかかわらず、現在遺伝子治療に用いられている送達システムには様々な制限が
ある。例えば、ＨＩＶ治療に関して、広範に使用されているマウスレトロウイル
スベクターはヒト末梢血リンパ球の形質導入（核酸の伝達）が乏しく、ＨＩＶの
貯蔵器であることが判明している単球／マクロファージなど非分裂細胞を形質導
入し得ない。ウイルスインヒビターの送達のためにより安全な新しいベクター、
特にＨＩＶ感染症の治療のために非分裂性造血幹細胞に送達し得るベクターが望
まれている。
【０００５】 非霊長類レンチウイルスは新しいベクター系開発のための可能なシステムを提
供する；しかし、これらのウイルスについてはあまり知られていない。非霊長類
レンチウイルスの生物学は霊長類レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ
−２およびＳＩＶ）に比べあまり調べられていないが、それらはレンチウイルス
の比較生物学にとっても興味があり、またより安全なレンチウイルスベクターの
有力な起源としても興味がある。ＨＩＶベースのレトロウイルスベクターは最近
治療用遺伝子伝達体として有望であることが示されているが、その理由は永続的
に感染する非分裂細胞のレンチレトロウイルス−特異性を示すからである（ナル
ディニ（Naldini）ら（１９９６）Science ２７２、２６３〜２６７参照）。そ れに対し、より単純なレトロウイルス（例えば、オンコビリナーエ）から誘導さ
れたレトロウイルスベクターは逆転写および組込みを遂行するための有糸分裂に
際し、核エンベロープの崩壊を必要とする。従って、これらのベクターは非分裂
細胞の形質導入が乏しく、それが静止状態にあるまたは有糸分裂後の細胞標的に
遺伝子を伝達するという有用性を制限する。しかし、ＨＩＶベクターは厄介な安
全性の問題を提起する（エマーマン（Emerman）（１９９６）Nature Biotechnol
ogy １４、９４３）。
供する；しかし、これらのウイルスについてはあまり知られていない。非霊長類
レンチウイルスの生物学は霊長類レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ
−２およびＳＩＶ）に比べあまり調べられていないが、それらはレンチウイルス
の比較生物学にとっても興味があり、またより安全なレンチウイルスベクターの
有力な起源としても興味がある。ＨＩＶベースのレトロウイルスベクターは最近
治療用遺伝子伝達体として有望であることが示されているが、その理由は永続的
に感染する非分裂細胞のレンチレトロウイルス−特異性を示すからである（ナル
ディニ（Naldini）ら（１９９６）Science ２７２、２６３〜２６７参照）。そ れに対し、より単純なレトロウイルス（例えば、オンコビリナーエ）から誘導さ
れたレトロウイルスベクターは逆転写および組込みを遂行するための有糸分裂に
際し、核エンベロープの崩壊を必要とする。従って、これらのベクターは非分裂
細胞の形質導入が乏しく、それが静止状態にあるまたは有糸分裂後の細胞標的に
遺伝子を伝達するという有用性を制限する。しかし、ＨＩＶベクターは厄介な安
全性の問題を提起する（エマーマン（Emerman）（１９９６）Nature Biotechnol
ogy １４、９４３）。
【０００６】 非霊長類レンチウイルスは、有蹄類レンチウイルス、例えば、ビンサ／マエデ
ィ・ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＶＥ）、ウマ感染性貧血性ウイル
ス（ＥＩＡＶ）、およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）などを包含する。これ
らのレンチウイルスは有蹄動物（有蹄類）のみに感染し、一般には有蹄類の特定
種にのみ感染する。
ィ・ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＶＥ）、ウマ感染性貧血性ウイル
ス（ＥＩＡＶ）、およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）などを包含する。これ
らのレンチウイルスは有蹄動物（有蹄類）のみに感染し、一般には有蹄類の特定
種にのみ感染する。
【０００７】 非霊長類レンチウイルスはまた、ネコ科の免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）をも包
含するが（クレメンツおよびジンク（Clements & Zink）（１９９６）Clinical
Microbiology Review ９、１００〜１１７）、これはネコ科にのみ感染する。数
種のＦＩＶが同定されている。
含するが（クレメンツおよびジンク（Clements & Zink）（１９９６）Clinical
Microbiology Review ９、１００〜１１７）、これはネコ科にのみ感染する。数
種のＦＩＶが同定されている。
【０００８】 非霊長類（例えば、ネコ科および有蹄類）レンチウイルスは霊長類のレンチウ
イルスベクターよりも安全な代替物を提供するが、その使用については、その分
子的性質についての知識、特に非宿主動物細胞への適用可能性についての知識が
比較的欠如しているために複雑である（エマーマン、上記）。すべてのレンチウ
イルスが高度に制限された指向性を示す（クレメンツおよびジンク（Clements &
Zink）（１９９６）上記；およびハース（Haase）（１９９４）Annals of the
New York Academy of Sciences ７２４、７５〜８６参照）。
イルスベクターよりも安全な代替物を提供するが、その使用については、その分
子的性質についての知識、特に非宿主動物細胞への適用可能性についての知識が
比較的欠如しているために複雑である（エマーマン、上記）。すべてのレンチウ
イルスが高度に制限された指向性を示す（クレメンツおよびジンク（Clements &
Zink）（１９９６）上記；およびハース（Haase）（１９９４）Annals of the
New York Academy of Sciences ７２４、７５〜８６参照）。
【０００９】 ＦＩＶは１９８６年、飼いネコ（フェリス・キャタス）に、またネコのみに後
天性免疫不全および神経性疾患の原因として発見された［ペダーセン（Pedersen
n）ら（１９８７）Science ２３５、７９０〜７９３（１９８７）；エルダーお よびフィリップス（Elder & Phillips）（１９９３）Infectious Agents and Di
sease ２、３６１〜３７４；ペダーセン（Pedersen）（１９９３）「ネコ科免疫
不全ウイルス」、The Retroviridae（レビイ（Levy, J.A.）編纂、１８１〜２２
８、プレナム・プレス、ニューヨーク、ベンディネリ（Bendinelli）ら（１９９
５）Clinical Microbiology Reviews ８、８７〜１１２；およびスパーガー（Sp
arger）(１９９３) Veterinary Clinics of North America, Small Animal Prac
tice ２３、１７３〜１９１）］。大型のネコ類では、ＦＩＶが地理的にも広く 拡散しており、偏共性であると思われる；自由徘徊性非飼育ネコ族の３７種中１
８種が世界中で感染していることが知られているが、疾病に進展しているものは
ない（エルダーおよびフィリップス（１９９３）上記；オルムシュテッド（Olms
ted）ら（１９９２）Journal of Virology ６６、６００８〜６０１８；バー（B
arr）ら（１９９５）Journal of Virology ６９、７３７１〜７３７４；クーチ ャンプ＆ポンチエル（Courchamp & Pontier）（１９９４）「ネコ族免疫不全ウ イルス：疫学的検討」Comptes Rendus de Academie des Sciences. Serie III,
Sciences de la Vie ３１７、１１２３〜１１３４）。このウイルスは流行性で あり、北アメリカ、ヨーロッパおよび日本での飼いネコ母集団の２〜２０％が感
染している；より高い罹病率は獣医の注意を惹くネコに見られる（ペダーセン（
１９９３）上記；およびクーチャンプ＆ポンチエル（１９９４）上記）。多様な
ネコ族でのＦＩＶの世界的流行と１９６０年代の日付のフェリス・キャタス血清
が同様の高陽性率を示すという観察は、ＦＩＶが飼いネコに最近入ってきたもの
ではないことを示唆している（ベンディネリ（Bendinelli）ら（１９９５）、上
記；オルムシュテッドら（１９９２）上記；クーチャンプ、エフ＆ポンチエル（
１９９４）上記；シェルトン（Shelton）ら（１９９０）Journal of Acquired I
mmune Deficiency Syndromes ３、６２３〜６３０；ベンネット＆スミス（Benne
tt & Smyth）（１９９２）British Veterinary Journal １４８、３９９〜４１ ２；ブラウン（Brown）ら（１９９３）Journal of Zoo and Wildlife Medicine
２４、３５７〜３６４；カーペンター＆オ'ブライアン（Carpenter & O'Brien）
（１９９５）Current Opinion in Genetics and Development ５、７３９〜７４
５）。
天性免疫不全および神経性疾患の原因として発見された［ペダーセン（Pedersen
n）ら（１９８７）Science ２３５、７９０〜７９３（１９８７）；エルダーお よびフィリップス（Elder & Phillips）（１９９３）Infectious Agents and Di
sease ２、３６１〜３７４；ペダーセン（Pedersen）（１９９３）「ネコ科免疫
不全ウイルス」、The Retroviridae（レビイ（Levy, J.A.）編纂、１８１〜２２
８、プレナム・プレス、ニューヨーク、ベンディネリ（Bendinelli）ら（１９９
５）Clinical Microbiology Reviews ８、８７〜１１２；およびスパーガー（Sp
arger）(１９９３) Veterinary Clinics of North America, Small Animal Prac
tice ２３、１７３〜１９１）］。大型のネコ類では、ＦＩＶが地理的にも広く 拡散しており、偏共性であると思われる；自由徘徊性非飼育ネコ族の３７種中１
８種が世界中で感染していることが知られているが、疾病に進展しているものは
ない（エルダーおよびフィリップス（１９９３）上記；オルムシュテッド（Olms
ted）ら（１９９２）Journal of Virology ６６、６００８〜６０１８；バー（B
arr）ら（１９９５）Journal of Virology ６９、７３７１〜７３７４；クーチ ャンプ＆ポンチエル（Courchamp & Pontier）（１９９４）「ネコ族免疫不全ウ イルス：疫学的検討」Comptes Rendus de Academie des Sciences. Serie III,
Sciences de la Vie ３１７、１１２３〜１１３４）。このウイルスは流行性で あり、北アメリカ、ヨーロッパおよび日本での飼いネコ母集団の２〜２０％が感
染している；より高い罹病率は獣医の注意を惹くネコに見られる（ペダーセン（
１９９３）上記；およびクーチャンプ＆ポンチエル（１９９４）上記）。多様な
ネコ族でのＦＩＶの世界的流行と１９６０年代の日付のフェリス・キャタス血清
が同様の高陽性率を示すという観察は、ＦＩＶが飼いネコに最近入ってきたもの
ではないことを示唆している（ベンディネリ（Bendinelli）ら（１９９５）、上
記；オルムシュテッドら（１９９２）上記；クーチャンプ、エフ＆ポンチエル（
１９９４）上記；シェルトン（Shelton）ら（１９９０）Journal of Acquired I
mmune Deficiency Syndromes ３、６２３〜６３０；ベンネット＆スミス（Benne
tt & Smyth）（１９９２）British Veterinary Journal １４８、３９９〜４１ ２；ブラウン（Brown）ら（１９９３）Journal of Zoo and Wildlife Medicine
２４、３５７〜３６４；カーペンター＆オ'ブライアン（Carpenter & O'Brien）
（１９９５）Current Opinion in Genetics and Development ５、７３９〜７４
５）。
【００１０】 非野外のＦＩＶ感染については証拠がない。有蹄類またはネコ科レンチウイル
スのいずれかによる交差感染は、非有蹄類においてもまた非野外種においても観
察されていない。ＨＩＶおよびＦＩＶはその伝染様式が顕著に異なっているが、
それはＦＩＶが原則として噛み付きにより拡散するからである（ペダーセン（１
９９３）上記）。ヒトは飼いネコの噛み付きによりしばしばＦＩＶに曝されるに
もかかわらず、この疑いもなく有効な接種手段はヒトのセロコンバーションに至
らず、あるいはヒトの感染または疾患の他の検出し得る証拠にも至らない（ペダ
ーセン（１９９３）上記；ベンディネリら（１９９５）上記；スパーガー（Spar
ger）(１９９３)上記；クーチャンプ、エフ＆ポンチエル（１９９４）上記；ブ ラウンら（１９９３））。
スのいずれかによる交差感染は、非有蹄類においてもまた非野外種においても観
察されていない。ＨＩＶおよびＦＩＶはその伝染様式が顕著に異なっているが、
それはＦＩＶが原則として噛み付きにより拡散するからである（ペダーセン（１
９９３）上記）。ヒトは飼いネコの噛み付きによりしばしばＦＩＶに曝されるに
もかかわらず、この疑いもなく有効な接種手段はヒトのセロコンバーションに至
らず、あるいはヒトの感染または疾患の他の検出し得る証拠にも至らない（ペダ
ーセン（１９９３）上記；ベンディネリら（１９９５）上記；スパーガー（Spar
ger）(１９９３)上記；クーチャンプ、エフ＆ポンチエル（１９９４）上記；ブ ラウンら（１９９３））。
【００１１】 ＦＩＶはまた、霊長類レンチウイルスとは遺伝子的にも抗原的にも離れている
。ヌクレオチド配列を比較すると、ＨＩＶおよびＳＩＶに対してよりも有蹄類レ
ンチウイルスにより密接な関連性を示す（オルムシュテッド（Olmsted）ら（１ ９８９）Proceedings of the National Academy of Sciences of the United St
ates of America ８６、２４４８〜２４５２（オルムシュテッドら（１９８９）
Ａ）；オルムシュテッドら（１９８９）Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America ８６、８０８８〜８０９２（オ
ルムシュテッドら（１９８９）Ｂ）。ＦＩＶコアタンパク質が数種の有蹄類レン
チウイルスと血清学的に交差反応することが観察されているが、ＨＩＶ−１、Ｈ
ＩＶ−２またはＳＩＶに対しては何も起こらない（エルダーおよびフィリップス
（Elder, J.H. & Phillips（１９９３）上記；ベンネットおよびスミス（Bennet
t, M. & Smyth）（１９９２）上記；オルムシュテッドら（１９８９）Ａ、上記 ；タルボット（Talbott）ら（１９８９）Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America ８６、５７４３〜５７４７； 宮沢（Miyazawa）ら（１９９４）Archives of Virology １３４、２２１〜２３ ４）。このウイルスはｄＵＴＰアーゼをコードする；この５番目のポル−コード
酵素活性は非霊長類レンチウイルスにのみ見出される特徴である（ワガマン（Wa
gaman）ら（１９９３）Virology １９６、４５１〜４５７）。系統発生学的およ
び疫学的データはＦＩＶと野生ネコ類の先祖間の古代適応のエピソード並びに他
のレンチウイルス先祖からの早期進化の多様性を示唆している（オルムシュテッ
ド（Olmsted、R.A.）ら（１９９２）上記；ブラウンら（１９９３）上記；カー ペンター＆オ'ブライアン（Carpenter & O'Brien）（１９９５）タルボット（Ta
lbott）ら（１９８９）上記）。
。ヌクレオチド配列を比較すると、ＨＩＶおよびＳＩＶに対してよりも有蹄類レ
ンチウイルスにより密接な関連性を示す（オルムシュテッド（Olmsted）ら（１ ９８９）Proceedings of the National Academy of Sciences of the United St
ates of America ８６、２４４８〜２４５２（オルムシュテッドら（１９８９）
Ａ）；オルムシュテッドら（１９８９）Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America ８６、８０８８〜８０９２（オ
ルムシュテッドら（１９８９）Ｂ）。ＦＩＶコアタンパク質が数種の有蹄類レン
チウイルスと血清学的に交差反応することが観察されているが、ＨＩＶ−１、Ｈ
ＩＶ−２またはＳＩＶに対しては何も起こらない（エルダーおよびフィリップス
（Elder, J.H. & Phillips（１９９３）上記；ベンネットおよびスミス（Bennet
t, M. & Smyth）（１９９２）上記；オルムシュテッドら（１９８９）Ａ、上記 ；タルボット（Talbott）ら（１９８９）Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America ８６、５７４３〜５７４７； 宮沢（Miyazawa）ら（１９９４）Archives of Virology １３４、２２１〜２３ ４）。このウイルスはｄＵＴＰアーゼをコードする；この５番目のポル−コード
酵素活性は非霊長類レンチウイルスにのみ見出される特徴である（ワガマン（Wa
gaman）ら（１９９３）Virology １９６、４５１〜４５７）。系統発生学的およ
び疫学的データはＦＩＶと野生ネコ類の先祖間の古代適応のエピソード並びに他
のレンチウイルス先祖からの早期進化の多様性を示唆している（オルムシュテッ
ド（Olmsted、R.A.）ら（１９９２）上記；ブラウンら（１９９３）上記；カー ペンター＆オ'ブライアン（Carpenter & O'Brien）（１９９５）タルボット（Ta
lbott）ら（１９８９）上記）。
【００１２】 細胞レベルでは、非霊長類レンチウイルス・ライフサイクルの増殖期および感
染期両方に対するヒト細胞での制限もまた明瞭である（朝永ら（１９９４）Jour
nal of Veterinary Medical Science ５６、１９９〜２０１；宮沢ら（１９９２
）Journal of General Virology ７３、１５４３〜１５４６；トーマーおよびシ
ガーダルドッター（Thormar & Sigurdardottir）（１９６２）Acta Pathol Micr
obiol Scandinav ５５、１８０〜１８６；ギルデン（Gilden）ら（１９８１）Ar
chives of Virology ６７、１８１〜１８５；カーレイおよびダルジール（Carey
& Dalziel）（１９９３）British Veterinary Journal １４９、４３７〜４５ ４）。これらの妨害について、非霊長類レンチウイルスベースのベクターをヒト
に応用するための開発を妨げるような基本的問題は十分に理解されていない。
染期両方に対するヒト細胞での制限もまた明瞭である（朝永ら（１９９４）Jour
nal of Veterinary Medical Science ５６、１９９〜２０１；宮沢ら（１９９２
）Journal of General Virology ７３、１５４３〜１５４６；トーマーおよびシ
ガーダルドッター（Thormar & Sigurdardottir）（１９６２）Acta Pathol Micr
obiol Scandinav ５５、１８０〜１８６；ギルデン（Gilden）ら（１９８１）Ar
chives of Virology ６７、１８１〜１８５；カーレイおよびダルジール（Carey
& Dalziel）（１９９３）British Veterinary Journal １４９、４３７〜４５ ４）。これらの妨害について、非霊長類レンチウイルスベースのベクターをヒト
に応用するための開発を妨げるような基本的問題は十分に理解されていない。
【００１３】 霊長類のＣＤ４分子は唯一既知のレンチウイルスレセプターである（例えば、
ＨＩＶに対して）。一次レセプターも二次レセプターも非霊長類レンチウイルス
のいずれについてもこれまで決定されていない。ＣＤ９のネコ同族体に結合する
抗体が組織培養においてＦＩＶの感染を阻害する（ウイレット（Willett）（１ ９９４）Immunology ８１、２２８〜２３３）が、引続き行われた研究がＣＤ９ もＣＤ４のネコ同族体もＦＩＶレセプターではないことを確立している（ウイレ
ットら（１９９７）Journal of General Virology ７８、６１１〜６１８）。報
告されているヒト細胞でのＦＩＶ発現に対する障害は、例えば、Ｒｅｖ／ＲＲＥ
調節軸などのコアウイルス機能が貧弱なことであり（朝永（Tomonaga、K.）ら（
１９９４）上記；シモンら（１９９５）Journal of Virology ６９、４１６６〜
１７２）、長鎖末端繰返し（ＬＴＲ）のプロモーター活性が貧弱なことである（
宮沢ら（１９９２）上記；スパーガー（Sparger）ら（１９９２）Virology １８
７、１６５〜１７７）。これらの障害のために、非宿主動物細胞における非霊長
類レンチウイルスＲｅｖ−依存性構造タンパク質の発現研究は非常に限られたも
のでしかない。
ＨＩＶに対して）。一次レセプターも二次レセプターも非霊長類レンチウイルス
のいずれについてもこれまで決定されていない。ＣＤ９のネコ同族体に結合する
抗体が組織培養においてＦＩＶの感染を阻害する（ウイレット（Willett）（１ ９９４）Immunology ８１、２２８〜２３３）が、引続き行われた研究がＣＤ９ もＣＤ４のネコ同族体もＦＩＶレセプターではないことを確立している（ウイレ
ットら（１９９７）Journal of General Virology ７８、６１１〜６１８）。報
告されているヒト細胞でのＦＩＶ発現に対する障害は、例えば、Ｒｅｖ／ＲＲＥ
調節軸などのコアウイルス機能が貧弱なことであり（朝永（Tomonaga、K.）ら（
１９９４）上記；シモンら（１９９５）Journal of Virology ６９、４１６６〜
１７２）、長鎖末端繰返し（ＬＴＲ）のプロモーター活性が貧弱なことである（
宮沢ら（１９９２）上記；スパーガー（Sparger）ら（１９９２）Virology １８
７、１６５〜１７７）。これらの障害のために、非宿主動物細胞における非霊長
類レンチウイルスＲｅｖ−依存性構造タンパク質の発現研究は非常に限られたも
のでしかない。
【００１４】 限られた指向性の問題に加えて、臨床使用のために有蹄類またはネコの細胞に
おいて非霊長類レンチウイルスベクターを産生させることは、内在性レトロウイ
ルスまたは他の潜在的な病原体の伝染という危険性が生じる。この危険性は多様
な動物起源の細胞について文献となっている（ストイおよびコフィン（Stoye ＆
Coffin）（１９９５）Nature Medicine １、１１００；バン・デル・クイル（v
an der Kuyl）ら（１９９７）Journal of Virology ７１、３６６６〜３６７６ ）。ネコの細胞はまた複製感応性タイプCの内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４ ）の多数コピーを含んでおり、これがヒト細胞中で複製して、他のレトロウイル
スと表現型混合し、そしてヌクレオチド配列レベルで霊長類レトロウイルスに関
係する（ヒヒ内在性ウイルス）（マック・アリスター（McAllister）ら（１９７
２）Nature New Biol ２３５、３〜６）。さらに、殆どの他のＣ型哺乳類レトロ
ウイルスと違って、ＲＤ１１４はヒト血清補体による不活性化に抵抗する（武内
ら（１９９４）Journal of Virology ６８、８００１〜８００７）。ネコの細胞
はまた他の未知な潜在的病原性感染作因を含んでいることがある。
おいて非霊長類レンチウイルスベクターを産生させることは、内在性レトロウイ
ルスまたは他の潜在的な病原体の伝染という危険性が生じる。この危険性は多様
な動物起源の細胞について文献となっている（ストイおよびコフィン（Stoye ＆
Coffin）（１９９５）Nature Medicine １、１１００；バン・デル・クイル（v
an der Kuyl）ら（１９９７）Journal of Virology ７１、３６６６〜３６７６ ）。ネコの細胞はまた複製感応性タイプCの内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４ ）の多数コピーを含んでおり、これがヒト細胞中で複製して、他のレトロウイル
スと表現型混合し、そしてヌクレオチド配列レベルで霊長類レトロウイルスに関
係する（ヒヒ内在性ウイルス）（マック・アリスター（McAllister）ら（１９７
２）Nature New Biol ２３５、３〜６）。さらに、殆どの他のＣ型哺乳類レトロ
ウイルスと違って、ＲＤ１１４はヒト血清補体による不活性化に抵抗する（武内
ら（１９９４）Journal of Virology ６８、８００１〜８００７）。ネコの細胞
はまた他の未知な潜在的病原性感染作因を含んでいることがある。
【００１５】 従って、より安定なレトロウイルスベクター、例えば、遺伝子送達、癌治療、
ウイルスインヒビター等々のための、非分裂細胞、例えば、造血幹細胞およびニ
ューロン細胞に対するベクター、および非霊長類レトロウイルスベクターをパッ
ケージング得るヒトベクターパッケージング細胞に対するベクターについて、技
術上の必要性がある。本発明はこれらの特徴および他の特徴を提供する。
ウイルスインヒビター等々のための、非分裂細胞、例えば、造血幹細胞およびニ
ューロン細胞に対するベクター、および非霊長類レトロウイルスベクターをパッ
ケージング得るヒトベクターパッケージング細胞に対するベクターについて、技
術上の必要性がある。本発明はこれらの特徴および他の特徴を提供する。
【００１６】 （発明の要約） 本発明は、ヒト細胞中で活性な非霊長類レトロウイルスベクターの発見と設計
に基づき、レトロウイルスパッケージングシステム、ベクター、パッケージャブ
ル核酸および他の特徴につき記載する。該ベクターは、ＦＩＶなど非霊長類レト
ロウイルスによりパッケージング可能なものであり、非分裂ヒト細胞を形質導入
する。該パッケージングシステムはベクターパッケージング成分をヒト細胞中で
トランスに産生し、それによって新しい病原体がヒトの集団に入り込む可能性を
回避する。これらのベクターおよびパッケージング成分は、一般の遺伝子伝達ベ
クターの構築およびヒト遺伝子治療にとって有用である。
に基づき、レトロウイルスパッケージングシステム、ベクター、パッケージャブ
ル核酸および他の特徴につき記載する。該ベクターは、ＦＩＶなど非霊長類レト
ロウイルスによりパッケージング可能なものであり、非分裂ヒト細胞を形質導入
する。該パッケージングシステムはベクターパッケージング成分をヒト細胞中で
トランスに産生し、それによって新しい病原体がヒトの集団に入り込む可能性を
回避する。これらのベクターおよびパッケージング成分は、一般の遺伝子伝達ベ
クターの構築およびヒト遺伝子治療にとって有用である。
【００１７】 本発明により提供される一群のレトロウイルスベクターは、非霊長類レトロウ
イルス、例えば、ＦＩＶまたは有蹄類レトロウイルスなどにより詰込まれたベク
ター核酸を有する。このように、該ベクターはパッケージャブル核酸をもち、そ
の核酸が、選択したレトロウイルス（例、ＦＩＶ）によりコードされたウイルス
パッケージングタンパク質により認識され、詰込まれる。該ベクター核酸はまた
治療遺伝子などの異種的標的核酸を含む。このベクター核酸には病原性はない、
その理由はこの核酸がウイルス複製に必要な１個またはそれ以上の遺伝子を欠失
しているか、または遺伝子に欠陥があるからである。しかし、その欠失または欠
陥成分（例えば、レトロウイルスタンパク質）がトランスに（例えば、パッケー
ジング細胞に）供給されるとき、該ベクター核酸はレトロウイルスのウイルス粒
子に詰込まれる。ベクターはベクターパッケージングまたは複製要素、例えば、
ウイルスタンパク質、ウイルス粒子、逆転写酵素活性、等々を任意に包含する。
イルス、例えば、ＦＩＶまたは有蹄類レトロウイルスなどにより詰込まれたベク
ター核酸を有する。このように、該ベクターはパッケージャブル核酸をもち、そ
の核酸が、選択したレトロウイルス（例、ＦＩＶ）によりコードされたウイルス
パッケージングタンパク質により認識され、詰込まれる。該ベクター核酸はまた
治療遺伝子などの異種的標的核酸を含む。このベクター核酸には病原性はない、
その理由はこの核酸がウイルス複製に必要な１個またはそれ以上の遺伝子を欠失
しているか、または遺伝子に欠陥があるからである。しかし、その欠失または欠
陥成分（例えば、レトロウイルスタンパク質）がトランスに（例えば、パッケー
ジング細胞に）供給されるとき、該ベクター核酸はレトロウイルスのウイルス粒
子に詰込まれる。ベクターはベクターパッケージングまたは複製要素、例えば、
ウイルスタンパク質、ウイルス粒子、逆転写酵素活性、等々を任意に包含する。
【００１８】 本発明ベクターの好適な一群の標的はヒト細胞、特に最終的に分化した造血系
細胞およびニューロンなどの非分裂細胞である（細胞は試験管内または生体内の
ものである）。従って、ヒト細胞の形質導入および感染をもたらす形質は好まし
い形質となる。例えば、ベクター表面上に水疱性口内炎（ＶＳＶ）糖タンパク質
を取込ませる態様は、多様なヒト細胞にベクターが侵入するのを容易にし、好ま
しい。同様に、ヒト細胞中でベクターがコードする１個またはそれ以上の核酸の
発現を誘導するプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーターまたはｔ−ＲＮＡプ
ロモーター）を導入することは、核酸の産生にとって、また任意にはヒト標的細
胞中でのベクターがコードするタンパク質の産生にとって望ましい。
細胞およびニューロンなどの非分裂細胞である（細胞は試験管内または生体内の
ものである）。従って、ヒト細胞の形質導入および感染をもたらす形質は好まし
い形質となる。例えば、ベクター表面上に水疱性口内炎（ＶＳＶ）糖タンパク質
を取込ませる態様は、多様なヒト細胞にベクターが侵入するのを容易にし、好ま
しい。同様に、ヒト細胞中でベクターがコードする１個またはそれ以上の核酸の
発現を誘導するプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーターまたはｔ−ＲＮＡプ
ロモーター）を導入することは、核酸の産生にとって、また任意にはヒト標的細
胞中でのベクターがコードするタンパク質の産生にとって望ましい。
【００１９】 ベクター核酸をトランスにパッケージングするウイルス成分がコードされてい
るパッケージングプラスミドもまた提供される。該パッケージングプラスミドは
ヒト細胞（例えば、ベクターパッケージングに使用するヒト細胞）において活性
なプロモーターを含む。このプロモーターは、ベクター核酸、例えば、ＦＩＶま
たは他の非霊長類レンチウイルスパッケージング核酸などをパッケージングする
のに必要な少なくとも１個のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結して
いる。該パッケージングプラスミドはＦＩＶパッケージング部位を欠如している
。
るパッケージングプラスミドもまた提供される。該パッケージングプラスミドは
ヒト細胞（例えば、ベクターパッケージングに使用するヒト細胞）において活性
なプロモーターを含む。このプロモーターは、ベクター核酸、例えば、ＦＩＶま
たは他の非霊長類レンチウイルスパッケージング核酸などをパッケージングする
のに必要な少なくとも１個のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結して
いる。該パッケージングプラスミドはＦＩＶパッケージング部位を欠如している
。
【００２０】 好適な一態様において、該パッケージングプラスミドはＵ３プロモーター欠失
を有するＦＩＶ ＬＴＲを、一般的にはその欠失部位への異種的プロモーター挿 入部とともにもつ。この配列は内在性ＦＩＶ ＬＴＲプロモーター機能を除き、 異種的プロモーターによる調節を可能とするようになる。
を有するＦＩＶ ＬＴＲを、一般的にはその欠失部位への異種的プロモーター挿 入部とともにもつ。この配列は内在性ＦＩＶ ＬＴＲプロモーター機能を除き、 異種的プロモーターによる調節を可能とするようになる。
【００２１】 非霊長類レンチウイルスパッケージャブル核酸をパッケージングするレトロウ
イルスパッケージング細胞は、上記のパッケージングプラスミドにより提供され
るということが認識されるだろう。特に、該細胞は、好ましくはヒトの細胞であ
るが、必要なウイルスパッケージング要素（例えば、ＧａｇおよびＥｎｖタンパ
ク質）をコードするパッケージングプラスミドを含んでなる。これらのパッケー
ジング要素はパッケージャブルベクター核酸をトランスにパッケージングするの
に使用される。安全性の理由から、該細胞は個々のパッケージングプラスミドを
含むことが時として好ましく、その各々が異なるパッケージングタンパク質をコ
ードする。例えば、パッケージング細胞は別個のレトロウイルスパッケージング
タンパク質（例えば、ＦＩＶ ＧａｇおよびＥｎｖタンパク質）をコードする個 々のパッケージングプラスミドを含む。該細胞はさらにＶＳＶエンベロープ糖タ
ンパク質などのシュードタイプ構成要素をコードするプラスミドを含んでなり、
その詰込まれたプラスミドの宿主領域を拡大する。シュードタイプ構成要素は他
の非霊長類レトロウイルス要素と同じプラスミド上、あるいは個々のプラスミド
上にコードすることができる。いずれにしても、所望のパッケージング要素は、
ヒト細胞において該組成の発現を誘導する適切な調節要素の制御下にある。パッ
ケージャブル核酸（例えば、ＦＩＶパッケージング部位および異種的核酸を含む
）が本発明の細胞に任意に（安定してまたは一過性に）形質導入される。
イルスパッケージング細胞は、上記のパッケージングプラスミドにより提供され
るということが認識されるだろう。特に、該細胞は、好ましくはヒトの細胞であ
るが、必要なウイルスパッケージング要素（例えば、ＧａｇおよびＥｎｖタンパ
ク質）をコードするパッケージングプラスミドを含んでなる。これらのパッケー
ジング要素はパッケージャブルベクター核酸をトランスにパッケージングするの
に使用される。安全性の理由から、該細胞は個々のパッケージングプラスミドを
含むことが時として好ましく、その各々が異なるパッケージングタンパク質をコ
ードする。例えば、パッケージング細胞は別個のレトロウイルスパッケージング
タンパク質（例えば、ＦＩＶ ＧａｇおよびＥｎｖタンパク質）をコードする個 々のパッケージングプラスミドを含む。該細胞はさらにＶＳＶエンベロープ糖タ
ンパク質などのシュードタイプ構成要素をコードするプラスミドを含んでなり、
その詰込まれたプラスミドの宿主領域を拡大する。シュードタイプ構成要素は他
の非霊長類レトロウイルス要素と同じプラスミド上、あるいは個々のプラスミド
上にコードすることができる。いずれにしても、所望のパッケージング要素は、
ヒト細胞において該組成の発現を誘導する適切な調節要素の制御下にある。パッ
ケージャブル核酸（例えば、ＦＩＶパッケージング部位および異種的核酸を含む
）が本発明の細胞に任意に（安定してまたは一過性に）形質導入される。
【００２２】 （定義） 本発明のために、以下の用語を次のように定義する。
【００２３】 「ベクター」とは、細胞を形質導入、形質転換または感染させ、それによって
細胞が、ベクターコード核酸を発現し、そして任意には該細胞にとって本来的で
あるタンパク質以外のタンパク質を発現させるか、または細胞にとって本来的で
はない様式で発現させる組成である。ベクターは該細胞が発現すべき核酸（通常
はＲＮＡまたはＤＮＡ）を含んでいる。ベクターは、任意には、細胞への核酸侵
入達成を介助する物質、例えば、レトロウイルス粒子、リポソーム、タンパク質
コーティングなどを含む。
細胞が、ベクターコード核酸を発現し、そして任意には該細胞にとって本来的で
あるタンパク質以外のタンパク質を発現させるか、または細胞にとって本来的で
はない様式で発現させる組成である。ベクターは該細胞が発現すべき核酸（通常
はＲＮＡまたはＤＮＡ）を含んでいる。ベクターは、任意には、細胞への核酸侵
入達成を介助する物質、例えば、レトロウイルス粒子、リポソーム、タンパク質
コーティングなどを含む。
【００２４】 「非霊長類レンチウイルスパッケージャブル核酸」とは有蹄類レンチウイルス
またはＦＩＶレンチウイルスに由来する機能的ウイルスパッケージング部位をも
つ核酸である。このパッケージング部位をもつ核酸は、対応する野生型ウイルス
がトランスに供給したウイルス成分によりウイルス粒子に取込ませることが可能
であり、野生型ウイルス（または野生型ウイルスから誘導される適切なパッケー
ジング成分）によりパッケージングされる。
またはＦＩＶレンチウイルスに由来する機能的ウイルスパッケージング部位をも
つ核酸である。このパッケージング部位をもつ核酸は、対応する野生型ウイルス
がトランスに供給したウイルス成分によりウイルス粒子に取込ませることが可能
であり、野生型ウイルス（または野生型ウイルスから誘導される適切なパッケー
ジング成分）によりパッケージングされる。
【００２５】 非霊長類レンチウイルスベクター核酸の「自己パッケージングをブロックする
パッケージング能欠損」とは、細胞との関係で、ベクター核酸をウイルス粒子に
パッケージングするのに必要な少なくとも１種のウイルスタンパク質を産生する
ことができない核酸の能力である。例えば、ＧａｇまたはＥｎｖタンパク質がレ
ンチウイルスベクターによりコードされない場合、ベクター核酸を細胞にパッケ
ージングする前に該タンパク質をトランスに供給しなければならない。そのウイ
ルス蛋白質産生能の欠損は、関連する遺伝子の翻訳領域もしくは非翻訳領域（例
えば、プロモーター）での、ウイルスクローンからのウイルスパッケージングに
必要な遺伝子の欠失または突然変異である。ベクター核酸は、それがＦＩＶなど
の非霊長類レンチウイルスベクターが認識するウイルスパッケージング部位をコ
ードする場合、トランスに救済可能である。
パッケージング能欠損」とは、細胞との関係で、ベクター核酸をウイルス粒子に
パッケージングするのに必要な少なくとも１種のウイルスタンパク質を産生する
ことができない核酸の能力である。例えば、ＧａｇまたはＥｎｖタンパク質がレ
ンチウイルスベクターによりコードされない場合、ベクター核酸を細胞にパッケ
ージングする前に該タンパク質をトランスに供給しなければならない。そのウイ
ルス蛋白質産生能の欠損は、関連する遺伝子の翻訳領域もしくは非翻訳領域（例
えば、プロモーター）での、ウイルスクローンからのウイルスパッケージングに
必要な遺伝子の欠失または突然変異である。ベクター核酸は、それがＦＩＶなど
の非霊長類レンチウイルスベクターが認識するウイルスパッケージング部位をコ
ードする場合、トランスに救済可能である。
【００２６】 「パッケージングプラスミド」とはパッケージングプラスミドにより形質導入
された細胞によるウイルス粒子の産生に必要な成分をコードするプラスミドであ
る。パッケージングプラスミドは、ウイルス粒子の産生に必要なすべての成分を
任意にコードするか、あるいはパッケージングに必要な成分のサブセットを任意
に包含する。例えば、好適な一態様において、パッケージング細胞は１以上のパ
ッケージングプラスミドで形質転換され、その各々が非霊長類レンチウイルス粒
子の産生において相補的な役割をもつ（例えば、ＦＩＶに対して）。パッケージ
ングプラスミドは機能的なパッケージング部位、すなわち、プラスミドがコード
する非霊長類レンチウイル成分により認識されるパッケージング部位を欠失し、
該プラスミドを自己パッケージングし得ないものとする。
された細胞によるウイルス粒子の産生に必要な成分をコードするプラスミドであ
る。パッケージングプラスミドは、ウイルス粒子の産生に必要なすべての成分を
任意にコードするか、あるいはパッケージングに必要な成分のサブセットを任意
に包含する。例えば、好適な一態様において、パッケージング細胞は１以上のパ
ッケージングプラスミドで形質転換され、その各々が非霊長類レンチウイルス粒
子の産生において相補的な役割をもつ（例えば、ＦＩＶに対して）。パッケージ
ングプラスミドは機能的なパッケージング部位、すなわち、プラスミドがコード
する非霊長類レンチウイル成分により認識されるパッケージング部位を欠失し、
該プラスミドを自己パッケージングし得ないものとする。
【００２７】 ２種（またはそれ以上）の非霊長類レンチウイルベースパッケージングプラス
ミドは、それらがウイルスパッケージングに必要な機能のすべてをコードする場
合、また、個々それぞれがパッケージングに必要な機能のすべてをコードしてい
ない場合、「相補的」である。このように、例えば、２つのプラスミドが単一の
細胞を形質導入し、そしてそれらが一緒になってＦＩＶパッケージング粒子の産
生についての情報をコードする場合、２つのベクターは「相補的」である。相補
的プラスミドの使用は、パッケージングプラスミドの形質転換により調製された
パッケージング細胞の安全性を増す故に好ましいが、それは組換えにより感染性
ウイルスを産生する可能性が低下したことによる。
ミドは、それらがウイルスパッケージングに必要な機能のすべてをコードする場
合、また、個々それぞれがパッケージングに必要な機能のすべてをコードしてい
ない場合、「相補的」である。このように、例えば、２つのプラスミドが単一の
細胞を形質導入し、そしてそれらが一緒になってＦＩＶパッケージング粒子の産
生についての情報をコードする場合、２つのベクターは「相補的」である。相補
的プラスミドの使用は、パッケージングプラスミドの形質転換により調製された
パッケージング細胞の安全性を増す故に好ましいが、それは組換えにより感染性
ウイルスを産生する可能性が低下したことによる。
【００２８】 パッケージングプラスミドはウイルス粒子の成分をコードする。該粒子は対応
するパッケージング部位をもつ標的ＲＮＡをパッケージングすることができる。
「高効率パッケージングプラスミド」はパッケージング部位をもつ標的ＲＮＡを
パッケージングしており、その結果パッケージング細胞は一過性にまたは安定に
パッケージングプラスミドで形質導入され、標的パッケージャブル核酸、標的パ
ッケージャブルベクターＲＮＡにより、その力価が１ｍｌ当たり少なくとも約１
０5または１０6ないし約１０7または１０8形質導入単位またはさらにそれ以上で
形質導入される。生じる正確な力価はパッケージャブル核酸の性質および選択し
たパッケージング細胞の性質により変化する。より高い感染性はパッケージング
ベクターが完全なパッケージング部位をもつときに一般に得られる。
するパッケージング部位をもつ標的ＲＮＡをパッケージングすることができる。
「高効率パッケージングプラスミド」はパッケージング部位をもつ標的ＲＮＡを
パッケージングしており、その結果パッケージング細胞は一過性にまたは安定に
パッケージングプラスミドで形質導入され、標的パッケージャブル核酸、標的パ
ッケージャブルベクターＲＮＡにより、その力価が１ｍｌ当たり少なくとも約１
０5または１０6ないし約１０7または１０8形質導入単位またはさらにそれ以上で
形質導入される。生じる正確な力価はパッケージャブル核酸の性質および選択し
たパッケージング細胞の性質により変化する。より高い感染性はパッケージング
ベクターが完全なパッケージング部位をもつときに一般に得られる。
【００２９】 「インヒビター」または「ウイルスインヒビター」とは、最も典型的には、活
性な抗ウイルス作因をコードする核酸であるか、またはそれ自体抗ウイルス作因
である。このよに、一態様において、該インヒビターは「直接インヒビター」で
ある、すなわち、該インヒビターはウイルス成分に直接作用し、細胞中のウイル
スの感染、複製、組込みまたは増殖を阻害する。例えば、特に好ましい一態様に
おいて、該インヒビターはＨＩＶ転写物を切断するトランス−活性リボザイムを
含んでなる。この立体配置において、該インヒビターは、典型的には触媒ヌクレ
アーゼ活性をもつＲＮＡ分子である。他の態様において、該インヒビターは「間
接的インヒビター」である、すなわち、該インヒビターは直接インヒビターをコ
ードする。インヒビターは、もしそれが直接インヒビターに対応するセンスまた
はアンチセンス・コーディングまたは相補的核酸を含むならば、活性リボザイム
、タンパク質、ＲＮＡ分子誘引物などの直接インヒビターを「コードする」。慣
習により、リボザイムなどの直接インヒビターＲＮＡは一般にその対応するＤＮ
Ａ配列として掲載される。これは対応する活性ＲＮＡの視覚化を単純化するため
になされ、Ｕ残基が置換わったＴ残基をもつ所定の配列に等価である。
性な抗ウイルス作因をコードする核酸であるか、またはそれ自体抗ウイルス作因
である。このよに、一態様において、該インヒビターは「直接インヒビター」で
ある、すなわち、該インヒビターはウイルス成分に直接作用し、細胞中のウイル
スの感染、複製、組込みまたは増殖を阻害する。例えば、特に好ましい一態様に
おいて、該インヒビターはＨＩＶ転写物を切断するトランス−活性リボザイムを
含んでなる。この立体配置において、該インヒビターは、典型的には触媒ヌクレ
アーゼ活性をもつＲＮＡ分子である。他の態様において、該インヒビターは「間
接的インヒビター」である、すなわち、該インヒビターは直接インヒビターをコ
ードする。インヒビターは、もしそれが直接インヒビターに対応するセンスまた
はアンチセンス・コーディングまたは相補的核酸を含むならば、活性リボザイム
、タンパク質、ＲＮＡ分子誘引物などの直接インヒビターを「コードする」。慣
習により、リボザイムなどの直接インヒビターＲＮＡは一般にその対応するＤＮ
Ａ配列として掲載される。これは対応する活性ＲＮＡの視覚化を単純化するため
になされ、Ｕ残基が置換わったＴ残基をもつ所定の配列に等価である。
【００３０】 「ウイルス阻害」とは細胞内でのウイルスの感染、増殖、組込み、または複製
を阻害する成分の能力をいう。阻害は一般に細胞のウイルス負荷（すなわち、細
胞、細胞培養物または生体に存在するウイルスおよび／またはウイルスタンパク
質または核酸の数）の変化をモニターすることにより、または感染にたいする細
胞、細胞培養物または生体による抵抗をモニターすることにより測定する。
を阻害する成分の能力をいう。阻害は一般に細胞のウイルス負荷（すなわち、細
胞、細胞培養物または生体に存在するウイルスおよび／またはウイルスタンパク
質または核酸の数）の変化をモニターすることにより、または感染にたいする細
胞、細胞培養物または生体による抵抗をモニターすることにより測定する。
【００３１】 「プロモーター」とは核酸の転写を誘導する一連の核酸制御配列である。本明
細書にて用いる場合、プロモーターは転写の開始部位に近い必要核酸配列であり
、例えば、ポリメラーゼII型プロモーターの場合、ＴＡＴＡ要素である。プロモ
ーターはまた、任意には、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素をも包含す
るが、これらは転写開始部位から数千塩基対離れて位置している。
細書にて用いる場合、プロモーターは転写の開始部位に近い必要核酸配列であり
、例えば、ポリメラーゼII型プロモーターの場合、ＴＡＴＡ要素である。プロモ
ーターはまた、任意には、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素をも包含す
るが、これらは転写開始部位から数千塩基対離れて位置している。
【００３２】 「構成」プロモーターは殆どの環境的および発生的条件下で活性なプロモータ
ーである。「誘導し得る」プロモーターとは環境的および発生的調節下にあるプ
ロモーターである。
ーである。「誘導し得る」プロモーターとは環境的および発生的調節下にあるプ
ロモーターである。
【００３３】 用語「単離した」または「生物学的に純粋な」とは、通常その自然の状態で見
出されたときには混ざっている成分から実質的にまたは本質的に遊離している物
質をいう。
出されたときには混ざっている成分から実質的にまたは本質的に遊離している物
質をいう。
【００３４】 用語「異種的」とは、核酸の部分を参照して使用する場合、該核酸が自然界で
は互いにそのような関係では存在し得ない２つ以上のサブシーケンスからなるこ
とをいう。例えば、該核酸は一般に組換えにより産生され、新しい機能的核酸を
造るために配列された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列をもつものである。
例えば、一態様において、核酸は、抗ウイルスリボザイムなどの異なる遺伝子か
らのコーディング配列を発現するように配列された１遺伝子からのプロモーター
を有する。このように、リボザイムコーディング配列についていえば、プロモー
ターは異種的である。
は互いにそのような関係では存在し得ない２つ以上のサブシーケンスからなるこ
とをいう。例えば、該核酸は一般に組換えにより産生され、新しい機能的核酸を
造るために配列された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列をもつものである。
例えば、一態様において、核酸は、抗ウイルスリボザイムなどの異なる遺伝子か
らのコーディング配列を発現するように配列された１遺伝子からのプロモーター
を有する。このように、リボザイムコーディング配列についていえば、プロモー
ターは異種的である。
【００３５】 ２つの核酸配列またはポリペプチド配列との関連での用語「同一である」とは
、２つの配列を最大に対応するように一列に整列させたときに同じである残基を
いう。配列同一性の割合をタンパク質またはペプチドを参照して用いるとき、同
一ではない残基の位置が同類アミノ酸置換によりしばしば異なることが認められ
るが、その場合アミノ酸残基は同様の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）
をもつ他のアミノ酸残基に置換わり、従って分子の機能的性質を変化させない。
配列が同類置換において異なる場合、配列同一性の割合は該置換の保存的性質に
対し上方に訂正、調整することができる。この調整方法は当業者周知である。一
般には、この方法は同類置換を全体のミスマッチよりもむしろ部分的ミスマッチ
として点数を付け、それによって配列同一性の割合を上昇させる。このように、
例えば、同一アミノ酸をスコア１とし、非同類置換のスコアをゼロとした場合、
同類置換のスコアはゼロと１の間とする。同類置換の点数化は例えば、マイヤー
およびミラー（Meyers and Miller）の演算法（Computer Applic. Biol. Sci.、
４：１１〜１７（１９８８））に従い、例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（イ
ンテリジェネティック、マウンテン・ビュー、カリフォルニア、ＵＳＡ）により
実施する。「比較ウインドウ」とは、本明細書にて用いる場合、少なくとも約５
０の隣接位置の区分、通常約５０ないし約２００、より一般的には約１００ない
し約１５０の区分をいい、その配列と同一数の隣接位置の参照配列とを、２つの
配列を最適に整列した後、比較する。比較に際しての配列の整列法は技術上周知
である。比較に際しての配列の最適整列は以下の方法により実施し得る：スミス
およびウオーターマン（Smith and Waterman）(Adv. Appln. Math. ２：４８２ （１９８１）) のローカル相同性演算法；ニードルマンおよびウンシュ（Needle
man and Wunsch）(J. Mol. Biol. ４８：４４３（１９７０）)の相同性直線整列
演算法；パーソンおよびリップマン（Pearson and Lipman）(Proc. Natl. Acad.
