JP2018523999A - ヒト化心筋 - Google Patents
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Abstract
ヒトNKX2-5、HANDII、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物を作製する方法であって、以下の工程を含む方法が、本明細書に記載されている：(a)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト動物細胞を作製する工程であって、非ヒトNKX2-5、HANDII、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの両方のコピーが、非ヒト動物内での機能的なNKX2-5、HANDII、TBX5タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；(b)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(a)の非ヒト動物細胞由来の核を除核非ヒト卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト胚盤胞を形成するよう分裂させることを含む体細胞核移植によって、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト胚盤胞を作製する工程；(c)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の非ヒト胚盤胞にヒト幹細胞を導入する工程；および、(d)偽妊娠代理非ヒト動物に(c)由来の胚盤胞を移植して、ヒトNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせを発現するキメラ非ヒト動物を作製する工程。
Description
優先権の主張
本願は、その優先権の恩典が本願で主張され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2015年6月30日出願の米国仮特許出願第62/187,040号の優先権の恩典を主張する。
本願は、その優先権の恩典が本願で主張され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2015年6月30日出願の米国仮特許出願第62/187,040号の優先権の恩典を主張する。
発明の背景
先天性心疾患（CHD）は、すべての出生児の約1％が患い、高い発病率および死亡率を有する（1〜5）。心血管疾患は、世界で第一位の死因であり、1900年以降毎年米国において最も一般的な死因となっている。今日、成人の3人に1人は、心血管疾患と共に生きている。最後に、先天性心臓欠陥は、一般集団において最も一般的な形態の出生異常であり、小児科集団および成人集団において進行または末期心不全に寄与する。先天性心疾患およびその他の心血管疾患は、心不全に発展し得る。末期心不全に対する唯一の治療は心臓移植であるが、移植用の器官の不足により、ごくわずかな患者しかそのような救命治療を受けることができない。心臓移植を受けた患者は、心臓の拒絶を防ぐための医薬が必要となり、これらの医薬は多くの場合、長期的な副作用を有し、これによっても生存が制限される。
先天性心疾患（CHD）は、すべての出生児の約1％が患い、高い発病率および死亡率を有する（1〜5）。心血管疾患は、世界で第一位の死因であり、1900年以降毎年米国において最も一般的な死因となっている。今日、成人の3人に1人は、心血管疾患と共に生きている。最後に、先天性心臓欠陥は、一般集団において最も一般的な形態の出生異常であり、小児科集団および成人集団において進行または末期心不全に寄与する。先天性心疾患およびその他の心血管疾患は、心不全に発展し得る。末期心不全に対する唯一の治療は心臓移植であるが、移植用の器官の不足により、ごくわずかな患者しかそのような救命治療を受けることができない。心臓移植を受けた患者は、心臓の拒絶を防ぐための医薬が必要となり、これらの医薬は多くの場合、長期的な副作用を有し、これによっても生存が制限される。
臨床用の個人向けヒト／ヒト化心筋組織／心筋細胞の作製のための宿主としての、NKX2-5/HANDII/TBX5ノックアウトブタまたは他の動物、例えばウシもしくはヤギの開発が、本明細書に開示されている。
遺伝子編集技術を用いて、NKX2-5/HANDII/TBX5ヌルであるブタ胚を作製し、我々は、ヒト幹細胞を用いてヒト・動物キメラを作製した。NKX2-5/HANDII/TBX5の多遺伝子編集を行うことで、ヒト化心臓細胞および／または組織（器官、例えば心臓を含む）を生成する、多能性を有するヒト細胞を用いた心臓の複製のための寛容なニッチが提供される。
1つの態様は、非ヒト動物細胞、桑実胚または胚盤胞が、機能的なNKX2-5タンパク質、HANDIIタンパク質、TBX5タンパク質またはそれらの組み合わせを欠くよう、そのゲノムがNKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの両方の対立遺伝子に変異を有する、非ヒト動物細胞、桑実胚または胚盤胞を提供する。1つの態様において、変異は、NKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの欠失である。別の態様において、非ヒト動物細胞、桑実胚または胚盤胞は、ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである。
1つの態様は、ヒトNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせを発現し、非ヒト動物NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせの発現を欠く、キメラ非ヒト動物桑実胚または胚盤胞を提供する。1つの態様において、非ヒト動物は、ヒト化心臓細胞および／または組織を生成する。
1つの態様は、外因性ブタNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせを発現し、内因性ブタNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせの発現を欠く、キメラブタ（ブタ・ブタキメラ）を提供する。1つの態様において、非ヒト動物は、ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである。
1つの態様は、ヒトNKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせを発現するキメラ非ヒト動物を作製するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：（a）NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト動物細胞を作製する工程であって、非ヒトNKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの遺伝子の両方のコピーが、機能的なNKX2-5タンパク質、HANDIIタンパク質、TBX5タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；（b）NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(a)の非ヒト細胞由来の核を除核非ヒト卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト桑実胚または胚盤胞を形成するよう分裂させる工程を含む体細胞核移植によって、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト桑実胚または胚盤胞を作製する工程；(c)非ヒトNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の非ヒト桑実胚または胚盤胞にヒト幹細胞を導入する工程；および(d)偽妊娠代理非ヒト動物に(c)由来の桑実胚または胚盤胞を移植して、ヒトNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせを発現するキメラ非ヒト動物を作製する工程。
別の態様は、外因性NKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせを発現するキメラブタを作製するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：（a）NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ細胞を作製する工程であって、内因性ブタMYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの遺伝子の両方のコピーが、機能的な内因性ブタMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；(b)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(a)のブタ細胞由来の核を除核ブタ卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を形成するよう分裂させる工程を含む体細胞核移植によって、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を作製する工程；(c)ブタNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の桑実胚または胚盤胞にブタ幹細胞を導入する工程；および(d)偽妊娠代理ブタに(c)由来の桑実胚または胚盤胞を移植して、外因性ブタNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせを発現するキメラブタを作製する工程。
別の態様は、非ヒト動物においてヒトまたはヒト化心臓細胞を生成する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：（a）NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト細胞を作製する工程であって、非ヒトNKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの両方の対立遺伝子が、機能的な非ヒトNKX2-5タンパク質、HANDIIタンパク質、TBX5タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；(b)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(a)の非ヒト細胞由来の核を除核非ヒト動物卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト動物桑実胚または胚盤胞を形成するよう分裂させる工程を含む体細胞核移植によって、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト桑実胚または胚盤胞を作製する工程；(c)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の非ヒト動物胚盤胞または桑実胚にヒト幹細胞を導入する工程；および(d)偽妊娠代理非ヒト動物に(c)由来の胚盤胞または桑実胚を移植して、ヒトまたはヒト化心臓細胞を発現する非ヒト動物を作製する工程。
1つの態様において、非ヒト動物は、ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである。別の態様において、ヒト幹細胞は、組織特異的幹細胞、多能性幹細胞、分化多能性成体幹細胞、人工多能性幹細胞または臍帯血幹細胞（UCBSC）である。別の態様において、人工多能性細胞は、線維芽細胞から形成される。
1つの態様は、機能的なNKX2-5タンパク質、HANDIIタンパク質、TBX5タンパク質またはそれらの組み合わせを欠くよう、そのゲノムがNKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの両方の対立遺伝子に変異を有するブタ細胞、桑実胚または胚盤胞を提供する。1つの態様において、変異は、NKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの欠失である。
