CN116554349A - 嵌合病毒包膜糖蛋白及包含其的载体 - Google Patents
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Abstract
本公开提供一种嵌合病毒包膜糖蛋白，其特征在于，所述嵌合病毒包膜糖蛋白包含狒狒内源性逆转录病毒包膜糖蛋白的胞外结构域和跨膜结构域以及灵长目白血病病毒包膜糖蛋白的胞质尾结构域或由其组成。本公开还提供编码所述嵌合病毒包膜糖蛋白的核酸，包含所述嵌合病毒包膜糖蛋白的病毒载体，包含所述嵌合病毒包膜糖蛋白、所述核酸或所述病毒载体的细胞，使用所述嵌合病毒包膜糖蛋白或所述核酸制备病毒载体包装细胞或病毒载体生产细胞的方法，以及使用所述嵌合病毒包膜糖蛋白、所述核酸或所述病毒载体转导细胞的方法。
Description
技术领域
本公开涉及慢病毒载体领域。具体地，本公开涉及一种嵌合病毒包膜糖蛋白，其包含狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的胞外结构域和跨膜结构域以及灵长目白血病病毒包膜糖蛋白的胞质尾结构域。本公开还涉及编码所述嵌合病毒包膜糖蛋白的核酸，包含所述嵌合病毒包膜糖蛋白的病毒载体，包含所述嵌合病毒包膜糖蛋白、所述核酸或所述病毒载体的细胞，使用所述嵌合病毒包膜糖蛋白或所述核酸制备病毒载体包装/生产细胞的方法，以及使用所述嵌合病毒包膜糖蛋白、所述核酸或所述病毒载体转导细胞的方法。
背景技术
慢病毒载体近些年来在细胞治疗领域应用较为广泛。虽然口炎疱疹病毒(VSV)假型慢病毒载体具有较高的生产滴度，并且可以感染分裂和非分裂的细胞，但是已有较多文献证实，该假型慢病毒载体，在转导一些静息的T细胞、B细胞、NK细胞、HSC细胞等时，转导效率普遍较低。为了提高转导效率，需要使用高剂量的VSV-G假型慢病毒载体(VSV-G-LV)，这存在着导致靶细胞发生插入突变的风险。同时，人类血清对VSV-G假型慢病毒载体存在着较强的免疫应答，这进一步限制了该类型病毒载体在某些基因治疗领域的应用。
目前已有一些能够高效转导静息细胞的新的假型慢病毒载体，包括猫内源性逆转录病毒(RD114)假型慢病毒载体、狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)假型慢病毒载体、麻疹病毒(H/F)假型慢病毒载体等。这些假型慢病毒载体均能高效转导静息的T细胞、B细胞、NK细胞、HSC细胞等，但由于滴度较低，限制了其商业化应用。对于狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)假型慢病毒载体(BaEV-LV)，据报道BaEV糖蛋白已被进一步改造以用于提高BaEV-LV的滴度，如使用小鼠白血病病毒包膜糖蛋白胞质尾结构域替换野生型BaEV包膜糖蛋白胞质尾结构域(BaEVTR(MLV))以及将野生型BaEV包膜糖蛋白胞质尾结构域的融合抑制性R肽去除(BaEVRless)(参见美国专利US9249426B2)。然而，上述假型慢病毒载体的滴度远低于VSV-G假型慢病毒载体，导致产能远低于治疗需求。因此，目前亟需一种能够高效转导静息T细胞、B细胞、NK细胞、HSC细胞等且具有更高滴度的假型病毒载体。
发明内容
本公开的目的在于提供一种能够高效转导静息T细胞、B细胞、NK细胞、HSC细胞等且具有较高产毒滴度的假型病毒载体。
为了解决上述技术问题，本发明人将狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域替换为灵长目白血病病毒包膜糖蛋白的胞质尾结构域从而获得一种新的嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体。令人惊奇的是，包含所述嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体的假型病毒载体在能够高效转导静息细胞的情况下具有显著提高的滴度。
具体地，本公开通过提供以下各项解决了上述技术问题。
在一个方面，本公开提供一种嵌合病毒包膜糖蛋白，所述嵌合病毒包膜糖蛋白包含狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的胞外结构域和跨膜结构域以及灵长目白血病病毒包膜糖蛋白的胞质尾结构域。
在一个实例中，所述灵长目白血病病毒为长臂猿白血病病毒(GaLV)。在一个实例中，所述灵长目白血病病毒为灵长目T细胞白血病病毒(PTLV)，例如猿猴T细胞白血病病毒(STLV)或人T细胞白血病病毒(HTLV)。猿猴T细胞白血病病毒(STLV)可以是1型(STLV-1)、2型(STLV-2)或3型(STLV-3)。人T细胞白血病病毒(HTLV)可以是1型(HTLV-1)、2型(HTLV-2)、3型(HTLV-3)或4型(HTLV-4)。