Sci. USA ８５：２４４４（１９８８）)の類似法の検索；これらの演算法のコ ンピューター化実施（例えば、ＰＣ／遺伝子プログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ
（インテリジェネティック、マウンテン・ビュー、カリフォルニア）、ＧＡＰ、
ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびウイスコンシン・ジェネティックス・ソフ
トウエア・パッケージにおけるＴＦＡＳＴＡ（ジェネティックス・コンピュータ
ー・グループ（ＧＣＧ）、５７５サイエンスドクター、マジソン、ウイスコンシ
ン、ＵＳＡ）；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは以下に詳しく記載されている：ヒギ
ンズおよびシャープ（Higgins and Sharp）Gene、７３：２３７〜２４４（１９ ８８）およびヒギンズおよびシャープ、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３（１ ９８９）；コーペット（Corpet）ら、Nucleic Acids Research １６、１０８８ １〜９０（１９８８）；ハン（Huang）ら、Computer Applications in the Bios
ciences ８、１５５〜６５（１９９２）；およびパーソン（Pearson）ら、Metho
ds in Molecular Biology ２４、３０７〜３１（１９９４）。直線整列はしばし
ば検査および手動整列により実施する。特定核酸配列の「保存的改変」とは同一
のまたは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または該核酸がアミノ
酸配列をコードしない場合には、実質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮
退のために、大多数の機能的に同一の核酸が所定のポリペプチドをコードする。
例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧはすべて
アミノ酸アルギニンをコードする。このように、アルギニンが１つのコドンによ
り特定されているそれぞれの位置において、該コドンはコードされたポリペプチ
ドを変えることなく、相当する上記コドンのいずれかに変更することができる。
かかる核酸の変更は「サイレント変更」であり、これが「保存的改変」の一態様
である。ポリペプチドをコードするそれぞれの核酸配列について、それぞれ可能
なサイレント変更を記載することができる。当業者は核酸の各コドン（メチオニ
ンに対する通常唯一のコドンであるＡＵＧを除く）を標準的技法により改変して
、機能的に同一の分子を生じさせ得ることを認識するだろう。従って、ポリペプ
チドをコードする核酸の各「サイレント変更」は記載された配列に暗示されてい
る。さらに、当業者は、コードされた配列内の単一アミノ酸またはアミノ酸の僅
かな割合（一般には５％以下、より一般には１％以下）が変更、付加または欠失
を受ける個々の置換、欠失または付加が「保存的改変」であり、該変更は１つの
アミノ酸が化学的に類似のアミノ酸と置換することである、と認識するだろう。
機能的に類似のアミノ酸を示す同類置換の一覧表は技術上周知である。以下の６
つの群はそれぞれ互いにとって同類置換であるアミノ酸を含んでいる：１）アラ
ニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グ
ルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニ
ン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニ
ン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）
、トリプトファン（Ｗ）。参照：クレイトン（Creighton）（１９８４）Protein
s W.H. フリーマン・アンド・カンパニー。最後に、核酸分子の活性を変化させ ない配列、例えば、非機能性配列などの付加は基礎となる核酸の同類置換である
。
、２つの配列を最大に対応するように一列に整列させたときに同じである残基を
いう。配列同一性の割合をタンパク質またはペプチドを参照して用いるとき、同
一ではない残基の位置が同類アミノ酸置換によりしばしば異なることが認められ
るが、その場合アミノ酸残基は同様の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）
をもつ他のアミノ酸残基に置換わり、従って分子の機能的性質を変化させない。
配列が同類置換において異なる場合、配列同一性の割合は該置換の保存的性質に
対し上方に訂正、調整することができる。この調整方法は当業者周知である。一
般には、この方法は同類置換を全体のミスマッチよりもむしろ部分的ミスマッチ
として点数を付け、それによって配列同一性の割合を上昇させる。このように、
例えば、同一アミノ酸をスコア１とし、非同類置換のスコアをゼロとした場合、
同類置換のスコアはゼロと１の間とする。同類置換の点数化は例えば、マイヤー
およびミラー（Meyers and Miller）の演算法（Computer Applic. Biol. Sci.、
４：１１〜１７（１９８８））に従い、例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（イ
ンテリジェネティック、マウンテン・ビュー、カリフォルニア、ＵＳＡ）により
実施する。「比較ウインドウ」とは、本明細書にて用いる場合、少なくとも約５
０の隣接位置の区分、通常約５０ないし約２００、より一般的には約１００ない
し約１５０の区分をいい、その配列と同一数の隣接位置の参照配列とを、２つの
配列を最適に整列した後、比較する。比較に際しての配列の整列法は技術上周知
である。比較に際しての配列の最適整列は以下の方法により実施し得る：スミス
およびウオーターマン（Smith and Waterman）(Adv. Appln. Math. ２：４８２ （１９８１）) のローカル相同性演算法；ニードルマンおよびウンシュ（Needle
man and Wunsch）(J. Mol. Biol. ４８：４４３（１９７０）)の相同性直線整列
演算法；パーソンおよびリップマン（Pearson and Lipman）(Proc. Natl. Acad.
Sci. USA ８５：２４４４（１９８８）)の類似法の検索；これらの演算法のコ ンピューター化実施（例えば、ＰＣ／遺伝子プログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ
（インテリジェネティック、マウンテン・ビュー、カリフォルニア）、ＧＡＰ、
ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびウイスコンシン・ジェネティックス・ソフ
トウエア・パッケージにおけるＴＦＡＳＴＡ（ジェネティックス・コンピュータ
ー・グループ（ＧＣＧ）、５７５サイエンスドクター、マジソン、ウイスコンシ
ン、ＵＳＡ）；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは以下に詳しく記載されている：ヒギ
ンズおよびシャープ（Higgins and Sharp）Gene、７３：２３７〜２４４（１９ ８８）およびヒギンズおよびシャープ、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３（１ ９８９）；コーペット（Corpet）ら、Nucleic Acids Research １６、１０８８ １〜９０（１９８８）；ハン（Huang）ら、Computer Applications in the Bios
ciences ８、１５５〜６５（１９９２）；およびパーソン（Pearson）ら、Metho
ds in Molecular Biology ２４、３０７〜３１（１９９４）。直線整列はしばし
ば検査および手動整列により実施する。特定核酸配列の「保存的改変」とは同一
のまたは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または該核酸がアミノ
酸配列をコードしない場合には、実質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮
退のために、大多数の機能的に同一の核酸が所定のポリペプチドをコードする。
例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧはすべて
アミノ酸アルギニンをコードする。このように、アルギニンが１つのコドンによ
り特定されているそれぞれの位置において、該コドンはコードされたポリペプチ
ドを変えることなく、相当する上記コドンのいずれかに変更することができる。
かかる核酸の変更は「サイレント変更」であり、これが「保存的改変」の一態様
である。ポリペプチドをコードするそれぞれの核酸配列について、それぞれ可能
なサイレント変更を記載することができる。当業者は核酸の各コドン（メチオニ
ンに対する通常唯一のコドンであるＡＵＧを除く）を標準的技法により改変して
、機能的に同一の分子を生じさせ得ることを認識するだろう。従って、ポリペプ
チドをコードする核酸の各「サイレント変更」は記載された配列に暗示されてい
る。さらに、当業者は、コードされた配列内の単一アミノ酸またはアミノ酸の僅
かな割合（一般には５％以下、より一般には１％以下）が変更、付加または欠失
を受ける個々の置換、欠失または付加が「保存的改変」であり、該変更は１つの
アミノ酸が化学的に類似のアミノ酸と置換することである、と認識するだろう。
機能的に類似のアミノ酸を示す同類置換の一覧表は技術上周知である。以下の６
つの群はそれぞれ互いにとって同類置換であるアミノ酸を含んでいる：１）アラ
ニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グ
ルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニ
ン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニ
ン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）
、トリプトファン（Ｗ）。参照：クレイトン（Creighton）（１９８４）Protein
s W.H. フリーマン・アンド・カンパニー。最後に、核酸分子の活性を変化させ ない配列、例えば、非機能性配列などの付加は基礎となる核酸の同類置換である
。
【００３６】 核酸のハイブリッド形成実験、例えば、サザーンおよびノーザンハイブリッド
形成に関連する「緊縮ハイブリッド形成洗浄条件」は配列依存性であり、異なる
環境パラメーターのもとで異なっている。核酸ハイブリッド形成への広範な指針
が以下に見出される：チジュセン（Tijssen）（１９９３）Laboratory Techniqu
es in Biochemistry and Molecular Biology（生化学と分子生物学における研究
室技法）−核酸プローブでのハイブリッド形成、パートI、第２章「ハイブリッ ド形成の原理と核酸プローブアッセイの戦略概観」、エルスビアー、ニューヨー
ク。一般に、高度緊縮ハイブリッド形成洗浄条件は規定されたイオン強度および
ｐＨで特定の配列に対して熱融点（Ｔm）よりも約５℃低い温度に選定される。 Ｔmとは標的配列の５０％が完全に適合したプローブとハイブリッド形成する温 度（規定されたイオン強度およびｐＨの下で）である。ある種のプローブに対し
ては、Ｔmと同じ程度の強い条件を用いる。
形成に関連する「緊縮ハイブリッド形成洗浄条件」は配列依存性であり、異なる
環境パラメーターのもとで異なっている。核酸ハイブリッド形成への広範な指針
が以下に見出される：チジュセン（Tijssen）（１９９３）Laboratory Techniqu
es in Biochemistry and Molecular Biology（生化学と分子生物学における研究
室技法）−核酸プローブでのハイブリッド形成、パートI、第２章「ハイブリッ ド形成の原理と核酸プローブアッセイの戦略概観」、エルスビアー、ニューヨー
ク。一般に、高度緊縮ハイブリッド形成洗浄条件は規定されたイオン強度および
ｐＨで特定の配列に対して熱融点（Ｔm）よりも約５℃低い温度に選定される。 Ｔmとは標的配列の５０％が完全に適合したプローブとハイブリッド形成する温 度（規定されたイオン強度およびｐＨの下で）である。ある種のプローブに対し
ては、Ｔmと同じ程度の強い条件を用いる。
【００３７】 相補的核酸ハイブリッド形成のための緊縮ハイブリッド形成条件の事例は、サ
ザーンおよびノーザンブロットにおいてフィルター上該核酸が１００以上の相補
的残基をもつものの例では、１ｍｇヘパリン含有５０％ホルマリンで、４２℃で
ハイブリッド形成を一夜実施することである。緊縮洗浄条件の例は、６５℃で１
５分間の２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣバッファーの説明については上記サムブ
ルークの著書参照）。多くの場合、バックグランドプローブシグナル除去のため
には、高度緊縮洗浄の前に低緊縮洗浄を行う。低緊縮洗浄の例は４０℃１５分間
の２×ＳＳＣである。一般に、シグナル／ノイズ比が特定のハイブリッド形成に
おいて非関連プローブに対し観測されるものの２×（またはそれ以上）であると
きは、特異的ハイブリッド形成が検出されていることを示す。
ザーンおよびノーザンブロットにおいてフィルター上該核酸が１００以上の相補
的残基をもつものの例では、１ｍｇヘパリン含有５０％ホルマリンで、４２℃で
ハイブリッド形成を一夜実施することである。緊縮洗浄条件の例は、６５℃で１
５分間の２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣバッファーの説明については上記サムブ
ルークの著書参照）。多くの場合、バックグランドプローブシグナル除去のため
には、高度緊縮洗浄の前に低緊縮洗浄を行う。低緊縮洗浄の例は４０℃１５分間
の２×ＳＳＣである。一般に、シグナル／ノイズ比が特定のハイブリッド形成に
おいて非関連プローブに対し観測されるものの２×（またはそれ以上）であると
きは、特異的ハイブリッド形成が検出されていることを示す。
【００３８】 緊縮条件下互いにハイブリッド形成しない核酸は、その核酸がコードするポリ
ぺプチドが実質的に同一であるならば、なお実質的に同一である。これは例えば
、核酸のコピーが遺伝子コードにより許される最大コドン縮退を用い作られる場
合に生じる。
ぺプチドが実質的に同一であるならば、なお実質的に同一である。これは例えば
、核酸のコピーが遺伝子コードにより許される最大コドン縮退を用い作られる場
合に生じる。
【００３９】 「ＦＩＶ−１Ｇａｇタンパク質」はＦＩＶ−１ｇａｇ遺伝子によりコードされ
たタンパク質である。Ｇａｇタンパク質は一般に大きなプレタンパク質として翻
訳され、それが切断されて構造コアタンパク質を形成し、それが野生型のゲノム
ＲＮＡをパッケージングする。短小化されたＧａｇタンパク質とは野生型配列に
比べて短いｇａｇ遺伝子から産生されたタンパク質のことである。同様に、ＦＩ
Ｖ逆転写酵素タンパク質およびＦＩＶエンベロープタンパク質はｐｏｌおよびｅ
ｎｖ遺伝子によりそれぞれコードされる。
たタンパク質である。Ｇａｇタンパク質は一般に大きなプレタンパク質として翻
訳され、それが切断されて構造コアタンパク質を形成し、それが野生型のゲノム
ＲＮＡをパッケージングする。短小化されたＧａｇタンパク質とは野生型配列に
比べて短いｇａｇ遺伝子から産生されたタンパク質のことである。同様に、ＦＩ
Ｖ逆転写酵素タンパク質およびＦＩＶエンベロープタンパク質はｐｏｌおよびｅ
ｎｖ遺伝子によりそれぞれコードされる。
【００４０】 「核酸」という用語は一本鎖または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまた
はリボヌクレオチドをいい、特に限定しない限り、天然産ヌクレオチドと類似の
様式で核酸にハイブリッド形成する天然ヌクレオチドの既知類似体を包含する。
特に断わりのない限り、特定の核酸配列はその相補配列を任意に包含する。
はリボヌクレオチドをいい、特に限定しない限り、天然産ヌクレオチドと類似の
様式で核酸にハイブリッド形成する天然ヌクレオチドの既知類似体を包含する。
特に断わりのない限り、特定の核酸配列はその相補配列を任意に包含する。
【００４１】 「操作可能に結合した」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモー
ター、または配置された転写因子結合部位）と第二核酸配列間の機能的連鎖をい
い、そこでは該発現制御配列が第二配列に相当する核酸の転写を誘導する。
ター、または配置された転写因子結合部位）と第二核酸配列間の機能的連鎖をい
い、そこでは該発現制御配列が第二配列に相当する核酸の転写を誘導する。
【００４２】 「組換え」という用語は、細胞に関して用いる場合、該細胞が核酸を複製する
かまたは発現すること、またはその起源が細胞に対して外来性である核酸により
コードされるペプチドまたはタンパク質を発現することを意味する。組換え細胞
は細胞の未変性（非組換え）型内には見出されない遺伝子を発現することができ
る。組換え細胞はまた、細胞の未変性型に見出される遺伝子であって、当該遺伝
子が人工的手段により該細胞中に再導入された場合、その遺伝子も発現する。
かまたは発現すること、またはその起源が細胞に対して外来性である核酸により
コードされるペプチドまたはタンパク質を発現することを意味する。組換え細胞
は細胞の未変性（非組換え）型内には見出されない遺伝子を発現することができ
る。組換え細胞はまた、細胞の未変性型に見出される遺伝子であって、当該遺伝
子が人工的手段により該細胞中に再導入された場合、その遺伝子も発現する。
【００４３】 「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」という場合、それは核酸
構築物であって、細胞内で特定の核酸の転写を可能とする核酸要素により、組換
えによりまたは合成により調製した核酸構築物である。組換え発現カセットはプ
ラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部であってもよい。一般に、組
換え発現カセットは転写すべき核酸およびプロモーターを含む。幾つかの態様に
おいて、発現カセットはまた、例えば、複製の起源、および／または染色体組込
み要素（例えば、レトロウイルスＬＴＲ）を含む。
構築物であって、細胞内で特定の核酸の転写を可能とする核酸要素により、組換
えによりまたは合成により調製した核酸構築物である。組換え発現カセットはプ
ラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部であってもよい。一般に、組
換え発現カセットは転写すべき核酸およびプロモーターを含む。幾つかの態様に
おいて、発現カセットはまた、例えば、複製の起源、および／または染色体組込
み要素（例えば、レトロウイルスＬＴＲ）を含む。
【００４４】 特定の核酸配列に関連して「サブシーケンス」という用語は、特定した核酸に
等しいか、またはより小さい核酸の領域をいう。
等しいか、またはより小さい核酸の領域をいう。
【００４５】 ウイルスまたはベクターは、それが核酸を細胞内に伝達する際に細胞を「形質
導入する」。ウイルスまたはベクターは、それが細胞を形質導入し、複製し、そ
して（相補性ウイルスまたはベクターの介助なしに）同じ型の子孫ベクターまた
はウイルスを生体または細胞培養物内の他の細胞に拡散する場合、「感染性」で
あり、その場合、子孫のベクターまたはウイルスは生体または細胞培養物を通し
て再生産され、拡散する同じ能力を有する。このように、例えば、ＦＩＶ粒子を
コードする核酸は、その核酸がＦＩＶ粒子により詰込まれ得ないならば（例えば
、もし該核酸がＦＩＶパッケージング部位を欠くならば）、たとえ該核酸が細胞
を形質導入し、形質転換するのに用い得るとしても、感染性ではない。同様に、
ＦＩＶ粒子により詰込まれたＦＩＶ−パッケージャブル核酸は、もしそれがパッ
ケージングされるＦＩＶ粒子をコードしていないならば、たとえそれが細胞を形
質導入し、形質転換するのに用い得るとしても、感染性ではない。ウイルスパッ
ケージング成分（例えば、ＧａｇおよびＥｎｖタンパク質）の完全セットをコー
ドしていないベクターは「パッケージング能欠損」である。これらのベクターは
該ベクターがパッケージング細胞中トランスに供給されたウイルスタンパク質に
よりパッケージングされる場合、「トランス救済可能」である。細胞培養物中Ｆ
ＩＶを感染させた細胞またはＦＩＶを感染させた生体を形質転換するために、も
しＦＩＶ−パッケージャブル核酸が用いられるならば、ＦＩＶ−パッケージャブ
ル核酸は複製され、感染性ＦＩＶウイルスと協力して生体中に拡散される。しか
し、ＦＩＶ−パッケージャブル核酸それ自体は「感染性」ではない、というのは
、パッケージング機能はトランス相補性を介して感染性ＦＩＶウイルスにより与
えられるからである。
導入する」。ウイルスまたはベクターは、それが細胞を形質導入し、複製し、そ
して（相補性ウイルスまたはベクターの介助なしに）同じ型の子孫ベクターまた
はウイルスを生体または細胞培養物内の他の細胞に拡散する場合、「感染性」で
あり、その場合、子孫のベクターまたはウイルスは生体または細胞培養物を通し
て再生産され、拡散する同じ能力を有する。このように、例えば、ＦＩＶ粒子を
コードする核酸は、その核酸がＦＩＶ粒子により詰込まれ得ないならば（例えば
、もし該核酸がＦＩＶパッケージング部位を欠くならば）、たとえ該核酸が細胞
を形質導入し、形質転換するのに用い得るとしても、感染性ではない。同様に、
ＦＩＶ粒子により詰込まれたＦＩＶ−パッケージャブル核酸は、もしそれがパッ
ケージングされるＦＩＶ粒子をコードしていないならば、たとえそれが細胞を形
質導入し、形質転換するのに用い得るとしても、感染性ではない。ウイルスパッ
ケージング成分（例えば、ＧａｇおよびＥｎｖタンパク質）の完全セットをコー
ドしていないベクターは「パッケージング能欠損」である。これらのベクターは
該ベクターがパッケージング細胞中トランスに供給されたウイルスタンパク質に
よりパッケージングされる場合、「トランス救済可能」である。細胞培養物中Ｆ
ＩＶを感染させた細胞またはＦＩＶを感染させた生体を形質転換するために、も
しＦＩＶ−パッケージャブル核酸が用いられるならば、ＦＩＶ−パッケージャブ
ル核酸は複製され、感染性ＦＩＶウイルスと協力して生体中に拡散される。しか
し、ＦＩＶ−パッケージャブル核酸それ自体は「感染性」ではない、というのは
、パッケージング機能はトランス相補性を介して感染性ＦＩＶウイルスにより与
えられるからである。
【００４６】 細胞「上清」は細胞が増殖する培地である。該培地は細胞からの物質、例えば
、細胞膜から伸び出し、培地に侵入するＦＩＶウイルス粒子などを含むものであ
る。
、細胞膜から伸び出し、培地に侵入するＦＩＶウイルス粒子などを含むものであ
る。
【００４７】 （発明の詳細な議論） 非霊長類レンチウイルスクローンＣＦ１の、ヒトＨｅＬａ、２９３、および２
９３−Ｔ腎臓細胞へのリン酸カルシウム共沈法によるトランスフェクションは、
５０ないし数百個の核と高レベル（１００万ｃｐｍを超える）の上清逆転写酵素
とを含む、広く膨れた合胞体細胞（エンベロープを発現している細胞が他の細胞
と融合して生じる多核の巨大細胞）という驚くべき結果をもたらす。意外なこと
に、ＣＦ１の一過性のトランスフェクション（たとえば７５cm2フラスコにおい て１０μgのＣＦ１のトランスフェクションによる）の後、ヒト２９３および２ ９３−Ｔ細胞およびＨｅＬａの単層培養物は、９０ないし９５％が合胞体細胞に
よって再現可能に破壊されたが、しかし感染性があるかまたは複製可能なウイル
スは産生されなかった：ＣＦ１でトランスフェクトされた２９３−Ｔ細胞の大量
の上清を、新鮮な２９３または２９３−Ｔ細胞か、またはクランドール（Cranda
ll）ネコ腎臓細胞に移した結果は、なんら合胞体細胞またはＲＴの産生を生じな
かった。ＦＩＶエンベロープの欠失以外はＣＦ１と同等なＣＦ１Δｅｎｖは、合
胞体細胞を生じないが、高レベルの逆転写酵素およびベクターのパッケージング
に必要な高レベルのウイルス機能を産生する。このような前例のない結果は、も
しＦＩＶプロモーターがヒト細胞中で活性のあるプロモーターに置換されるなら
、調節のＲｅｖ／ＲＲＥ軸、Ｆ１Ｖｇａｇ／ｐｏｌ産生、およびエンベロープに
媒介される合胞体細胞を含め、タンパク質産生に必要とされるＦＩＶ等の非哺乳
類ベクターのすべての機能が、ヒト細胞において起こり得るだろうという新たな
洞察を生みだす。
９３−Ｔ腎臓細胞へのリン酸カルシウム共沈法によるトランスフェクションは、
５０ないし数百個の核と高レベル（１００万ｃｐｍを超える）の上清逆転写酵素
とを含む、広く膨れた合胞体細胞（エンベロープを発現している細胞が他の細胞
と融合して生じる多核の巨大細胞）という驚くべき結果をもたらす。意外なこと
に、ＣＦ１の一過性のトランスフェクション（たとえば７５cm2フラスコにおい て１０μgのＣＦ１のトランスフェクションによる）の後、ヒト２９３および２ ９３−Ｔ細胞およびＨｅＬａの単層培養物は、９０ないし９５％が合胞体細胞に
よって再現可能に破壊されたが、しかし感染性があるかまたは複製可能なウイル
スは産生されなかった：ＣＦ１でトランスフェクトされた２９３−Ｔ細胞の大量
の上清を、新鮮な２９３または２９３−Ｔ細胞か、またはクランドール（Cranda
ll）ネコ腎臓細胞に移した結果は、なんら合胞体細胞またはＲＴの産生を生じな
かった。ＦＩＶエンベロープの欠失以外はＣＦ１と同等なＣＦ１Δｅｎｖは、合
胞体細胞を生じないが、高レベルの逆転写酵素およびベクターのパッケージング
に必要な高レベルのウイルス機能を産生する。このような前例のない結果は、も
しＦＩＶプロモーターがヒト細胞中で活性のあるプロモーターに置換されるなら
、調節のＲｅｖ／ＲＲＥ軸、Ｆ１Ｖｇａｇ／ｐｏｌ産生、およびエンベロープに
媒介される合胞体細胞を含め、タンパク質産生に必要とされるＦＩＶ等の非哺乳
類ベクターのすべての機能が、ヒト細胞において起こり得るだろうという新たな
洞察を生みだす。
【００４８】 したがって本発明は、ヒト標的細胞の形質導入のための、ヒトのパッケージン
グ細胞においてパッケージングされた非哺乳類レンチウイルスベクターの初めて
の使用法を提供する。本発明より前には、このようなパッケージングシステムが
ヒト細胞において開発できるのか、パッケージングされた非哺乳類レンチウイル
スベクターがヒト細胞の形質導入に使用できるのか、またかかるベクターの調節
用の、プロセッシングならびにパッケージング成分がヒト細胞において活性を持
つことができるのかどうかを知る手だてがなかった。本発明のベクターならびに
パッケージング細胞において特に有用な、所望の配列または特定の構築物、たと
えば本文に記述したＦＩＶを主成分とするベクターならびにパッケージングシス
テムの配列ならびに構築については、何ら情報がなかった。ベクターにとっての
利点は、ベクターならびにパッケージングシステムが基盤としているウイルスに
、ヒトへの病原性がないこと、およびベクターが非分裂ヒト細胞を形質導入する
能力である。かかる非分裂細胞は、ヒト神経系、目、造血系、外皮、内分泌系、
胆肝道系、胃腸管、泌尿生殖路、骨、筋肉、心臓血管系、および呼吸系の細胞を
含むがこれらに限定されない。これらの細胞はすべて、本発明のベクターを用い
てインヴィトロならびにインヴィヴォにおいて形質導入される。このようなベク
ターはまた患者の、非ヒト細胞との接触を防ぎ、さらに既知の病原体由来のレン
チウイルス遺伝子またはレンチウイルスタンパク質との接触を防ぐ。
グ細胞においてパッケージングされた非哺乳類レンチウイルスベクターの初めて
の使用法を提供する。本発明より前には、このようなパッケージングシステムが
ヒト細胞において開発できるのか、パッケージングされた非哺乳類レンチウイル
スベクターがヒト細胞の形質導入に使用できるのか、またかかるベクターの調節
用の、プロセッシングならびにパッケージング成分がヒト細胞において活性を持
つことができるのかどうかを知る手だてがなかった。本発明のベクターならびに
パッケージング細胞において特に有用な、所望の配列または特定の構築物、たと
えば本文に記述したＦＩＶを主成分とするベクターならびにパッケージングシス
テムの配列ならびに構築については、何ら情報がなかった。ベクターにとっての
利点は、ベクターならびにパッケージングシステムが基盤としているウイルスに
、ヒトへの病原性がないこと、およびベクターが非分裂ヒト細胞を形質導入する
能力である。かかる非分裂細胞は、ヒト神経系、目、造血系、外皮、内分泌系、
胆肝道系、胃腸管、泌尿生殖路、骨、筋肉、心臓血管系、および呼吸系の細胞を
含むがこれらに限定されない。これらの細胞はすべて、本発明のベクターを用い
てインヴィトロならびにインヴィヴォにおいて形質導入される。このようなベク
ターはまた患者の、非ヒト細胞との接触を防ぎ、さらに既知の病原体由来のレン
チウイルス遺伝子またはレンチウイルスタンパク質との接触を防ぐ。
【００４９】 ヒト細胞におけるＦＩＶのライフサイクルのメカニズムは本文中に記述されて
いる。ここでは、パッケージングプラスミドにコードされたネコ免疫不全ウイル
ス（ＦＩＶ）タンパク質が、ＦＩＶゲノムの長い末端反復をヒトサイトメガロウ
イルスの急性期プロモーター（ＣＭＶプロモーター）等の異種的プロモーターで
置換することにより、ヒト細胞において、複製欠損様式にて高濃度に発現され、
さらにＦＩＶパッケージャブルベクターに対しトランスに供給されることを初め
て報告する。とくに、ＦＩＶ ＬＴＲのプロモーターエレメントを異種のpol II
プロモーターで置換することは、ヒト細胞における高濃度のＦＩＶタンパク質の
、トランスでの産生を可能にする。さらに、ＦＩＶの５プライムＵ３エレメント
を、異種的プロモーターをＲ反復に正確に融合することにより選択的に置換する
と、ネコ細胞においてのみ複製可能な野性型ＦＩＶが、ヒト細胞において高濃度
に産生される結果となった。三つのプラスミド、複製欠損、ｅｎｖ欠失、完全に
異種的のプロモーターによりプロモートされる、ＦＩＶベクターシステムが構築
され、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）−シュードタイプＦ
ＩＶ粒子を用いて、ヒトの分裂ならびに非分裂細胞が効率よく形質導入されるこ
とが発見された。ネコ細胞に対する形質導入には利点はなかった：ヒトならびに
ネコの多様な系統の分裂細胞においては、相対的な形質導入効率は、モロニーマ
ウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）を主成分とするベクターについてのものと
同様であった。この共通したＭ−ＭｕＬＶベクターとは全く対照的に、ＦＩＶベ
クターは末期的に分化したヒトマクロファージならびにニューロン（ｈＮＴニュ
ーロン）を含むヒトの非分裂細胞を効果的に形質導入した。ヒト細胞においてＦ
ＩＶの発現が可能である場合には、広大な合胞体細胞を形成する；この活性は、
合胞体細胞を誘導するＨＩＶ分離株のコリセプター、ＣＸＣＲ４／fusin３５の 発現を必要とする。ネコＣＲＦＫ細胞におけるヒトＣＸＣＲ４細胞の発現は、ウ
イルスの表現型を高度に合胞体細胞誘導性に変え、かつＦＩＶエンベロープをつ
けたベクターの侵入を媒介する。研究により、ヒト、齧歯類、およびネコの細胞
における合胞体細胞形成のため、ＦＩＶはヒトのＣＸＣＲ４相同物を利用するこ
とができること、さらにネコ細胞におけるウイルス侵入についてのコリセプター
の役割と一致することが示されている。
いる。ここでは、パッケージングプラスミドにコードされたネコ免疫不全ウイル
ス（ＦＩＶ）タンパク質が、ＦＩＶゲノムの長い末端反復をヒトサイトメガロウ
イルスの急性期プロモーター（ＣＭＶプロモーター）等の異種的プロモーターで
置換することにより、ヒト細胞において、複製欠損様式にて高濃度に発現され、
さらにＦＩＶパッケージャブルベクターに対しトランスに供給されることを初め
て報告する。とくに、ＦＩＶ ＬＴＲのプロモーターエレメントを異種のpol II
プロモーターで置換することは、ヒト細胞における高濃度のＦＩＶタンパク質の
、トランスでの産生を可能にする。さらに、ＦＩＶの５プライムＵ３エレメント
を、異種的プロモーターをＲ反復に正確に融合することにより選択的に置換する
と、ネコ細胞においてのみ複製可能な野性型ＦＩＶが、ヒト細胞において高濃度
に産生される結果となった。三つのプラスミド、複製欠損、ｅｎｖ欠失、完全に
異種的のプロモーターによりプロモートされる、ＦＩＶベクターシステムが構築
され、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）−シュードタイプＦ
ＩＶ粒子を用いて、ヒトの分裂ならびに非分裂細胞が効率よく形質導入されるこ
とが発見された。ネコ細胞に対する形質導入には利点はなかった：ヒトならびに
ネコの多様な系統の分裂細胞においては、相対的な形質導入効率は、モロニーマ
ウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）を主成分とするベクターについてのものと
同様であった。この共通したＭ−ＭｕＬＶベクターとは全く対照的に、ＦＩＶベ
クターは末期的に分化したヒトマクロファージならびにニューロン（ｈＮＴニュ
ーロン）を含むヒトの非分裂細胞を効果的に形質導入した。ヒト細胞においてＦ
ＩＶの発現が可能である場合には、広大な合胞体細胞を形成する；この活性は、
合胞体細胞を誘導するＨＩＶ分離株のコリセプター、ＣＸＣＲ４／fusin３５の 発現を必要とする。ネコＣＲＦＫ細胞におけるヒトＣＸＣＲ４細胞の発現は、ウ
イルスの表現型を高度に合胞体細胞誘導性に変え、かつＦＩＶエンベロープをつ
けたベクターの侵入を媒介する。研究により、ヒト、齧歯類、およびネコの細胞
における合胞体細胞形成のため、ＦＩＶはヒトのＣＸＣＲ４相同物を利用するこ
とができること、さらにネコ細胞におけるウイルス侵入についてのコリセプター
の役割と一致することが示されている。
【００５０】 ネコ免疫不全ウイルスは、ネコ細胞については複製可能であるがヒト細胞につい
てはそうではなく、前述のヒトサイトメガロウイルスの急性期プロモーター（Ｃ
ＭＶプロモーター）等の異種的プロモーターと、ＦＩＶのＲ反復のすぐ上流のＦ
ＩＶゲノムとの正確な融合により、ヒトおよびネコ細胞において高レベルに産生
される。一つの態様においては、融合はＴＡＴＡボックスにかけて正確に結合さ
れる（ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックが使用される；ＦＩＶ配列は、ＴＡ
ＴＡボックのすぐ下流のＳａｃＩ部位で始まる）。ｍＲＮＡの転写開始部位の空
間配置に対してＴＡＴＡボックスを保存するこの融合の詳細は、実施例に図解さ
れている。
てはそうではなく、前述のヒトサイトメガロウイルスの急性期プロモーター（Ｃ
ＭＶプロモーター）等の異種的プロモーターと、ＦＩＶのＲ反復のすぐ上流のＦ
ＩＶゲノムとの正確な融合により、ヒトおよびネコ細胞において高レベルに産生
される。一つの態様においては、融合はＴＡＴＡボックスにかけて正確に結合さ
れる（ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックが使用される；ＦＩＶ配列は、ＴＡ
ＴＡボックのすぐ下流のＳａｃＩ部位で始まる）。ｍＲＮＡの転写開始部位の空
間配置に対してＴＡＴＡボックスを保存するこの融合の詳細は、実施例に図解さ
れている。
【００５１】 ＦＩＶ由来のレトロウイルスベクターは、ＦＩＶベクターの５プライムＵ３エ
レメントが異種的プロモーターによって正確に置換されている同様の異種的プロ
モーターＲ反復融合物から高いレベルで任意に発現される。このようなＦＩＶベ
クターは、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）に
よるシュードタイプを含むがそれに限定されない異種のエンベロープを介し、ヒ
トの分裂中および増殖停止細胞の両者を含む非ネコ哺乳類細胞に、複製欠損様式
にて高い力価でデリバーされることが可能である；これは非哺乳類レンチウイル
スを用いたヒト細胞への遺伝子デリバリーの最初の証明である。
レメントが異種的プロモーターによって正確に置換されている同様の異種的プロ
モーターＲ反復融合物から高いレベルで任意に発現される。このようなＦＩＶベ
クターは、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）に
よるシュードタイプを含むがそれに限定されない異種のエンベロープを介し、ヒ
トの分裂中および増殖停止細胞の両者を含む非ネコ哺乳類細胞に、複製欠損様式
にて高い力価でデリバーされることが可能である；これは非哺乳類レンチウイル
スを用いたヒト細胞への遺伝子デリバリーの最初の証明である。
【００５２】 ＦＩＶタンパク質とＦＩＶベクターとの同時産生(co-production）の結果、ヒ
ト細胞ならびにネコ細胞に遺伝子をデリバーすることが可能な、高力価の複製欠
損レンチウイルスベクターが得られる。ヒト細胞について、１０7/mlを超えるＦ
ＩＶベクターの力価が達成され、入手可能な方法を用いた産生ならびに濃縮の改
善をもってより高い力価が達成される。したがって、本発明はヒトの遺伝子治療
への直接的な適応の可能性を有する。ヒト細胞において活性のある他のプロモー
ターもまた、いくつかの態様では有用であろう。
ト細胞ならびにネコ細胞に遺伝子をデリバーすることが可能な、高力価の複製欠
損レンチウイルスベクターが得られる。ヒト細胞について、１０7/mlを超えるＦ
ＩＶベクターの力価が達成され、入手可能な方法を用いた産生ならびに濃縮の改
善をもってより高い力価が達成される。したがって、本発明はヒトの遺伝子治療
への直接的な適応の可能性を有する。ヒト細胞において活性のある他のプロモー
ターもまた、いくつかの態様では有用であろう。
【００５３】 本発明はいくつかの安全上の利点を具現化している。本発明の一つの重要な安
全上の利点は、ヒト細胞においては完全に複製欠損性のベクターの産生である。
ネイティブなＦＩＶプロモーター（ＬＴＲ）は、ヒト細胞においては不活性かま
たは最小限の活性を有する。事実、本文において実施されたようなｈＣＭＶＩＥ
プロモーターは、ネコならびにヒト細胞においてＦＩＶ ＬＴＲよりも高い発現 を可能にする。ネコの産生細胞においては、ネイティブなＦＩＶ ＬＴＲが発現 を誘導するべく（ＭｏＭＬＶを主成分とするシステムにおいて、モロニーマウス
白血病（ＭｏＭＬＶ）ウイルスプロモーターを使用することに類似して）用いら
れるが、かかる使用は避けられることが好ましい明確な安全上の問題を呈示する
。ネコ細胞は、ヒト細胞において複製する複製可能なＣ型内在レトロウイルス（
ＲＤ１１４）を含むことがある。ヒト細胞よりも科学的な研究を受けていないネ
コ細胞は、潜在的に病原性のある他の未知の感染性因子を含む可能性もある。Ｒ
Ｄ１１４は、初めネコ胎児において継代されたヒト横紋筋肉腫細胞から単離され
た。複製可能ＲＤ１１４もまた、ヒトと他の非ネコ細胞との同時培養により、培
養されたネコ細胞系から単離されている。さらに、ＲＤ１４４は核酸配列のレベ
ルにおいて霊長類レトロウイルス（ヒヒの内在性ウイルスまたはＢａＥＶ）に著
しい関連性がある。この事実は、ヒト細胞系において証明された複製コンピテン
スに加えて、ヒトへの種を超えた伝染についての明らかな可能性を示唆している
。異物移植か、または動物の細胞または組織由来の生体材料との接触を介しての
、ＲＤ１１４等の内在性ウイルスまたは他のウイルスのヒトへの伝染の危険性は
、最近大きな懸念を生みだしている。たとえばブタは、ＲＤ１１４と同様にヒト
細胞において複製することができる内在性レトロウイルスを潜伏させることが示
されている。この発見は現在この分野の専門家により、動物の臓器をヒトへ異物
移植すること、あるいは動物由来の滅菌可能ではない生体物質を治療を目的とし
て使用することの安全性について、重大な疑問を掲げるべく検討されている。し
たがって、ヒトまたは齧歯類の細胞系よりはるかに少ししか特徴づけられていな
いネコまたは有蹄類の細胞系に由来するベクターにヒトを接触させることは問題
となるであろう。本発明のベクターのキメラ状の設計は、２９３Ｔ細胞等のよく
明らかにされたヒトの産生細胞系における産生を完全に可能にする。安全上の利
点は、産生のいかなる段階においてもネコの細胞または組織との接触が避けられ
ることである。したがって、細胞またはベクターを患者へ導入することを含む適
用には、ヒトのパッケージング細胞においてパッケージングされたベクターを用
いることが好ましい。
全上の利点は、ヒト細胞においては完全に複製欠損性のベクターの産生である。
ネイティブなＦＩＶプロモーター（ＬＴＲ）は、ヒト細胞においては不活性かま
たは最小限の活性を有する。事実、本文において実施されたようなｈＣＭＶＩＥ
プロモーターは、ネコならびにヒト細胞においてＦＩＶ ＬＴＲよりも高い発現 を可能にする。ネコの産生細胞においては、ネイティブなＦＩＶ ＬＴＲが発現 を誘導するべく（ＭｏＭＬＶを主成分とするシステムにおいて、モロニーマウス
白血病（ＭｏＭＬＶ）ウイルスプロモーターを使用することに類似して）用いら
れるが、かかる使用は避けられることが好ましい明確な安全上の問題を呈示する
。ネコ細胞は、ヒト細胞において複製する複製可能なＣ型内在レトロウイルス（
ＲＤ１１４）を含むことがある。ヒト細胞よりも科学的な研究を受けていないネ
コ細胞は、潜在的に病原性のある他の未知の感染性因子を含む可能性もある。Ｒ
Ｄ１１４は、初めネコ胎児において継代されたヒト横紋筋肉腫細胞から単離され
た。複製可能ＲＤ１１４もまた、ヒトと他の非ネコ細胞との同時培養により、培
養されたネコ細胞系から単離されている。さらに、ＲＤ１４４は核酸配列のレベ
ルにおいて霊長類レトロウイルス（ヒヒの内在性ウイルスまたはＢａＥＶ）に著
しい関連性がある。この事実は、ヒト細胞系において証明された複製コンピテン
スに加えて、ヒトへの種を超えた伝染についての明らかな可能性を示唆している
。異物移植か、または動物の細胞または組織由来の生体材料との接触を介しての
、ＲＤ１１４等の内在性ウイルスまたは他のウイルスのヒトへの伝染の危険性は
、最近大きな懸念を生みだしている。たとえばブタは、ＲＤ１１４と同様にヒト
細胞において複製することができる内在性レトロウイルスを潜伏させることが示
されている。この発見は現在この分野の専門家により、動物の臓器をヒトへ異物
移植すること、あるいは動物由来の滅菌可能ではない生体物質を治療を目的とし
て使用することの安全性について、重大な疑問を掲げるべく検討されている。し
たがって、ヒトまたは齧歯類の細胞系よりはるかに少ししか特徴づけられていな
いネコまたは有蹄類の細胞系に由来するベクターにヒトを接触させることは問題
となるであろう。本発明のベクターのキメラ状の設計は、２９３Ｔ細胞等のよく
明らかにされたヒトの産生細胞系における産生を完全に可能にする。安全上の利
点は、産生のいかなる段階においてもネコの細胞または組織との接触が避けられ
ることである。したがって、細胞またはベクターを患者へ導入することを含む適
用には、ヒトのパッケージング細胞においてパッケージングされたベクターを用
いることが好ましい。
【００５４】 すべての態様において、このシステムはＨＩＶを主成分とするレンチウイルス
ベクターに比べて有意な安全上の利点があるが、それは前文に記したように、Ｆ
ＩＶにはヒトへの伝染性もヒトにおける病原性もないからである。本発明はした
がって、ＦＩＶにはヒトにおける病原性の証拠が何もないというよく証明された
事実を利用する。本発明の実用への適用の可能性もまた、ヒトにおける親和性ま
たは病原性の欠如が他のいかなる非霊長類レンチウイルス（これらはＶｉｓｎａ
／Ｍａｅｄｉ、ＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、およびＢＩＶを含む）よりもＦＩＶについ
てよく立証されているという事実から利益を得ているが、それは自然界でＦＩＶ
が野性および飼育ネコの両者の間で主に伝染されるのと同一の手段、すなわちネ
コがかむことにより、毎年何千人ものヒトが接触しているからである。
ベクターに比べて有意な安全上の利点があるが、それは前文に記したように、Ｆ
ＩＶにはヒトへの伝染性もヒトにおける病原性もないからである。本発明はした
がって、ＦＩＶにはヒトにおける病原性の証拠が何もないというよく証明された
事実を利用する。本発明の実用への適用の可能性もまた、ヒトにおける親和性ま
たは病原性の欠如が他のいかなる非霊長類レンチウイルス（これらはＶｉｓｎａ
／Ｍａｅｄｉ、ＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、およびＢＩＶを含む）よりもＦＩＶについ
てよく立証されているという事実から利益を得ているが、それは自然界でＦＩＶ
が野性および飼育ネコの両者の間で主に伝染されるのと同一の手段、すなわちネ
コがかむことにより、毎年何千人ものヒトが接触しているからである。
【００５５】 すべてのレンチウイルスは、もっぱら体液の交換により伝染する。ＨＩＶは主
として性交渉により伝染する；自然界でＦＩＶが性交渉により伝染するという証
拠はほとんどない；そのかわりに、ネコがかむこと（これにはヒトもまた普通に
接触しているが）が主たる機構である。これらの動物はなわばりをもち、オスは
特になわばりおよび優位性をめぐってしばしば戦いを交えるため、かみ傷はネコ
の間では日常的なものである；したがってＦＩＶ感染はメスネコよりもオスネコ
において、より一般的である。
として性交渉により伝染する；自然界でＦＩＶが性交渉により伝染するという証
拠はほとんどない；そのかわりに、ネコがかむこと（これにはヒトもまた普通に
接触しているが）が主たる機構である。これらの動物はなわばりをもち、オスは
特になわばりおよび優位性をめぐってしばしば戦いを交えるため、かみ傷はネコ
の間では日常的なものである；したがってＦＩＶ感染はメスネコよりもオスネコ
において、より一般的である。
【００５６】 要約すると、ネコ科以外の動物についてはＦＩＶ感染の証拠はない：この限定
された親和性はすべての既知のレンチウイルスの性質である。かむことは、ネコ
間でのＦＩＶの蔓延の自然の手段であり、ネコがかむことによるヒトへのＦＩＶ
の頻繁な接触にもかかわらず、このもっともらしく効率的な接種手段は、結果的
に何らヒトのセロコンバージョンまたはヒトの感染についての他の検出可能な証
拠を生じない。非霊長類レンチウイルスの中では、それゆえヒトへの病原性に対
する疫学的証拠はＦＩＶについてはなくてはならないものである。
された親和性はすべての既知のレンチウイルスの性質である。かむことは、ネコ
間でのＦＩＶの蔓延の自然の手段であり、ネコがかむことによるヒトへのＦＩＶ
の頻繁な接触にもかかわらず、このもっともらしく効率的な接種手段は、結果的
に何らヒトのセロコンバージョンまたはヒトの感染についての他の検出可能な証
拠を生じない。非霊長類レンチウイルスの中では、それゆえヒトへの病原性に対
する疫学的証拠はＦＩＶについてはなくてはならないものである。
【００５７】 ＦＩＶはバイオセイフティーレベル-２（ＢＬ−２）での実施を利用して日常 的に作業されるため、ベクターはＢＬ−２施設を用いて日常的に作業することが
可能であり、その開発ならびに製造にかかわる人々に生じる危険度はＨＩＶベク
ターに比較してより少なく、また製造の容易性ならびに便利性は亢進される。
可能であり、その開発ならびに製造にかかわる人々に生じる危険度はＨＩＶベク
ターに比較してより少なく、また製造の容易性ならびに便利性は亢進される。
【００５８】 細胞への遺伝子導入ならびに遺伝子治療に、非哺乳類レンチウイルスを用いる
ことに固有の、安全上の利点に加えて、ＦＩＶの分子クローン（３４ＴＦ１０）
からの本発明に記述されている好ましいシステムは、重要なＦＩＶ遺伝子（ＯＲ
Ｆ２）が欠損しており、したがって弱毒化ウイルスである。３４ＴＦ１０は接着
