KR20190053649A - 복합 파킨슨 유전자를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 파킨슨병 질환 모델 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 복합 파킨슨 유전자를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 파킨슨병 질환 모델에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 인간 유래의 PINK1(G309D) 돌연변이 유전자 및 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T)) 돌연변이 유전자를 포함하는 파킨슨병 질환모델 제작용 벡터, 상기 벡터를 도입한 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC1330BP), 상기 세포주를 체세포 복제기법을 이용하여 형질전환된 파킨슨병 질환모델에 관한 것이다.
Description
본 발명은 복합 파킨슨 유전자를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 파킨슨병 질환 모델에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 인간 유래의 PINK1(G309D) 돌연변이 유전자 및 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T)) 돌연변이 유전자를 포함하는 파킨슨병 질환모델 제작용 벡터, 상기 벡터를 도입한 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC1330BP), 상기 세포주를 체세포 복제기법을 이용하여 형질전환한 파킨슨병 질환모델에 관한 것이다.
파킨슨병(Parkinson`s disease)은 신경계 퇴행성 질환 중의 한 종류로서, 몸이 떨리는 증상(진전, tremor), 근육이 뻣뻣하게 굳어지는 증상(강직, rigidity), 전반적인 동작이 느려지는 운동 완서 증상(서동, bradykinesia)이 대표적 증상이다. 대부분의 파킨슨병은 한쪽 팔, 다리로부터 떨리는 증상이 나타난 후, 느려지고 뻣뻣한 증상이 생기고, 서서히 반대 측 팔다리로 진행된다.
파킨슨병 환자는 사후 부검 시 85% 이상의 환자에서 뇌 흑색질(Substantia nigra)의 미토콘드리아 호흡복합체 I의 활성이 감소됨을 나타낸다. 파킨슨병의 환경적 원인 인자인 로테논(rotenone), 패러쿠왓(paraquat)이나 MPTP는 모두 세포내 소기관인 미토콘드리아를 표적으로 하여 신경세포의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.
미토콘드리아는 세포내 활성산소(Reactive Oxygen Species, ROS) 제거 효소가 세포질에 비해 부족하고 핵 DNA와 달리 히스톤(histone) 단백질이 결여된 naked 상태이기 때문에 다른 세포소기관에 비하여 활성산소에 의해 쉽게 손상 받을 수 있다. 또한 세포 내에서 발생하는 90% 이상의 ROS는 미토콘드리아에서 생성되기 때문에 미토콘드리아가 손상 받게 되면 세포내 활성 산소종이 더욱 증가하게 되어 세포 사멸이 유도된다.
이에 로테논, 패러쿠왓, MPTP 등이나 활성산소종을 유발하는 6-OHDA (6-hydroxydopamine)를 기저핵 부위에 직접 주사하거나 혹은 전신으로 투여하는 방법에 의해 마우스 모델을 제조하는 방법이 있다. 그러나, 이러한 방법은 도파민성 신경세포 이외의 다른 부위나 조직에 독성을 일으키며 재현성이 나빠 반복실험을 수행하는 데 문제가 있다.
인간의 난치질환 연구를 위해서는 난치질환을 지닌 모델동물이 필요하고, 이러한 모델동물로서 실험동물은 난치 질환에 대한 기전규명, 치료법 개발, 신약개발, 진단기술 개발 및 관련 의료기기 개발에까지 활용되고 있다.
인체 파킨슨병 모방형 모델로서, 1) 원하는 시기와 연령에 맞추어 파킨슨병이 발생하는 예측 가능하고, 2) 여러 원인들의 복합적인 작용에 의한 파킨슨병 질병발생을 정확히 이해할 수 있으며, 3) 인체 파킨슨병의 진행 경과와 병리학적 기전이 일치하여 파킨슨 병의 치료제 개발 및 질병 치료에 응용할 수 있는 동물 모델이 절실히 요구되고 있다.
파킨슨병 연구를 위한 실험모델은 초파리모델에서부터 마우스, 레트 모델에 이르기까지 다양하게 존재하고 있으나 인간 파킨슨 질환과 유사한 증상 및 병리 소견을 보여주는 동물 모델이 없다.