在另一个方面，本公开提供一种核酸，所述核酸编码本公开的嵌合病毒包膜糖蛋白。
在另一个方面，本公开提供一种载体，所述载体包含本公开的嵌合病毒包膜糖蛋白。在一个实例中，所述载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体。在一个实例中，所述载体是慢病毒载体。在一个实例中，所述载体是假型逆转录病毒载体，例如假型慢病毒载体。
在另一个方面，本公开提供一种细胞，所述细胞包含本公开的嵌合病毒包膜糖蛋白、本公开的核酸或本公开的逆转录病毒载体。在某些实例中，所述细胞可以是病毒载体包装细胞或病毒载体生产细胞，例如逆转录病毒载体包装细胞或逆转录病毒载体生产细胞，例如慢病毒载体包装细胞或慢病毒载体生产细胞。
在另一个方面，本公开提供一种制备病毒载体包装细胞或病毒载体生产细胞的方法，所述方法包括将本公开的嵌合病毒包膜糖蛋白或本公开的核酸转入细胞中。在一个实例中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一个实例中，所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。在一个实例中，所述逆转录病毒载体是假型逆转录病毒载体，例如假型慢病毒载体。
在另一个方面，本公开提供一种转导细胞的方法，所述方法包括使用本公开的嵌合病毒包膜糖蛋白、本公开的核酸或本公开的逆转录病毒载体。
附图说明
图1显示根据本公开的一个方面的嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体的构造。Surfacesuit：胞外结构域受体识别区；Ectodomain：胞外结构域；TMD：跨膜结构域；Cytoplasm：胞质尾结构域；R：融合抑制多肽。
图2显示根据本公开的一个方面的在采用瞬转方法的情况下各种BaEV包膜糖蛋白突变体假型慢病毒载体产毒滴度的比较结果。
图3显示根据本公开的一个方面的在制备稳定慢病毒生产细胞系的情况下各种BaEV包膜糖蛋白突变体假型慢病毒载体产毒滴度的比较结果。
图4显示根据本公开的一个方面的VSV-G假型慢病毒载体(VSV-G-LV)与根据本公开的嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体假型慢病毒载体(BaEVTR(STLV-3)-LV)转导自然杀伤性细胞(NK-92MI)的效率比较。
具体实施方式
以下实施例用以对本发明的技术方案进行说明，以下实施例不应被认为对本发明的范围和精神的限制。
本发明人通过将狒狒内源性病毒(BaEV)包膜糖蛋白的胞外结构域和跨膜结构域与灵长目白血病病毒包膜糖蛋白的胞质尾(cytoplasmic tail，下文中记为TR)结构域融合形成新的嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体，显著提高了包含所述嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体的假型化慢病毒载体(BaEV-LV)的产毒滴度。在以下实施例中，本发明人将BaEV包膜糖蛋白的胞质尾结构域替换成3种灵长目白血病病毒包膜糖蛋白的胞质尾结构域，并将构建得到的嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体BaEVTR(STLV-3)、BaEVTR(GaLV)和BaEVTR(HTLV-1)与根据美国专利US9249426B2构建的BaEVTR(MLV)和BaEVRless以及野生型BaEV(BaEV wt)进行产毒滴度比较。上述BaEVTR(STLV-3)包膜糖蛋白突变体是将BaEV包膜糖蛋白的胞质尾结构域替换成猿猴T细胞白血病病毒3型(STLV-3)包膜糖蛋白的胞质尾结构域得到的。上述BaEVTR(GaLV)包膜糖蛋白突变体是将BaEV包膜糖蛋白的胞质尾结构域替换成长臂猿白血病病毒(GaLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域得到的。上述BaEVTR(HTLV-1)包膜糖蛋白突变体是将BaEV包膜糖蛋白的胞质尾结构域替换成人T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)包膜糖蛋白的胞质尾结构域得到的。上述BaEVTR(MLV)是根据US9249426B2所述将BaEV包膜糖蛋白的胞质尾结构域替换成小鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域得到的。上述BaEVRless是根据US9249426B2所述将BaEV包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合抑制性R肽去除得到的。
