CN108135943A

CN108135943A - 人源化的骨骼肌

Info

Publication number: CN108135943A
Application number: CN201680049673.3A
Authority: CN
Inventors: D·J·加里; M·G·加里; N·小谷野-中川
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2018-06-08
Also published as: EP3316898A4; US20210161110A1; WO2017004367A1; BR112017028619A2; US10874092B2; RU2018103093A; AU2016288196A1; CA2991053A1; US20180177166A1; MX2018000273A; EP3316898A1; JP2018522553A

Abstract

本文描述了产生表达人类MYF5、MYOD、MRF4基因或其组合基因的嵌合非人类动物的方法，包括：a)建立MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类动物细胞，其中非人类MYF5、MYOD、MRF4基因或其组合的两个拷贝携带突变以防止在所述非人类动物中产生功能性MYF5、MYOD、MRF4蛋白或其组合；b)通过体细胞核移植产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类胚泡，包括将来自a)的所述MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类动物细胞的核融合至去核非人类卵母细胞中并活化所述卵母细胞分裂以形成MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类胚泡；c)将人类干细胞引入b)的MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类胚泡中；和d)将来自c)的所述胚泡移植到假孕的代孕非人类动物中以产生表达人类MYF5、MYOD、MRF4或其组合的嵌合非人类动物。

Description

人源化的骨骼肌

优先权要求

本申请要求于2015年6月30日提交的美国临时专利申请第62/187,027号的优先权权益，本文要求该优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明背景

诸如肌肉萎缩症类的肌病是常见且致命的。此外，许多肌肉状况如萎缩和肌肉减少症与衰老有关。虽然骨骼肌具有强大的再生能力，但这种潜能最终会因为疾病和衰老而衰退。目前没有可用于治疗晚期肌肉疾病的方法，百分之五十老年人的跌倒导致他们的死亡。

发明概述

本文描述了MYF5/MYOD/MRF4敲除的猪或其他动物(例如牛或山羊)作为宿主产生个性化人类/人源化肌肉/肌肉细胞用于临床应用的研发。

利用基因编辑技术已经产生了MYF5/MYOD/MRF4无效猪胚胎。对MYF5/MYOD/MRF4进行多重基因编辑产生允许微环境(niche)，利用具有多潜能能力的人类细胞用肌肉重新填充该微环境，从而产生人源化骨骼肌(例如在非人类动物中)。

一个实施方案提供了非人类动物细胞、桑椹胚或胚泡，其中基因组在MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的两个等位基因中携带突变，以致非人类动物细胞、桑椹胚或胚泡缺乏功能性MYF5蛋白、MYOD蛋白、MRF4蛋白或其组合。在一个实施方案中，突变是MYF5基因、MYOD基因、和/或MRF4基因的缺失。在一个实施方案中，非人类动物细胞、桑椹胚或胚泡是猪、牛、马或山羊的。

一个实施方案提供了表达人类MYF5、MYOD和/或MRF4并且缺乏所述非人类动物MYF、MYOD和/或MRF4的表达的嵌合非人类动物、桑椹胚或胚泡。在一个实施方案中，该非人类动物产生人源化骨骼肌细胞和/或组织。在一个实施方案中，该非人类动物是猪、牛、马或山羊。

一个实施方案提供了表达外源猪MYF5、MYOD、MRF4或其组合并且缺乏内源猪MYF5、MYOD、MRF4或其组合的表达的嵌合猪(猪-猪嵌合体)。

一个实施方案提供了产生表达人类MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的嵌合非人类动物的方法，包括：a)产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的非人类动物细胞，其中猪MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的两个拷贝携带突变以防止在所述非人类动物中产生功能性MYF5蛋白、MYOD蛋白、MRF4蛋白或其组合；b)通过体细胞核移植产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的非人类桑椹胚或胚泡，包括将来自a)的所述MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的非人类动物细胞的核融合到去核非人类卵母细胞中，并且活化所述卵母细胞分裂以形成MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的非人类桑椹胚或胚泡；c)将人类干细胞引入b)的MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的非人类桑椹胚或胚泡中；和d)将来自c)的所述桑椹胚或胚泡移植到假孕的代孕非人类动物中以产生表达人类MYF5、MYOD、MRF4或其组合的嵌合非人类动物。

另一个实施方案提供了产生表达外源MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的嵌合猪的方法，包括：a)产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的猪细胞，其中内源猪MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合基因的两个拷贝携带突变以防止功能性内源猪MYF5蛋白、MYOD蛋白、MRF4蛋白或其组合的产生；b)通过体细胞核移植产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的猪桑椹胚或胚泡，包括将来自a)的所述MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的猪细胞的核融合到去核猪卵母细胞中并活化所述卵母细胞分裂以形成MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的猪桑椹胚或胚泡；c)将猪干细胞引入b)的猪MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的桑椹胚或胚泡中；和d)将来自c)的所述桑椹胚或胚泡移植到假孕的代孕猪中以产生表达外源猪MYF5、MYOD、MRF4或其组合的嵌合猪。

一个实施方案提供了在非人类动物中产生人类和/或人源化骨骼肌细胞的方法，包括：a)产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的非人类动物细胞，其中非人类动物MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的两个等位基因携带突变以防止功能性MYF5蛋白、MYOD蛋白、MRF4蛋白或其组合的产生；b)通过体细胞核移植产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的非人类动物胚泡或桑椹胚，包括将来自a)的所述MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的非人类动物细胞的核融合到去核非人类卵母细胞中并活化所述卵母细胞分裂以形成MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的非人类桑椹胚或胚泡；c)将人类供体干细胞引入b)的MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的非人类胚泡或桑椹胚；和d)将来自c)的所述胚泡或桑椹胚移植到假孕的代孕非人类动物中以产生表达人类或人源化骨骼肌细胞的非人类动物。

在一个实施方案中，非人类动物是猪、牛、马或山羊。在另一个实施方案中，人类供体干细胞是组织特异性干细胞、多潜能干细胞、多能成体干细胞、诱导性多潜能干细胞或脐带血干细胞(UCBSC)。在一个实施方案中，诱导性多潜能细胞由成纤维细胞形成。

一个实施方案包含通过本文所述的方法产生的非人类动物。

在一个实施方案中，提供了猪细胞、桑椹胚或胚泡，其中基因组在MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的两个等位基因中携带突变(例如终止密码子提前或缺失)，使得猪细胞或胚泡缺乏功能性MYF5蛋白、MYOD蛋白、MRF4蛋白或其组合。在一个实施方案中，突变是MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的缺失。

一个实施方案提供了表达人类MYF5、MYOD、MRF4或其组合并且缺乏猪MYF5、MYOD、MRF4或其组合的表达的嵌合猪。在一个实施方案中，嵌合猪产生人源化骨骼肌细胞和/或组织。

另一个实施方案提供了表达得自猪干细胞的猪MYF5、MYOD、MRF4的嵌合猪(猪-猪嵌合体)。

一个实施方案提供了产生表达人类MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的嵌合猪的方法，包括：a)产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的猪细胞，其中猪MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合基因的两个拷贝携带突变以防止功能性猪MYF5蛋白、MYOD蛋白、MRF4蛋白或其组合的产生；b)通过体细胞核移植产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的猪桑椹胚或胚泡，包括将来自a)的所述MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的猪细胞的核融合到去核猪卵母细胞中并且活化所述卵母细胞分裂以形成MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的猪桑椹胚或胚泡；c)将人类干细胞引入b)的猪MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的桑椹胚或胚泡中；和d)将来自c)的所述桑椹胚或胚泡移植到假孕的代孕猪中以产生表达人类MYF5、MYOD、MRF4(和人类骨骼肌)或其组合的嵌合猪。

另一个实施方案提供了在猪中产生人源化骨骼肌细胞的方法，包括：a)产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的猪细胞，其中猪MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的两个等位基因携带突变以防止功能性猪MYF5蛋白、MYOD蛋白、MRF4蛋白或其组合的产生；b)通过体细胞核移植产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的猪桑椹胚或胚泡，包括将来自a)的所述MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的猪细胞的核融合到去核猪卵母细胞中并且活化所述卵母细胞分裂以形成MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的猪桑椹胚或胚泡；c)将人类干细胞引入b)的猪MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效的桑椹胚或胚泡；和d)将来自c)的所述桑椹胚或胚泡移植到假孕的代孕猪中以产生表达人源化骨骼肌细胞的猪。