퇴행성 신경질환은 다양한 원인에 의하여 일어나기 때문에, 단일 유전자를 이용한 동물모델이 인간 파킨슨 질환과 많이 다른 원인으로 알려지고 있다. 인간과 비슷한 영장류 파킨슨 질환 동물 모델을 생산하는 것이 가장 좋으나, 가격과 시설 면에서 매우 제한적인 문제점이 있어, 영장류를 대체 할 수 있는 중소동물 중 개를 이용한 질환 동물 생산이 매우 중요하게 되었다.
본 발명의 배경기술로는 한국공개특허 제10-2015-0145201(2015.12.29.)이 있으며, 상기 특허에는 알츠하이머 질환 모델용 형질전환 돼지 및 이의 용도에 관하여 개시되어 있다.
이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 예의 노력한 결과, 인간 유래 파킨슨 돌연변이 유전자인 PINK1 및 α-synuclein를 함께 도입한 세포주를 개발하기에 이르렀다.
따라서 본 발명은 파킨슨병 질환모델 제작용 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 파킨슨병 질환 동물모델 제작용 벡터를 도입하여, 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 복합 유전자 세포주를 체세포 복제 기법을 이용하여, 형질전환된 파킨슨병 질환모델을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 복제란을 이용한 파킨슨 질환 모델의 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, PINK1(G309D) 돌연변이 유전자 및 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T)) 돌연변이 유전자를 포함하는 파킨슨병 질환모델 제작용 벡터가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 PINK1(G309D) 돌연변이는 PINK1 유전자 중 309 위치에서 Gly이 Asp로 치환되고, 상기 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T)) 돌연변이는 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T)) 유전자 중 53 위치에서 Ala이 Thr으로 치환된 돌연변이인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 질환모델 제작용 벡터가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 파킨슨 질환모델 제작용 벡터가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 파킨슨병 질환 동물모델은 개인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 질환모델 제작용 벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 파킨슨병 질환 동물모델 제작용 벡터로 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC13310BP)가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 세포주(기탁번호: KCTC13310BP)는 포유류의 섬유아세포에서 유래한 것을 특징으로 하는 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC13310BP)가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포유류는 개인 것을 특징으로 하는, 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC13310BP)가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 PINK1(G309D) 유전자 및 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T))는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC13310BP)가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 복합 유전자 세포주를 체세포 복제 기법을 이용하여, 형질전환된 파킨슨병 질환모델이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, PINK1(G309D)과 α-synuclein(A53T) 돌연변이 유전자를 벡터에 도입하는 단계; 상기 벡터를 이용하여, 포유류의 세포를 형질전환시키는 단계; 및 형질전환된 세포를 탈핵시킨 수정란에 도입하는 핵치환 단계를 포함하는 복제란의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, electrode를 이용하는 퓨전방법에서 35~55V의 퓨전전압으로 핵과 세포질을 융합하는 단계를 포함하는 복제란의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 55% 이상의 퓨전율을 나타내는 핵치환 단계를 포함하는 복제란의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 복제란을 대리모에 이식하는 단계를 포함하는 파킨슨 질환 모델의 생산방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 파킨슨 질환 모델의 생산방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포유류는 개인 것을 특징으로 하는 파킨슨 질환 모델의 생산방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 생산방법에 따라 생산된 파킨슨 질환 모델을 이용한 파킨슨병 예방제 또는 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명은 2개의 파킨슨 관련 인간 유전자를 돌연변이화하여, 인간 파킨슨 질환과 유사한 증상 및 병리 소견을 보여줄 수 있는 복합 유전자를 이용한 동물 모델을 제공할 수 있다.
본 발명은 인간 복합 파킨슨 유전자 탑재 개 세포주 개발 기술 성공으로 타 퇴행성 신경질환 모델 개발로 확장 및 신약치료 기술 효능 평가 기초 자료를 제공할 수 있다.
나아가, 본 발명의 파킨슨병 질환모델은, 파킨슨 병 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발 등에 다양하게 활용될 수 있으므로, 파킨슨병 질환모델로서 매우 유용할 것이다.
도 1은 개 체세포의 특성을 분석하기 위하여, 섬유아세포 특이 마커로 RT-PCR을 진행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 인간 PINK1 파킨슨 유전자와 개 파킨슨 유전자 종간 유사도를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 인간 α-synuclein 파킨슨 유전자와 개 파킨슨 유전자 종간 유사도를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 인간 복합 파킨슨 유전자를 탑재한 레트로바이러스 벡터를 나타낸 모식도이다.