如本公开中使用的，“载体”是指能够将生物材料转移到细胞中的任何载体。本公开的载体可以是非病毒载体，例如脂质纳米粒(LNP)或脂质体。本公开的载体也可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体，特别是慢病毒载体。慢病毒可以例如是人类免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV-1或HIV-2，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，马传染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)等。
慢病毒载体是本领域技术人员所熟知的。目前常用的第三代慢病毒载体系统仅保留了原始的HIV-1基因组中的gag、pol和rev基因序列。慢病毒载体可以由本领域技术人员容易地制备，例如通过将包含病毒包膜糖蛋白的编码序列的质粒、表达慢病毒gag/pol基因的质粒、表达慢病毒Rev基因的质粒，以及转移载体质粒瞬转到宿主细胞如293T中，或通过如中国专利申请CN202010366440.4中所述的方法，利用转座子系统建立稳定的慢病毒生产细胞系。
如本公开中使用的，术语“假型病毒载体”或“假型化病毒载体”是指包含外来病毒包膜糖蛋白的病毒载体，例如，包含BaEV包膜糖蛋白的慢病毒载体(BaEV-LV)。本公开的假型病毒载体是包含本公开的嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体的假型病毒载体，如包含本公开的嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体的假型慢病毒载体。
如本公开中使用的，术语“BaEV包膜糖蛋白”是指野生型BaEV包膜糖蛋白或所述野生型BaEV包膜糖蛋白的突变体，所述突变体可以例如与所述野生型BaEV包膜糖蛋白的氨基酸序列至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％相同，前提是所述包膜糖蛋白突变体假型慢病毒保留了所述野生型BaEV包膜糖蛋白假型慢病毒结合受体ASCT1和ASCT2的能力(参见Anais Girard-Gagnepain et al，Blood2014；124(8):1221–1231)。
BaEV包膜糖蛋白可以是如Rokusuke Yoshikawa等人在Virus Research,2015:128-134中所述的。通常，野生型BaEV包膜糖蛋白由核酸序列SEQ ID NO:1编码，并且可以具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。如本领域技术人员所知，BaEV包膜糖蛋白包括胞质尾结构域，跨膜结构域和胞外结构域。胞质尾结构域的C末端包括融合抑制性R肽。包膜糖蛋白序列中与胞质尾结构域，跨膜结构域和胞外结构域相对应的区域可以由本领域技术人员容易地确定。通常，胞外结构域位于野生型BaEV包膜糖蛋白的氨基酸1-506之间。通常，跨膜结构域位于野生型BaEV包膜糖蛋白的氨基酸507-529之间。通常，胞质尾结构域位于野生型BaEV包膜糖蛋白的氨基酸530-563之间，融合抑制性R肽在氨基酸547-563之间。
如本公开中使用的，术语“灵长目”具有本领域中的通常含义，并且可以例如包括人、黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩、红毛猩猩、长臂猿、猕猴、长尾猴、狒狒、山魈、疣猴等。如本公开中使用的，术语“灵长目白血病病毒”是指在灵长目动物中发现的白血病病毒，例如长臂猿白血病病毒，人T细胞白血病病毒，猿猴T细胞白血病病毒等。
如本公开中使用的，术语“灵长目白血病病毒包膜糖蛋白”是指野生型灵长目白血病病毒包膜糖蛋白或所述野生型灵长目白血病病毒包膜糖蛋白的突变体，所述突变体可以例如与所述野生型灵长目白血病病毒包膜糖蛋白的氨基酸序列至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％相同，前提是包含由所述突变体的胞质尾结构域与BaEV包膜糖蛋白的跨膜结构域和胞外结构域形成的嵌合BaEV包膜糖蛋白的假型慢病毒的产毒滴度为包含由所述野生型灵长目白血病病毒包膜糖蛋白的胞质尾结构域与BaEV包膜糖蛋白的跨膜结构域和胞外结构域形成的嵌合BaEV包膜糖蛋白的假型慢病毒的产毒滴度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％，优选地，前者的产毒滴度不低于后者。本领域技术人员可以容易地确定与灵长目白血病病毒包膜糖蛋白序列中的胞质尾结构域相对应的区域，如通过TMHMM-2.0分析。
