KR102124236B1 - Park2 유전자 넉아웃 파킨슨 질환 모델용 돼지 및 이의 용도 - Google Patents

Park2 유전자 넉아웃 파킨슨 질환 모델용 돼지 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파킨슨 질환 모델용 형질전환 돼지 및 이의 제조방법, 그리고 이의 이용에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Park2 유전자를 넉아웃(knock-out)시킨 형질전환 돼지를 파킨슨 질환 동물 모델로 이용하는 것에 관한 것이다.

Description

PARK2 유전자 넉아웃 파킨슨 질환 모델용 돼지 및 이의 용도{PARK2 knock-out porcine Models for Parkinson' s disease and the Use thereof}
본 발명은 파킨슨 질환 모델용 형질전환 돼지 및 이의 제조방법, 그리고 이의 이용에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Park2 유전자를 넉아웃(knock-out)시킨 형질전환 돼지를 파킨슨 질환 동물 모델로 이용하는 것에 관한 것이다.
치매(dementia)는 기억력 장애, 판단력 상실 등 전신기능의 전반적인 장애를 동반하는 질환이다. 치매의 발병 형태는 매우 다양한데, 약 50% 정도는 파킨슨형 치매(dementia of Parkinson type)이며, 약 30% 정도는 혈관성 치매(dementia of Vascular type), 알콜성 치매 및 파킨슨병 치매이고, 약 20% 정도는 파킨슨형 치매 및 혈관성 치매 등 양쪽성으로 발병하는 것으로 알려져 있다.
파킨슨병(PD)은 퇴행성 신경질환 중 노인성치매에 이어 두 번째로 흔한 노화관련 질환으로 65세 이상 노인의 2% 가량이 이 병으로 고통 받고 있으며, 미국에서만 약 백만 명의 환자가 있다. 이 병은 손떨림, 강직증세, 느린 운동성, 자세의 불안정성 등과 같은 운동기능의 장애가 나타나며, 정서불안 및 공포감 등의 정서적 장애가 동반된다. 병의 전개과정이 점진적이며, 병리학적으로 뇌의 흑질 내도파민성 신경세포의 심각한 퇴화(약 70-80%)가 관찰된다. 이들 세포 내에서는 루이소체(Lewy body)라고 하는 단백질의 비정상적 침착이 확인된다.
우리나라 노인인구는 급속히 증가하고 있으며, 이와 더불어 파킨슨병 환자도 계속해서 증가하고 있다. 파킨슨병의 원인은 아직 정확히 밝혀지지 않았다. 하지만, 유전적 인자와 환경적 인자가 복합적으로 작용하여 파킨슨병이 발생하는 것으로 보고되고 있다. 특히, 최근 유전학이 발전하면서 그동안 알려지지 않은 파킨슨병의 유전 인자에 대한 연구가 매우 빠르게 발전하고 있다.
이러한 실정에서, 뇌신경 질환에 대한 새로운 치료법을 발견하기 위해 동물 모델을 이용하는 것은 새로운 치료 표적(therapeutic target)을 발견하고, 전임상 단계에서 약물 검사를 수행하기 위해 필수적인 요소이다.
신경과학자들의 제 1차적 관심은 연구 목표를 달성하는데 유용한 가장 적절한 동물 모델의 선택이다. 연구자들은 환자에게서 필수적으로 나타나지 않는 기전에 근거하지만, 질환의 기본적인 병적 특징을 가지는 모델과 모든 임상적 특징이 재연되지는 않지만, 알려진 병인 기전에 근거한 동물모델 사이에서의 선택에 직면하는 경우도 많다. 따라서, 연구자들은 병인, 증상,치료, 생리학적 기초에 부합하는 동물모델의 개발에 도전하고 있다. 이러한 동물모델의 연구는 치매의 특징, 비정상적인 뇌세포의 시공간적 변화과정 및 뇌의 기능장애 기전을 정확히 알아내고, 다양한 새로운 치료 표적들과 새로운 치료법의 효과 검증에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
지금까지는 퇴행성 뇌신경 질환의 약물치료나 기전연구를 위한 질병모델로는 대부분 설치류를 이용해 왔으나, 동물 질환모델의 병리양상과 증상이 사람에서 관찰되는 것과 많은 차이를 보이고 있어 설치류 질환모델에서 나온 결과를 토대로 임상시험을 시행할 경우 많은 문제점이 있어왔다.
즉, 효과적인 질환 모델로 사용 가능할 만큼 사람의 파킨슨병(PD) 및 파킨슨(PD)의 증상을 모두 발현하는 모델동물은 아직까지 확립하지 못하고 있는 실정이다.
그러므로, 인간과의 디멘존, 번식, 수명 및 행동양상의 확연한 차이로 인해 보다 인간과 가까운 종을 이용한 질환동물 모델에 대한 필요성이 제기되었고, 영장류의 경우 그 희소성 및 사육관리의 비용 및 어려움으로 인해 극히 제한적인 분야에서만 질환연구에 활용 가능한 제약이 있으므로, 이에 따라 비교적 저렴한 비용과 시설에서 보다 정확한 난치질환 연구를 할 수 있는 돼지를 새로운 모델 동물로서 바이오 메디컬 분야에 활용하고자 하는 요구가 증가 되고 있다.
돼지는 해부 생리학적으로 인간과 유사성이 인정되어 이미 각종 질환의 병리학적 기전과 치료를 위한 연구에 이용되고 있으며, 특히 오랫동안 경제 동물로 가치가 인정되어 다른 중/대 동물을 질환모델로 사용할 때보다 윤리적인 문제점을 피해갈 수 있으며, 안정적인 사육 시스템이 구축되어 있어 실험동물 모델 개발시 유지 및 관리가 용이한 장점이 있다.
이에, 본 발명자들은 인간 유전자와 유사성이 인정되는 돼지를 이용하되, 인간 Park2 유전자의 특이 서열을 인식하여 절단하는 뉴클라아제를을 이용하여 형질전환 체세포 복제 기법으로 적용함으로써, Park2 유전자를 넉아웃 시켜 효과적인 파킨슨 질환 동물모델을 제작할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
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본 발명의 목적은 파킨슨 질환 모델용 돼지 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 파킨슨 질환 모델용 돼지의 제조방법에 필요한 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포 및 핵 이식란을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 파킨슨 질환 모델용 돼지의 제조방법에 필요한, 인위적인 뉴클라아제 시스템을 이용하는 유전자 넉아웃 또는 넉다운 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 파킨슨 질환 모델용 돼지의 다양한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 파킨슨 질환 모델용 돼지를 이용하여 파킨슨 예방 및 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
Park2 결핍 질환 모델용 돼지의 생산을 위한, Park2 유전자의 인위적 조작 및 이의 이용을 제공한다. 보다 구체적으로, Park2 유전자의 인위적인 조작 또는 변형을 이용하여 Park2 결핍 표현형을 가지는 돼지를 생산하는 방법 및 이의 이용에 관한 것이다. 상기 Park2 결핍 표현형은 파킨슨 질환으로 나타날 수 있다.
그러므로, 본 발명은 파킨슨 병의 진행 및 병리학적 기전의 연구에 유용한 돼지 모델 및 이의 이용을 제공할 수 있다.
본 발명은 특정 목적을 위해 Park2 유전자의 조작 또는 변형용 조성물 및 이를 이용하는 방법을를 제공한다.
일 구현예에서는, Park2 유전자의 핵산서열 내 변형에 의해 Park2 유전자가 넉아웃된, Park2 단백질 발현이 불활성화된, Park2 결핍 질환 돼지 모델을 제공한다.
Parkin(Park2)은 465개의 아미노산으로 구성된 단백질로서 유비퀴틴 단백질 연결효소3(ubiquitin-protein ligase 3)의 일종이다. 그 아미노 말단은 유비퀴틴과 유사하며, 카복시 말단은 2개의 ring finger 도메인을 지닌다. 일 예로 서열번호 1로 본원 명세서에 개시하였다.
상기 핵산서열 내 변형은 하나 이상의 핵산의 결실, 치환, 삽입 또는 역위를 포함할 수 있다.
일 구체예에서는, 상기 핵산의 변형은 Park2 유전자의 엑손 6 영역에 일어난 것일 수 있다.
일 구체예에서는, 핵산서열 내 변형은 뉴클레아제 제제에 의해 인위적으로 일으킬 수 있다.
예를 들어, 상기 뉴클레아제 제제는 하기의 뉴클레아제 중 1 이상을 사용할 수 있다.:
(a) 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN);
(b) 전사 활성화 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN);
(c) 메가뉴클레아제; 또는
(d) RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)
일 실시예에서, 상기 핵산서열 내 변형은 전사 활성화 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 또는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN)에 의해 인위적으로 조작될 수 있다. 대상은 표적 핵산, 유전자, 염색체 또는 단백질일 수 있다.
상기 TALEN은 TAL이펙터 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인이 링커를 통하여 연결된 형태도 포함한다. "PARK2 유전자를 타겟팅하는 TALEN"은 PARK2 유전자의 특정 서열에 결합하여 PARK2 유전자의 절단을 가져오는 TALEN을 의미한다. 상기 PARK2 유전자를 타겟팅하는 TALEN은 바람직하게는 PARK2 유전자의 엑손 6을 특이적으로 절단하는 것이며, 더욱 바람직하게는 PARK2 유전자의 엑손 6에 위치한 서열번호 2 또는 3 부위에 결합하는 TALEN일 수 있다.
상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)로부터 유래될 수 있다. Cas9 패밀리의 추가의 예는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2014/131833에 기재되어 있다. 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)유래의 Cas9 단백질일 수 있다.
예를 들어, 상기 Park2 유전자는 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)에 의해 유전적으로 조작될 수 있는데,
상기 Park2 유전자를 구성하는 핵산서열 중 엑손 6 영역 내의
하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입;
야생형 유전자와 상이한 하나 이상의 뉴클레오타이드로의 치환;
외부 유래의 하나 이상의 뉴클레오타이드 삽입
중 하나 이상의 핵산의 변형을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에서 Parkin(Park2) 핵산의 변형은 염색체 전체 게놈 서열에서 2 이상의 복수 부위에서 일어날 수 있다.
구체적인 실시 형태에서, 적어도 한 부위 이상에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 Park2 유전자 핵산서열에서 변화될 수 있다. 이에 의해 Park2 유전자는 넉아웃(knock out) 또는 넉다운(knock down)될 수 있다.
상기 핵산의 변형은 유전자의 프로모터 영역에서 일어날 수 있다.
상기 핵산의 변형은 유전자의 엑손 영역에서 일어날 수 있다. 바람직하게는 엑손 6 영역에서 일어날 수 있다.
상기 핵산의 변형은 유전자의 인트론 영역에서 일어날 수 있다.
상기 핵산의 변형은 유전자의 인핸서 영역에서 일어날 수 있다.
또한, 다른 구현예에서, Park2 유전자의 핵산 서열 중 TALEN에 의해 인식가능한 서열을 제공한다.
또한, 다른 구현예에서, Park2 유전자의 핵산 서열 중 타겟 서열에 각각 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산을 제공한다.
상기 서열들은 Park2 유전자의 핵산 서열 중 1이상의 부위일 수 있다.
상기 TALEN에 의해 인식가능한 서열은 비제한적으로, 18 내지 25 bp, 18 내지 24 bp, 18 내지 23 bp, 19 내지 23 bp, 19 내지 23 bp, 또는 20 내지 23 bp의 뉴클레오타이드일 수 있다.
예를 들어, 이하의 TALEN에 의해 인식가능한 서열을 제공할 수 있다:
5-TGAGTGCCAGTCTCCAAACT-3 (서열번호 2)
5-AGCAGTAAGTACTGGTCAAA-3 (서열번호3)
또한, 구현예에서, 본 발명은 상기 인위적으로 조작된 Park2 유전자 및 이로부터 발현되는 산물 중 1이상을 포함하는, 인위적으로 조작된 세포 또는 배아를 제공할 수 있다.
상기 세포 또는 배아는 핵산서열 내 변형이 일어난 불활성화된 Park2 유전자를 포함하고, 이의 표현형을 가지는 개체로 발달할 수 있다.
또한, 구현예에서, 본 발명은 Park2 유전자를 유전적으로 조작하기 위한 조성물 및 이의 이용을 제공할 수 있다.
일 실시예에서, Park2 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산; 및 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 Park2 유전자 조작용 조성물을 제공한다.
다른 실시예에서, Park2 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위를 인식하여 절단할 수 있는 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease) 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 Park2 유전자 조작용 조성물을 제공한다.
임의의 구체예에서, 본 발명은 제1 및 제2 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머를 포함하는 TAL 이펙터 뉴클레아제 쌍 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 Park2 유전자 넉아웃용 조성물을 제공한다.
상기 제1 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머의 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 표적 서열 5-TGAGTGCCAGTCTCCAAACT-3(서열번호2)에 결합하고, 상기 제2 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머의 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 표적 서열 5-AGCAGTAAGTACTGGTCAAA-3(서열번호3)에 결합할 수 있다.
각각의 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머에서 DNA 절단 도메인이 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인 C-말단에 위치할 수 있다. 상기 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머의 DNA 절단 도메인은 FokI-엔도뉴클레아제의 DNA-분열 도메인일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은
Park2 유전자 상의 표적 게놈 유전자좌를 포함하는 세포 또는 배아에, 상기 Park2 유전자 조작용 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는, Park2 유전자의 핵산 서열이 변경된 세포 또는 배아를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 TALEN, RNA-가이드 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA 등은, 각각 핵산 서열의 형태로 1 이상의 벡터에 존재하거나, 또는 가이드 핵산과 RNA-가이드 엔도뉴클레아제의 결합으로 복합체를 형성하여 존재할 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 생체 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다. 바람직하게는 생체 외(in vitro)에서 수행될 수 있다.
접촉시키는 단계는 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행될 수 있다.
바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 1이상일 수 있다.
구현예에서, 본 발명은
Park2 유전자를 넉아웃(knock-out) 시키는 질환 돼지모델 제작용 재조합 벡터로 형질전환된 세포주, 및 이를 이용한 Park2 유전자가 넉아웃된 질환 모델용 돼지를 제공한다. 이 때, 상기 형질전환은 체세포 핵 이식 기술(somatic cell nuclear transfer, SCNT)에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명은 상기 Park2 결핍 질환 모델용 돼지의 제조방법의 과정에서 수득될 수 있는 Park2 결핍 질환 모델 제작에 필요한 형질전환 벡터, 세포 및 핵 이식란 등을 모두 포함한다.
예를 들어, Park2 유전자 특정 서열을 인식하여 절단하는 활성을 가지는 인공 뉴클레아제를 코딩하는 서열을 함유하는 Park2 결핍 질환 돼지모델 제작용 재조합 벡터가 도입된, 형질전환 세포를 제공할 수 있고, 상기 형질전환된 돼지 유래 세포의 핵을, 탈핵된 난자에 이식하여 형성된 돼지의 핵 이식란도 제공할 수 있다.