在一个实施方案中，所述方法使用人类诱导性多潜能干细胞或人类脐带血干细胞。在一个实施方案中，所述方法使用由成纤维细胞形成的人类诱导性多潜能细胞。

一个实施方案提供了基因敲除猪细胞或胚泡，其中基因组包含MYF5、MYOD、MRF4基因或其组合基因的缺失，使得猪细胞或胚泡缺乏功能性MYF5、MYOD、MRF4蛋白或其组合，其中猪细胞或胚泡是对于所述缺失是纯合的。在一个实施方案中，在MYF5ENSSSCG00000000937(MYF5ENSG00000111049)处提供了野生型猪(野猪(Sus scrofa))MYF5的序列，在MYOD NC_010444(人类基因:MYOD ENSG00000129152)处提供了MYOD的序列，在MYF6 ENSSSCG00000026533(人类基因:MYF6 ENSG00000111046)处提供了MRF4(也称为MYF6)的序列。

为每个受体的免疫复合物制造个性化的人类或人源化组织或器官将是有用的。如本文所公开的，通过利用大型动物作为宿主并编辑其基因组以敲除或削弱负责靶器官生长和/或分化的基因并向处于胚泡或受精卵阶段的动物接种供体干细胞以互补缺失的用于所述器官生长和发育的遗传信息是有可能做到这些的。结果是嵌合动物，其中互补的组织(人类或人源化器官)与供体的基因型和表型相匹配。这种器官可在一代中制造，并且干细胞可从患者自身身体中获取或产生。如本文所公开的，通过在细胞中同时编辑多个基因是有可能做到这些的(参见例如WO 2015/168125，其通过引用并入本文)。在脊椎动物细胞或胚胎中，可以使用靶向核酸酶和同源定向修复(HDR)模板靶向多个基因来编辑。

附图说明

图1描绘了在猪模型中产生人源化骨骼肌的总体策略。使用多重基因编辑来产生MYF5/MYOD/MRF4突变的猪成纤维细胞，SCNT和人类干细胞递送以工程化具有人源化骨骼肌的猪。

图2A-B表明Myf5、Myod、Mrf4是骨骼肌的主要调节子，且限于发育中和成体的骨骼肌中。这里显示的是在E11.5时Myod-GFP转基因表达限于小鼠的体节、膈膜和建立的骨骼肌中(图A)。在图B中，使用35S标记的MyoD核糖核酸探针对E13.5(妊娠中期)小鼠胚胎的旁矢状面切面进行原位杂交。注意在背侧、肋间和肢体肌肉群的表达。

图3A-C(A.)TALEN对是针对猪MYOD、MYF5和MYF6(又名MRF4)基因设计的。TALEN结合位点(红色箭头指出)位于每个基因碱性(+)螺旋-环-螺旋(HLH)结构域的上游。上面显示了TALEN结合位点(红色箭头指出)，通过同源依赖性修复(HDR)靶向提前终止密码子的氨基酸用黄色箭头指出。(B.)将1500ng每种TALEN对同时转染至原代猪成纤维细胞中，连同0.1nmol每种为引入提前终止密码子和新的限制性内切酶识别位点(HindIII)而设计的90mer HDR寡聚物，以允许对HDR事件进行简单分析。通过PCR扩增每个基因的感兴趣区域并评估转染细胞群的限制性片段长度多态性(RFLP)。实心的箭头指出未切割或野生型等位基因，而空心箭头指出HDR等位基因。MYOD、MYF5和MYF6的HDR等位基因阳性百分比分别为14％、31％和36％。(C)这些群被挑出用于单独的集落分离。在768个集落中有38个(4.9％)表现出4个或更多的RFLP事件并通过测序进一步分析。通过掺入提前终止密码子的HDR或将会导致移码和随后的提前终止密码子的插入缺失(indel)鉴定出了5个克隆是所有三个基因纯合敲除的。显示了作为MYOD/MYF5/MYF6三重敲除克隆的RFLP分析和测序的实例。

图4A-B描绘了在E18.0，野生型(Wt)胚胎具有明确的体节(s)、结蛋白阳性(红色)肌节(m)和发育中的肌肉系统(图3A)。此外，发育中的心脏管表现出强结蛋白信号(h)。相反，MYF5/MYOD/MRF4KO胚胎显示缺乏肌节形成，而心脏仍然是结蛋白阳性(图3B)。

图5A-B描绘了(A)在ICM中具有DiI标记的hiPSC的胚泡。箭头指出DiI和HNA阳性的细胞。(B)在ICM中具有EdU标记的hiPSC的胚泡。用40μM EdU标记hiPSC 24小时并注射。胚泡用10μM BrdU脉冲1小时以标记正在分裂的细胞。箭头指出双阳性细胞。BrdU+/EdU-细胞是正在分裂的宿主细胞。请注意胚泡开始孵化(括号)，这表示发育进展。

图6A-D描绘了与GFP标记的卵裂球互补的E20猪MYF5/MYOD/MRF4无效胚胎。在全胚胎的肝和卵黄囊中观察到天然GFP。B.来自与GFP标记的卵裂球互补的MYF5/MYOD/MRF4无效胚胎(E20)的猪肝脏切片。肝中可见天然GFP。C.来自与GFP标记的卵裂球互补的E20猪MYF5/MYOD/MRF4无效胚胎(胚胎1(如图A、B、D所示)、3、5)的卵黄囊的PCR。GFP标记的猪成纤维细胞是阳性对照，而WT猪肝脏是阴性对照。用GFP标记的成纤维细胞进行滴定。这些数据表明在卵黄囊中大约有1:10个细胞表达GFP。D.来自与GFP标记的卵裂球互补的E20猪MYF5/MYOD/MRF4无效胚胎的体节切片证明在体节中存在GFP互补并且结蛋白(红色)存在于GFP标记的细胞中(箭头)。这些数据表明成功进行猪：猪互补的能力，并且进一步显示结蛋白在互补细胞中产生。这些数据表明在缺乏骨骼肌的猪模型中造成三重敲除的能力，其将为互补组织的形成创造一个微环境。这种方法被用来在猪上产生人源化的骨骼肌。

发明详述

使用基因编辑技术已经产生了MYF5/MYOD/MRF4无效猪胚胎。对MYF5/MYOD/MRF4进行多重基因编辑创建了一个允许微环境，该微环境可以利用具有多潜能能力的猪细胞用肌肉重新填充，并且利用人类干细胞重新填充以在非人类动物中产生人源化骨骼肌。

定义

以下包括的定义为说明书和权利要求提供了清楚和一致的理解。如本文所用，所述术语具有以下含义。在本说明书中使用的所有其他术语和短语具有本领域技术人员将理解的其普通含义。这样的普通含义可以通过参考技术字典获得，例如Hawley's CondensedChemical Dictionary 14th Edition,by R.J.Lewis,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,2001。

说明书中提及“一个实施方案”、“实施方案”等表明所描述的实施方案可包括特定的方面、特征、结构、部分或者特性，但不是每个实施方案都必须包括该方面、特征、结构、部分或特性。而且，这样的短语可能(但不一定)指代说明书的其他部分中提到的相同实施方案。此外，当结合实施方案描述特定方面、特征、结构、部分或特性时，本领域技术人员知道将这样的方面、特征、结构、部分或特性影响或关联其他实施方案，无论是否明确描述。

如本文所用，冠词“一”和“一个”是指冠词语法对象的一或多于一个，即至少一个。举例来说，“一个元素”表示一个元素或多于一个元素。

术语“和/或”是指项目中的任何一个，项目的任何组合或与该术语相关联的所有项目。短语“一或多”容易被本领域技术人员理解，特别是当阅读其使用的上下文时。例如，在苯环上的一或多个取代基是指1至5，或者1至4(例如如果苯环被双取代)。