如本公开中使用的，术语“长臂猿白血病病毒(GaLV)包膜糖蛋白”是指野生型GaLV包膜糖蛋白或所述野生型GaLV包膜糖蛋白的突变体，所述突变体可以例如与所述野生型GaLV包膜糖蛋白的氨基酸序列至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％相同，前提是包含由所述突变体的胞质尾结构域与BaEV包膜糖蛋白的跨膜结构域和胞外结构域形成的嵌合BaEV包膜糖蛋白的假型慢病毒的产毒滴度为包含由所述野生型GaLV包膜糖蛋白的胞质尾结构域与BaEV包膜糖蛋白的跨膜结构域和胞外结构域形成的嵌合BaEV包膜糖蛋白的假型慢病毒的产毒滴度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％，优选地，前者的产毒滴度不低于后者。本领域技术人员可以容易地确定与GaLV包膜糖蛋白序列中的胞质尾结构域相对应的区域，如通过TMHMM-2.0分析。通常，GaLV包膜糖蛋白的胞质尾结构域位于野生型GaLV包膜糖蛋白的氨基酸654-685之间。野生型的GaLV包膜糖蛋白胞质尾结构域可以例如包含氨基酸序列SEQ ID NO:8或由其组成。
如本公开中使用的，术语“T细胞白血病病毒(TLV)包膜糖蛋白”是指野生型TLV包膜糖蛋白或所述野生型TLV包膜糖蛋白的突变体，所述突变体可以例如与所述野生型TLV包膜糖蛋白的氨基酸序列至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％相同，前提是包含由所述突变体的胞质尾结构域与BaEV包膜糖蛋白的跨膜结构域和胞外结构域形成的嵌合BaEV包膜糖蛋白的假型慢病毒的产毒滴度为包含由所述野生型TLV包膜糖蛋白的胞质尾结构域与BaEV包膜糖蛋白的跨膜结构域和胞外结构域形成的嵌合BaEV包膜糖蛋白的假型慢病毒的产毒滴度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％，优选地，前者的产毒滴度不低于后者。本领域技术人员可以容易地确定与TLV包膜糖蛋白序列中的胞质尾结构域相对应的区域，如通过TMHMM-2.0分析。
如本公开中使用的，术语“猿猴T细胞白血病病毒(STLV)包膜糖蛋白”是指野生型STLV包膜糖蛋白或所述野生型STLV包膜糖蛋白的突变体，所述突变体可以例如与所述野生型STLV包膜糖蛋白的氨基酸序列至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％相同，前提是包含由所述突变体的胞质尾结构域与BaEV包膜糖蛋白的跨膜结构域和胞外结构域形成的嵌合BaEV包膜糖蛋白的假型慢病毒的产毒滴度为包含由所述野生型STLV包膜糖蛋白的胞质尾结构域与BaEV包膜糖蛋白的跨膜结构域和胞外结构域形成的嵌合BaEV包膜糖蛋白的假型慢病毒的产毒滴度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％，优选地，前者的产毒滴度不低于后者。本领域技术人员可以容易地确定与STLV包膜糖蛋白序列中的胞质尾结构域相对应的区域，如通过TMHMM-2.0分析。猿猴T细胞白血病病毒(STLV)可以是1型(STLV-1)、2型(STLV-2)或3型(STLV-3)。作为一个示例，通常，STLV-3包膜糖蛋白的胞质尾结构域位于野生型STLV-3包膜糖蛋白的氨基酸467-492之间。野生型的STLV-3包膜糖蛋白胞质尾结构域可以例如包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或由其组成。
如本公开中使用的，术语“人T细胞白血病病毒(HTLV)包膜糖蛋白”是指野生型HTLV包膜糖蛋白或所述野生型HTLV包膜糖蛋白的突变体，所述突变体可以例如与所述野生型HTLV包膜糖蛋白的氨基酸序列至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％相同，前提是包含由所述突变体的胞质尾结构域与BaEV包膜糖蛋白的跨膜结构域和胞外结构域形成的嵌合BaEV包膜糖蛋白的假型慢病毒的产毒滴度为包含由所述野生型HTLV包膜糖蛋白的胞质尾结构域与BaEV包膜糖蛋白的跨膜结构域和胞外结构域形成的嵌合BaEV包膜糖蛋白的假型慢病毒的产毒滴度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％，优选地，前者的产毒滴度不低于后者。本领域技术人员可以容易地确定与HTLV包膜糖蛋白序列中的胞质尾结构域相对应的区域，如通过TMHMM-2.0分析。人T细胞白血病病毒(HTLV)可以是1型(HTLV-1)、2型(HTLV-2)、3型(HTLV-3)或4型(HTLV-4)。作为一个示例，通常，HTLV-1包膜糖蛋白的胞质尾结构域位于野生型HTLV-1包膜糖蛋白的氨基酸465-488之间。野生型的HTLV-1包膜糖蛋白胞质尾结构域可以例如包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或由其组成。