1つの態様は、ヒトNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせを発現し、ブタNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせの発現を欠くキメラブタを提供する。1つの態様において、キメラブタは、ヒト化心臓細胞および／または組織を生成する。
1つの態様は、ヒトNKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせを発現するキメラブタを作製するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：(a)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ細胞を作製する工程であって、ブタNKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの遺伝子の両方のコピーが、機能的なブタNKX2-5タンパク質、HANDIIタンパク質、TBX5タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；(b)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(a)のブタ細胞由来の核を除核ブタ卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を形成するよう分裂させる工程を含む体細胞核移植によって、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を作製する工程；(c)ブタNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の桑実胚または胚盤胞にヒト幹細胞を導入する工程；および(d)偽妊娠代理ブタに(c)由来の桑実胚または胚盤胞を移植して、ヒトNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせを発現するキメラブタを作製する工程。
別の態様は、ブタにおいてヒト化心臓細胞を生成する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：(a)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ細胞を作製する工程であって、ブタNKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの両方の対立遺伝子が、機能的なブタNKX2-5タンパク質、HANDIIタンパク質、TBX5タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；(b)MYF5、MYOD、NRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(a)のブタ細胞由来の核を除核ブタ卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を形成するよう分裂させる工程を含む体細胞核移植によって、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を作製する工程；(c)ブタNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(b)のブタ胚盤胞にヒト幹細胞を導入する工程；および(d)偽妊娠代理ブタに(c)由来の胚盤胞を移植して、ヒト化心臓細胞を発現するブタを作製する工程。1つの態様において、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト多能性幹細胞またはヒト臍帯血幹細胞である。別の態様において、ヒト人工多能性細胞は、線維芽細胞から形成される。
各レシピエントの免疫複合体に特化したヒトまたはヒト化組織および器官を作製することが有用であろう。本明細書に開示されているように、宿主として大型動物を使用し、標的器官の成長および／または分化を担う遺伝子をノックアウトまたは失活させるようそのゲノムを編集し、胚盤胞または受精卵段階のその動物にドナー幹細胞を接種してその器官の成長および発生に関する失われた遺伝情報を補完することによって、それが実現する。その結果は、補完された組織（ヒト／ヒト化器官）がドナーの遺伝子型および表現型に適合しているキメラ動物である。そのような器官は一世代で作製され得、幹細胞は、患者自身の身体から採取または生成され得る。本明細書に開示されているように、細胞内で複数の遺伝子を同時に編集することによって、それが実現する（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、WO 2015/168125を参照のこと）。複数の遺伝子は、脊椎動物細胞または胚において標的化されたヌクレアーゼおよび相同組み換え修復（HDR（homology directed repair））テンプレートを用いて編集のために標的化され得る。
発明の詳細な説明
心血管疾患は、この国および世界で第一位の死因である。今日、成人の3人に1人は、心血管疾患と共に生きている。先天性心臓欠陥は一般的であり、末期心不全に発展し得る。心臓移植が末期心不全に対する唯一の治療であるが、ドナー器官の入手性の制限により、ごくわずかな患者しかこの治療を受けることができない。要するに、この治癒的な治療を必要とする患者を処置するための心臓の供給が不十分である。さらに、先天性または心不全疾患に対する新規のデバイス、薬理学的または外科的治療法を試験するための関連するヒトモデルが存在しない。第3に、心臓移植の必要性をなくし得る、心臓再生を促進する因子を同定または試験するための関連するヒトモデルが存在しない。最後に、患者自身の幹細胞を用いて作製することができる（それによって、臓器提供またはヒト胚性幹細胞の使用等の倫理的問題を取り除く）個人向けヒト組織の供給源が、本明細書に記載されている。したがって、大型動物モデルにおいてヒト化された心臓を作製することにより当技術分野に革命を起こす新技術の利用が、本明細書に提供されている。
心血管疾患は、この国および世界で第一位の死因である。今日、成人の3人に1人は、心血管疾患と共に生きている。先天性心臓欠陥は一般的であり、末期心不全に発展し得る。心臓移植が末期心不全に対する唯一の治療であるが、ドナー器官の入手性の制限により、ごくわずかな患者しかこの治療を受けることができない。要するに、この治癒的な治療を必要とする患者を処置するための心臓の供給が不十分である。さらに、先天性または心不全疾患に対する新規のデバイス、薬理学的または外科的治療法を試験するための関連するヒトモデルが存在しない。第3に、心臓移植の必要性をなくし得る、心臓再生を促進する因子を同定または試験するための関連するヒトモデルが存在しない。最後に、患者自身の幹細胞を用いて作製することができる（それによって、臓器提供またはヒト胚性幹細胞の使用等の倫理的問題を取り除く）個人向けヒト組織の供給源が、本明細書に記載されている。したがって、大型動物モデルにおいてヒト化された心臓を作製することにより当技術分野に革命を起こす新技術の利用が、本明細書に提供されている。
移植用心臓／組織の無限の供給源として機能し、ヒト心臓の再生および／または実験的医薬に対するヒト心臓の応答を研究するための大型動物モデルを提供するであろうブタにおいてヒト器官（心臓）／ヒト化組織を作製するための組成物および方法が、本明細書に示されている。
特に、そのような治療からの利益を享受するであろう数百万の人々に個人向け心臓組織または心臓を提供するための組成物および方法が、本明細書に提供されている。このストラテジーは、心血管医学に革命を起こし、この深刻な疾患に対する救済を提供するであろう。個人向け心臓弁、心臓組織、冠動脈および心臓全体が患者のために利用可能となり得、それによって免疫抑制剤の使用が回避されるであろう。さらに、他の組織、例えば、個人向け血液、血管、筋肉、骨および肺の作製のためのプラットフォームが、本明細書に提供されている。
以前に、心臓発生に必要かつ十分なネットワークを定義するために、トランスジェニックおよび遺伝子破壊マウスモデルが作製された。心臓の発生の転写活性化因子として、血液形成の抑制因子としておよびマスター内皮／心内膜因子であるEtv2の活性化因子としてのNkx2-5の役割（5〜21）が実証されている。このデータおよび他の刊行物に基づき、Nkx2-5/Hand2/Tbx5に関する変異動物は、心臓を完全に欠くであろうと考えられた（22〜26）。最新の遺伝子編集技術を用いて、発生初期の段階で致死的であり、心血管系統が破壊されているまたは存在しない、変異ブタ胚を作製した。心血管疾患の処置のためのヒト組織の新しい供給源として機能するのに加えて、ヒト化ブタはまた、ヒト系統の再生または薬理学的作用物質に対する応答を研究するための大型動物モデルとしても機能し得、先天性および心不全疾患を含む心血管疾患の治療を改善し得る。このアプローチは、ブタ宿主において心血管系統を支配するネットワークおよび幹細胞集団を解読し、ヒト特異的組織を生成する創造的かつ新規の技術を結集させたものである。
定義
以下の定義は、本明細書および特許請求の範囲の明確かつ一貫性のある理解を提供するために含まれている。本明細書で使用される場合、列挙されている用語は以下の意味を有する。本明細書で使用される他の用語およびフレーズはすべて、当業者が理解しているであろうそれらの通常の意味を有する。そのような通常の意味は、技術辞書、例えばHawley's Condensed Chemical Dictionary 14th Edition, by R.J. Lewis, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2001を参照することによって知ることができる。
以下の定義は、本明細書および特許請求の範囲の明確かつ一貫性のある理解を提供するために含まれている。本明細書で使用される場合、列挙されている用語は以下の意味を有する。本明細書で使用される他の用語およびフレーズはすべて、当業者が理解しているであろうそれらの通常の意味を有する。そのような通常の意味は、技術辞書、例えばHawley's Condensed Chemical Dictionary 14th Edition, by R.J. Lewis, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2001を参照することによって知ることができる。
本明細書における「1つの態様」、「態様」等の参照は、記載される態様がある特定の局面、特性、構造、部分または特徴を含み得るが、必ずしもすべての態様がその局面、特性、構造、部分または特徴を含むとは限らないことを示している。さらに、そのようなフレーズは、本明細書の他の部分で参照されている同じ態様を参照し得るが、必ずそうであるということではない。さらに、特定の局面、特性、構造、部分または特徴がある態様に関連して記載されているのであれば、明示的に記載されているかどうかによらず、そのような局面、特性、構造、部分または特徴を他の態様に影響させるまたは他の態様と結びつけることも当業者の知識の範囲内である。
本明細書で使用される場合、「1つの（a）」および「1つの（an）」という冠詞は、1つまたは2つ以上、すなわち少なくとも1つの、その冠詞の文法上の目的語を表す。例として、「要素（an element）」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
「および（ならびに）／または（もしくは）」という用語は、この用語に関連する項目の任意の1つ、その項目の任意の組み合わせ、またはその項目のすべてを意味する。「1つまたは（もしくは）複数」というフレーズは、特にその用法に照らして読めば、当業者に直ちに理解される。例えば、フェニル環上の1つまたは複数の置換基は、1〜5つ、または例えばそのフェニル環が二置換である場合、1〜4つを表す。