구현예에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 개체를 수득하는 방법 및 그러한 개체를 제공할 수 있다.
상기 개체는 비-인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 닭, 조류, 토끼, 염소, 개, 고양이 및 어류로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1이상의 동물일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 Park2 결핍 질환, 예를 들어 파킨슨 질환 모델용 돼지의 다양한 용도를 제공한다.
일 예로써, 다음을 포함하는, Park2 결핍 질환, 예를 들어 파킨슨 질환 예방 및 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다:
상기 Park2 결핍 질환 모델용 돼지에 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 및 후보물질 투여 후, 상기 돼지의 조직을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 분석하는 단계.
이처럼, 본 발명은 생리학적으로 사람과 가장 유사한 동물인 돼지를 이용한 Park2 결핍 질환 동물모델 및 이의 다양한 용도를 제공한다.
본 발명의 파킨슨 질환 모델용 돼지는, 인간과 유전적으로 유사하고 유전적 분석이 유용하며 정확한 질병원인과 기전을 연구하기에 유용할 뿐 아니라 독성 및 안전성 평가에도 최적 동물모델로서, 파킨슨 질병 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발 등에 다양하게 활용될 수 있으므로, 파킨슨 질환 동물 모델로서 매우 유용할 것이다.
도 1은 in vitro culture하여 만든 배반포의 돌연변이 효율을 간접적으로 측정하여 분석한 결과이다.
도 2은 공여 세포의 효율 검증을 위해 genomic DNA 및 in vitro condition에서 생산된 배반포를 mismatch-sensitive nuclease assay를 이용하여 분석한 결과이다.
도 3는 PDM5의 구개열(cleft), 간(liver), 뇌(brain), 심장(heart), 폐(lung), 신장(kidney)및 비장(spleen) 사진이다.
도 4는 PDM3을 재 복제한 PDM10 과 PDM11의 사진이다.
도 5는 본 발명의 파킨슨 질환 모델용 돼지(PDM1~PDM11)의 유전자 발현 분석결과이다.
도 6은 1년령 Parkin KO 미니돼지의 18F-FDG의 PET과 CT에 관한 영상 결과이다.
도 7은 1년령 Parkin KO 미니돼지의 FP-CIT의 PET과 CT에 관한 영상 결과이다.
도 8은 1년령 Parkin KO 미니돼지의 CT에 관한 영상 결과이다.
도 9는 1년령 Parkin KO 미니돼지의 MRI에 관한 영상 결과이다.
도 10은 정상돼지와 차이를 나타내는 분변을 섭취모습 및 평상시에도 혀가 밖으로 노출된 모습을 나타내는 사진이다.
본 발명에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"유전자 가위(engineered nuclease)"는 임의의 유전자에 결합해 특정 핵산 부위, 예를 들어 특정 DNA부위를 절단하여 손상 또는 파괴할 수 있는 인공적 뉴클라아제 및/또는 이를 포함하는 시스템을 통칭하는 용어이다. "표적화 (엔도)뉴클레아제(target-specific (endo)nuclease)" 또는 "인공 뉴클레아제(engineered nuclease)"로 표현하기도 한다. 상기 유전자 가위는 서열-특이적 엔도뉴클레아제이다. '서열-특이적 엔도뉴클레아제' 또는 '서열-특이적 뉴클레아제'는, 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 특정 뉴클레오티드 서열에서 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 표적 유전자를 인식하고 결합하여, 상기 폴리뉴클레오티드에서의 단일- 또는 이중-가닥 파손을 촉매하는 단백질을 가리킨다. 특정 서열을 특이적으로 인식하여 핵산을 절단할 수 있으므로 유전자 편집 (Genome Editing) 기술에 매우 유용하다. 예를 들어, ZFN(Zinc finger protein), TALEN(transcription activator-like effector protein), CRISPR/Cas system을 포함하는 RGEN(RNA-guided endonuclease) 등이 있다.
"세포", "숙주 세포", "변형 숙주 세포" 등은 특정 대상 세포뿐만 아니라 이런 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 의미한다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경 영향에 의해 후대에서 일어날 수 있기 때문에, 이런 자손은, 사실상, 부모 세포와 동일하지 않을 것이나 본 발명에 사용된 용어와 범위 내에 여전히 포함된다.
핵산에 대해 적용된 용어 "변형된" 또는 "조작된"은 본 발명에서 교환적으로 사용되며, 이는 유전자를 구성하는 핵산서열 내 인위적인 변경을 가한 것을 의미한다. 상기 변경은 하나 이상의 핵산의 결실, 치환, 삽입 또는 역위 등을 포함할 수 있다. 변형된 또는 조작된 핵산 서열은 이들 핵산 또는 이의 발현 생성물의 발현 및/또는 기능적 활성의 변경, 예를 들어, 증가, 촉진, 감소 또는 소실 등의 양태로 나타날 수 있다.
핵산에 대해 적용된 용어 "손상" 및 "파괴"는 본 발명에서 교환적으로 사용되어 핵산 또는 이의 발현 생성물의 발현 및/또는 기능적 활성을 감소 또는 제거하는 임의의 유전자 변형을 의미한다. 예를 들어, 유전자의 파괴는 유전자의 발현 및/또는 상응하는 유전자 생성물(예를 들어, mRNA 및/또는 단백질)의 기능적 활성을 감소 또는 제거하는 임의의 유전자 변형의 범위 내에 포함된다. 유전자 변형은 핵산(예를 들어, 유전자)의 완전 또는 부분 불활성화, 억제, 결실, 방해, 봉쇄 또는 하강 조절을 포함한다.
핵산에 대해 적용된 용어 "절단"은 유전자의 뉴클레오티드 분자의 공유결합된 백본의 연결을 해제하는 것을 의미한다.
'질환 모델 동물'이란 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환 모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.
'동물' 또는 '실험동물'은 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다. 이런 동물들은 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류(예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 소,양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위), 영장류(예를 들어, 침팬지, 원숭이, 붉은털원숭이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직한 동물은 돼지이다.
'녹아웃(knock-out)'은 표적 유전자의 기능 저하를 가져다 주는 유전자 서열 상의 변형을 의미하는데, 바람직하게는 이로써 표적 유전자 발현이 탐지 가능하지 않거나 무의미하다. 본 발명에서 Parkin(Park2) 유전자의 녹아웃은 Parkin(Park2) 유전자의 기능이 실질적으로 저하되어 발현이 탐지될 수 없거나 또는 무의미한 수준으로만 존재하는 것을 의미한다. 녹아웃 형질전환체는 Parkin(Park2) 유전자의 이형 접합성 녹아웃 또는 Parkin(Park2) 유전자의 동형 접합성 녹아웃을 갖는 형질전환성 동물일 수 있다. 녹아웃에는 예를 들어, 표적 유전자 변형을 증진시키는 물질에 해당동물을 노출시키거나, 표적 유전자 부위에서 재조합을 증진시키는 효소를 도입시키거나 또는 출생 후에 표적 유전자 변형을 지시하는 기타 방법시, 표적 유전자의 변형이 일어날 수 있는 조건적 녹아웃이 또한 포함된다.
'표적 유전자'는, 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 세포 내 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 가리킨다. "표적 서열"은, 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 표적 유전자의 일부분, 예를 들어, 표적 유전자의 하나 이상의 엑손 서열, 표적 유전자의 인트론 서열 또는 조절 서열, 또는 표적 유전자의 엑손 및 인트론 서열, 인트론 및 조절 서열, 엑손 및 조절 서열, 또는 엑손, 인트론 및 조절 서열의 조합을 가리킨다.
'서열 상동성'은, 공여체 및 표적 유전자 폴리뉴클레오티드 서열들과 관련하여, 서열들을 배열하고, 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위해 간격을 도입한 후, 표적 유전자 서열 중의 뉴클레오티드 잔기와 비교한 공여체 서열 중의 뉴클레오티드 잔기의 동일성 백분율로 정의된다. 백분율 뉴클레오티드 서열 상동성을 결정하기 위한 정렬은 당해기술에 해당하는 다양한 방식으로 달성될 수 있는데, 예를 들면 상용화된 컴퓨터 소프트웨어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어 등을 사용할 수 있다. 당해기술의 숙련가들은 서열의 정렬을 위한 적절한 매개변수들, 예를 들면 비교될 서열들의 전장에 걸친 최대 정렬을 달성하기에 필요한 모든 알고리즘 등을 결정할 수 있다.
'핵 이식'은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.'핵 이식란'은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.
'복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 돼지의 체세포, 배아 세포, 태아 유래 세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다. 본 발명은 핵 이식 기술을 이용하여 돼지을 복제하는 기술을 이용한다. 특히, 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.
'핵 공여 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다. '난자'는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다. 본 발명에서 상기 핵 공여 세포로는 돼지의 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있다.
'체세포(somatic cell)'란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포이며, 어떤 목적으로 특화하여 그 이외의 세포는 되지 않는 분화된 세포와, 몇종류인가의 다른 기능을 갖는 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포를 포함한다.
'줄기세포(stem cell)'는 어떤 조직으로든 발달할 수 있는 세포를 의미한다. 기본적인 특징으로는 두 가지가 있는데, 우선 반복 분열하여 자신을 만들어 내는 자기 재생산(self-renewal), 그리고 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는다.
'배양'은 생물체나 생물체의 일부(기관 ·조직 ·세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일로써, 이 경우 외적 조건으로 온도 ·습도 ·빛 ·기체상의 조성(이산화탄소나 산소의 분압) 등이 중요하며, 그 밖에 배양되는 생물체에 가장 중요한 직접적인 영향을 주는 것은 배지(배양기)로, 그 생물체의 직접적인 환경인 동시에 생존이나 증식에 필요한 각종 영양소의 공급장이다.
'체외배양'이란 세포 등이 체내에서 자라는 상태와 구분되는 방법으로 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내의 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하는 것이다.
'배지' 또는 '배지 조성물'은 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다.
'산자(living offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다.
'치료'는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. '치료'는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 '완화(Palliating)'하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
'약'이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "함유하다" 및 "포함하다"란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 Parkin(Park2) 유전자 결핍 질환 동물 모델에 관한 것이다.
보다 구체적으로, Parkin(Park2) 유전자의 핵산서열을 인위적으로 변형시키는 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.
[Parkin 결핍 돼지 모델]
모델 동물로서의 돼지는 기존의 설치류 모델에 비해 생존 기간이 길며, 인간과 유사한 생체 메카니즘을 지니고 있다고 알려져 있어 기존의 한계성을 극복 가능할 차세대 질환모델 동물 종으로서 각광받고 있다.
따라서 본 발명자들은 대동물인 돼지를 이용하여 설치류 모델을 뛰어넘는 질환 모델의 생산, 행동을 통해 보다 신뢰성있는 Parkin(Park2) 결핍 질환 동물 모델을 개발하고 이를 활용하고자 하였다. 예를 들어, 파킨슨 질환 동물모델일 수 있다.
파킨슨병(Parkinson's disease, PD)은 가장 흔한 퇴행성신경질환(neurodegenerative disease)의 하나로 대부분 50-60세 사이에 발병되며, 남녀 간의 발생 빈도는 비슷하거나 남자에서 약간 높게 나타난다(Tanner와 Aston, 2000). 파킨슨병의 4대 징후는 진전(tremor), 강직(rigidity), 운동완서(bradykinesia), 불량한 자세반사(poor postural reflexes)이다(Benatru 등, 2008). 파킨슨병의 원인은 아직까지 정확하게 알려지지는 않았으나 흑색질(substantia nigra)에서 바닥핵(basial ganglia)의 기능을 조절하기 위해 분비되는 물질인 도파민(dopamine)이 부족하면 나타나는 병증으로 알려져 있다(Di Monte, 2000). 파킨슨병의 주증상은 근육경직, 보행 장애, 균형 장애, 인지기능 저하 등의 신체적인 문제를 야기하며(Emre, 2003), 발병 이후 우울증과 자기 효능감(self-efficacy) 저하 등의 사회심리적인 문제가 나타남으로써(Hantz 등, 1994) 궁극적으로는 환자의 삶의 질을 떨어뜨리고 부양가족의 부담도 증가시키게 된다(Ray 등, 2006; Olanow 등, 2009). 이 질병 역시 현재까지 완치시킬 수 있는 명확한 치료약이나 치료법은 없는 실정이다.
파킨슨 병은 흑질(substantia nigra) 도파민 신경세포의 퇴행성 변화 및 사멸과 α-synuclein이 세포질내 침착(cytoplasmic inclusion)된 루이소체(Lewy body)가 특징적인 소견으로, 이로 인해 각종 파킨슨 증상이 발생하게 된다. 최근에는 흑질 및 기저핵과 같은 특정 부위 뿐만 아니라 뇌간(brain stem)을 포함한 전반적인 뇌 부위에 병리적 소견이 관찰되며, 운동 증상 이외에도 자율신경 증상 및 정신심리적 증상 등도 중요함이 밝혀져, 파킨슨 병에 대한 동물 모델을 제작하는 것은 매우 어렵다
파킨슨 병 동물 모델은 환경 독소 또는 합성 독소를 투여하여 유도하는 신경 독성(neurotoxic) 모델과 α-synuclein, Parkin, Pink1, DJ-1, LRRK2 등의 유전자 변형을 통해 제조된 유전학적(genetic) 동물 모델로 크게 나눌 수 있다.
신경 독성 약제를 이용한 동물 모델 제작으로, 도파민 신경 독소인 6-OHDA(6-hydroxydopamine)을 흑질에 투여하거나, 파킨슨 병 쥐 및 원숭이 모델을 만들기 위한 신경 독성 화합물로 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)를 사용하는 방법, 살충제 로테논(rotenone) 또는 제초제 파라콰트(paraquat)를 사용하는 방법 등이 이용된다.
상기 신경 독성 모델은 진행성 신경세포 퇴행, 루이소체 침착, 비 운동 증상 등을 나타내는 소견에는 한계가 있으므로, 유전학적 모델을 통해 파킨슨 병 환자의 질병 유발 기전과 유사한 동물 모델을 만들기 위해 연구하고 있다.
기존의 퇴행성 뇌질환 연구를 위한 유전학적 모델동물은 형질전환 기법을 적용한 설치류 모델이 대부분이고, 다른 동물 종은 한계점이 많다. 이처럼, 기존 파킨슨 동물모델은 생쥐에 국한되어 있으며, 인간과의 유전적 유사성과 다산 등 여러 가지 이유로 PD질환 돼지모델 생산에 대한 필요성이 급증하고 있으며, 현재까지 파킨슨 돼지모델은 개발되지 않고 있다.