本公开发现BaEVTR(GaLV)、BaEVTR(STLV-3)、BaEVTR(HTLV-1)包膜糖蛋白突变体假型慢病毒载体具备显著高于BaEVTR(MLV)、BaEVRless包膜糖蛋白突变体假型慢病毒载体的产毒能力，基于本公开的突变体构建的慢病毒生产细胞系具备进行大规模生产的潜力。
实施例1：质粒构建
以下实施例所使用的分子克隆技术，例如，DNA片段的扩增、DNA片段的限制性内切酶酶切、DNA片段的凝胶回收、两段DNA片段的连接、连接产物感受态细胞的转化、质粒提取制备及鉴定等方法均为本领域成熟已知技术。以下实施例中涉及以下试剂、材料或服务：高保真DNA聚合酶(艾科瑞)；限制性核酸内切酶(NEB)；T4连接酶(Thermo)；DNA片段凝胶回收试剂盒(Omega，D2500-02)；质粒小提试剂盒(OMEGA，D6943-02)；化学感受态细胞(XL-10gold)；SEQ ID NO:1所示核苷酸序列由金斯瑞合成并用于本公开所述质粒构建，质粒测序由擎科生物公司完成。在本实施例中，通过以野生型BaEV包膜糖蛋白序列为模板并使用专门设计的引物进行PCR反应，从而将野生型BaEV包膜糖蛋白的胞质尾结构域替换为另一种病毒的胞质尾结构域。表1为质粒构建的引物信息。表2为质粒编号及名称。
06.01.1785质粒的构建：将由金斯瑞合成的两端分别添加有ClaI和XhoI酶切位点的野生型BaEV包膜糖蛋白的编码序列(SEQ ID NO:1)使用限制性内切酶ClaI和XhoI酶切，并连接到同样经过酶切处理的06.01.1285质粒(该质粒与中国专利申请CN202010366440.4中的质粒18BF063相同)的相应位点处。
06.01.1857质粒的构建：以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12为引物，并且以06.01.1785为模板进行PCR扩增。然后以该PCR产物为模板，使用引物SEQ ID NO:11和SEQID NO:13进行扩增，并将所得的产物使用限制性内切酶ClaI和XhoI酶切，并连接到同样经过酶切处理的06.01.1285质粒的相应位点处。该质粒表达的嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体包含猿猴T细胞白血病病毒3型(STLV-3)的胞质尾结构域(即，BaEVTR(STLV-3)，其具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列)。
06.01.1860质粒的构建：以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14为引物，并且以06.01.1785为模板进行PCR扩增。然后以该PCR产物为模板，使用引物SEQ ID NO:11和SEQID NO:15进行扩增，并将所得的产物使用限制性内切酶ClaI和XhoI酶切，并连接到同样经过酶切处理的06.01.1285质粒的相应位点处。该质粒表达的嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体包含长臂猿白血病病毒(GaLV)的胞质尾结构域(即，BaEVTR(GaLV)，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列)。
06.01.1862质粒的构建：以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16为引物，并且以06.01.1785为模板进行PCR扩增。然后以该PCR产物为模板，使用引物SEQ ID NO:11和SEQID NO:17进行扩增，并将所得的产物使用限制性内切酶ClaI和XhoI酶切，并连接到同样经过酶切处理的06.01.1285质粒的相应位点处。该质粒表达的嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体包含人T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的胞质尾结构域(即，BaEVTR(HTLV-1)，其具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列)。
06.01.1786质粒的构建：以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:18为引物，并且以06.01.1785为模板进行PCR扩增。然后以该PCR产物为模板，使用引物SEQ ID NO:11和SEQID NO:19进行扩增，并将所得的产物使用限制性内切酶ClaI和XhoI酶切，并连接到同样经过酶切处理的06.01.1285质粒的相应位点处。该质粒表达的嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体包含小鼠白血病病毒(MLV)的胞质尾结构域(即，BaEVTR(MLV)，其具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列)。