本明細書で使用される場合、「または（もしくは）」は、上で定義された「および（ならびに）／または（もしくは）」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、ある項目のリストに介在する場合、「および（ならびに）／または（もしくは）」または「または（もしくは）」は、内包的であること、例えば、多数の項目の少なくとも1つを含むが、2つ以上、かつ任意でさらなる列挙されていない項目も含むものと解釈されるべきである。そうでないことを明確に示す用語、例えば、「〜のうちの1つのみ」または「〜のうちのただ1つ」、または特許請求の範囲で使用される場合は「〜からなる」、のみが、多数の要素または要素のリストのうちのただ1つの要素を含むことを表す。一般に、本明細書で使用される「または（もしくは）」という用語は、排他性の用語、例えば、「いずれか」、「〜のうちの1つ」、「〜のうちの1つのみ」または「〜のうちのただ1つ」、が先行する場合にのみ、排他的な選択肢（すなわち、一方または他方であるが両方でないこと）を示すと解釈されるべきである。
本明細書で使用される場合、「含む（including）」、「含む（includes）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「〜と共に（with）」という用語またはそれらの派生語は、「含む（comprising）」という用語と同様に内包的であることが意図されている。
「約」という用語は、指定されている値の±5％、±10％、±20％または±25％のばらつきを表し得る。例えば、「約50」パーセントは、いくつかの態様において、45〜55パーセントのばらつきを有し得る。整数の範囲について、「約」という用語は、その範囲の各々の外縁で指定されている整数よりも1または2大きいおよび／または小さい整数値を含み得る。本明細書にそれ以外のことが示されていない限り、「約」という用語は、個々の成分、組成物または態様の機能に関して等価である指定されている範囲に近似する値、例えば重量パーセント、を含むことが意図されている。約という用語はまた、指定されている範囲の終端を修飾し得る。
当業者に理解されるであろうが、成分の量、特性、例えば分子量、反応条件等を表すものを含むすべての数値は近似値であり、すべての例において任意で「約」という用語によって修飾されることが理解される。これらの値は、本明細書の教示を用いて当業者が取得しようとする所望の特性に依存して変化し得る。そのような値は、本来的に、それらの各々の試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じるばらつきを含むことも理解される。
当業者に理解されるであろうが、任意かつすべての目的において、特に書面による説明を提供する観点から、本明細書で言及されているすべての範囲は、任意かつすべての可能性のある部分範囲およびそれらの部分範囲の組み合わせ、ならびにその範囲を構成する個々の値、特に整数値も包含する。言及されている範囲（例えば、重量パーセントまたは炭素基）は、その範囲内の各々の具体的な値、整数、分数または固有値（identity）を含む。あらゆる列挙されている範囲は、その同じ範囲が少なくとも二等分、三等分、四等分、五等分または十等分に分割されることを十分に表し、それを可能にするものと容易に理解することができる。非限定的な例として、本明細書に記載されている各範囲は、下側の三分の一、中間の三分の一および上側の三分の一等に容易に分割され得る。当業者に理解されるであろうが、「最大〜」、「少なくとも〜」、「〜より高い」、「〜未満」、「〜より多い」、「またはそれ以上（複数）」等のすべての言語は、言及されている数を含み、かつそのような用語は、上記のようにその後に部分範囲に分割できる範囲を表す。同様に、本明細書で言及されているすべての比は、その広い比に含まれるすべての部分比も含む。したがって、基、置換基および範囲に関して言及されている特定の値は説明のためのものにすぎず、それらは他の明確な値または基および置換基に関する明確な範囲内の他の値を排除しない。
当業者はまた、メンバーが一般的な様式、例えばマーカッシュグループでひとまとめにされている場合、本発明は、列挙されているグループ全体をまとめて包含するだけでなく、そのグループの各メンバーを個々にもおよび主グループのすべての可能性のある部分グループも包含することを直ちに理解するであろう。
さらに、すべての目的のために、本発明は、その主グループだけでなく、そのグループメンバーの1つまたは複数を欠く主グループも包含する。したがって本発明は、言及されているグループのメンバーの任意の1つまたは複数の明示的な除外を想定している。したがって、例えば明示の負の制限で使用される、言及されている要素、種または態様の任意の1つまたは複数をそのようなカテゴリーまたは態様から除外し得るただし書きが、任意の開示されているカテゴリーまたは態様に適用され得る。
「単離された」という用語は、インビボでその因子、細胞または細胞群に付随する1つもしくは複数の因子、細胞または1つもしくは複数の細胞成分を付随しない因子、細胞または細胞群を表す。
「接触する」という用語は、例えば、細胞または分子レベルで、例えば溶液中、反応混合物中、インビトロまたはインビボで、生理学的反応、化学反応または物理的変化をもたらすことを含む、触れる、接点を作るまたは直にもしくは近くに接近させる動作を表す。
本明細書で使用される「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という用語は、言い換え可能に使用され得る。これらの用語はすべて、任意かつすべての後続世代であるそれらの子孫も含む。すべての子孫は、意図的なまたは意図的でない変異により同一でない場合があることが理解される。
「細胞」は、脊椎動物、例えばヒトを含む哺乳動物由来の細胞を含み、「対象」は脊椎動物、例えばヒトを含む哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、家畜動物、競技用動物およびコンパニオンアニマルを含むがこれらに限定されない。「動物」という用語には、イヌ、ネコ、魚類、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、ウマ、ウサギ、ブタ、マウス、サル（例えば、類人猿、ゴリラ、チンパンジーまたはオランウータン）、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシおよび鳥類が含まれる。
1つの態様において、幹細胞、前駆（progenitor）細胞または前駆（precursor）細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞および／または分化多能性幹細胞（例えば、分化多能性中胚葉前駆体）である。1つの態様において、幹細胞、前駆（progenitor）細胞または前駆（precursor）細胞は、哺乳動物細胞である。1つの態様において、幹細胞は、人工多能性幹細胞、臍帯血幹細胞、間葉性幹細胞、多能性幹細胞を含むがこれらに限定されない。1つの態様において、幹細胞は、ヒト起源である。別の態様において、幹細胞は、ブタ起源である。
全能性（totipoent）（全能性（omnipotent）としても公知）幹細胞は、胚性および胚外性細胞型に分化し得る。そのような細胞は、完全な、生きた有機体を構築し得る。これらの細胞は、卵細胞と精子細胞の融合から生じる。受精卵の最初の数回の分裂によって生ずる細胞も全能性である。多能性幹細胞は、全能性細胞の子孫であり、ほぼすべての細胞、すなわち、3つの胚葉のいずれか由来の細胞に分化し得る。分化多能性幹細胞は、多くの細胞型であるが、関係の近い細胞ファミリーのそれらのみに分化し得る。複分化能性（oligopotent）幹細胞、例えばリンパまたは骨髄幹細胞は、少数の細胞型にのみ分化し得る。単分化能性（unipotent）細胞は、それら自身である1つのみの細胞型しか生成することができないが［4］、自己再生の特性を有し、これによって非幹細胞（例えば、前駆細胞、筋幹細胞）と区別される。
「増殖（expansion）」は、分化を伴わない細胞の増殖を表す。
「前駆細胞」は、最終分化した子孫のすべてではないがいくつかの特徴を有する、幹細胞の分化の過程で生じる細胞である。定義された前駆細胞は、特定のまたは最終分化した細胞型ではなく、ある系統に拘束されている。「内皮細胞」というフレーズは、最終分化した細胞型だけでなく、最終分化していないが内皮細胞系統に拘束されている細胞も含む。
「分化因子」は、系統への拘束を誘導する細胞因子、好ましくは成長因子または血管新生因子を表す。
「ブタ（pig）」、「ブタ（swine）」および「ブタ（porcine）」という用語は、言い換え可能に使用され、これらは性別、サイズまたは品種に関係なく同タイプの動物を表す一般用語である。「ブタ（pig）」、「ブタ（swine）」および「ブタ（porcine）」という用語、例えばヒトまたはブタ遺伝子で補完されるヌルである「ブタ（pig）」、「ブタ（swine）」および「ブタ（porcine）」は、胚、新生児または成体であり得る（生まれたてのブタまたは幼いブタを含む）ことにも留意されたい。
「Hand2」および「HandII」という用語は、言い換え可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「ヒト化骨格筋」、「ヒト化心筋」、または「ヒト化筋肉」というフレーズは、1つまたは複数のヒト遺伝子および／またはタンパク質を発現するブタまたは非ヒト動物内の細胞または組織を表す。1つの態様において、1つまたは複数のヒト遺伝子／タンパク質を発現するブタ細胞または組織は、対応する機能的なブタ遺伝子および／またはタンパク質を発現しない。
遺伝子の「コード領域」は、その遺伝子の転写によって生成されるmRNA分子のコード領域と相同であるまたは相補的である、それぞれ、その遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基およびその遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなる。
「対照」細胞は、試験細胞と同じ細胞型を有する細胞である。対照細胞は、例えば、試験細胞が試験されるのと正確にまたはほぼ同じときに試験され得る。対照細胞はまた、例えば、試験細胞が試験されたのと異なるときに試験され得、対照細胞の試験の結果は、試験細胞の試験によって得られた結果と比較できるように記録され得る。
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」は、選択された効果、例えば疾患または障害の症状の軽減、を生ずるのに十分な量を意味する。組み合わせの形態の化合物、例えば複数の化合物の投与の場合、各化合物の量は、別の化合物と組み合わせて投与される場合、その化合物を単独で投与するときとは異なり得る。したがって、各化合物の実際の量は様々であり得るが、化合物の組み合わせの有効量は、その組み合わせを全体としてまとめて表すものである。「より有効」という用語は、選択された影響が、比較対象の第2の処置よりもある処置によって大きく軽減されることを意味する。
「コードする」は、定義されたヌクレオチド配列（すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA）または定義されたアミノ酸配列のいずれかならびにそれらに由来する生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子の合成のテンプレートとして機能する、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子、cDNAまたはmRNA内の特定のヌクレオチド配列の固有の特性を表す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物学的システムにおいてあるタンパク質を生成する場合、そのタンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖の両方が、そのタンパク質またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードすると称され得る。
「フラグメント」または「セグメント」は、少なくとも1つのアミノ酸を含むアミノ酸配列の一部分、または少なくとも1つのヌクレオチドを含む核酸配列の一部分である。「フラグメント」および「セグメント」という用語は、本明細書で言い換え可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「機能的」な生物学的分子は、それを特徴づける特性を示す形態にある生物学的分子である。機能的な酵素は、例えば、その酵素を特徴づける特徴的な触媒活性を示すものである。