도 5는 인간 복합 유전자 탑재 세포의 염색체 검사(Karyotyping) 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 복합 유전자가 탑재된 개 체세포(cFF2,PS)에서 인간 복합 파킨슨 유전자의 발현 유무를 분석하기 위하여, RT-PCR 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 복합 유전자가 탑재된 개 체세포(cFF2,PS)에서 인간 복합 파킨슨 단백질의 발현 유무를 분석하기 위하여, 면역형광염색법 결과를 나타낸 도면이다.
도 8 a 및 도 8b는 각각 염색체에 삽입된 파킨슨 복합 유전자(copy)의 수를 분석하기 위하여 리얼타임 PCR 결과를 나타낸 도면 및 파킨슨 복합 유전자(copy)의 수를 측정한 그래프이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 의한 파킨슨 질환모델 개의 유전자 도입 여부를 검정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 의한 파킨슨 질환모델 개의 친자감별 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의하여 생산된 파킨슨 질환모델 개의 성장한 사진이다.
도 2는 인간 PINK1 파킨슨 유전자와 개 파킨슨 유전자 종간 유사도를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 인간 α-synuclein 파킨슨 유전자와 개 파킨슨 유전자 종간 유사도를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 인간 복합 파킨슨 유전자를 탑재한 레트로바이러스 벡터를 나타낸 모식도이다.
도 5는 인간 복합 유전자 탑재 세포의 염색체 검사(Karyotyping) 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 복합 유전자가 탑재된 개 체세포(cFF2,PS)에서 인간 복합 파킨슨 유전자의 발현 유무를 분석하기 위하여, RT-PCR 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 복합 유전자가 탑재된 개 체세포(cFF2,PS)에서 인간 복합 파킨슨 단백질의 발현 유무를 분석하기 위하여, 면역형광염색법 결과를 나타낸 도면이다.
도 8 a 및 도 8b는 각각 염색체에 삽입된 파킨슨 복합 유전자(copy)의 수를 분석하기 위하여 리얼타임 PCR 결과를 나타낸 도면 및 파킨슨 복합 유전자(copy)의 수를 측정한 그래프이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 의한 파킨슨 질환모델 개의 유전자 도입 여부를 검정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 의한 파킨슨 질환모델 개의 친자감별 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의하여 생산된 파킨슨 질환모델 개의 성장한 사진이다.
본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 뿐만 아니라, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 것이다. 일반적으로, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질과 핵산 화학, 그리고 혼성화와 관련되어 사용되는 명명법과 이와 관련된 기술들은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 것이며, 또한 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 사용되고 있는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, PINK1(G309D) 돌연변이 유전자 및 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T)) 돌연변이 유전자를 포함하는 파킨슨병 질환모델 제작용 벡터가 제공된다.
상기 PINK1(PTEN-induced putative kinase 1) 유전자는 잠정적인 세린 쓰레오닌 키나아제로 파킨슨 환자의 8-15% 정도에서 변이가 발견된다. PINK1 유전자가 DJ-1과 상호작용하며, 미토콘드리아의 기능장애와 관련된다는 보고가 있다. 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T))은 뇌세포 사이에 신경전달을 돕는 단백질로 퇴행성 뇌질환인 파킨슨병을 일으키는 주요 원인이다.
본원발명에서는 그중에서도, PINK1과 α-synuclein 유전자에서 인간과 개 유전자 유사도를 조사한 결과, PINK1은 86%(도 1), α-synuclein은 94%(도 2)로 높은 유전자 유사도를 보여주었다. 이와 같이, 인간과 개 사이의 PINK1과 α-synuclein 유전자에서 유전자 유사도는 매우 높게 나타나, PINK1과 α-synuclein 유전자를 복합 채택하였다. 따라서 본 발명에 의한 파킨슨 질환 개를 이용하여 영장류를 대체할 수 있는 질환 모델을 제공할 수 있고, 행동을 통해 파킨슨 질환의 유발을 확인할 수 있어 보다 신뢰성 있는 파킨슨 질환 동물 모델을 개발하고 이를 활용하고자 하였다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 PINK1(G309D) 돌연변이는 PINK1 유전자 중 309 위치에서 Gly이 Asp로 치환되고, 상기 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T)) 돌연변이는 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T)) 유전자 중 53 위치에서 Ala이 Thr으로 치환된 돌연변이인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 질환모델 제작용 벡터가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 파킨슨 질환모델 제작용 벡터가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 파킨슨병 질환 동물모델은 개인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 질환모델 제작용 벡터가 제공된다.