性のネコ細胞系では複製するが、リンパ球においては複製しない；ネコリンパ球
における複製コンピテンスはＯＲＦ２にマップされている。さらに、ＯＲＦ２マ
イナスのウイルスは向神経性である。もしある細胞型にデリバリーが必要とされ
れば、ＯＲＦ２は修復されることが可能である。さらに、他の態様においては、
ＦＩＶの他の株または分子クローンが同様の様式で用いられているが、それは本
発明がヒト細胞の形質導入に対するそれらの適用の可能性を明らかにしているか
らである。
ことに固有の、安全上の利点に加えて、ＦＩＶの分子クローン（３４ＴＦ１０）
からの本発明に記述されている好ましいシステムは、重要なＦＩＶ遺伝子（ＯＲ
Ｆ２）が欠損しており、したがって弱毒化ウイルスである。３４ＴＦ１０は接着
性のネコ細胞系では複製するが、リンパ球においては複製しない；ネコリンパ球
における複製コンピテンスはＯＲＦ２にマップされている。さらに、ＯＲＦ２マ
イナスのウイルスは向神経性である。もしある細胞型にデリバリーが必要とされ
れば、ＯＲＦ２は修復されることが可能である。さらに、他の態様においては、
ＦＩＶの他の株または分子クローンが同様の様式で用いられているが、それは本
発明がヒト細胞の形質導入に対するそれらの適用の可能性を明らかにしているか
らである。
【００５９】 本文の一つの実施例においては異種的プロモーターをＦＩＶ配列に融合させる
キメラ構築物が用いられているが、融合部は転写の開始部位に局在しているため
、ＦＩＶ配列のみが転写される（すなわち、ＦＩＶプロモーター配列のみがこの
システムによって生じるｍＲＮＡ中に現われる；異種的プロモーター配列は転写
されない）。したがって、ＲＮＡレベルの組換えによって生じる複製可能キメラ
ウイルスの可能性は減じられる。
キメラ構築物が用いられているが、融合部は転写の開始部位に局在しているため
、ＦＩＶ配列のみが転写される（すなわち、ＦＩＶプロモーター配列のみがこの
システムによって生じるｍＲＮＡ中に現われる；異種的プロモーター配列は転写
されない）。したがって、ＲＮＡレベルの組換えによって生じる複製可能キメラ
ウイルスの可能性は減じられる。
【００６０】 さらに、系統発生学的にＨＩＶから遠いこのレンチウイルスが、この発明にお
いて、ヒト細胞の形質導入に適応可能であることが今示されていることから、他
の非霊長類、とくに有蹄類レンチウイルスが同様に利用可能であることは今や明
らかである。
いて、ヒト細胞の形質導入に適応可能であることが今示されていることから、他
の非霊長類、とくに有蹄類レンチウイルスが同様に利用可能であることは今や明
らかである。
【００６１】 パッケージングプラスミドからの発現を巧みに工作することにより、ベクター
とエンベロープ発現プラスミドとが同一のヒトプロモーターから発生し、タンパ
ク質発現の同調した発現（すなわち時間的な調和）が促進される。
とエンベロープ発現プラスミドとが同一のヒトプロモーターから発生し、タンパ
ク質発現の同調した発現（すなわち時間的な調和）が促進される。
【００６２】 （パッケージングプラスミドおよびパッケージャブル核酸の作成） 本発明は、前述の通り、種々のパッケージングプラスミドおよびパッケージャ
ブル核酸を提供する。パッケージングプラスミドは非霊長類レンチウイルス由来
の核酸、とくにＦＩＶならびに有蹄類レンチウイルスに由来するものを含む。パ
ッケージャブルベクターは、レンチウイルスのパッケージング部位（たとえばＦ
ＩＶまたは有蹄類由来）と、任意に他の非霊長類レンチウイルス核酸か、または
異種の核酸を含むＲＮＡをコードしている。
ブル核酸を提供する。パッケージングプラスミドは非霊長類レンチウイルス由来
の核酸、とくにＦＩＶならびに有蹄類レンチウイルスに由来するものを含む。パ
ッケージャブルベクターは、レンチウイルスのパッケージング部位（たとえばＦ
ＩＶまたは有蹄類由来）と、任意に他の非霊長類レンチウイルス核酸か、または
異種の核酸を含むＲＮＡをコードしている。
【００６３】 本発明のパッケージャブルベクターおよびパッケージングプラスミドは、レン
チウイルスクローンから由来したものである。かかるクローンの多くは熟練者に
は周知であり、一般に市販されている。よく確立された配列情報の貯蔵所は、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、およびＮＣＢＩを含む。よく特徴づけられ
たＨＩＶクローンは：ＨＩＶ−１NL43、ＨＩＶ−１SF2、ＨＩＶ−１BRU、ＨＩＶ
−１MNを含む。
チウイルスクローンから由来したものである。かかるクローンの多くは熟練者に
は周知であり、一般に市販されている。よく確立された配列情報の貯蔵所は、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、およびＮＣＢＩを含む。よく特徴づけられ
たＨＩＶクローンは：ＨＩＶ−１NL43、ＨＩＶ−１SF2、ＨＩＶ−１BRU、ＨＩＶ
−１MNを含む。
【００６４】 さらに、ウイルスクローンは野性型ウイルスから既知の技術を用いて単離する
ことができる。典型的には、完全長のレンチウイルスのプロウイルスを含んでい
るラムダファージクローンは、血清陽性動物の末梢血単核細胞から単離されたウ
イルス株に感染された細胞系の、ゲノムＤＮＡから得られる。このウイルスはイ
ンヴィトロにおいて複製可能であって、個体からの標的細胞（たとえばＣＤ４+ 細胞）に直接トランスフェクトした後、感染性の子孫ウイルス粒子を産生する。
一般には、完全なビルレントなゲノムが、パッケージングプラスミドを作成する
べく用いられる。ＦＩＶパッケージングベクターに関して「完全長のＦＩＶゲノ
ム」は、ＦＩＶウイルスまたはウイルスクローン（たとえばＤＮＡファージ）に
よりコード化されている核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）からなり、５'および３'Ｌ
ＴＲ領域と、ＬＴＲ領域の間の、典型的な対応ウイルスに存在する遺伝子とを含
む。ＦＩＶについては、これらの遺伝子は：ｇａｇ−ｐｏｌ、ｅｎｖ、およびｏ
ｒｆ−２を含み、またさらにいくつかのまだ特徴づけされていない読み枠が、特
にｅｎｖに存在する。
ことができる。典型的には、完全長のレンチウイルスのプロウイルスを含んでい
るラムダファージクローンは、血清陽性動物の末梢血単核細胞から単離されたウ
イルス株に感染された細胞系の、ゲノムＤＮＡから得られる。このウイルスはイ
ンヴィトロにおいて複製可能であって、個体からの標的細胞（たとえばＣＤ４+ 細胞）に直接トランスフェクトした後、感染性の子孫ウイルス粒子を産生する。
一般には、完全なビルレントなゲノムが、パッケージングプラスミドを作成する
べく用いられる。ＦＩＶパッケージングベクターに関して「完全長のＦＩＶゲノ
ム」は、ＦＩＶウイルスまたはウイルスクローン（たとえばＤＮＡファージ）に
よりコード化されている核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）からなり、５'および３'Ｌ
ＴＲ領域と、ＬＴＲ領域の間の、典型的な対応ウイルスに存在する遺伝子とを含
む。ＦＩＶについては、これらの遺伝子は：ｇａｇ−ｐｏｌ、ｅｎｖ、およびｏ
ｒｆ−２を含み、またさらにいくつかのまだ特徴づけされていない読み枠が、特
にｅｎｖに存在する。
【００６５】 パッケージングプラスミドは完全長のゲノムからパッケージング部位を欠失す
ることにより作られ、クローンにウイルスタンパク質の産生を可能にするが、ウ
イルスＲＮＡが自らパッケージングできないようにする。ＦＩＶパッケージング
部位のＲＮＡの二次構造は、ＭＳＤとｇａｇ−ｐｏｌとの間の領域を含むらしい
；適切なパッケージングには、さらに他の領域が重要であるのかもしれない。パ
ッケージング部位の精密な特性は、欠失分析を行なうことにより決定することが
できる。
ることにより作られ、クローンにウイルスタンパク質の産生を可能にするが、ウ
イルスＲＮＡが自らパッケージングできないようにする。ＦＩＶパッケージング
部位のＲＮＡの二次構造は、ＭＳＤとｇａｇ−ｐｏｌとの間の領域を含むらしい
；適切なパッケージングには、さらに他の領域が重要であるのかもしれない。パ
ッケージング部位の精密な特性は、欠失分析を行なうことにより決定することが
できる。
【００６６】 パッケージングプラスミドにおいては、全ｐｓｉ部位（パッケージング部位）
が欠失されていることが好ましいが、パッケージングを阻害するために十分な部
位を欠失または突然変異させる、いかなる突然変異または欠失でも十分である。
このことは、典型的には主要スプライスドナー部位（「ＭＳＤ］）とｇａｇ遺伝
子の始めの部分との間の領域に実質的な欠失を生じる結果となるが、他の領域も
同様に含んでもよい。コード化されたウイルスタンパク質のウイルスによる発現
を支持するプロモーターエレメントの欠失や、異種的プロモーターの取り込みは
望ましい。とくに、ヒトのプロモーター（すなわちヒト細胞において活性があり
、典型的には、しかし必ずではないが、ヒト由来であるか、またはヒトにおいて
活性があるウイルス等のヒト病原体に由来する）の取り込みは好ましい。
が欠失されていることが好ましいが、パッケージングを阻害するために十分な部
位を欠失または突然変異させる、いかなる突然変異または欠失でも十分である。
このことは、典型的には主要スプライスドナー部位（「ＭＳＤ］）とｇａｇ遺伝
子の始めの部分との間の領域に実質的な欠失を生じる結果となるが、他の領域も
同様に含んでもよい。コード化されたウイルスタンパク質のウイルスによる発現
を支持するプロモーターエレメントの欠失や、異種的プロモーターの取り込みは
望ましい。とくに、ヒトのプロモーター（すなわちヒト細胞において活性があり
、典型的には、しかし必ずではないが、ヒト由来であるか、またはヒトにおいて
活性があるウイルス等のヒト病原体に由来する）の取り込みは好ましい。
【００６７】 結果として得られる本発明のパッケージングプラスミドは、この欠失クローン
をパッケージング細胞（典型的には２９３等のヒト細胞か、またはいかなる不要
成分も含まない他のよく特徴づけされた細胞）に形質導入すること、およびこの
プラスミドを発現させることにより、ウイルス粒子を作成するべく用いられる。
このプラスミドはレンチウイルスのパッケージング部位を欠くため、ウイルス粒
子内にはパッケージングされない。
をパッケージング細胞（典型的には２９３等のヒト細胞か、またはいかなる不要
成分も含まない他のよく特徴づけされた細胞）に形質導入すること、およびこの
プラスミドを発現させることにより、ウイルス粒子を作成するべく用いられる。
このプラスミドはレンチウイルスのパッケージング部位を欠くため、ウイルス粒
子内にはパッケージングされない。
【００６８】 形質導入されたパッケージング細胞の安全性を増すためには、パッケージング
プラスミド（または相同なクローン）を相補機能のある多数のパッケージングプ
ラスミドに切断（たとえばサブクローニングにより）することが好ましい。この
ことは、組換えの結果として感染性の粒子を産みだすことになる機会を減少させ
る。
プラスミド（または相同なクローン）を相補機能のある多数のパッケージングプ
ラスミドに切断（たとえばサブクローニングにより）することが好ましい。この
ことは、組換えの結果として感染性の粒子を産みだすことになる機会を減少させ
る。
【００６９】 パッケージング可能な核酸は、ＦＩＶ粒子によりパッケージングされることが
できるＲＮＡをコード化している。かかる核酸は、ＦＩＶパッケージング部位を
、選択した核酸と組換え結合することにより構築することができる。パッケージ
ング部位（ｐｓｉ部位）は５'ＬＴＲに隣接して局在しており、主としてＭＳＤ 部位と、ｇａｇ遺伝子のリーダー配列のｇａｇ開始コドン（ＡＵＧ）との間であ
る。したがって、最小のパッケージング部位はＭＳＤと、関連するレンチウイル
スからのｇａｇ開始コドンとの間の核酸の大部分を含む。好ましくは完全なパッ
ケージング部位は、最大のパッケージング効率のために５'ＬＴＲからの配列と ｇａｇ遺伝子の５'領域とを含む。このようなパッケージング配列は、典型的に はｇａｇ遺伝子、たとえばｇａｇをコードしている領域に約１００塩基またはそ
れ以上延ばした部分と、ＦＩＶ５'ＬＴＲに約１００塩基またはそれ以上延ばし た部分とを含む。さらに、ｅｎｖ遺伝子からの配列が任意にパッケージング部位
、特にＲＲＥに含まれる。
できるＲＮＡをコード化している。かかる核酸は、ＦＩＶパッケージング部位を
、選択した核酸と組換え結合することにより構築することができる。パッケージ
ング部位（ｐｓｉ部位）は５'ＬＴＲに隣接して局在しており、主としてＭＳＤ 部位と、ｇａｇ遺伝子のリーダー配列のｇａｇ開始コドン（ＡＵＧ）との間であ
る。したがって、最小のパッケージング部位はＭＳＤと、関連するレンチウイル
スからのｇａｇ開始コドンとの間の核酸の大部分を含む。好ましくは完全なパッ
ケージング部位は、最大のパッケージング効率のために５'ＬＴＲからの配列と ｇａｇ遺伝子の５'領域とを含む。このようなパッケージング配列は、典型的に はｇａｇ遺伝子、たとえばｇａｇをコードしている領域に約１００塩基またはそ
れ以上延ばした部分と、ＦＩＶ５'ＬＴＲに約１００塩基またはそれ以上延ばし た部分とを含む。さらに、ｅｎｖ遺伝子からの配列が任意にパッケージング部位
、特にＲＲＥに含まれる。
【００７０】 本発明のパッケージングプラスミドと標的のパッケージング可能なベクター核
酸とを作成するための戦略が与えられれば、熟練者は機能的に同等な核酸を含む
種々のクローンを構築することができる。これらの目的を達成するためのクロー
ニングの方法論と、核酸の配列を確認するための配列法とはこの技術では周知で
ある。適切なクローニングならびに配列技術の実例および、数多くのクローニン
グ実習を通して熟練者を指導するのに十分な指示は、Berger および Kimmel, Gu
ide to Molecular Cloning Techniques, Method in Enzymology 152巻、アカデ ミック・プレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州（Berger）；Sambrook 等 、（1989）Molecular Cloning - A Laboratory Manual（第２版）１-３巻、コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー出版、ニュ
ーヨーク州、（Sambrook）；およびCurrent Protocols in Molecular Biology、
F. M. Ausubel 等共編、Current Protocols, グリーンパブリッシングアソシエ ーツ社（Greene Publishing Associates, Inc.）とジョンウィリー＆サンズ社（
John Wiley & Sons, Inc）との合弁企業、(1994年増刊）(Ausubel）、に見られ る。生物学的試薬および実験器材の製造業者からの製品情報もまた、既知の生物
学的手法に有用な情報を提供する。かかる製造業者は、シグマ化学社（セントル
イス、ミズーリ州）、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ州）、ファル
マシアＬＫＢバイオケミストリー（ピスカタウェイ(Piscataway)、ニュージャー
ジー州）、クロンテックラボラトリーズ社（パロウアルトウ、カリフォルニア州
）、ケムジーンズコープ（Chem. Genes Corp.）、オールドリッチケミカルカン パニー（Aldrich Chemical Company) （ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、
グレンリサーチ社（Glen Research, Inc）、ギブコBRLライフテクノロジーズ社 （GIBCO BRL Life Technologies, Inc.）（ガイザースバーグ（Gaithersberg)、
メリーランド州）、フルカケミカ-ビオケミカアナリティカ（Fluka Chemica-Bio
chemika Analytika（Fluka Chemie AG、ブックス（Buchs)、スイス）、インヴィ
トロジェン（Invitrogen)、サンディエゴ、カリフォルニア州、およびアプライ ドバイオシステムズ（Applied Biosystems )（フォスターシティー、カリフォル
ニア州）、ならびに熟練者に周知の他の多くの商業用の供給源を含む。
酸とを作成するための戦略が与えられれば、熟練者は機能的に同等な核酸を含む
種々のクローンを構築することができる。これらの目的を達成するためのクロー
ニングの方法論と、核酸の配列を確認するための配列法とはこの技術では周知で
ある。適切なクローニングならびに配列技術の実例および、数多くのクローニン
グ実習を通して熟練者を指導するのに十分な指示は、Berger および Kimmel, Gu
ide to Molecular Cloning Techniques, Method in Enzymology 152巻、アカデ ミック・プレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州（Berger）；Sambrook 等 、（1989）Molecular Cloning - A Laboratory Manual（第２版）１-３巻、コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー出版、ニュ
ーヨーク州、（Sambrook）；およびCurrent Protocols in Molecular Biology、
F. M. Ausubel 等共編、Current Protocols, グリーンパブリッシングアソシエ ーツ社（Greene Publishing Associates, Inc.）とジョンウィリー＆サンズ社（
John Wiley & Sons, Inc）との合弁企業、(1994年増刊）(Ausubel）、に見られ る。生物学的試薬および実験器材の製造業者からの製品情報もまた、既知の生物
学的手法に有用な情報を提供する。かかる製造業者は、シグマ化学社（セントル
イス、ミズーリ州）、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ州）、ファル
マシアＬＫＢバイオケミストリー（ピスカタウェイ(Piscataway)、ニュージャー
ジー州）、クロンテックラボラトリーズ社（パロウアルトウ、カリフォルニア州
）、ケムジーンズコープ（Chem. Genes Corp.）、オールドリッチケミカルカン パニー（Aldrich Chemical Company) （ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、
グレンリサーチ社（Glen Research, Inc）、ギブコBRLライフテクノロジーズ社 （GIBCO BRL Life Technologies, Inc.）（ガイザースバーグ（Gaithersberg)、
メリーランド州）、フルカケミカ-ビオケミカアナリティカ（Fluka Chemica-Bio
chemika Analytika（Fluka Chemie AG、ブックス（Buchs)、スイス）、インヴィ
トロジェン（Invitrogen)、サンディエゴ、カリフォルニア州、およびアプライ ドバイオシステムズ（Applied Biosystems )（フォスターシティー、カリフォル
ニア州）、ならびに熟練者に周知の他の多くの商業用の供給源を含む。
【００７１】 本発明の核酸組成物は、ＲＮＡであれ、ｃＤＮＡであれ、ゲノムＤＮＡであれ
、あるいは種々の組み合わせによるハイブリッドであれ、生体供給源から単離さ
れるか、またはインヴィトロにおいて合成される。本発明の核酸は、トランスフ
ォームまたはトランスフェクトされた全細胞中か、トランスフォームまたはトラ
ンスフェクトされた細胞溶解物中に存在するか、または部分的に精製されたかま
たは実質的に純粋な形で存在する。
、あるいは種々の組み合わせによるハイブリッドであれ、生体供給源から単離さ
れるか、またはインヴィトロにおいて合成される。本発明の核酸は、トランスフ
ォームまたはトランスフェクトされた全細胞中か、トランスフォームまたはトラ
ンスフェクトされた細胞溶解物中に存在するか、または部分的に精製されたかま
たは実質的に純粋な形で存在する。
【００７２】 分子プローブとして用いるための配列の増幅に、あるいは次に続くサブクロー
ニングのための核酸フラグメントの生成に適した、インヴィトロの増幅技術につ
いては周知である。かかるインヴィトロの増幅法を通して熟練者を指示するのに
十分な技術の実例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） リガーゼ連鎖反応（Ｌ ＣＲ）、Qβ-レプリカーゼ増幅、および他のＲＮＡポリメラーゼを介する技術（
たとえばＮＡＳＢＡ）を含み、Berger、Sambrook、およびAusubelならびに、Mul
lis等（1987）の米国特許第4,683,202号；PCR Protocols A Guide to Methods a
nd Applications（Innis等編）アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォ
ルニア州（1990）(Innis）;Arnheim および Levinson（1990年10月１日）C& EN
36 - 47；The Journal Of NIH Research（1991）3, 81 - 94；（Kwoh 等（1989 ）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173；Guatelli 等（1990） Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 87, 1874；Lomell 等（1989）J. Clin. Chem 35, 1826；Landegr
en 等,（1988）Science 241, 1077 - 1080；Van Brunt（1990）Biochemistry 8,
291 - 294；Wu および Wallace,（1989）Gene 4, 560；Barringer 等（1990）G
ene 89, 117、およびSooknanan および Malek（1995）Biotechnology 13 : 563
- 564に見られる。増幅された核酸のインビトロにおける改良されたクローニン グ法は、Wallace等の米国特許第5,426,039号に記述されている。
ニングのための核酸フラグメントの生成に適した、インヴィトロの増幅技術につ
いては周知である。かかるインヴィトロの増幅法を通して熟練者を指示するのに
十分な技術の実例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） リガーゼ連鎖反応（Ｌ ＣＲ）、Qβ-レプリカーゼ増幅、および他のＲＮＡポリメラーゼを介する技術（
たとえばＮＡＳＢＡ）を含み、Berger、Sambrook、およびAusubelならびに、Mul
lis等（1987）の米国特許第4,683,202号；PCR Protocols A Guide to Methods a
nd Applications（Innis等編）アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォ
ルニア州（1990）(Innis）;Arnheim および Levinson（1990年10月１日）C& EN
36 - 47；The Journal Of NIH Research（1991）3, 81 - 94；（Kwoh 等（1989 ）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173；Guatelli 等（1990） Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 87, 1874；Lomell 等（1989）J. Clin. Chem 35, 1826；Landegr
en 等,（1988）Science 241, 1077 - 1080；Van Brunt（1990）Biochemistry 8,
291 - 294；Wu および Wallace,（1989）Gene 4, 560；Barringer 等（1990）G
ene 89, 117、およびSooknanan および Malek（1995）Biotechnology 13 : 563
- 564に見られる。増幅された核酸のインビトロにおける改良されたクローニン グ法は、Wallace等の米国特許第5,426,039号に記述されている。
【００７３】 たとえばインヴィトロの増幅法においてプローブとして使用するための、また
は遺伝子プローブとして、あるいは阻害成分（たとえばリボザイム）として使用
するためのオリゴヌクレオチドは、典型的にはBeaucageおよび Caruthers（1981
), Tetrahedron Letts., 22 (20) : 1859 - 1862に記述されている固相ホスホロ
アミダイトトリエステル法により、たとえばNeedham - VanDevanter 等（1984）
Nucleic Acid Res., 12 : 6159 - 6168に述べられているような自動合成装置を 用いて化学的に合成される。オリゴヌクレオチドはまた熟練者には周知の種々の
商業的な供給源に誂えて作らせ、取り寄せることも可能である。オリゴヌクレオ
チドの精製は、必要な場合には、典型的にはPersonおよび Regnier（1983）J. C
hrom. 255 : 137 - 149に記述されているように、未変性のアクリルアミドゲル 電気泳動法かまたは陰イオン交換ＨＰＬＣのいずれかにより行なわれる。合成オ
リゴヌクレオチドの配列は、Grossman & Moldave(共編)アカデミックプレス、ニ
ューヨーク、Methods in Enzymology 65 : 499 - 560のMaxam およびGilbert（1
980）による化学的分解法を用いて確認することができる。
は遺伝子プローブとして、あるいは阻害成分（たとえばリボザイム）として使用
するためのオリゴヌクレオチドは、典型的にはBeaucageおよび Caruthers（1981
), Tetrahedron Letts., 22 (20) : 1859 - 1862に記述されている固相ホスホロ
アミダイトトリエステル法により、たとえばNeedham - VanDevanter 等（1984）
Nucleic Acid Res., 12 : 6159 - 6168に述べられているような自動合成装置を 用いて化学的に合成される。オリゴヌクレオチドはまた熟練者には周知の種々の
商業的な供給源に誂えて作らせ、取り寄せることも可能である。オリゴヌクレオ
チドの精製は、必要な場合には、典型的にはPersonおよび Regnier（1983）J. C
hrom. 255 : 137 - 149に記述されているように、未変性のアクリルアミドゲル 電気泳動法かまたは陰イオン交換ＨＰＬＣのいずれかにより行なわれる。合成オ
リゴヌクレオチドの配列は、Grossman & Moldave(共編)アカデミックプレス、ニ
ューヨーク、Methods in Enzymology 65 : 499 - 560のMaxam およびGilbert（1
980）による化学的分解法を用いて確認することができる。
【００７４】 （保存的置換の作成） 熟練者には、開示された核酸構築物の数多の保存性の変異が機能的に同等な構
築物をもたらすことが理解されよう。たとえば、遺伝コードの縮重による「サイ
レントな置換」（すなわち、コード化されたポリペプチドに変化を生じる結果に
ならない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコード化している核酸配列のすべてが
暗に含んでいる特性である。同様に、パッケージングまたはパッケージング可能
な構築物のアミノ酸配列における一つまたは数個のアミノ酸における「保存的ア
ミノ酸置換」は、非常に類似した性質をもつ異なるアミノ酸によって置換されて
おり（定義の章、前出、参照）、また開示された構築物に非常に類似しているこ
とで容易に同定される。各々明白に開示された配列についての、保存的に置換さ
れたかかる変異体は、本発明の一つの特徴である。
築物をもたらすことが理解されよう。たとえば、遺伝コードの縮重による「サイ
レントな置換」（すなわち、コード化されたポリペプチドに変化を生じる結果に
ならない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコード化している核酸配列のすべてが
暗に含んでいる特性である。同様に、パッケージングまたはパッケージング可能
な構築物のアミノ酸配列における一つまたは数個のアミノ酸における「保存的ア
ミノ酸置換」は、非常に類似した性質をもつ異なるアミノ酸によって置換されて
おり（定義の章、前出、参照）、また開示された構築物に非常に類似しているこ
とで容易に同定される。各々明白に開示された配列についての、保存的に置換さ
れたかかる変異体は、本発明の一つの特徴である。
【００７５】 熟練者には、所与の核酸構築物に変異を産みだす数多の方法が認識されよう。
かかる周知の方法は、部位特異的突然変異誘発、変性オリゴヌクレオチドを用い
るＰＣＲ増幅、当該核酸を含んでいる細胞の、突然変異誘発剤または放射線への
接触、所望のオリゴヌクレオチドの化学的合成（たとえば連結および／または巨
大核酸を生じるためのクローニングと関連して）、および他の周知な方法を含む
。Giliman Smith（1979）Gene 8 : 81 - 97、Roberts 等（1987）Nature 328 :
731 - 734、ならびにSambrook, Innis, Ausbel, Berger, Needham VanDevanter
およびMullis（すべて前出）参照のこと。
かかる周知の方法は、部位特異的突然変異誘発、変性オリゴヌクレオチドを用い
るＰＣＲ増幅、当該核酸を含んでいる細胞の、突然変異誘発剤または放射線への
接触、所望のオリゴヌクレオチドの化学的合成（たとえば連結および／または巨
大核酸を生じるためのクローニングと関連して）、および他の周知な方法を含む
。Giliman Smith（1979）Gene 8 : 81 - 97、Roberts 等（1987）Nature 328 :
731 - 734、ならびにSambrook, Innis, Ausbel, Berger, Needham VanDevanter
およびMullis（すべて前出）参照のこと。
【００７６】 熟練者は、提供された配列と、レトロウイルス全般についてのこの技術の知識
とに基づき、本発明の所望の核酸を選択することができる。レトロウイルスゲノ
ムにおける多数の突然変異の特異的な影響が知られている。さらに、タンパク質
ならびに核酸の性質に関する全般的な知識は、熟練者に、本文の一覧表に開示さ
れた核酸ならびにタンパク質に類似または同等の活性をもつ適切な配列を選択す
ることができるようにする。本文の定義の章は、見本となる保存的なアミノ酸置
換について述べている。
とに基づき、本発明の所望の核酸を選択することができる。レトロウイルスゲノ
ムにおける多数の突然変異の特異的な影響が知られている。さらに、タンパク質
ならびに核酸の性質に関する全般的な知識は、熟練者に、本文の一覧表に開示さ
れた核酸ならびにタンパク質に類似または同等の活性をもつ適切な配列を選択す
ることができるようにする。本文の定義の章は、見本となる保存的なアミノ酸置
換について述べている。
【００７７】 最後に、核酸に対する修飾はほとんどが、所望の特徴に適した分析法における
型通りのスクリーニング技術により評価される。たとえば、コード化されたポリ
ペプチドの免疫学的特徴における変化は、適切な免疫学的分析法によって検出す
ることができる。相補的な核酸に対する核酸のハイブリッド形成、コード化され
たタンパク質の酸化還元または熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受
性、または凝集する傾向等の、他の特性の修飾は、すべて標準的な技術により分
析した。
型通りのスクリーニング技術により評価される。たとえば、コード化されたポリ
ペプチドの免疫学的特徴における変化は、適切な免疫学的分析法によって検出す
ることができる。相補的な核酸に対する核酸のハイブリッド形成、コード化され
たタンパク質の酸化還元または熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受
性、または凝集する傾向等の、他の特性の修飾は、すべて標準的な技術により分
析した。
【００７８】 (安定なパッケージング細胞系の作成) 安定なパッケージング細胞系は、哺乳類細胞をパッケージングプラスミドを用
いて安定性に、または一過性に形質導入することにより、最も好ましくはヒト細
胞を形質導入することにより作成される。哺乳類（ヒトを含む）細胞の形質導入
は、この技術では周知である。宿主細胞は形質転換についてコンピテントである
か、または種々の既知の手段によりコンピテントにされる。動物細胞内にＤＮＡ
を導入するいくつかの周知の方法がある。これらは：リン酸カルシウム沈殿法、
ＤＮＡを含んでいる細菌プロトプラストと受容細胞との融合、ＤＮＡを含んでい
るリポソームを用いた受容細胞の処理、ＤＥＡＥデキストラン法、受容体仲介エ
ンドサイトーシス、電気穿孔、および細胞内へのＤＮＡの直接的なマイクロイン
ジェクションを含む。
いて安定性に、または一過性に形質導入することにより、最も好ましくはヒト細
胞を形質導入することにより作成される。哺乳類（ヒトを含む）細胞の形質導入
は、この技術では周知である。宿主細胞は形質転換についてコンピテントである
か、または種々の既知の手段によりコンピテントにされる。動物細胞内にＤＮＡ
を導入するいくつかの周知の方法がある。これらは：リン酸カルシウム沈殿法、
ＤＮＡを含んでいる細菌プロトプラストと受容細胞との融合、ＤＮＡを含んでい
るリポソームを用いた受容細胞の処理、ＤＥＡＥデキストラン法、受容体仲介エ
ンドサイトーシス、電気穿孔、および細胞内へのＤＮＡの直接的なマイクロイン
ジェクションを含む。
【００７９】 本発明と関連して使用される細胞培養物は、細胞系と、組織または血液検体か
らの培養細胞とを含み、この技術においては周知である。Freshney(Culture of
Animal Cells, a Manual of Basic Technique、第３版ウィリー-リス（Wiley-Li
ss）、ニューヨーク（1994））およびそれに引用された参考文献は、細胞培養に
ついての全般的な手引きを提供する。形質転換された細胞はこの技術に周知の手
段により培養される。Kuchler et al. (1977）Biochemical Methods in Cell Cu
lture and Virology, Kuchler, R. J.、ダウドン、ハチンソン、およびロス社（
Dowden, Hutchinson and Ross, Inc）も参照のこと。哺乳類細胞のシステムはし
ばしば単層の細胞形態をとることがあるが、哺乳類細胞の懸濁物もまた使用され
る。例証となる哺乳類の細胞系は、ＶＥＲＯならびにＨｅＬａ細胞、２９３胚性
腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、Ｗ１３８、ＢＨＫ、
Ｃｏｓ−７、またはＭＤＣＫ細胞系を含む（たとえばFreshney、前出、参照）。
ヒトの細胞は最も好ましい。
らの培養細胞とを含み、この技術においては周知である。Freshney(Culture of
Animal Cells, a Manual of Basic Technique、第３版ウィリー-リス（Wiley-Li
ss）、ニューヨーク（1994））およびそれに引用された参考文献は、細胞培養に
ついての全般的な手引きを提供する。形質転換された細胞はこの技術に周知の手
段により培養される。Kuchler et al. (1977）Biochemical Methods in Cell Cu
lture and Virology, Kuchler, R. J.、ダウドン、ハチンソン、およびロス社（
Dowden, Hutchinson and Ross, Inc）も参照のこと。哺乳類細胞のシステムはし
ばしば単層の細胞形態をとることがあるが、哺乳類細胞の懸濁物もまた使用され
る。例証となる哺乳類の細胞系は、ＶＥＲＯならびにＨｅＬａ細胞、２９３胚性
腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、Ｗ１３８、ＢＨＫ、
Ｃｏｓ−７、またはＭＤＣＫ細胞系を含む（たとえばFreshney、前出、参照）。
ヒトの細胞は最も好ましい。
【００８０】 本発明のパッケージング細胞の細胞培養物からの上清は、前出のFreshneyに教
示されたものと同様の標準的な技術を用いて取得される。また、Corbeau 等（19
96）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 14070 - 14075およびその参考文献も参 照のこと。細胞上清からの成分は、標準的な技術を用いてさらに精製することが
できる。たとえば、この上清中のＦＩＶ粒子は遠心分離法、クロマトグラフ法、
親和性による精製法、その他のようなウイルス精製に典型的に用いられる方法に
より、当該上清から精製することができる。
示されたものと同様の標準的な技術を用いて取得される。また、Corbeau 等（19
96）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 14070 - 14075およびその参考文献も参 照のこと。細胞上清からの成分は、標準的な技術を用いてさらに精製することが
できる。たとえば、この上清中のＦＩＶ粒子は遠心分離法、クロマトグラフ法、
親和性による精製法、その他のようなウイルス精製に典型的に用いられる方法に
より、当該上清から精製することができる。
【００８１】 核酸を用いた哺乳類細胞の形質転換は、たとえば、ＦＩＶ粒子をコード化して
いる核酸を含んでいるプラスミドと共にコンピテント細胞をインキュベートする
ことを含んでもよい。宿主細胞を形質転換するべく用いられるプラスミドは、好
ましくは、転写を開始するための核酸配列と、コード化された配列の翻訳を調節
するための配列とを含む。このような配列は一般的に発現調節配列と呼ばれる。
哺乳類の発現調節配列の実例は、ＳＶ−４０プロモーター（Science（1983）222
: 524 - 527）、ＣＭＶ Ｉ.Ｅ.プロモーター（Proc. Natl. Acad. Sci. （1984
）81 : 659 - 663）、ＣＭＶプロモーター、またはメタロチオネインプロモータ
ー（Nature（1982）296 : 39 - 42）から得られる。発現調節配列を含んでいる クローニングベクターは、制限酵素を用いて切断され、必要な、または所望の大
きさに調整され、さらにこの技術に周知の手段により、興味のＨＩＶ配列をコー
ドしているＤＮＡと連結される。ヒト細胞において活性のある非常に多種類の特
異的なｐｏｌIIおよびｐｏｌIIIプロモーターはこの技術においては周知であり 、熟練者は所望の発現レベル、パターン、形質転換細胞、またはその他に基づき
、かかるプロモーターを選択して使用することができる。
いる核酸を含んでいるプラスミドと共にコンピテント細胞をインキュベートする
ことを含んでもよい。宿主細胞を形質転換するべく用いられるプラスミドは、好
ましくは、転写を開始するための核酸配列と、コード化された配列の翻訳を調節
するための配列とを含む。このような配列は一般的に発現調節配列と呼ばれる。
哺乳類の発現調節配列の実例は、ＳＶ−４０プロモーター（Science（1983）222
: 524 - 527）、ＣＭＶ Ｉ.Ｅ.プロモーター（Proc. Natl. Acad. Sci. （1984
）81 : 659 - 663）、ＣＭＶプロモーター、またはメタロチオネインプロモータ
ー（Nature（1982）296 : 39 - 42）から得られる。発現調節配列を含んでいる クローニングベクターは、制限酵素を用いて切断され、必要な、または所望の大
きさに調整され、さらにこの技術に周知の手段により、興味のＨＩＶ配列をコー
ドしているＤＮＡと連結される。ヒト細胞において活性のある非常に多種類の特
異的なｐｏｌIIおよびｐｏｌIIIプロモーターはこの技術においては周知であり 、熟練者は所望の発現レベル、パターン、形質転換細胞、またはその他に基づき
、かかるプロモーターを選択して使用することができる。
【００８２】 既知の哺乳動物の遺伝子からのポリアデニル化または転写終結配列は、典型的
には本発明のベクターに取り込まれる。ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデ
ニル化配列は、終結配列の一例である。転写物の正確なスプラシシングのための
配列もまた含まれてよい。スプライシング配列の実例はＳＶ４０からのＶＰ１イ
ントロンである（Sprague等（1983）J. Virol. 45 : 773 - 781）。さらに、特 定の宿主細胞における複製を調節する遺伝子配列は、ウシパピローマウイルス型
のベクターに見られるようなベクターに取り込まれる。Saveria - Campo（1985 ）の、DNA Cloning 第２巻a Practical Approach、第213 - 238頁における"Bovi
ne Papillooma virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector"、Glover（編）、ＩＲ
Ｌ出版、アーリントン、バージニア州、参照のこと。
には本発明のベクターに取り込まれる。ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデ
ニル化配列は、終結配列の一例である。転写物の正確なスプラシシングのための
配列もまた含まれてよい。スプライシング配列の実例はＳＶ４０からのＶＰ１イ
ントロンである（Sprague等（1983）J. Virol. 45 : 773 - 781）。さらに、特 定の宿主細胞における複製を調節する遺伝子配列は、ウシパピローマウイルス型
のベクターに見られるようなベクターに取り込まれる。Saveria - Campo（1985 ）の、DNA Cloning 第２巻a Practical Approach、第213 - 238頁における"Bovi
ne Papillooma virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector"、Glover（編）、ＩＲ
Ｌ出版、アーリントン、バージニア州、参照のこと。
【００８３】 コプラスミドを選択法に用いることができる。このような方法においては、抗
生物質耐性遺伝子等の選択可能マーカーを含んでいるプラスミドが、ＨＩＶパッ
ケージング核酸をコード化しているプラスミドと共に細胞をコトランスフェクト
するべく用いられる。細胞は抗生物質耐性について選択され、興味のプラスミド
の存在はサザン分析法、ノーザン分析法、またはＰＣＲにより確認される。ＨＩ
Ｖ粒子の表面上に発現されるべきタンパク質（たとえば、ＶＳＶエンベロープ等
のキャプシドの宿主範囲を広げるタンパク質、細胞リセプターリガンド、または
細胞リセプターに対する抗体）をコード化しているコプラスミドは、任意にパッ
ケージング細胞に形質導入される。ＶＳＶに加えて、他の脂質エンベロープに被
われたウイルスのエンベロープタンパク質は、任意に本発明の粒子に取り込まれ
、それにより粒子の形質導入範囲が拡張される。
生物質耐性遺伝子等の選択可能マーカーを含んでいるプラスミドが、ＨＩＶパッ
ケージング核酸をコード化しているプラスミドと共に細胞をコトランスフェクト
するべく用いられる。細胞は抗生物質耐性について選択され、興味のプラスミド
の存在はサザン分析法、ノーザン分析法、またはＰＣＲにより確認される。ＨＩ
Ｖ粒子の表面上に発現されるべきタンパク質（たとえば、ＶＳＶエンベロープ等
のキャプシドの宿主範囲を広げるタンパク質、細胞リセプターリガンド、または
細胞リセプターに対する抗体）をコード化しているコプラスミドは、任意にパッ
ケージング細胞に形質導入される。ＶＳＶに加えて、他の脂質エンベロープに被
われたウイルスのエンベロープタンパク質は、任意に本発明の粒子に取り込まれ
、それにより粒子の形質導入範囲が拡張される。
【００８４】 選択された配列をコード化する核酸を含んでいるウイルスベクターもまた、ベ
クターの宿主範囲内の細胞を形質転換するべく用いられる。Method in Enzymolo
gy第185巻、アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州（C. V. G
oeddel編）（1990）、またはM. Krieger、Gene Transfer and Expression - - A
Laboratory Manual、ストックトン出版、ニューヨーク、ニューヨーク州（1990
）およびそれに引用された参考文献参照のこと。
クターの宿主範囲内の細胞を形質転換するべく用いられる。Method in Enzymolo
gy第185巻、アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州（C. V. G
oeddel編）（1990）、またはM. Krieger、Gene Transfer and Expression - - A
Laboratory Manual、ストックトン出版、ニューヨーク、ニューヨーク州（1990
）およびそれに引用された参考文献参照のこと。
【００８５】 一旦安定な形質転換された細胞系が作られ、それがＦＩＶ粒子を発現すれば、
この形質転換された細胞系は、ＦＩＶベクターに取り込まれるべき核酸をコード
化しているベクターを用いてトランスフェクトされる。典型的には、このような
ベクターはプラスミドであるか、またはウイルスベクター内にコード化されてい
る。パッケージングされた核酸は、ウイルスインヒビターまたは他の治療用遺伝
子等の興味の配列とと共に、ＦＩＶのパッケージング部位のサブシーケンス（su
bsequence)を含む（ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ感染、リンパ腫、白血病、神経腫、そ
の他を含め、非分裂細胞またはそれらの子孫に媒介されるいかなる状態も、本発
明のベクターを用いて処置できることが理解されよう）。
この形質転換された細胞系は、ＦＩＶベクターに取り込まれるべき核酸をコード
化しているベクターを用いてトランスフェクトされる。典型的には、このような
ベクターはプラスミドであるか、またはウイルスベクター内にコード化されてい
る。パッケージングされた核酸は、ウイルスインヒビターまたは他の治療用遺伝
子等の興味の配列とと共に、ＦＩＶのパッケージング部位のサブシーケンス（su
bsequence)を含む（ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ感染、リンパ腫、白血病、神経腫、そ
の他を含め、非分裂細胞またはそれらの子孫に媒介されるいかなる状態も、本発
明のベクターを用いて処置できることが理解されよう）。
【００８６】 ヒトの細胞は好ましいパッケージング細胞系であり、上記の技術により形質転
換を可能にすることができる。たとえば、安定したＦＩＶパッケージング細胞系
を産生するために、ＦＩＶ細胞は本文の実施例に述べられたカルシウムリン酸法
によりトランスフェクトされる。たとえば、６ウェルプレート（カスター（Cost
ar)、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）中の集密に近い培養物を、直鎖化し 、リン酸カルシウム法により沈殿したプラスミド（10μg）により、たとえば、 １０％ＦＣＳ、抗生物質、およびグルタミンを加えたダルベッコ変法イーグル培
養液（DMEM - 10%FCS）において、任意にコプラスミドマーカーと共にトランス フェクトする。１８時間後、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）pH７.