本明細書で使用される「相同」は、2つのポリマー分子間、例えば2つの核酸分子、例えば2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子間、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の類似性を表す。2つの分子の両方のサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占められている場合、例えば、2つのDNA分子の各々の位置がアデニンによって占められている場合、それらはその位置において相同である。2つの配列間の相同性は、一致するまたは相同な位置の数の一次関数である、例えば、2つの化合物配列内の位置の半分（例えば、10サブユニット長のポリマーにおける5つの位置）が相同な場合、その2つの配列は50％相同であり、90％の位置、例えば10のうちの9が一致するまたは相同な場合、その2つの配列は90％の相同性を共有している。例として、DNA配列3'ATTGCC5'および3'TATGGCは、50％の相同性を共有している。
本明細書で使用される場合、「相同性」は、「同一性」と同義的に使用される。
2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。例えば、2つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、Karlin and Altschul （1990）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268）のアルゴリズムであり、これはKarlin and Altschul （1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877）で改変されている。このアルゴリズムは、Altschul, et al. （1990, J. Mol. Biol. 215:403-410）のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれており、例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のワールドワイドウェブサイトでアクセス可能であり、NCBIウェブサイトにBLASTツールを使用するユニバーサルリソールロケーターがある。本明細書に記載される核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、以下のパラメータを用いるNBLASTプログラム（NCBIウェブサイトにおいて「blastn」で指定されている）によってBLASTヌクレオチド検索が実施され得る：ギャップペナルティ＝5；ギャップエクステンションペナルティ＝2；ミスマッチペナルティ＝3；マッチリワード＝1；期待値10.0；およびワードサイズ＝11。本明細書に記載されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、以下のパラメータを用いるXBLASTプログラム（NCBIウェブサイトにおいて「blastn」で指定されている）またはNCBI「blastp」プログラムによってBLASTタンパク質検索が実施され得る：期待値10.0、BLOSUM62採点行列。比較目的でギャップ有りのアラインメントを得るために、Altschul et al.（1997, Nucleic Acid Res. 25:3389-3402）に記載されるGapped BLASTが使用され得る。あるいは、ヌクレオチド間の距離的関係（同書）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する反復検索を実施するために、PSI-BlastまたはPHI-Blastが使用され得る。BLAST、Gapped BLAST、PSI-BlastおよびPHI-Blastプログラムを使用する場合、各プログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータが使用され得る。
2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容してまたは許容せずに、上記と同様の技術を用いて決定され得る。パーセント同一性を計算する際、典型的に正確な一致が計上される。
本明細書で使用される場合、「指示書」は、出版物、記録、図または本明細書で言及されている様々な疾患または障害を軽減するためのキットにおける本発明の有用性を伝達するために使用できる任意の他の表現媒体を含む。任意で、または代替的に、指示書は、哺乳動物の細胞または組織において疾患または障害を軽減する1つまたは複数の方法を説明し得る。本発明のキットの指示書は、例えば、本発明もしくはその一部を含む容器に貼り付けられ得る、または本発明もしくはその一部を含む容器と共に出荷され得る。あるいは、指示書は、指示書および化合物が受取者によって一緒に使用され得るよう、本発明を含む容器とは別に出荷され得る。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、RNAならびに一本鎖および二本鎖DNAおよびcDNAを含む。さらに、「核酸」、「DNA」、「RNA」という用語およびその類語はまた、核酸アナログ、すなわち、ホスホジエステルではない骨格を有するアナログを含む。例えば、当技術分野で公知であり、その骨格にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有するいわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内であるとみなされる。「核酸」は、デオキシリボヌクレオシドから構成されるかリボヌクレオシドから構成されるかによらず、かつホスホジエステル連結から構成されるか修飾された連結、例えばホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロアミデート、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン連結ならびにそのような連結の組み合わせから構成されるかによらず、任意の核酸を意味する。核酸という用語はまた、特に5つの生物学的に生成される塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から構成される核酸も含む。本明細書では、ポリヌクレオチド配列を記載する上で従来的な表記法が使用されており、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は5’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は5’方向と称される。新生RNA転写物への5’から3’へのヌクレオチド付加の方向は、転写方向と称される。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、「コード鎖」と称され、DNA上の参照点の5’側に位置するDNA鎖上の配列は「上流配列」と称され、DNA上の参照点の3’側にあるDNA鎖上の配列は「下流配列」と称される。
「核酸コンストラクト」という用語は、本明細書で使用される場合、ゲノム法によって得られたものであるか合成法によって得られたものであるかによらず、望まれる特定の遺伝子または遺伝子フラグメントをコードするDNAおよびRNA配列を含む。
それ以外のことが示されていない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重版であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的に、通常約50ヌクレオチド以下である、短いポリヌクレオチドを表す。ヌクレオチド配列がDNA配列（すなわち、A、T、G、C）によって表される場合、これは「U」が「T」と置き換わったRNA配列（すなわち、A、U、G、C）も含むことが理解されるであろう。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）は、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することによって作製された人工的な制限酵素である。これらの試薬は、インサイチューでのゲノム編集のための、効率的、プログラム可能かつ特異的なDNA切断を実現する。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、配列特異的な様式でDNAに結合するタンパク質である。そのようなTALEをヌクレアーゼ（例えば、FokIエンドヌクレアーゼ）に融合することによって、極めて特異的なDNA用の「ハサミ」になる（これらの分子は、任意のDNA配列に結合するよう改変することができる）。TALENという用語は、本明細書で使用される場合、広義的であり、別のTALENからの援助がなくとも二本鎖DNAを切断することができる単量体のTALENを含む。TALENという用語はまた、同じ部位のDNAを切断するよう共同作用するよう改変されたTALENの対の一方または両方のメンバーを表すために使用される。共同作用するTALENは、DNAの利き手を参照して左側TALENおよび右側TALENと称され得る。
TALEN遺伝子は、構築された後、プラスミドに挿入され、次いでそのプラスミドが、標的細胞をトランスフェクトするために使用され、そこで遺伝子産物を発現させ、核に侵入してゲノムにアクセスする。TALENは、二本鎖分裂（DSB）を誘導し、任意で積載されている／予め選択された遺伝子を挿入し、これらに対して細胞に修復機構を用いて応答させることによってゲノムを編集するために使用され得る。このようにして、それらは、例えば疾患を引き起こすゲノム内の変異を修正するために使用され得る。
遺伝子編集を含む遺伝子操作は、当業者が利用可能な任意の方法によって、例えば標的化エンドヌクレアーゼの使用、ならびに遺伝子編集のため（例えば、所望の標的遺伝子をノックアウトするため）の相同組み換え修復（HDR）、TALEN、CRISPR（例えば、CAS9/CRISPR）、リコンビナーゼ融合分子、合成ブタ人工染色体、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーまたはrAAVベースのシステムによって実施され得る。さらに、ノックアウトの目的で、遺伝子の不活性化のために（例えば、干渉性RNA（shRNA、siRNA、dsRNA、RISC、miRNA））または遺伝子の発現のために、様々な核酸が、細胞に導入され得る。
体細胞核移植（SCNT）は、体細胞および卵細胞から生きた胚を作製する研究技術である。体細胞核移植のプロセスでは、2つの異なる細胞が使用される。第1は、卵子（卵／卵母細胞）としても公知の、メスの配偶子である。第2は、ヒトの身体の細胞を表す、体細胞である。皮膚細胞、脂肪細胞および肝細胞は、その一例である。ドナー卵細胞の核は取り出され、廃棄され、それが「プログラム解除」された状態とされる。体細胞の核も取り出されるがそれは維持され、除核された体細胞が廃棄される。残されるのは、一つの体細胞核と除核された卵細胞である。次いでこれらを、体細胞核を「空の」卵子に吹き付けることによって融合させる。卵に導入された後、体細胞核は、その宿主である卵細胞によって再プログラムされる。ここで、体細胞の核を含んでいる卵子は、電撃により刺激され、分裂を開始するであろう。この卵は、この時点で生きており、1体のみの親由来のすべての必要とされる遺伝子情報を含む成体器官を生成することができる。発生は通常通り進み、多数回の有糸分裂の後に、この単一細胞は、元の生物と同一のゲノムを有する胚盤胞（約100個の細胞を含む初期段階の胚）（すなわち、クローン）を形成する。その後、治療目的クローニングにおいて使用するために、このクローン胚の破壊によって幹細胞が取得され得、または複製目的クローニングの場合は、さらなる発生のためにクローン胚が宿主母（偽妊娠／代理）に移植され、出産が行われる。
「キメラ」は、遺伝的に異なる細胞から構成される単一の生物を表す。
ヌル欠損性生物は、同じ遺伝子に関して2つの変異または欠失対立遺伝子を有する。変異／欠失対立遺伝子は、完全な機能喪失対立遺伝子または「ヌル」対立遺伝子の両方であり、したがってホモ接合性ヌルまたはヌル欠損性は同義語である。
遺伝子ノックアウト（略称：KO）は、生物の対立遺伝子の両方を非機能的にする（その生物からノックアウトする）遺伝子技術である。ノックアウト生物または単にノックアウトとしても公知である。この用語はまた、遺伝子を「ノックアウトする」というように、そのような生物を作製するプロセスも表す。この技術は本質的に、遺伝子のノックインの逆である。