따라서 본 발명자들은 대동물인 돼지를 이용하여 설치류 모델을 뛰어넘는 질환 모델의 생산, 행동을 통해 파킨슨 질환의 유발을 확인함으로써, 보다 신뢰성있는 파킨슨 질환 동물 모델을 개발하고 이를 활용하고자 하였다.
본 발명은 일 관점에서, Parkin(Park2) 유전자를 넉아웃 시킨 유전자 변형 동물모델, 바람직하게는 파킨슨 질환의 돼지 모델에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 유전적으로 변형된 동물, 그 중에서도 Parkin(Park2) 유전자를 넉아웃 시킨 재조합 돼지, 바람직하게는 미니돼지에 관한 것이다.
돼지는 해부학적으로 장기의 크기가 인간과 비슷하여 이종 장기모델로서 적합할 뿐만 아니라 생리, 유전학적으로도 인간과 유사한 점이 아주 많다. 또한 높은 번식능력을 가지고 있으므로 생산 및 치료용 생물 신소재 개발에 있어서도 적합할 뿐만 아니라 독성 및 안전성 평가에 좋은 동물모델이라 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 돼지는 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있는, 공지된 임의의 종류를 사용할 수 있다.
돼지(학명 :SusscrofPDomestica)는 수아강, 진수하강, 맹수유제구 측추상목구, 우제목(소,염소를 포함), 멧돼지과에 속하며,염색체 수는 2n=38이다. 본래 돼지는 육용 가축으로 육성된 잡식동물이나,생리 해부학적 소견이 사람과 유사한 점과 근년 동물복지에 대한 높은 관심과 함께 실험동물로서도 크게 주목받고 있다. 돼지는 생리 해부학적으로서도 크게 주목받고 있다. 돼지는 생리 해부학적으로 많은 점에 있어 사람과 유사하므로 연구 전반에 넓게 이용되고 있다.
특히, 본 발명에서는 성숙시의 최대 체중이 사람에 가까운 60-70kg의 미니돼지(대표예:피트만,무어)를 사용하거나, 실험에 사용하기 더 쉬운 소형돈(성체중: 30-40kg) 괴팅겐계,유카탄계 미니돼지,마이크로 돼지 등을 사용할 수도 있다. 최근에는 체형이 작을 뿐 아니라 특성이 분명한 근교계 미니돼지(NIH계)의 작출도 되고 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 유카탄계 미니돼지를 사용하였다
[PARK2 유전자 조작 또는 변형]
본 발명의 파킨슨 질환 돼지 모델은 Parkin(Park2) 유전자를 넉아웃하도록 형질전환 시켜 사용하는 것을 특징으로 한다.
Parkin(Park2)은 465개의 아미노산으로 구성된 단백질로서 유비퀴틴 단백질 연결효소3(ubiquitin-protein ligase 3)의 일종이다. 그 아미노 말단은 유비퀴틴과 유사하며, 카복시 말단은 2개의 ring finger 도메인을 지닌다.
상기 Parkin(Park2)을 암호화하는 각 핵산은 당업계에 공지된 PARK2를 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
또한 상기 Parkin(Park2)을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예컨대, 게놈으로부터 핵산을 증폭시키기 위한 PCR 증폭, 화학적 합성법 또는 cDNA 서열을 제조하는 기술 등이 있다.
또한 상기 핵산은 Parkin(Park2)의 각 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다.
상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1,2,3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 80％,보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 본 발명의 SNCA와 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.
이 때, 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 Parkin(Park2)를 암호화하는 아미노산 서열을 서열번호 1로 표시하였다.
공지의 임의의 방법을 이용하여 Parkin(Park2) 유전자를 넉아웃할 수 있고, 예를 들어, 공지의 유전자 가위를 이용할 수 있다. 예를 들어, ZFN(Zinc finger protein), TALEN(transcription activator-like effector protein), CRISPR/Cas system을 포함하는 RGEN(RNA-guided endonuclease) 등을 이용할 수 있다.
다른 구체예에서, Parkin(Park2) 유전자의 조작은 불활성화시키기 위해 세포 또는 배아에 적용될 수 있다.
일 실시예에서, 세포 또는 배아의 염색체 표적부위에 특이적으로 결합하여, 이중가닥 DNA 파괴를 일으켜서 유전자를 방해하여 생식세포 형성과정을 선택적으로 방해하는 제제를 포함하는 시험관내 세포 또는 배아이며, 상기 제제는 공지의 유전자 가위(표적화 엔도뉴클레아제) 및 재조합효소 융합 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
다른 구체예에서, Parkin(Park2) 유전자의 조작은
예를 들어, Parkin(Park2) 유전자의 표적화된 변화 또는 다른 원하는 폴리뉴클레오티드의 표적화된 변화를 비롯한 대상으로 하는 폴리뉴클레오티드의 표적화된 변화를 포함할 수 있다.
이러한 표적화된 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 대상으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분의 녹아웃, 대상으로 하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분의 녹인, 내인성 핵산 서열의 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 그 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 구체적인 실시 형태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 변화되어 표적화된 게놈 변형을 형성한다
예시적 예에서, 표적 서열은 유전자의 뉴클레오티드 서열에 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 상동성을 나타낸다.
본 발명의 Parkin(Park2) 유전자 조작은 유전자 발현 조절 과정을 고려하여 이루어질 수 있다.
구현예에서, 전사조절, RNA 가공 조절, RNA 수송 조절, RNA 분해 조절, 번역 조절 또는 단백질 변형 조절 단계에서 각 단계에 적합한 조작수단을 선택하여 이루어질 수 있다.
구현예에서, RNAi (RNA 간섭 or RNA silencing)을 이용하여, small RNA(sRNAs)가 mRNA를 방해하거나 안정성을 저하시키며, 경우에 따라서는 파괴하여 단백질 합성정보가 중간에서 전달되지 못하게 함으로써 유전정보의 발현을 제어할 수 있다. 예시적 예에서, 발현 생성물은 Parkin(Park2) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 표적 지역을 포함하며 Parkin(Park2) 유전자의 발현을 약화 또는 파괴하는 RNA 분자(예를들어, siRNA, shRNA, miRNA, dsRNA 등)이다.
구현예에서, DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자 내 핵산들 사이의 결합들(bonds)의 가수분해(절단(cleavage))을 촉매화할 수 있는 야생형 또는 변종(variant) 효소를 이용할 수 있다.
임의의 구체예로서, 메가뉴클레아제(meganuclease); 징크핑거(Zinc finger) 뉴클레아제;　TALE-뉴클레아제; RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN), 예를 들어, CRISPR/Cas9 (Cas9 단백질), CRISPR-Cpf1(Cpf1 단백질) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레아제를 이용하여 유전자를 조작하여 유전정보의 발현을 제어할 수 있다.
일 양태에서, Parkin(Park2) 유전자의 비 암호 또는 암호 영역의 일부 또는 전부를 타겟팅하여 유전자 조작하는 조성물 및 방법을 제공할 수 있다.
상기 조성물 및 방법은
구현예에서, 목적하는 Parkin(Park2) 불활성화를 위해, 이에 관여하는 Parkin(Park2) 유전자 핵산 서열 중 일부를 조작하거나 변형시킬 수 있다. 조작 결과로서, 넉다운(knock down), 넉아웃(knock out), 넉인(knock in) 형태를 모두 포함한다.
구현예에서, 프로모터 영역, 또는 전사 서열, 예를 들어 인트론 또는 엑손 서열을 타겟으로 할 수 있다. 암호 서열, 예를 들어 암호 영역, 초기 암호 영역은 발현의 변경 및 넉아웃을 위해 표적화될 수 있다.
구현예에서, 핵산 변형은 하나 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30bp, 1 내지 27bp, 1 내지 25bp, 1 내지 23bp, 1 내지 20bp, 1 내지 15bp, 1 내지 10bp, 1 내지 5bp, 1 내지 3bp, 또는 1bp의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 및/또는 삽입일 수 있다.
구현예에서, Parkin(Park2) 유전자 중 하나 이상 영역에서의 결실 또는 돌연변이를 포함하도록 표적화될 수 있다.
구현예에서, 유전자 넉다운은 원치않는 Parkin(Park2) 유전자의 전사 부위가 표적화될 수 있다.
임의의 구체예에서, 엑손 영역을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 엑손 6 영역을 표적화할 수 있다.
구현예에서, 프로모터, 인핸서, 인트론, 3'UTR, 및/또는 폴리아데닐화 신호의 비 암호 서열을 표적화함으로써 Parkin(Park2) 유전자의 발현 또는 활성을 변경하기 위해 사용될 수 있다.
상기 유전자 변형은 유전자의 전부 또는 일부 (예컨대, 하나 이상의 뉴클레오타이드)의 결실, 치환, 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입에 의한 유전자의 활성 조절, 예컨대, 불활성화를 의미하는 것일 수 있다. 상기 유전자 불활성화는 유전자의 발현 억제 또는 발현 감소 (downregulation) 또는 본래의 기능을 상실한 단백질을 코딩하도록 변형된 것을 의미한다. 또한 유전자 조절은 타겟 유전자의 하나 이상의 Exon을 둘러싸고 있는 양쪽 intron 부위를 동시에 타겟팅(targeting)함으로 인한 Exon 부위의 결실로 인해 얻어지는 단백질의 구조 변형, Dominant negative 형태의 단백질 발현, soluble 형태로 분비되는 경쟁적 저해제발현 등의 결과에 의한 유전자의 기능 변화를 의미하는 것일 수 있다
상기 유전자 변형은 유전자를 불활성화시킴으로써 이 유전자로부터 코딩되는 단백질이 본래의 기능을 갖는 단백질 형태로 발현되지 않도록 하는 것일 수 있다
일 예에서, 상기 유전자 변형은 표적화 엔도뉴클레아제를 포함하는 유전체 교정 시스템에 의하여 타겟된 유전자 내의 특정 부위의 단일가닥 또는 이중가닥 절단(cleavage)을 촉매화하여 타겟된 유전자를 불활성화시키는 것일 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제에 의하여 촉매되는 핵산 가닥 손상(breaks)은 상동(homologous) 재조합(recombination) 또는 비상동 말단 연결(nonhomologous end joining; NHEJ) 등의 메커니즘들을 통하여 수선될 수 있다. 이 경우, NHEJ 메커니즘이 일어나면, 절단 위치(cleavage site)에서 DNA 서열에 변화가 유발되고, 이에 의하여 유전자가 불활성화될 수 있다.
이 경우, NHEJ 메커니즘이 일어나면, 절단 위치(cleavage site)에서 DNA 서열에 변화가 유발되고, 이에 의하여 유전자가 불활성화될 수 있다. NHEJ을 통한 수선은 짧은 유전자 단편의 치환들, 삽입들 또는 결실을 야기하고, 해당 유전자 넉아웃(knockouts)의 유도에 사용될 수 있다.
상기 Parkin(Park2) 유전자의 변형은 다음 중 하나 이상에 의하여 유도된 것일 수 있다:
1) 변형 대상 유전자 (이하, '타겟 유전자')의 전부 또는 일부 결실, 예컨대, 타겟 유전자의 1bp 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 27개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오타이드의 결실,
2) 타겟 유전자의 1bp 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 27개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오타이드의 원래(야생형)와 상이한 뉴클레오타이드로의 치환, 및
3) 하나 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 7개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오타이드 (각각 독립적으로 A, T, C 및 G 중에 서 선택됨)의 타겟 유전자의 임의의 위치에의 삽입.
상기 타겟 유전자의 변형되는 일부 ('타겟 부위')는 상기 유전자 중의 1bp 이상, 3bp 이상, 5bp 이상, 7bp 이상, 10bp 이상, 12bp 이상, 15bp 이상, 17bp 이상, 20bp 이상, 예컨대, 1bp 내지 30bp, 3bp 내지 30bp, 5bp 내지 30bp, 7bp 내지 30bp, 10bp 내지 30bp, 12bp 내지 30bp, 15bp 내지 30bp, 17bp 내지 30bp, 20bp 내지 30bp, 1bp 내지 27bp, 3bp 내지 27bp, 5bp 내지 27bp, 7bp 내지 27bp, 10bp 내지 27bp, 12bp 내지 27bp, 15bp 내지 27bp, 17bp 내지 27bp, 20bp 내지 27bp, 1bp 내지 25bp, 3bp 내지 25bp, 5bp 내지 25bp, 7bp 내지 25bp, 10bp 내지 25bp, 12bp 내지 25bp, 15bp 내지 25bp, 17bp 내지 25bp, 20bp 내지 25bp, 1bp 내지 23bp, 3bp 내지 23bp, 5bp 내지 23bp, 7bp 내지 23bp, 10bp 내지 23bp, 12bp 내지 23bp, 15bp 내지 23bp, 17bp 내지 23bp, 20bp 내지 23bp, 1bp 내지 20bp, 3bp 내지 20bp, 5bp 내지 20bp, 7bp 내지 20bp, 10bp 내지 20bp, 12bp 내지 20bp, 15bp 내지 20bp, 17bp 내지 20bp, 21bp 내지 25bp, 18bp 내지 22bp, 또는 21bp 내지 23bp의 연속하는 염기서열 부위일 수 있다.
그러므로, 본 발명의 대표적인 구현예에서는,
Parkin(Park2) 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위를 타겟 서열 부위, 즉, 핵산 변형이 일어날 수 있는 부위를 유전적으로 변형 또는 조작함으로써, Parkin(Park2) 유전자의 기능을 감소 또는 제거한다.
상기 타겟 서열은 Parkin(Park2) 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 2 이상의 부위를 동시에 타겟으로 할 수 있다.
일 실시예에서는 1종 이상의 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머를 이용하여 Parkin(Park2) 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1이상의 부위를 타겟으로 할 수 있다. 이에 의해 Parkin(Park2) 유전자를 넉아웃 또는 넉다운할 수 있다.
일 실시예에서는 1종 이상의 가이드 RNA를 이용하여 Parkin(Park2) 유전자를 구성하는 핵산 서열 중 1 이상의 부위를 타겟으로 할 수 있다. 이에 의해 Parkin(Park2) 유전자를 넉아웃 또는 넉다운할 수 있다.
일 구체예에서, Parkin(Park2) 유전자의 레벨 및/또는 활성 저하는 Parkin(Park2) 유전자를 구성하는 핵산서열의 변형, 예를 들어, 비암호화 영역, 암호화 영역, 및/또는 인트론 등에서의 변형 등에 기인할 수 있다.
이러한 Parkin(Park2) 유전자 핵산서열 변형은 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 게놈으로의 치환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
Parkin(Park2) 유전자 핵산서열로의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입,
Parkin(Park2) 유전자 핵산서열로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실,
Parkin(Park2) 유전자 핵산서열에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환,
Parkin(Park2) 유전자 핵산서열 또는 이의 부분의 녹아웃,
Parkin(Park2) 유전자 핵산서열 또는 이의 부분의 녹인, 내인성 핵산 서열의 이종 핵산 서열로의 치환, 또는
그 조합을 포함한 Parkin(Park2) 유전자 핵산서열 변화를 포함할 수 있다.