如本文所用，“或”应当被理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离项目列表时，“和/或”或者“或”将被解释为包含性的，例如包括多个项目的至少一个，但也包括多于一个，并且任选地，额外未列出的项目。只有清楚地表明相反的术语，诸如“仅一个”或“确切的一个”，或者当在权利要求中使用时，“由…组成”将指包含多个或列表元素中的确切的一个元素。一般而言，在此使用的术语“或”在排他性术语(例如“任一”、“之一”、“仅之一”、或者“确切的一个”)之后应当仅被解释为指示排他性的替代(即“一个或另一个，但不是全部”)。

如本文所用，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”、“有”或者其变型旨在类似于术语“包含”的包含性。

术语“约”可以表示具体值的±5％、±10％、±20％或者±25％的变化。例如，“约50”％在一些实施方案中可以具有45％到55％的变化。对于整数范围，术语“约”可以包括在该范围的每端点处大于和/或小于所列举整数的一个或两个整数。除非本文另外指出，否则术语“约”旨在包括接近所列举范围的值(例如重量百分数)，其在单独的成分、组合物或实施方案的功能性方面是等价的。术语“约”还可以修饰所列范围的端点。

如本领域技术人员将理解的，所有数字，包括表示成分、性质的量，诸如分子量、反应条件等的那些数值都是近似值，并且被理解为在所有情况下可选地被术语“约”修饰。这些值可以根据本领域技术人员利用本文描述的教导寻求获得期望的性质而变化。还应该理解的是，这样的值固有地包含各自的测试测量中发现的标准偏差引起的必然的可变性。

如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文所列举的所有范围还包括任何和所有可能的子范围以及其子范围的组合，以及组成所述范围的各个值，特别是整数值。所列举的范围(例如重量百分比或碳基团)包括所述范围内的每个具体值、整数、小数或相同性。任何所列的范围都可以被容易地理解为足以描述和使相同范围被分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一或十分之一。作为非限制性实例，这里讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一、上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”、“多于”、“或更多”等的所有语言，包括所列举的数字以及这样的术语指代的范围随后可以分解成如上讨论的子范围。以相同方式，本文所列举的所有比率还包括落在更宽比率内的所有子比率。因此，对于自由基、取代基和范围所列举的具体数值仅用于说明；它们不排除自由基和取代基限定范围内的其他限定值或其他值。

本领域技术人员还将容易地意识到，当成员以普通方式组合在一起时，例如以马库什组合，本发明不仅包含作为整体列出的整个组，而且包括该组的每个成员和主要组的所有可能的亚组。

此外，为了所有目的，本发明不仅包含主要组，还包括缺少一或多个组成员的主要组。因此，本发明设想明确地排除所列举组中的任何一或多个成员。因此，条款可适用于任何公开的类别或实施方案，其中可以从这样的类别和实施方案中排除任何一或多个所列举的元素、物种或实施方案，例如，用于明确地负面限制。

术语“分离的”是指一或多个因子、一或多个细胞，其不与在体内与所述一或多个因子、一或多个细胞相关的一或多个因子、细胞或一或多个细胞成分相关。

术语“接触”是指触及、接触或使其紧邻或极为接近的行为，包括在细胞或分子水平上，例如引起生理反应、化学反应或物理变化，例如在溶液中、在反应混合物中、在体外或在体内。

本文所用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语还包括它们的子代，其为任何和所有后续世代。可以理解，由于有意或无意突变，所有子代可能不完全相同。

“细胞”包括来自脊椎动物的细胞，或者“对象”是脊椎动物，例如哺乳动物，包括人。哺乳动物包括但不限于人、家畜、运动动物和伴侣动物。术语“动物”包括狗、猫、鱼、沙鼠、豚鼠、仓鼠、马、兔、猪、小鼠、猴(例如猿、大猩猩、黑猩猩或猩猩)、大鼠、绵羊、山羊、牛和鸟。

在一个实施方案中，干细胞、祖细胞或前体细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、诱导性多潜能干细胞和/或多能干细胞(例如多能中胚层前体)。在一个实施方案中，干细胞、祖细胞或前体细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，干细胞包括但不限于诱导性多潜能干细胞、脐带血干细胞、间充质干细胞、多潜能干细胞。在一个实施方案中，干细胞是人源的。在另一实施方案中，干细胞是猪源的。

全能性(又称全能的)干细胞可分化为胚胎和胚外细胞类型。这种细胞可以构建完整的、有活力的生物体。这些细胞由卵细胞和精细胞融合而产生。由受精卵前几个分裂产生的细胞也是全能性的。多潜能干细胞是全能性细胞的后代，并且可以分化成几乎所有的细胞，即衍生自三个胚层任何的细胞。多能干细胞可以分化成许多细胞类型，但只有那些密切相关的细胞家族。寡能干细胞只能分化成少数细胞类型，如淋巴系干细胞或髓样干细胞。单能细胞只能产生自身一种细胞类型，[4]但具有自我更新的特性，这使得它们区别于非干细胞(例如祖细胞、肌肉干细胞)。

“扩展”是指细胞繁殖而不分化。

“祖细胞”是在干细胞分化过程中产生的细胞，其具有一些，但不是全部它们终末分化后代的特征。确定的祖细胞定型谱系，而不是具体的或终末分化的细胞类型。短语“内皮细胞”不仅包括终末分化的细胞类型，而且还包括定型内皮谱系但不是终末分化的细胞。

“分化因子”是指细胞因子，优选诱导谱系定型的生长因子或血管生成因子。

术语“猪”是上位术语，是指不考虑性别、大小或品种的相同类型的动物。还应注意的是，术语“猪”，诸如与人或猪基因互补的无效“猪”，所述“猪”可是胚胎、新生儿或成体(包括新生猪和幼猪)。

如本文所用，短语“人源化骨骼肌”是指在猪或其他非人类动物中表达一或多种人类基因和/或蛋白质的细胞或组织。在一个实施方案中，表达一或多种人类基因/蛋白质的猪细胞或组织不表达相应的功能性猪基因和/或蛋白质。

基因的“编码区”由基因的编码链的核苷酸残基和基因的非编码链的核苷酸组成，其分别与基因转录产生的mRNA分子的编码区同源或互补。

“对照”细胞是与测试细胞具有相同细胞类型的细胞。例如，对照细胞可以在检测测试细胞时，精确地或几乎同时被检测。例如，对照细胞还可以在远离测试细胞检测时间的时间检测，并且可以记录对照细胞的检测结果，从而可以将所记录的结果与检测测试细胞所获得的结果进行比较。

如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生选定效果的量，诸如缓解疾病或病症的症状。在以组合的形式(诸如多种化合物)施用化合物的情况下，当与另外一或多个化合物组合施用时，每种化合物的量可不同于单独施用所述化合物时的量。因此，尽管各化合物的实际量可变化，但化合物组合的有效量总体地是指作为一个整体的组合。术语“更有效”是指通过一次治疗相对于所比较的第二治疗，选定效果得到更大程度的缓解。

“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列的固有性质，用作在生物过程中合成其他具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学性质的聚合物和大分子的模板。因此，如果转录和翻译对应于该基因的mRNA在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以表示编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

“片段”或“区段”是包含至少一个氨基酸的氨基酸序列的一部分或含有至少一个核苷酸的核酸序列的一部分。术语“片段”和“区段”在本文中互换使用。

如本文所用，“功能性”生物分子是以呈现其表征的性质的形式的生物分子。例如，功能性酶是呈现表征酶的特征性催化活性的酶。

如本文所用，“同源”是指两个多聚分子之间的亚基序列相似性，例如在两个核酸分子之间，例如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间。当两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据(例如如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据)时，那么它们在该位置是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置的数量的直接函数，例如，如果两个化合物序列中位置的一半(例如长度为10亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则两个序列是50％同源的，如果该位置的90％(例如10个中的9个)是匹配或同源的，则两个序列具有90％同源性。举例来说，DNA序列3’ATTGCC5’和3’TATGGC具有50％同源性。