遺伝子という用語は、広義的であり、機能的な産物を生成するよう発現される染色体DNAを表す。遺伝子は、対立遺伝子を有する。遺伝子編集は、単対立遺伝子的または両対立遺伝子的な編集である。
2つのポリヌクレオチドを「機能的に連結されている」と表現することによって、その2つのポリヌクレオチドの少なくとも一方が、それを他者に対して特徴づける生理学的効果を発揮することができるように、一本鎖または二本鎖核酸部分がその核酸部分内に配置された2つのポリヌクレオチドを含んでいることが意味される。例として、遺伝子のコード領域に機能的に連結されたプロモーターは、そのコード領域の転写を促進することができる。
「組み換えポリヌクレオチド」は、自然界では接続されてひとつになっていない配列を有するポリヌクレオチドを表す。増幅または構築された組み換えポリヌクレオチドは、適当なベクターに含まれ得、そのベクターが、適当な宿主細胞を形質転換するために使用され得る。
組み換えポリヌクレオチドは、非コード機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位等）としての役割も果たし得る。
組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組み換え宿主細胞」と称される。組み換え宿主細胞において発現される、組み換えポリヌクレオチドを含む遺伝子は、「組み換えポリペプチド」を生成する。
「組み換え細胞」は、導入遺伝子を含む細胞である。そのような細胞は、真核細胞または原核細胞であり得る。また、トランスジェニック細胞は、導入遺伝子を含む胚性幹細胞、トランスジェニック胚性幹細胞由来のキメラ哺乳動物から得られる、導入遺伝子を含む細胞、トランスジェニック哺乳動物またはそれらの胎生もしくは胎盤組織から得られる細胞、および導入遺伝子を含む原核細胞を含むがこれらに限定されない。
「調節する」という用語は、関心対象の機能または活性を刺激することまたは阻害することのいずれかを表す。
本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」は、本発明からの利益を享受するであろう患者、動物、哺乳動物またはヒトである。
本明細書で使用される場合、「実質的に相同なアミノ酸配列」は、参照抗体鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％の相同性、好ましくは少なくとも約96％の相同性、より好ましくは少なくとも約97％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも約98％の相同性、そして最も好ましくは少なくとも約99％またはそれ以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列の類似性または同一性は、BLAST（basic local alignment search tool）2.0.14アルゴリズムを採用するBLASTPおよびTBLASTNプログラムを使用することによって算出され得る。これらのプログラムで使用されるデフォルト設定は、本発明の目的で実質的に類似のアミノ酸配列を同定するのに適している。
「実質的に相同な核酸配列」は、参照核酸配列によってコードされるペプチドと実質的に同じ構造および機能を有するペプチド、例えば、そのペプチドの機能に実質的に影響しないアミノ酸にのみ変化が生じているペプチド、をコードする、参照核酸配列に対応する核酸配列を意味する。好ましくは、実質的に同一の核酸配列は、参照核酸配列によってコードされるペプチドをコードする。実質的に類似の核酸配列と参照核酸配列の間の同一性の比率は、少なくとも約50％、65％、75％、85％、95％、99％またはそれ以上である。核酸配列の実質的同一性は、2つの配列の配列同一性を比較することによって、例えば、物理的／化学的方法（すなわち、ハイブリダイゼーション）によってまたはコンピュータアルゴリズムを通じた配列アラインメントによって、決定され得る。ヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列と実質的に類似するかどうかを決定するための適当な核酸ハイブリダイゼーション条件は：7％ドデシル硫酸ナトリウムSDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA、50℃、および2X標準生理食塩水クエン酸（SSC）、0.1% SDS、50℃での洗浄；好ましくは7％（SDS）、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃、および1X SSC、0.1％SDS、50℃での洗浄；好ましくは7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA、50℃、および0.5X SSC、0.1％SDS、50℃での洗浄；より好ましくは、7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃、および0.1X SSC、0.1％SDS、65℃での洗浄、である。2つの核酸配列間の実質的類似性を決定するための適当なコンピュータアルゴリズムは、GCSプログラムパッケージ（Devereux et al., 1984 Nucl. Acids Res. 12:387）およびBLASTNまたはFASTAプログラム（Altschul et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990 87:14:5509-13; Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990 215:3:403-10; Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）を含む。これらのプログラムで提供されるデフォルト設定は、本発明の目的で核酸配列の実質的類似性を決定するのに適している。
「ベクター」は、単離された核酸を含み、その単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物を伴うポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むがこれらに限定されない多くのベクターが当技術分野で公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、細胞への核酸の移送または送達を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソーム等を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組み換えウイルスベクター等を含むがこれらに限定されない。非ウイルスベクターの例は、リポソーム、DNAのポリアミン誘導体等を含むがこれらに限定されない。
従来的な分子生物学技術を利用する方法が本明細書に記載されている。そのような技術は一般に当技術分野で公知であり、方法論の論文、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol.1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；およびCurrent Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992（定期的な更新あり）に詳細に記載されている。核酸の化学合成法は、例えば、Beaucage and Carruthers, Tetra. Letts 22: 1859-1862, 1981およびMatteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981で議論されている。
「含む（comprises）」、「含む（comprising）」等の用語は、米国特許法においてそれらが有する意味を有し得、かつ「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味し得る。本明細書で使用される場合、「含む（including）」または「含む（includes）」等は、非限定的に含むことを意味する。
外来器官／組織の生成
ヒト化された大型動物モデルは、再生医療のリソースであり、個人向けヒト化ブタモデルのプラットフォームとして機能するであろう。このストラテジーは、現在の臨床実務のパラダイムを慢性筋骨格疾患および移植用に変換するであろう。ブタ心筋の除去は、大型動物モデルにおいてヒト化心筋を作製することを目指しているという理由だけでなく、免疫拒絶を回避する新規のアプローチであり、外来器官作製ストラテジーに広く適用可能であるという理由から、唯一の存在である。
ヒト化された大型動物モデルは、再生医療のリソースであり、個人向けヒト化ブタモデルのプラットフォームとして機能するであろう。このストラテジーは、現在の臨床実務のパラダイムを慢性筋骨格疾患および移植用に変換するであろう。ブタ心筋の除去は、大型動物モデルにおいてヒト化心筋を作製することを目指しているという理由だけでなく、免疫拒絶を回避する新規のアプローチであり、外来器官作製ストラテジーに広く適用可能であるという理由から、唯一の存在である。
現時点で、進行型末期臓器不全に対する唯一の信頼できる治療は移植である。数百万の患者がそのような治療からの利益を享受できるが、限定的なドナー器官の入手性から移植適格者とならない。したがって、死体または生体ドナー器官が大いに不足している。さらに、器官の移植は、生涯にわたる免疫抑制を必要とし、これもまた有害、致死的な副作用を有する。本明細書には、ブタにおいて作製されたヒト化組織が記載されており、これは移植用器官の無限の供給源として機能し、心血管疾患の処置のためのパラダイムシフトをもたらすプラットフォームを提供するであろう（図6）。
外来移植が高い注目を集めており、最近の技術の進歩は、これらのストラテジーが成功するであろうという考えを支持している。例えば、胚盤胞補完プロセスにより、マウスにおいてラット膵臓が作製された（38）。これらの研究において、膵臓発生におけるマスター調節遺伝子であるPdx1に関する胚盤胞変異体に、野生型ラット由来の多能性幹細胞（rPSC）が注射された（38）。代理マウス母獣へのrPSC注射胚盤胞の移植により、ラット細胞から構成される機能的な膵臓を有するマウスキメラが誕生した。これらの変異宿主は、健常なドナー幹細胞を増殖させドナー由来器官を生成するための発生上の「ニッチ」を提供する。胚盤胞補完ストラテジーはまた、げっ歯類において腎臓および肝臓、最近ブタにおいて膵臓等の器官も生成した（39〜41）。ブタモデルを用いた後者の報告は、その後に移植または高度治療に使用できるブタにおけるヒト患者特異的器官の開発を支持している（図6）。
ヒト化された大型動物モデルは、再生医療のリソースであり、個人向けヒト化ブタモデルのプラットフォームとして機能するであろう。このストラテジーは、現在の臨床実務のパラダイムを慢性筋骨格疾患および移植用に変換するであろう。ブタ心臓組織の除去は、大型動物モデルにおいてヒト化心臓組織を作製することを目指しているという理由だけでなく、免疫拒絶を回避する新規のアプローチであり、外来器官作製ストラテジーに広く適用可能であるという理由から、唯一の存在である。
遺伝子編集プラットフォームを用いて、器官および／または組織欠損ブタが生成するよう様々な発生遺伝子を変異させることができ、その中で外来器官および／または組織を生成するために胚盤胞補完が行われ得る。このシステムの能力により、多くの遺伝子を実験的に試験することができる。複数の調節遺伝子の同時修飾は、複雑な組織オントロジーの調節を可能にする。
筋疾患／障害
心臓の組織および細胞は、心筋を構成する筋肉細胞（筋細胞（myocytes））である心筋細胞（cardiac muscle cells）または心筋細胞（cardiomyocytes）（心筋細胞（myocardiocytes）または心筋細胞（cardiac myocytes）としても公知）を含む。心血管疾患または心疾患は、心臓および血管の疾患を含み、これらの多くはアテローム性動脈硬化に関連する。疾患／障害は、心臓発作、脳卒中、心不全、不整脈および心臓弁の問題を含むがこれらに限定されない。
心臓の組織および細胞は、心筋を構成する筋肉細胞（筋細胞（myocytes））である心筋細胞（cardiac muscle cells）または心筋細胞（cardiomyocytes）（心筋細胞（myocardiocytes）または心筋細胞（cardiac myocytes）としても公知）を含む。心血管疾患または心疾患は、心臓および血管の疾患を含み、これらの多くはアテローム性動脈硬化に関連する。疾患／障害は、心臓発作、脳卒中、心不全、不整脈および心臓弁の問題を含むがこれらに限定されない。