８を用いてウェルを洗浄し、HEPES緩衝化生理食塩水（50 mM HEPES pH 7.1, 280
m M NaCl, 1.5 m M Na2HPO4）中の１５％グリセロール溶液と共に２０℃にて２
分間インキュベートし、PBSを用いて２回洗浄し、さらにDMEM - 10%FCS中で培養
する。細胞を形質導入マーカー遺伝子に適した選択にかける。
換を可能にすることができる。たとえば、安定したＦＩＶパッケージング細胞系
を産生するために、ＦＩＶ細胞は本文の実施例に述べられたカルシウムリン酸法
によりトランスフェクトされる。たとえば、６ウェルプレート（カスター（Cost
ar)、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）中の集密に近い培養物を、直鎖化し 、リン酸カルシウム法により沈殿したプラスミド（10μg）により、たとえば、 １０％ＦＣＳ、抗生物質、およびグルタミンを加えたダルベッコ変法イーグル培
養液（DMEM - 10%FCS）において、任意にコプラスミドマーカーと共にトランス フェクトする。１８時間後、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）pH７.
８を用いてウェルを洗浄し、HEPES緩衝化生理食塩水（50 mM HEPES pH 7.1, 280
m M NaCl, 1.5 m M Na2HPO4）中の１５％グリセロール溶液と共に２０℃にて２
分間インキュベートし、PBSを用いて２回洗浄し、さらにDMEM - 10%FCS中で培養
する。細胞を形質導入マーカー遺伝子に適した選択にかける。
【００８７】 （パッケージング細胞系、標的細胞、および細胞溶解物におけるパッケージング
プラスミド、パッケージング可能な核酸、およびＦＩＶ粒子の分析） 広く多様な方式ならびに標識が、パッケージング細胞、標的細胞、患者、およ
び細胞溶解物におけるパッケージングプラスミド、パッケージング可能な核酸、
およびレンチウイルス粒子の検出に利用でき、また適している。レンチウイルス
成分に対する抗体と、本発明のポリペプチドならびに核酸（ベクター、パッケー
ジングプラスミド、コード化された核酸およびポリペプチド、その他）は、当業
者に周知の数多くの手段により検出ならびに定量される。これらは、分光光度法
、Ｘ線撮影法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフ
法（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフ法（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフ法そ
の他のような分析用の生化学的方法と、液体またはゲル沈降反応法、免疫拡散法
（一重または二重）、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡＳ）、エ
ンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光分析法その他のような種々の
免疫学的方法とを含む。レンチウイルス成分（たとえばＦＩＶ）の検出用には、
いくつかの入手可能なＥＬＩＳＡ分析法が利用でき、熟練者が非霊長類レンチウ
イルス粒子か、または非哺乳類レンチウイルスを生体試料中に検出することを可
能にする。
プラスミド、パッケージング可能な核酸、およびＦＩＶ粒子の分析） 広く多様な方式ならびに標識が、パッケージング細胞、標的細胞、患者、およ
び細胞溶解物におけるパッケージングプラスミド、パッケージング可能な核酸、
およびレンチウイルス粒子の検出に利用でき、また適している。レンチウイルス
成分に対する抗体と、本発明のポリペプチドならびに核酸（ベクター、パッケー
ジングプラスミド、コード化された核酸およびポリペプチド、その他）は、当業
者に周知の数多くの手段により検出ならびに定量される。これらは、分光光度法
、Ｘ線撮影法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフ
法（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフ法（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフ法そ
の他のような分析用の生化学的方法と、液体またはゲル沈降反応法、免疫拡散法
（一重または二重）、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡＳ）、エ
ンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光分析法その他のような種々の
免疫学的方法とを含む。レンチウイルス成分（たとえばＦＩＶ）の検出用には、
いくつかの入手可能なＥＬＩＳＡ分析法が利用でき、熟練者が非霊長類レンチウ
イルス粒子か、または非哺乳類レンチウイルスを生体試料中に検出することを可
能にする。
【００８８】 核酸の検出は、サザン分析法、ノーザン分析法、ゲル電気泳動法、ＰＣＲ、放
射標識ならびにシンチレーションカウンティング、およびアフィニティクロマト
グラフィーのような周知の方法により進められる。Tijssen（1993）Laboratory
Techniques in biochemistry and molecular biology - hybridization with nu
cleic acid probes 第I部および第II部、エルセヴィア（Elsevier）、ニューヨ ークおよびChoo（編）（1994）Methods In Molecular Biology 第３３巻 - In S
itu Hybridization Protocols フマーナプレス社（Humana Press Inc.)、ニュー
ジャージー州（Methods in Molecular Biologyシリーズの他の本も参照のこと）
において総説されたものを含む多くの分析方式が適しており、特にChoo（同著）
の“Detection of Virus Nucleic Acid by Radioactive and Nonisotopic in Si
tu Hybridization”の第２１章を参照のこと。種々の自動化された固相検出技術
も適している。たとえば、超大量固定化ポリマーアレイ（ＶＬＳＩＰＳTM）が核
酸の検出に用いられる。Tijssen（前出）、Fodor等、（1991) Science, 251 : 7
67 - 777およびSheldon等（1993）Clinical Chemistry 39(4) : 718 - 719参照 。最後に、生体試料中の核酸検出には、ＰＣＲもまた日常的に用いられる（ＰＣ
Ｒ技術の全般的な記述についてはInnis、前出参照）。
射標識ならびにシンチレーションカウンティング、およびアフィニティクロマト
グラフィーのような周知の方法により進められる。Tijssen（1993）Laboratory
Techniques in biochemistry and molecular biology - hybridization with nu
cleic acid probes 第I部および第II部、エルセヴィア（Elsevier）、ニューヨ ークおよびChoo（編）（1994）Methods In Molecular Biology 第３３巻 - In S
itu Hybridization Protocols フマーナプレス社（Humana Press Inc.)、ニュー
ジャージー州（Methods in Molecular Biologyシリーズの他の本も参照のこと）
において総説されたものを含む多くの分析方式が適しており、特にChoo（同著）
の“Detection of Virus Nucleic Acid by Radioactive and Nonisotopic in Si
tu Hybridization”の第２１章を参照のこと。種々の自動化された固相検出技術
も適している。たとえば、超大量固定化ポリマーアレイ（ＶＬＳＩＰＳTM）が核
酸の検出に用いられる。Tijssen（前出）、Fodor等、（1991) Science, 251 : 7
67 - 777およびSheldon等（1993）Clinical Chemistry 39(4) : 718 - 719参照 。最後に、生体試料中の核酸検出には、ＰＣＲもまた日常的に用いられる（ＰＣ
Ｒ技術の全般的な記述についてはInnis、前出参照）。
【００８９】 一つの好ましい態様においては、抗体は、パッケージングされたベクターによ
り発現されたタンパク質、パッケージング核酸、を検出するため、または循環し
ているＨＩＶ、ＨＴＬＶ（または他の関連する病原体）、ヒト血液中のレベルを
監視するため、たとえばＦＩＶをパッケージングされた核酸にコード化された遺
伝子治療薬剤のインヴィヴォの影響を監視するために用いられる。他の態様にお
いては、抗体はウイルス粒子に取り込まれるべく、パッケージング細胞において
同時発現される。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造法は、当業者
には周知であり、多くの抗体が利用できる。Coligan（1991）Current Protocols
in Immunology ウィリー／グリーン（Wiley/Greene）、ニューヨーク；およびH
arlowおよびLane（1989）Antibodies : A Laboratory Manualコールドスプリン グハーバー出版、ニューヨーク；Stites等（共編）Basic and Clinical Immunol
ogy（第４版）ランゲメディカルパブリケイションズ（Lange Medical Publicati
ons)、ロスアルトス、カリフォルニア州、およびそれに引用された参考文献；Go
ding（1986）Monoclonal Antibodies : Princeples and Practice(第２版）アカ
デミックプレス、ニューヨーク、ニューヨーク州；およびKohlerおよびMilstein
（1975）Nature 256 : 495 - 497参照のこと。抗体の調製についての他の適切な
技術は、ファージまたは同様のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選
択を含む。Hues等（1989）Science 246 : 1275 - 1281；およびWard等（1989）N
ature 341 : 544 - 546参照のこと。特異的なモノクローナルおよびポリクロー ナル抗体および抗血清は、少なくとも約 .１μMのＫDをもち、好ましくは少なく
とも約 .０１μMまたはそれよりよく、また最も典型的かつ好ましくは .００１ μMかまたはそれよりよい。
り発現されたタンパク質、パッケージング核酸、を検出するため、または循環し
ているＨＩＶ、ＨＴＬＶ（または他の関連する病原体）、ヒト血液中のレベルを
監視するため、たとえばＦＩＶをパッケージングされた核酸にコード化された遺
伝子治療薬剤のインヴィヴォの影響を監視するために用いられる。他の態様にお
いては、抗体はウイルス粒子に取り込まれるべく、パッケージング細胞において
同時発現される。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造法は、当業者
には周知であり、多くの抗体が利用できる。Coligan（1991）Current Protocols
in Immunology ウィリー／グリーン（Wiley/Greene）、ニューヨーク；およびH
arlowおよびLane（1989）Antibodies : A Laboratory Manualコールドスプリン グハーバー出版、ニューヨーク；Stites等（共編）Basic and Clinical Immunol
ogy（第４版）ランゲメディカルパブリケイションズ（Lange Medical Publicati
ons)、ロスアルトス、カリフォルニア州、およびそれに引用された参考文献；Go
ding（1986）Monoclonal Antibodies : Princeples and Practice(第２版）アカ
デミックプレス、ニューヨーク、ニューヨーク州；およびKohlerおよびMilstein
（1975）Nature 256 : 495 - 497参照のこと。抗体の調製についての他の適切な
技術は、ファージまたは同様のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選
択を含む。Hues等（1989）Science 246 : 1275 - 1281；およびWard等（1989）N
ature 341 : 544 - 546参照のこと。特異的なモノクローナルおよびポリクロー ナル抗体および抗血清は、少なくとも約 .１μMのＫDをもち、好ましくは少なく
とも約 .０１μMまたはそれよりよく、また最も典型的かつ好ましくは .００１ μMかまたはそれよりよい。
【００９０】 （本発明の核酸の分子プローブとしての使用） パッケージング細胞系の作成に利用することに加えて、本発明の非感染性のパ
ッケージングプラスミドは、サザンまたはノーザンブロット分析法を用いた生体
試料中の野性型ウイルスの検出に使用することができる。簡単に言えば、パッケ
ージングプラスミドにコード化された核酸を、典型的には放射性または生物発光
標識を用いて標識し、ウイルス（ＦＩＶ、有蹄類レトロウイルス等）を含んでい
ると思われる試料のノーザンまたはサザンブロットをプローブするべく用いられ
る。プローブとしてのパッケージングプラスミドの使用は、感染性ウイルスのプ
ローブとしての使用よりも安全である。パッケージングプラスミドはまた、より
小さいプローブよりも野性型ウイルスを検出しやすいが、それは小さいプローブ
と異なり、パッケージングプラスミドプローブは、野性型ウイルスと同じように
（パッケージング部位を除いて）任意に事実上完全なゲノムをもち、プローブ結
合部位の突然変異によって野性型ウイルスが検出を免れることがないようにする
からである。
ッケージングプラスミドは、サザンまたはノーザンブロット分析法を用いた生体
試料中の野性型ウイルスの検出に使用することができる。簡単に言えば、パッケ
ージングプラスミドにコード化された核酸を、典型的には放射性または生物発光
標識を用いて標識し、ウイルス（ＦＩＶ、有蹄類レトロウイルス等）を含んでい
ると思われる試料のノーザンまたはサザンブロットをプローブするべく用いられ
る。プローブとしてのパッケージングプラスミドの使用は、感染性ウイルスのプ
ローブとしての使用よりも安全である。パッケージングプラスミドはまた、より
小さいプローブよりも野性型ウイルスを検出しやすいが、それは小さいプローブ
と異なり、パッケージングプラスミドプローブは、野性型ウイルスと同じように
（パッケージング部位を除いて）任意に事実上完全なゲノムをもち、プローブ結
合部位の突然変異によって野性型ウイルスが検出を免れることがないようにする
からである。
【００９１】 さらに、パッケージングプラスミドはポジテジブコントロールとして、対応す
るレトロウイルス（たとえばＦＩＶ）の検出のための、基本的にすべての既知の
検出法に用いることができる。この態様においては、パッケージングプラスミド
の核酸またはコード化されたタンパク質は、ＦＩＶ検出分析が適切に機能してい
ることを立証するべく、ポジティブコントロールとして用いられる。たとえばオ
リゴヌクレオチドは、獣医学的な背景においてネコの血液等の生体試料中のＦＩ
Ｖ核酸を検出するべく、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして用いられる。パッ
ケージングプラスミドは、増幅されるべき領域に相当する核酸のサブシーケンス
を含んでおり、ヒト血液などの生体試料からの別の反応において、増殖の鋳型と
して、ＰＣＲ試薬ならびにハイブリッド形成条件が適切であることを決定するべ
く用いられる。同様に、パッケージングプラスミドにコード化されたポリペプチ
ドは、生体試料中のＦＩＶ発現産物の検出のための分析において、ＥＬＩＳＡ試
薬をチェックするべく用いることができる。
るレトロウイルス（たとえばＦＩＶ）の検出のための、基本的にすべての既知の
検出法に用いることができる。この態様においては、パッケージングプラスミド
の核酸またはコード化されたタンパク質は、ＦＩＶ検出分析が適切に機能してい
ることを立証するべく、ポジティブコントロールとして用いられる。たとえばオ
リゴヌクレオチドは、獣医学的な背景においてネコの血液等の生体試料中のＦＩ
Ｖ核酸を検出するべく、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして用いられる。パッ
ケージングプラスミドは、増幅されるべき領域に相当する核酸のサブシーケンス
を含んでおり、ヒト血液などの生体試料からの別の反応において、増殖の鋳型と
して、ＰＣＲ試薬ならびにハイブリッド形成条件が適切であることを決定するべ
く用いられる。同様に、パッケージングプラスミドにコード化されたポリペプチ
ドは、生体試料中のＦＩＶ発現産物の検出のための分析において、ＥＬＩＳＡ試
薬をチェックするべく用いることができる。
【００９２】 パッケージング可能な核酸もまた、たとえばそれらがＨＩＶパッケージング部
位、ＨＩＶ ＬＴＲｓ、トランスドミナントＴａｔまたはＲｅｖタンパク質、ま たはその他のようなＨＩＶ成分をコード化している場合には、ＨＩＶの検出のた
めの分子プローブとして、またはＨＩＶ検出試薬として、同様なやり方で用いる
ことができる。
位、ＨＩＶ ＬＴＲｓ、トランスドミナントＴａｔまたはＲｅｖタンパク質、ま たはその他のようなＨＩＶ成分をコード化している場合には、ＨＩＶの検出のた
めの分子プローブとして、またはＨＩＶ検出試薬として、同様なやり方で用いる
ことができる。
【００９３】 （細胞の形質転換と遺伝子治療） 本発明はインヴィトロおよびインヴィヴォでの細胞の形質転換のためのパッケ
ージャブル核酸を提供する。これらのパッケージャブル核酸は、本文に述べたレ
ンチウイルスパッケージング細胞系において、ＦＩＶ粒子等の非霊長類レンチウ
イルス粒子内にパッケージングされる。好ましくは、標的がＶＳＶウイルスの宿
主範囲にある場合（たとえば造血幹細胞）、粒子もまたＶＳＶ糖タンパク質を含
む。核酸は、核酸を取り囲んでいるＦＩＶ粒子と、ＦＩＶまたはＶＳＶの細胞リ
セプターとの相互作用を介して細胞内にトランスフェクトされる。
ージャブル核酸を提供する。これらのパッケージャブル核酸は、本文に述べたレ
ンチウイルスパッケージング細胞系において、ＦＩＶ粒子等の非霊長類レンチウ
イルス粒子内にパッケージングされる。好ましくは、標的がＶＳＶウイルスの宿
主範囲にある場合（たとえば造血幹細胞）、粒子もまたＶＳＶ糖タンパク質を含
む。核酸は、核酸を取り囲んでいるＦＩＶ粒子と、ＦＩＶまたはＶＳＶの細胞リ
セプターとの相互作用を介して細胞内にトランスフェクトされる。
【００９４】 一つの特にこのましい部類の態様においては、本発明のパッケージャブル核酸
は、遺伝子治療のための細胞形質転換法に使用される。遺伝子治療は、ＨＩＶ等
の慢性感染症ならびに癌および酵素欠損症のような先天性異常等の非感染症と戦
うための方法を提供する。Yu等（1994）Gen Therapy 1 : 13 - 26およびその参 考文献は、ＨＩＶ感染についての遺伝子治療戦略に対する全般的な手引きを提供
する。またSodoski等のPCT／US91／04335も参照のこと。マウスレトロウイルス 等の共通な遺伝子治療ベクターの一つの一般的な限界は、それらが活発に分裂し
ている細胞のみに感染すること、およびそれらが一般的に非特異的であることで
ある。本発明は熟練者に、インヴィヴォにおいて幹細胞を特異的に標的としかつ
インヴィトロにおいて多くの細胞型を形質転換する強力なレトロウイルス遺伝子
治療ベクターの生成を可能にするいくつかの特徴を提供する。ＣＤ４+細胞、神 経細胞、および他の非分裂細胞（しばしばＣＸＣＲ４ポジティブ）は、ＦＩＶ粒
子内にパッケージングされた核酸により形質導入される。さらにベクターは任意
に、幹細胞の形質転換のためのシュードタイプである。
は、遺伝子治療のための細胞形質転換法に使用される。遺伝子治療は、ＨＩＶ等
の慢性感染症ならびに癌および酵素欠損症のような先天性異常等の非感染症と戦
うための方法を提供する。Yu等（1994）Gen Therapy 1 : 13 - 26およびその参 考文献は、ＨＩＶ感染についての遺伝子治療戦略に対する全般的な手引きを提供
する。またSodoski等のPCT／US91／04335も参照のこと。マウスレトロウイルス 等の共通な遺伝子治療ベクターの一つの一般的な限界は、それらが活発に分裂し
ている細胞のみに感染すること、およびそれらが一般的に非特異的であることで
ある。本発明は熟練者に、インヴィヴォにおいて幹細胞を特異的に標的としかつ
インヴィトロにおいて多くの細胞型を形質転換する強力なレトロウイルス遺伝子
治療ベクターの生成を可能にするいくつかの特徴を提供する。ＣＤ４+細胞、神 経細胞、および他の非分裂細胞（しばしばＣＸＣＲ４ポジティブ）は、ＦＩＶ粒
子内にパッケージングされた核酸により形質導入される。さらにベクターは任意
に、幹細胞の形質転換のためのシュードタイプである。
【００９５】 （パッケージャブルベクターのシュードタイプ化（pseudotyping）） 造血幹細胞は一般的に細胞の形質転換のための、また特に遺伝子治療（特に抗
ＨＩＶ遺伝子治療）のための特に好ましい標的である。パッケージャブルベクタ
ーは、ベクターをシュードタイプ化することによりＣＤ３４+細胞を形質転換す ることができるようにされる。このことは、ベクターをパッケージングするため
に用いられる細胞系を、レトロウイルスのｅｎｖ機能に取って代るかまたは補足
するＥｎｖタンパク質をコード化している核酸を用いて形質導入することによっ
て行なわれる。このエンベロープ機能は、いくつかの異種のウイルスのエンベロ
ープタンパク質によりトランスに供給されることが可能である。これらはＶＳＶ
−Ｇ、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）の両栄養性エンベロープ
、およびテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープを含むがこれに制
限されない。ベクターの表面に発現された、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の
エンベロープ糖タンパク質は、好ましいシュードタイプ化成分である。ＶＳＶは
分裂および非分裂ＣＤ３４+細胞の両者に感染し、またＶＳＶエンベロープタン パク質を発現しているシュードタイプベクターはこれらの細胞を形質導入するこ
とができる。
ＨＩＶ遺伝子治療）のための特に好ましい標的である。パッケージャブルベクタ
ーは、ベクターをシュードタイプ化することによりＣＤ３４+細胞を形質転換す ることができるようにされる。このことは、ベクターをパッケージングするため
に用いられる細胞系を、レトロウイルスのｅｎｖ機能に取って代るかまたは補足
するＥｎｖタンパク質をコード化している核酸を用いて形質導入することによっ
て行なわれる。このエンベロープ機能は、いくつかの異種のウイルスのエンベロ
ープタンパク質によりトランスに供給されることが可能である。これらはＶＳＶ
−Ｇ、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）の両栄養性エンベロープ
、およびテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープを含むがこれに制
限されない。ベクターの表面に発現された、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の
エンベロープ糖タンパク質は、好ましいシュードタイプ化成分である。ＶＳＶは
分裂および非分裂ＣＤ３４+細胞の両者に感染し、またＶＳＶエンベロープタン パク質を発現しているシュードタイプベクターはこれらの細胞を形質導入するこ
とができる。
【００９６】 同様に、ウイルスまたは細胞のタンパク質は一般にＦＩＶを主成分とするベク
ターの宿主範囲を増すべく同時発現されることが可能である。典型的には、選択
されたタンパク質をコード化している核酸が、本発明のＦＩＶパッケージング細
胞において同時発現される。核酸によってコード化されたタンパク質は、ＦＩＶ
のパッケージャブル核酸をパッケージングする粒子内に取り込まれ、それはパッ
ケージング細胞の膜から出芽する。もしこのタンパク質が標的細胞上の細胞リセ
プターによって認識されれば、受容体仲介エンドサイトーシスにより、粒子は細
胞内へ形質導入される。好ましいタンパク質はウイルスエンベロープまたは外皮
タンパク質、細胞リセプターリガンド、抗体、または標的細胞上の細胞リセプタ
ーと結合する抗体フラグメント、その他を含む。
ターの宿主範囲を増すべく同時発現されることが可能である。典型的には、選択
されたタンパク質をコード化している核酸が、本発明のＦＩＶパッケージング細
胞において同時発現される。核酸によってコード化されたタンパク質は、ＦＩＶ
のパッケージャブル核酸をパッケージングする粒子内に取り込まれ、それはパッ
ケージング細胞の膜から出芽する。もしこのタンパク質が標的細胞上の細胞リセ
プターによって認識されれば、受容体仲介エンドサイトーシスにより、粒子は細
胞内へ形質導入される。好ましいタンパク質はウイルスエンベロープまたは外皮
タンパク質、細胞リセプターリガンド、抗体、または標的細胞上の細胞リセプタ
ーと結合する抗体フラグメント、その他を含む。
【００９７】 （好ましいプロモーター） 一つの部類の態様はＦＩＶパッケージャブルベクター用のプロモーターとして
、ＨＩＶ ＬＴＲ配列を利用する。これらのＬＴＲ配列は、ＬＴＲプロモーター を含んでいる細胞の感染に際し、 感染しているＨＩＶウイルスによってトラン スに活性化される。ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターは、ｔａｔならびにｒｅｖとの 結合に加えて、感染に際しＨＩＶゲノムの転写を許すべく作用する細胞内サイト
カイン（ＩＬ−２およびＳＰ−１等の）に反応性がある。したがって一つの態様
においては、選択された治療用核酸はＬＴＲプロモーターの支配下に置かれ、通
常はＨＩＶ感染に対して最も傷つきやすい細胞を、感染に対して抵抗性にする。
さらに、一つの態様においては、ＨＩＶパッケージング部位（ＦＩＶまたは他の
非霊長類レンチウイルスパッケージング部位に加えて）は、ＦＩＶパッケージャ
ブルベクターに含まれる。これにより、ＦＩＶを主成分とするベクターにコード
化された抗ＨＩＶ治療薬剤が感染性ＨＩＶウイルスによりパッケージングされか
つ散布されることが可能となり、ＨＩＶ感染と組み合わされて伝播されるという
二次的な予防効果を生じ、それにより感染が減速される。ＨＩＶのパッケージン
グ部位は詳細に記述されており、Poznansky等、（1991）Journal or Virology 6
5 (1) : 532 - 536；Aldovini およびYoung（1990）Journal of Virology 64 (5
) : 1920 - 1926、およびClever等、（1995）Journal of Virology 69 (4) : 21
01 - 2109参照のこと。二次予防効果を提供するべくＨＩＶによりパッケージン グされるベクターの記述については、Wong - Stall等の米国特許第5,650,309号 参照のこと。
、ＨＩＶ ＬＴＲ配列を利用する。これらのＬＴＲ配列は、ＬＴＲプロモーター を含んでいる細胞の感染に際し、 感染しているＨＩＶウイルスによってトラン スに活性化される。ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターは、ｔａｔならびにｒｅｖとの 結合に加えて、感染に際しＨＩＶゲノムの転写を許すべく作用する細胞内サイト
カイン（ＩＬ−２およびＳＰ−１等の）に反応性がある。したがって一つの態様
においては、選択された治療用核酸はＬＴＲプロモーターの支配下に置かれ、通
常はＨＩＶ感染に対して最も傷つきやすい細胞を、感染に対して抵抗性にする。
さらに、一つの態様においては、ＨＩＶパッケージング部位（ＦＩＶまたは他の
非霊長類レンチウイルスパッケージング部位に加えて）は、ＦＩＶパッケージャ
ブルベクターに含まれる。これにより、ＦＩＶを主成分とするベクターにコード
化された抗ＨＩＶ治療薬剤が感染性ＨＩＶウイルスによりパッケージングされか
つ散布されることが可能となり、ＨＩＶ感染と組み合わされて伝播されるという
二次的な予防効果を生じ、それにより感染が減速される。ＨＩＶのパッケージン
グ部位は詳細に記述されており、Poznansky等、（1991）Journal or Virology 6
5 (1) : 532 - 536；Aldovini およびYoung（1990）Journal of Virology 64 (5
) : 1920 - 1926、およびClever等、（1995）Journal of Virology 69 (4) : 21
01 - 2109参照のこと。二次予防効果を提供するべくＨＩＶによりパッケージン グされるベクターの記述については、Wong - Stall等の米国特許第5,650,309号 参照のこと。
【００９８】 治療用核酸の発現を指示するための、ｐｏｌIIIプロモーター等の構成プロモ ーターもまた好ましい。ＰＣＴ出願PCT／US94／05700（WO 94／26877）およびC
hatterjee等（Science（1992）, 258 : 1485 - 1488、下文のChetterjee等、１ ）は、標的細胞におけるＨＩＶー１の感染性のアンチセンス阻害を、抗ＴＡＲ ＲＮＡを発現している構成されたｐｏｌIII発現カセットをもつウイルスベクタ ーを用いて記述している。Chatterjee等（ＰＣＴ出願PCT／US91／03440（1991）
、下文のChetterjee等、２）は、アンチセンスＴＡＲ配列を発現するＡＡＶを主
成分とするベクターを含むウイルスベクターについて記述している。Chatterjee
およびWong (Methods, A companion to Methods in Enzymology（1993）, 5 : 5
1 - 59）は、さらにアンチセンスＲＮＡのデリバリーのためのウイルスベクター
を記述している。ＰＣＴ公告WO 94／26877（PCT／US94／05700）は、種々の抗Ｈ
ＩＶ治療遺伝子と、自殺遺伝子、トランスドミナント遺伝子、リボザイム、およ
びアンチセンス遺伝子、および遺伝子治療ベクターのおとり遺伝子を含む、一般
的な遺伝子治療戦略を記述している。Yu等（1994）Gene Therapy 1 : 13 - 26お
よびそれに引用された参考文献は、ＨＩＶ感染に対して有用な遺伝子治療戦略へ
の全般的な手引きを提供する。
hatterjee等（Science（1992）, 258 : 1485 - 1488、下文のChetterjee等、１ ）は、標的細胞におけるＨＩＶー１の感染性のアンチセンス阻害を、抗ＴＡＲ ＲＮＡを発現している構成されたｐｏｌIII発現カセットをもつウイルスベクタ ーを用いて記述している。Chatterjee等（ＰＣＴ出願PCT／US91／03440（1991）
、下文のChetterjee等、２）は、アンチセンスＴＡＲ配列を発現するＡＡＶを主
成分とするベクターを含むウイルスベクターについて記述している。Chatterjee
およびWong (Methods, A companion to Methods in Enzymology（1993）, 5 : 5
1 - 59）は、さらにアンチセンスＲＮＡのデリバリーのためのウイルスベクター
を記述している。ＰＣＴ公告WO 94／26877（PCT／US94／05700）は、種々の抗Ｈ
ＩＶ治療遺伝子と、自殺遺伝子、トランスドミナント遺伝子、リボザイム、およ
びアンチセンス遺伝子、および遺伝子治療ベクターのおとり遺伝子を含む、一般
的な遺伝子治療戦略を記述している。Yu等（1994）Gene Therapy 1 : 13 - 26お
よびそれに引用された参考文献は、ＨＩＶ感染に対して有用な遺伝子治療戦略へ
の全般的な手引きを提供する。
【００９９】 （エクスヴィヴォ（生体外）における細胞の形質転換） 生物体の中の細胞におけるウイルスの複製を阻害するためのエクスヴィヴォの
方法（または治療用遺伝子を細胞内へ形質導入する他の方法）は、本発明の治療
用核酸を用いてエクスヴィヴォで細胞を形質導入することと、さらにその細胞を
生物体に導入することを含む。標的細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞等のＣＤ４+細胞、患
者から単離および培養されたマクロファージ、幹細胞、またはその種の他のもの
を含む。Freshney等、前出、および、いかにして患者から細胞を単離し培養する
かについての議論のためにそれに引用された参考文献を参照のこと。別法として
、細胞は細胞バンク（たとえば血液バンク）に貯蔵されたものでもよい。好まし
い態様の一つの部類においては、パッケージャブル核酸は抗ウイルス治療薬剤（
たとえば、自殺遺伝子、トランスドミナント遺伝子、抗ＨＩＶリボザイム、アン
チセンス遺伝子、またはおとり遺伝子）をコード化しており、それは活性化また
は構成されたプロモーターの支配の下にＨＩＶウイルスの生育ならびに複製を阻
害する。細胞形質転換ベクターは、ＨＩＶに未感染の細胞に対して予防効果を付
与すると共に、既にＨＩＶウイルスに感染した細胞のいずれにおいても、ウイル
スの複製を阻害する。さらに好ましい態様においては、ベクターはＨＩＶの複製
機構を用いて複製され、さらにＨＩＶキャプシド内へパッケージングされ、それ
により抗ＨＩＶ治療遺伝子の、ＨＩＶウイルスの複製に関連した伝播を引き起こ
す。したがって、ＨＩＶに感染した生物体は、その細胞の一集団を本発明のベク
ターを用いて形質転換し、かつ形質転換された細胞を本文に記述したように生物
体に戻すことにより、感染に対する治療が可能である。したがって本発明は、た
とえ細胞が、予防が探究されているウイルスに既に感染されている場合でも、イ
ンヴィトロ、エクスヴィヴォ、またはインヴィヴォにおいて細胞を防護する方法
を提供する。
方法（または治療用遺伝子を細胞内へ形質導入する他の方法）は、本発明の治療
用核酸を用いてエクスヴィヴォで細胞を形質導入することと、さらにその細胞を
生物体に導入することを含む。標的細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞等のＣＤ４+細胞、患
者から単離および培養されたマクロファージ、幹細胞、またはその種の他のもの
を含む。Freshney等、前出、および、いかにして患者から細胞を単離し培養する
かについての議論のためにそれに引用された参考文献を参照のこと。別法として
、細胞は細胞バンク（たとえば血液バンク）に貯蔵されたものでもよい。好まし
い態様の一つの部類においては、パッケージャブル核酸は抗ウイルス治療薬剤（
たとえば、自殺遺伝子、トランスドミナント遺伝子、抗ＨＩＶリボザイム、アン
チセンス遺伝子、またはおとり遺伝子）をコード化しており、それは活性化また
は構成されたプロモーターの支配の下にＨＩＶウイルスの生育ならびに複製を阻
害する。細胞形質転換ベクターは、ＨＩＶに未感染の細胞に対して予防効果を付
与すると共に、既にＨＩＶウイルスに感染した細胞のいずれにおいても、ウイル
スの複製を阻害する。さらに好ましい態様においては、ベクターはＨＩＶの複製
機構を用いて複製され、さらにＨＩＶキャプシド内へパッケージングされ、それ
により抗ＨＩＶ治療遺伝子の、ＨＩＶウイルスの複製に関連した伝播を引き起こ
す。したがって、ＨＩＶに感染した生物体は、その細胞の一集団を本発明のベク
ターを用いて形質転換し、かつ形質転換された細胞を本文に記述したように生物
体に戻すことにより、感染に対する治療が可能である。したがって本発明は、た
とえ細胞が、予防が探究されているウイルスに既に感染されている場合でも、イ
ンヴィトロ、エクスヴィヴォ、またはインヴィヴォにおいて細胞を防護する方法
を提供する。
【０１００】 一つの特に好ましい態様においては、細胞の形質転換および遺伝子治療のため
のエクスヴィヴォの方法において幹細胞（典型的にはＣＤ４+ではない）が用い られる。幹細胞を用いることの利点は、それらがインヴィトロで他の細胞型に分
化すること、あるいは哺乳類（細胞のドナー等の）に導入され、そこで骨髄に植
え付けられることになることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ
−α等のサイトカインを用い、ＣＤ３４+細胞を臨床上重要な細胞型に分化させ る方法が知られている（Inaba等（1992) J. Exp. Med. 176, 1693 - 1702および
Szabolcs等（1995) 154 : 5851 - 5861参照のこと）。ＦＩＶベクターをシュー ドタイプ化してそれらが幹細胞を形質転換できるようにする方法は前文に記述さ
れている。アフィニティーカラムによる単離法を、ＣＤ３４に結合する細胞、ま
たはＣＤ３４に結合する抗体を単離するべく用いることができる。Ho等（1995）
Stem Cells 13（前出３) ：100 - 105参照。また、Brenner（1993） Journal of
Hematotherapy 2 : 7 - 17も参照のこと。もう一つの態様においては、造血幹 細胞は胎児の脈管血から単離される。Yu等（1995）PNAS 92 : 699 - 703は、レ トロウイルスベクターを用いてヒト胎児脈管血からのＣＤ３４+細胞を形質導入 する好ましい方法を記述している。エクスヴィヴォ方法における好ましい態様で
は、幹細胞を用いるよりもむしろＴ細胞がまた形質導入される。Ｔ細胞の単離に
はいくつかの技術が知られている。一つの方法では、フィコール-ハイパック密 度勾配遠心法が、確立された手技による赤血球および好中球からＰＢＭＣを分離
するべく用いられる。細胞は、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足した、改造さ
れたＡＩＭ−Ｖ（２mMグルタミン、１０μg／mlの硫酸ゲンタマイシン、５０μg
／mlのストレプトマイシンを加えたAIM-V(ギブコ）からなる）を用いて洗浄され
る。Ｔ細胞の濃縮は、カラムまたは磁気ビーズに結合された適切なモノクローナ
ル抗体によるネガティブまたはポジティブな選別により、標準的な技術を用いて
行なわれる。細胞のアリコートが、所望の細胞表面の表現型について分析される
（たとえば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１４、その他）。
のエクスヴィヴォの方法において幹細胞（典型的にはＣＤ４+ではない）が用い られる。幹細胞を用いることの利点は、それらがインヴィトロで他の細胞型に分
化すること、あるいは哺乳類（細胞のドナー等の）に導入され、そこで骨髄に植
え付けられることになることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ
−α等のサイトカインを用い、ＣＤ３４+細胞を臨床上重要な細胞型に分化させ る方法が知られている（Inaba等（1992) J. Exp. Med. 176, 1693 - 1702および
Szabolcs等（1995) 154 : 5851 - 5861参照のこと）。ＦＩＶベクターをシュー ドタイプ化してそれらが幹細胞を形質転換できるようにする方法は前文に記述さ
れている。アフィニティーカラムによる単離法を、ＣＤ３４に結合する細胞、ま
たはＣＤ３４に結合する抗体を単離するべく用いることができる。Ho等（1995）
Stem Cells 13（前出３) ：100 - 105参照。また、Brenner（1993） Journal of
Hematotherapy 2 : 7 - 17も参照のこと。もう一つの態様においては、造血幹 細胞は胎児の脈管血から単離される。Yu等（1995）PNAS 92 : 699 - 703は、レ トロウイルスベクターを用いてヒト胎児脈管血からのＣＤ３４+細胞を形質導入 する好ましい方法を記述している。エクスヴィヴォ方法における好ましい態様で
は、幹細胞を用いるよりもむしろＴ細胞がまた形質導入される。Ｔ細胞の単離に
はいくつかの技術が知られている。一つの方法では、フィコール-ハイパック密 度勾配遠心法が、確立された手技による赤血球および好中球からＰＢＭＣを分離
するべく用いられる。細胞は、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足した、改造さ
れたＡＩＭ−Ｖ（２mMグルタミン、１０μg／mlの硫酸ゲンタマイシン、５０μg
／mlのストレプトマイシンを加えたAIM-V(ギブコ）からなる）を用いて洗浄され
る。Ｔ細胞の濃縮は、カラムまたは磁気ビーズに結合された適切なモノクローナ
ル抗体によるネガティブまたはポジティブな選別により、標準的な技術を用いて
行なわれる。細胞のアリコートが、所望の細胞表面の表現型について分析される
（たとえば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１４、その他）。
【０１０１】 一般的に、表面マーカーの発現はＴ細胞の同定ならびに精製を容易にする。Ｔ
細胞の同定ならびに単離法は、ＦＡＣＳ、カラムクロマトグラフ法、磁気ビーズ
を用いたより分け、ウェスタン法、Ｘ線撮影法、電気泳動法、キャピラリー電気
泳動法、高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフ法（ＴＬ
Ｃ）、超拡散クロマトグラフ法、その他と、液体またはゲル沈降反応、免疫拡散
法（一重または二重）、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）、
エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光分析法その他を含む。免疫
学的ならびにイムノアッセイの方法についての全般的な総説は、StitesおよびTe
rr（共編）1991 Basic and Clinical Immunology（第７版）およびPaul（前出 ）を参照。抗原を選択するべくいかに抗体を作成するかについての議論は、たと
えば、Coligan（1991）Current Protocols in Immunology ウィリー／グリーン 、ニューヨーク州；およびHarlowおよびLane（1989）Antibodies : A Laborator
y Manual コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク州；Stites等（共編 ）Basic and Clinical Immunology（第４版）参照のこと。
細胞の同定ならびに単離法は、ＦＡＣＳ、カラムクロマトグラフ法、磁気ビーズ
を用いたより分け、ウェスタン法、Ｘ線撮影法、電気泳動法、キャピラリー電気
泳動法、高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフ法（ＴＬ
Ｃ）、超拡散クロマトグラフ法、その他と、液体またはゲル沈降反応、免疫拡散
法（一重または二重）、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）、
エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光分析法その他を含む。免疫
学的ならびにイムノアッセイの方法についての全般的な総説は、StitesおよびTe
rr（共編）1991 Basic and Clinical Immunology（第７版）およびPaul（前出 ）を参照。抗原を選択するべくいかに抗体を作成するかについての議論は、たと
えば、Coligan（1991）Current Protocols in Immunology ウィリー／グリーン 、ニューヨーク州；およびHarlowおよびLane（1989）Antibodies : A Laborator
y Manual コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク州；Stites等（共編 ）Basic and Clinical Immunology（第４版）参照のこと。
【０１０２】 上記のエクスヴィヴォでの使用に加えて、本発明のパッケージング細胞系なら
びに本発明のＨＩＶパッケージャブル核酸は、全般的にクローニング法において
有用である。パッケージャブル核酸は、ＦＩＶ粒子内にパッケージングされ、イ
ンヴィトロまたはインヴィヴォにおいてＦＩＶ感染性細胞（たとえばネコ造血細
胞）を形質転換するべく使用される。このことは熟練者に、たとえば薬物発見分
析法において、あるいは遺伝子調節の研究における道具として、あるいは一般的
なクローニングベクターとして、選択された核酸を用いて細胞を形質転換するた
めの技術ならびにベクターを提供する。
びに本発明のＨＩＶパッケージャブル核酸は、全般的にクローニング法において
有用である。パッケージャブル核酸は、ＦＩＶ粒子内にパッケージングされ、イ
ンヴィトロまたはインヴィヴォにおいてＦＩＶ感染性細胞（たとえばネコ造血細
胞）を形質転換するべく使用される。このことは熟練者に、たとえば薬物発見分
析法において、あるいは遺伝子調節の研究における道具として、あるいは一般的
なクローニングベクターとして、選択された核酸を用いて細胞を形質転換するた
めの技術ならびにベクターを提供する。
【０１０３】 （インヴィヴォにおける形質転換） 治療用遺伝子を含んでいる非霊長類レンチウイルス粒子は、インヴィヴォにお
ける細胞の形質導入のため、個体に直接投与することができる。投与は、分子を
最終的に血液または組織細胞と接するべく導入するために通常用いられるいずれ
かの経路による。ＦＩＶまたは他の非霊長類レンチウイルス粒子にパッケージン
グされたパッケージャブル核酸は、動物ならびにヒトの患者におけるＡＩＤＳな
どのウイルスに媒介される疾患を、治療ならびに予防するべく用いられる。パッ
ケージングされた核酸はいずれかの適切な方法で投与され、好ましくは製薬上許
容される担体と共に投与される。かかるパッケージャブル核酸を、本発明の状況
において患者へ投与する適切な方法は入手可能であり、また、特定の組成物の投
与に一より多くの経路が使用可能であっても、ある特定の経路が他の経路よりさ
らに速効性の、かつ有効な反応をしばしば提供することが可能である。
ける細胞の形質導入のため、個体に直接投与することができる。投与は、分子を
最終的に血液または組織細胞と接するべく導入するために通常用いられるいずれ
かの経路による。ＦＩＶまたは他の非霊長類レンチウイルス粒子にパッケージン
グされたパッケージャブル核酸は、動物ならびにヒトの患者におけるＡＩＤＳな
どのウイルスに媒介される疾患を、治療ならびに予防するべく用いられる。パッ
ケージングされた核酸はいずれかの適切な方法で投与され、好ましくは製薬上許
容される担体と共に投与される。かかるパッケージャブル核酸を、本発明の状況
において患者へ投与する適切な方法は入手可能であり、また、特定の組成物の投
与に一より多くの経路が使用可能であっても、ある特定の経路が他の経路よりさ
らに速効性の、かつ有効な反応をしばしば提供することが可能である。
【０１０４】 製剤上許容される担体は、部分的には投与される特定の組成物により、ならび
に当該組成物の投与に用いられる特定の方法により決定される。したがって、本
発明の製剤組成物の適切な製剤には幅広い多様性がある。
に当該組成物の投与に用いられる特定の方法により決定される。したがって、本
発明の製剤組成物の適切な製剤には幅広い多様性がある。
【０１０５】 パッケージングされた核酸は、単独または他の適当な組成物と組み合わせて、
吸入により投与されるべく、エアロゾル製剤（すなわちそれらは「噴霧状」にさ
れ得る）に製造されてもよい。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、
プロパン、窒素、その他のような加圧された許容される噴射剤の中に入れられて
もよい。
吸入により投与されるべく、エアロゾル製剤（すなわちそれらは「噴霧状」にさ
れ得る）に製造されてもよい。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、
プロパン、窒素、その他のような加圧された許容される噴射剤の中に入れられて
もよい。
【０１０６】 たとえば関節内（関節の中へ）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下
経路等の非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および当該
製剤を所期の患者の血液と等張にする溶質を含有することが可能な、水性および
非水性の等張の無菌注入溶液と、懸濁化剤、可溶化剤、糊料、安定化剤、および
保存料を含有することが可能な水性または非水性の無菌懸濁液とを含む。非経口
投与ならびに静脈内投与は、好ましい投与法である。パッケージングされた核酸
の製剤は、アンプルおよびバイアル等の、単位用量または多用量の密封容器に入
れて提供される。
経路等の非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および当該
製剤を所期の患者の血液と等張にする溶質を含有することが可能な、水性および
非水性の等張の無菌注入溶液と、懸濁化剤、可溶化剤、糊料、安定化剤、および
保存料を含有することが可能な水性または非水性の無菌懸濁液とを含む。非経口
投与ならびに静脈内投与は、好ましい投与法である。パッケージングされた核酸
の製剤は、アンプルおよびバイアル等の、単位用量または多用量の密封容器に入
れて提供される。
【０１０７】 エクスヴィヴォの治療状況において、上記のようにパッケージングされた核酸
により形質導入された細胞もまた、静脈内かまたは上記のように非経口に投与さ
れてよい。
により形質導入された細胞もまた、静脈内かまたは上記のように非経口に投与さ
れてよい。
【０１０８】 本発明の状況において患者に投与される用量は、時間を通じて患者に有益な治
療反応を生じさせるべく、あるいは病原体による感染を阻害するべく十分である
べきである。この用量は、用いられた特定のベクターの効能と、患者の状態、な
らびに治療されるべき患者の体重および表面積により決定されることになる。用
量の大きさはまた、特定のベクターの投与に伴う逆の副作用の存在、性質、およ
び大きさと、特定の患者において形質導入された細胞の型とによって決定されて
もよい。
療反応を生じさせるべく、あるいは病原体による感染を阻害するべく十分である
べきである。この用量は、用いられた特定のベクターの効能と、患者の状態、な
らびに治療されるべき患者の体重および表面積により決定されることになる。用
量の大きさはまた、特定のベクターの投与に伴う逆の副作用の存在、性質、およ
び大きさと、特定の患者において形質導入された細胞の型とによって決定されて
もよい。
【０１０９】 ＡＩＤＳ等のウイルスに媒介される疾患の治療または予防法においては、投与
されるベクターの有効量の決定に際し、内科医は循環している血漿レベル、ベク
ターの毒性、疾患の悪化、および抗ベクター抗体の産生を評価する。一般的に、
ベクターからのむきだしの核酸と同等の用量は、典型的な７０キログラムの患者
について約１μgないし１００μgであり、レトロウイルス粒子を含むベクターの
用量は、阻害剤である核酸の同等量を生じるべく算出される。本発明のベクター
は、ウイルスに媒介される状態に対する、細胞毒性薬剤、ヌクレオチド類似体、
および生物学的反応の調節剤を含むいかなる既知の通常の治療法も補足すること
ができる。
されるベクターの有効量の決定に際し、内科医は循環している血漿レベル、ベク
ターの毒性、疾患の悪化、および抗ベクター抗体の産生を評価する。一般的に、
ベクターからのむきだしの核酸と同等の用量は、典型的な７０キログラムの患者
について約１μgないし１００μgであり、レトロウイルス粒子を含むベクターの
用量は、阻害剤である核酸の同等量を生じるべく算出される。本発明のベクター
は、ウイルスに媒介される状態に対する、細胞毒性薬剤、ヌクレオチド類似体、
および生物学的反応の調節剤を含むいかなる既知の通常の治療法も補足すること
ができる。
【０１１０】 投与については、本発明の阻害剤および形質導入された細胞は、阻害剤のＬＤ
-５０、ベクター、または形質導入された細胞の型と、患者の質量ならびに総体 的な健康状態に適合するようにした種々の濃度における、阻害剤、ベクター、ま
たは細胞型の副作用とにより決定される割合で投与されてよい。
-５０、ベクター、または形質導入された細胞の型と、患者の質量ならびに総体 的な健康状態に適合するようにした種々の濃度における、阻害剤、ベクター、ま
たは細胞型の副作用とにより決定される割合で投与されてよい。
【０１１１】 形質導入された細胞の導入に関しては、注入に先立ち、血液試料を取得して分
析用に取っておく。１x １０8個と１x１０12個の間の形質導入された細胞を、６
０ないし２００分間にわたり静脈内へ注入する。バイタルサインおよびパルス酸
素測定法による酸素飽和度を詳しく監視する。血液試料は、注入の５分および１
時間後に取得し、後の分析用に取っておく。白血球フェレーシス、形質導入、お
よび再注入を、合計４ないし６回の治療について、２ないし３ヵ月ごとに一年周
期で繰り返す。初回の治療の後、外来患者の基準に基づき、臨床医の自由裁量で
注入を行なうことができる。もし外来患者として再注入が与えられる場合には、
治療の後、患者は少なくとも４、また好ましくは８時間にわたり監視される。
析用に取っておく。１x １０8個と１x１０12個の間の形質導入された細胞を、６
０ないし２００分間にわたり静脈内へ注入する。バイタルサインおよびパルス酸
素測定法による酸素飽和度を詳しく監視する。血液試料は、注入の５分および１
時間後に取得し、後の分析用に取っておく。白血球フェレーシス、形質導入、お
よび再注入を、合計４ないし６回の治療について、２ないし３ヵ月ごとに一年周
期で繰り返す。初回の治療の後、外来患者の基準に基づき、臨床医の自由裁量で
注入を行なうことができる。もし外来患者として再注入が与えられる場合には、
治療の後、患者は少なくとも４、また好ましくは８時間にわたり監視される。
【０１１２】 形質導入された、細胞は確立された方法により再注入用に調製される。Abraha
msen等（1991）J. Clin. Apheresis 6 : 48 - 53；Carter等（1988）J. Clin. A
rpheresis 4 : 113 - 117；Aebersold等（1988), J. Immunol. Methods 112 : 1
- 7；Muul等（1987）J. Immunol. Methods 101: 171 - 181、およびCarter等（
1987）Transfusion 27 : 362 - 365参照。約２ないし４週間の培養期間の後、細
胞は１x １０8個と１x１０12個の間であるはずである。この点については、細胞
の生育特性は患者ごとに、また細胞型ごとに異なっている。形質導入された細胞
の再注入の約７２時間前に、表現型の分析用、ならびに治療用薬剤を発現してい
る細胞のパーセンテージ用にアリコートをとる。
msen等（1991）J. Clin. Apheresis 6 : 48 - 53；Carter等（1988）J. Clin. A
rpheresis 4 : 113 - 117；Aebersold等（1988), J. Immunol. Methods 112 : 1
- 7；Muul等（1987）J. Immunol. Methods 101: 171 - 181、およびCarter等（
1987）Transfusion 27 : 362 - 365参照。約２ないし４週間の培養期間の後、細
胞は１x １０8個と１x１０12個の間であるはずである。この点については、細胞
の生育特性は患者ごとに、また細胞型ごとに異なっている。形質導入された細胞
の再注入の約７２時間前に、表現型の分析用、ならびに治療用薬剤を発現してい
る細胞のパーセンテージ用にアリコートをとる。
【０１１３】 もしベクターまたは形質導入された細胞の注入を受けている患者が発熱、冷え
、または筋肉痛を生じる場合には、彼／彼女は適切な用量のアスピリン、イブプ
ロフェン、またはアセトアミノフェンを受ける。注入に対し、発熱、筋肉痛、お
よび冷え等の反応を経験する患者は、以降の注入の３０分前に、アスピリン、ア
セトアミノフェン、またはジフェンヒドラミンのいずれかを前投薬される。解熱
剤および抗ヒスタミン剤に対して速やかに反応しない、さらに重い冷えおよび筋
肉痛には、メペリジンが用いられる。細胞の注入は、反応の激しさに依存して遅
くするかまたは中断される。
、または筋肉痛を生じる場合には、彼／彼女は適切な用量のアスピリン、イブプ
ロフェン、またはアセトアミノフェンを受ける。注入に対し、発熱、筋肉痛、お
よび冷え等の反応を経験する患者は、以降の注入の３０分前に、アスピリン、ア
セトアミノフェン、またはジフェンヒドラミンのいずれかを前投薬される。解熱
剤および抗ヒスタミン剤に対して速やかに反応しない、さらに重い冷えおよび筋
肉痛には、メペリジンが用いられる。細胞の注入は、反応の激しさに依存して遅
くするかまたは中断される。
【０１１４】 （ウイルス阻害剤） 使用の意図するところがウイルス（たとえばＨＩＶ）の阻害である場合には、
特殊化されたウイルス阻害剤が典型的には本発明のパッケージングされた核酸に
コードされる。したがって、核酸の構築ならびに維持に適用できる技術は、本発
明の阻害剤に適合する。本発明のウイルス阻害剤に任意に取り込まれる抗ウイル
ス剤は、アンチセンス遺伝子、リボザイム、おとり遺伝子、およびトランスドミ
ナントな核酸である。
特殊化されたウイルス阻害剤が典型的には本発明のパッケージングされた核酸に
コードされる。したがって、核酸の構築ならびに維持に適用できる技術は、本発
明の阻害剤に適合する。本発明のウイルス阻害剤に任意に取り込まれる抗ウイル
ス剤は、アンチセンス遺伝子、リボザイム、おとり遺伝子、およびトランスドミ
ナントな核酸である。
【０１１５】 アンチセンス核酸は、発現に際し、特定のＲＮＡ分子か、転写プロモーターか
、または遺伝子のセンス鎖とハイブリッド形成する核酸である。ハイブリッド形
成により、アンチセンス核酸は相補的な核酸の転写か、ｍＲＮＡの翻訳か、また
は触媒ＲＮＡの機能を妨げる。本発明に有用なアンチセンス分子は、ウイルス遺
伝子転写物とハイブリッド形成するものを含む。アンチセンス分子の二つの標的
配列は、ＨＩＶ遺伝子の第一および第二のエクソン、ｔａｔおよびｒｅｖである
。ChatterjeeおよびWong、前出、ならびにMarcus-Sekura（Analytical Biochemi
stry（1988）172, 289 - 285）は、遺伝子の発現を阻止または修飾するアンチセ
ンス遺伝子の使用を記述している。
、または遺伝子のセンス鎖とハイブリッド形成する核酸である。ハイブリッド形
成により、アンチセンス核酸は相補的な核酸の転写か、ｍＲＮＡの翻訳か、また
は触媒ＲＮＡの機能を妨げる。本発明に有用なアンチセンス分子は、ウイルス遺
伝子転写物とハイブリッド形成するものを含む。アンチセンス分子の二つの標的
配列は、ＨＩＶ遺伝子の第一および第二のエクソン、ｔａｔおよびｒｅｖである
。ChatterjeeおよびWong、前出、ならびにMarcus-Sekura（Analytical Biochemi
stry（1988）172, 289 - 285）は、遺伝子の発現を阻止または修飾するアンチセ
ンス遺伝子の使用を記述している。
【０１１６】 リボザイムは触媒性のＲＮＡ分子であり、特定の核酸配列を有する他のＲＮＡ
分子を切断する。ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＲＮアーゼ
Ｐリボザイム（すなわち、原核生物または真核生物からの天然に生じたＲＮアー
ゼＰリボザイムに由来するリボザイム）を含むリボザイムの一般的な構築法は、
この技術では周知である。Castanotto等（1994）Adavnces in Pharmacology 25
: 289 - 317は、グループＩのリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピ ンリバザイム、ＲＮアーゼＰ、およびアクスヘッド(axhead)リボザイムを含む全
般的なリボザイムを提供し総説している。本発明に有用なリボザイムは、ウイル
ス転写物、特にＨＩＶ遺伝子転写物を切断するものを含む。Ojwang等、Proc. Na
tl. Acad. Sci., U. S. A., 89 : 10802 - 06（1992）；Wong-Staal等（PCT／US
94／05700)；Ojwang等（1993）Proc Natl Acad Sci USA 90 : 6340 - 6344；Yam
ada等（1994）Human Gene Therapy 1 : 39 - 45；Leavitt等（1995）Proc Natl
Acad Sci USA 92 : 699 - 703；Leavitt等（1994) Human Gene Therapy 5 : 115
1 ？ 1120；Yamada等（1994）Virology205 : 121 - 126、およびDropulic等（19
92）Journal of Virology 66(3) : 1432 - 1441は、ＨＩＶ-１に特異的なヘアピ
ンおよびハンマーヘッドリボザイムを提供している。
分子を切断する。ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＲＮアーゼ
Ｐリボザイム（すなわち、原核生物または真核生物からの天然に生じたＲＮアー
ゼＰリボザイムに由来するリボザイム）を含むリボザイムの一般的な構築法は、
この技術では周知である。Castanotto等（1994）Adavnces in Pharmacology 25
: 289 - 317は、グループＩのリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピ ンリバザイム、ＲＮアーゼＰ、およびアクスヘッド(axhead)リボザイムを含む全
般的なリボザイムを提供し総説している。本発明に有用なリボザイムは、ウイル
ス転写物、特にＨＩＶ遺伝子転写物を切断するものを含む。Ojwang等、Proc. Na
tl. Acad. Sci., U. S. A., 89 : 10802 - 06（1992）；Wong-Staal等（PCT／US
94／05700)；Ojwang等（1993）Proc Natl Acad Sci USA 90 : 6340 - 6344；Yam
ada等（1994）Human Gene Therapy 1 : 39 - 45；Leavitt等（1995）Proc Natl
Acad Sci USA 92 : 699 - 703；Leavitt等（1994) Human Gene Therapy 5 : 115
1 ？ 1120；Yamada等（1994）Virology205 : 121 - 126、およびDropulic等（19
92）Journal of Virology 66(3) : 1432 - 1441は、ＨＩＶ-１に特異的なヘアピ
ンおよびハンマーヘッドリボザイムを提供している。
【０１１７】 手短にいえば、本発明に特に有用な二つの型のリボザイムは、ヘアピンリボザ
イムとハンマーヘッドリボザイムを含む。ハンマーヘッドリボザイム（Rossie等
（1991）Pharmac. Ther. 50 : 245 - 254；ForsterおよびSymons（1987）Cell 4
8 : 211 - 220；HaseloffおよびGerlacn（1988）Nature328 : 596 - 600；Walbo
tおよびBruening（1988）Nture334 : 196；HaseloffおよびGerlach（1988）Natu
re 334 : 585；およびDropulic等およびCastanotto等、およびそれに引用された
参考文献、前出、参照のこと）およびヘアピンリボザイム（Hampel等（1990）Nu
cl. Acids Res. 18 : 229 - 304；Hempel等（1990）欧州特許公告第0 360 257号
；1993年10月３日発行の合衆国特許第5,254,678号；Wong-Staal等、PCT／US94／
05700；Ojwang等（1993）Proc Natl Acad Sci USA 90 : 6340 - 6344；Yamada等
（1994）Human Gene Therapy 1 : 39 - 45；Leavitt等（1995）Proc Natl Acad
Sci USA 92 : 699 - 703；Leavitt等（1994）Human Gene Therapy 5 : 1151 ？
1120；およびYamada等（1994）Virology 205 : 121 - 126参照）は、アンチセン
スおよびエンドリボヌレオチダーゼ活性を有する触媒分子である。ＨＩＶ ＲＮ Ａに向けられたハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムの細胞内で
の発現は、ＨＩＶ感染に対する有意な抵抗性を与えることが示されている。この
ようなリボザイムは、ＨＩＶゲノムの一部、または当該ゲノムにコード化された
核酸を標的とするべく構築される。ＨＩＶ-１の好ましい標的部位はＵ５領域と 、ポリメラーゼ遺伝子を含む。ＧＵＣおよびＧＵＡ切断性のトランスアクティブ
な抗ＨＩＶリボザイムが知られている。
イムとハンマーヘッドリボザイムを含む。ハンマーヘッドリボザイム（Rossie等
（1991）Pharmac. Ther. 50 : 245 - 254；ForsterおよびSymons（1987）Cell 4
8 : 211 - 220；HaseloffおよびGerlacn（1988）Nature328 : 596 - 600；Walbo
tおよびBruening（1988）Nture334 : 196；HaseloffおよびGerlach（1988）Natu
re 334 : 585；およびDropulic等およびCastanotto等、およびそれに引用された
参考文献、前出、参照のこと）およびヘアピンリボザイム（Hampel等（1990）Nu
cl. Acids Res. 18 : 229 - 304；Hempel等（1990）欧州特許公告第0 360 257号
；1993年10月３日発行の合衆国特許第5,254,678号；Wong-Staal等、PCT／US94／
05700；Ojwang等（1993）Proc Natl Acad Sci USA 90 : 6340 - 6344；Yamada等
（1994）Human Gene Therapy 1 : 39 - 45；Leavitt等（1995）Proc Natl Acad
Sci USA 92 : 699 - 703；Leavitt等（1994）Human Gene Therapy 5 : 1151 ？
1120；およびYamada等（1994）Virology 205 : 121 - 126参照）は、アンチセン
スおよびエンドリボヌレオチダーゼ活性を有する触媒分子である。ＨＩＶ ＲＮ Ａに向けられたハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムの細胞内で
の発現は、ＨＩＶ感染に対する有意な抵抗性を与えることが示されている。この
ようなリボザイムは、ＨＩＶゲノムの一部、または当該ゲノムにコード化された
核酸を標的とするべく構築される。ＨＩＶ-１の好ましい標的部位はＵ５領域と 、ポリメラーゼ遺伝子を含む。ＧＵＣおよびＧＵＡ切断性のトランスアクティブ
な抗ＨＩＶリボザイムが知られている。
【０１１８】 おとり核酸は、調節核酸結合タンパク質（すなわち、転写因子、細胞転送因子
、その他）によって認識される配列を有する核酸である。発現に際し、転写因子
はゲノム中のその天然の標的よりもむしろ、おとり核酸に結合する。有用なおと
り核酸配列は、ウイルスの転写因子が結合するいかなる配列をも含む。たとえば
、ｔａｔタンパク質が結合するＴＡＲ配列、およびｒｅｖタンパク質が結合する
ＨＩＶ ＲＲＥ配列（特にＳＬII配列）は、おとり核酸としての使用に適した配 列である。
、その他）によって認識される配列を有する核酸である。発現に際し、転写因子
はゲノム中のその天然の標的よりもむしろ、おとり核酸に結合する。有用なおと
り核酸配列は、ウイルスの転写因子が結合するいかなる配列をも含む。たとえば
、ｔａｔタンパク質が結合するＴＡＲ配列、およびｒｅｖタンパク質が結合する
ＨＩＶ ＲＲＥ配列（特にＳＬII配列）は、おとり核酸としての使用に適した配 列である。
【０１１９】 トランスドミナントな核酸は一つのタンパク質を発現する核酸であって、トラ
ンス相補性に供給された場合には、その表現型が当該タンパク質の生来の形態の
効果に打ち勝つこととなる。たとえば、ｔａｔおよびｒｅｖはＴＡＲおよびＲＲ
Ｅにそれぞれ結合する能力は保持するが、これらのタンパク質の適切な調整機能
を欠くべく突然変異されることが可能である。特にｒｅｖは、適切な正常の転写
調節に必須であるＣ末端に近いロイシンに富むドメインを除去することにより、
トランスドメインにされることが可能である。Ｔａｔのトランスドミナントタン
パク質は、ＲＮＡ結合性／核局在性ドメインにおける突然変異によって生じるこ
とが可能である。欠損ＨＩＶ分子クローンの相互の相補性は、たとえば、Lori等
（1992）Journal of virology 66 (9) 5553 - 5560に記述されている。
ンス相補性に供給された場合には、その表現型が当該タンパク質の生来の形態の
効果に打ち勝つこととなる。たとえば、ｔａｔおよびｒｅｖはＴＡＲおよびＲＲ
Ｅにそれぞれ結合する能力は保持するが、これらのタンパク質の適切な調整機能
を欠くべく突然変異されることが可能である。特にｒｅｖは、適切な正常の転写
調節に必須であるＣ末端に近いロイシンに富むドメインを除去することにより、
トランスドメインにされることが可能である。Ｔａｔのトランスドミナントタン
パク質は、ＲＮＡ結合性／核局在性ドメインにおける突然変異によって生じるこ
とが可能である。欠損ＨＩＶ分子クローンの相互の相補性は、たとえば、Lori等
（1992）Journal of virology 66 (9) 5553 - 5560に記述されている。
【０１２０】 （実施例） 以下の実施例は説明のためだけに提供するものであって、限定のために提供す
るものではない。熟練者は、重大でない多様なパラメータを容易に認識し、そし
てこれを変更又は修正して本質的に類似の結果を得るであろう。 実施例１：ＦＩＶパッケージングプラスミド及びベクターの構築
るものではない。熟練者は、重大でない多様なパラメータを容易に認識し、そし
てこれを変更又は修正して本質的に類似の結果を得るであろう。 実施例１：ＦＩＶパッケージングプラスミド及びベクターの構築
【０１２１】 ＦＩＶの長い末端反復配列（ＬＴＲ）はヒト細胞内で不活性であるか又はごく
僅かに活性である。非霊長類レンチウイルスタンパク質の全長補体をヒト細胞内
においてトランスでそして複製欠陥型で高レベルで発現する先行方法はこれまで
に記載されていない。それ故、ヒト細胞内において複製欠陥態様でトランスで高
レベルのＦＩＶタンパク質を発現させるため且つ複製に必要とされるＦＩＶの重
要な部分を置換して安全性を高めるために、ＦＩＶクローン３４ＴＦ１０をＥｓ
ｐＩで開裂し、２００μＭのｄＮＴＰの存在下Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理
し、次いでＳａｃＩで開裂し、２００μＭのｄＮＴＰの存在下Ｔ４ ＤＮＡポリ メラーゼで処理し、そして得られたウイルスコード化領域含有（しかしＬＴＲは
含有していない）フラグメントをゲル精製した。次いで、このフラグメントをＮ
ｏｔＩ及びＸｂａＩで開裂し、Klenow酵素で処理し、仔ウシ腸アルカリホスファ
ターゼ処理したＣＭＶ−発現プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶのバックボーンに平滑末
端連結させた。得られたプラスミド（ＣＦ１）は多重診断的制限消化によって確
認された。ＣＦ１はＣＭＶプロモーターに続いて、ＬＴＲ後の５’側リーダーの
遠位部（主要スプライスドナーの９３ヌクレオチド上流）からＦＩＶの最後のＯ
ＲＦ（Ｒｅｖ）の３８ヌクレオチド下流までのＦＩＶゲノムを含有している。
僅かに活性である。非霊長類レンチウイルスタンパク質の全長補体をヒト細胞内
においてトランスでそして複製欠陥型で高レベルで発現する先行方法はこれまで
に記載されていない。それ故、ヒト細胞内において複製欠陥態様でトランスで高
レベルのＦＩＶタンパク質を発現させるため且つ複製に必要とされるＦＩＶの重
要な部分を置換して安全性を高めるために、ＦＩＶクローン３４ＴＦ１０をＥｓ
ｐＩで開裂し、２００μＭのｄＮＴＰの存在下Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理
し、次いでＳａｃＩで開裂し、２００μＭのｄＮＴＰの存在下Ｔ４ ＤＮＡポリ メラーゼで処理し、そして得られたウイルスコード化領域含有（しかしＬＴＲは
含有していない）フラグメントをゲル精製した。次いで、このフラグメントをＮ
ｏｔＩ及びＸｂａＩで開裂し、Klenow酵素で処理し、仔ウシ腸アルカリホスファ
ターゼ処理したＣＭＶ−発現プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶのバックボーンに平滑末
端連結させた。得られたプラスミド（ＣＦ１）は多重診断的制限消化によって確
認された。ＣＦ１はＣＭＶプロモーターに続いて、ＬＴＲ後の５’側リーダーの
遠位部（主要スプライスドナーの９３ヌクレオチド上流）からＦＩＶの最後のＯ
ＲＦ（Ｒｅｖ）の３８ヌクレオチド下流までのＦＩＶゲノムを含有している。
【０１２２】 ＦＩＶクローン３４ＴＦ１０は、このＦＩＶクローンが既にＯＲＦ２遺伝子を
不活性化する突然変異を有しているという理由で本研究用に選択した。タルッボ
ット・アール．エル．（Talbott, R.L.）他（1989年）Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86、5743〜5747参照。ＯＲＦ２は推定上のトランスアクチベーターであり、
そしてこれはネコ末梢血リンパ球の複製に必要であることが示されている。かく
して、３４ＴＦ１０は弱毒化ウイルスであり、この弱毒化はベクターの性能に影
響を与えないで野生型病原性ＦＩＶの危険性を更に最小限にするので本発明にと
って有益である。しかしながら、同様の特性を有する他のクローンは、組換え方
法を使用して野生型ウイルスを同様に不活性化することによって入手できるか又
は容易に誘導することができる。
不活性化する突然変異を有しているという理由で本研究用に選択した。タルッボ
ット・アール．エル．（Talbott, R.L.）他（1989年）Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86、5743〜5747参照。ＯＲＦ２は推定上のトランスアクチベーターであり、
そしてこれはネコ末梢血リンパ球の複製に必要であることが示されている。かく
して、３４ＴＦ１０は弱毒化ウイルスであり、この弱毒化はベクターの性能に影
響を与えないで野生型病原性ＦＩＶの危険性を更に最小限にするので本発明にと
って有益である。しかしながら、同様の特性を有する他のクローンは、組換え方
法を使用して野生型ウイルスを同様に不活性化することによって入手できるか又
は容易に誘導することができる。
【０１２３】 リン酸カルシウム共沈殿法でＣＦ１をヒトＨｅＬａ、２９３及び２９３−Ｔ腎
細胞中にトランスフェクションすると、５０から数百個の核を含有する合胞体細
胞（エンベロープ発現細胞と他の細胞との融合によって産生される多核巨大細胞
）の広範囲に及ぶ出現と培養上静中の高レベル（百万ｃｐｍを超える）の逆転写
酵素の産生いう驚くべき結果が得られた。実際、本発明者はヒト２９３及び２９
３−Ｔ細胞並びにＨｅＬａ単層培養物がＣＦ１による一過性トランスフェクショ
ン後に（例えば、７５ｃｍ2のフラスコ中で１０μｇのＣＦ１によるトランスフ ェクションによって）合胞体細胞によって再現可能的に９０〜９５％破壊される
ことを見いだしたが、設計されそして予期されたように、感染又は複製可能イル
スは産生されない。すなわち、大量のＣＦ１でトランスフェクションした２９３
−Ｔ細胞上清液を新鮮な２９３若しくは２９３−Ｔ細胞又はクランダールネコ腎
細胞に移しても合胞体細胞又はＲＴ産生は生じなかった。ＦＩＶエンベロープの
欠失（詳細については以下参照）を除いてＣＦ１と同一のＣＦ１△ｅｎｖは合胞
体細胞を生じさせないが、高レベルの逆転写酵素などのベクターのパッケージン
グに必要とされるウイルス機能は有していた。ＦＩＶプロモーターがヒト細胞内
で活性のプロモーターによって特異的に置換されている場合、上記の先例のない
結果から、Ｒｅｖ／ＲＲＥ調節軸、ＦＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ産生及びエンベロー プ介在性合胞体細胞を含めてタンパク質産生に必要なＦＩＶの機能は全てヒト細
胞内で生じる可能性があるという新規な識見が得られた。
細胞中にトランスフェクションすると、５０から数百個の核を含有する合胞体細
胞（エンベロープ発現細胞と他の細胞との融合によって産生される多核巨大細胞
）の広範囲に及ぶ出現と培養上静中の高レベル（百万ｃｐｍを超える）の逆転写
酵素の産生いう驚くべき結果が得られた。実際、本発明者はヒト２９３及び２９
３−Ｔ細胞並びにＨｅＬａ単層培養物がＣＦ１による一過性トランスフェクショ
ン後に（例えば、７５ｃｍ2のフラスコ中で１０μｇのＣＦ１によるトランスフ ェクションによって）合胞体細胞によって再現可能的に９０〜９５％破壊される
ことを見いだしたが、設計されそして予期されたように、感染又は複製可能イル
スは産生されない。すなわち、大量のＣＦ１でトランスフェクションした２９３
−Ｔ細胞上清液を新鮮な２９３若しくは２９３−Ｔ細胞又はクランダールネコ腎
細胞に移しても合胞体細胞又はＲＴ産生は生じなかった。ＦＩＶエンベロープの
欠失（詳細については以下参照）を除いてＣＦ１と同一のＣＦ１△ｅｎｖは合胞
体細胞を生じさせないが、高レベルの逆転写酵素などのベクターのパッケージン
グに必要とされるウイルス機能は有していた。ＦＩＶプロモーターがヒト細胞内
で活性のプロモーターによって特異的に置換されている場合、上記の先例のない
結果から、Ｒｅｖ／ＲＲＥ調節軸、ＦＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ産生及びエンベロー プ介在性合胞体細胞を含めてタンパク質産生に必要なＦＩＶの機能は全てヒト細
胞内で生じる可能性があるという新規な識見が得られた。
【０１２４】 ＣＦ１及びＣＴ５（下記）をヒト細胞に導入することにより産生された合胞体
細胞は、ＦＩＶに感染したネコから得られた血漿の１：１０００希釈物を含める
ことによって完全に阻害された（１：１０，０００から１：３０，０００の間の
ＩＣ５０）が、感染していない飼い猫から得られた血漿ではどの希釈物でも（１
：１０であっても）全く阻害されなかった。抗ＦＩＶ抗体によるこの特異的な阻
害によって、上記合胞体細胞がＦＩＶエンベロープ特異的であるという更なる証
拠が提供された。
細胞は、ＦＩＶに感染したネコから得られた血漿の１：１０００希釈物を含める
ことによって完全に阻害された（１：１０，０００から１：３０，０００の間の
ＩＣ５０）が、感染していない飼い猫から得られた血漿ではどの希釈物でも（１
：１０であっても）全く阻害されなかった。抗ＦＩＶ抗体によるこの特異的な阻
害によって、上記合胞体細胞がＦＩＶエンベロープ特異的であるという更なる証
拠が提供された。
【０１２５】 ３５Ｓ−メチオニン及び３５Ｓ−システイン−標識し、ＣＦ１及び親ウイルス
（３４ＴＦ１０）でトランスフェクションした、ヒト（２９３−Ｔ、ＨｅＬａ）
及びネコ（ＣＲＦＫ）細胞を放射線免疫沈降法により解析すると、、ＦＩＶ＋ど
ちらかのプラスミドでトランスフェクションしたＣＲＦＫ細胞からもＦＩＶウイ
ルスタンパク質はＦＩＶ陽性血清で特異的に免疫沈降できることが示された。ヒ
ト細胞では、３４ＴＦ１０は殆ど又は全くタンパク質を産生せず、これはＦＩＶ
プロモーターの活性がヒトでは最小限であることを示しているが、ＣＦ１は大量
のＦＩＶタンパク質を産生した。これらのタンパク質は対照プラスミドでトラン
スフェクションした同じ細胞の免疫沈降物中には存在しなかったので、ＦＩＶに
特異的であることが示された。
（３４ＴＦ１０）でトランスフェクションした、ヒト（２９３−Ｔ、ＨｅＬａ）
及びネコ（ＣＲＦＫ）細胞を放射線免疫沈降法により解析すると、、ＦＩＶ＋ど
ちらかのプラスミドでトランスフェクションしたＣＲＦＫ細胞からもＦＩＶウイ
ルスタンパク質はＦＩＶ陽性血清で特異的に免疫沈降できることが示された。ヒ
ト細胞では、３４ＴＦ１０は殆ど又は全くタンパク質を産生せず、これはＦＩＶ
プロモーターの活性がヒトでは最小限であることを示しているが、ＣＦ１は大量
のＦＩＶタンパク質を産生した。これらのタンパク質は対照プラスミドでトラン
スフェクションした同じ細胞の免疫沈降物中には存在しなかったので、ＦＩＶに
特異的であることが示された。
【０１２６】 異種（例えば、ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープを使用できるように、ＣＦ１由来の
ＦＩＶエンベロープ（ｅｎｖ遺伝子の産生物）の特異的欠失を３パート結合によ
って行った。すなわち、ＣＦ１はＰｆｌｍＩ（これはＣＦ１中に４回存在する）
で切断した。ｅｎｖ遺伝子内の問題の２つのＰｆｌＭ部位は共存できず、そして
これらのＰｆｌＭ部位を単に平滑末端化しただけでフレーム内ｅｎｖ欠失がもた
らされるであろうから、ＰｆｌＭ消化物をＴ４ポリメラーゼで処理して３’Ｐｆ
ｌｍＩ突出部を除去しそしてフレーム・シフト化ｓａｃＩＩリンカーに連結し、
ＳａｃＩＩで消化し、そしてゲル精製した。次いで、ＰｆｌＭＩ／ＳａｃＩＩ連
結消化物の分別物をｓａｃＩＩで切断し、そしてｐｖｕＩか又はＢｓｕ３６Ｉの
どちらかで別個に切断した。次いで、３パート連結を行った（ＰｖｕＩ−ＢｓＵ
３６ＩプラスＢｓＵ３６Ｉ−ＰｆｌＭ（ＳａｃＩＩリンカー）プラス（ＳａｃＩ
Ｉリンカー）ＰｆｌＭＩ−ＰｖｕＩ）。得られたプラスミド（ＣＦ１△ｅｎｖ）
は多重診断的制限消化によって確認された。ＣＦ１△ｅｎｖはｅｎｖ中に８７５
ヌクレオチドを欠失していた。これはトランスフェクション後にヒト細胞中で高
レベルの逆転写酵素を産生したが、合胞体細胞は産生せず、上述した血漿阻害実
験に加えて、ＣＦ１で見られた合胞体細胞はＦＩＶエンベロープで特異的に介在
されたという更なる証拠が提供された。
ＦＩＶエンベロープ（ｅｎｖ遺伝子の産生物）の特異的欠失を３パート結合によ
って行った。すなわち、ＣＦ１はＰｆｌｍＩ（これはＣＦ１中に４回存在する）
で切断した。ｅｎｖ遺伝子内の問題の２つのＰｆｌＭ部位は共存できず、そして
これらのＰｆｌＭ部位を単に平滑末端化しただけでフレーム内ｅｎｖ欠失がもた
らされるであろうから、ＰｆｌＭ消化物をＴ４ポリメラーゼで処理して３’Ｐｆ
ｌｍＩ突出部を除去しそしてフレーム・シフト化ｓａｃＩＩリンカーに連結し、
ＳａｃＩＩで消化し、そしてゲル精製した。次いで、ＰｆｌＭＩ／ＳａｃＩＩ連
結消化物の分別物をｓａｃＩＩで切断し、そしてｐｖｕＩか又はＢｓｕ３６Ｉの