如本文所用，“同源性”与“相同性”同义使用。

两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比相同性的确定可以使用数学算法来完成。例如，用于比较两个序列的一种数学算法是Karlin和Altschul(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268)的算法，Karlin和Altschul(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)中加以改良的算法。该算法被并入Altschul等(1990，J.Mol.Biol.215：403-410)的NBLAST和XBLAST程序中，并且可以在例如具有通用资源定位器的National Center for Biotechnology Information(NCBI)全球网站上使用NCBI网站上的BLAST工具获得。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序(在NCBI网站中指定为“blastn”)使用以下参数进行：缺口罚分(gap penalty)＝5；缺口延伸罚分(gap extensionpenalty)＝2；错配罚分＝3；匹配奖励(match reward)＝1；期望值(expectation value)10.0；以及字长＝11以获得与本文描述的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序(在NCBI网站指定为“blastn”)或NCBI“blastp”程序使用以下参数进行：期望值10.0，BLOSUM62评分矩阵以获得与本文描述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以使用如Altschul等(1997，NucleicAcidsRes.25：3389-3402)描述的Gapped BLAST。或者，可使用PSI-Blast或PHI-Blast来执行迭代搜索，其检测分子间的远距离关系(Id.)和分子间具有共同模式的关系。当使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast和PHI-Blast程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。

两个序列之间的百分比相同性可以使用类似于上述的技术来确定，有或没有允许缺口。在计算百分比相同性中，通常会计算精确匹配。

如本文所用，“说明材料”包括可用于传达本发明在试剂盒中用于缓解本文所述各种疾病或病症的有用性的出版物、记录、图表或任何其它表达媒介。任选地或可选地，说明材料可以描述缓解哺乳动物的细胞或组织中的疾病或病症的一或多种方法。例如，本发明的试剂盒的说明材料可以被固定到包含所标识的发明或其一部分的容器上，或者与包含本发明或其一部分的容器一起运输。或者，说明材料可以与容器分开运输，使得说明材料和化合物由接受者合作使用。

如本文所用，术语“核酸”包括RNA以及单链和双链DNA和cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和类似术语还包括核酸类似物，即具有除磷酸二酯主链以外的类似物。例如，本领域已知的并在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键的所谓的“肽核酸”也被认为在本发明的范围内。“核酸”是指任何核酸，无论是由脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸组成，无论是由磷酸二酯键或修饰的键例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硅氧烷键、碳酸酯键、羧甲基酯键、乙酰胺酯(acetamidate)键、氨基甲酸酯键、硫醚键、桥连氨基磷酸酯键、桥连亚甲基膦酸酯键、桥连氨基磷酸酯键、桥连氨基磷酸酯键、桥连亚甲基膦酸酯键、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、二硫代磷酸酯键、桥连硫代磷酸酯键或砜键类、以及这些键的组合。术语核酸还具体地包括由五种生物学存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外的碱基组成的核酸。本文使用常规符号来描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端是5'端；将双链多核苷酸序列的左手方向称为5'-方向。将5'到3'添加核苷酸到新生RNA转录物的方向称为转录方向。具有与mRNA相同序列的DNA链称为“编码链”；位于DNA参考点5'的DNA链上的序列称为“上游序列”；DNA参考点3'的DNA链上的序列称为“下游序列”。

本文使用的术语“核酸构建体”包括编码所需的特定基因或基因片段的DNA和RNA序列，不管是通过基因组还是合成方法获得的。

除非另外指明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此简并版本且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。

术语“寡核苷酸”通常是指短多核苷酸，通常不超过约50个核苷酸。应该理解，当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括其中用“U”代替“T”的RNA序列(即A、U、G、C)。

类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)是通过将TAL效应物DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制酶。这些试剂能够进行有效的、可程序设计的和特异性的DNA切割，用于原位基因组编辑。类转录激活因子效应物(TALE)是以序列特异性方式结合DNA的蛋白质。通过将这种TALE与核酸酶(例如FokI核酸内切酶)融合，产生高度特异性的DNA“剪刀”(这些分子可以被改造以结合任何DNA序列)。本文使用的术语TALEN是宽泛的，并且包括可在不需要另一TALEN的帮助下切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN也被用来指一对TALEN中的一个或两个成员，其被改造以一起工作从而在相同位点切割DNA。一起工作的TALEN可以称为左TALEN和右TALEN，其中提到了DNA的手性。

一旦TALEN基因已经被组装，它们被插入到质粒中；然后使用质粒来转染靶细胞，其中基因产物被表达并进入细胞核以接近基因组。TALEN可用于通过诱导双链断裂(DSB)和任选地插入货物基因/预选基因来编辑基因组，所述细胞响应于修复机制。以这种方式，它们可以用于例如校正导致疾病的基因组中的突变。

遗传工程(包括基因编辑)可通过本领域技术人员可用的任何方法进行，例如通过使用靶向内切核酸酶和同源定向修复(HDR)、TALEN、CRISPR(例如CAS9/CRISPR)、重组酶融合分子、合成猪人工染色体、大范围核酸酶、基于锌指或rAAV的基因编辑系统(例如敲除所需的靶基因)。此外，为了敲除目的，可以将多种核酸引入细胞中用于失活基因(例如干扰RNA(shRNA、siRNA、dsRNA、RISC、miRNA)或表达基因。

体细胞核移植(SCNT)是一种用于从体细胞和卵细胞中产生活胚胎的实验室技术。体细胞核移植的过程涉及两种不同细胞。第一个是雌性配子，被称为卵子(卵/卵母细胞)。第二个是体细胞，指人体的细胞。皮肤细胞、脂肪细胞和肝细胞只是一些实例。供体卵细胞的细胞核被去除并丢弃，使其“去编程”。体细胞的细胞核也被去除但被保留，去核体细胞被丢弃。剩下的是一个单独的体细胞核和一个去核的卵细胞。然后通过将体细胞核注入“空”卵子来融合。插入卵后，体细胞核被宿主卵细胞重编程。现在含有体细胞核的卵子受到电击(shock)刺激，并开始分裂。卵现在是有活的并且能够产生含有仅来自一个亲本的所有必要遗传信息的成体生物体。发育将随即正常发生，并且在许多有丝分裂后，该单细胞形成具有与原始生物体(即克隆)相同基因组的胚泡(具有约100个细胞的早期胚胎)。然后可以通过破坏该克隆胚胎获得干细胞来用于治疗性克隆或者在生殖性克隆的情况下，将克隆胚胎植入宿主母体(假孕/代孕)中用于进一步发育并达到足月生产。

“嵌合体”是指由遗传上不同的细胞组成的单一生物体。

“人源化”是指从非人类动物收取的器官或组织，其蛋白质序列和遗传互补更类似人类而不是非人类宿主。

“器官”是指在结构单元中连接的组织集合，以起到共同功能。如本文所用，“组织”是指来自相同来源的共同执行特定功能的类似细胞的集合。

无效合子生物体携带两个相同基因的突变或缺失等位基因。突变/缺失等位基因既是完全丧失功能，也是“无效”等位基因，所以纯合无效和无效合子是同义的。

基因敲除(缩写：KO)是一种遗传技术，其中生物体的两个等位基因都不起作用(生物体的“敲除”)。术语敲除、失活和破坏在本文中可互换使用，表示靶位点被改变，从而基因表达产物被消除或大大减少。也被称为敲除生物体或简单敲除。该术语也指产生这种生物体的过程，例如“敲除”基因。该技术本质上是基因敲入的反义词。

术语基因是广泛的，是指被表达以制造功能性产物的染色体DNA。基因有等位基因。基因编辑可能是单等位基因的或双等位基因的。

描述将两个多核苷酸“可操作地连接”是指单链或双链核酸部分包含以这样的方式排列在核酸部分内的两个多核苷酸，使得两个多核苷酸中的至少一个能够对另一个发挥其表征的生理作用。举例来说，可操作地连接至基因的编码区的启动子能够促进编码区的转录。