따라서, 구체적인 실시 형태에서, Parkin(Park2) 유전자의 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 등을 파괴함으로써 저하되거나 제거될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 적어도 한 부위 이상에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 Parkin(Park2) 유전자 핵산서열에서 변화된다. 다양한 방법을 사용하여, 추가의 표적화된 변형을 일으킬 수 있다.
임의의 구체예에서, Parkin(Park2) 단백질의 레벨 및/또는 활성 저하는 Parkin(Park2) 유전자의 유전자 변형(즉, 조절 영역, 암호화 영역, 및/또는 인트론 등에서의 유전자 변형)에 기인할 수 있다.
이러한 유전자 변형은 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 게놈으로의 치환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이러한 유전자 변형은 예를 들어,
Parkin(Park2) 유전자로의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입,
Parkin(Park2) 유전자로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실,
Parkin(Park2) 유전자에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환,
Parkin(Park2) 유전자 또는 이의 부분의 녹아웃,
Parkin(Park2) 유전자 또는 이의 부분의 녹인, 내인성 핵산 서열의 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 그 조합을 포함한 Parkin(Park2) 유전자 변화를 포함할 수 있다.
따라서, 구체적인 실시 형태에서, Parkin(Park2) 폴리펩티드의 활성은 Parkin(Park2) 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 파괴함으로써 저하되거나 제거될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 Parkin(Park2) 유전자에서 변화된다. 다양한 방법을 사용하여, 추가의 표적화된 유전자 변형을 일으킬 수 있다.
[뉴클레아제 시스템]
본 발명의 구현예에서, Parkin(Park2) 유전자의 게놈을 변형시키기 위해 하기의 표적화 뉴클레아제 시스템 또는 이러한 시스템의 성분을 이용할 수 있다. 뉴클레아제 제제로 총칭힌다. 바람직한 예에서, TALEN(Transcription activator-like effector nuclease) 또는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN) 시스템을 이용할 수 있다.
아연 핑거 뉴클레아제 시스템
아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)는 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 융합시킴으로써 생성된 인공 제한효소이다. 아연 핑거 도메인은 원하는 DNA 서열들을 타겟팅하기 위해 조작될 수 있으며, 이것은 아연-핑거 뉴클레아제가 복합 게놈내 특별한 서열들을 타겟팅할 수 있게 한다. 내인성 DNA 수선 기계의 잇점을 취하여, 상기 시약들은 고등 유기체의 게놈을 변형시키기 위해 사용될 수 있다. ZFN은 유전자들을 불활성화시키는 방법에 사용될 수 있다.
아연 핑거 DNA-결합 도메인은 약 30개의 아미노산들을 가지며, 안정한 구조로 접힌다. 각 핑거는 DNA 기질내에서 1차적으로 삼중체에 결합한다. 중요한 위치에서의 아미노산 잔기들은 DNA 부위와의 서열-특이적 상호작용의 대부분에 기여한다. 이들 아미노산들은 필수 구조를 보존하기 위해 남은 아미노산들을 유지하면서 변화될 수 있다.
더 긴 DNA 서열들에 결합하는 것은 여러 도메인들을 동시에 결합시킴으로써 이루어진다. 비-특이적 FokI 분열 도메인(N), 전사활성인자 도메인(A), 전사 억제인자 도메인(R) 및 메틸라아제(M)와 같은 다른 작용기들은 ZFP에 융합되어, 각각 ZFN, 아연 핑거 전사 활성인자(ZFA), 아연 핑거 전사 억제인자(ZFR), 및 아연 핑거 메틸라아제(ZFM)를 형성할 수 있다.
유전자조작 동물을 생산하기 위해 아연 핑거 및 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하기 위한 물질 및 방법들은 예를 들면, 미국특허 제8,106,255호, 미국특허 제2012/0192298호, 미국특허 2011/0023159, 및 미국특허 제2011/0281306호에 개시되어 있다.
TALEN 시스템
"TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)"은 DNA결합 도메인(DNA-binding domain)과 DNA 절단 도메인(Nuclease domain, 엔도뉴클레아제 도메인)으로 구성된 단백질이다.
TALEN의 N말단(N-terminal)에 위치한 DNA 결합 도메인은 식물의 병원성 세균인 Xanthomonas spp.에서 발견한 Transcription activator-like effectors(TALEs)단백질을 활용할 수 있다.
TALE 단백질은 33~35개의 아미노산으로 구성된 모듈(module)이 반복적으로 있는 구조이며 1개의 모듈이 1개의 염기쌍을 인지한다. 모듈에 의해 인지되는 염기쌍은 모듈의 12번째와 13번째에 있는 아미노산의 종류에 의해 결정되며, 이 두 아미노산을 RVD(Repeat variable diresidues)라고 한다. TALE에 쓰이는 RVD단위는 20개이며, 각각 DNA 사슬의 큰홈(Major groove)에 있는 DNA 염기 하나에 결합하게 된다.
RVD(단일 철자 코드) RVD(3개 철자 코드) 뉴클레오티드(들):
NH Asn-His G
HD His-Asp C
NG Asn-Gly T
NI Asn-Ile A
NN Asn-Asn R(G, A)
NK Asn-Lys G
NS Asn-Ser N(A, C, G, T)
"RVD 서열"은, TAL 이펙터 결합 도메인 내에서의 RVD의 연속적인 서열로 이해되며, 이 경우 이 서열은 달리 명시되지 않는 한, N-C-방향으로, 즉 N-말단으로부터 C-말단까지로 명시되어 있다. 여기서, 당업자가 자명하게 알고 있는 사실은, 하나의 "RVD 서열"의 RVD들이 그 방향으로 직접 연속하지 않고, 심지어 이들이 직접 서로 공유 결합되어 있지 않고, 오히려 RVD들이 포함되어 있는 반복 단위("repeat")들이 직접 서로 결합되어 있음으로써, 결과적으로 RVD들이 각각 그 반복 단위들의 기본 구조의 아미노산에 의해서 분리된다.
TALEN의 C말단(C-terminal)에 위치한 DNA 절단 도메인은 FokI 제한효소(Restriction enzyme)의 nuclease 영역을 사용한다. FokI 제한효소의 경우 이중쇄절단을 위해 두 개의 FokI 제한효소가 같이 작용해야 한다. 따라서, TALEN은 작용하기 위해 왼쪽 TALEN과 오른쪽 TALEN이 동시에 필요하며, 이것에 의해 TALEN의 선택성(Specificity)은 극히 증가된다.
"TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머"는, 단 하나의 폴리펩티드 체인으로 이루어지는 TAL 이펙터 뉴클레아제를 의미한다. "TAL 이펙터 뉴클레아제 쌍" 또는 "TALEN 쌍"은 2개의 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머로 조성된 TALEN으로 이해된다. 모노머는, 하나의 DNA의 마주 놓여 있는 가닥에 결합하고 함께 하나의 지점에서 DNA의 분열을 야기하는 TALEN의 좌측 또는 우측 암을 나타낸다. 하나의 TALEN 쌍 내에서는 TALEN 모노머가 쌍으로 삽입되는 한편, 다시 말해 하나의 모노머가 하나의 표적 서열을 그 목적 가닥에 연결함으로써 이중 가닥 DNA 내부에서 가닥 파괴를 야기하는 한편, 그 TALEN 쌍의 다른 TALEN 모노머는 하나의 표적 서열을 그 목적 가닥에 대해 상보적인 반대 목적 가닥에 연결함으로써, 결과적으로 뉴클레아제 도메인들이 서로에 대해 정렬되고, "스페이서(spacer)"로서 지칭되는 표적 서열들 사이의 공동 DNA 영역에 놓이게 되며, 그곳에서 각각 단일 가닥 파괴를 야기한다.
TALEN 클로닝은 표적에 필요한 인위적인 단백질을 합성하고, 해당부위의 DNA 절단을 유도할 수 있기 때문에 genomic DNA 내의 프로모터, ORF, enhancer 등 어떤 부위라도 유전자 제거를 유도할 수 있다. TALEN은 DNA 염기 하나가 TALE의 RVD단위 하나에 일대일로 붙는 특징을 가지기 때문에 표적 염기서열에 맞게 RVD 단위를 배열하여 실험자가 원하는 TALEN을 쉽게 디자인할 수 있다. 또한 표적 염기서열을 정하는데 있어 티민으로 시작해야 한다는 것 외에는 특별한 조건이 없으므로 쉽고 다양한 표적에 사용될 수 있는 장점이 있다.
"표적 서열"은, TAL 이펙터 결합 도메인에 의해서 결합되는 하나의 뉴클레오티드서열, 일반적으로는 하나의 DNA 서열로 이해된다.
본 발명의 일 실시예에서도 이러한 TALEN 방법을 이용하여 Parkin(Park2) 유전자를 넉아웃시켰다.
예를 들어, 제1 및 제2 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머를 포함하는 TAL 이펙터 뉴클레아제 쌍을 이용하여 Park2 유전자의 특정 서열을 특이적으로 인식하여 절단할 수 있다.
각각의 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머는 타입 II 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 엔도뉴클레아제 도메인 및 복수의 반복 단위를 갖는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함하며, 이들 각각은 가변성 아미노산 쌍 RVD를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 제1 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머의 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 표적 서열 5-TGAGTGCCAGTCTCCAAACT-3(서열번호2)에 결합할 수 있고, 상기 제2 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머의 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 표적 서열 5-AGCAGTAAGTACTGGTCAAA-3(서열번호3)에 결합할 수 있다.
특정부위에 결합한 TALEN 은 Fok1 nuclease 활성이 결합 되어 있으며, 표적 부위 근처에서 DNA 절단을 유도할 수 있다. 표적 DNA부위에서 발생한 절단으로 인해 수복 기작이 작동되지만, NHEJ (nonhomologous end joining) 등과 같은 원래의 상태로 DNA 염기서열이 돌아올 수 없는 수복 기작이 작동하기 때문에 DNA의 돌연변이 등이 발생하게 된다. 구체적으로 상기 돌연변이는 치환, 결실, 삽입 및 이들의 조합에 의한 돌연변이일 수 있다.
상기 Park2 유전자 특정 서열을 인식하여 절단하는 활성을 가지는 TALEN 유전자를 암호화하는 각 핵산은 당업계에 공지된 Park2 유전자 특정 서열을 인식하여 절단하는 활성을 가지는 TALEN 유전자를 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
또한, 상기 TALEN 유전자를 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예컨대, 게놈으로부터 핵산을 증폭시키기 위한 PCR 증폭, 화학적 합성법 또는 cDNA 서열을 제조하는 기술 등이 있다.
또한, 상기 핵산은 TALEN 유전자의 각 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 80％,보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 park2유전자의 특정 서열을 인식하여 절단하는 활성을 가지는 폴리펩티드를 말한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 TALEN 유전자를 암호화하는 핵산은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 벡터 내에 삽입될 수 있다.
'작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 또한, 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 이들을 통틀어 'TALEN 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물' 이라고 표현할 수도 있다.
RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RGEN) 시스템
본 발명의 다른 양태에 따르면, Park2 유전자 넉아웃은 RGEN을 통해서도 이루어질 수 있다.
RGEN(RNA-guided engineered nuclease)의 대표적인 예는 CRISPR 관련 뉴클레아제(nuclease) Cas9 및 서열 특이적 가이드(guide) RNA(gRNA)를 비롯한 CRISPR 시스템이다.
CRISPR 관련 뉴클레아제 Cas9 및 서열 특이적 가이드 RNA(gRNA)를 비롯한 CRISPR 시스템의 성분은 하나 이상의 벡터, 예컨대, 플라스미드 상에 코딩된 상태로 세포 내로 도입될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템은 Cas 유전자의 발현 또는 활성 유도에 관여하는 전사물 및 다른 요소를 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은 타입 I, 타입 II 또는 타입 III 시스템일 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 핵산의 부위 특이적 절단을 위해 CRISPR 복합체(Cas 단백질과 복합체를 형성한 가이드RNA(gRNA)를 포함함)를 이용함으로써 CRISPR/Cas 시스템을 사용한다.
Cas 단백질
Cas 단백질은 일반적으로 적어도 하나의 RNA 인식 또는 결합 도메인을 포함한다. 이러한 도메인은 가이드 RNA(gRNA, 이하에 더욱 상세히 기술됨)와 상호작용할 수 있다.
뉴클레아제 도메인은 핵산 절단을 위한 촉매 활성을 갖는다. 절단은 핵산 분자의 공유 결합의 파괴를 포함한다. 절단은 평활 말단 또는 스태거된 말단을 생성할 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥으로 될 수 있다.
Cas 단백질의 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e(CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9(Csn1 또는 Csx12), Cas10, Casl0d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1(CasA), Cse2(CasB), Cse3(CasE), Cse4(CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1 및 Cu1966, 및 이들의 상동체 또는 변형된 버전(modified version)을 들 수 있다.
Cas 단백질은 타입 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 Cas9 단백질이거나, Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다.
Cas9 단백질은 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)로부터 유래될 수 있다. Cas9 패밀리의 추가의 예는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2014/131833에 기재되어 있다. 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)유래의 Cas9 단백질 또는 이의 유도체는 바람직한 효소이다.
Cpf1 단백질은 Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Lachnospiraceae bacterium (MC2017), Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Smiihella sp. (SC_KO8D17), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens 등의 미생물 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, 또는 Eubacterium eligens 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Cas 단백질은 야생형 단백질(즉, 천연에서 발생하는 것), 변형된 Cas 단백질(즉, Cas 단백질 변이체) 또는 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 단편일 수 있다. Cas 단백질은 또한 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 활성 변이체 또는 단편일 수 있다. 활성 변이체 또는 단편은 야생형 또는 변형된 Cas 단백질 또는 이의 부분에 대하여, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할수 있으며, 여기서 활성 변이체는 원하는 절단 부위에서 절단하는 능력을 보유하므로, 닉 유도 또는 이중 가닥절단 유도 활성을 보유한다. 닉 유도 또는 이중 가닥 절단 유도 활성의 측정법은 공지되어 있다.
Cas 단백질은 핵산 결합 친화성, 핵산 결합 특이성 및/또는 효소 활성을 증가시키거나 감소시키도록 변형될 수 있다. Cas 단백질은 또한 단백질의 다른 활성이나 특성, 예를 들어 안정성을 변화시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인을 변형, 결실 또는 불활성화시킬 수 있거나, Cas 단백질을 절단하여 단백질의 기능에 필수적이지 않은 도메인을 제거하거나 Cas 단백질의 활성을 최적화시킬 수 있다.
1개 또는 2개의 뉴클레아제 도메인이 결실되거나 돌연변이되어, 더 이상 기능적이지 않거나 뉴클레아제 활성 저하를 가져올 수 있다.