どちらかで別個に切断した。次いで、３パート連結を行った（ＰｖｕＩ−ＢｓＵ
３６ＩプラスＢｓＵ３６Ｉ−ＰｆｌＭ（ＳａｃＩＩリンカー）プラス（ＳａｃＩ
Ｉリンカー）ＰｆｌＭＩ−ＰｖｕＩ）。得られたプラスミド（ＣＦ１△ｅｎｖ）
は多重診断的制限消化によって確認された。ＣＦ１△ｅｎｖはｅｎｖ中に８７５
ヌクレオチドを欠失していた。これはトランスフェクション後にヒト細胞中で高
レベルの逆転写酵素を産生したが、合胞体細胞は産生せず、上述した血漿阻害実
験に加えて、ＣＦ１で見られた合胞体細胞はＦＩＶエンベロープで特異的に介在
されたという更なる証拠が提供された。
【０１２７】 ＣＦ１△ｅｎｖの上記エンベロープ機能は、任意の数の異種ウイルスエンベロ
ープタンパク質によってトランスで供給することができる。これらには、レトロ
ウイルスのエンベロープ機能に効率的に取って替わり得るため当該技術分野の熟
練者に良く知られているＶＳＶ−Ｇ、モロニー（Moloney）マウス白血病ウイル ス（ＭｏＭｕＬＶ）のアンホトロピックエンベロープ、及びテナガザル白血病ウ
イルス（ＧＡＬＶ）エンベロープが含まれるが、これらに限定されない。
ープタンパク質によってトランスで供給することができる。これらには、レトロ
ウイルスのエンベロープ機能に効率的に取って替わり得るため当該技術分野の熟
練者に良く知られているＶＳＶ−Ｇ、モロニー（Moloney）マウス白血病ウイル ス（ＭｏＭｕＬＶ）のアンホトロピックエンベロープ、及びテナガザル白血病ウ
イルス（ＧＡＬＶ）エンベロープが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】 他の実施態様では、ＦＩＶ配列の追加的な欠失がＣＦ１△ｅｎｖから作成され
る。例えば、主要な５’スプライスドナーとｇａｇＡＴＧコドン間の領域は、Ｆ
ＩＶでは僅か２０ヌクレオチドである（ＨＩＶ−１における４０以上及びＨＩＶ
−２における７０以上と比較して）が、配列中で欠失又は変更させることができ
る。追加的なｅｎｖ配列を除去して試験し、そして欠失ｖｉｆまたは他の領域の
影響を試験する。
る。例えば、主要な５’スプライスドナーとｇａｇＡＴＧコドン間の領域は、Ｆ
ＩＶでは僅か２０ヌクレオチドである（ＨＩＶ−１における４０以上及びＨＩＶ
−２における７０以上と比較して）が、配列中で欠失又は変更させることができ
る。追加的なｅｎｖ配列を除去して試験し、そして欠失ｖｉｆまたは他の領域の
影響を試験する。
【０１２９】 好ましい実施態様では、幾つかの理由（Ｕ３、又は３−プライム固有領域はレ
トロウイルスのプロモーター／エンハンサーエレメントを有している）のために
、この系では（即ち、パッケージング及びベクター構築物の両方で）ＦＩＶ Ｕ ３のプロモーター機能を完全に置換することが決定された。第１に、ＦＩＶ Ｌ ＴＲはヒト細胞では不活性であるか又は殆ど活性でないのに対し、ヒト細胞への
形質導入の親和性を高めることができまたネコ細胞を使用する良好なトランスフ
ェクション系が良好に特徴化されていないという理由で、ヒト細胞内でベクター
産生を試みることが望まれた。第２に、一定の系（例えば、２９３Ｔヒト胚性腎
細胞系）中でのｈＣＭＶ急性期プロモーターのようなプロモーターによって誘導
される良く知られた高レベルの発現が好ましい。第３に、ベクターとパッケージ
ング構築物の両方においてＵ３を置換することが複製可能ＦＩＶの危険性除去に
更に役立つであろう。他の修飾では、特にＴＡＴＡボックスを含めて３−プライ
ムＵ３領域の８０塩基もベクターから欠失させた。それ故、この欠失によりそし
てパッケージングプラスミドがｅｎｖ遺伝子欠失とＯＲＦ２不活性化停止コドン
の両方を有しているという理由により、複製可能ＦＩＶは再生され得ない。第４
に、同じプロモーターで作用する３つの成分（パッケージングプラスミド、ベク
ター、エンベロープ発現プラスミド）を全て有していることは同調発現及び効率
的な粒子形成を高める可能性がある。第５に、上記したように、ネコ細胞は既知
又は未知の感染性物質をヒトに導入する危険性を提起するので、臨床用途にはヒ
ト細胞産生の方がネコ細胞産生より安全である。
トロウイルスのプロモーター／エンハンサーエレメントを有している）のために
、この系では（即ち、パッケージング及びベクター構築物の両方で）ＦＩＶ Ｕ ３のプロモーター機能を完全に置換することが決定された。第１に、ＦＩＶ Ｌ ＴＲはヒト細胞では不活性であるか又は殆ど活性でないのに対し、ヒト細胞への
形質導入の親和性を高めることができまたネコ細胞を使用する良好なトランスフ
ェクション系が良好に特徴化されていないという理由で、ヒト細胞内でベクター
産生を試みることが望まれた。第２に、一定の系（例えば、２９３Ｔヒト胚性腎
細胞系）中でのｈＣＭＶ急性期プロモーターのようなプロモーターによって誘導
される良く知られた高レベルの発現が好ましい。第３に、ベクターとパッケージ
ング構築物の両方においてＵ３を置換することが複製可能ＦＩＶの危険性除去に
更に役立つであろう。他の修飾では、特にＴＡＴＡボックスを含めて３−プライ
ムＵ３領域の８０塩基もベクターから欠失させた。それ故、この欠失によりそし
てパッケージングプラスミドがｅｎｖ遺伝子欠失とＯＲＦ２不活性化停止コドン
の両方を有しているという理由により、複製可能ＦＩＶは再生され得ない。第４
に、同じプロモーターで作用する３つの成分（パッケージングプラスミド、ベク
ター、エンベロープ発現プラスミド）を全て有していることは同調発現及び効率
的な粒子形成を高める可能性がある。第５に、上記したように、ネコ細胞は既知
又は未知の感染性物質をヒトに導入する危険性を提起するので、臨床用途にはヒ
ト細胞産生の方がネコ細胞産生より安全である。
【０１３０】 この構築物の設計は、正しくＴＡＴＡボックスにおけるＣＭＶプロモーターと
ＦＩＶゲノム（５’Ｒ反復配列から続いている）の融合に関係している。先ず、
ＰＣＲ（合成ＰＣＲはエキソヌクレアーゼ＋Ｖｅｎｔポリメラーゼを使用して行
った）は、ＦＩＶ ＴＡＴＡボックスのすぐ下流のヌクレオチドと相同的なＳａ ｃＩ−テール付加センスＰＣＲプライマー（５’−ａｔａｔａＧＡＧＣＴＣｔｇ
ｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃ−３’）を、ＦＩＶ ｇａｇ遺伝子の 反対側ストランドと相同的なアンチセンスＰＣＲプライマー（５’−ｃｃａａｔ
ｃｔｃｇｃｃｃｃｔｇｔｃｃａｔｔｃｃｃｃ−３’）と組み合わせて使用して行
った。生成したＰＣＲ産生物は４５０ｂｐであった。このＰＣＲ産生物は、ｓａ
ｃＩ消化前にＸｈｏＩで消化した（何故なら、ＦＩＶ ＬＴＲにはＸｈｏＩ部位 のすぐ後にｓａｃ部位が存在しており、そしてこのようにして消化しない場合Ｓ
ａｃＩ−ＳａｃＩフラグメントが生成されるので）。ＸｈｏＩ消化とその後のＳ
ａｃＩ消化の後、得られた３１０ｂｐフラグメントは次のとおりであった： ＧＡＧＣＴ／Ｃｔｇｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｔｇａ
ｇｇａｃｔｔｔｔｇａｇｔｔｃｔｃｃｃｔｔｇａｇｇｃｔｃｃｃａｃａｇａｔａ
ｃａａｔａａａｔａｔｔｔｇａｇａｔｔｇａａｃｃｃｔｇｔｃｇａｇｔａｔｃｔ
ｇｔｇｔａａｔｃｔｔｔｔｔｔａｃｃｔｇｔｇａｇｇｔｃｔｃｇｇａａｔｃｃｇ
ｇｇｃｃｇａｇａａｃｔｔｃｇｃａｇｔｔｇｇｃｇｃｃｃｇａａｃａｇｇｇａｃ
ｔｔｇａｔｔｇａｇａｇｔｇａｔｔｇａｇｇａａｇｔｇａａｇｃｔａｇａｇｃａ
ａｔａｇａａａｇｃｔｇｔｔａａｇｃａｇａａｃｔｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔａａ
ａｔａｇｇｇａａｇｃａｇｔａｇｃａｇａｃｇｃｔｇｃｔａａｃａｇｔｇａｇｔ
ａｔｃｔｃｔａｇｔｇａａｇｃｇｇａＣ＼ＴＣＧＡＧｃｔｃ。
ＦＩＶゲノム（５’Ｒ反復配列から続いている）の融合に関係している。先ず、
ＰＣＲ（合成ＰＣＲはエキソヌクレアーゼ＋Ｖｅｎｔポリメラーゼを使用して行
った）は、ＦＩＶ ＴＡＴＡボックスのすぐ下流のヌクレオチドと相同的なＳａ ｃＩ−テール付加センスＰＣＲプライマー（５’−ａｔａｔａＧＡＧＣＴＣｔｇ
ｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃ−３’）を、ＦＩＶ ｇａｇ遺伝子の 反対側ストランドと相同的なアンチセンスＰＣＲプライマー（５’−ｃｃａａｔ
ｃｔｃｇｃｃｃｃｔｇｔｃｃａｔｔｃｃｃｃ−３’）と組み合わせて使用して行
った。生成したＰＣＲ産生物は４５０ｂｐであった。このＰＣＲ産生物は、ｓａ
ｃＩ消化前にＸｈｏＩで消化した（何故なら、ＦＩＶ ＬＴＲにはＸｈｏＩ部位 のすぐ後にｓａｃ部位が存在しており、そしてこのようにして消化しない場合Ｓ
ａｃＩ−ＳａｃＩフラグメントが生成されるので）。ＸｈｏＩ消化とその後のＳ
ａｃＩ消化の後、得られた３１０ｂｐフラグメントは次のとおりであった： ＧＡＧＣＴ／Ｃｔｇｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｔｇａ
ｇｇａｃｔｔｔｔｇａｇｔｔｃｔｃｃｃｔｔｇａｇｇｃｔｃｃｃａｃａｇａｔａ
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ｇｔｇｔａａｔｃｔｔｔｔｔｔａｃｃｔｇｔｇａｇｇｔｃｔｃｇｇａａｔｃｃｇ
ｇｇｃｃｇａｇａａｃｔｔｃｇｃａｇｔｔｇｇｃｇｃｃｃｇａａｃａｇｇｇａｃ
ｔｔｇａｔｔｇａｇａｇｔｇａｔｔｇａｇｇａａｇｔｇａａｇｃｔａｇａｇｃａ
ａｔａｇａａａｇｃｔｇｔｔａａｇｃａｇａａｃｔｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔａａ
ａｔａｇｇｇａａｇｃａｇｔａｇｃａｇａｃｇｃｔｇｃｔａａｃａｇｔｇａｇｔ
ａｔｃｔｃｔａｇｔｇａａｇｃｇｇａＣ＼ＴＣＧＡＧｃｔｃ。
【０１３１】 このフラグメントを１４０ｂｐ残基からゲル精製して離し、そしてｐＲｃ／Ｃ
ＭＶプラスミドのＳａｃＩ−ＸｈｏＩバックボーン中にクローン化した。要約す
ると、この段階ではＦＩＶ ＬＴＲ配列をＴＡＴＡボックスの下流に、ＣＭＶプ ロモーターのＴＡＴＡボックスとＦＩＶの置換されたＴＡＴＡボックスの両方に
対して正確に重なるように配列する：これは、正に、ＳａｃＩ部位がｈＣＭＶプ
ロモーター中のＴＡＴＡボックスの３ヌクレオチド下流に存在するように、Ｓａ
ｃＩ部位をＴＡＴＡボックスの３ヌクレオチド下流に配置し、そしてＦＩＶ Ｒ 反復配列を、ＦＩＶゲノム中と同様に、ＴＡＴＡボックスから正確に９ヌクレオ
チド下流に配置する。それ故、上記融合によってＣＭＶプロモーターとＦＩＶ転
写配列の両方のヌクレオチド距離は保持され（且つ連結しており）、そして以下
の配列で詳記される： ．．ａｃｇｔａｔａａｇｔｔｇｔｔｃｃａｔｔｇｔａａｇａｇｔａＴＡＴＡＡｃ
ｃａｇｔｇｃｔｔｔｇｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｔｇ ａｇｇａ ＦＩＶＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧ ＣＡＧＡＧＣＴＣ ＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣ．．．．．．．．．
．． ｐＲｃ／ＣＭＶ ＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴ
Ｃｔｇｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｔｇａｇｇａ ＣＲ
Ｆ１
ＭＶプラスミドのＳａｃＩ−ＸｈｏＩバックボーン中にクローン化した。要約す
ると、この段階ではＦＩＶ ＬＴＲ配列をＴＡＴＡボックスの下流に、ＣＭＶプ ロモーターのＴＡＴＡボックスとＦＩＶの置換されたＴＡＴＡボックスの両方に
対して正確に重なるように配列する：これは、正に、ＳａｃＩ部位がｈＣＭＶプ
ロモーター中のＴＡＴＡボックスの３ヌクレオチド下流に存在するように、Ｓａ
ｃＩ部位をＴＡＴＡボックスの３ヌクレオチド下流に配置し、そしてＦＩＶ Ｒ 反復配列を、ＦＩＶゲノム中と同様に、ＴＡＴＡボックスから正確に９ヌクレオ
チド下流に配置する。それ故、上記融合によってＣＭＶプロモーターとＦＩＶ転
写配列の両方のヌクレオチド距離は保持され（且つ連結しており）、そして以下
の配列で詳記される： ．．ａｃｇｔａｔａａｇｔｔｇｔｔｃｃａｔｔｇｔａａｇａｇｔａＴＡＴＡＡｃ
ｃａｇｔｇｃｔｔｔｇｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｔｇ ａｇｇａ ＦＩＶＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧ ＣＡＧＡＧＣＴＣ ＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣ．．．．．．．．．
．． ｐＲｃ／ＣＭＶ ＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴ
Ｃｔｇｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｔｇａｇｇａ ＣＲ
Ｆ１
【０１３２】 ＣＲＦ１はＣＭＶプロモーターとＦＩＶ Ｒ反復配列の５−プライム融合を完 了したが、３−プライムＬＴＲとＦＩＶゲノムの残りは下流に置かれたままであ
った。それ故、ｓａｌＩ−テール付加ＰＣＲプライマーＦ３’Ｓ（ｔａｔａｔａ
ＧＴＣｇａｃｔａｇｇｇａｃｔｇｔｔｔａｃｇａａｃ）及びＦ３’Ａ／Ｎｏｔ（
ａｔａｔａｔａｇｔｃｇａｃＧＣＧＧＣＣＧＣｔｇｃｇａａｇｔｔｃｔｃｇ）を
使用して３’ＦＩＶ ＬＴＲを増幅した：ＳａＬＩで消化したＰＣＲ産生物は、 アルカリホスファターゼで処理したＣＲＦ１の適合性ＸｈｏＩ部位に連結し、そ
してこの連結は加熱不活性化し、そしてＸｈｏＩを使用して野生型に対して選択
した。得られた、ＣＲＦ（Ｌ）と命名されたプラスミドは上記の両ＬＴＲを有し
ており、そして３’ＬＴＲの３’末端に固有のＮｏｔＩ部位を配置している。
った。それ故、ｓａｌＩ−テール付加ＰＣＲプライマーＦ３’Ｓ（ｔａｔａｔａ
ＧＴＣｇａｃｔａｇｇｇａｃｔｇｔｔｔａｃｇａａｃ）及びＦ３’Ａ／Ｎｏｔ（
ａｔａｔａｔａｇｔｃｇａｃＧＣＧＧＣＣＧＣｔｇｃｇａａｇｔｔｃｔｃｇ）を
使用して３’ＦＩＶ ＬＴＲを増幅した：ＳａＬＩで消化したＰＣＲ産生物は、 アルカリホスファターゼで処理したＣＲＦ１の適合性ＸｈｏＩ部位に連結し、そ
してこの連結は加熱不活性化し、そしてＸｈｏＩを使用して野生型に対して選択
した。得られた、ＣＲＦ（Ｌ）と命名されたプラスミドは上記の両ＬＴＲを有し
ており、そして３’ＬＴＲの３’末端に固有のＮｏｔＩ部位を配置している。
【０１３３】 次に、ＦＩＶゲノムの主要コード化領域は、ｐ３４ＴＦ１０の８，８４５ヌク
レオチドのＢｂｅＩ−ＥｓｐＩフラグメントを連結してＣＲＦ（Ｌ）のリン酸化
ＢｂｅＩ−ＥｓｐＩバックボーン中に挿入した。得られたプラスミドはＣＴ５と
呼称した（ＣＭＶプロモーター−−＞Ｔａｔａボックスでの融合−−＞３’ＬＴ
Ｒ Ｕ５エレメントにおけるＲ反復配列から正常なプロウイルス末端までの完全 なＦＩＶゲノムから）。ＣＴ５は、最初のラウンドにおいてＣＭＶプロモーター
でプロモートされる全長の感染性ＦＩＶをコードしている（その後のラウンドで
は、逆転写によって５’プロウイルス末端で野生型Ｕ３が産生されるので、ＦＩ
Ｖ ＬＴＲでプロモートされる）。ヒト２９３−Ｔ細胞におけるＣＴ５か又は野 生型３４ＴＦ１０によるトランスフェクションは、ＦＩＶ複製に関する標準的な
アッセイにおいて上清液と広範囲に及んでいる合胞体細胞の両方で等レベルのＲ
Ｔを生じさせた。すなわち、トランスフェクションした２９３−Ｔ細胞から得ら
れたろ過上清液を伝達した後に０．５％血清で維持したネコのクランダール（Cr
andall）ネコ腎細胞（ＣＲＦＫ細胞）での合胞体細胞形成（Tozzini他（1992年 ）Journal of Virological Methods 37、241〜252も参照）。しかしながら、３ ４ＴＦ１０で産生したウイルスと同じく、ＣＴ５で産生したウイルスはその向性
において完全に野生型である：これはヒト細胞では複製しない。このことは、Ｃ
Ｔ５の３−プライムＵ３が野生型であるので予期される（レトロウイルスはビリ
オンｍＲＮＡの３−プライム末端にプロモーターを有している。すなわち、逆転
写によって、感受性細胞でその後の転写ラウンドをプロモートする能力を獲得し
ている組み込まれたプロウイルスの５’末端に３−プライムＵ３のコピーが配置
される）。要約すると、ネコ細胞に対して複製可能であるＦＩＶは、２９３Ｔ細
胞を含む付着細胞系へのＣＴ５のトランスフェクションによって産生され、複製
ではなくて、ライフサイクルの生産相がヒト細胞で効率的に達成されたことを証
明している。
レオチドのＢｂｅＩ−ＥｓｐＩフラグメントを連結してＣＲＦ（Ｌ）のリン酸化
ＢｂｅＩ−ＥｓｐＩバックボーン中に挿入した。得られたプラスミドはＣＴ５と
呼称した（ＣＭＶプロモーター−−＞Ｔａｔａボックスでの融合−−＞３’ＬＴ
Ｒ Ｕ５エレメントにおけるＲ反復配列から正常なプロウイルス末端までの完全 なＦＩＶゲノムから）。ＣＴ５は、最初のラウンドにおいてＣＭＶプロモーター
でプロモートされる全長の感染性ＦＩＶをコードしている（その後のラウンドで
は、逆転写によって５’プロウイルス末端で野生型Ｕ３が産生されるので、ＦＩ
Ｖ ＬＴＲでプロモートされる）。ヒト２９３−Ｔ細胞におけるＣＴ５か又は野 生型３４ＴＦ１０によるトランスフェクションは、ＦＩＶ複製に関する標準的な
アッセイにおいて上清液と広範囲に及んでいる合胞体細胞の両方で等レベルのＲ
Ｔを生じさせた。すなわち、トランスフェクションした２９３−Ｔ細胞から得ら
れたろ過上清液を伝達した後に０．５％血清で維持したネコのクランダール（Cr
andall）ネコ腎細胞（ＣＲＦＫ細胞）での合胞体細胞形成（Tozzini他（1992年 ）Journal of Virological Methods 37、241〜252も参照）。しかしながら、３ ４ＴＦ１０で産生したウイルスと同じく、ＣＴ５で産生したウイルスはその向性
において完全に野生型である：これはヒト細胞では複製しない。このことは、Ｃ
Ｔ５の３−プライムＵ３が野生型であるので予期される（レトロウイルスはビリ
オンｍＲＮＡの３−プライム末端にプロモーターを有している。すなわち、逆転
写によって、感受性細胞でその後の転写ラウンドをプロモートする能力を獲得し
ている組み込まれたプロウイルスの５’末端に３−プライムＵ３のコピーが配置
される）。要約すると、ネコ細胞に対して複製可能であるＦＩＶは、２９３Ｔ細
胞を含む付着細胞系へのＣＴ５のトランスフェクションによって産生され、複製
ではなくて、ライフサイクルの生産相がヒト細胞で効率的に達成されたことを証
明している。
【０１３４】 （ＣＴ５から誘導されたＦＩＶベクター） ＣＴ５は、ヒト細胞中であれネコ細胞中であれトランスフェクションされると
、ネコ細胞に対して複製可能であるがヒト細胞に対しては複製可能でないＦＩＶ
を産生する：このウイルス転写物はプロデューサー細胞内でネコプロモーターで
はなくてヒトプロモーターで発現されるが、ネコの３−プライムＵ３は無傷のま
まであり、そしてその後の複製ラウンドにおける５−プライムＵ３プロモーター
の供給源は常にプロデューサー細胞転写物の３−プライムＵ３である。この残っ
ている３−プライムＵ３エレメントを欠失させることもできる。
、ネコ細胞に対して複製可能であるがヒト細胞に対しては複製可能でないＦＩＶ
を産生する：このウイルス転写物はプロデューサー細胞内でネコプロモーターで
はなくてヒトプロモーターで発現されるが、ネコの３−プライムＵ３は無傷のま
まであり、そしてその後の複製ラウンドにおける５−プライムＵ３プロモーター
の供給源は常にプロデューサー細胞転写物の３−プライムＵ３である。この残っ
ている３−プライムＵ３エレメントを欠失させることもできる。
【０１３５】 ＣＴ５の修飾物からレトロウイルスベクターを産生するために、２つの戦略を
使用した。１つの実施態様では、ＦＩＶのＲＲＥがＦＩＶのコード配列に対して
３−プライムに（他のレンチウイルスと同様に、ＳＵ／ＴＭ結合部というよりは
むしろＴＭタンパク質の末端に）位置しているという事実に注目する。それ故、
それ自体のポリアデニル化ｐ（Ａ）シグナルを有しているレポーター遺伝子カセ
ットがＦＩＶ配列に関してアンチセンス方向に配置されている場合、ＲＲＥの位
置は保存され、シス作用性シグナルの使用とパッケージングを高めるであろう。
第２の実施態様では、ＲＲＥを通常の３−プライム位置から除去し、そして標準
的なクローニング技術によってＦＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子部分の直後に配置 し、ｇａｇ配列を含有するベクター転写物のＲｅｖ保護とレポーター遺伝子カセ
ットのセンス方向下流での挿入を可能にした。ｇａｇ遺伝子配列は他のレトロウ
イルスではパッケージングを高めることが示されているので、この遺伝子配列を
これらのベクター内に含める。しかしながら、これらのベクターでは、ｇａｇ遺
伝子はｇａｇのヌクレオチド２９８に位置するＴｔｈ ＩＩＩ １部位（Ｔｔｈ ＩＩＩ１消化、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ介在性充填、連結、リガーゼ不活性化
、そして最後に野生型に対するＴｔｈ ＩＩＩ１選択によってクローン化されて いる）の平滑化閉鎖によってフレームシフトさせて、機能的なｇａｇの組換えを
妨げ、そしてトランス優先的に抑制するＧａｇタンパク質の産生を妨げる。この
フレームシフトを超えるか又は更には先行しているｇａｇの追加的な部分は力価
に影響を与えることなくベクターから除去することができる。
使用した。１つの実施態様では、ＦＩＶのＲＲＥがＦＩＶのコード配列に対して
３−プライムに（他のレンチウイルスと同様に、ＳＵ／ＴＭ結合部というよりは
むしろＴＭタンパク質の末端に）位置しているという事実に注目する。それ故、
それ自体のポリアデニル化ｐ（Ａ）シグナルを有しているレポーター遺伝子カセ
ットがＦＩＶ配列に関してアンチセンス方向に配置されている場合、ＲＲＥの位
置は保存され、シス作用性シグナルの使用とパッケージングを高めるであろう。
第２の実施態様では、ＲＲＥを通常の３−プライム位置から除去し、そして標準
的なクローニング技術によってＦＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子部分の直後に配置 し、ｇａｇ配列を含有するベクター転写物のＲｅｖ保護とレポーター遺伝子カセ
ットのセンス方向下流での挿入を可能にした。ｇａｇ遺伝子配列は他のレトロウ
イルスではパッケージングを高めることが示されているので、この遺伝子配列を
これらのベクター内に含める。しかしながら、これらのベクターでは、ｇａｇ遺
伝子はｇａｇのヌクレオチド２９８に位置するＴｔｈ ＩＩＩ １部位（Ｔｔｈ ＩＩＩ１消化、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ介在性充填、連結、リガーゼ不活性化
、そして最後に野生型に対するＴｔｈ ＩＩＩ１選択によってクローン化されて いる）の平滑化閉鎖によってフレームシフトさせて、機能的なｇａｇの組換えを
妨げ、そしてトランス優先的に抑制するＧａｇタンパク質の産生を妨げる。この
フレームシフトを超えるか又は更には先行しているｇａｇの追加的な部分は力価
に影響を与えることなくベクターから除去することができる。
【０１３６】 これらのベクターの転写はＣＭＶプロモーターで生起し、そしてＦＩＶプロモ
ーターでは生起しないことに注意されたい。他のプロモーターは任意に使用する
ことができる。加えて、ＦＩＶゲノムの追加的な領域、例えばｇａｇの領域を以
下に詳記するようにして欠失させることによって多数の修飾が可能である。
ーターでは生起しないことに注意されたい。他のプロモーターは任意に使用する
ことができる。加えて、ＦＩＶゲノムの追加的な領域、例えばｇａｇの領域を以
下に詳記するようにして欠失させることによって多数の修飾が可能である。
【０１３７】 このようなベクターを以下に記載しそして説明する： １．ベクターＣＴＡＧＣｇｆｓＢ。 括弧内の記載中で下線を引いたボールド
体文字はベクターの名称の由来を示す（ＣＭＶプロモーターがＴＡＴＡボックス
で結合し、逆方向の内部レポーター遺伝子カセットＣＭＶ−ＧＦＰ−ｐ（Ａ）の
発現を行い、そしてｇａｇ遺伝子フレームシフト（gene frame shift）突然変異
とそれに続くｓｖ４０Ｔ抗原結合部位の挿入を有しており、ＳＶ４０Ｔ抗原発現
細胞内でトランスフェクション後にプラスミドの増幅を生起させる）。ＣＴＡＧ
ＣｇｆｓＢは、ＣＴ５のｐｖｕＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント、緑色蛍光タンパク
質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するプラスミドであるｐＺｃｍｖＧＦＰｐＡのＥｃｏ
ＲＩ−ＳｐｅＩフラグメント、及びＣＴ５のＳｐｅＩ−ＰｖｕＩフラグメントの
３−パートライゲーションによって構築した。このライゲーションはＣＭＶプロ
モーター−ＧＦＰ−ｐ（Ａ）シグナルカセットをＦＩＶゲノム内のＥｃｏＲＩと
ＳｐｅＩ間で逆方向に配置する。次に、上記ベクター内に残っているｇａｇ／ｐ
ｏｌ部分のＴｔｈ ＩＩＩ１部位を開裂し、２００μＭのｄＮＴＰの存在下でＫ ｌｅｎｏｗポリメラーゼを使用して充填し、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用 して閉鎖した。この平滑化によって、Ｔｔｈ ＩＩＩ１部位の２，３の塩基内で ｇａｇフラグメントをフレームシフトするエキストラＧ残基が挿入される。ｐｏ
ｌ配列は全く存在していない。それ故、ｇａｇ／ｐｏｌのプリカーサーはＣＦ１
△ｅｎｖ又はその後のＣＦ１△ｅｎｖの修飾物からトランスで供給されなければ
ならない。更に、このステップは野生型組換えの機会及びトランス優先的に干渉
するＧａｇタンパク質フラグメントが産生される機会を減少させる。最後に、Ｓ
ｖ４０Ｔ抗原で作用するプラスミド増幅による利益を得るためにそして必要な場
合ｎｅｏＲの選択を可能にするために、ｐＲｃ／ＣＭＶ由来のｓｖ４０−プロモ
ーター−ｎｅｏＲカセットをプラスミドのベクター配列の外側に挿入した。１つ
の実施態様では、ｇａｇ遺伝子ＡＴＧ開始コドンは停止コドンに突然変異させる
ことができる。さらに、ＢｓＲＧ１部位と上流のＰｓｔＩ部位間の領域を任意に
欠失させてより多くのｇａｇを除去する。
体文字はベクターの名称の由来を示す（ＣＭＶプロモーターがＴＡＴＡボックス
で結合し、逆方向の内部レポーター遺伝子カセットＣＭＶ−ＧＦＰ−ｐ（Ａ）の
発現を行い、そしてｇａｇ遺伝子フレームシフト（gene frame shift）突然変異
とそれに続くｓｖ４０Ｔ抗原結合部位の挿入を有しており、ＳＶ４０Ｔ抗原発現
細胞内でトランスフェクション後にプラスミドの増幅を生起させる）。ＣＴＡＧ
ＣｇｆｓＢは、ＣＴ５のｐｖｕＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント、緑色蛍光タンパク
質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するプラスミドであるｐＺｃｍｖＧＦＰｐＡのＥｃｏ
ＲＩ−ＳｐｅＩフラグメント、及びＣＴ５のＳｐｅＩ−ＰｖｕＩフラグメントの
３−パートライゲーションによって構築した。このライゲーションはＣＭＶプロ
モーター−ＧＦＰ−ｐ（Ａ）シグナルカセットをＦＩＶゲノム内のＥｃｏＲＩと
ＳｐｅＩ間で逆方向に配置する。次に、上記ベクター内に残っているｇａｇ／ｐ
ｏｌ部分のＴｔｈ ＩＩＩ１部位を開裂し、２００μＭのｄＮＴＰの存在下でＫ ｌｅｎｏｗポリメラーゼを使用して充填し、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用 して閉鎖した。この平滑化によって、Ｔｔｈ ＩＩＩ１部位の２，３の塩基内で ｇａｇフラグメントをフレームシフトするエキストラＧ残基が挿入される。ｐｏ
ｌ配列は全く存在していない。それ故、ｇａｇ／ｐｏｌのプリカーサーはＣＦ１
△ｅｎｖ又はその後のＣＦ１△ｅｎｖの修飾物からトランスで供給されなければ
ならない。更に、このステップは野生型組換えの機会及びトランス優先的に干渉
するＧａｇタンパク質フラグメントが産生される機会を減少させる。最後に、Ｓ
ｖ４０Ｔ抗原で作用するプラスミド増幅による利益を得るためにそして必要な場
合ｎｅｏＲの選択を可能にするために、ｐＲｃ／ＣＭＶ由来のｓｖ４０−プロモ
ーター−ｎｅｏＲカセットをプラスミドのベクター配列の外側に挿入した。１つ
の実施態様では、ｇａｇ遺伝子ＡＴＧ開始コドンは停止コドンに突然変異させる
ことができる。さらに、ＢｓＲＧ１部位と上流のＰｓｔＩ部位間の領域を任意に
欠失させてより多くのｇａｇを除去する。
【０１３８】 ２．ベクターＣＴＲＺＬｂ。（ＣＭＶプロモーターがＴＡＴＡボックスで結合
し、内部センス方向のＬａｃＺレポーター遺伝子カセットのＲ反復配列で始まる
発現を行い、そしてｌａｃＺ後に３’ＬＴＲを有している；これもＴｔｈ ＩＩ Ｉ１部位にｇａｇ遺伝子フレームシフト突然変異とそれに続くｓｖ４０Ｔ抗原結
合（binding）部位の挿入を有しており、トランスフェクション後にプラスミド の増幅を生起させる）。このベクターを構築するために、ＥｃｏＲＩ及びＢｓｒ
ＧＩ酵素での開裂によってＥｃｏＲＩとＢｓｒＧＩ間でＣＴＡＧＣｇｆｓを欠失
させ、２００μＭのｄＮＴＰを用いてKlenow酵素で処理し、Ｔ４リガーゼ平滑化
閉鎖連結し、そしてＥｃｏＲＩを使用して野生型に対して選択した。ＢｓｒＧＩ
部位を再生させた。ｐｚ−ｌａｃｚのＢｓｒｇＩ−ＥｃｏＮＩフラグメントをKl
enow酵素で処理し、そして固有のＥｃｏＮＩ部位に平滑化した。構造は次のとお
りであった：ＣＭＶプロモーター−−ＦＩＶ Ｒ反復配列とのＴａＴａボックス 融合−−Ｕ５−−△ｇａｇ−−ＦＩＶ Ｒｅｖ応答エレメント−−ｃｍｖプロモ ーター−−ＬａｃＺ遺伝子−−ＬＴＲ。最後に、ｐＲｃ／ＣＭＶ由来のｓｖ４０
−プロモーター−ｎｅｏＲ領域は、Ｓｖ４０Ｔ抗原で作用するプラスミド増幅の
利益を得るため、そして必要な場合ｎｅｏＲの選択を可能にするために、プラス
ミドのベクター下流に挿入してＴ抗原結合部位を提供した。ｇａｇ遺伝子のＡＴ
Ｇ開始コドンは停止コドンに突然変異させることができ、そしてｇａｇの追加的
な部分は任意に欠失させる。
し、内部センス方向のＬａｃＺレポーター遺伝子カセットのＲ反復配列で始まる
発現を行い、そしてｌａｃＺ後に３’ＬＴＲを有している；これもＴｔｈ ＩＩ Ｉ１部位にｇａｇ遺伝子フレームシフト突然変異とそれに続くｓｖ４０Ｔ抗原結
合（binding）部位の挿入を有しており、トランスフェクション後にプラスミド の増幅を生起させる）。このベクターを構築するために、ＥｃｏＲＩ及びＢｓｒ
ＧＩ酵素での開裂によってＥｃｏＲＩとＢｓｒＧＩ間でＣＴＡＧＣｇｆｓを欠失
させ、２００μＭのｄＮＴＰを用いてKlenow酵素で処理し、Ｔ４リガーゼ平滑化
閉鎖連結し、そしてＥｃｏＲＩを使用して野生型に対して選択した。ＢｓｒＧＩ
部位を再生させた。ｐｚ−ｌａｃｚのＢｓｒｇＩ−ＥｃｏＮＩフラグメントをKl
enow酵素で処理し、そして固有のＥｃｏＮＩ部位に平滑化した。構造は次のとお
りであった：ＣＭＶプロモーター−−ＦＩＶ Ｒ反復配列とのＴａＴａボックス 融合−−Ｕ５−−△ｇａｇ−−ＦＩＶ Ｒｅｖ応答エレメント−−ｃｍｖプロモ ーター−−ＬａｃＺ遺伝子−−ＬＴＲ。最後に、ｐＲｃ／ＣＭＶ由来のｓｖ４０
−プロモーター−ｎｅｏＲ領域は、Ｓｖ４０Ｔ抗原で作用するプラスミド増幅の
利益を得るため、そして必要な場合ｎｅｏＲの選択を可能にするために、プラス
ミドのベクター下流に挿入してＴ抗原結合部位を提供した。ｇａｇ遺伝子のＡＴ
Ｇ開始コドンは停止コドンに突然変異させることができ、そしてｇａｇの追加的
な部分は任意に欠失させる。
【０１３９】 リン酸カルシウム コ・トランスフェクション法によって産生されたベクター 上清液をヒト（ＨｅＬａ、２９３）及びネコ（ＣＲＦＫ、Ｆｃ３Ｔｇ）細胞で力
価検定した。慣用のモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）に基づく
レトロウイルスベクターと比較して、ＦＩＶベクターはヒト及びネコ細胞の形質
導入で同等に有効であった。超遠心による１回の濃縮ラウンド後に、ネコ及びヒ
ト細胞の両方で１０7の力価が達成された。より高い力価は、トランスフェクシ ョンを純化しそして更に超遠心することによって達成することができる。加えて
、形質導入の２４時間前に添加しそしてｌａｃＺ染色により毎日取り替えた培養
培地中でアフィジコリン１５μｇ／ｍｌを使用して増殖を停止させるとき、ヒト
（ＨｅＬａ）及びネコ（ＣＲＦＫ）細胞は共に効率的に形質導入される。アフィ
ジコリン停止細胞中でのＦＩＶベクターによるｌａｃＺ力価は分裂中の細胞にお
ける力価の８０〜９０％であり、一方Ｍｏ−ＭｕＬＶベクター形質導入はアフィ
ジコリン処理によって消失した。これらの結果は、ＦＩＶベクターがヒト細胞を
形質導入でき、そして慣用の（例えば、マウス）レトロウイルスベクター中では
欠失しているレンチウイルス特異的生物学的特性である、非分裂細胞を形質導入
する能力を明らかに有していることを示している。重要なことは、本発明者はネ
コ細胞に対するＦＩＶベクターの優先性を検出しなかったことである。つまり種
々のヒト及びネコ細胞の相対的な形質導入は細胞特異的であってベクター特異的
ではなかった。換言すると、ＦＩＶベクターによる形質導入が効率的であった細
胞はまた、慣用のモロニーマウス白血病ウイルスベクターによっても効率的に形
質導入され、そしてその逆も同じであった。
価検定した。慣用のモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）に基づく
レトロウイルスベクターと比較して、ＦＩＶベクターはヒト及びネコ細胞の形質
導入で同等に有効であった。超遠心による１回の濃縮ラウンド後に、ネコ及びヒ
ト細胞の両方で１０7の力価が達成された。より高い力価は、トランスフェクシ ョンを純化しそして更に超遠心することによって達成することができる。加えて
、形質導入の２４時間前に添加しそしてｌａｃＺ染色により毎日取り替えた培養
培地中でアフィジコリン１５μｇ／ｍｌを使用して増殖を停止させるとき、ヒト
（ＨｅＬａ）及びネコ（ＣＲＦＫ）細胞は共に効率的に形質導入される。アフィ
ジコリン停止細胞中でのＦＩＶベクターによるｌａｃＺ力価は分裂中の細胞にお
ける力価の８０〜９０％であり、一方Ｍｏ−ＭｕＬＶベクター形質導入はアフィ
ジコリン処理によって消失した。これらの結果は、ＦＩＶベクターがヒト細胞を
形質導入でき、そして慣用の（例えば、マウス）レトロウイルスベクター中では
欠失しているレンチウイルス特異的生物学的特性である、非分裂細胞を形質導入
する能力を明らかに有していることを示している。重要なことは、本発明者はネ
コ細胞に対するＦＩＶベクターの優先性を検出しなかったことである。つまり種
々のヒト及びネコ細胞の相対的な形質導入は細胞特異的であってベクター特異的
ではなかった。換言すると、ＦＩＶベクターによる形質導入が効率的であった細
胞はまた、慣用のモロニーマウス白血病ウイルスベクターによっても効率的に形
質導入され、そしてその逆も同じであった。
【０１４０】 本発明はヒト遺伝子療法に適用可能である。上記で詳記したように、これらの
レトロウイルスベクターは、ＨＩＶベクターが致命的にヒト病原体から誘導され
ることから、ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターを超える安全性利益を有し
ている。ＦＩＶベクターはＢＬ−２レベルの施設内で研究することができるので
、これらの産生に関与するヒトに引き起こされる危険性はＨＩＶベクターと比較
して低下し、そして産生の容易さや便利さが高められる。これらのベクターは、
分裂しないか又は稀に分裂する細胞への安定な遺伝子伝達が望まれる場合、他の
遺伝子送達方法を超える利点を有している。このような細胞にはヒト神経系、目
、造血系、外皮、内分泌系、肝胆汁系、胃腸管、尿生殖路、骨、筋肉、心血管系
及び呼吸器系の細胞が含まれるが、これらに限定されない。これらのベクターは
また患者の非ヒト細胞への接触も防止し、そして既知の病原体から誘導されるレ
ンチウイルス遺伝子又はレンチウイルスタンパク質への接触も防止する。 実施例２：ＦＩＶに基づくレンチウイルスベクターによる非分裂ヒト細胞の形質
導入並びにＦＩＶ感染及び細胞変性に対するＣＸＣＲ４要件の証明。
レトロウイルスベクターは、ＨＩＶベクターが致命的にヒト病原体から誘導され
ることから、ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターを超える安全性利益を有し
ている。ＦＩＶベクターはＢＬ−２レベルの施設内で研究することができるので
、これらの産生に関与するヒトに引き起こされる危険性はＨＩＶベクターと比較
して低下し、そして産生の容易さや便利さが高められる。これらのベクターは、
分裂しないか又は稀に分裂する細胞への安定な遺伝子伝達が望まれる場合、他の
遺伝子送達方法を超える利点を有している。このような細胞にはヒト神経系、目
、造血系、外皮、内分泌系、肝胆汁系、胃腸管、尿生殖路、骨、筋肉、心血管系
及び呼吸器系の細胞が含まれるが、これらに限定されない。これらのベクターは
また患者の非ヒト細胞への接触も防止し、そして既知の病原体から誘導されるレ
ンチウイルス遺伝子又はレンチウイルスタンパク質への接触も防止する。 実施例２：ＦＩＶに基づくレンチウイルスベクターによる非分裂ヒト細胞の形質
導入並びにＦＩＶ感染及び細胞変性に対するＣＸＣＲ４要件の証明。
【０１４１】 ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターは非分裂中の細胞を効率的に形質導入
するが、このようなベクターは致命的にヒト病原体から誘導されるために問題が
多い。しかしながら、非霊長類レンチウイルスの使用はこれらの分子特性、特に
ヒト細胞への適合可能性に関する知識が比較的存在していないため複雑であった
。この実施例はヒト細胞内におけるＦＩＶライフサイクルの生産的及びレセプタ
ー感染後のメカニズムの両方を記載し、そしてレンチウイルスベクター形質導入
に必要な感染が高い効率で生起し得ることを示す。非ネコ細胞では殆ど機能を果
たさないＦＩＶプロモーターの置換を行った。全く異種的にプロモートされそし
てｅｎｖ−プソイド型化されたＦＩＶベクター系は、トランスでのＦＩＶタンパ
ク質の高レベルヒト細胞発現とプロセシングを証明し、そして増殖を停止した有
糸分裂後の分裂ヒト細胞（マクロファージ及びｈＮＴニューロン）を高い力価で
形質導入するＦＩＶレトロウイルスベクターを産生した。この系はネコプロデュ
ーサー細胞の安全性リスクを消失させる。ヒト細胞において異種的にプロモート
されたＦＩＶエンベロープタンパク質による重篤な細胞変性が観察され、そして
本発明のベクターを使用してこの現象を研究した。ヒトサイトメガロウイルスプ
ロモーターによるＦＩＶゲノムの発現は、多種多様なヒト細胞では膨大なＥｎｖ
特異的合胞体細胞を誘導したが、齧歯類細胞では誘導しなかった。さらに、この
融合誘導活性にはＣＸＣＲ４、即ちＨＩＶの合胞体細胞誘導株のコ・レセプター
の共発現が必要であった。しかしながら、そのＣＸＣＲ４−依存性にもかかわら
ず、非宿主細胞ＦＩＶ Ｅｎｖ合胞体細胞誘導はウイルス侵入から分離すること ができた。すなわち、非ネコ細胞でのＣＸＣＲ４発現はＦＩＶ Ｅｎｖ特異的細 胞融合を可能にしたが、ＦＩＶ Ｅｎｖ介在性ベクター形質導入もそしてウイル ス複製も可能にしなかった。コ・レセプターの役割と一致して、ネコ細胞でのヒ
トＣＸＣＲ４発現はウイルス表現型を非細胞変性から高い細胞変性に変化させ、
そしてウイルスの感染性とＦＩＶにエンベロープされたベクターによる形質導入
の両方を高めた。進化的に離れたレンチウイルスによるＣＸＣＲ４の利用は、レ
ンチウイルス複製と細胞変性におけるこのケモカインレセプターの基本的な役割
を暗示している。これらの結果は比較レンチウイルス生物学並びにヒト遺伝子療
法に関して密接な関係を有している。
するが、このようなベクターは致命的にヒト病原体から誘導されるために問題が
多い。しかしながら、非霊長類レンチウイルスの使用はこれらの分子特性、特に
ヒト細胞への適合可能性に関する知識が比較的存在していないため複雑であった
。この実施例はヒト細胞内におけるＦＩＶライフサイクルの生産的及びレセプタ
ー感染後のメカニズムの両方を記載し、そしてレンチウイルスベクター形質導入
に必要な感染が高い効率で生起し得ることを示す。非ネコ細胞では殆ど機能を果
たさないＦＩＶプロモーターの置換を行った。全く異種的にプロモートされそし
てｅｎｖ−プソイド型化されたＦＩＶベクター系は、トランスでのＦＩＶタンパ
ク質の高レベルヒト細胞発現とプロセシングを証明し、そして増殖を停止した有
糸分裂後の分裂ヒト細胞（マクロファージ及びｈＮＴニューロン）を高い力価で
形質導入するＦＩＶレトロウイルスベクターを産生した。この系はネコプロデュ
ーサー細胞の安全性リスクを消失させる。ヒト細胞において異種的にプロモート
されたＦＩＶエンベロープタンパク質による重篤な細胞変性が観察され、そして
本発明のベクターを使用してこの現象を研究した。ヒトサイトメガロウイルスプ
ロモーターによるＦＩＶゲノムの発現は、多種多様なヒト細胞では膨大なＥｎｖ
特異的合胞体細胞を誘導したが、齧歯類細胞では誘導しなかった。さらに、この
融合誘導活性にはＣＸＣＲ４、即ちＨＩＶの合胞体細胞誘導株のコ・レセプター
の共発現が必要であった。しかしながら、そのＣＸＣＲ４−依存性にもかかわら
ず、非宿主細胞ＦＩＶ Ｅｎｖ合胞体細胞誘導はウイルス侵入から分離すること ができた。すなわち、非ネコ細胞でのＣＸＣＲ４発現はＦＩＶ Ｅｎｖ特異的細 胞融合を可能にしたが、ＦＩＶ Ｅｎｖ介在性ベクター形質導入もそしてウイル ス複製も可能にしなかった。コ・レセプターの役割と一致して、ネコ細胞でのヒ