06.01.1787质粒的构建：以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:20为引物，并且以06.01.1785为模板进行PCR进行扩增，并将所得的产物使用限制性内切酶ClaI和XhoI酶切，并连接到同样经过酶切处理的06.01.1285质粒的相应位点处。该质粒表达的BaEV包膜糖蛋白突变体的胞质尾结构域的融合抑制性R肽被去除(即，BaEVRless，其具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列)。
06.01.1224质粒构建：将由金斯瑞合成的基础质粒06.01.1275(中国专利申请CN202010366440.4中的质粒18BF003)和由金斯瑞合成的两端分别添加有NotI和AsiSI酶切位点的PB-HS4I序列(序列如SEQ ID NO:21所示)分别使用限制性内切酶NotI和AsiSI酶切，并使用T4连接酶(Thermo)连接。将所得的载体和由金斯瑞合成的两端分别添加有SpeI和AgeI酶切位点的pRRLSIN序列(Addgene，#12252)分别使用限制性内切酶SpeI和AgeI酶切，并使用T4连接酶(Thermo)连接。将得到的载体和由金斯瑞合成两端分别添加有SpeI和AvrII酶切位点的SV40-optiPuroR序列(序列如SEQ ID NO:22所示)分别使用限制性内切酶SpeI和AvrII酶切，并使用T4连接酶(Thermo)连接从而得到标题质粒。
06.01.1254质粒的构建：将由金斯瑞合成的两端分别添加有PacI和XhoI酶切位点的EF1a-EGFP序列(Addgene，#11923)和06.01.1224质粒分别使用限制性内切酶PacI和XhoI酶切，并使用T4连接酶(Thermo)连接从而得到标题质粒。
表1.引物列表
表2.质粒编号及名称
实施例2：瞬转产毒滴度比较
本实施例的目的在于研究在将慢病毒生产细胞构建所需的各基因或序列(gag/pol、rev、包膜糖蛋白)瞬转到宿主细胞中的情况下，各种BaEV包膜糖蛋白突变体假型慢病毒的产毒滴度的差异。根据中国专利申请CN202010366440.4(其通过引用结合于此)中所述的方法，使用Sleeping Beauty转座子系统(SB100X)，将rtTA-CymR编码序列(由CN202010366440.4中的质粒19BF074携带，其两端带有SB酶识别位点)稳定整合至293T细胞(ATCC)基因组中，将所得的细胞按照1.0E+06细胞/孔接种至6孔板中，并在5％ CO2静置培养箱中培养(培养基为DMEM(建顺生物)+10％ FBS(依科赛生物，FSD500))。24小时后，使用磷酸钙转染法，将1.8μg的各BaEV包膜糖蛋白质粒(质粒06.01.1857(携带BaEVTR(STLV-3)包膜糖蛋白突变体的编码序列)、质粒06.01.1860(携带BaEVTR(GaLV)包膜糖蛋白突变体的编码序列)、质粒06.01.1862(携带BaEVTR(HTLV-1)包膜糖蛋白突变体的编码序列)、质粒06.01.1786(携带BaEVTR(MLV)包膜糖蛋白突变体的编码序列)、质粒06.01.1787(携带BaEVRless包膜糖蛋白突变体的编码序列)、以及质粒06.01.1785(携带野生型BaEV包膜糖蛋白的编码序列))，1.6μg的携带慢病毒gag/pol基因(Addgene，#12251)的质粒(中国专利申请CN202010366440.4中的质粒18BF074)，0.8μg的携带慢病毒rev基因(Addgene，#12253)的质粒(中国专利申请CN202010366440.4中的质粒18BF071)，以及2μg的转移载体质粒(上述06.01.1254)瞬转到所述细胞中。诱导产毒48h后，取上清液1ml，置于EP管中以1500g离心5min。
使用293T作为滴度检测细胞。将293T细胞消化重悬后，按照5.0E+04/孔铺板至24孔板。第二天，吸弃培养基，更换含有8μg/ml Polybrene(sigma)的完全培养基。取离心后的病毒样品上清按照倍半稀释法稀释，然后将稀释后的病毒样品加入到上述24孔板中。细胞培养2天后，取胰酶(Thermo)消化后的细胞，使用流式细胞仪进行感染效率的检测，并计算滴度。