“重组多核苷酸”是指具有不天然连接在一起的序列的多核苷酸。扩增或组装的重组多核苷酸可包含在合适的载体中，并且该载体可用于转化合适的宿主细胞。

重组多核苷酸也可以起到非编码功能(例如启动子、复制起点、核糖体结合位点等)的作用。

包含重组多核苷酸的宿主细胞被称为“重组宿主细胞”。在重组宿主细胞中表达的基因(其中所述基因包含重组多核苷酸)产生“重组多肽”。

“重组细胞”是包含转基因的细胞。这种细胞可是真核细胞或原核细胞。此外，转基因细胞包括但不限于包含转基因的胚胎干细胞、得自衍生自转基因胚胎干细胞的嵌合哺乳动物的细胞(其中细胞包含转基因)、得自转基因哺乳动物的细胞、或其胎儿或胎盘组织、以及包含转基因的原核细胞。

术语“调节”是指刺激或抑制感兴趣的功能或活性。

如本文所用，“对其有需要的对象”是将受益于本发明的患者、动物、哺乳动物或人类。

如本文所用，“基本上同源的氨基酸序列”包括那些与参考抗体链的氨基酸序列具有至少约95％同源性、优选至少约96％同源性、更优选至少约97％同源性、甚至更优选至少约98％同源性、并且最优选至少约99％或更高同源性的氨基酸序列。氨基酸序列相似性或相同性可以通过使用BLASTP和TBLASTN程序计算，这两种程序采用BLAST(基本局部比对搜索工具)2.0.14算法。为本发明目的，使用这些程序的默认设置适合于鉴定基本相似的氨基酸序列。

“基本上同源的核酸序列”是指对应于参考核酸序列的核酸序列，其中对应序列编码的肽与参考核酸序列编码的肽具有基本相同的结构和功能；例如，其中只有不显著影响肽功能的氨基酸改变发生。优选地，基本相同的核酸序列编码由参考核酸序列编码的肽。基本相似的核酸序列与参考核酸序列之间的相同性百分比为至少约50％、65％、75％、85％、95％、99％或更多。核酸序列的基本相同性可以通过比较两个序列的序列相同性(例如通过物理/化学方法(即杂交)或通过计算机算法的序列比对)来确定。确定核苷酸序列是否与参考核苷酸序列基本上相似的合适的核酸杂交条件是：在50℃的7％十二烷基硫酸钠SDS、0.5M NaPO4，1mM EDTA中，并用50℃的2X标准柠檬酸盐溶液(SSC)、0.1％SDS洗涤；优选在50℃的7％(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中，并用50℃的1X SSC、0.1％SDS洗涤；优选在50℃的7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA中，并用50℃的0.5X SSC、0.1％SDS洗涤；更优选在50℃的7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA中，并用65℃的0.1X SSC、0.1％SDS洗涤。确定两个核酸序列的基本相似性的合适的计算机算法包括GCS程序包(Devereux等，1984Nucl.Acids Res.12：387)、和BLASTN或FASTA程序(Altschul等，1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990 87：14：5509-13；Altschul等，J.Mol.Biol.1990 215：3：403-10；Altschul等，1997Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)。为本发明目的，这些程序提供的默认设置适合于确定核酸序列的基本相似性。

“载体”是包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。本领域已知的多种载体包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应该解释为包括促进核酸向细胞的转移或递送的非质粒和非病毒化合物，例如多聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、重组病毒载体等。非病毒载体的实例包括但不限于脂质体、DNA的多胺衍生物等。

本文描述了涉及常规分子生物学技术的方法。这些方法在本领域中通常是已知的并在方法论文中详细描述，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook等,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；和Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel等,GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York,1992(定期更新)。例如，在Beaucage和Carruthers,Tetra.Letts.22:1859-1862,1981及Matteucci等,J.Am.Chem.Soc.103:3185,1981中讨论了核酸化学合成的方法。

术语“包含”、“含有”等可以具有美国专利法中赋予它们的含义，并且可以表示“包括”等。如本文所使用的，“包括”等意味着包括但不限于。

外源器官/组织产生

人源化的大型动物模型是再生医学的资源并将作为个性化人源化猪模型的平台。这一战略将改变目前慢性肌肉骨骼疾病和移植的临床实践范例。猪骨骼肌的除去(ablation)是独特的，因为它不仅旨在大动物模型中开发人源化骨骼肌，还因为它是规避免疫排斥的新方法，并且可以广泛地应用于外源性器官发育策略。

目前，对于进行性肌无力、肌肉骨骼疾病(例如肌肉萎缩症等遗传性疾病)或肌肉减少症(与衰老过程相关的肌无力和萎缩)有限的疗法是可用的。在某些情况下，晚期器官衰竭或需要组织治疗病况/疾病的唯一确定疗法是移植。移植的限制因素是供体器官/组织可得性。成千上万的患者可以从这种治疗中受益，但由于其合并疾病而不是适合移植候选者。因此，尸体或活体相关供体器官/组织存在着显著不足。此外，器官或组织的移植需要终身免疫抑制，这也具有有害的副作用。本文描述了在猪中产生人源化组织，特别是肌肉组织，其将作为用于移植的整个肌肉的无限资源并为治疗许多疾病和/或病况提供了范例转化平台。

兴趣集中在异种移植上。例如，通过胚泡互补过程在小鼠中产生大鼠胰腺(27)。在这些研究中，用来自于野生型(Wt)大鼠的多潜能干细胞(rPSC)注射Pdx1(用于胰腺发育的主调节基因)胚泡突变体(27)。将rPSC-注射的胚泡转移到代孕雌性小鼠中，产生了具有由大鼠细胞组成的功能性胰腺的小鼠嵌合体。这些研究证明了产生缺乏关键发育调节因子的胚泡，使胚胎完全缺少目标器官/组织。然后，这些突变体宿主为健康供体干细胞提供发育的“微环境”以填充并产生供体衍生的器官和/或组织。胚泡互补策略还产生了如啮齿动物的肾脏、胸腺和肝脏等器官，以及最近的猪胰脏(28-31)。

使用基因编辑平台，可以突变各种发育基因以产生器官和/或组织缺陷型猪，在其基础上可以部署胚泡互补以产生外源器官和/或组织。该系统的效率允许经验性地测试许多基因。多种调节基因的同时修饰允许复杂组织个体发育的调节。

肌肉疾病/病症

肌肉帮助你移动并帮助你的身体工作。不同类型的肌肉有不同的职责。有许多问题可以影响肌肉。肌肉病症可导致无力、疼痛或甚至麻痹。

肌肉疾病/病症的原因包括损伤或过度使用，如扭伤或劳损、绞痛或腱炎；遗传性病症如肌肉萎缩症、癌症、炎症如肌炎、影响肌肉的神经疾病、感染和某些药物。

肌病是一种肌肉疾病，其中肌纤维由于许多原因中的任何一种而不起作用，导致肌无力。“肌病”仅意味着肌肉疾病(myo-希腊语μυο"肌肉"+pathos-pathy希腊语"患有")。这个含义意味着主要缺陷在肌肉内，与神经(“神经病”或“神经原性”病症)或其他地方(例如大脑等)相反。肌肉绞痛、僵硬和痉挛也可能与肌病有关。

肌肉疾病可在自然界中分类为神经肌肉疾病或肌肉骨骼疾病。一些病况，如肌炎，可被认为同时是神经肌肉疾病和肌肉骨骼疾病。

全身性疾病中的肌病(也称为肌肉萎缩症)源自几种不同的疾病过程，包括遗传性(出生就患有)、内分泌、炎性(例如由皮肌炎、多发性肌炎引起的炎性肌病；包涵体肌炎、病毒性(HIV)、副肿瘤性、感染性、药物和毒素诱导性(如醇、皮质类固醇类、麻醉药类、秋水仙碱类、氯喹)、危重病性肌病、代谢性、副肿瘤性肌病、胶原相关性、伴有其他全身性疾病的肌病。全身性肌病患者通常表现出急性或亚急性。另一方面，家族性肌病或萎缩症通常以慢性方式存在，除了代谢性肌病之外，其中症状有时可急性发生。大多数炎性肌病可能与恶性病变有偶然关联；皮肌炎患者的发病率似乎特别增加。