トＣＸＣＲ４発現はウイルス表現型を非細胞変性から高い細胞変性に変化させ、
そしてウイルスの感染性とＦＩＶにエンベロープされたベクターによる形質導入
の両方を高めた。進化的に離れたレンチウイルスによるＣＸＣＲ４の利用は、レ
ンチウイルス複製と細胞変性におけるこのケモカインレセプターの基本的な役割
を暗示している。これらの結果は比較レンチウイルス生物学並びにヒト遺伝子療
法に関して密接な関係を有している。
【０１４２】 ペタルマ（Petaluma）株のＯＲＦ２欠失分子クローン（ＦＩＶ ３４ＴＦ１０ ）１９を使用した（図１）。図１の上部に、ＦＩＶ ３４ＴＦ１０とプラスミド ＣＦ１が示されている。この研究で使用したＣＦ１の更なる修飾物はＦＩＶ ３ ４ＴＦ１０に関する図面の下に示されそして記載されている。ＣＦ１を産生する
ために、３４ＴＦ１０のＳａｃＩ−ＥｓｐＩフラグメントを、ｈＣＭＶＩＥプロ
モーター発現プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（Invitrogen）のポリリンカーのＮｏｔ
ＩとＸｂａＩ間に平滑末端連結した。プラスミドＣＴ５（ＳａｃＩ部位で結合）
では、ＴＡＴＡボックス（ＣＭＶＩＥｐ由来の）とＲ反復配列（ＦＩＶ由来の）
の開始間でｈＣＭＶＩＥプロモーターとＦＩＶゲノムの融合が行われ、そしてこ
れが示されている。ＰＣＲ産生融合物は、ＣＭＶ ＴＡＴＡボックスの下流のＦ ＩＶ Ｒ反復配列を、置換ＦＩＶ ＴＡＴＡボックスの位置に正確に重ねて配置し
ている；これはまた、ｖｉｆ、ＯＲＦ２、ｐｏｌ及びｅｎｖ配列を全て欠いてい
るベクター（下部）の発現も行う。マーカー遺伝子カセットはｌａｃＺに対して
センス方向でありそしてＧＦＰに対してはアンチセンス方向であり、追加的なポ
リ（Ａ）シグナルを有している。フレームシフトは、残っているｇａｇフラグメ
ントのヌクレオチド２９８で上記ベクターに導入された。プソイド型ベクターを
産生させるために、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＨＣＭＶ−Ｇ４２（示されてい
ない）をＣＦ１△ｅｎｖ及び示されたベクターを使用して２９３Ｔ細胞内でコ・
トランスフェクションした。追加的なクローニングの詳細は実施例１に見られる
。
ために、３４ＴＦ１０のＳａｃＩ−ＥｓｐＩフラグメントを、ｈＣＭＶＩＥプロ
モーター発現プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（Invitrogen）のポリリンカーのＮｏｔ
ＩとＸｂａＩ間に平滑末端連結した。プラスミドＣＴ５（ＳａｃＩ部位で結合）
では、ＴＡＴＡボックス（ＣＭＶＩＥｐ由来の）とＲ反復配列（ＦＩＶ由来の）
の開始間でｈＣＭＶＩＥプロモーターとＦＩＶゲノムの融合が行われ、そしてこ
れが示されている。ＰＣＲ産生融合物は、ＣＭＶ ＴＡＴＡボックスの下流のＦ ＩＶ Ｒ反復配列を、置換ＦＩＶ ＴＡＴＡボックスの位置に正確に重ねて配置し
ている；これはまた、ｖｉｆ、ＯＲＦ２、ｐｏｌ及びｅｎｖ配列を全て欠いてい
るベクター（下部）の発現も行う。マーカー遺伝子カセットはｌａｃＺに対して
センス方向でありそしてＧＦＰに対してはアンチセンス方向であり、追加的なポ
リ（Ａ）シグナルを有している。フレームシフトは、残っているｇａｇフラグメ
ントのヌクレオチド２９８で上記ベクターに導入された。プソイド型ベクターを
産生させるために、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＨＣＭＶ−Ｇ４２（示されてい
ない）をＣＦ１△ｅｎｖ及び示されたベクターを使用して２９３Ｔ細胞内でコ・
トランスフェクションした。追加的なクローニングの詳細は実施例１に見られる
。
【０１４３】 ３４ＴＦ１０はクランデルネコ腎細胞（ＣＲＦＫ細胞）を生産的に感染するが
、ネコ末梢血リンパ球又は一次ネコマクロファージを感染しない（Carpenter &
O'Brien（1995年）Current Opinion in Genetics and Development 5、739〜745
；Waters他（1996年）Virology 215、10〜16；Sparger他（1994年）Virology 20 5 、546〜553；Bandecchi他（1995年）New Microbiologica 18、241〜252；Tozzi
ni他（1992年）Journal of Virological Methods 37、241〜252（1992年）；Olm
sted他（1989年）Proceedings of the National Academy of Sciences of the U
nited States of America 86、2448〜2452）。この制限された屈性はｅｎｖにで
はなくてＯＲＦ２突然変異に位置する。つまり、ＯＲＦ２、即ち推定上のＬＴＲ
トランスアクチベーターの修復はこれら３６のネコ細胞型の全ての生産的３４Ｔ
Ｆ１０感染を生じさせる。かくして、３４ＴＦ１０エンベロープは、ＨＩＶとの
ゆるやかな類似性によって「二重屈性」であると考えることができる。しかしな
がら、ｌａｂ適合性／Ｔ−屈性対一次／マクロファージ屈性分類はＦＩＶ株又は
クローンに関しては確立されていない。実際、エイズ（ＡＩＤＳ）になるＣＤ４
枯渇は特徴的であるが、ＦＩＶは感染したネコにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞だけでな
くＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢ細胞も感染させる（Pedersen（1993年）上述）。３４Ｔ
Ｆ１０又は任意の他の飼いネコ株若しくはクローンはいずれもＣＲＦＫ細胞内で
細胞溶解性である。小さな多核巨大細胞（４〜１２個の核）が最大限感染させた
培養物中で検出されることがあるが、広範囲の細胞死は生起していない（Barr他
（1995年）、上述；Tozzini他（1992年）Journal of Virological Methods 37、
241〜252；Barr（1997年）Virology 228、84〜91）。３４ＴＦ１０は実験的に感
染させた飼いネコでは重大なウイルス血症又は疾病を引き起こさず、ＯＲＦ２修
復クローンのインビボ表現型は未だ知られていない（Sparger他（1994年）Virol
ogy 205、546〜553）。
、ネコ末梢血リンパ球又は一次ネコマクロファージを感染しない（Carpenter &
O'Brien（1995年）Current Opinion in Genetics and Development 5、739〜745
；Waters他（1996年）Virology 215、10〜16；Sparger他（1994年）Virology 20 5 、546〜553；Bandecchi他（1995年）New Microbiologica 18、241〜252；Tozzi
ni他（1992年）Journal of Virological Methods 37、241〜252（1992年）；Olm
sted他（1989年）Proceedings of the National Academy of Sciences of the U
nited States of America 86、2448〜2452）。この制限された屈性はｅｎｖにで
はなくてＯＲＦ２突然変異に位置する。つまり、ＯＲＦ２、即ち推定上のＬＴＲ
トランスアクチベーターの修復はこれら３６のネコ細胞型の全ての生産的３４Ｔ
Ｆ１０感染を生じさせる。かくして、３４ＴＦ１０エンベロープは、ＨＩＶとの
ゆるやかな類似性によって「二重屈性」であると考えることができる。しかしな
がら、ｌａｂ適合性／Ｔ−屈性対一次／マクロファージ屈性分類はＦＩＶ株又は
クローンに関しては確立されていない。実際、エイズ（ＡＩＤＳ）になるＣＤ４
枯渇は特徴的であるが、ＦＩＶは感染したネコにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞だけでな
くＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢ細胞も感染させる（Pedersen（1993年）上述）。３４Ｔ
Ｆ１０又は任意の他の飼いネコ株若しくはクローンはいずれもＣＲＦＫ細胞内で
細胞溶解性である。小さな多核巨大細胞（４〜１２個の核）が最大限感染させた
培養物中で検出されることがあるが、広範囲の細胞死は生起していない（Barr他
（1995年）、上述；Tozzini他（1992年）Journal of Virological Methods 37、
241〜252；Barr（1997年）Virology 228、84〜91）。３４ＴＦ１０は実験的に感
染させた飼いネコでは重大なウイルス血症又は疾病を引き起こさず、ＯＲＦ２修
復クローンのインビボ表現型は未だ知られていない（Sparger他（1994年）Virol
ogy 205、546〜553）。
【０１４４】 図１に図示されているように、ヒトサイトメガロウイルス急性期遺伝子プロモ
ーター（ｈＣＭＶＩＥｐ）を、（ａ）ＦＩＶ主要５’スプライスドナー（プラス
ミドＣＦ１中）の上流９７ヌクレオチドの結合部と共にＦＩＶ ＬＴＲを全て置 換するように、又は（ｂ）ＴＡＴＡボックスと転写開始、即ちＲ反復配列間の−
１４位における融合によってＦＩＶ Ｕ３プロモーターエレメント（プラスミド ＣＴ５中とＦＩＶベクター中）を選択的に置換するように配列させた。この配列
によって、ＣＭＶ ＴＡＴＡボックスは転写開始部（−２７位）に関して置換Ｆ ＩＶ ＴＡＴＡボックスの位置に正確に重ねて配置される。ＣＦ１は、ｒｅｖ Ｏ
ＲＦと重複している３−プライムＵ３の８９ヌクレオチド部分を除いて両ＬＴＲ
を欠いている（ＦＩＶはＨＩＶ ｎｅｆと相同性を有していない）ので、複製や 組込みに必要なシス作用性配列（Ｕ３プロモーター配列、ｔＲＮＡプライマー結
合部位、Ｒ反復配列、Ｕ５エレメント）を欠いている。この実施例に記載した構
築物のクローニングに関する詳細については実施例１も参照されたい。ＣＦ１△
ｅｎｖはｅｎｖにおいて、ＳＵ−ＴＭ結合部に及んでおり且つフレームシフトも
している更なる８７５ヌクレオチド欠失を有している：それ故、プソイド型ベク
ターのパッケージングに使用したこのプラスミドはＯＲＦ−２、ｅｎｖ及び認め
られたシス作用性レトロウイルスエレメントを欠いている。対照的に、ＣＴ５は
野生型の複製可能３４ＴＦ１０を完全にコードしている。それ故、この系はネコ
プロモーターの必要性を排除している。それ故、ＯＲＦ２の機能は決定的には特
定されていないが、この遺伝子産生物３６に関して記載されたＦＩＶ ＬＴＲト ランス活性化活性も不要であろう。
ーター（ｈＣＭＶＩＥｐ）を、（ａ）ＦＩＶ主要５’スプライスドナー（プラス
ミドＣＦ１中）の上流９７ヌクレオチドの結合部と共にＦＩＶ ＬＴＲを全て置 換するように、又は（ｂ）ＴＡＴＡボックスと転写開始、即ちＲ反復配列間の−
１４位における融合によってＦＩＶ Ｕ３プロモーターエレメント（プラスミド ＣＴ５中とＦＩＶベクター中）を選択的に置換するように配列させた。この配列
によって、ＣＭＶ ＴＡＴＡボックスは転写開始部（−２７位）に関して置換Ｆ ＩＶ ＴＡＴＡボックスの位置に正確に重ねて配置される。ＣＦ１は、ｒｅｖ Ｏ
ＲＦと重複している３−プライムＵ３の８９ヌクレオチド部分を除いて両ＬＴＲ
を欠いている（ＦＩＶはＨＩＶ ｎｅｆと相同性を有していない）ので、複製や 組込みに必要なシス作用性配列（Ｕ３プロモーター配列、ｔＲＮＡプライマー結
合部位、Ｒ反復配列、Ｕ５エレメント）を欠いている。この実施例に記載した構
築物のクローニングに関する詳細については実施例１も参照されたい。ＣＦ１△
ｅｎｖはｅｎｖにおいて、ＳＵ−ＴＭ結合部に及んでおり且つフレームシフトも
している更なる８７５ヌクレオチド欠失を有している：それ故、プソイド型ベク
ターのパッケージングに使用したこのプラスミドはＯＲＦ−２、ｅｎｖ及び認め
られたシス作用性レトロウイルスエレメントを欠いている。対照的に、ＣＴ５は
野生型の複製可能３４ＴＦ１０を完全にコードしている。それ故、この系はネコ
プロモーターの必要性を排除している。それ故、ＯＲＦ２の機能は決定的には特
定されていないが、この遺伝子産生物３６に関して記載されたＦＩＶ ＬＴＲト ランス活性化活性も不要であろう。
【０１４５】 ヒト細胞中に３４ＴＦ１０ではなくてＣＦ１又はＣＴ５（図１）をトランスフ
ェクションすると１２〜１８時間以内に爆発的な合胞体細胞形成が生じた。Ｈｅ
Ｌａ細胞及び２９３ヒト胚性腎細胞単層は、ＣＦ１又はＣＴ５のトランスフェク
ション後４８〜６０時間以内に合胞体細胞溶解によって、再現可能的に９０〜９
５％破壊された。３つのプラスミドは全て常に、より少なく（４００倍）より小
さな（４〜１２個の核）多数の合胞体細胞を産生し、そしてＣＲＦＫ細胞では認
識可能な細胞溶解は得られなかった。
ェクションすると１２〜１８時間以内に爆発的な合胞体細胞形成が生じた。Ｈｅ
Ｌａ細胞及び２９３ヒト胚性腎細胞単層は、ＣＦ１又はＣＴ５のトランスフェク
ション後４８〜６０時間以内に合胞体細胞溶解によって、再現可能的に９０〜９
５％破壊された。３つのプラスミドは全て常に、より少なく（４００倍）より小
さな（４〜１２個の核）多数の合胞体細胞を産生し、そしてＣＲＦＫ細胞では認
識可能な細胞溶解は得られなかった。
【０１４６】 エレクトロポレートしたＵ８７ＭＧ及びＵ８７ＭＧ．ＣＸＣＲ４細胞を除いて
、トランスフェクションはリン酸カルシウム沈殿法によるものであった。全ての
場合において、この研究でトランスフェクションした細胞は、同一のリン酸カル
シウム沈殿物で同時にトランスフェクションした細胞を使用して定量的合胞体細
胞巣状アッセイで比較した。細胞はクリスタル・バイオレットによってか又は、
巣状感染性アッセイでは、ＦＩＶ−ペタルマ血清及びネコＩｇＧ４１に対するホ
ースラディッシュ・ペルオキシダーゼ抱合ヤギ二次抗体を用いるイムノペルオキ
シダーゼ染色によって染色した。比較は全て、ｈＣＭＶＩＥでプロモートしたＧ
ＦＰ又はＬａｃＺレポータープラスミドのコ・トランスフェクションによってイ
ンプットＤＮＡの１０％として制御した。トランスフェクション効率が比較細胞
系間で＜５％で変化する実験だけ報告する。溶解がＣＦ１に対して２４時間目に
広範囲であった場合、ＧＦＰ蛍光による比較トランスフェクション効率は、合胞
体細胞形成を阻止するためにＦＩＶ感染飼いネコ血漿の１：３００希釈物の存在
下平行ウェル中でアッセイした。細胞は全て、抗生物質を有する１０％ウシ血清
中で増殖させたＡＴＣＣ系であり、ＣＲＦＫ細胞は記載されているようにしてＬ
５０培地中で増殖させた。ＣＲＦＫのＡＴＣＣ番号はＡＴＣＣＣＣＬ９４であっ
た。
、トランスフェクションはリン酸カルシウム沈殿法によるものであった。全ての
場合において、この研究でトランスフェクションした細胞は、同一のリン酸カル
シウム沈殿物で同時にトランスフェクションした細胞を使用して定量的合胞体細
胞巣状アッセイで比較した。細胞はクリスタル・バイオレットによってか又は、
巣状感染性アッセイでは、ＦＩＶ−ペタルマ血清及びネコＩｇＧ４１に対するホ
ースラディッシュ・ペルオキシダーゼ抱合ヤギ二次抗体を用いるイムノペルオキ
シダーゼ染色によって染色した。比較は全て、ｈＣＭＶＩＥでプロモートしたＧ
ＦＰ又はＬａｃＺレポータープラスミドのコ・トランスフェクションによってイ
ンプットＤＮＡの１０％として制御した。トランスフェクション効率が比較細胞
系間で＜５％で変化する実験だけ報告する。溶解がＣＦ１に対して２４時間目に
広範囲であった場合、ＧＦＰ蛍光による比較トランスフェクション効率は、合胞
体細胞形成を阻止するためにＦＩＶ感染飼いネコ血漿の１：３００希釈物の存在
下平行ウェル中でアッセイした。細胞は全て、抗生物質を有する１０％ウシ血清
中で増殖させたＡＴＣＣ系であり、ＣＲＦＫ細胞は記載されているようにしてＬ
５０培地中で増殖させた。ＣＲＦＫのＡＴＣＣ番号はＡＴＣＣＣＣＬ９４であっ
た。
【０１４７】 以前の研究（Bar他（1995年）Journal of Virology 69、7371〜7374）と一致 して、ＣＲＦＫ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９４）の３４ＴＦ１０及びＣＴ５トランス
フェクションによって、７〜１４日までに高いＲＴ値（＞５×１０5ｃｐｍ／ｍ ｌ）による永続的感染が確立されたが、細胞変性効果は最小限であった（６ウェ
ルプレートの９．６ｃｍ2ウェル当たり６〜１２±４個の合胞体細胞、４〜８個 の核）。しかしながら、予期されたように、ＣＦ１は感染性ウイルスを産生しな
かった。すなわち、１０7個のＣＲＦＫ細胞又は１０7個のヒト細胞（ＨｅＬａ、
２９３、Ｈ９、Ｍｏｌｔ４、ｓｕｐＴ１、Ｕ９３７）に対してＣＦ１でトランス
フェクションしたヒト又はネコ細胞から得られたろ過上清液を継代しても合胞体
細胞又はＲＴ産生をもたらさなかった。付着細胞系も、以前に記載された巣状感
染性アッセイ（ＦＩＡ）（Remington他（1991年）Journal of Virology 65、308
〜312）で陰性であり、３４ＴＦ１０−又はＣＴ５−感染ＣＲＦＫ細胞では１ｍ ｌ当たり＜５感染単位に対して感受性であった。
フェクションによって、７〜１４日までに高いＲＴ値（＞５×１０5ｃｐｍ／ｍ ｌ）による永続的感染が確立されたが、細胞変性効果は最小限であった（６ウェ
ルプレートの９．６ｃｍ2ウェル当たり６〜１２±４個の合胞体細胞、４〜８個 の核）。しかしながら、予期されたように、ＣＦ１は感染性ウイルスを産生しな
かった。すなわち、１０7個のＣＲＦＫ細胞又は１０7個のヒト細胞（ＨｅＬａ、
２９３、Ｈ９、Ｍｏｌｔ４、ｓｕｐＴ１、Ｕ９３７）に対してＣＦ１でトランス
フェクションしたヒト又はネコ細胞から得られたろ過上清液を継代しても合胞体
細胞又はＲＴ産生をもたらさなかった。付着細胞系も、以前に記載された巣状感
染性アッセイ（ＦＩＡ）（Remington他（1991年）Journal of Virology 65、308
〜312）で陰性であり、３４ＴＦ１０−又はＣＴ５−感染ＣＲＦＫ細胞では１ｍ ｌ当たり＜５感染単位に対して感受性であった。
【０１４８】 ヒト細胞又はＣＲＦＫ細胞のどちらで産生させたとしても、ｐ３４ＴＦ１０−
又はＣＴ５−産生ＦＩＶはどちらもヒト細胞内で複製しなかった。それにも拘わ
らず、ＣＦ１△ｅｎｖのトランスフェクションではどの細胞内でも合胞体細胞は
産生されなかったが比較的高いＲＴ値を生じさせたので、ヒト及びネコ細胞内へ
のＣＦ１及びＣＴ５トランスフェクションで産生された合胞体細胞はＦＩＶエン
ベロープタンパク質によって特異的に生起させられた。
又はＣＴ５−産生ＦＩＶはどちらもヒト細胞内で複製しなかった。それにも拘わ
らず、ＣＦ１△ｅｎｖのトランスフェクションではどの細胞内でも合胞体細胞は
産生されなかったが比較的高いＲＴ値を生じさせたので、ヒト及びネコ細胞内へ
のＣＦ１及びＣＴ５トランスフェクションで産生された合胞体細胞はＦＩＶエン
ベロープタンパク質によって特異的に生起させられた。
【０１４９】 Ｍｇ２+依存性逆転写酵素は、指示されたプラスミドをＣＲＦＫ細胞、ＨｅＬ ａ、２９３及び２９３Ｔ細胞内でトランスフェクションして５２時間後に以前に
記載された（Willey他（1988年）Journal of Virology 62、139〜147）ようにし
て測定した。広範な合胞体細胞溶解はＣＴ５、ＣＦ１、ＣＦ１△ｐｏｌ及びｐＨ
ＣＭＶ−Ｇでトランスフェクションした細胞内で見られた。後者の２つのプラス
ミドはウイルス特異性を証明するために細胞溶解用の対照として含めた。１．０
の感染多重度のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２を使用して２週間早く感染させたＨ９
細胞から得られた上清液も比較のためにアッセイした。図２において、各点は三
重複測定平均値±Ｓ．Ｅ．である。 ＦＩＶ（ペタルマ株）で感染させた飼いネコ血漿でトランスフェクションした
細胞の放射線免疫沈降法を行った。２９３細胞、ＨｅＬａ及びＣＲＦＫ細胞は、
２５ｃｍ2のフラスコ内でリン酸カルシウム沈殿法によって、指示されたプラス ミドでトランスフェクションさせた。トランスフェクション後２７時間（２９３
細胞）又は４８時間（ＨｅＬａ及びＣＲＦＫ細胞）目に、７．５％の透析ウシ胎
児血清を有するシステイン及びメチオニン不含培地中で35Ｓ−システイン及び35 Ｓ−メチオニンを使用して、同位元素を有していない上記培地中で１時間予めイ
ンキュベートした後に、細胞を５時間放射線標識した。溶解物は正常ネコ血清及
びプロテインＡセファロースを使用して予め清浄化し、ＦＩＶ感染ネコ血漿１０
μｌと共に一夜インキュベートし、プロテインＡセファロースで沈殿させ、そし
て１０又は１２．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で予め染色したマーカ
ーを使用して電気泳動にかけた。溶解物は、広範な合胞体細胞溶解により細胞が
損失したので、概ね１５〜２５％の量の他のレーンの細胞から誘導した。パネル
Ｂは、２９３Ｔ及びＨｅＬａ細胞におけるＦＩＶ感染飼いネコ血漿によるＣＦ１
誘導合胞体細胞の阻害を示す。合胞体細胞はメタノール固定細胞のクリスタル・
バイオレット染色によって、≧８個の核を有する巣状物として４８時間目に記録
した。１２ウエルプレート内でのトランスフェクション時にＦＩＶ＋（四角、丸
）か又はＦＩＶ−（菱形、三角）血漿のどちらかの希釈物を細胞に添加し、そし
て１４時間後に再度培地を交換した。
記載された（Willey他（1988年）Journal of Virology 62、139〜147）ようにし
て測定した。広範な合胞体細胞溶解はＣＴ５、ＣＦ１、ＣＦ１△ｐｏｌ及びｐＨ
ＣＭＶ−Ｇでトランスフェクションした細胞内で見られた。後者の２つのプラス
ミドはウイルス特異性を証明するために細胞溶解用の対照として含めた。１．０
の感染多重度のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２を使用して２週間早く感染させたＨ９
細胞から得られた上清液も比較のためにアッセイした。図２において、各点は三
重複測定平均値±Ｓ．Ｅ．である。 ＦＩＶ（ペタルマ株）で感染させた飼いネコ血漿でトランスフェクションした
細胞の放射線免疫沈降法を行った。２９３細胞、ＨｅＬａ及びＣＲＦＫ細胞は、
２５ｃｍ2のフラスコ内でリン酸カルシウム沈殿法によって、指示されたプラス ミドでトランスフェクションさせた。トランスフェクション後２７時間（２９３
細胞）又は４８時間（ＨｅＬａ及びＣＲＦＫ細胞）目に、７．５％の透析ウシ胎
児血清を有するシステイン及びメチオニン不含培地中で35Ｓ−システイン及び35 Ｓ−メチオニンを使用して、同位元素を有していない上記培地中で１時間予めイ
ンキュベートした後に、細胞を５時間放射線標識した。溶解物は正常ネコ血清及
びプロテインＡセファロースを使用して予め清浄化し、ＦＩＶ感染ネコ血漿１０
μｌと共に一夜インキュベートし、プロテインＡセファロースで沈殿させ、そし
て１０又は１２．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で予め染色したマーカ
ーを使用して電気泳動にかけた。溶解物は、広範な合胞体細胞溶解により細胞が
損失したので、概ね１５〜２５％の量の他のレーンの細胞から誘導した。パネル
Ｂは、２９３Ｔ及びＨｅＬａ細胞におけるＦＩＶ感染飼いネコ血漿によるＣＦ１
誘導合胞体細胞の阻害を示す。合胞体細胞はメタノール固定細胞のクリスタル・
バイオレット染色によって、≧８個の核を有する巣状物として４８時間目に記録
した。１２ウエルプレート内でのトランスフェクション時にＦＩＶ＋（四角、丸
）か又はＦＩＶ−（菱形、三角）血漿のどちらかの希釈物を細胞に添加し、そし
て１４時間後に再度培地を交換した。
【０１５０】 ＣＦ１でトランスフェクションしたヒト細胞内の合胞体細胞はＦＩＶペタムラ
株で感染させた飼いネコ血漿によって強力に抑制され、２９３Ｔ及びＨｅＬａ細
胞において、それぞれ１：３２，０００倍及び１：１２，７００倍希釈で５０％
阻害され、一方前免疫飼いネコ血漿は、どのような希釈であっても、１：１０で
さえ合胞体細胞形成に対して効果を全く有していなかった（図２Ｂ）。さらに、
合胞体細胞誘導は、ｅｎｖのＳＵ部分に限定されたフレームシフトしていない５
３９ヌクレオチド（ヌクレオチド７３２２〜７８６１）のより小さな欠失（ＴＭ
ドメインと上流のタンパク質溶解開裂部位を割愛；図１のＣＦ１△ＳＵ参照）に
よって終了したので、合胞体細胞誘導にはエンベロープのＳＵ及びＴＭドメイン
の両方が必要であることを示唆している。これらの実験用の１：３００希釈抗血
清の存在下で、平行ウエルにおいてＧＦＰレポーター コ・トランスフェクショ ンによって決定されたトランスフェクション効率は≦１０％であったので、合胞
体細胞溶解が非トランスフェクション細胞とトランスフェクション細胞との融合
によって媒介されることを示していた。
株で感染させた飼いネコ血漿によって強力に抑制され、２９３Ｔ及びＨｅＬａ細
胞において、それぞれ１：３２，０００倍及び１：１２，７００倍希釈で５０％
阻害され、一方前免疫飼いネコ血漿は、どのような希釈であっても、１：１０で
さえ合胞体細胞形成に対して効果を全く有していなかった（図２Ｂ）。さらに、
合胞体細胞誘導は、ｅｎｖのＳＵ部分に限定されたフレームシフトしていない５
３９ヌクレオチド（ヌクレオチド７３２２〜７８６１）のより小さな欠失（ＴＭ
ドメインと上流のタンパク質溶解開裂部位を割愛；図１のＣＦ１△ＳＵ参照）に
よって終了したので、合胞体細胞誘導にはエンベロープのＳＵ及びＴＭドメイン
の両方が必要であることを示唆している。これらの実験用の１：３００希釈抗血
清の存在下で、平行ウエルにおいてＧＦＰレポーター コ・トランスフェクショ ンによって決定されたトランスフェクション効率は≦１０％であったので、合胞
体細胞溶解が非トランスフェクション細胞とトランスフェクション細胞との融合
によって媒介されることを示していた。
【０１５１】 次いで、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイ及びＦＩＶ感染飼いネコから得られた血
漿を使用する放射線標識細胞の免疫沈降法によってヒト細胞における発現を更に
試験した。ｈＣＭＶＩＥでプロモートされた構築物はヒト細胞（ＨｅＬａ、２９
３、２９３Ｔ）内で高いＭｇ２+依存性ＲＴ値を発現し、そしてさらにまた、ネ コ（ＣＲＦＫ）細胞及びヒト細胞の両方でｐ３４ＴＦ１０の天然ＬＴＲより優れ
ていた（図２Ａ）。対照的に、ヒト細胞内での３４ＴＦ１０によるＬＴＲ誘導Ｒ
Ｔ発現は最小限であった：ｈＣＭＶＩＥｐ−キメラ構築物によるタンパク質発現
もネコ細胞内での３４ＴＦ１０発現を概ね６倍のファクターだけ上回っていた。
ｐｏｌ−欠失突然変異体（ＣＦ１△ｐｏｌ）はＲＴを全く産生しなかった（図２
Ａ）が、ＣＦ１と同様に広範に合胞体細胞を産生した。
漿を使用する放射線標識細胞の免疫沈降法によってヒト細胞における発現を更に
試験した。ｈＣＭＶＩＥでプロモートされた構築物はヒト細胞（ＨｅＬａ、２９
３、２９３Ｔ）内で高いＭｇ２+依存性ＲＴ値を発現し、そしてさらにまた、ネ コ（ＣＲＦＫ）細胞及びヒト細胞の両方でｐ３４ＴＦ１０の天然ＬＴＲより優れ
ていた（図２Ａ）。対照的に、ヒト細胞内での３４ＴＦ１０によるＬＴＲ誘導Ｒ
Ｔ発現は最小限であった：ｈＣＭＶＩＥｐ−キメラ構築物によるタンパク質発現
もネコ細胞内での３４ＴＦ１０発現を概ね６倍のファクターだけ上回っていた。
ｐｏｌ−欠失突然変異体（ＣＦ１△ｐｏｌ）はＲＴを全く産生しなかった（図２
Ａ）が、ＣＦ１と同様に広範に合胞体細胞を産生した。
【０１５２】 トランスフェクションし、放射線標識したヒト及びネコ細胞の免疫沈降法によ
って、ＲＴアッセイと同等の量でヒト細胞内でのＣＦ１又はＣＴ５による野生型
３４ＴＦ１０発現パターンが証明された。それにも拘わらず、ｐ３４ＴＦ１０発
現はＨｅＬａ細胞ではＲＩＰＡによって明白に検出可能であったが、ＣＭＶＩＥ
ｐ−キメラよりかなり低い値であり、そして２９３又は２９３Ｔ細胞では検出で
きなかった（フィルム暴露を延長した後であっても）。この結果と一致して、小
さな合胞体細胞（４〜６個の核、１１〜１４個の合胞体細胞±４、ｎ＝４、６ウ
エルプレートの１ウエル当たり）はｐ３４ＴＦ１０トランスフェクション４８時
間後のＨｅＬａ細胞で検出可能であった。ＣＦ１△ＳＵのフレーム保持ＳＵ欠失
によって、予測される切断エンベローププリカーサーが生じ、これは短縮ＳＵ／
ｇｐ１００開裂産生物を有する殆ど解析されていない塗沫標本と一致する。使用
した血漿はどの細胞から得られるＴＭタンパク質も沈殿させなかった。他の２つ
のｅｎｖ突然変異体は免疫沈降性Ｅｎｖ産生を終了し、そしてどのエンベロープ
突然変異体も全ての細胞内で合胞体細胞を形成しなかった。ＲＴデータと一致し
て、ＣＦ１発現もＣＲＦＫ細胞内のＬＴＲ作用性発現より優れていた。
って、ＲＴアッセイと同等の量でヒト細胞内でのＣＦ１又はＣＴ５による野生型
３４ＴＦ１０発現パターンが証明された。それにも拘わらず、ｐ３４ＴＦ１０発
現はＨｅＬａ細胞ではＲＩＰＡによって明白に検出可能であったが、ＣＭＶＩＥ
ｐ−キメラよりかなり低い値であり、そして２９３又は２９３Ｔ細胞では検出で
きなかった（フィルム暴露を延長した後であっても）。この結果と一致して、小
さな合胞体細胞（４〜６個の核、１１〜１４個の合胞体細胞±４、ｎ＝４、６ウ
エルプレートの１ウエル当たり）はｐ３４ＴＦ１０トランスフェクション４８時
間後のＨｅＬａ細胞で検出可能であった。ＣＦ１△ＳＵのフレーム保持ＳＵ欠失
によって、予測される切断エンベローププリカーサーが生じ、これは短縮ＳＵ／
ｇｐ１００開裂産生物を有する殆ど解析されていない塗沫標本と一致する。使用
した血漿はどの細胞から得られるＴＭタンパク質も沈殿させなかった。他の２つ
のｅｎｖ突然変異体は免疫沈降性Ｅｎｖ産生を終了し、そしてどのエンベロープ
突然変異体も全ての細胞内で合胞体細胞を形成しなかった。ＲＴデータと一致し
て、ＣＦ１発現もＣＲＦＫ細胞内のＬＴＲ作用性発現より優れていた。
【０１５３】 総合すると、これらのデータは、非霊長類レンチウイルスの全ゲノムレパート
リーの高レベル発現がヒト細胞内で生起しておりそしてプロモーター置換によっ
て、ヒト細胞内で生産相のＦＩＶ複製が最大限の効率で且つＣＲＦＫ細胞中の天
然プロモーターか又はＣＭＶＩＥプロモーターのどちらかで見られる値より高い
値で生起できるようになる（Ｒｅｖ／ＲＲＥ調節軸、スプライシング、Ｇａｇ／
ＰｏｌとＥｎｖプリカーサーの両者の産生、及び各々の正しいタンパク質溶解プ
ロセシングを含めて）ことを示している。選択的Ｕ３置換（ＣＴ５で、そして以
下に記載するベクターで使用するために）と全ＬＴＲ置換（トランスでタンパク
質を産生するために）は共に有効であった。
リーの高レベル発現がヒト細胞内で生起しておりそしてプロモーター置換によっ
て、ヒト細胞内で生産相のＦＩＶ複製が最大限の効率で且つＣＲＦＫ細胞中の天
然プロモーターか又はＣＭＶＩＥプロモーターのどちらかで見られる値より高い
値で生起できるようになる（Ｒｅｖ／ＲＲＥ調節軸、スプライシング、Ｇａｇ／
ＰｏｌとＥｎｖプリカーサーの両者の産生、及び各々の正しいタンパク質溶解プ
ロセシングを含めて）ことを示している。選択的Ｕ３置換（ＣＴ５で、そして以
下に記載するベクターで使用するために）と全ＬＴＲ置換（トランスでタンパク
質を産生するために）は共に有効であった。
【０１５４】 ヒト細胞におけるＦＩＶライフサイクルの侵入後相を試験するために、ｐｏｌ
、ｅｎｖ及びアクセサリー遺伝子並びにｇａｇの一部分を置換している内部的に
プロモートされるマーカー遺伝子カセットを含有するレトロウイルスベクターを
構築するための出発点としてＣＴ５を使用した。ＴｔｈＩＩＩ１部位を平滑化閉
鎖して全てのベクターの残っているｇａｇＯＲＦのヌクレオチド２９８にフレー
ムシフト突然変異を導入し、ヌクレオチド３１９に停止コドンを産生させた（図
１）。ベクターＣＴＲＺＬｂは、リン酸カルシウム共沈殿法によって２９３Ｔ細
胞内でＣＦ１△ｅｎｖ及びＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＨＣＭＶ−Ｇを使用して
コ・トランスフェクションさせた。トランスフェクション後４８〜９６時間目に
、ＦＩＶベクターと対照ＶＳＶ−Ｇプソイド型化Ｍｕ−ＭＬＶ ｌａｃＺベクタ ーの上清液を清明化し、ろ過し（０．４５μＭ）、ＨｅＬａ細胞上で滴定し、そ
してその後ネコ及びヒト細胞系集団に対する限定希釈によって再度滴定した。こ
れらの実験は増殖中か又は２０μｇ／ｍｌのアフィジコリンを使用してＧ１／Ｓ
に停止させた細胞を使用して行った。慣用のモロニーマウス白血病ウイルスレト
ロウイルスベクターの力価と同等の高力価（１０6）は、超遠心による単一ラウ ンド濃縮（Burns他（1993年）Proceedings of the National Academy of Scienc
es of the United States of America 90、8033〜8037）によって達成すること ができた。ＨＩＶベクターと同様に、ＦＩＶベクターは細胞周期停止では最小限
にしか影響を受けなかったが、Ｍｕ−ＭＬＶベクター形質導入は消失したので、
ＦＩＶベクターのこのレンチウイルス特異的特性及びこの特性をヒト細胞に伝達
できることが証明された。同等に重要なことは、増殖中の細胞内でＶＳＶ−Ｇプ
ソイド型化モロニーマウス白血病ウイルスｌａｃＺベクターと比較したとき、Ｆ
ＩＶベクターはネコ細胞に対する顕著な優先性を示さなかったことである（力価
比の比較、挿入表のプロット参照）。ＣＴＲＺＬｂで形質導入した後の増殖が可
能になったとき、大きな（１００〜４００個の細胞）同種ｌａｃＺ陽性コロニー
が産生され、導入遺伝子の安定でクローン的維持を示していた。細胞系は予期さ
れたように形質導入性がかなり変化したが、これらの差異はモロニーとＦＩＶベ
クターで同等であった。即ち、これらの差異はベクター特異的というよりはむし
ろ細胞特異的であったので、ＶＳＶ−Ｇ介在性形質導入を受け易いことを示して
いる。それ故、非ネコ細胞におけるＦＩＶライフサイクルの感染段階に対する主
要な遮断は更に下流というよりはむしろビリオン侵入段階であることが示されて
いる。
、ｅｎｖ及びアクセサリー遺伝子並びにｇａｇの一部分を置換している内部的に
プロモートされるマーカー遺伝子カセットを含有するレトロウイルスベクターを
構築するための出発点としてＣＴ５を使用した。ＴｔｈＩＩＩ１部位を平滑化閉
鎖して全てのベクターの残っているｇａｇＯＲＦのヌクレオチド２９８にフレー
ムシフト突然変異を導入し、ヌクレオチド３１９に停止コドンを産生させた（図
１）。ベクターＣＴＲＺＬｂは、リン酸カルシウム共沈殿法によって２９３Ｔ細
胞内でＣＦ１△ｅｎｖ及びＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＨＣＭＶ−Ｇを使用して
コ・トランスフェクションさせた。トランスフェクション後４８〜９６時間目に
、ＦＩＶベクターと対照ＶＳＶ−Ｇプソイド型化Ｍｕ−ＭＬＶ ｌａｃＺベクタ ーの上清液を清明化し、ろ過し（０．４５μＭ）、ＨｅＬａ細胞上で滴定し、そ
してその後ネコ及びヒト細胞系集団に対する限定希釈によって再度滴定した。こ
れらの実験は増殖中か又は２０μｇ／ｍｌのアフィジコリンを使用してＧ１／Ｓ
に停止させた細胞を使用して行った。慣用のモロニーマウス白血病ウイルスレト
ロウイルスベクターの力価と同等の高力価（１０6）は、超遠心による単一ラウ ンド濃縮（Burns他（1993年）Proceedings of the National Academy of Scienc
es of the United States of America 90、8033〜8037）によって達成すること ができた。ＨＩＶベクターと同様に、ＦＩＶベクターは細胞周期停止では最小限
にしか影響を受けなかったが、Ｍｕ−ＭＬＶベクター形質導入は消失したので、
ＦＩＶベクターのこのレンチウイルス特異的特性及びこの特性をヒト細胞に伝達
できることが証明された。同等に重要なことは、増殖中の細胞内でＶＳＶ−Ｇプ
ソイド型化モロニーマウス白血病ウイルスｌａｃＺベクターと比較したとき、Ｆ
ＩＶベクターはネコ細胞に対する顕著な優先性を示さなかったことである（力価
比の比較、挿入表のプロット参照）。ＣＴＲＺＬｂで形質導入した後の増殖が可
能になったとき、大きな（１００〜４００個の細胞）同種ｌａｃＺ陽性コロニー
が産生され、導入遺伝子の安定でクローン的維持を示していた。細胞系は予期さ
れたように形質導入性がかなり変化したが、これらの差異はモロニーとＦＩＶベ
クターで同等であった。即ち、これらの差異はベクター特異的というよりはむし
ろ細胞特異的であったので、ＶＳＶ−Ｇ介在性形質導入を受け易いことを示して
いる。それ故、非ネコ細胞におけるＦＩＶライフサイクルの感染段階に対する主
要な遮断は更に下流というよりはむしろビリオン侵入段階であることが示されて
いる。
【０１５５】 ＦＩＶベクターが非分裂ヒト細胞を形質導入できる能力を更に評価するために
、本発明者は、２つの最も進展した限定的なヒト組織培養モデル、すなわち一次
ヒトマクロファージ及びｈＮＴニューロンを使用して有糸分裂後ヒト細胞を形質
導入した。ｈＮＴニューロンは不可逆的に分化され、偏光ヒトニューロンは、レ
チノイン酸及び幾つかの有糸分裂インヒビターを使用して６週間処理することに
よってＮＴ２奇形癌腫細胞から誘導される。ここで使用した、３回目に播いたｈ
ＮＴ細胞は不可逆的に有糸分裂後であるので、ヌードマウスの脳内に移植して１
年後にそのままであり、一次ニューロンと形態学的に類似しており、多量のニュ
ーロン特異的マーカーを発現し、そして機能的軸索及び樹状突起を構成するニュ
ーロン集団を成長させた。ｌａｃＺ染色を示した１．０の感染多重度で形質導入
されたｈＮＴニューロンは細胞体と突起の両方で見ることができた。一次ヒトマ
クロファージは高いバックグラウンドｌａｃＺ染色を示したので、正常ドナーの
末梢血から単離した後９日目にＧＦＰベクターＣＴＡＧＣｂを使用して形質導入
した。これらの細胞はＦＩＶベクターによって高力価で形質導入されたが、ＧＦ
Ｐ形質導入Ｍｕ−ＭＬＶベクターでは形質導入されなかった。
、本発明者は、２つの最も進展した限定的なヒト組織培養モデル、すなわち一次
ヒトマクロファージ及びｈＮＴニューロンを使用して有糸分裂後ヒト細胞を形質
導入した。ｈＮＴニューロンは不可逆的に分化され、偏光ヒトニューロンは、レ
チノイン酸及び幾つかの有糸分裂インヒビターを使用して６週間処理することに
よってＮＴ２奇形癌腫細胞から誘導される。ここで使用した、３回目に播いたｈ
ＮＴ細胞は不可逆的に有糸分裂後であるので、ヌードマウスの脳内に移植して１
年後にそのままであり、一次ニューロンと形態学的に類似しており、多量のニュ
ーロン特異的マーカーを発現し、そして機能的軸索及び樹状突起を構成するニュ
ーロン集団を成長させた。ｌａｃＺ染色を示した１．０の感染多重度で形質導入
されたｈＮＴニューロンは細胞体と突起の両方で見ることができた。一次ヒトマ
クロファージは高いバックグラウンドｌａｃＺ染色を示したので、正常ドナーの
末梢血から単離した後９日目にＧＦＰベクターＣＴＡＧＣｂを使用して形質導入
した。これらの細胞はＦＩＶベクターによって高力価で形質導入されたが、ＧＦ
Ｐ形質導入Ｍｕ−ＭＬＶベクターでは形質導入されなかった。
【０１５６】 ＦＩＶキャプシド化の決定因子はこれまで研究されていない。レンチウイルス
キャプシド化シグナルはマウスオンコウイルスより複雑である（Lever、（1996 年）Gene Therapy 3、470〜471）。ＬＴＲをＣＦ１△ｅｎｖから欠失させてパッ
ケージングを妨げそして逆転写及び組込みに必要な配列を除去した。主要スプラ
イスドナーとｇａｇ遺伝子間の２０ヌクレオチド、即ち推定上レンチウイルスパ
ッケージングに寄与するものはＦＩＶでは例外的に短い（ＨＩＶ−１の４４ヌク
レオチド、ＨＩＶ−２の７５ヌクレオチド、そしてＭｕ−ＭＬＶの３７５ヌクレ
オチドと比較して２０ヌクレオチド）。この領域のスクランブリングや欠失は力
価を改善する可能性がある。
キャプシド化シグナルはマウスオンコウイルスより複雑である（Lever、（1996 年）Gene Therapy 3、470〜471）。ＬＴＲをＣＦ１△ｅｎｖから欠失させてパッ
ケージングを妨げそして逆転写及び組込みに必要な配列を除去した。主要スプラ
イスドナーとｇａｇ遺伝子間の２０ヌクレオチド、即ち推定上レンチウイルスパ
ッケージングに寄与するものはＦＩＶでは例外的に短い（ＨＩＶ−１の４４ヌク
レオチド、ＨＩＶ−２の７５ヌクレオチド、そしてＭｕ−ＭＬＶの３７５ヌクレ
オチドと比較して２０ヌクレオチド）。この領域のスクランブリングや欠失は力
価を改善する可能性がある。
【０１５７】 ＦＩＶ構造遺伝子をコードする配列が、ＣＦ１パッケージング化ベクターを使
用する形質導入によって標的細胞に伝達されたかどうかを試験するために、ＤＮ
ＡｓｅｄＣＴＲＺＬｂベクターを使用して、１０6個のＣＲＦＫ細胞に感染多重 度＝１０で形質導入し、９９％の形質導入が得られた。これらの細胞から得られ
た１μｇのゲノムＤＮＡはｇａｇ配列のＰＣＲで陰性であったが、３４ＴＦ１０
で長期に感染させたＣＲＦＫ培養物から得られた１０個ほどもの少ない細胞から
得られたゲノムＤＮＡを加えた同じ量のこのＤＮＡの同時増幅は陽性であった。
用する形質導入によって標的細胞に伝達されたかどうかを試験するために、ＤＮ
ＡｓｅｄＣＴＲＺＬｂベクターを使用して、１０6個のＣＲＦＫ細胞に感染多重 度＝１０で形質導入し、９９％の形質導入が得られた。これらの細胞から得られ
た１μｇのゲノムＤＮＡはｇａｇ配列のＰＣＲで陰性であったが、３４ＴＦ１０
で長期に感染させたＣＲＦＫ培養物から得られた１０個ほどもの少ない細胞から
得られたゲノムＤＮＡを加えた同じ量のこのＤＮＡの同時増幅は陽性であった。
【０１５８】 ＦＩＶエンベロープ発現がヒト細胞内で可能であったとき、重篤な細胞変性が
生じた。ＨＩＶの合胞体細胞誘導株のコ・レセプターとしてＣＸＣＲ４が最近発