본 발명의 '벡터' 또는 '발현벡터'라 함은 구조유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 본원발명에 속하는 기술분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 바이러스 벡터로는, 이에 제한되지는 않으나, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 있다. 특히, 레트로바이러스를 이용하는 방법이 바람직하다. 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 제작된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 파킨슨병 질환 동물모델 제작용 벡터로 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC13310BP)가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 세포주(기탁번호: KCTC13310BP)는 포유류의 섬유아세포에서 유래한 것을 특징으로 하는 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC13310BP)가 제공된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 태아 유래 세포 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있다. 가장 바람직하게는, 개의 태아 및 성체에서 분리한 섬유아세포를 이용한다. 이 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포유류는 개인 것을 특징으로 하는, 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC13310BP)가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 PINK1(G309D) 유전자 및 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T))는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC13310BP)가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 복합 유전자 세포주를 체세포 복제 기법을 이용하여, 형질전환된 파킨슨병 질환모델이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, PINK1(G309D)과 α-synuclein(A53T) 돌연변이 유전자를 벡터에 도입하는 단계; 상기 벡터를 이용하여, 포유류의 세포를 형질전환시키는 단계; 및 형질전환된 세포를 탈핵시킨 수정란에 도입하는 핵치환 단계를 포함하는 복제란의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따른 벡터를 본원발명에 속하는 기술분야에 공지된 방법으로 세포 내에 도입할 수 있다.
예를 들어, 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAEDextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 형질전환 동물 제작을 위한 세포 내로 도입할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 파킨슨병 질환모델 제작용인, 핵 공여 세포는 본원발명에 속하는 기술분야에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.
적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용가능한 배지를 사용할 수 있다.
상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 일반적으로 배양에 이용되는 기본 배지로는 MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)이 있으며, 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지라면 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게는, α-MEM 배지(GIBCO), K-SFM 배지, DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), DMEM/F12 배지, PCM 배지, M199/F12(mixture)(GIBCO), 및 MSC 확장배지(Chemicon)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
이러한 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다.
본원발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 다양한 조직 기원 유래 줄기세포에 가장 적합한 배지를 선택 또는 조합하여 공지의 방법으로 적절히 배양할 수 있음은 자명할 것이다.
또한, 이 분야의 통상의 지식에 기초하여 적합한 배양 환경, 시간, 온도 등의 조건을 조절하면서 배양할 수 있음은 자명하다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, electrode를 이용하는 퓨전방법에서 35~55V의 퓨전전압으로 핵과 세포질을 융합하는 단계를 포함하는 복제란의 제조방법이 제공된다. 이에 한정되는 것은 아니나, 퓨전전압이 35V 미만일 때는 퓨전 퓨전율(성공된 난자/퓨전시도된 난자)이 낮을 수 있고, 퓨전전압이 55V 초과일 때는 퓨전율(성공된 난자/퓨전시도된 난자)이 오히려 더 낮아질 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 55% 이상인, 바람직하게는 60%이상인, 더 바람직하게는 65% 이상인, 퓨전율을 나타내는 핵치환 단계를 포함하는 복제란의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 복제란을 대리모에 이식하는 단계를 포함하는 파킨슨 질환 모델의 생산방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 파킨슨 질환 모델의 생산방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 포유류는 개인 것을 특징으로 하는 파킨슨 질환 모델의 생산방법이 제공된다.
본 발명에서 “질환 모델 동물”이란 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환 모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환 모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어, "동물" 또는 "실험동물"은 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다. 이런 동물들은 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류(예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 소,양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위), 영장류(예를 들어, 침팬지, 원숭이, 붉은털원숭이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 생산방법에 따라 생산된 파킨슨 질환 모델을 이용한 파킨슨병 예방제 또는 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 난치병이라 여겨지는 파킨슨병에 있어서, 개를 이용한 파킨슨병 동물 모델 및 이의 다양한 용도를 제공함으로써 파킨슨 병 치료기술 개발 및 실용화에 매우 유용할 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 비글 cFF2 세포 분리
비글견 암, 수 35일령 태아를 분리하고 태아의 머리, 사지, 내장 및 혈액을 제거하고, 나머지 부분을 모아 PBS로 세정한 후, 20ml 0.1% trypsin/ 0.04% EDTA 용액에 넣고 10분간 반응 및 분쇄하고 배양액에서 3회 세척하여 세포 분리하였다. 분리한 비글 섬유아세포는 DMEM에 10% 소태아 혈청을 첨가한 배양액으로 배양하였다.