肌病的种类很多：

遗传形式包括：萎缩症((或肌肉萎缩症)是以肌肉退化和再生为特征的肌病亚型。临床上，肌肉萎缩症通常是进行性的，因为肌肉的再生能力最终丧失，导致进行性无力，通常导致使用轮椅，最终导致死亡，通常与呼吸无力有关)、肌强直、神经性肌强直、先天性肌病(其不显示进行性肌肉萎缩症过程(即肌肉死亡)或炎症的证据，而是看到与肌肉的收缩能力降低相关的特征性微观变化。先天性肌病包括但不限于：纤维状肌病(特征在于肌肉中存在“纤维状棒”)、多轴空/微轴空肌病(multi/minicore myopathy)(特征在于多个小“核”或区域肌纤维破坏)、中央核性肌病(或肌管性肌病)(其中核在肌纤维中心异常发现)、罕见肌肉萎缩障碍(rare muscle wasting disorder))、线粒体肌病(其是由于为肌肉提供能量源的线粒体缺陷)、家族性周期性麻痹、炎性肌病(其由于免疫系统攻击肌肉组分而导致肌肉发炎迹象的问题所致)、代谢性肌病(其是主要影响肌肉的生化代谢缺陷导致的)、糖原贮积病(其可影响肌肉)和/或脂贮积症。

获得的形式包括：外部物质诱导的肌病、药物诱导的肌病、皮质类固醇肌病(由这类类固醇引起，增加肌肉蛋白质的分解，导致肌肉萎缩)、酒精性肌病、由于其他毒性剂引起的肌病、皮肌炎产生肌无力和皮肤变化；多发性肌炎产生肌无力、包涵体肌炎(是一种缓慢进行性疾病，产生握力无力和矫直膝盖)、骨化性肌炎、横纹肌溶解症和/或肌红蛋白尿。

MYF5/MYOD/MRF4

MYF5/MYOD/MRF4突变产生骨骼肌谱系缺陷猪胚胎(MYF5/MYOD/MRF4无效猪胚胎；细节见实施例2)。具体而言，在E18和E24收取的胚胎在肌节中不存在结蛋白，但保留了心脏结蛋白。此外，通过注射GFP标记的猪卵裂球进入无效胚泡，猪：猪互补使用PCR、组织学和免疫组化方法加以证明。在这些互补的胚胎中，GFP与体节中的结蛋白共定位在一起(E24)。对MYF5/MYOD/MRF4进行多重基因编辑产生允许微环境，利用具有多潜能能力的猪干细胞用肌肉重新填充该微环境，产生野生型猪骨骼肌。该基因编辑的猪模型缺乏MYF5/MYOD/MRF4，将被用于在将人类干细胞递送到突变体桑葚胚或胚泡中之后产生人源化骨骼肌。

人源化的大型动物模型将成为再生医学的重要资源并将成为制造个体化器官的平台。这一策略可以转化目前肌肉疾病和移植的临床实践范例。迄今为止，在小鼠与大鼠之间进行了外源性移植器官(27,29)；以及在猪与猪之间(31)，并没有报道人源化器官在大型动物模型中的成功开发。美国临时申请系列第62/247,092；62/247096和62/247,122号在此通过引用并入本文。

以下实施例旨在进一步说明本发明的某些实施方案，而不意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1

材料与方法

成年母猪/小母猪：家养的母本雌性猪(8-12个月大)将用作为胚胎移植受体并在批准的IACUC方案下，在预期妊娠和母猪生产中如同普通家养猪那样照顾和维持。

同期发情和受精：在成年母猪发情周期的第11-22天，将6.8mL的Matrix(烯丙孕素2.2mg/mL)混合到其早晨饲料中以使发情期同步。律胎素(Lutalyse)(2cc)将在Matrix的最后一天和四天后IM施用。在施用Matrix之后第6天开始，成年母猪每天检查两次发情期。在第一次检测到发情期后，成年母猪将用来自选定公猪的精液至多授精三次。使用多普勒超声或通过线性5m Hz传感器经腹部超声在妊娠期23-90天间检查成年母猪的怀孕情况。超声的形式都不是侵入性的，不会损害成年母猪或胎儿。可以从怀孕小母猪/成年母猪采取血样以确定在兽医的要求下是否存在任何疾病或用于遗传分析。

胚胎移植：重建的克隆胚胎手术转移到异步受体雌性猪的子宫内。对于手术胚胎移植，用以下组合诱导麻醉：氯胺酮(2mg/kg)、替来他明/唑拉西泮(0.25mg/kg)、甲苯噻嗪(1mg/kg)和阿托品(0.03mg/kg；全部来自Iowa Veterinary Supply)。在剩余过程中用异氟烷或七氟烷(5％诱导，维持在1-4％以保持在手术平面)维持全身麻醉。在背卧时，受体为手术进行无菌准备，并且做一个尾腹侧切口来暴露和检查生殖道，包括子宫、输卵管和卵巢。通常，使用5.5英寸导管(Iowa Veterinary Supply)将150-200个重建的克隆胚胎置于输卵管的峡部。将子宫放回腹膜腔，缝合受体动物并置于术后恢复。在妊娠期间，用附有3.5MHz经腹部探头的Aloka 500超声扫描仪(Aloka Co.Ltd,Wallingford,CT)进行实时超声检查以确认和监测妊娠。受体饲养将与正常妊娠母猪一样维持。对于仔猪生产，受体将被允许自然分娩或在妊娠118天之前通过剖腹产分娩。必要时可提供初乳喂养和强化新生儿支持，包括Nurtinger饲养单位。

Myf5、Myod、和Mrf4是肌生成的调节物

包括Myod、Mrf5、Mrf4和Myog的Myod家族的发现为了解骨骼肌肌生成的调节机制提供了基础平台(6-8)。

已经采用多种策略来研究Myod家族在肌生成过程中的调节网络，如转录组分析、启动子分析和ChIP-seq(6-7；10)。Myod家族成员是主要的肌源性调节子，因为他们反式激活广谱基因家族(包括肌特异性基因、转录因子、细胞周期基因等)以促进肌源细胞命运(6-7；10-11)。之前的基因破坏研究已经证明缺少Myf5/Myod/MRF4的小鼠缺乏骨骼肌并且在出生后早期致死，这大概是由于它们无能力呼吸(由于没有横膈膜)(8)。

利用TALEN和同源依赖性修复(HDR)敲除MYOD、MYF5和MRF4

为检测MYF5/MYOD/MRF4(又叫MYF6)在猪中的作用，在猪成纤维细胞中利用在基因侧翼的两个TALEN对去除每个编码序列(图3)。

MYF5/MYOD/MRF4敲除的猪胚胎缺乏骨骼肌谱系

收取MYF5/MYOD/MRF4无效胚胎并在E18.0分析(图4A和4B)。在无效中，与Wt胚胎相比，肌节发育受损，结蛋白不存在。相反，在无效中，心脏结蛋白保留，表明基因编辑的特异性。在小鼠和猪中的结果反映了相似表型，并支持MYF5/MYOD/MRF4的功能在小鼠和猪中是保守的观点，因为突变胚胎缺乏骨骼肌。这些数据表明，本领域技术人员可以将多个突变导入猪基因组中以支持将有多于一种细胞类型被人源化的嵌合器官的生长。

用GFP WT猪卵裂球互补MYF5/MYOD/MRF4敲除的表型

使用SCNT产生猪MYF5/MYOD/MRF4无效胚泡，并注射GFP标记的猪卵裂球(因为没有经验证的猪ES细胞可用，该实验用卵裂球)。将所得的嵌合体植入假孕成年母猪中并在E20检查。因为肝和卵黄囊是GFP阳性的，证明了互补的可行性。此外，通过PCR分析，约10％的猪MYF5/MYOD/MRF4无效胚泡是GFP标记的。这些数据支持在猪突变体宿主中，猪：猪互补的可行性。