1개의 뉴클레아제 도메인이 결실되거나 돌연변이되는 경우, 생성된 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)은 닉카아제(nickase)로 지칭될 수 있으며, 이중 가닥 DNA 내의 CRISPR RNA 인식 서열에서 단일 가닥 절단을 생성할 수 있다.
2개의 뉴클레아제 도메인이 결실되거나 돌연변이되는 경우, 생성된 Cas 단백질(예를들어, Cas9)은 이중 가닥 DNA의 두 가닥을 절단하는 능력이 저하될 것이다. Cas9를 닉카아제로 전환시키는 돌연변이의 예로는 sp.Cas9의 RuvC 도메인에서의 D10A 또는 H939A 또는 H840A가 있을 수 있다.
Cas 단백질은 또한 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 절단 도메인, 후성적 변형 도메인, 전사활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인에 융합될 수 있다. 융합된 도메인 또는 이종 폴리 펩티드는 N 말단, C 말단, 또는 Cas 단백질 내부에 위치할 수 있다.
또한, Cas 단백질은 이종 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 이종 펩티드는 예를 들어, 핵을 표적화하기 위한 SV40 NLS와 같은 핵 국재화 시그널 (NLS), 미토콘드리아를 표적화하기 위한 미토콘드리아 국재화 시그널, ER 보류 시그널(retention signal) 등을 포함한다. 이러한 시그널은 N 말단, C 말단 또는 Cas 단백질 내의 어디에도 위치할 수 있다.
Cas 단백질은 또한 세포 투과성 도메인에 연결될 수 있다. 예를 들어, 세포 투과성 도메인은 HIV-1 TAT단백질, 인간 B형 간염 바이러스 유래의 TLM 세포 투과성 모티프, MPG, Pep-1, VP22, 단순 헤르페스 바이러스 유래의 세포 투과성 펩티드, 또는 폴리아르기닌 펩티드 서열로부터 유래될 수 있다.
Cas 단백질은 또한 추적 또는 정제를 용이하게 하기 위한 이종 폴리펩티드, 예를 들어 형광 단백질, 정제 태그 또는 에피토프 태그를 포함할 수 있다.
Cas 단백질은 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 gRNA와 복합체를 형성한 Cas 단백질과 같은 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 RNA(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA)) 또는 DNA와 같은, Cas 단백질을 암호화하는 핵산의 형태로 제공될 수 있다. 임의로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 특정 세포 또는 유기체에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있으며, 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 발현 구축물의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
가이드 RNA(gRNA)
"가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 Cas 단백질에 결합하고, 표적 DNA 내의 특정 위치의 Cas 단백질을 표적으로 하는 RNA 분자를 포함한다. 가이드 RNA는 2개의 세그먼트, 즉, "DNA 표적 세그먼트"와 "단백질 결합 세그먼트"를 포함할 수 있다. "세그먼트"는 RNA의 뉴클레오티드의 연속 스트레치와 같은, 분자의 세그먼트, 섹션 또는 영역을 포함한다. 일부 gRNA는 2개의 분리된 RNA 분자, 즉, "활성화(activator)-RNA"인 crRNA와 "표적화(targeter)-RNA"인 tracrRNA를 포함한다. 다른 gRNA는 "단일 분자 gRNA", "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로도 지칭되는 단일 RNA 분자(단일 RNA 폴리뉴클레오티드)이다.
crRNA와 대응하는 tracrRNA는 혼성화하여, gRNA를 형성한다. crRNA는 CRISPR RNA 인식 서열에 혼성화하는 단일 가닥 DNA 표적화 세그먼트를 제공한다.세포 내에서의 변형에 사용된다면, 주어진 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 완전 서열은 RNA 분자가 사용될 종류에 특이적이도록 설계될 수 있다.
주어진 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트(crRNA)는 표적 DNA의 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
gRNA의 DNA 표적화 세그먼트는 혼성화를 통해 서열 특이적으로 표적 DNA와 상호 작용한다(즉, 염기쌍 형성). 이와 같이, DNA 표적화 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 달라질 수 있으며, gRNA 및 표적 DNA가 상호 작용할 표적 DNA 내의 위치를 결정한다. 대상 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트는 표적 DNA 내의 원하는 서열에 혼성화되도록 변형될 수 있다.
DNA 표적화 세그먼트는 약 12개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 예를들어, DNA 표적화 세그먼트는 약 12개의 뉴클레오티드(nt) 내지 약 80개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 50개의nt, 약 12개의 nt 내지 약 40개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 30개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 25개의 nt, 약 12개의 nt 내지 약 20개의 nt, 또는 약 12개의 nt 내지 약 19개의 nt의 길이를 가질 수 있다.
tracrRNA는 임의의 형태(예를 들어, 전장 tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA) 및 다양한 길이로 될 수 있다.
표적 DNA 내의 DNA 표적화 서열과 CRISPR RNA 인식 서열 사이의 상보성 비율은 적어도 60%(예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)일 수 있다.
가이드 RNA는 추가의 바람직한 특징, 예를 들어, 변형되거나 조절된 안정성; 세포내 표적화; 형광 표지를 이용한 추적; 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 결합 부위 등을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다.
이러한 변형의 예로는 예를 들어, 5' 캡(예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡(m7G)); 3' 폴리아데닐화된 테일(즉, 3' 폴리(A) 테일); 리보스위치(riboswitch) 서열(예를 들어, 단백질 및/또는 단백질 복합체에 의한 조절된 안정성 및/또는 조절된 접근성을 고려함); 안정성 제어 서열; dsRNA 이중 나선 구조(즉, 헤어핀)를 형성하는 서열 등을 포함할 수 있다.
가이드 RNA는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 2개의 분자(분리된 crRNA 및 tracrRNA) 또는 1개의 분자(sgRNA)로서의 RNA 형태 및 임의로 Cas 단백질과의 복합체 형태로 제공될 수 있다. gRNA는 또한 RNA를 암호화하는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. gRNA를 암호화하는 DNA는 단일 RNA 분자(sgRNA) 또는 분리된 RNA 분자(예를 들어, 분리된 crRNA 및 tracrRNA)를 암호화할 수 있다.
gRNA를 암호화하는 DNA는 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있으며, 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, gRNA를 암호화하는 DNA는 발현 구축물의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 인간 U6 프로모터를 이용할 수 있다.
핵산의 절단
Cas 단백질은 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트가 결합할 표적 DNA에 존재하는 핵산 서열의 내부 또는 외부의 부위에서 핵산을 절단할 수 있다.
"절단 부위"는 Cas 단백질이 단일 가닥 절단 또는 이중 가닥 절단을 일으키는 핵산위치를 포함한다. 예를 들어, CRISPR 복합체 형성은 gRNA의 DNA 표적화 세그먼트가 결합될 표적 DNA 내에 존재하는 핵산 서열 또는 그 부근에(예를 들어, 상기 핵산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 이상의 염기쌍 내에) 한 가닥 또는 두 가닥의 절단을 일으킬 수 있다.
절단 부위는 핵산의 한 가닥에만 또는 두 가닥에 있을 수 있다. 절단 부위는 핵산의 두 가닥의 동일한 위치에 있을 수 있거나(평활 말단을 생성함), 각 가닥의 상이한 부위에 있을 수 있다(스태거된 말단을 생성함).
Cas9에 의한 표적 DNA의 부위 특이적 절단은 표적 DNA에서, (i) gRNA와 표적 DNA 사이의 염기쌍 형성 상보성과 (ii) PAM으로 지칭되는 짧은 모티프에 의해 결정되는 위치에서 발생할 수 있다.
PAM(Protospacer adjacent motif)은 CRISPR RNA 인식 서열에 플랭킹될 수 있다. 임의로, CRISPR RNA 인식 서열은 PAM이 플랭킹될 수 있다. 예를 들어, Cas9의 절단 부위는 PAM 서열의 상류 또는 하류에 약 1 내지 약 10개, 또는 약 2 내지 약 5개의 염기쌍(예를 들어, 3개의 염기쌍)으로 될 수 있다.
[유전자 조작용 조성물]
본 발명의 일 구현예에서, Parkin(Park2) 유전자의 유전적 조작 또는 변형용 조성물 및 이의 이용방법을 제공한다.
일 구체예에서, Parkin(Park2) 유전자의 유전적 조작 또는 변형용 조성물은 상기 TALEN(Transcription activator-like effector nuclease) 시스템의 구성성분을 포함할 수 있다.
예를 들어, 제1 및 제2 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머를 포함하는 TAL 이펙터 뉴클레아제 쌍을 이용하여 Park2 유전자의 특정 서열을 특이적으로 인식하여 절단할 수 있다.
각각의 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머는 타입 II 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 엔도뉴클레아제 도메인 및 복수의 반복 단위를 갖는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함하며, 이들 각각은 가변성 아미노산 쌍 RVD를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 제1 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머의 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 표적 서열 5-TGAGTGCCAGTCTCCAAACT-3(서열번호2)에 결합할 수 있고, 상기 제2 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머의 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 표적 서열 5-AGCAGTAAGTACTGGTCAAA-3(서열번호3)에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 TALEN 쌍을 형성하는 TALEN 모노머들은 또한 분리된 상태로 2개의 핵산 내에서 포함될 수도 있다. 제1 및 제2 TALEN 모노머를 구성하는 핵산은 각각 mRNA, 특히 바람직하게는 안정화된 mRNA일 수 있다. 경우에 따라서는, 제1 및 제2 TALEN 모노머 핵산 외에 또 다른 요소들을 포함할 수 있는데, 예를 들면 하나 또는 복수의 촉진제, 및 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 2개의 TALEN 암(우측 암 및 좌측 암)이 동시에 또는 별도로 하나의 세포 내부로 보내질 수 있다.
TALEN 쌍을 mRNA를 통해서 운반하는 것은 임상적인 적용을 위해 일련의 결정적인 장점들을 갖는다. DNA를 기본으로 하는 유전자 전달 매개자의 사용이 피해질 수 있으며, 이와 같은 상황은 제조 공정 및 실제 적용을 결정적으로 단순하게 한다. TALEN의 mRNA 매개된 발현은 다만 비교적 짧게만 이루어지는데, 그 이유는 mRNA가 표적 세포 내에서 신속하게 분해되기 때문이다. 그럼으로써, 오프 타깃 효과의 위험이 더욱 줄어든다. 더 나아가, 표적 세포는 다만 매우 짧은 시간 동안만 체외에서 배양되면 된다. 상응하는 공학 기술은 GMP 요구 조건에 쉽게 매칭될 수 있다. 바이러스성 매개자 또는 플라스미드 매개자와 달리, 유전자 전달 자체에 의한 부작용(예컨대 삽입 돌연변이 생성) 또는 원치 않는 매개자 삽입으로 인한 장기간 동안의 TALEN 발현에 의한 부작용(오프 타깃 효과, TALEN 특유의 면역 반응의 활성화)은 예상되지 않는다.
다른 구체예에서, Parkin(Park2) 유전자의 유전적 조작 또는 변형용 조성물은 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN) 시스템의 구성성분을 포함할 수 있다.
예를 들어, 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산 분자와 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-Guided Endonuclease; RGEN) 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 유전체 조작용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 발현 카세트 형태로 제공될 수 있다.
Park2 유전자 넉아웃용 재조합벡터
본 발명은 일 구현예에서, Parkin(Park2)유전자 넉아웃시키는 파킨슨 질환 동물모델 제작용, 가장 바람직하게는 파킨슨 질환 돼지모델 제작용 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 '벡터' 또는 '발현벡터'라 함은 구조유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 플라스미드벡터일 수 있다.
본 발명의 벡터는 세포 내에 도입하여 본 발명의 Park2 유전자를 넉아웃시키기 위한 수단으로서 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 발현벡터를 사용할 수 있으며, 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 벡터는 Park2 유전자 특정 서열을 인식하여 절단하는 활성을 가지는 유전자가위를 포함하고, 이 때, 상기 유전자가위로서, Zinc finger nuclease(ZFN),Transcription activator-like effector nuclease(TALEN; 탈렌), RNA-guided engineered nuclease (RGEN) 등을 이용할 수 있지만, 가장 바람직하게는, TALEN(Transcription activator-like effector nuclease) 또는 RGEN(RNA-guided engineered nuclease)을 이용할 수 있다.
또한, 상기 재조합 발현 백터는 유전자를 발현하는 당 분야의 프로모터를 사용할 수 있다.
'프로모터'는 전사 개시 및 속도가 조절되는 핵산 서열 영역인 조절 서열이다. 이들 프로모터는, RNA 폴리머라제 및 기타 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합하여 핵산 서열의 특이적인 전사를 개시할 수 있는 유전자 요소를 함유할 수 있다. '유효하게 배치된', '유효하게 결합된', '조절 하에' 및 '전사 조절 하에'란 용어는, 프로모터가 서열의 전사 개시 및 발현을 조절하는 핵산 서열과 관련하여 올바른 작용 위치 및/또는 배향으로 배치됨을 의미한다.
한편, 상기 Park2 유전자 넉아웃 벡터는 리포터(reporter)유전자를 포함할 수 있으며, 상기 리포터 유전자에는 리포터 시스템을 포함할 수 있다.
리포터 시스템에는 일 예로 대리 리포터가 있을 수 있으며, 대리 리포터는 유세포분리(Flow cytometry)용 대리 리포터, 자석분리(Magnetic seperation)용 대리 리포터, 항생제분리(Antibiotic selection)용 대리 리포터가 있다. 대리 리포터의 기본 구조는 CMV 프로모터를 시작으로 mRFP 유전자, 표적 염기서열, 종결 코돈(Stop codon)까지 공통 구성을 지닌다. 종결 코돈 뒤에는 대리 리포터 별로 eGFP 유전자, H-2kk 유전자, 하이그로마이신 내성(Hygromycin resistance) 유전자가 각각 삽입되어있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 선택 마커를 포함할 수 있으며, 상기 선택 마커에는 카나마이신 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자와 같은 항생제 저항성 유전자 및 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질과 같은 형광 단백질 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 벡터 내에는 단백질 분리 정제 또는 확인용 태그 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 태그 서열의 예로는 GFP, GST (Glutathione S-transferase)-tag, HA, His-tag, Myc-tag, T7-tag 등이 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 태그 서열이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 GFP을 사용하여 발현 유무 및 발현량을 확인하였다.
상기 Park2 유전자 넉아웃용 재조합 벡터는, 돼지 세포에서 Park2 유전자를 넉아웃시키는 돌연변이를 야기하여 파킨슨을 유발할 수 있다.
핵공여 세포로의 벡터 도입
본 발명의 일 구체예는, Parkin(Park2) 유전자의 유전적 조작 또는 변형용 조성물을 돼지의 세포에 도입하는 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAEDextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 형질전환 동물 제작을 위한 세포 내로 도입할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전적 조작 또는 변형을 위해, 예를 들어, 넉아웃, 유전자 불활성화, 또는 특정 유전자의 발현을 얻기 위해, 또는 다른 목적을 위해, 세포에 다양한 핵산들이 도입될 수 있다.