器官の作製のためのヒト・ブタキメラを作製するための精密ノックアウト（KO）ブタの作製
部位特異的ヌクレアーゼを使用して、大型動物ゲノムへの精密遺伝子改変の導入効率が、100,000倍以上改善された。それぞれ50％および20％の比率の、家畜における高効率ホモ接合性および二対立遺伝子ノックアウト（KO）が、部位特異的ヌクレアーゼにより切断された二本鎖開裂の非相同末端接続（NHEJ）により遺伝子を不活性化させるTALENベースのプラットフォームを用いて実証された（27）。この遺伝子編集プラットフォームを用いて、様々な発生上の遺伝子を変異させ、器官欠損ブタを作製することができ、その中で外来器官を生成するために胚盤胞補完が行われ得る。このシステムの効率により、多くの遺伝子を実験的に試験することができる。
部位特異的ヌクレアーゼを使用して、大型動物ゲノムへの精密遺伝子改変の導入効率が、100,000倍以上改善された。それぞれ50％および20％の比率の、家畜における高効率ホモ接合性および二対立遺伝子ノックアウト（KO）が、部位特異的ヌクレアーゼにより切断された二本鎖開裂の非相同末端接続（NHEJ）により遺伝子を不活性化させるTALENベースのプラットフォームを用いて実証された（27）。この遺伝子編集プラットフォームを用いて、様々な発生上の遺伝子を変異させ、器官欠損ブタを作製することができ、その中で外来器官を生成するために胚盤胞補完が行われ得る。このシステムの効率により、多くの遺伝子を実験的に試験することができる。
ETV2ノックアウトブタ胚は内皮系統を欠いている
以前の研究は、Nkx2-5がEtv2遺伝子の上流調節因子であることおよび、Etv2を欠く胚が脈管構造を有さずおよそE9.5で死亡することから、Etv2がマウスにおける内皮系統のマスター調節因子であることを示した（8、10、12、13）。ブタにおけるETV2の役割を試験するため、ブタ線維芽細胞において、全ETV2コード配列を、この遺伝子に隣接する2つのTALEN対を用いて除去した（図7A）。このプロセスは、ホモ接合性遺伝子除去に関して15％の効率であり、遺伝子型決定されたクローンの79/528個が、ETV2遺伝子の欠失に関してホモ接合性であった（図7B）。ETV2ホモ接合性ノックアウト線維芽細胞クローンを、核クローニング（体細胞核移植；SCNT）に使用して、ETV2ヌル胚を作製し、これを代理雌性ブタに移植した。そのクローニング効率は、20％の平均成功率よりも高い29％であった。胚をE18.0で収集および分析した（図8）。この段階で、Wt胚は脈管構造を有しており、十分に発達した血管網が尿膜に存在した（図8A、C）。対照的に、ETV2 KOでは成長が有意に遅れており（図7B）、これらの胚は、心内膜／内皮系統を欠いていた（図8D、F、H）。ETV2 KO胚は、Wt胚では明らかに発生する主静脈、背部大動脈および心内膜を欠いていた（図8E〜H）。これらの結果は、マウスおよびブタ表現型における類似性を反映しており、ETV2の機能がこれらの種の間で保存されていることを示唆している。さらに、これらのデータは、2つ以上の細胞型でヒト化されるであろうキメラ器官の成長を支持するために複数の変異をブタゲノムに導入することができることを示している。
以前の研究は、Nkx2-5がEtv2遺伝子の上流調節因子であることおよび、Etv2を欠く胚が脈管構造を有さずおよそE9.5で死亡することから、Etv2がマウスにおける内皮系統のマスター調節因子であることを示した（8、10、12、13）。ブタにおけるETV2の役割を試験するため、ブタ線維芽細胞において、全ETV2コード配列を、この遺伝子に隣接する2つのTALEN対を用いて除去した（図7A）。このプロセスは、ホモ接合性遺伝子除去に関して15％の効率であり、遺伝子型決定されたクローンの79/528個が、ETV2遺伝子の欠失に関してホモ接合性であった（図7B）。ETV2ホモ接合性ノックアウト線維芽細胞クローンを、核クローニング（体細胞核移植；SCNT）に使用して、ETV2ヌル胚を作製し、これを代理雌性ブタに移植した。そのクローニング効率は、20％の平均成功率よりも高い29％であった。胚をE18.0で収集および分析した（図8）。この段階で、Wt胚は脈管構造を有しており、十分に発達した血管網が尿膜に存在した（図8A、C）。対照的に、ETV2 KOでは成長が有意に遅れており（図7B）、これらの胚は、心内膜／内皮系統を欠いていた（図8D、F、H）。ETV2 KO胚は、Wt胚では明らかに発生する主静脈、背部大動脈および心内膜を欠いていた（図8E〜H）。これらの結果は、マウスおよびブタ表現型における類似性を反映しており、ETV2の機能がこれらの種の間で保存されていることを示唆している。さらに、これらのデータは、2つ以上の細胞型でヒト化されるであろうキメラ器官の成長を支持するために複数の変異をブタゲノムに導入することができることを示している。
Nkx2-5、HandIIおよびTbx5
Ntx2-5、HandIIおよびTbx5を変異させ、心筋系統欠損ブタ胚を作製した（Nkx2-5/HandII/Tbx5ヌルブタ胚）。Nkx2-5/HandII/Tbx5に関する多遺伝子編集を行い、多能性を有するヒト細胞を用いて心臓細胞と共に増幅され、ヒト化心臓／心臓組織および／または心筋を生成する寛容なニッチを作製した。詳細については実施例2を参照のこと。
Ntx2-5、HandIIおよびTbx5を変異させ、心筋系統欠損ブタ胚を作製した（Nkx2-5/HandII/Tbx5ヌルブタ胚）。Nkx2-5/HandII/Tbx5に関する多遺伝子編集を行い、多能性を有するヒト細胞を用いて心臓細胞と共に増幅され、ヒト化心臓／心臓組織および／または心筋を生成する寛容なニッチを作製した。詳細については実施例2を参照のこと。
ヒト化された大型動物モデルは、再生医療の重要なリソースであり、個人向けの器官を作製するためのプラットフォームとして機能するであろう。このストラテジーは、現在の臨床実務のパラダイムを筋疾患および移植用に変換するであろう。現時点で、器官の外来移植は、マウスとラット（27,29）およびブタとブタ（31）の間で行われており、大型動物モデルにおけるヒト化器官の発生の成功は報告されていない。米国仮出願第62/247,092号、同第62/247096号および同第62/247,122号が参照により本明細書に組み入れられる。
以下の実施例は、本発明の特定の特に好ましい態様をさらに説明することを意図しており、いかなる様式によっても本発明の範囲を限定することは意図されていない。
実施例1：心臓発生の調節因子としてのNkx2-5、HandIIおよびTbx5
心臓の発生は、電気的に連結され、最終的に機能的な合胞体を形成する心臓前駆体の特化、増殖、遊走および分化を含む複雑で高度に組織化された現象である（図1）。これらの心臓発生段階は、遺伝子破壊技術を用いて心臓の形成および生存に必要であることが示されている転写ネットワークによって支配されている（6,8,9,22〜26）（表1）。
心臓の発生は、電気的に連結され、最終的に機能的な合胞体を形成する心臓前駆体の特化、増殖、遊走および分化を含む複雑で高度に組織化された現象である（図1）。これらの心臓発生段階は、遺伝子破壊技術を用いて心臓の形成および生存に必要であることが示されている転写ネットワークによって支配されている（6,8,9,22〜26）（表1）。
（表１）心臓遺伝子変異の表現型
Nkx2-5は、ショウジョウバエ（Drosophila）ホメオドメインタンパク質であるTinman（Csx）の脊椎動物ホモログである。Tinmanを変異させると、ハエにおいて心臓が形成されなくなる（35）。Nkx2-5は、心臓系統において発現される最も初期の転写因子の1つである。Nkx2-5の特異的破壊は、心臓の形態形成を混乱させ、重度の成長遅延をもたらし、およそE9.5で胚を死亡させる（22,24）。Nkx2-5相互作用因子の1つは、T-box転写因子であるTbx5であり、これらは複合体を形成して心臓の遺伝子発現を転写活性化させる（36）。マウスにおけるTbx5の全体的欠失は、心臓の形態形成を混乱させ（重度の心房心室低形成）、E10.5までに胚を死亡させる（25）。ハプロ不全マウス（Tbx5+/-）でさえも、重度の先天性の心臓および前肢の奇形を示し、ホルト・オーラム症候群患者における欠陥の原因であることが示されている（25）。HandII（dHand）は、bHLH転写因子であり、これもまた、心臓の形態形成に必要とされることが示されている。HandII変異胚は、胚発生初期の段階で致死的であり、重度の右心室低形成および大動脈弓欠陥を示す（23）。さらに、Nkx2-5およびHandIIの両方を欠くマウスは、心室形成不全を示し、1つの心房腔しか有さない（図2）（26）。
ブタNKX2-5、HANDIIおよびTBX5遺伝子の多重ノックアウト
心臓前駆細胞においてNkx2-5転写調節カスケードを定義するために、人工ノックアウト・トランスジェニックマウスモデルを使用して、幹細胞集団から心臓系統への特化を誘導する分子ネットワークが定義された（8,9,37）。心臓発生時のNkx2-5を通じたネットワークを定義するため、発生段階のNkx2-5ヌル心臓（9）におけるCPC集団の分子指標を試験した。Nkx2-5ヌルCPCにおいてEYFP発現を誘導するために、6kb Nkx2-5エンハンサー-EYFPトランスジェニックマウスモデルを、Nkx2-5ヌルのバックグラウンドと交配させた。FACSを用いて、段階（年齢）を一致させた個々の胚からWtおよびNkx2-5ヌルCPCを単離し、RNAを単離および増幅し、全ゲノム分析を用いて各々の分子プログラムを調査した。このストラテジーにより、下流のNkx2-5標的遺伝子が定義され、心臓発生、内皮／心内膜系統特化（Etv2の誘導）および血液形成の抑制におけるNkx2-5の役割が明らかにされた（図5F）。本研究はまた、初期CPC集団の分子指標を同定し、この中にNkx2-5、HandIIおよびTbx5が含まれていた（37）。
心臓前駆細胞においてNkx2-5転写調節カスケードを定義するために、人工ノックアウト・トランスジェニックマウスモデルを使用して、幹細胞集団から心臓系統への特化を誘導する分子ネットワークが定義された（8,9,37）。心臓発生時のNkx2-5を通じたネットワークを定義するため、発生段階のNkx2-5ヌル心臓（9）におけるCPC集団の分子指標を試験した。Nkx2-5ヌルCPCにおいてEYFP発現を誘導するために、6kb Nkx2-5エンハンサー-EYFPトランスジェニックマウスモデルを、Nkx2-5ヌルのバックグラウンドと交配させた。FACSを用いて、段階（年齢）を一致させた個々の胚からWtおよびNkx2-5ヌルCPCを単離し、RNAを単離および増幅し、全ゲノム分析を用いて各々の分子プログラムを調査した。このストラテジーにより、下流のNkx2-5標的遺伝子が定義され、心臓発生、内皮／心内膜系統特化（Etv2の誘導）および血液形成の抑制におけるNkx2-5の役割が明らかにされた（図5F）。本研究はまた、初期CPC集団の分子指標を同定し、この中にNkx2-5、HandIIおよびTbx5が含まれていた（37）。
ブタにおける多重相同組み換え（HDR）
前述の通り（上記参照）、TALEN型HDR技術を用いてブタ線維芽細胞に二対立遺伝子ノックアウト（KO）を導入する方法（28）が確立されている。これらの新技術を、多重遺伝子KOを行うため（すなわち、NKX2-5/HANDII/TBX5変異および他の器官特異的因子を有するETV2ノックアウト体を作製するため）にさらに利用した。この技術を多重二対立遺伝子遺伝子編集に関して検証するために、各々20％超のHDR/部位をもたらすTALEN対を使用し、各組み合わせがブタゲノムにおける5つの別個の遺伝子を標的化する3つの組み合わせでこれらの対を同時に共トランスフェクトした（28）。
前述の通り（上記参照）、TALEN型HDR技術を用いてブタ線維芽細胞に二対立遺伝子ノックアウト（KO）を導入する方法（28）が確立されている。これらの新技術を、多重遺伝子KOを行うため（すなわち、NKX2-5/HANDII/TBX5変異および他の器官特異的因子を有するETV2ノックアウト体を作製するため）にさらに利用した。この技術を多重二対立遺伝子遺伝子編集に関して検証するために、各々20％超のHDR/部位をもたらすTALEN対を使用し、各組み合わせがブタゲノムにおける5つの別個の遺伝子を標的化する3つの組み合わせでこれらの対を同時に共トランスフェクトした（28）。