실시예 2: 개 체세포 특성 분석
체세포 복제견에 이용되는 체세포주 특성을 분석하기 위하여 섬유아세포 특이 마커로 RT-PCR을 수행하였다. cFF2 세포는 Mmp13과 Sox5 유전자를 제외한 모든 섬유아세포 마커를 발현하였다(도 1).
실시예 3: 인간과 개 증식유도 유전자와 복합 파킨슨 유전자 유사도 확인
대부분의 유전자들은 종간 변이가 그리 많지 않으나, 유전자 차이가 심하다면 인간 유전자를 개에 적용하기 힘들기 때문에 파킨슨 유전자에서 인간과 개 유전자 유사도를 조사하였다. PINK1은 86% (도 2), α-Synuclein은 94% (도 3)로 높은 유전자 유사도를 보이고 있다.
인간 파킨슨 유전자 중 PINK1은 309번째 아미노산이 글라이신에서 아스파테이트로 돌연변이된 유전자를 사용하였고 α-Synuclein은 53번째 아미노산이 알라닌에서 트레오닌으로 돌연변이된 유전자를 사용하였다.
실시예 4: 인간 복합 파킨슨 유전자 탑재 벡터 제작
형질전환 개를 만들기 위해 PINK1(G309D)와 α-synuclein(A53T) 유전자를 가진 레트로 레트로바이러스를 구축하였다. pQC 랜티바이러스 벡터를 이용하였는데 이 벡터는 CMV 프로모터에 의해 조절되며, long terminal repeat(LTR), virus packaging signal (ψ+), puromycin 저항 유전자를 포함하고 있다. 이 벡터와 PCR을 이용하여 사람의 PINK1(G309D)와 α-synuclein(A53T) 유전자를 PCR로 증폭시킨 후 각각 제한효소인 KpnI과 MluI으로 잘라 클로닝하였다 (도 4 참조). 형질전환 개 생산을 위해 PINK1(G309D)와 α-synuclein(A53T) 유전자가 클로닝된 레트로바이러스 벡터를 293T에 형질시킨 후 레트로바이러스를 생산하였다.
실시예 5: 인간 복합 파킨슨 돌연변이 유전자 도입 세포주 개발
제작한 인간 복합 파킨슨 유전자 존재 레트로바이러스를 293T 세포에 도입하여 복합 파킨슨 유전자 탑재 바이러스를 생산한 후, 레트로바이러스 농축 키트를 이용하여 생산한 바이러스 농축하였다.
cFF2 세포와 복합 파킨슨 바이러스를 48시간동안 배양하여 감염시켰다.
잔여 바이러스를 제거하고 puromycin을 첨가하여 2주간 선별 배양한 후, 단일 세포를 96 well 배양 플레이트로 옮겨 배양하여 단일클론 복합 파킨슨 유전자 탑재 개 세포주 선별하였다.
배양된 각 세포주에서 분리한 RNA를 이용해 RT-PCR을 수행한 결과, 도입한 인간 복합 파킨슨 유전자 발현이 확인되었다.
핵치환에 사용하기 위한 세포는 1x106의 세포를 1 vial에 넣어 액체질소에 저장하였다.
실시예 6: 파킨슨 복합 유전자 탑재 개 체세포주 특성 분석
바이러스 도입에 의한 유전자 탑재시 세포내의 염색체 이상 유무를 확인한 결과 cFF2.PINK1/α-synuclein (cFF2.PS) 세포는 76 상염색체에 XX로 분석되어 정상핵형을 가진 것으로 검증되었다 (도 5).
cFF2에 파킨슨 복합 유전자를 도입한 후, RT-PCR 기법으로 복합 유전자 탑재된 개 체세포(cFF2,PS)에서 PINK1, α-synuclein 유전자가 강하게 발현하는 것을 검증하였다(도 6).
또한 면역형광염색법으로도 모든 cFF2.PS세포에서 PINK1, α-synuclein 단백질이 발현하는 것을 검증하여 복합 파킨슨 돌연변이 유전자가 도입되었음을 검증하였다(도 7).
염색체에 삽입된 유전자 수를 분석하기 위하여 gDNA를 이용해 real time PCR을 수행하였다. 각각 PINK1+α-synuclein 유전자 발현 Ct값과 GAPDH와 알부민 유전자 Ct값을 비교하여 상대적인 gene copy를 계산한 결과 게놈내 1군데 삽입된 것을 알 수 있었다(도 8).