핵산은 예를 들면, cDNA, 게놈 DNA, 합성(예를 들면, 화학합성된) DNA 뿐만 아니라, 자연발생 및 화학변형 핵산들, 예를 들면 합성 염기 또는 교대 백본들을 포함하는 RNA 및 DNA 둘다 의미한다. 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다.
상기 핵산은 벡터에 포함될 수 있다.
벡터는 발현 벡터 또는 벡터 시스템을 의미할 수 있으며, 에피솜, 플라스미드, 또는 심지어 바이러스/파지 DNA 세그먼트와 같은, 게놈 또는 다른 타겟팅되는 DNA 서열로 DNA 삽입을 일으키는 데 필요한 성분들의 셋트이다.
동물에서 유전자 전달을 위해 사용되는 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 비-바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
많은 다른 종류의 벡터들이 알려져 있다. 예를 들면, 플라스미드 및 바이러스 벡터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터가 알려져 있다. 포유류 발현 플라스미드는 전형적으로, 복제기원, 적당한 프로모터, 및 선택적인 인핸서, 및 임의의 필수 리보솜 결합부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 수용체 부위, 전사종결서열, 및 5'플랭킹 비-전사서열을 가진다. 벡터들의 예들은: 플라스미드(벡터의 다른 타입의 담체일 수도 있음), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스(예를 들면, 변형된 HIV-1, SIV 또는 FIV), 레트로바이러스(예를 들면, ASV, ALV 또는 MoMLV), 및 트랜스포손(예를 들면, Sleeping Beauty, P-elements, Tol-2, Frog Prince, piggyBac)을 포함한다.
일 구체예에서, 표적 핵산서열은 프로모터와 같은 조절영역에 조작가능하게 결합될 수 있다
일 구체예에서, 추가의 조절영역들을 함께 도입할 수 있다. 폴리아세틸화 서열, 해독조절서열들(예를 들면, 내부 리보솜 유입 세그먼트, IRES), 인핸서, 유도성 요소들 또는 인트론들을 포함하며, 여기에 국한되지 않는다.
일 구체예에서, 신호 펩티드 또는 선택가능한 마커들을 인코딩하는 핵산 구조물들이 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 외인성 핵산은 폴리펩티드를 인코딩한다. "tag"를 인코딩하는 tag 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 핵산은 non-viral 벡터 전달 방식으로 전달될 수 있다.,
예를 들어, mRNA형태의 TAL 이펙터 뉴클레아제 모노머를 지질 나노 입자에 패키지하여 전달할 수 있다. 핵산을 전달함에 있어 가장 널리 알려진 양이온 물질에는 천연 폴리머(naturally-occurring polymer), 합성 폴리머(synthetic polymer) 그리고 지질(lipids)이 있다
일 구체예에서, 본 발명은 불활성화된 또는 제거된 Parkin(Park2) 유전자를 가진 돼지 세포를 제공할 수 있다.
예를 들어, Parkin(Park2) 넉아웃용 조성물을 포함하는 재조합 벡터를 핵 공여 세포로 도입하는 방법 및 상기 재조합 벡터가 도입된 세포에 관한 것이다.
예를 들어, Parkin(Park2) 넉아웃용 조성물을 포함하는 RNP 복합체를 핵 공여 세포로 도입하는 방법 및 상기 RNP 복합체가 도입된 세포에 관한 것이다.
일 구체예에서, 상기 세포는 돼지의 배아세포, 체세포 또는 줄기세포일 수 있다.
임의의 구체예에서, 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 또한, 다양한 기원 조직으로부터 유래된 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 자궁, 골수, 근육, 태반, 제대혈 또는 피부(상피) 등의 조직 유래 줄기세포를 사용할 수 있다. 비-인간 숙주 배아는 일반적으로 2-세포 단계, 4-세포 단계, 8-세포 단계, 16-세포 단계, 32-세포 단계, 64-세포 단계, 상실배, 또는 배반포를 포함하는 배아일 수 있다.
보다 바람직하게는, 태아 유래 세포 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있다. 가장 바람직하게는, 돼지의 태아 및 성체에서 분리한 섬유아세포를 이용한다. 이 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다.
핵 공여 세포로서 제공되는 상기 배아세포, 체세포 또는 줄기세포는 당업계에 공지되어 있는 통상적인 방법을 사용하여 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 Parkin(Park2) 유전자 결핍 질환 돼지 모델 제작용의, Parkin(Park2) 유전자를 넉아웃용 벡터로 형질전환된 핵 공여 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.
적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용 가능한 배지를 사용할 수 있다.
상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 일반적으로 배양에 이용되는 기본 배지로는 MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)이 있으며, 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지라면 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게는, α-MEM 배지(GIBCO), K-SFM 배지, DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), DMEM/F12 배지, PCM 배지, M199/F12(mixture)(GIBCO), 및 MSC 확장배지(Chemicon)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
이러한 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다.
당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 적합한 배지를 선택 또는 조합하여 공지의 방법으로 적절히 배양할 수 있음은 자명할 것이다. 또한, 이 분야의 통상의 지식에 기초하여 적합한 배양 환경, 시간, 온도 등의 조건을 조절하면서 배양할 수 있음은 자명하다.
[형질전환 동물]
본 발명은 일 구체예로서, 재조합 벡터가 도입된 핵 공여 세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 산자를 생산함으로써, Park2 유전자을 넉아웃 시킨 파킨슨 모델용 형질전환 돼지의 제조방법 및 이에 의해 제조된 파킨슨 질환 모델용 돼지에 관한 것이다.
임의의 구현예에서, Parkin(Park2) 단백질 발현이 불활성화된 돼지를 생산하기 위해, 적합한 조건하에서 배아를 임신시킬 수 있다.
예를 들어, 형질전환된 돼지의 체세포를 사용하여 상기의 체세포핵 이식법(SCNT)을 이용할 수 있다.
임의의 구체예에서, 본 발명은, Parkin(Park2) 유전자를 넉아웃시킨 형질전환 세포주를 이용하여 체세포 핵이식 방법(somatic cell nuclear transfer, SCNT)으로 본 발명의 파킨슨 질환 모델 복제동물을 생산한다.
일 구체예를 들어, 본 발명의 파킨슨 질환 모델용 돼지 생산방법은,
(a) 돼지의 조직으로부터 분리한 체세포 또는 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 핵 공여 세포 제조단계;
(b) Park2 표적화 뉴클레아제(유전자가위)를 상기 핵 공여 세포에 도입하는 단계;
(c) 돼지의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 탈핵 난자에 (b) 단계의 핵 공여 세포를 미세주입하고 융합시키는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 단계;및
(f) 상기 활성화된 난자를 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함할 수 있다.
각 단계에 관한 통상적 기술 내용은 당업계에 공지되어 있는 종래의 체세포 핵이식 기술을 이용한 복제 동물의 제조방법 등을 참조하여 이해할 수 있을 것이다.
일 구체예로서, Parkin(Park2) 유전자를 넉아웃시키는 조성물로 형질전환된 돼지 유래 체세포, 배아세포 또는 줄기세포의 핵을, 탈핵된 난자에 이식하여 형성된 돼지의 핵 이식란 제조방법 및 이에 의해 제조된 핵 이식란을 제공할 수 있다.
다른 구체예로서, 상기 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하여 산자를 생산하는 단계를 포함하는 Parkin(Park2) 유전자을 넉아웃 시킨 파킨슨 질환 모델용 형질전환 돼지의 제조방법 및 이에 의해 제조된 Park2(parkin) 유전자가 넉아웃 된 것을 특징으로 하는 Park2(parkin) 결핍 질환, 예를 들어 파킨슨 질환 모델용 돼지를 제공한다.
임의의 구체예에서, 본 발명은 유전자조작 동물의 생산방법을 포함하며,
상기 방법은 배아 또는 세포를 타겟팅 뉴클레아제(예를 들면, 메가뉴클레아제, 아연 핑거, TALEN, RGEN, 재조합효소 융합 분자들)를 인코딩하는 mRNA에 노출시키는 단계,
대리모내 세포를 클로닝하거나, 대리모내 배아들을 이식하는 단계를 포함하며, 상기 타겟팅 뉴클레아제는 배아 또는 세포내 표적 염색체 부위에 특이적으로 결합하여 세포 염색체에 변화를 일으키며, 대리모는 표적 염색체 부위에서 유전자조작된 동물을 임신시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에서의 Park2 넉아웃 된 형질전환 돼지의 유전자 발현 분석을 통해 뉴클레오티드의 손실, 삽입 또는 point 돌연변이가 일어난 것을 확인하였다.
상기의 Park2 유전자 넉아웃이 확인된 형질전환 돼지의 세포를 이용하여 재복제를 통해 모두 Park2 유전자가 넉아웃된 파킨슨질환 모델용 돼지를 생산한다.
재복제의 방법은 제한이 없으나, 예를 들어, 형질전환 된 돼지의 체세포를 사용하여 상기의 체세포핵 이식법(SCNT)을 이용할 수 있다.
파킨슨 돼지모델 용도
또한, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 파킨슨 질환 모델용 돼지의 임상적 상태 판단을 위한 UPDRS(Unified Parkinson's Disease Rating Scale) 활용방법을 제공한다.
UPDRS는 파킨슨 환자의 운동증상과 일상생활 수행능력을 점수로 표현하여 파킨슨병 환자의 증상을 시간경과 및 치료에 따른 악화와 호전을 점수로 표현하는 방법이다. UPDRS는 4개의 부분으로 나누어지는데, Part 1은 정신 및 기분에 대한 지표이며, Part 2는 일상생활 능력, Part 3는 파킨슨병의 운동증상, Part 4는 치료의 부작용을 평가하게 되어 있다. 파킨슨병의 주된 증상이 운동증상이므로 Part 3만 평가하여 기록하는 경우도 있고, 필요에 따라 Part 1-4 중 선택하여 사용하기도 한다.
본 발명의 파킨슨 질환 모델용 돼지에 대해서, 상기 UPDRS(Unified Parkinson's Disease Rating Scale) 방법을 적절히 변경하여 적용함으로써 파킨슨 질환 동물 모델로서의 유용성을 확인할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 운동성을 평가하였다.
이처럼, 본 발명의 파킨슨 질환 모델용 돼지는 인간 파킨슨 환자의 경우와 매우 유사한 병리 기작을 나타내는 바, 인간 파킨슨 치료 연구를 위한 동물 모델로서 매우 유용하다.
본 발명에 따른 Park2 유전자 넉아웃 된 파킨슨 모델용 형질전환 돼지는 교배를 통해 산자 생산이 가능하며, 후대로 상기 외부 유전자의 전달이 가능하다.
그러므로, 본 발명의 Park2 유전자가 넉아웃 된 것을 특징으로 하는 돼지는 용이한 재현 가능성을 장점으로 가지고 있는 바, 파킨슨 질환 동물 모델로서 매우 유용하다.
즉, 본 발명의 파킨슨 질환 모델 미니돼지를 이용하여 파킨슨 유발여부를 확인 할 수 있으며, 신경독성물질 투여 외 다른 방법으로 개발된 파킨슨 질환모델의 발병을 비교할 수 있고, 나아가 파킨슨 질병 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발 등 다양한 활용이 가능할 것이다.
그러므로, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제작한 파킨슨 질환 모델용 돼지의 다양한 용도를 포함한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 동물모델은 파킨슨 질환을 치료하거나 예방하는데 필요한 연구에, 예를 들어 피험 약제를 스크리닝하는 방법으로 사용될 수 있다.
일 구체예로서, 본 발명의 상기 스크리닝 방법은
1) 파킨슨 질환 모델 돼지에 파킨슨 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계;
2) 후보물질 투여 후, 상기 돼지의 조직을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물,세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 화합물은 신규 화합물이어도 되고, 널리 알려진 화합물이어도 된다. 이러한 후보 물질은 염을 형성하고 있어도 된다.
상기와 같은 후보 물질을 투여하는 방법으로는 예를 들면, 경구투여, 정맥주사, 피하투여, 피내투여 또는 복강 투여 등 중에서 대상 동물의 증상, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다. 또한, 후보 물질의 투여량은 투여 방법 또는 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다.
이처럼, 본 발명은 난치병이라 여겨지는 파킨슨 질병에 있어서, 생리학적으로 사람과 가장 유사한 동물인 돼지를 이용한 파킨슨 질환 동물모델 및 이의 다양한 용도를 제공함으로써 파킨슨 질환 치료기술 개발 및 실용화에 매우 유용할 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
재료 및 방법
1. 일차 세포 배양(Primary cell culture)
성인 암컷 Yucatan 신장(16 개월령) 을 실험실에 옮겨 실험 세포를 구축하였다. 신장 전체를 PBS에서 3회 세척하고 다음의 절차에 따라 실험을 수행하였다. 세척한 신장을 트립신으로 작은 조각으로 잘게 절단하고, 상기 트립신-처리된 조직들을 30분 동안 37℃에서 배양하였다.
잘 해리된 조직들을 2분 동안 1500rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 펠렛들을 PBS로 재현탁한 후에 2분 동안 1500rpm에서 원심분리하였다. 이러한 절차들을 2회 반복하였고, 마지막으로, 상청액을 버린 후 펠렛을 15% FBS (Gibco), 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S) (Gibco), 1% 비필수 아미노산(NEAA) (Gibco) 및 100 mmol/l β-메르캅토에탄올(ME)로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(Gibco, Carlsbad, California, USA)에 여러 번 뒤집으면서 재현탁하였다.
상기 배지에 재현탁된 세포들을 상온(약 25℃)에서 5분 동안 두고, 현탁물을 세포 배양 디쉬에 옮긴 후 배양 배지를 매 2-3일마다 교체하면서 약 10일 동안 배양하였다. 이러한 일차 세포들을 배양하여 확장시킨 후 사용을 위해 -196℃에서 냉동시켰다. 상기 세포 배양물을 15% FBS, 1% P/S, 1% NEAA 및 100 mmol/l β-ME와 함께 DMEM에서 유지시켰다.
2. Parkin KO(knock out)세포주 확립
돼지 일차 세포(Pig primary cell)에 유전자가위 도입을 최적화하기 위한 조건 test를 mismatch-senstive nuclease assay를 이용하여 검증하였다.
확립된 조건을 이용하여 PD 관련 유전자 중 pig PARK2에 대해 활성이 검증된 TALEN과 reporter system을 이용하여 여러 종류의 pig primary cell line에서 넉아웃 된 공여세포를 생산하였다.
본 발명의 PARK2 유전자의 아미노산 서열의 일 예는 다음과 같다.