（本明細書で議論されている）TALEN刺激HDRおよびNHEJによる変異の組み合わせを使用して、NKX2-5/HANDII/TBX5変異ブタ胚性線維芽細胞を作製した。各遺伝子を、それらの保存された転写因子／DNA結合ドメイン内またはその直前のいずれかで標的化した（図3A）。このストラテジーは、下流AUGからの開始により機能的ペプチドを生成する機会を減らすために転写開始部位付近の遺伝子を標的化することよりも望ましい。TBX5およびNKX2-5に関して、機能的な完全読み取りタンパク質を防ぐ新しいインフレーム停止コドン、RFLPスクリーニング用の制限部位および停止コドン後の追加の5塩基挿入を生成する相同性鋳型を提供した。HANDII TALENは、約10％の効率であり、したがってこの実験を、ブタ線維芽細胞において複数のHDRを用いた場合に観察される現象（未公開データ）であるTBX5およびNKX2-5 HDRとの干渉を回避するために相同性鋳型を用いずに行った。三重変異を、三段階アプローチを用いて同定した。第1に、コロニーを、TBX5およびNKX2-5 RFLPアッセイの二重ノックアウトについてスクリーンした（図3B）。480コロニーの第1ラウンドにおいて、33個（7％）が、二重ノックアウト体であることが見出された。これらの二重ノックアウト体の中で、4個が、HANDIIについても変異体であることが同定（全体の1％）された（図3C）。一回のショットで三重ヌルブタ線維芽細胞株を確実に生成する能力は、唯一のものであり、革新的技術である。
三重ノックアウトブタ胚における心臓の非存在
実験は、心臓発生を混乱させ、先天性心疾患の研究および処置のための新しいモデルを提供する多くの転写因子（すなわち、MESP1、GATA4、NKX2-5、HANDII、TBX5等）を対象とした。本明細書には、概念実証として、NKX2-5/HANDII/TBX5遺伝子の欠失に関してホモ接合性のクローンの標的化および作製の成功が示されている。三重ノックアウト線維芽細胞クローンを核クローニング（SCNT）に使用してNKX2-5/HANDII/TBX5ヌルブタ胚を作製し、これを代理雌性ブタに移植した。胚を収集し、マウスのE11と同等のE18で分析した。E18で、三重ノックアウトブタ胚は、野生型対照ブタ胚と比較して、脈管構造、骨格筋および血液を有するが、心臓を欠いている（最小のGATA4免疫組織化学陽性心筋細胞）（図4を参照のこと）。
実験は、心臓発生を混乱させ、先天性心疾患の研究および処置のための新しいモデルを提供する多くの転写因子（すなわち、MESP1、GATA4、NKX2-5、HANDII、TBX5等）を対象とした。本明細書には、概念実証として、NKX2-5/HANDII/TBX5遺伝子の欠失に関してホモ接合性のクローンの標的化および作製の成功が示されている。三重ノックアウト線維芽細胞クローンを核クローニング（SCNT）に使用してNKX2-5/HANDII/TBX5ヌルブタ胚を作製し、これを代理雌性ブタに移植した。胚を収集し、マウスのE11と同等のE18で分析した。E18で、三重ノックアウトブタ胚は、野生型対照ブタ胚と比較して、脈管構造、骨格筋および血液を有するが、心臓を欠いている（最小のGATA4免疫組織化学陽性心筋細胞）（図4を参照のこと）。
実施例2 - ブタ単為生殖体（受精なしで発生するよう電気的に活性化された胚）の内部細胞塊（ICM）へのヒト幹細胞の導入
ヒト幹細胞／前駆細胞集団は、ブタ単為生殖キメラに寄与し、関係し得る。ブタ単為生殖発生に寄与するヒト誘導性多能性幹細胞（hiPSC）、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）、ヒト多能性幹細胞およびヒト心臓前駆体（hCPC）の能力が比較される。ブタ単為発生胚盤胞を用いたデータ（30）は、hiPSCが単為生殖体の内部細胞塊に組み込まれるという考えを支持している。実験は、hiPSC株、hMSC株、ヒト多能性幹細胞およびhCPCならびにインビトロおよびインビボでブタ単為発生胚を用いてヒト・ブタキメラを生成するのに成功するそれらの能力を試験する。これらの研究は、インビトロ分析として、ヒト幹細胞集団の増殖能、アポトーシスおよび発生進行を試験する。インビボ分析は、ヒト特異的抗血清を用いた免疫組織化学および移植後単為生殖体のインサイチューハイブリダイゼーションを使用する。
ヒト幹細胞／前駆細胞集団は、ブタ単為生殖キメラに寄与し、関係し得る。ブタ単為生殖発生に寄与するヒト誘導性多能性幹細胞（hiPSC）、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）、ヒト多能性幹細胞およびヒト心臓前駆体（hCPC）の能力が比較される。ブタ単為発生胚盤胞を用いたデータ（30）は、hiPSCが単為生殖体の内部細胞塊に組み込まれるという考えを支持している。実験は、hiPSC株、hMSC株、ヒト多能性幹細胞およびhCPCならびにインビトロおよびインビボでブタ単為発生胚を用いてヒト・ブタキメラを生成するのに成功するそれらの能力を試験する。これらの研究は、インビトロ分析として、ヒト幹細胞集団の増殖能、アポトーシスおよび発生進行を試験する。インビボ分析は、ヒト特異的抗血清を用いた免疫組織化学および移植後単為生殖体のインサイチューハイブリダイゼーションを使用する。
ブタ胚盤胞に組み込まれ胚発生に関係するhiPSCの能力を評価した。ブタ単為発生胚盤胞を、卵母細胞の電気刺激を用いて作製した（42）。活性化から6日後、9〜12のDiIまたはEdU（24時間）標識されたhiPSCを卵割腔に注射した。胚盤胞を培養下で2日間回復させ、その後に画像化した。標識されたhiPSCが、ブタ胚盤胞の90％のICMにおいて観察された（図9A、B、代表画像が示されている）。ヒト核抗原特異的抗体（HNA）を用いた免疫組織化学によるDil分布の比較は、HNA抗体が、注射されたヒト幹細胞を検出することを明らかにした（図9A、矢印）。EdU標識hiPSCを注射された胚盤胞を、BrdUを用いて1時間さらにパルスし、その後に増殖性細胞の検出のために収集した。EdUによる二重標識は、注射されたヒト幹細胞が注射から48時間後も増殖し続けていることを明らかにした（図9B、矢印）。これらの結果は、ブタ胚盤胞のICMへのヒト幹細胞の組み込み、および子宮への移植の準備におけるキメラ胚盤胞の孵化段階への発生の進行を実証している。
これらの結果は、提案されたストラテジーの論拠および実現性を支持しており、ヒト幹細胞集団がICMの発生に適合するおよび／または寄与するかどうかを試験する高速アッセイを提供する。さらに、単為発生胚盤胞の移植は、発生段階の胚へのヒト幹細胞の組み込みおよび分化を試験する高スループット法を提供する。このストラテジーの大きな利点は、ブタ卵母細胞が、食物生産の副産物として豊富に入手可能であること、および単為発生胚が定期的に大量生産可能であること、である。単為発生胚は、8週を超えて生存せず、したがって望まれないヒト・ブタキメラが誤って誕生する懸念を払拭することに注目されたい。
ヒト幹細胞集団は増殖し、ヒト・ブタ単為生殖キメラの形成に寄与する。ヒト間葉系幹細胞（hMSC）（46）および心臓前駆細胞（hCPC）（47）は、発生段階のブタにおいて胚系統に寄与するそれらの能力に関してより限定的であろう。さらに、hiPSCおよびブタ幹細胞集団は、胚系統に同等に寄与し得る。
ヒト幹／前駆細胞集団は、NKX2-5/HANDII/TBX5変異ブタ胚を救済するであろう。hiPSCは、NKX2-5/HANDII/TBX5変異未熟胚においてあらゆる心臓系細胞の前駆体となるであろう。
TALENを通じた技術（27,28）を用いて、生存能力がなく、内皮系統を欠いているETV2変異ブタ胚を作製した。TALENを通じた技術を用いてNKX2-5/HANDII/TBX5変異線維芽細胞を作製し、データはこれらの変異ブタ胚が心臓を欠いていることを示した。データはさらに、ヒト幹細胞（ヒト臍帯血幹細胞およびヒトiPSC）がブタ単為生殖体のICMに組み込まれ得るという考えを支持している。ヒト・ブタ補完研究において、E17ヒト幹細胞・ブタキメラにおけるヒト幹細胞の移植が試験されるであろう。
実施例3
材料および方法
TALENの設計および作製
候補TALEN標的DNA配列およびRVD配列は、オンラインツール「TAL EFFECTOR NUCLEOTIDE TARGETER 2.0」を用いて特定した。次いで、TALEN DNAトランスフェクションまたはインビトロTALEN mRNA転写のためのプラスミドを、最終目標ベクターとしてRCIscript-GOLDYTALEN（Addgene ID 38143）を用いるGolden Gate Assemblyプロトコル（Carlson 2012）にしたがい構築した。QIAPREP SPIN MINIPREPキット（Qiagen）を用いて調製した構築したRCIscriptベクターを、以前に示された（Carlson, 2009）ようにmMESSAGE mMACHINE（登録商標）T3キット（Ambion）を用いるインビトロTALEN mRNA転写におけるテンプレートとして使用するために、SacIにより直鎖状にした。得られたmRNAを、MEGACLEAR REACTION CLEANUPキット（Applied Biosciences）またはRNeasyキット（Qiagen）を用いる精製の前にDNAse処理した。
材料および方法
TALENの設計および作製
候補TALEN標的DNA配列およびRVD配列は、オンラインツール「TAL EFFECTOR NUCLEOTIDE TARGETER 2.0」を用いて特定した。次いで、TALEN DNAトランスフェクションまたはインビトロTALEN mRNA転写のためのプラスミドを、最終目標ベクターとしてRCIscript-GOLDYTALEN（Addgene ID 38143）を用いるGolden Gate Assemblyプロトコル（Carlson 2012）にしたがい構築した。QIAPREP SPIN MINIPREPキット（Qiagen）を用いて調製した構築したRCIscriptベクターを、以前に示された（Carlson, 2009）ようにmMESSAGE mMACHINE（登録商標）T3キット（Ambion）を用いるインビトロTALEN mRNA転写におけるテンプレートとして使用するために、SacIにより直鎖状にした。得られたmRNAを、MEGACLEAR REACTION CLEANUPキット（Applied Biosciences）またはRNeasyキット（Qiagen）を用いる精製の前にDNAse処理した。
組織培養およびトランスフェクション
ブタ線維芽細胞は、（示されているように）摂氏37または30度、5％CO2下、10％ウシ胎仔血清、100 I.U./mLペニシリンおよびストレプトマイシン、2mM L-グルタミンおよび10mM Hepesを補充したDMEM中で維持した。Neon Transfectionシステム（Life Technologies）を使用して、TALENおよびHDRオリゴを送達した。70〜100％コンフルエンスの低継代OssabawまたはLandraceブタ線維芽細胞を、1：2に分割し、次の日に70〜80％コンフルエンスで収集した。約600,000細胞を、mRNA TALENおよびHDRオリゴを含む"R"Buffer（Life Technologies）中に再懸濁し、100μLチップ内で以下のパラメータを用いて電気穿孔した：入力電圧：1800V；パルス幅：20ms；パルス数：1。関心対象の特定の遺伝子につき0.1〜4 ugのTALEN mRNAおよび0.1〜0.4 nmolのHDRオリゴを各トランスフェクションに含めた。トランスフェクトされた細胞を摂氏30度で2〜3日間培養し、その後に遺伝子編集効率について分析し、コロニー形成のためにプレーティングした。
ブタ線維芽細胞は、（示されているように）摂氏37または30度、5％CO2下、10％ウシ胎仔血清、100 I.U./mLペニシリンおよびストレプトマイシン、2mM L-グルタミンおよび10mM Hepesを補充したDMEM中で維持した。Neon Transfectionシステム（Life Technologies）を使用して、TALENおよびHDRオリゴを送達した。70〜100％コンフルエンスの低継代OssabawまたはLandraceブタ線維芽細胞を、1：2に分割し、次の日に70〜80％コンフルエンスで収集した。約600,000細胞を、mRNA TALENおよびHDRオリゴを含む"R"Buffer（Life Technologies）中に再懸濁し、100μLチップ内で以下のパラメータを用いて電気穿孔した：入力電圧：1800V；パルス幅：20ms；パルス数：1。関心対象の特定の遺伝子につき0.1〜4 ugのTALEN mRNAおよび0.1〜0.4 nmolのHDRオリゴを各トランスフェクションに含めた。トランスフェクトされた細胞を摂氏30度で2〜3日間培養し、その後に遺伝子編集効率について分析し、コロニー形成のためにプレーティングした。