실시예 7: 체세포 복제 기법을 이용한 파킨슨 질환모델 개 생산 및 검정
파킨슨병 유전자 탑재 체세포 활용 핵치환 복제란 생산 및 이식을 통한 파킨슨병 질환모델 개를 하기와 같은 방법으로 생산하였다.
인공수정 또는 자연교미한 비글견의 태아를 임신 28일령에 제왕절개 방법으로 회수한다. 회수된 태아는 실험실로 운반하여 머리와 사지를 제거하고 몸통만 DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline)로 3회 세척하였다.
세척 후 남아있는 조직은 잘게 자르고 39℃, 5% CO2 및 95% 공기의 가습 조건으로 15% (v/v) FBS(invitrogen), 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 100mm 배양 접시에서 배양하였다. 배양접시에 붙지 않은 조직은 제거하고 부착된 세포들을 컨플루언시(confluency)까지 배양하였다. 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 1분간 트립신 처리하고 세포 1x105개/vial농도로 분주하여, 10% DMSO를 첨가한 FBS를 사용하여 -196℃의 액체 질소 내에서 동결 저장하였다.
1~5년령의 잡종 암캐를 사용하여 수핵 난자를 얻었다. 발정견으로부터 매일 채혈을 실시하여 Roche cobas e 411 면역형광분석 기기와 estrogen 및 progesterone 분석 Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)을 이용하여 혈청 프로게스테론 및 에스트로겐을 측정하였다. 난자공여견의 혈중 에스트로겐 피크로부터 72시간 후를 배란일로 추정하고, 에스트로겐 피크 측정이 불가능한 개체의 경우 혈중 프로게스테론 농도(6~15ng/ml)를 배란일로 추정하였다. 추정된 배란일부터 3일 후 외과적 수술을 통해 체내에서 성숙난자를 회수하여, 난구세포를 0.1% hyalulonidase를 이용하여 제거한 후, 실체현미경을 통하여 성숙난자만을 선별하여 복제수정란 생산에 이용하였다. 성숙난자는 5 ug/ml Hoechst 33342로 염색한 후, 제 1 극체 및 중기염색체를 미세피펫으로 흡입하여 제거하고, 액체질소에 냉동 보존된 파킨슨병 유전자가 도입된 체세포를 융해하고 3번 washing 후 15분간 37℃에서 인큐베이션시켜 안정화시킨 후, 탈핵 난자에 주입하였다.
난자와 체세포의 융합을 위하여 세포융합액 내에서 DC49V, 15μsec pulse width, 2pulse, 0.1sec interval의 조건으로 전기적 융합을 실시한 후, 복제수정란을 10μM 칼슘 아이노어포어(Ca-ionophore)에서 4분간 활성화 처리 후, 6-DMAP(dimethylaminopurine)에서 4시간 동안 배양을 실시하였다.
대리모견에 이식하기 위하여 위에서 언급한 배란 추정방법에 의하여 추정된 배란일 후 2일~3일차 되는 대리모견를 준비하고, 외과적 수술을 통하여 대리모견의 난관팽대부에 복제수정란을 이식하였다.
이식 30일째 임신감정을 하고, 57일째부터 혈중 프로게스테론을 측정하여 혈중 프로게스테론 농도가 급 감소함을 확인한 24시간 후(62일째), 제왕절개로 파킨슨 질환모델 개를 생산하였다.
제왕절개 시, 분리한 탯줄에서 genomic DNA를 추출하여 도입된 돌연변이 인간 PINK1과 α-synuclein의 존재여부를 PCR기법으로 확인하여, 생산된 질환모델 개의 gDNA에 외래 유전자 2가지가 함께 삽입되어 있음을 확인하였다(도 10).
PCR 기법으로 확인 시, 사용된 프라이머의 종류는 하기의 표 1과 같다.
또한, 복제견의 친자감별을 위하여 공여세포, 복제견의 탯줄조직, 대리모견의 혈액에서 Genomic DNA를 분리하여 친자감별에 이용한다. 생산된 형질전환 모델 개가 핵공여개와 유전적으로 일치하는지를 알아보기 위해 형질전환 모델 개의 탯줄, 난자제공견의 피, 대리모의 피, 핵공여개의 체세포에서 genomic DNA를 추출하여 microsatellite 분석과 마이토콘드리아 DNA의 sequencing을 수행하였다. 먼저 microsatellite 분석은 18개의 canine-specific markers를 사용하였다(도 11). 도 11에서 볼 수 있듯이 cFF2 파킨슨 원본세포와 cFF2 파킨슨 질환모델 복제견 1의 microsatellite 패턴이 모든 locus들에서 일치한다는 것을 알 수 있었다.