(서열번호 1)
MIVFVRFNSSHGFPVEVDSDTSIFQLKEVVAKRQGVPADQLRVIFAGKELRNDWTVQNCDLDQQSIVHIV
QRPWRKGQEMNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDLSSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGR
SIYNSFYVYCKGPCQRVQPGKLRVQCSTCRQATLTLTQGPSCWDDVLIPNRMSGECQSPHCPGTSAEFFF
KCGAHPTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQCNSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHD
PQLGYSLPCVGTGDTVVLRGALGGFRRGVAGCPNSLIKELHHFRILGEEQYNRYQQYGAEECVLQMGGVL
CPRPGCGAGLLPEPDQRKVTCEGGNGLGCGYGQRRTK
TALEN 뉴클레아제가 인식하는 PARK2유전자의 특정 서열(서열번호 2 및 3)은 다음과 같다.
(서열번호2)
5-TGAGTGCCAGTCTCCAAACT-3
(서열번호3)
5-AGCAGTAAGTACTGGTCAAA-3
3. 형질전환 된 Parkin KO 복제 미니돼지 생산
TALEN 또는 CRISPR/Cas9을 이용하여 parkin 유전자를 넉아웃한 세포 (GFP를 발현하는 세포)를 선별하였고, 그 세포를 체세포 핵이식에 공여세포로 사용하여 산자를 생산하였다.
이하 좀 더 구체적으로 설명한다.
3-1. 체세포핵 이식을 위한 수핵 난자의 준비
도축장으로부터 돼지 난소를 28-31℃의 생리식염수에 담아 실험실로 운반하여, 직경이 3-6mm가 되는 난포로부터 18-게이지 바늘이 장착된 10ml 주사기를 이용하여 난구세포-난자복합체 (cumulus-oocyte complex, COC)를 회수하였다. 난구세포로 난자의 투명대 외벽이 여러 겹으로 쌓여있고, 난자의 세포질이 균일한 상태의 COC를 선택하여 체외성숙배양액에서 5% 이산화탄소의 39℃ 배양기에서 40시간 동안 체외성숙을 유도하였다.
TALP(Tyrode's albumin lactate pyruvate) 배지 내에서 0.1% (v/v) 히알루로니다아제(hyaluronidase)에 침지한 후, 미세 유리피펫을 이용, 반복 피펫팅 (pipetting)하여, 체외 성숙된 난자로부터 난구세포를 제거하였다. 그 후, 각각의 난자들을 홀딩 마이크로피펫으로 고정하고, 5 ug/mL 비즈벤지마이드 (bisbenzimide) (Hoechst 33342)와 5 ug/mL 사이토칼라신 B가 보충된 TALP 배지 내에서 미세조작기 (Nikon-Narishige, Tokyo, Japan)로 탈핵하였다.
비즈벤지마이드로 염색된 제1극체 및 중기-II 염색체를 흡입 피펫 (aspiration pipette)을 사용하여 제거하고, 탈핵된 난자는 PZM(Porcine zygote media)-5에 두고 계속하여 체세포 핵이식에 사용하였다.
3-2. 체세포핵이식을 위한 공여세포의 준비
돼지의 park2 유전자 넉아웃 되는 세포를 이용하여, 형질전환복제수정란을 생산하는 과정은 다음과 같이 수행하였다.
체세포 핵 이식을 위하여 park2 유전자 넉아웃 세포들을 해동하고, 100% 컨플루언시가 될 때까지 배양한 후 약 3분 동안 트립신 처리하여 단일 층으로부터 분리시켜 하나의 세포로 회복시켜 핵 공여세포로 이용하였다. 리포터 유전자인 GFP가 발현되는 세포가 park2 유전자 넉아웃 되는 세포임을 이용하여 복제수정란을 작성하였다.
3-3. 체세포 핵이식기법을 이용한 PD 복제수정란 생산
앞서 준비되어진 탈핵 난자의 위란강 (perivitelline) 공간으로 단일의 GFP가 발현되는 공여세포를 주입하고, 상기 결합체 (couplets)를 0.26 M 만니톨, 0.1 mM MgSO4, 0.5 mM HEPES를 포함하는 융합 배지에 침전시켜, 바늘 형의 전극을 사용하여 융합시켰다.
단일 세포-난자 결합체를 미세조작기 (Nikon-Narishige, Tokyo, Japan)에 부착되어 있는 2개의 마주보는 전극 사이에 놓고, 난자 세포질체 및 핵 공여세포 사이의 접촉면을 전극과 평행하게 놓은 후, 전기-세포 융합 기구(Electro-Cell Fusion SNCAaratus)(NEPA GENE Co., Chiba, Japan)로 전기 자극을 주었다. 1.2 Kv/cm의 직류전압으로 한번의 30 ㎲ 지속시간으로 가하고, 전기자극 30분 후에 핵 공여세포와 난자 세포질체의 융합을 실체 현미경 하에서 관찰하였다.
융합된 수정란만을 선별하여 0.26 M 만니톨, 0.5 mM HEPES, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgSO4가 첨가된 활성 배지가 담긴 챔버에 넣고 전극을 연결한 후, BTX electro-cell Manipulator 2001 기계를 이용하여 1.5 kv/cm의 직류전압으로 한 번의 60 ㎲의 지속시간으로 전류를 가하여 활성화시켰다. 미네랄 오일 (mineral oil)로 도포된 20 uL의 PZM-5 미세소적 (microdrops) 내에서 수정란을 5-6개씩 배양하였다.
3-4. 체세포 핵이식으로 만들어진 배아의 대리모에 이식 방법
발정이 동기화된 대리모를 농장으로부터 공급받는다. 대리모에 1 mg/kg의 케타민과 0.5 mg/kg의 자일라진 합제를 돼지의 이정맥으로 투여하여 전 마취를 유도하였다. 합제를 투여하고 잠시 기다린 후 쓰러져 의식이 없는 돼지를 수술대로 옮긴 후, 아이소플루란을 이용하여 전신마취를 유지하도록 하였다.
수술부위를 비누를 이용하여 깨끗하게 씻어준 다음, 면도기를 이용하여 수술부위의 털을 깔끔하게 제거해주고, 포비돈, 알코올, 포비돈, 알코올, 포비돈 순으로 수술부위를 소독해준 다음, 완전한 멸균상태를 유지한 채 수술을 진행하였다.
먼저 하복부의 중간 부위를 정중 절개한 후 자궁을 견인하고, 난관과 난소의 상태를 눈으로 확인한 후, 형질전환 복제수정란을 난관 내로 이식하였다. 탐캣 카테터(Tomcat catheter)를 이용하여 난관에 직접 날카로운 바늘로 구멍을 낸 후 형질전환 복제수정란이 로딩되어 있는 카테터를 넣은 후 난자를 대리모에 이식하였다. 이렇게 형질전환 복제수정란의 이식이 끝난 돼지는 자궁을 환납하고 열상을 봉합하였다.
봉합이 완료된 대리모는 환부를 베타딘으로 소독해준 다음, 수술 후 대기실로 옮긴 후 수술 후 케어를 하였다. 또한 수술 후 발생할 수 있는 여러 가지 감염에 대비하여 광범위 항생제를 투여하였다. 마취가 완전히 깨고, 기력을 회복하면 본래 거주하던 임신사로 옮겨져 개별 관리에 들어갔고, 분만예정일에 제왕절개를 통해서 복제돼지를 분만하였다.
4. 재복제를 통한 Parkin KO 복제 미니돼지 생산
parkin 유전자 넉아웃이 확인된 개체의 세포를 이용하여 재복제를 통해서 parkin 유전자 넉아웃 개체를 복제하였다. 이를 통하면 100% 넉아웃 된 개체를 생산할 수 있다는 장점이 있다.
먼저 homo 넉아웃으로 확인된 PDM5 세포를 이용해서 체세포 핵이식을 진행하였고, PDM9을 생산하였다.
PDM5와 마찬가지로 PDM9도 구개열을 가지고 있었고, 이로 인해 sacrifice를 결정하였다.
다음으로 hetero KO으로 확인된 PDM3 세포를 이용해서 체세포 핵이식을 진행하였고, PDM10과 PDM11을 생산하여 건강하게 자라는 것을 확인하였다.
5. Parkin KO 복제 미니돼지 유전자 발현 분석
태어난 모든 개체에 대해서 sequencing을 진행하였다.
6. 복제미니돼지의 행동, 영상학적 분석
6-1. 영상학적 분석
park2 유전자 넉아웃 복제미니돼지의 뇌영상 자료를 확보하기 위해 다음과 같은 검사를 수행하였다.
뇌 PET 영상의 연구를 위해 HRRT(high resolution research tomography)-PET(Siemens Medical Systems and CTI, Inc)를 이용하여 뇌 18F-FDG PET 영상을 촬영하였다. 전신 마취 전에[F-18 FDG (500 uCi/100g of body weight)를 정맥주사하고, 30분 뒤에 뇌 18F-FDG PET 영상 촬영은 기관지 삽관을 통한 이소플루란 흡입마취를 이용하여 시행하였다. PD와 관련된 뇌 영역 부분에서의 기능 평가 그리고 뇌의 형태를 비교분석하여 질병의 정도를 판정하였다.
정상 미니돼지를 대조군으로 사용하여 위의 동일한 뇌영상 자료를 확보하였다.
6-2. 행동분석
복제 돼지에 대한 스코어링 분석표는 UPDRS(United Parkinson's disease rating scale)에 기초하였다.
상기 UPDRS는 PD 환자의 평가를 위해 가장 넓게 임상적 스케일이 인정된다. 복제 돼지의 운동 점수(Motor scores)는 3회에 걸쳐 평가하였다. (6개월째부터 1년 4월째까지)
실시예 1: 형질전환된 공여세포 및 배반포의 돌연변이 확인
1-1. 배반포의 돌연변이 효율 간접적 분석
돼지세포를 이용하여 형질전환 공여세포 생산 후 48h이후에 세포 중 GFP positive한 세포를 이용하여 체세포 핵이식을 진행하였다. T7E1으로 돌연변이 효율을 검증하고 in vitro culture하여 만든 배반포를 전달받아 돌연변이 효율을 간접적으로 측정하여 분석하였다. (도 1)
도 1을 보면 배반포는 park2 TALEN이 발현하여 reporter 유전자가 발현됨을 볼 수 있다. 따라서, 이로 인해 park2 유전자의 돌연변이가 발생하였고, 본 발명의 공여세포의 돌연변이 발생 효율이 있음을 어느 정도 파악할 수 있었다.
1-2. 생산된 공여 세포의 효율 검증
생산된 공여 세포의 효율 검증을 위해 genomic DNA 및 in vitro condition에서 생산된 배반포를 전달 받아서 mismatch-sensitive nuclease assay를 이용하여 분석한 결과는 도 2에 도시하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 총 44개의 배반포를 분석하여 8개의 positive를 확인하여 20%의 효율로 돌연변이가 관찰됨을 알 수 있었다.
이는, 생산된 공여 세포 중 삽입 된 park2 TALEN이 발현하여 park2 유전자의 돌연변이가 일어날 가능성이 약 20%정도 됨을 의미한다.
실시예 2: Parkin KO 복제 미니돼지의 생산 및 특징
총 8마리의 산자를 생산하였고, 각각 PDM1 내지 8이라고 명명하였다.
출생 후 sequencing을 이용한 분석을 통해 확인해본 결과, 8마리 중에서 parkin 유전자의 넉아웃이 확인된 산자는 총 3마리였다 (Hetero 넉아웃; PDM3, homo 넉아웃; PDM5 and PDM6). 나머지 5마리는 wild type인 것으로 확인되었다.
이를 통해 parkin 유전자의 확인된 넉아웃 효율은 37.5%였다.
현재까지 PD 넉아웃 개체는 체세포핵이식을 통해서 총 11마리의 산자를 생산하였다 (표 1).
PDM1부터 PDM8까지의 8마리는 TALEN을 세포에 transfection하여서 KO을 유도한 세포를 공여세포로 사용하여 체세포핵이식을 진행하여서 태어난 산자들이고, PDM9부터 PDM11까지의 3마리는 태어난 산자의 체세포를 이용하여 재복제를 진행하여 태어난 산자들이다.
PDM1부터 PDM8까지의 산자들 중 parkin이 KO된 산자는 PDM3 (hetero KO), PDM5 (homo KO) 그리고 PDM6 (homo KO)의 총 3마리였다. 이를 토대로 KO의 효율을 추정해보면, 37.5%인 것을 확인할 수 있었다. 나머지 5마리는 wild type으로 확인되었다.
Figure 112017502067439-pat00001
KO이 확인된 개체들이 존재했기 때문에 추가적으로 진행되는 체세포핵이식은 KO이 확인된 개체에서 유래한 체세포를 이용하여 진행하였다.
먼저, homo KO이 확인된 개체인 PDM5를 이용한 산자생산에서 PDM9가 태어났다. 염기서열 확인결과 PDM5와 정확하게 일치하는 homo KO인 것을 확인하였으나, PDM5와 마찬가지로 구개열을 가지고 있었다.
도 3은 구개열을 가지고 태어난 PDM5의 구개열(cleft), 간(liver), 뇌(brain), 심장(heart), 폐(lung), 신장(kidney)및 비장(spleen) 사진이다.
부검상에서 구개열 이외에 특별한 이상을 발견하지 못하였다.
다음으로 재복제는 hetero KO인 PDM3 을 대상으로 하였고, PDM3의 세포를 이용해서 PDM10과 PDM11의 두 마리 산자가 태어났다. PDM10의 경우 혀가 기형이 발견되었지만, PDM11의 경우 건강하였고(도 4), 두 마리 모두 900g 이상으로 건강하게 태어났다.
본 발명에 의한 파킨슨 질환 돼지모델은 parkin 유전자의 넉아웃 효율은 37.5%로 8마리 중 3마리로 효율이 높은 편이었고, 이를 재복제에 의한 경우 parkin 유전자의 넉아웃된 개체(PDM3, 5)를 이용하기 때문에 parkin 유전자의 넉아웃 100% 효율을 가진 파킨슨 질환 돼지를 생산할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: Parkin KO 복제 미니돼지 유전자 발현 분석
태어난 모든 개체에 대해서 sequencing을 진행한 결과는 도 5에 기재하였다. KO을 유발하기 전 target site의 wild type sequence는 도 5의 가장 위에 제시된 sequence이다.
PDM1, PDM2, PDM4, PMD7 그리고 PDM8의 경우 이 wild type과 sequence가 완벽하게 일치하는 것을 확인하였다.
반면에 TALEN transfection을 직접적으로 한 세포를 이용해서 태어난 산자의 sequencing 결과에서, PDM3의 경우 한 쪽 allelle에 7bp가 deletion이 일어난 hetero KO (KO이 일어난 반대쪽 allelle에는 A가 G로 변한 point mutation이 있음)이었고, PDM5의 경우 4bp deletion/7bp insertion이 일어난 homo KO, PDM6의 경우 78bp deletion/14bp deletion이 일어난 homo KO 복제 미니 돼지인 것을 확인하였다.