结果如图2所示，BaEV-wt假型慢病毒载体没有测得滴度，BaEVTR(STLV-3)、BaEVTR(HTLV-1)、BaEVTR(GaLV)、BaEVTR(MLV)和BaEVRless的滴度分别为1.11E+06TU/ml、2.46E+06TU/ml、1.03E+06TU/ml、1.52E+05TU/ml和3.43E+05TU/ml。可见的是，BaEVTR(STLV-3)、BaEVTR(HTLV-1)和BaEVTR(GaLV)假型慢病毒载体的产毒滴度极显著高于根据已有专利文献制备的BaEVTR(MLV)和BaEVRless假型慢病毒载体的产毒滴度(p-value<0.0001)。BaEVTR(STLV-3)假型慢病毒载体的产毒滴度是BaEVTR(MLV)假型慢病毒载体的产毒滴度的约7.3倍，是BaEVRless假型慢病毒载体的产毒滴度的约3.24倍。BaEVTR(HTLV-1)假型慢病毒载体的产毒滴度是BaEVTR(MLV)假型慢病毒载体的产毒滴度的约16.18倍，是BaEVRless假型慢病毒载体的产毒滴度的约7.17倍。BaEVTR(GaLV)假型慢病毒载体的产毒滴度是BaEVTR(MLV)假型慢病毒载体的产毒滴度的约6.78倍，是BaEVRless假型慢病毒载体的产毒滴度的约3倍。
实施例3：稳定生产细胞系产毒滴度比较
本实施例的目的在于研究在将慢病毒生产细胞构建所需的各基因或序列(gag/pol、rev、包膜糖蛋白)稳定整合至宿主细胞基因组中的情况下，各种BaEV包膜糖蛋白突变体假型慢病毒的产毒滴度的差异。根据中国专利申请CN202010366440.4(其通过引用结合于此)中所述的方法，构建稳定的慢病毒生产细胞系并进行诱导产毒，不同之处在于将携带VSV-G编码序列的质粒分别替换成如上所述的质粒06.01.1857(携带BaEVTR(STLV-3)包膜糖蛋白突变体的编码序列)、质粒06.01.1860(携带BaEVTR(GaLV)包膜糖蛋白突变体的编码序列)、质粒06.01.1862(携带BaEVTR(HTLV-1)包膜糖蛋白突变体的编码序列)、质粒06.01.1786(携带BaEVTR(MLV)包膜糖蛋白突变体的编码序列)、质粒06.01.1787(携带BaEVRless包膜糖蛋白突变体的编码序列)、或质粒06.01.1785(携带野生型BaEV包膜糖蛋白的编码序列)。具体地，使用Sleeping Beauty转座子系统(SB100X)将携带rtTA-Cymr编码序列的质粒(中国专利申请CN202010366440.4中的质粒19BF074)、携带慢病毒gag/pol基因的质粒(中国专利申请CN202010366440.4中的质粒18BF074)、携带rev基因的质粒(中国专利申请CN202010366440.4中的质粒18BF071)以及如上所述的携带各BaEV包膜糖蛋白突变体的编码序列的质粒所携带的相应的各序列或基因稳定整合至293T细胞的基因组中。然后，使用PiggyBac转座子系统将转移载体(06.01.1254)所携带的目的基因(GOI，即EGFP)进一步稳定整合至所述293T细胞基因组中，以构建稳定生产细胞系富集群。构建完成后，将所述生产细胞按照每孔1.0E+06，接种至6孔板中。24小时后进行诱导产毒。诱导产毒48小时后，收集病毒上清液，并且以1500g离心5min。按照实施例1中的滴度检测方法感染293T细胞并进行滴度检测。
滴度结果如图3所示。图中可以看到，使用BaEVTR(STLV-3)、BaEVTR(HTLV-1)、BaEVTR(GaLV)、BaEVTR(MLV)、BaEVRless和BaEV-wt包膜糖蛋白构建的BaEV假型慢病毒的生产细胞富集群的产毒滴度分别为1.97E+06TU/ml、1.93E+06TU/ml、1.35E+06TU/ml、2.89E+05TU/ml、7.46E+05TU/ml、2.77E+04TU/ml。BaEVTR(STLV-3)、BaEVTR(HTLV-1)和BaEVTR(GaLV)包膜糖蛋白突变体假型慢病毒生产细胞富集群的产毒滴度均显著高于BaEVTR(MLV)和BaEVRless包膜糖蛋白突变体假型慢病毒生产细胞富集群的产毒滴度(p-value<0.05)。BaEVTR(HTLV-1)包膜糖蛋白突变体假型慢病毒生产细胞富集群的产毒滴度是BaEVTR(MLV)包膜糖蛋白突变体假型慢病毒生产细胞富集群的产毒滴度的约6.68倍，是BaEVRless包膜糖蛋白突变体假型慢病毒生产细胞富集群的产毒滴度的约2.59倍；BaEVTR(STLV-3)包膜糖蛋白突变体假型慢病毒生产细胞富集群的产毒滴度是BaEVTR(MLV)包膜糖蛋白突变体假型慢病毒生产细胞富集群的产毒滴度的约6.82倍，是BaEVRless包膜糖蛋白突变体假型慢病毒生产细胞富集群的产毒滴度的约2.64倍；BaEVTR(GaLV)包膜糖蛋白突变体假型慢病毒生产细胞富集群的产毒滴度是BaEVT(MLV)包膜糖蛋白突变体假型慢病毒生产细胞富集群的产毒滴度的约4.67倍，是BaEVRless包膜糖蛋白突变体假型慢病毒生产细胞富集群的产毒滴度的约1.81倍。