형질전환 체세포를 이용한 핵치환시 퓨전전압에 따른 퓨전율을 확인하였다. 퓨전 전압을 34V, 49V, 59V로 달리 하였을 때, 퓨전 성공된 난자/퓨전시도된 난자를 퓨전율로 하여, 백분율로 표 2에 나타내었다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13310BP
수탁일자 : 2017818
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION
<120> Vector comprising a combined dual Parkinson gene and disease
model using the same
<130> NPF-31300
<160> 12
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 1
ccttctacgg ctagggcaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 2
ttaagcgtac gaggcctacc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 3
caaggccccc aaagtagtga 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 4
ctctcttacc cgtcattggc t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 5
agtagcccag aagacagtgg a 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 6
acgcgtacgc gtttaggctt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 7
ccaagctagg atggaggtgc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 8
atgaatggcc tgggtggttt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 9
ttgtggctgc tgctgagaaa a 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 10
cagaattcct tcctgtgggg ct 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 11
gtcatccctg agctgaacgg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 12
tccgatgcct gcttcactac 20
Claims (16)
- PINK1(G309D) 돌연변이 유전자 및 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T)) 돌연변이 유전자를 포함하는 파킨슨병 질환모델 제작용 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 PINK1(G309D) 돌연변이는 PINK1 유전자 중 309 위치에서 Gly이 Asp로 치환되고, 상기 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T)) 돌연변이는 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T)) 유전자 중 53 위치에서 Ala이 Thr으로 치환된 돌연변이인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 질환모델 제작용 벡터. - 제1항에 있어서,
상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 파킨슨 질환모델 제작용 벡터. - 제1항에 있어서,
상기 파킨슨병 질환 동물모델은 개인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 질환모델 제작용 벡터. - 제1항의 파킨슨병 질환 동물모델 제작용 벡터를 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC13310BP).
- 제5항에 있어서,
상기 세포주(기탁번호: KCTC13310BP)는 포유류의 섬유아세포에서 유래한 것을 특징으로 하는 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC13310BP). - 제6항에 있어서,
상기 포유류는 개인 것을 특징으로 하는, 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC13310BP). - 제5항에 있어서,
상기 PINK1(G309D) 유전자 및 알파-시뉴클레인(α-synuclein(A53T))는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 형질전환된 복합 유전자 돌연변이 세포주(기탁번호: KCTC13310BP). - 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 복합 유전자 세포주를 체세포 복제 기법을 이용하여, 형질전환된 파킨슨병 질환모델.
- PINK1(G309D)과 α-synuclein(A53T) 돌연변이 유전자를 벡터에 도입하는 단계;
상기 벡터를 이용하여, 포유류의 세포를 형질전환시키는 단계; 및
형질전환된 세포를 탈핵시킨 수정란에 도입하는 핵치환 단계를 포함하는 복제란의 제조방법. - 제10항에 있어서,
상기 핵치환 단계에서 electrode를 이용하는 퓨전방법에서 35~55V의 퓨전전압으로 핵과 세포질을 융합하는 단계를 포함하는 복제란의 제조방법. - 제10항에 있어서,
상기 핵치환 단계에서 55% 이상의 퓨전율을 나타내는 핵치환 단계를 포함하는 복제란의 제조방법. - 제10항에 기재된 방법에 의해 복제란을 대리모에 이식하는 단계를 포함하는 파킨슨 질환 모델의 생산방법.
- 제10항에 있어서,
상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 파킨슨 질환 모델의 생산방법. - 제10항에 있어서,
상기 포유류는 개인 것을 특징으로 하는, 파킨슨 질환 모델의 생산방법. - 제13항의 생산방법에 따라 생산된, 파킨슨 질환 모델을 이용한 파킨슨병 예방제 또는 치료제의 스크리닝 방법.
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WO2023085505A1 (ko) * | 2021-11-15 | 2023-05-19 | 주식회사 엠케이바이오텍 | 파킨슨 병 유도 벡터 및 이를 이용한 개 모델의 제조 방법 |
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