人类诱导性人类多潜能干细胞(hiPSC)整合到猪孤雌生殖体的内细胞团、胚泡、并选择人类干细胞供体

提供的额外数据表明产生人-猪嵌合体。检测了人类脐带血干细胞(hUCBSC)和hiPSC整合到猪胚泡中并参与胚胎发育的能力。使用电刺激卵母细胞产生猪孤雌生殖的胚泡(并且超过妊娠中期是没有活力的)。活化6天后，将9-12个染料标记的hUCBSC或hiPSC注射到胚泡腔内。允许胚泡在培养基中恢复两天，然后成像(图5)。标记的hUCBSC和hiPSC在90％的猪胚泡内细胞团中观察到(分别是图5A和5B)。使用人类细胞核抗原特异性抗体(HNA)免疫组化比较DiI分布，揭示了HNA抗体检测到注入的人类干细胞(图5A，箭头)。注射EdU标记hiPSC的胚泡在收取前用BrdU进一步脉冲1小时以检测增殖细胞。用EdU双标记显示注射48小时后，注射的人类干细胞继续增殖(图5B，箭头)。这些结果表明为了准备移植到子宫内，将人类干细胞掺入猪胚泡的ICM中，并且将嵌合胚泡发育进展到孵化阶段。

在猪中利用新的基因编辑策略，数据表明hiPSC将会参与猪胚胎(桑椹胚或胚泡)发育。因此，人类干/祖细胞群可拯救MYF5/MYOD/MRF4突变猪胚胎。干细胞(例如hiPSC)可以是MYF5/MYOD/MRF4突变早期胚胎中每个骨骼肌细胞的祖细胞。

近期研究表明，使用缺乏关键调节基因的遗传突变宿主的胚泡互补策略已经在猪中产生供体器官(1-4)。TALEN介导的技术(21、22)用于本文以成功敲除猪胚胎中的MYF5/MYOD/MRF4并且数据支持这些突变胚胎缺乏肌节和结蛋白的观点(图4)。本文提供的证据表明，WT-GFP标记的猪卵裂球填充了猪MYF5/MYOD/MRF4无效宿主的骨骼肌谱系(图6)，表明MYF5/MYOD/MRF4是产生骨骼肌互补宿主的理想靶。这些数据进一步支持人类干细胞(人类脐带血干细胞和人类iPSC)可以整合到猪孤雌生殖的ICM的观点(图5)。

实施例2

材料与方法

TALEN设计和产生

使用在线工具“TAL EFFECTOR NUCLEOTIDE TARGETER 2.0”鉴定候选TALEN靶DNA序列和RVD序列。然后使用RCIscript-GOLDYTALEN(Addgene ID 38143)作为最终目的载体，按照Golden Gate Assembly方法构建用于TALEN DNA转染或体外TALEN mRNA转录的质粒(Carlson 2012)。如前所述，使用QIAPREP SPIN MINIPREP试剂盒(Qiagen)制备的组装RCIscript载体通过SacI线性化以用作使用mMESSAGET3试剂盒(Ambion)体外TALEN mRNA转录的模板(Carlson,2009)。纯化之前，使用MEGACLEAR REACTIONCLEANUP试剂盒(Applied Biosciences)或RNeasy试剂盒(Qiagen)用DNAse处理所得的mRNA。

组织培养和转染

将猪成纤维细胞在补充有10％胎牛血清、100I.U./mL青霉素和链霉素、2mM L-谷氨酰胺和10mM Hepes的DMEM中，在5％CO2、37或30摄氏度保持(如所示)。使用Neon转染系统(Life Technologies)来递送TALEN和HDR寡核苷酸。当低传代Ossabaw或者Landrace猪成纤维细胞在70-100％汇合度时，以1:2传代，并在第二天到70-80％汇合度时收取。将大约600,000个细胞与mRNA TALEN和HDR寡核苷酸重悬于“R”缓冲液(Life Technologies)中，并使用以下参数在100uL吸头中进行电穿孔：输入电压：1800V；脉冲宽度：20ms；脉冲数：1。每个转染包括针对感兴趣的特定基因的0.1-4ug的TALEN mRNA和0.1-0.4nmol的HDR寡核苷酸。将转染的细胞在30摄氏度培养2或3天，然后分析基因编辑效率，并铺板形成集落。

稀释克隆

转染后两或三天，将50到250个细胞接种到10cm培养皿中并培养直到单个集落直径达到约5mm。加入8mL的以1:4(体积/体积)的TrypLE和DMEM培养基(Life Technologies)混合物并吸出集落，转移到48孔板和96孔复制板中的孔中并在相同条件下培养。收集达到汇合的集落并进行冷冻保存和用于基因型分型的样品制备。

样品制备

从6孔培养皿的孔中收集第3天和第10天的转染细胞群，并将10-30％重悬于50μl如下的1X PCR相容裂解缓冲液中：10mM Tris-Cl pH 8.0、2mM EDTA、0.45％Tryton X-100(体积/体积)、新鲜补充有200μg/ml蛋白酶K的0.45％Tween-20(体积/体积)。使用以下程序在热循环仪中处理裂解物：55℃60分钟，95℃15分钟。

分析基因编辑

使用AccuStart^TM Taq DNA聚合酶HiFi(Quanta Biosciences)根据制造商的推荐用1μl细胞裂解物进行预期位点侧翼的PCR。使用SURVEYOR MUTATION DETECTION Kit(Transgenomic)根据制造商的推荐使用10μl如上所述的PCR产物分析群体中的突变频率。SURVEYOR反应在10％TBE聚丙烯酰胺凝胶上解析并通过溴化乙锭染色显现。使用ImageJ进行带的密度计量测量；并且如(Guschin等，2010)中所述计算SURVEYOR反应的突变率。使用针对ssMYOD中的HDR等位基因的ssMYOD NJ F2至ssMYOD NJ R2引物、针对ssMYF5中的HDR等位基因的ssMYF5NJ F1至ssMYF5NJ R1引物、以及针对ssMYF6中的HDR等位基因的ssMYF6 NJF1至ssMYF6 NJ R1引物，针对HDR等位基因的存在筛选个体集落。对于PCR产物进行通过用HindIII消化所得的PCR扩增子的限制性片段长度多态性分析(RFLP)以确定等位基因中是否有一个、两个或没有被切割并且因此含有HDR等位基因。在琼脂糖凝胶上解析产物。

猪基因:MYOD NC_010444

人类基因:MYOD ENSG00000129152

移码KO等位基因：在ssMYOD的外显子1中加入一个移码和一个提前终止密码子

TALEN:

ssMYOD 1.2(从5'到3')

左:CAAGAGGTGCACCAC(SEQ ID NO:1)

右:AGGCTGCCCAAGGTGG(SEQ ID NO:2)

ssMYOD 1.2HDR寡核苷酸

下划线＝来自MYOD 1.2切割位点右侧的52bp同源物

粗体＝来自MYOD 1.2切割位点左侧的33bp同源物

斜体＝插入碱基

下划线＝HindIII位点

大写＝提前终止密码子

ssMYOD NJ F2至ssMYOD NJ R2的完整序列：

筛选引物：

ssMYOD NJ F2:CGACGTAGATTTGACGGGCC(SEQ ID NO:4)

ssMYOD NJ R2:CGCTGATTCGGGTTGCTAGA(SEQ ID NO:5)

这是当HDR发生时的PCR预测产物：

这是野生型等位基因的PCR预测产物：

Cgacgtagatttgacgggccccgacggctctctctgcaactttgcaacagcggacgacttctatgatgacccgtgtttcgactccccggacctgcgcttcttcgaggacctggacccgcgccttgtgcacgtgggcgcgctcctaaagcccgaggaacactcgcacttccctgccgcagcgcacccggccccgggagctcctgaggacgagcatgtgcgcgcgcccagcgggcaccaccaggcgggccgctgtctactgtgggcctgcaaggcgtgcaaacgcaagaccactaacgccgaccgccgcaaggccgccaccatgcgcgagcggcgccgcttgagcaaagtcaacgaggccttcgagactctcaagcgctgcacgtctagcaacccgaatcagcg(SEQ ID NO:7)