实施例4：VSV-G假型慢病毒载体(VSV-G-LV)与嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体假型慢病毒载体(BaEVTR(STLV-3)-LV)转导NK细胞(NK-92MI)的效率比较
将通过实施例3所述的方法制备的BaEVTR(STLV-3)包膜糖蛋白突变体假型慢病毒生产细胞以及使用类似方法(不同之处在于将质粒06.01.1857替换为中国专利申请CN202010366440.4中的18BF068质粒)制备的VSV-G假型慢病毒生产细胞，分别以每盘5.0E+06个细胞铺板至100mm细胞培养皿。诱导产毒48小时后，收集病毒上清液，经0.22μm滤器(优宁维)过滤后，使用超速离心机(贝克曼)以25000rpm离心1.5h浓缩病毒。然后使用实施例2中描述的滴度检测方法对浓缩后的病毒进行感染滴度检测，以获得VSV-G-LV和BaEVTR(STLV-3)-LV的标准品。使用所述标准品分别感染NK-92MI细胞(上海酶研生物，CC-Y1401)。具体地，将含有8μg/ml Polybrene的细胞悬液，按照5.0E+05/孔，铺板至24孔板。分别使用浓缩后的BaEVTR(STLV-3)-LV和VSV-G-LV以不同MOI(5MOI、2.5MOI、1.25MOI、0.625MOI、0.3125MOI)感染所述细胞。然后，以800g离心1h。完毕后，将细胞放置细胞静置培养箱。感染24小时后，加入等体积的细胞培养基以稀释Polybrene，避免Polybrene对细胞生长的影响。感染48小时后，使用流式细胞仪进行病毒感染效率的检测。
结果如图4所示。图中可以看出，在5MOI下，BaEVTR(STLV-3)-LV感染NK-92MI细胞的感染效率为VSV-G-LV的约3.85倍(85.79％vs.22.27％)；在2.5MOI下，BaEVTR(STLV-3)-LV感染NK-92MI细胞的感染效率为VSV-G-LV的约5.95倍(89.74％vs.15.09％)；在1.25MOI下，BaEVTR(STLV-3)-LV感染NK-92MI细胞的感染效率为VSV-G-LV的约9.0倍(80.09％vs.8.9％)；在0.625MOI下，BaEVTR(STLV-3)-LV感染NK-92MI细胞的感染效率为VSV-G-LV的约11.10倍(61.42％vs.5.53％)；在0.3125MOI下，BaEVTR(STLV-3)-LV感染NK-92MI细胞的感染效率为VSV-G-LV的约17.64倍(34.57％vs.1.96％)。由此可见，相较于VSV-G假型慢病毒载体，根据本公开的嵌合BaEV包膜糖蛋白突变体假型慢病毒载体对于静息期细胞，如NK细胞，具有显著更高的转导效率。
Claims (10)
1.一种嵌合病毒包膜糖蛋白，其特征在于，所述嵌合病毒包膜糖蛋白包含狒狒内源性逆转录病毒包膜糖蛋白的胞外结构域和跨膜结构域以及灵长目白血病病毒包膜糖蛋白的胞质尾结构域。
2.根据权利要求1所述的嵌合病毒包膜糖蛋白，其特征在于，所述灵长目白血病病毒为长臂猿白血病病毒。
3.根据权利要求1所述的嵌合病毒包膜糖蛋白，其特征在于，所述灵长目白血病病毒为灵长目T细胞白血病病毒，例如是猿猴T细胞白血病病毒或人T细胞白血病病毒。
4.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合病毒包膜糖蛋白。
5.一种载体，其特征在于，所述载体包含根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合病毒包膜糖蛋白。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体是病毒载体，例如是逆转录病毒载体，特别是慢病毒载体。
7.根据权利要求5或6所述的载体，其特征在于，所述载体是假型逆转录病毒载体。
8.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合病毒包膜糖蛋白、根据权利要求4所述的核酸或根据权利要求5-7中任一项所述的载体，所述细胞可以是病毒载体包装细胞或病毒载体生产细胞。
9.一种制备病毒载体包装细胞或病毒载体生产细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合病毒包膜糖蛋白或根据权利要求4所述的核酸转入细胞中。
10.一种转导细胞的方法，其特征在于，所述方法包括使用根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合病毒包膜糖蛋白、根据权利要求4所述的核酸或根据权利要求5-7中任一项所述的载体。
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