見されたので、これらの観察によって特異的なメカニズムに関する直接的な問題
が提起された。ＦＩＶ一次レセプターは依然として知られていない。大部分のヒ
ト細胞系は、ＨｅＬａ及び２９３細胞を含めて、かなりのレベルのＣＸＣＲ４を
発現するので、本発明者は次に、ＣＸＣＲ４を全く発現しない（Ｕ８７ＭＧ及び
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞）か又は極端に低いレベルのＣＸＣＲ４（ＨＯＳ細胞）を発
現することが知られている珍しいヒト細胞系を使用した（Berson他（1996年）Jo
urnal of Virology 70、6288〜6295；Endres他（1996年）Cell 87、745〜756；H
arouse & Gonzalez-Scarano（1996年）Journal of Virology 70、7290〜7294） 。ＣＦ１又はＣＴ５をＵ８７ＭＧ及びＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞中にトランスフェクシ
ョン（エレクトロポレーション又はリン酸カルシウム共沈殿法によって）しても
決して合胞体細胞を形成しなかった（各系でｎ＝９、ＧＦＰレポーター コ・ト ランスフェクションによるトランスフェクション効率≧１０％）。加えて、ＣＦ
１でトランスフェクションしたラット２０８Ｆ細胞は多様なヒト細胞系及びＣＲ
ＦＫ細胞と容易に融合したが、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ又はＵ８７ＭＧ細胞では融合は生
起しなかった。さらに、他の齧歯類細胞（ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ細胞）のトラン
スフェクッションは合胞体細胞を産生しなかった（ｎ＝８、ＧＦＰコ・トランス
フェクションによる効率≧１０％）。
生じた。ＨＩＶの合胞体細胞誘導株のコ・レセプターとしてＣＸＣＲ４が最近発
見されたので、これらの観察によって特異的なメカニズムに関する直接的な問題
が提起された。ＦＩＶ一次レセプターは依然として知られていない。大部分のヒ
ト細胞系は、ＨｅＬａ及び２９３細胞を含めて、かなりのレベルのＣＸＣＲ４を
発現するので、本発明者は次に、ＣＸＣＲ４を全く発現しない（Ｕ８７ＭＧ及び
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞）か又は極端に低いレベルのＣＸＣＲ４（ＨＯＳ細胞）を発
現することが知られている珍しいヒト細胞系を使用した（Berson他（1996年）Jo
urnal of Virology 70、6288〜6295；Endres他（1996年）Cell 87、745〜756；H
arouse & Gonzalez-Scarano（1996年）Journal of Virology 70、7290〜7294） 。ＣＦ１又はＣＴ５をＵ８７ＭＧ及びＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞中にトランスフェクシ
ョン（エレクトロポレーション又はリン酸カルシウム共沈殿法によって）しても
決して合胞体細胞を形成しなかった（各系でｎ＝９、ＧＦＰレポーター コ・ト ランスフェクションによるトランスフェクション効率≧１０％）。加えて、ＣＦ
１でトランスフェクションしたラット２０８Ｆ細胞は多様なヒト細胞系及びＣＲ
ＦＫ細胞と容易に融合したが、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ又はＵ８７ＭＧ細胞では融合は生
起しなかった。さらに、他の齧歯類細胞（ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ細胞）のトラン
スフェクッションは合胞体細胞を産生しなかった（ｎ＝８、ＧＦＰコ・トランス
フェクションによる効率≧１０％）。
【０１５９】 それ故、本発明者は、ビシストロンｍＲＮＡからヒトＣＸＣＲ４及びｎｅｏＲ
を発現するＭＭＬＶに基づくレトロウイルスベクター、ｐＺ．ＣＸＣＲ４を構築
し、そしてこれを使用して、ヒトＣＸＣＲ４を発現し、Ｇ４１８で選択されるＵ
８７ＭＧ、ＨＯＳ、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＮＩＨ３Ｔ３及びＣＲＦＫ細胞系のパネル
を産生させた。Ｇ４１８で選択される対照系は親レトロウイルスベクター、ｐＪ
Ｚ３０８５４を使用して産生された。ＣＸＣＲ４の発現はｐＺ．ＣＸＣＲ４で形
質導入した全ての細胞系で記録された。ＣＦ１又はＣＴ５をＵ８７ＭＧ．ＣＸＣ
Ｒ４、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ．ＣＸＣＲ４、３Ｔ３．ＣＸＣＲ４中にはトランスフェク
ションするが、それぞれの対照系（ＣＦ１についてはｎ＝８、ＣＴ５については
ｎ＝６）には同時にトランスフェクションしない場合、多数の合胞体細胞を産生
した。さらに、ＣＦ１でトランスフェクションしたＨＯＳ細胞内では常に小さな
４〜８個の合胞体細胞を観察することができたが、ＣＦ１でトランスフェクショ
ンしたＨＯＳ．ＣＸＣＲ４細胞は数百個の核を含有する大量の多核巨大細胞を産
生した。これらの結果を確認するために、本発明者は３２０１−ＦＩＶ細胞（長
期ＦＩＶ感染ネコリンパ腫細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０９０９）を使用してネコ
／ヒト細胞混合研究も実施した。Ｕ８７ＭＧ、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＯＳ、３Ｔ３
細胞、これらのそれぞれのｐＺ．ＣＸＣＲ４ベクターで選択した対応する系統及
びＨｅＬａ細胞をそれぞれ６ウエルプレートに播いた（３×１０5個の細胞）。 翌日、１ウエル当たり１０5個の３２０１−ＦＩＶ細胞を加えた。１８時間目に 、ＨｅＬａ細胞及び各ＣＸＣＲ４発現系統の大きな急増中の合胞体細胞（３０〜
８０％の単層を含む）が観察された。Ｕ８７ＭＧ、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＯＳ又は
３Ｔ３細胞ではどの時点でも合胞体細胞は全く見られなかった。
を発現するＭＭＬＶに基づくレトロウイルスベクター、ｐＺ．ＣＸＣＲ４を構築
し、そしてこれを使用して、ヒトＣＸＣＲ４を発現し、Ｇ４１８で選択されるＵ
８７ＭＧ、ＨＯＳ、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＮＩＨ３Ｔ３及びＣＲＦＫ細胞系のパネル
を産生させた。Ｇ４１８で選択される対照系は親レトロウイルスベクター、ｐＪ
Ｚ３０８５４を使用して産生された。ＣＸＣＲ４の発現はｐＺ．ＣＸＣＲ４で形
質導入した全ての細胞系で記録された。ＣＦ１又はＣＴ５をＵ８７ＭＧ．ＣＸＣ
Ｒ４、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ．ＣＸＣＲ４、３Ｔ３．ＣＸＣＲ４中にはトランスフェク
ションするが、それぞれの対照系（ＣＦ１についてはｎ＝８、ＣＴ５については
ｎ＝６）には同時にトランスフェクションしない場合、多数の合胞体細胞を産生
した。さらに、ＣＦ１でトランスフェクションしたＨＯＳ細胞内では常に小さな
４〜８個の合胞体細胞を観察することができたが、ＣＦ１でトランスフェクショ
ンしたＨＯＳ．ＣＸＣＲ４細胞は数百個の核を含有する大量の多核巨大細胞を産
生した。これらの結果を確認するために、本発明者は３２０１−ＦＩＶ細胞（長
期ＦＩＶ感染ネコリンパ腫細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０９０９）を使用してネコ
／ヒト細胞混合研究も実施した。Ｕ８７ＭＧ、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＯＳ、３Ｔ３
細胞、これらのそれぞれのｐＺ．ＣＸＣＲ４ベクターで選択した対応する系統及
びＨｅＬａ細胞をそれぞれ６ウエルプレートに播いた（３×１０5個の細胞）。 翌日、１ウエル当たり１０5個の３２０１−ＦＩＶ細胞を加えた。１８時間目に 、ＨｅＬａ細胞及び各ＣＸＣＲ４発現系統の大きな急増中の合胞体細胞（３０〜
８０％の単層を含む）が観察された。Ｕ８７ＭＧ、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＯＳ又は
３Ｔ３細胞ではどの時点でも合胞体細胞は全く見られなかった。
【０１６０】 次いで、ＦＩＶ Ｅｎｖによる形質導入は、２９３Ｔ細胞内でのＣＦ１とＣＴ ＲＺＬｂのコ・トランスフェクションを使用して試験した。表１に示されている
ように、このベクターは、ＣＸＣＲ４発現に関係なく、どのヒト細胞系も形質導
入することができなかった；形質導入はＣＲＦＫ細胞で検出できたが、力価は非
常に低かった（＜１０形質導入単位／ｍｌ）。対照的に、ＣＲＦＫ ＣＸＣＲ４ 細胞はＣＲＦＫより少なくとも１００倍高い力価（３．６×１０2）で形質導入 することができた。さらに、ＣＸＣＲ４のリガンドはＦＩＶエンベロープによる
ベクター形質導入を阻害した。
ように、このベクターは、ＣＸＣＲ４発現に関係なく、どのヒト細胞系も形質導
入することができなかった；形質導入はＣＲＦＫ細胞で検出できたが、力価は非
常に低かった（＜１０形質導入単位／ｍｌ）。対照的に、ＣＲＦＫ ＣＸＣＲ４ 細胞はＣＲＦＫより少なくとも１００倍高い力価（３．６×１０2）で形質導入 することができた。さらに、ＣＸＣＲ４のリガンドはＦＩＶエンベロープによる
ベクター形質導入を阻害した。
【０１６１】 ベクターのデータによって、ＣＸＣＲ４がネコ細胞ウイルス侵入並びにより広
範に介在する融合誘導を高めることが示されたので、本発明者は次に、ＣＲＦＫ
細胞とＣＲＦＫ．ＣＸＣＲ４細胞に対する複製可能ＦＩＶの感染性を比較した。
各系統は１ウエル当たり１０4個の細胞を４８ウエルプレート中に播き、そして 翌日、ＣＲＦＫ細胞内で産生させた３４ＴＦ１０ウイルスストックの連続４倍希
釈物で感染させた。ＣＲＦＫ．ＣＸＣＲ４細胞における３４ＴＦ１０の顕著な細
胞変性による人工的な力価損失を減少させるために、プレートを固定し、そして
１０6個中１個の感染細胞に感受性の巣状感染性アッセイ（ＦＩＶ陽性血清の１ ：５００希釈及びホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合抗ネコＩｇＧ二次抗
体を使用する）によって感染後４０時間目に試験した（Remington他（1991年）J
ournal of Virology 65、308〜312及びChesebro & Wehrly（1988年）Journal of
Virology 62、3779〜3788も参照）。３４ＴＦ１０はＣＲＦＫよりＣＲＦＫ．Ｃ
ＸＣＲ４に対して８倍感染性であった（ｐ＝０．０００２）。本発明者はこれを
、ＩＦＡで染色される多数の丸い浮遊しているか又は殆ど付着しない細胞が４０
時間ほどもの早い時期に感染ＣＲＦＫ．ＣＸＣＲ４ウエル中に存在し（しかし非
感染対照ウエル又は感染ＣＲＦＫウエル中では存在していなかった）そして数え
られなかったので、感染性比率の最小見積もりと考える。これらの結果を確認す
るために、２つの細胞系での３４ＴＦ１０の限定的希釈力価滴定を、上記したよ
うにして感染させることによって実施した；細胞は４〜５日間隔で３週間分割し
、そして陽性ウエルはＲＴアッセイによって同定した。
範に介在する融合誘導を高めることが示されたので、本発明者は次に、ＣＲＦＫ
細胞とＣＲＦＫ．ＣＸＣＲ４細胞に対する複製可能ＦＩＶの感染性を比較した。
各系統は１ウエル当たり１０4個の細胞を４８ウエルプレート中に播き、そして 翌日、ＣＲＦＫ細胞内で産生させた３４ＴＦ１０ウイルスストックの連続４倍希
釈物で感染させた。ＣＲＦＫ．ＣＸＣＲ４細胞における３４ＴＦ１０の顕著な細
胞変性による人工的な力価損失を減少させるために、プレートを固定し、そして
１０6個中１個の感染細胞に感受性の巣状感染性アッセイ（ＦＩＶ陽性血清の１ ：５００希釈及びホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合抗ネコＩｇＧ二次抗
体を使用する）によって感染後４０時間目に試験した（Remington他（1991年）J
ournal of Virology 65、308〜312及びChesebro & Wehrly（1988年）Journal of
Virology 62、3779〜3788も参照）。３４ＴＦ１０はＣＲＦＫよりＣＲＦＫ．Ｃ
ＸＣＲ４に対して８倍感染性であった（ｐ＝０．０００２）。本発明者はこれを
、ＩＦＡで染色される多数の丸い浮遊しているか又は殆ど付着しない細胞が４０
時間ほどもの早い時期に感染ＣＲＦＫ．ＣＸＣＲ４ウエル中に存在し（しかし非
感染対照ウエル又は感染ＣＲＦＫウエル中では存在していなかった）そして数え
られなかったので、感染性比率の最小見積もりと考える。これらの結果を確認す
るために、２つの細胞系での３４ＴＦ１０の限定的希釈力価滴定を、上記したよ
うにして感染させることによって実施した；細胞は４〜５日間隔で３週間分割し
、そして陽性ウエルはＲＴアッセイによって同定した。
【０１６２】 これらの結果を総合すると、関連性の遠い霊長類及び非霊長類レンチウイルス
の融合誘導活性及びウイルス侵入が同一の細胞表面分子で媒介されることが示さ
れる。一次レセプターとしてＣＤ４を使用しない非霊長類レンチウイルスにＣＸ
ＣＲ４がこのように広範に利用されることは、レンチウイルスの合胞体細胞形成
及びエイズ病因論におけるＣＸＣＲ４の根本的な役割を黙示している。本発明者
の実験は、ヒト細胞の低レベルＦＩＶエンベロープ介在性感染が、ＨＩＶ−１及
びＨＩＶ−２の幾つかの単離物に関して良好に記載されている（Endres他（1996
年）Cell 87、745〜756；Harouse & Gonzalez-Scarano（1996年）Journal of Vi
rology 70、7290〜7294；McKnight他（1994年）Virology 201、8〜18；Reeves他
（1997年）Virology 231、130〜134；Potempa他（1997年）Journal of Virology
71、4419〜4424；Harouse他（1995年）Journal of Virology 69、7383〜7390；
Talbot他（1995年）Journal of Virology 69、3399〜3406；Tateno他（1989年）
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 86、4287〜4290（1989年）；Clapham他（1992年）Journal of Virology
66、3531〜3537）ように、多分ＣＸＣＲ４単独によって生起するということを 排除しているのではなくて、これらの実施例の大部分と同様に、このような処理
が無効であることを示している。同様に、ウサギもＨＩＶ−１で感染させること
ができるが、上記のプロセスでは全く無効である（Gardner & Luciw（1989年）F
aseb Journal 3、2593〜2606）。本発明者のデータは一次ＦＩＶレセプターの存
在と一致している。例えば、ベクターのデータに加えて、ＨｅＬａ細胞は生産的
ＦＩＶ複製を支持しないが、ＶＳＶ−Ｇプソイド型を使用すると容易に形質導入
可能であり、豊富なＣＸＣＲ４を発現し、広範なＥｎｖ特異的細胞変性を示し、
低いがかなりのレベルのＦＩＶ ＬＴＲ誘導発現を示し、正常なウイルスタンパ ク質プロセシングを可能にし、そしてプラスミドＣＴ５から複製可能ＦＩＶを産
生した。
の融合誘導活性及びウイルス侵入が同一の細胞表面分子で媒介されることが示さ
れる。一次レセプターとしてＣＤ４を使用しない非霊長類レンチウイルスにＣＸ
ＣＲ４がこのように広範に利用されることは、レンチウイルスの合胞体細胞形成
及びエイズ病因論におけるＣＸＣＲ４の根本的な役割を黙示している。本発明者
の実験は、ヒト細胞の低レベルＦＩＶエンベロープ介在性感染が、ＨＩＶ−１及
びＨＩＶ−２の幾つかの単離物に関して良好に記載されている（Endres他（1996
年）Cell 87、745〜756；Harouse & Gonzalez-Scarano（1996年）Journal of Vi
rology 70、7290〜7294；McKnight他（1994年）Virology 201、8〜18；Reeves他
（1997年）Virology 231、130〜134；Potempa他（1997年）Journal of Virology
71、4419〜4424；Harouse他（1995年）Journal of Virology 69、7383〜7390；
Talbot他（1995年）Journal of Virology 69、3399〜3406；Tateno他（1989年）
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 86、4287〜4290（1989年）；Clapham他（1992年）Journal of Virology
66、3531〜3537）ように、多分ＣＸＣＲ４単独によって生起するということを 排除しているのではなくて、これらの実施例の大部分と同様に、このような処理
が無効であることを示している。同様に、ウサギもＨＩＶ−１で感染させること
ができるが、上記のプロセスでは全く無効である（Gardner & Luciw（1989年）F
aseb Journal 3、2593〜2606）。本発明者のデータは一次ＦＩＶレセプターの存
在と一致している。例えば、ベクターのデータに加えて、ＨｅＬａ細胞は生産的
ＦＩＶ複製を支持しないが、ＶＳＶ−Ｇプソイド型を使用すると容易に形質導入
可能であり、豊富なＣＸＣＲ４を発現し、広範なＥｎｖ特異的細胞変性を示し、
低いがかなりのレベルのＦＩＶ ＬＴＲ誘導発現を示し、正常なウイルスタンパ ク質プロセシングを可能にし、そしてプラスミドＣＴ５から複製可能ＦＩＶを産
生した。
【０１６３】 それ故、上記の結果はレンチウイルス生物学及びヒト遺伝子療法にとって重要
な意味を有している。非霊長類レンチウイルスも細胞融合とウイルス侵入の両方
にＣＸＣＲ−４を利用することを示すことによって、本発明者のデータは、この
ケモカインレセプターがレンチウイルス複製、合胞体細胞形成、そして多分病因
論において広く根本的な役割を果たしていることを示している。ＦＩＶのインビ
ボ複製は更なるそして一層微妙な要件を有しているようにも思われる。それ故、
ＦＩＶベクターはＨＩＶベクターの本来的により安全な代替物を表している。こ
の仮説に対する疫学的支持は、ネコで作用する同一の主要感染経路（ネコのかみ
傷）により長年に亘って多数のヒトで自然に接種された後、ＦＩＶがヒトで疾病
を感染させるか又は引き起こす能力を示していないので、他の非霊長類レンチウ
イルスよりＦＩＶに対して最も強力である。さらに、Ｕ３、ＯＲＦ２及びｅｎｖ
に加えて、ベクター及びパッケージングプラスミドの両方からＦＩＶ配列を追加
的に欠失させることも可能である。ＦＩＶベクターは、感染性ＦＩＶが生物安全
性レベル（Biosafety Level）２の組織培養物中で定型的に増殖するので、論理 的にはより容易に産生される（本発明のベクターはＵＣサンジエゴ施設生物安全
性委員会（UC San Diego Institutional Biosafety Committee）によってＢＬ−
２使用が承認されている）。
な意味を有している。非霊長類レンチウイルスも細胞融合とウイルス侵入の両方
にＣＸＣＲ−４を利用することを示すことによって、本発明者のデータは、この
ケモカインレセプターがレンチウイルス複製、合胞体細胞形成、そして多分病因
論において広く根本的な役割を果たしていることを示している。ＦＩＶのインビ
ボ複製は更なるそして一層微妙な要件を有しているようにも思われる。それ故、
ＦＩＶベクターはＨＩＶベクターの本来的により安全な代替物を表している。こ
の仮説に対する疫学的支持は、ネコで作用する同一の主要感染経路（ネコのかみ
傷）により長年に亘って多数のヒトで自然に接種された後、ＦＩＶがヒトで疾病
を感染させるか又は引き起こす能力を示していないので、他の非霊長類レンチウ
イルスよりＦＩＶに対して最も強力である。さらに、Ｕ３、ＯＲＦ２及びｅｎｖ
に加えて、ベクター及びパッケージングプラスミドの両方からＦＩＶ配列を追加
的に欠失させることも可能である。ＦＩＶベクターは、感染性ＦＩＶが生物安全
性レベル（Biosafety Level）２の組織培養物中で定型的に増殖するので、論理 的にはより容易に産生される（本発明のベクターはＵＣサンジエゴ施設生物安全
性委員会（UC San Diego Institutional Biosafety Committee）によってＢＬ−
２使用が承認されている）。
【０１６４】 本明細書で引用した刊行物や特許出願は全て、個々の各刊行物又は特許出願が
あたかも、全ての目的で全体として参照して組み入れるように明示的にそして個
々に示されているかのように、参照して本明細書に組み入れる。上記発明は明白
な理解を目的として説明及び実施例によって幾らか詳細に記載されているが、下
記特許請求の範囲の精神又は範囲から離れることなく、本発明の教示を考慮して
一定の変更及び修飾を行い得ることは当該技術分野の通常の技倆を有する者に容
易に明白であろう。
あたかも、全ての目的で全体として参照して組み入れるように明示的にそして個
々に示されているかのように、参照して本明細書に組み入れる。上記発明は明白
な理解を目的として説明及び実施例によって幾らか詳細に記載されているが、下
記特許請求の範囲の精神又は範囲から離れることなく、本発明の教示を考慮して
一定の変更及び修飾を行い得ることは当該技術分野の通常の技倆を有する者に容
易に明白であろう。
【図１】 本発明核酸構築物の模式図であり、ＦＩＶ３４ＴＦ−１０、ＣＴ５、ＣＴＲＺ
ＬｂおよびＣＴＡＧＣｂを包含する。
ＬｂおよびＣＴＡＧＣｂを包含する。
【図２】 実験結果をグラフ化して示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１０月４日（２０００．１０．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３０】 この構築物の設計は、正しくＴＡＴＡボックスにおけるＣＭＶプロモーターと
ＦＩＶゲノム（５’Ｒ反復配列から続いている）の融合に関係している。先ず、
ＰＣＲ（合成ＰＣＲはエキソヌクレアーゼ＋Ｖｅｎｔポリメラーゼを使用して行
った）は、ＦＩＶ ＴＡＴＡボックスのすぐ下流のヌクレオチドと相同的なＳａ ｃＩ−テール付加センスＰＣＲプライマー（５’−ａｔａｔａＧＡＧＣＴＣｔｇ
ｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃ−３’（配列番号４））を、ＦＩＶ ｇａｇ遺伝子の反対側ストランドと相同的なアンチセンスＰＣＲプライマー（５
’−ｃｃａａｔｃｔｃｇｃｃｃｃｔｇｔｃｃａｔｔｃｃｃｃ−３’ （配列番号 ５） ）と組み合わせて使用して行った。生成したＰＣＲ産生物は４５０ｂｐであ
った。このＰＣＲ産生物は、ｓａｃＩ消化前にＸｈｏＩで消化した（何故なら、
ＦＩＶ ＬＴＲにはＸｈｏＩ部位のすぐ後にｓａｃ部位が存在しており、そして このようにして消化しない場合ＳａｃＩ−ＳａｃＩフラグメントが生成されるの
で）。ＸｈｏＩ消化とその後のＳａｃＩ消化の後、得られた３１０ｂｐフラグメ
ントは次のとおりであった： ＧＡＧＣＴ／Ｃｔｇｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｔｇａ
ｇｇａｃｔｔｔｔｇａｇｔｔｃｔｃｃｃｔｔｇａｇｇｃｔｃｃｃａｃａｇａｔａ
ｃａａｔａａａｔａｔｔｔｇａｇａｔｔｇａａｃｃｃｔｇｔｃｇａｇｔａｔｃｔ
ｇｔｇｔａａｔｃｔｔｔｔｔｔａｃｃｔｇｔｇａｇｇｔｃｔｃｇｇａａｔｃｃｇ
ｇｇｃｃｇａｇａａｃｔｔｃｇｃａｇｔｔｇｇｃｇｃｃｃｇａａｃａｇｇｇａｃ
ｔｔｇａｔｔｇａｇａｇｔｇａｔｔｇａｇｇａａｇｔｇａａｇｃｔａｇａｇｃａ
ａｔａｇａａａｇｃｔｇｔｔａａｇｃａｇａａｃｔｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔａａ
ａｔａｇｇｇａａｇｃａｇｔａｇｃａｇａｃｇｃｔｇｃｔａａｃａｇｔｇａｇｔ
ａｔｃｔｃｔａｇｔｇａａｇｃｇｇａＣ＼ＴＣＧＡＧｃｔｃ（配列番号６）。
ＦＩＶゲノム（５’Ｒ反復配列から続いている）の融合に関係している。先ず、
ＰＣＲ（合成ＰＣＲはエキソヌクレアーゼ＋Ｖｅｎｔポリメラーゼを使用して行
った）は、ＦＩＶ ＴＡＴＡボックスのすぐ下流のヌクレオチドと相同的なＳａ ｃＩ−テール付加センスＰＣＲプライマー（５’−ａｔａｔａＧＡＧＣＴＣｔｇ
ｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃ−３’（配列番号４））を、ＦＩＶ ｇａｇ遺伝子の反対側ストランドと相同的なアンチセンスＰＣＲプライマー（５
’−ｃｃａａｔｃｔｃｇｃｃｃｃｔｇｔｃｃａｔｔｃｃｃｃ−３’ （配列番号 ５） ）と組み合わせて使用して行った。生成したＰＣＲ産生物は４５０ｂｐであ
った。このＰＣＲ産生物は、ｓａｃＩ消化前にＸｈｏＩで消化した（何故なら、
ＦＩＶ ＬＴＲにはＸｈｏＩ部位のすぐ後にｓａｃ部位が存在しており、そして このようにして消化しない場合ＳａｃＩ−ＳａｃＩフラグメントが生成されるの
で）。ＸｈｏＩ消化とその後のＳａｃＩ消化の後、得られた３１０ｂｐフラグメ
ントは次のとおりであった： ＧＡＧＣＴ／Ｃｔｇｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｔｇａ
ｇｇａｃｔｔｔｔｇａｇｔｔｃｔｃｃｃｔｔｇａｇｇｃｔｃｃｃａｃａｇａｔａ
ｃａａｔａａａｔａｔｔｔｇａｇａｔｔｇａａｃｃｃｔｇｔｃｇａｇｔａｔｃｔ
ｇｔｇｔａａｔｃｔｔｔｔｔｔａｃｃｔｇｔｇａｇｇｔｃｔｃｇｇａａｔｃｃｇ
ｇｇｃｃｇａｇａａｃｔｔｃｇｃａｇｔｔｇｇｃｇｃｃｃｇａａｃａｇｇｇａｃ
ｔｔｇａｔｔｇａｇａｇｔｇａｔｔｇａｇｇａａｇｔｇａａｇｃｔａｇａｇｃａ
ａｔａｇａａａｇｃｔｇｔｔａａｇｃａｇａａｃｔｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔａａ
ａｔａｇｇｇａａｇｃａｇｔａｇｃａｇａｃｇｃｔｇｃｔａａｃａｇｔｇａｇｔ
ａｔｃｔｃｔａｇｔｇａａｇｃｇｇａＣ＼ＴＣＧＡＧｃｔｃ（配列番号６）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３１】 このフラグメントを１４０ｂｐ残基からゲル精製して離し、そしてｐＲｃ／Ｃ
ＭＶプラスミドのＳａｃＩ−ＸｈｏＩバックボーン中にクローン化した。要約す
ると、この段階ではＦＩＶ ＬＴＲ配列をＴＡＴＡボックスの下流に、ＣＭＶプ ロモーターのＴＡＴＡボックスとＦＩＶの置換されたＴＡＴＡボックスの両方に
対して正確に重なるように配列する：これは、正に、ＳａｃＩ部位がｈＣＭＶプ
ロモーター中のＴＡＴＡボックスの３ヌクレオチド下流に存在するように、Ｓａ
ｃＩ部位をＴＡＴＡボックスの３ヌクレオチド下流に配置し、そしてＦＩＶ Ｒ 反復配列を、ＦＩＶゲノム中と同様に、ＴＡＴＡボックスから正確に９ヌクレオ
チド下流に配置する。それ故、上記融合によってＣＭＶプロモーターとＦＩＶ転
写配列の両方のヌクレオチド距離は保持され（且つ連結しており）、そして以下
の配列で詳記される： ．．ａｃｇｔａｔａａｇｔｔｇｔｔｃｃａｔｔｇｔａａｇａｇｔａＴＡＴＡＡｃ
ｃａｇｔｇｃｔｔｔｇｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｔｇ ａｇｇａ ＦＩＶ（配列番号７） ＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴ Ｃ ＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣ．．．．．．．． ｐＲｃ／ＣＭＶ （配列番号８） ＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴ
Ｃｔｇｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｔｇａｇｇａ ＣＲ
Ｆ１（配列番号９）
ＭＶプラスミドのＳａｃＩ−ＸｈｏＩバックボーン中にクローン化した。要約す
ると、この段階ではＦＩＶ ＬＴＲ配列をＴＡＴＡボックスの下流に、ＣＭＶプ ロモーターのＴＡＴＡボックスとＦＩＶの置換されたＴＡＴＡボックスの両方に
対して正確に重なるように配列する：これは、正に、ＳａｃＩ部位がｈＣＭＶプ
ロモーター中のＴＡＴＡボックスの３ヌクレオチド下流に存在するように、Ｓａ
ｃＩ部位をＴＡＴＡボックスの３ヌクレオチド下流に配置し、そしてＦＩＶ Ｒ 反復配列を、ＦＩＶゲノム中と同様に、ＴＡＴＡボックスから正確に９ヌクレオ
チド下流に配置する。それ故、上記融合によってＣＭＶプロモーターとＦＩＶ転
写配列の両方のヌクレオチド距離は保持され（且つ連結しており）、そして以下
の配列で詳記される： ．．ａｃｇｔａｔａａｇｔｔｇｔｔｃｃａｔｔｇｔａａｇａｇｔａＴＡＴＡＡｃ
ｃａｇｔｇｃｔｔｔｇｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｔｇ ａｇｇａ ＦＩＶ（配列番号７） ＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴ Ｃ ＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣ．．．．．．．． ｐＲｃ／ＣＭＶ （配列番号８） ＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴ
Ｃｔｇｔｇａａａｃｔｔｃｇａｇｇａｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｔｇａｇｇａ ＣＲ
Ｆ１（配列番号９）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３２】 ＣＲＦ１はＣＭＶプロモーターとＦＩＶ Ｒ反復配列の５−プライム融合を完 了したが、３−プライムＬＴＲとＦＩＶゲノムの残りは下流に置かれたままであ
った。それ故、ｓａｌＩ−テール付加ＰＣＲプライマーＦ３’Ｓ（ｔａｔａｔａ
ＧＴＣｇａｃｔａｇｇｇａｃｔｇｔｔｔａｃｇａａｃ（配列番号１０））及びＦ
３’Ａ／Ｎｏｔ（ａｔａｔａｔａｇｔｃｇａｃＧＣＧＧＣＣＧＣｔｇｃｇａａｇ
ｔｔｃｔｃｇ（配列番号１１））を使用して３’ＦＩＶ ＬＴＲを増幅した：Ｓ ａＬＩで消化したＰＣＲ産生物は、アルカリホスファターゼで処理したＣＲＦ１
の適合性ＸｈｏＩ部位に連結し、そしてこの連結は加熱不活性化し、そしてＸｈ
ｏＩを使用して野生型に対して選択した。得られた、ＣＲＦ（Ｌ）と命名された
プラスミドは上記の両ＬＴＲを有しており、そして３’ＬＴＲの３’末端に固有
のＮｏｔＩ部位を配置している。
った。それ故、ｓａｌＩ−テール付加ＰＣＲプライマーＦ３’Ｓ（ｔａｔａｔａ
ＧＴＣｇａｃｔａｇｇｇａｃｔｇｔｔｔａｃｇａａｃ（配列番号１０））及びＦ
３’Ａ／Ｎｏｔ（ａｔａｔａｔａｇｔｃｇａｃＧＣＧＧＣＣＧＣｔｇｃｇａａｇ
ｔｔｃｔｃｇ（配列番号１１））を使用して３’ＦＩＶ ＬＴＲを増幅した：Ｓ ａＬＩで消化したＰＣＲ産生物は、アルカリホスファターゼで処理したＣＲＦ１
の適合性ＸｈｏＩ部位に連結し、そしてこの連結は加熱不活性化し、そしてＸｈ
ｏＩを使用して野生型に対して選択した。得られた、ＣＲＦ（Ｌ）と命名された
プラスミドは上記の両ＬＴＲを有しており、そして３’ＬＴＲの３’末端に固有
のＮｏｔＩ部位を配置している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１−１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ルーニイ、 ディビッド ジェイ. アメリカ合衆国 92024 カリフォルニア 州 エンツニタス ナンタケット コート 519 (72)発明者 ウォン−スタール、 フロッシー アメリカ合衆国 92130 カリフォルニア 州 サン ディエゴ モンテレー サイプ レス ウェイ 12737 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA32 BA80 CA04 CA11 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA17 HA20 4B064 AG32 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA95Y AB01 BA02 CA24 CA26 CA44
Claims (37)
- 【請求項１】 非霊長類レンチウイルスパッケージャブル核酸を含んでなる
レトロウイルスベクターであって、該核酸が異種的標的核酸と非霊長類レンチウ
イルスパッケージング部位からなり、該標的核酸がヒト細胞中で活性なプロモー
ターに操作可能に結合しており、そこで該パッケージャブル核酸が自己パッケー
ジングをブロックするパッケージング能欠損をもち、かつ、該パッケージング能
欠損がトランスで救済可能であることを特徴とするレトロウイルスベクター。 - 【請求項２】 該レトロウイルスベクターがＦＩＶパッケージング部位を有
し、また、該標的核酸がトランスに供給されたＦＩＶパッケージング成分により
パッケージングされることを特徴とする請求項１記載のレトロウイルスベクター
。 - 【請求項３】 非ＦＩＶプロモーターがＣＭＶ中期領域プロモーターである
請求項２記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項４】 ＦＩＶ Ｇａｇタンパク質、ＦＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）タン パク質およびＦＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質からなる群より選択され
る１またはそれ以上のＦＩＶタンパク質を含む、レトロウイルス粒子を含んでな
る請求項２記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項５】 該粒子が逆転写酵素活性を含み、ヒト細胞に感染性ではない
請求項４記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項６】 該粒子がＨＩＶのコレセプターであるＣＸＣＲ４を有するヒ
ト細胞に感染する請求項４記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項７】 水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質を含むレトロウイルス粒
子を含む請求項１記載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項８】 水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質を含むレトロウイルス粒
子を含み、該レトロウイルス粒子が非分裂ヒト細胞に形質導入し得る請求項１記
載のレトロウイルスベクター。 - 【請求項９】 ヒト細胞中にて活性を有するプロモーターを含むパッケージ
ングプラスミドであって、該プロモーターが請求項１のベクターをパッケージン
グするのに必要なタンパク質の少なくとも1種をコードする核酸サブシーケンス に操作可能に結合しており、該パッケージングプラスミドが機能的非霊長類レン
チウイルスパッケージング部位を欠くことを特徴とするパッケージングプラスミ
ド。 - 【請求項１０】 該パッケージングプラスミドが有蹄類−パッケージャブル
核酸をトランスにパッケージングするのに必要な少なくとも1種の有蹄類パッケ ージングタンパク質をコードする請求項９記載のパッケージングプラスミド。 - 【請求項１１】 該パッケージングプラスミドがＦＩＶ−パッケージャブル
核酸をトランスにパッケージングするのに必要な少なくとも1種のＦＩＶ−パッ ケージングタンパク質をコードする請求項９記載のパッケージングプラスミド。 - 【請求項１２】 該パッケージングプラスミドの核酸サブシーケンスがＦＩ
Ｖ Ｇａｇタンパク質をコードする翻訳領域配列を含む請求項１１記載のパッケ ージングプラスミド。 - 【請求項１３】 該パッケージングプラスミドの核酸サブシーケンスがＦＩ
Ｖ ｅｎｖタンパク質をコードする翻訳領域配列を含む請求項１１記載のパッケ ージングプラスミド。 - 【請求項１４】 該プラスミドがＵ３プロモーターの欠失を有するＦＩＶ ＬＴＲを含む請求項１１記載のパッケージングプラスミド。
- 【請求項１５】 該プラスミドがＵ３プロモーターの欠失を有するＦＩＶ ＬＴＲを含み、該Ｕ３プロモーター欠失部位に異種的プロモーターの挿入を含む
請求項１１記載のパッケージングプラスミド。 - 【請求項１６】 該プラスミドがＵ３プロモーター欠失を有するＦＩＶ Ｌ ＴＲを含み、該Ｕ３プロモーター欠失部位に異種的プロモーターの挿入を含むの
もであって、該異種的プロモーターがＣＭＶプロモーターである請求項１１記載
のパッケージングプラスミド。 - 【請求項１７】 請求項１記載のベクターをトランスにパッケージングする
能力を有する非霊長類レンチウイルスパッケージング細胞であって、異種的ヒト
プロモーターに操作可能に結合した少なくとも1種の非霊長類レンチウイルスパ ッケージングタンパク質をコードする組換え核酸プラスミドを少なくとも1種含 み、パッケージングタンパク質がトランスに供給されたときにベクターに組込ま
れるパッケージング細胞。 - 【請求項１８】 該異種的プロモーターに操作可能に結合した第二の非霊長
類レンチウイルスをコードする第二の核酸を含み、パッケージングタンパク質が
トランスに供給されたときにベクターに組込まれる請求項１７記載のパッケージ
ング細胞。 - 【請求項１９】 該パッケージングプラスミドがＦＩＶパッケージングタン
パク質をコードする請求項１７記載のパッケージング細胞。 - 【請求項２０】 請求項１記載のベクターを含む請求項１７記載のパッケー
ジング細胞。 - 【請求項２１】 該細胞が、救済可能な複製能欠損型ＦＩＶパッケージャブ
ル核酸を含み、該核酸が異種的プロモーターの制御下に標的核酸をコードする請
求項１７記載のパッケージング細胞。 - 【請求項２２】 該標的核酸がウイルスインヒビターをコードする請求項２
１記載の方法。 - 【請求項２３】 該標的核酸がリボザイムをコードする請求項２１記載の方
法。 - 【請求項２４】 該細胞がヒト細胞である請求項１７記載のパッケージング
細胞。 - 【請求項２５】 ＶＳＶタンパク質をコードする組換え核酸を含む請求項１
７記載のパッケージング細胞。 - 【請求項２６】 該異種的プロモーターがヒト細胞中で活性である請求項１
７記載のパッケージング細胞。 - 【請求項２７】 トランスに救済可能な複製能欠損型ＦＩＶパッケージャブ
ル核酸を含む請求項１７記載のパッケージング細胞。 - 【請求項２８】 該パッケージャブル核酸がヒト細胞中で活性なプロモータ
ーに操作可能に結合した異種的核酸を含む請求項２６記載のパッケージング細胞
。 - 【請求項２９】 ＦＩＶ Ｇａｇタンパク質、ＦＩＶ逆転写酵素、およびＶ ＳＶエンベロープ糖タンパク質を少なくとも1つ含むレトロウイルスキャプシド にパッケージャブル核酸がパッケージングされる請求項２６記載のパッケージン
グ細胞。 - 【請求項３０】 標的核酸をコードする非霊長類レンチウイルスパッケージ
ャブル核酸を含んでなるレトロウイルスベクターとヒト細胞を接触させ、それに
よってレトロウイルスベクターにより該細胞に形質導入させることを特徴とする
標的核酸によるヒト細胞の形質導入方法。 - 【請求項３１】 標的核酸を発現することを特徴とする請求項３０記載の方
法。 - 【請求項３２】 標的核酸を発現し、該核酸がウイルスインヒビターをコー
ドすることを特徴とする請求項３０記載の方法。 - 【請求項３３】 標的核酸を発現し、その場合該標的核酸が生体外細胞中で
ＨＩＶ複製を阻害するリボザイムをコードすることを特徴とする請求項３０記載
の方法。 - 【請求項３４】 形質導入した細胞を哺乳動物に導入することを特徴とする
請求項３０記載の方法。 - 【請求項３５】 該細胞が造血幹細胞、最終分化ニューロン細胞、および最
終分化造血細胞からなる群より選択される非分裂細胞である請求項３０記載の方
法。 - 【請求項３６】 該細胞が生体内でレトロウイルスベクターと接触する請求
項３０記載の方法。 - 【請求項３７】 該非霊長類レンチウイルスパッケージャブル核酸がＦＩＶ
パッケージング成分により詰込まれる請求項３０記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US93663397A | 1997-09-24 | 1997-09-24 | |
| US08/936,633 | 1997-09-24 | ||
| PCT/US1998/019162 WO1999015641A1 (en) | 1997-09-24 | 1998-09-15 | Non-primate lentiviral vectors and packaging systems |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000512934A Withdrawn JP2001517433A (ja) | 1997-09-24 | 1998-09-15 | 非霊長類レンチウイルスベクターおよびパッケージングシステム |
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| AU (1) | AU747438B2 (ja) |
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