猪基因:MYF5ENSSSCG00000000937

人类基因:MYF5ENSG00000111049

移码KO等位基因：在ssMYF5的外显子1中加入一个移码和一个提前终止密码子

TALEN:

ssMYF5 1.1(从5'到3')

左:GCCTCATGTGGGCCTG(SEQ ID NO:8)

右:AAATCCACCACCATGG(SEQ ID NO:9)

ssMYF5 1.1HDR寡核苷酸

下划线＝来自MYF5 1.1切割位点右侧的42bp同源物

粗体＝来自MYF5 1.1切割位点左侧的43bp同源物

斜体＝插入碱基

下划线＝HindIII位点

大写＝提前终止密码子

ssMYF5 NJ F1至ssMYF5NJ R1的完整序列：

筛选引物：

ssMYF5 NJ F1:GCCTGTCCGCAGAAGATGGA(SEQ ID NO:10)

ssMYF5 NJ R1:TTACCATGCCGTCGGAGCAG(SEQ ID NO:11)

这是当HDR发生时的PCR预测产物：

这是野生型等位基因的PCR预测产物：

Gcctgtccgcagaagatggacctgatggacggctgccagttctcgccttctgagtacttctacgatggctcctgcatcccatcccccgagggcgagttcggggacgagtttgagccacgagtggctgctttcggggcgcacaaagcagacctgcccggctcagacgaggaagagcacgtgcgagcacctacgggccaccaccaggccggccactgcctcatgtgggcctgcaaagcgtgcaagaggaaatccaccaccatggatcggcggaaggcggccaccatgcgcgagcggagacgcctgaagaaggtcaaccaggcgtttgagacgctcaagaggtgcaccacgactaaccccaaccagaggctgcccaaggtggagatcctcaggaatgccatccgctacattgagagcctgcaggagctgctgagggagcaggtggaaaactactacagcctgcccaggcagagctgctctgagcccaccagccccacctccagctgctccgacggcatggtaa(SEQ ID NO:13)

猪基因:MYF6 ENSSSCG00000026533(也被称为MRF4)

人基因:MYF6 ENSG00000111046

移码敲除等位基因：在ssMYF6的外显子1中加入一个移码和一个提前终止密码子

TALEN:

ssMYF6 1.2(从5'到3')

左:GCCAGGACCAAATGCC(SEQ ID NO:14)

右:GACAGCAGTGGAGAGGA(SEQ ID NO:15)

ssMYF6 1.2HDR寡核苷酸

下划线＝来自MYF6 1.2切割位点右侧的32bp同源物

粗体＝来自MYF6 1.2切割位点左侧的54bp同源物

斜体＝插入碱基

下划线＝HindIII位点

大写＝提前终止密码子

ssMYF6 NJ F1至ssMYF6 NJ R1的完整序列：

筛选引物：

ssMYF6 NJ F1:ATCTGGGTGGCTCCTCTGGGTT(SEQ ID NO:18)

ssMYF6 NJ R1:TAGTTGATGGCGCTCCGCAG(SEQ ID NO:19)

这是当HDR发生时的PCR预测产物：

这是野生型等位基因的PCR预测产物：

Atctgggtggctcctctgggtttttgagcccatcacccagttcagaccgagtcagaggccaaggaggagaacatgatgatggacctttttgaaactggctcctatttcttctatttggacggggaaaatgttaccctgcagcccctagaagtggcagaaggctctcctttgtatccagggagtgatggtaccctgtccccctgccaggaccaaatgcccccggaagctgggagcgacagcagtggagaggaacatgtcctggcgcccccaggcctgcagcctccccactgccccggccaatgtctgatctgggcttgcaagacctgcaagagaaaatctgccccaaccgaccgcaggaaggcggccactctgcgcgagaggaggcggctgaagaaaatcaacgaggccttcgaggcactgaagcggcggactgtggccaaccccaaccaaaggctgcccaaggtggagatcctgcggagcgccatcaacta(SEQ ID NO:21)

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本公开通篇引用的所有出版物、专利、和专利申请、Genbank序列、网站和其他公开材料在此通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利、或专利申请、Genbank序列、网站和其他公开材料被具体地和单独地指示为通过引用并入。如果通过引用并入的术语的定义与本文定义的术语冲突，则应以本说明书为准。

Claims

1.非人类动物细胞、桑椹胚或胚泡，其中基因组在MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合中的两个等位基因中携带突变，使得所述非人类动物细胞或胚泡缺乏功能性MYF5蛋白、MYOD蛋白、MRF4蛋白或其组合。

2.权利要求1的非人类动物细胞、桑椹胚或胚泡，其中所述突变是MYF5基因、MYOD基因和/或MRF4基因的缺失。

3.权利要求1或2的非人类动物细胞、桑椹胚或胚泡，其中所述非人类动物细胞、桑椹胚或胚泡为猪、牛、马或山羊的。

4.嵌合非人类动物、桑椹胚或胚泡，其表达人类MYF5、MYOD和/或MRF4并且缺乏所述非人类动物MYF、MYOD和/或MRF4的表达。

5.权利要求4的嵌合非人类动物，其中所述非人类动物产生人源化骨骼肌细胞和/或组织。

6.表达外源猪MYF5、MYOD、MRF4或其组合并且缺乏内源猪MYF5、MYOD、MRF4或其组合的表达的嵌合猪(猪-猪嵌合体)。

7.权利要求4或5的嵌合非人类动物，其中所述非人类动物是猪、牛、马或山羊。

8.产生表达人类MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的嵌合非人类动物的方法，包括：

a)产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类动物细胞，其中猪MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的两个拷贝携带突变以防止在所述非人类动物中产生功能性MYF5蛋白、MYOD蛋白、MRF4蛋白或其组合；

b)通过体细胞核移植产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类桑椹胚或者胚泡，包括将来自a)的所述MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类动物细胞的核融合至去核非人类卵母细胞中并活化所述卵母细胞分裂以形成MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类胚泡；

c)将人类干细胞引入b)的MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类桑椹胚或者胚泡中；和

d)将来自c)的所述桑椹胚或者胚泡移植到假孕的代孕非人类动物中以产生表达人类MYF5、MYOD、MRF4或其组合的嵌合非人类动物。

9.产生表达外源MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的嵌合猪的方法，包括：

a)产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效猪细胞，其中内源猪MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合基因的两个拷贝携带突变以防止产生功能性内源猪MYF5蛋白、MYOD蛋白、MRF4蛋白或其组合；

b)通过体细胞核移植产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效猪胚泡，包括将来自a)的所述MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效猪细胞的核融合至去核猪卵母细胞中并活化所述卵母细胞分裂以形成MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效猪胚泡；

c)将猪干细胞引入b)的猪MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效胚泡中；和

d)将来自c)的所述胚泡移植到假孕的代孕猪中以产生表达外源猪MYF5、MYOD、MRF4或其组合的嵌合猪。

10.在非人类动物中产生人类和/或人源化骨骼肌细胞的方法，包括：

a)产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类动物细胞，其中非人类动物MYF5基因、MYOD基因、MRF4基因或其组合的两个等位基因携带突变以防止产生功能性MYF5蛋白、MYOD蛋白、MRF4蛋白或其组合；

b)通过体细胞核移植产生MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类动物胚泡或桑椹胚，包括将来自a)的所述MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类动物细胞的核融合至去核非人类卵母细胞中并活化所述卵母细胞分裂以形成MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类胚泡；

c)将人类供体干细胞引入b)的MYF5、MYOD、MRF4或其组合无效非人类胚泡或桑椹胚中；和

d)将来自c)的所述胚泡或桑椹胚移植到假孕的代孕非人类动物中以产生表达人类或人源化骨骼肌细胞的非人类动物。

11.权利要求8或10的方法，其中所述非人类动物是猪、牛、马或山羊。

12.权利要求8或10的方法，其中所述人类供体干细胞是组织特异性干细胞、多潜能干细胞、多能成体干细胞、诱导性多潜能干细胞或脐带血干细胞(UCBSC)。

13.权利要求8或10所述的方法，其中所述诱导性多潜能细胞由成纤维细胞形成。

14.通过权利要求8-13任一项的方法产生的非人类动物。