이렇게 KO이 확인된 체세포 중 일부를 이용하여 재복제를 진행하였고, PDM5를 재복제하여 생산한 PDM9의 경우 PDM5와 sequencing 결과가 정확하게 일치하는 것을 확인하였고, PDM3를 재복제하여 생산한 PDM10과 PDM11의 경우 PDM3와 sequencing 결과가 정확하게 일치하는 것을 확인하였다.
또한, PDM3의 경우 KO이 일어나지 않은 반대쪽 allelle에 A가 G로 바뀐 point mutation이 발생했는데, 재복재 된 PDM10과 PDM11도 동일한 point mutation이 존재하는 것도 확인하였다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 돼지모델 11마리 중 6마리에서 Park2 유전자가 넉아웃된 것을 유전자 서열 분석을 통해 알 수 있었고, 그 결과 Park2 유전자가 넉아웃된 파킨슨 질환 동물모델을 효과적으로 제조할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4: Parkin KO 복제 미니돼지 PDM11의 행동, 영상학적 분석
4-1. 행동분석 증상
2015년 3월 태어난 PARK2 KO 유전자 개체로 2013년 9월을 시작으로 2016년 7월까지, 총 3회 행동관찰을 진행한 결과 행동 및 운동양상의 지속적인 감소소견이 관찰되었다. (평가 개별점수; 7, 6, 6)
따라서, 이 결과로 본 발명에 의해 제조된 Park2 넉아웃 된 돼지모델은 파킨슨 질환과 유사한 행동분석 증상을 보임을 확인할 수 있었다.
4-2. 영상분석 증상
Parkin KO 미니돼지 1년령 PDM-11의 경우 정상 미니돼지와 비교하여 FDG PET 영상에서 양 측 occipital cortex 대사가 감소함이 관찰되었다.
또한, FP-CIT PET 영상에서 양 측 putamen 섭취가 현저하게 감소 되었음을 관찰하였으며, Cortical atrophy와 ventricle size가 증가가 관찰되었다.
따라서, 본 발명에 의해 제조된 Park2 넉아웃 된 돼지모델은 파킨슨 질환과 유사한 영상분석 증상을 보임을 확인할 수 있었다.
실시예 5: Parkin KO 미니돼지(PDM-11)와 정상 미니돼지의 생후 1년째의 뇌의 PET, CT 촬영의 영상학적 평가 및 분석
5-1 실험방법
Parkin KO 미니돼지(PDM-11)와 정상 미니돼지의 생후 1년째의 뇌의 PET, CT 촬영의 영상학적 평가 및 분석
서울대학교병원 암병원 핵의학과의 PET과 CT 영상기기를 이용하여 Parkin KO 미니돼지와 정상 미니돼지의 brain PET과 brain CT를 행하여 Parkin KO 미니돼지와 정상 미니돼지의 뇌영상 자료를 확보하였다. 뇌 PET 영상은 1) dopamine transporter인 Fluoro-CIT ([18F] FP-CIT) radioisotope 정맥주사제의 정맥주입 후 약 2시간 후에 촬영하였고, 2) glucose uptake metabolism을 평가하는 glucose analog인 FDG (Fluorodeoxyglucose (18F), [18F]FDG, 18F-FDG) radioisotope 정맥주사제의 정맥주입 후 약 30분 후에 촬영하였다.
<PET과 CT 영상촬영에 사용한 Parkin KO 복제 미니돼지의 종류>
FP-CIT (PDM-11): Yucatan, ♂/ 28주령
FP-CIT (정상돼지): Yucatan, ♂/ 30 주령
FDG (PDM-11): Yucatan, ♂/ 28주령
FDG (정상돼지): Yucatan, ♂/ 30주령
Parkin KO 미니돼지(PDM-11)와 정상 미니돼지의 생후 1년째의 뇌의 MRI, CT 촬영의 영상학적 평가 및 분석
일산 헬릭스동물병원의 CT와 1.5T MRI 영상 기기를 이용하여 Parkin KO 미니돼지와 정상 미니돼지의 brain CT와 brain MRI를 시행하여 Parkin KO 미니돼지와 정상 미니돼지의 뇌영상 자료를 확보하였다.
<MRI와 CT 영상촬영에 사용한 Parkin KO 미니돼지의 종류>
PDM-11 : Yucatan, ♂/ 28주령
정상돼지 : Yucatan, ♂/ 30주령
5-2 실험 결과
Parkin KO 미니돼지(PDM-11)와 정상 미니돼지의 생후 1년째의 뇌의 PET, CT, MRI 촬영의 영상학적 평가 및 분석을 실시하였다.
그 결과, Parkin KO 미니돼지의 18F-FDG의 PET과 CT에 관한 영상 소견으로, 정상 미니돼지와 비교하여 FDG PET 영상에서 양 측 occipital cortex 대사가 감소함이 관찰되었다(도 6).
그리고, Parkin KO 미니돼지의 FP-CIT의 PET과 CT에 관한 영상 소견으로, 정상 미니돼지와 비교하여 FP-CIT PET 영상에서 양 측 putamen 섭취가 현저하게 감소되었음을 관찰하였다(도 7).
또한, Parkin KO 미니돼지(PDM-11)와 정상 미니돼지의 생후 1년째의 뇌의 MRI, CT 촬영의 영상학적 평가 및 분석한 결과, Parkin KO 미니돼지의 CT에 관한 영상 소견으로, 정상 미니돼지와 비교하여 Parkin KO 미니돼지에서 유의한 이상 소견이 없었다(도 8).
그리고, parkin KO 미니돼지의 MRI에 관한 영상 소견으로, 정상 미니돼지와 비교하여 Parkin KO 미니돼지에서 Cortical atrophy와 ventricle size가 증가됨이 관찰되었다.
즉, Parkin KO 미니돼지 1년령 PDM-11의 경우 정상 미니돼지와 비교하여 FDG PET 영상에서 양측 occipital cortex 대사가 감소함이 관찰되었고 FP-CIT PET 영상에서 양 측 putamen 섭취가 현저하게 감소되었음을 관찰하였고 Cortical atrophy와 ventricle size가 증가됨이 관찰되었다(도 9).
실시예 6 : PARK2 KO PD 모델 미니돼지 행동 평가
PARK2 KO PD 모델 미니돼지의 행동학적 특성을 평가하기 위하여, 다음과 같이 실험을 수행하였다.
2015년 3월 6일 분만한 PARK2 KO 미니돼지(male) 1두가 2015년 11월 5일 차폐시설로 입식되었다. 입식당시 체중은 약 35 kg이었다. 입식 및 뇌 영상 촬영 후 2016년 1월부터 총 3회에 걸쳐 행동관찰을 실시하였으며, 관찰 항목의 결과는 점수화(scoring)를 통해 도출하였다.
PDM-11 개체와 성별이 동일한 개체 및 일령이 유사한 정상인 미니돼지를 선정하여, 정상 미니돼지의 행동을 0점으로 부여한 후 비교하여 PDM-11 개체의 행동을 관찰하였으며, 관찰 후 각 항목에 대한 점수는 다음 표와 같다.
Figure 112017502067439-pat00002
PDM-11 개체의 경우는 다른 항목에 있어서는 정상인 개체와 큰 차이가 없었지만, 원통에서 발을 밖으로 빼는 실험과 피부에 스티커를 붙였을 때의 반응은 크게 차이를 보여 반응을 거의 보이지 않았다. 이는 발을 밖으로 빼내려고 노력하고 몸을 흔들어 스티커를 제거하려는 정상 개체들과는 큰 차이를 보이는 항목이다.
또한, 행동관찰 항목 이외에 정상인 개체와 차이가 확인되는 모습은 다른 미니돼지들의 분변을 섭취하고, 평상시에도 혀가 밖으로 노출된 모습이 관찰되었다(도 10).
이처럼, 본 발명에 의해 제조된 Park2 넉아웃 된 돼지모델은 파킨슨 질환 모델로서 매유 유용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> SNU R&DB Foundation <120> PARK2 knockout porcine Models for Parkinson disease and the Use thereof <130> CP17-251 <150> KR 10-2016-0127412 <151> 2016-10-04 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 387 <212> PRT <213> sus scrofa <400> 1 Met Ile Val Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu 1 5 10 15 Val Asp Ser Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys 20 25 30 Arg Gln Gly Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Glu Leu Arg Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln 50 55 60 Ser Ile Val His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met 65 70 75 80 Asn Ala Thr Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu 85 90 95 Arg Glu Pro Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu 100 105 110 Pro Gly Asp Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg 115 120 125 Lys Asp Ser Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn 130 135 140 Ser Phe Tyr Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly 145 150 155 160 Lys Leu Arg Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu 165 170 175 Thr Gln Gly Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met 180 185 190 Ser Gly Glu Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe 195 200 205 Phe Phe Lys Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val 210 215 220 Ala Leu His Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr 225 230 235 240 Cys Thr Asp Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg 245 250 255 His Val Ile Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu 260 265 270 Asn Asp Arg Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro 275 280 285 Cys Val Gly Thr Gly Asp Thr Val Val Leu Arg Gly Ala Leu Gly Gly 290 295 300 Phe Arg Arg Gly Val Ala Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu 305 310 315 320 His His Phe Arg Ile Leu Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln 325 330 335 Tyr Gly Ala Glu Glu Cys Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro 340 345 350 Arg Pro Gly Cys Gly Ala Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys 355 360 365 Val Thr Cys Glu Gly Gly Asn Gly Leu Gly Cys Gly Tyr Gly Gln Arg 370 375 380 Arg Thr Lys 385 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> sus scrofa <400> 2 tgagtgccag tctccaaact 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> sus scrofa <400> 3 agcagtaagt actggtcaaa 20

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  16. Park2 유전자가 넉아웃 된 돼지로서,
    상기 Park2 유전자가 넉아웃 된 돼지의 뇌조직은 α-synuclein, Parkin, Pink1, DJ-1 또는 LRRK2를 암호화하는(encoding) 파킨슨 병 연관 유전자 (Parkinson's disease-associated gene) 중 오직 상기 Parkin을 암호화하는 Park2 유전자만 넉아웃 된 세포를 하나 이상 포함하고,
    - 이 때, 상기 Park2 유전자만 넉아웃 된 세포는 제1 Park2 유전자를 포함하는 제1 염색체 및 제2 Park2 유전자를 포함하는 제2 염색체를 포함하고,
    이 때, 상기 제1 염색체와 상기 제2 염색체는 상동염색체이고,
    이 때, 상기 제1 Park2 유전자만 야생형(wild type)의 Park2 유전자와 다른 핵산 서열을 가짐으로써 넉아웃되고, 및 상기 제2 Park2 유전자는 내재된(endogenous) 유전자임-; 및
    상기 Park2 유전자가 넉아웃 된 돼지의 뇌조직 내부에 형성되어 있는 뇌실(ventricle)의 크기는 야생형 돼지의 뇌조직 내부에 형성되어 있는 뇌실의 크기보다 더 큰 것을 특징으로 하는,
    Park2 유전자가 넉아웃된 돼지.
  17. Park2 유전자가 넉아웃 된 돼지로서,
    상기 Park2 유전자가 넉아웃 된 돼지의 뇌조직은 α-synuclein, Parkin, Pink1, DJ-1 또는 LRRK2를 암호화하는(encoding) 파킨슨 병 연관 유전자 (Parkinson's disease-associated gene) 중 오직 상기 Parkin을 암호화하는 Park2 유전자만 넉아웃 된 세포를 하나 이상 포함하고,
    - 이 때, 상기 Park2 유전자만 넉아웃 된 세포는 제1 Park2 유전자를 포함하는 제1 염색체 및 제2 Park2 유전자를 포함하는 제2 염색체를 포함하고,
    이 때, 상기 제1 염색체와 상기 제2 염색체는 상동염색체이고,
    이 때, 상기 제1 Park2 유전자만 야생형(wild type)의 Park2 유전자와 다른 핵산 서열을 가짐으로써 넉아웃되고, 및 상기 제2 Park2 유전자는 내재된(endogenous) 유전자임-; 및
    상기 Park2 유전자가 넉아웃된 돼지의 후두피질의 대사는 야생형 돼지의 후두피질의 대사보다 감소된 것을 특징으로 하는,
    Park2 유전자가 넉아웃된 돼지.
  18. Park2 유전자가 넉아웃 된 돼지로서,
    상기 Park2 유전자가 넉아웃 된 돼지의 뇌조직은 α-synuclein, Parkin, Pink1, DJ-1 또는 LRRK2를 암호화하는(encoding) 파킨슨 병 연관 유전자 (Parkinson's disease-associated gene) 중 오직 상기 Parkin을 암호화하는 Park2 유전자만 넉아웃 된 세포를 하나 이상 포함하고,
    - 이 때, 상기 Park2 유전자만 넉아웃 된 세포는 제1 Park2 유전자를 포함하는 제1 염색체 및 제2 Park2 유전자를 포함하는 제2 염색체를 포함하고,
    이 때, 상기 제1 염색체와 상기 제2 염색체는 상동염색체이고,
    이 때, 상기 제1 Park2 유전자만 야생형(wild type)의 Park2 유전자와 다른 핵산 서열을 가짐으로써 넉아웃되고, 및 상기 제2 Park2 유전자는 내재된(endogenous) 유전자임-; 및
    상기 Park2 유전자가 넉아웃된 돼지의 조가비핵에서 도파민(dopamine)의 섭취량은 야생형 돼지의 조가비핵에서 도파민의 섭취량보다 현저하게 감소된 것을 특징으로 하는,
    Park2 유전자가 넉아웃된 돼지.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 Park2 유전자가 넉아웃 된 돼지의 뇌조직 내부에 형성되어 있는 뇌실의 크기는 야생형 돼지의 뇌조직 내부에 형성되어 있는 뇌실의 크기의 1.2배 이상인 것을 특징으로 하는,
    Park2 유전자가 넉아웃된 돼지.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 Park2 유전자가 넉아웃 된 돼지의 조가비핵에서 도파민의 섭취량은 야생형 돼지의 조가비핵에서 도파민의 섭취량의 0.5배 이하인 것을 특징으로 하는,
    Park2 유전자가 넉아웃된 돼지.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 Park2 유전자는 상기 야생형의 Park2 유전자에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 결실, 치환, 삽입 또는 역위된 것과 같은 서열을 포함하는,
    Park2 유전자가 넉아웃된 돼지.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 제1 Park2 유전자는 서열번호 1을 포함하는,
    Park2 유전자가 넉아웃된 돼지.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 제1 Park2 유전자는 상기 야생형의 Park2 유전자의 엑손 6 부위에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 치환, 삽입 또는 역위된 것과 같은 서열을 포함함으로써 넉아웃 된 것을 특징으로 하는,
    Park2 유전자가 넉아웃된 돼지.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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