希釈クローニング
トランスフェクションの2または3日後に、50〜250個の細胞を10cmディッシュに播種し、個々のコロニーが約5mm径に達するまで培養した。8 mLのTrypLEおよびDMEM培地の1：4（vol/vol）混合物（Life Technologies）を添加し、コロニーを吸引し、48ウェルディッシュおよびレプリカの96ウェルディッシュのウェルに移し、同一条件下で培養した。凍結保存のためおよび遺伝子タイピング用のサンプル調製のために、コンフルエンスに達したコロニーを収集した。
トランスフェクションの2または3日後に、50〜250個の細胞を10cmディッシュに播種し、個々のコロニーが約5mm径に達するまで培養した。8 mLのTrypLEおよびDMEM培地の1：4（vol/vol）混合物（Life Technologies）を添加し、コロニーを吸引し、48ウェルディッシュおよびレプリカの96ウェルディッシュのウェルに移し、同一条件下で培養した。凍結保存のためおよび遺伝子タイピング用のサンプル調製のために、コンフルエンスに達したコロニーを収集した。
サンプル調製
第3および10日のトランスフェクト細胞集団を、6ウェルディッシュのウェルから回収し、10〜30％を、200μg/mlプロテイナーゼKを直前に補充した50μlの1X PCR適合溶解緩衝液：10mM Tris-Cl pH 8.0、2mM EDTA、0.45％ Tryton X-100（vol/vol）、0.45％ Tween-20（vol/vol）に再懸濁させた。その溶解産物を、サーマルサイクラーで以下のプログラムを用いて処理した：55℃で60分間、95℃で15分間。
第3および10日のトランスフェクト細胞集団を、6ウェルディッシュのウェルから回収し、10〜30％を、200μg/mlプロテイナーゼKを直前に補充した50μlの1X PCR適合溶解緩衝液：10mM Tris-Cl pH 8.0、2mM EDTA、0.45％ Tryton X-100（vol/vol）、0.45％ Tween-20（vol/vol）に再懸濁させた。その溶解産物を、サーマルサイクラーで以下のプログラムを用いて処理した：55℃で60分間、95℃で15分間。
遺伝子編集の分析
意図する部位に隣接するPCRを、AccuStart（商標）Taq DNA Polymerase HiFi（Quanta Biosciences）および1μlの細胞溶解産物を製造元の推奨にしたがい用いて行った。集団内の変異頻度を、上記のように10μlのPCR産物を用いて製造元の推奨にしたがうSURVEYOR MUTATION DETECTION Kit（Transgenomic）により分析した。SURVEYOR反応物を、10％ TBEポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。バンドの濃度測定を、ImageJを用いて行い、SURVEYOR反応物の変異率を、（Guschin et al. 2010）に記載されるようにして計算した。プライマーを用いて、個々のコロニーをHDR対立遺伝子の存在についてスクリーンした。得られたPCR増幅産物をHindIIIで消化することによって、PCR産物を制限酵素断片長多型分析（RFLP）に供し、対立遺伝子の一方、両方が切断されたかまたはいずれも切断されなかったか、したがってHDR対立遺伝子を含んでいたかどうかを決定した。生成物を、アガロースゲル上で分離した。
意図する部位に隣接するPCRを、AccuStart（商標）Taq DNA Polymerase HiFi（Quanta Biosciences）および1μlの細胞溶解産物を製造元の推奨にしたがい用いて行った。集団内の変異頻度を、上記のように10μlのPCR産物を用いて製造元の推奨にしたがうSURVEYOR MUTATION DETECTION Kit（Transgenomic）により分析した。SURVEYOR反応物を、10％ TBEポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。バンドの濃度測定を、ImageJを用いて行い、SURVEYOR反応物の変異率を、（Guschin et al. 2010）に記載されるようにして計算した。プライマーを用いて、個々のコロニーをHDR対立遺伝子の存在についてスクリーンした。得られたPCR増幅産物をHindIIIで消化することによって、PCR産物を制限酵素断片長多型分析（RFLP）に供し、対立遺伝子の一方、両方が切断されたかまたはいずれも切断されなかったか、したがってHDR対立遺伝子を含んでいたかどうかを決定した。生成物を、アガロースゲル上で分離した。
ブタ配列
参考文献
本明細書の開示を通じて参照されているすべての刊行物、特許および特許出願、Genbank配列、ウェブサイトならびに他の公開されている資料は、各々個々の刊行物、特許または特許出願、Genbank配列、ウェブサイトおよび他の公開されている資料が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されているものとして、参照により本明細書に組み入れられる。参照により組み入れられる用語の定義が本明細書で定義されている用語と相反する場合、本明細書が優先される。
Claims (14)
- 非ヒト動物細胞または胚盤胞が、機能的なNKX2-5タンパク質、HANDIIタンパク質、TBX5タンパク質またはそれらの組み合わせを欠くよう、そのゲノムが、NKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの両方の対立遺伝子に変異を有する、非ヒト動物細胞、桑実胚または胚盤胞。
- 変異が、NKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの欠失である、請求項1記載の非ヒト動物細胞、桑実胚または胚盤胞。
- 非ヒト動物細胞または胚盤胞が、ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項1または2記載の非ヒト動物細胞、桑実胚または胚盤胞。
- ヒトNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせを発現し、非ヒト動物NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせの発現を欠く、キメラ非ヒト動物、桑実胚または胚盤胞。
- 前記非ヒト動物が、ヒト化心臓細胞および／または組織を生成する、請求項4記載のキメラ非ヒト動物。
- 外因性ブタNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせを発現し、内因性ブタNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせの発現を欠く、キメラブタ（ブタ・ブタキメラ）。
- 非ヒト動物が、ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項4または5記載のキメラ非ヒト動物。
- ヒトNKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせを発現するキメラ非ヒト動物を作製するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
(a)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト動物細胞を作製する工程であって、非ヒトNKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの遺伝子の両方のコピーが、機能的なNKX2-5タンパク質、HANDIIタンパク質、TBX5タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；
(b)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(a)の非ヒト細胞由来の核を除核非ヒト卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト桑実胚または胚盤胞を形成するよう分裂させることを含む体細胞核移植によって、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト桑実胚、胚盤胞を作製する工程；
(c)非ヒトNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の桑実胚または胚盤胞にヒト幹細胞を導入する工程；および
(d)偽妊娠代理非ヒト動物に(c)由来の桑実胚または胚盤胞を移植して、ヒトNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせを発現するキメラ非ヒト動物を作製する工程。 - 外因性NKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせを発現するキメラブタを作製するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
(a)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ細胞を作製する工程であって、内因性ブタMYF5遺伝子、MYOD遺伝子、MRF4遺伝子またはそれらの組み合わせの遺伝子の両方のコピーが、機能的な内因性ブタMYF5タンパク質、MYODタンパク質、MRF4タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；
(b)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(a)のブタ細胞由来の核を除核ブタ卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を形成するよう分裂させる工程を含む体細胞核移植によって、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルであるブタ桑実胚または胚盤胞を作製する工程；
(c)ブタNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の桑実胚または胚盤胞にブタ幹細胞を導入する工程；および
(d)偽妊娠代理ブタに(c)由来の桑実胚または胚盤胞を移植して、外因性ブタNKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせを発現するキメラブタを作製する工程。 - 非ヒト動物においてヒトまたはヒト化心臓細胞を生成する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(a)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト細胞を作製する工程であって、非ヒトNKX2-5遺伝子、HANDII遺伝子、TBX5遺伝子またはそれらの組み合わせの両方の対立遺伝子が、機能的な非ヒトNKX2-5タンパク質、HANDIIタンパク質、TBX5タンパク質またはそれらの組み合わせの生成を妨げる変異を有する、工程；
(b)MYF5、MYOD、MRF4またはそれらの組み合わせがヌルである(a)の非ヒト細胞由来の核を除核非ヒト動物卵母細胞に融合し、該卵母細胞を活性化させて、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト動物胚盤胞を形成するよう分裂させることを含む体細胞核移植によって、NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである非ヒト桑実胚または胚盤胞を作製する工程；
(c)NKX2-5、HANDII、TBX5またはそれらの組み合わせがヌルである(b)の非ヒト動物胚盤胞または桑実胚にヒト幹細胞を導入する工程；および
(d)偽妊娠代理非ヒト動物に(c)由来の胚盤胞または桑実胚を移植して、ヒトまたはヒト化心臓細胞を発現する非ヒト動物を作製する工程。 - 非ヒト動物が、ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項8または10記載の方法。
- ヒト幹細胞が、組織特異的幹細胞、多能性幹細胞、分化多能性成体幹細胞、人工多能性幹細胞または臍帯血幹細胞（UCBSC）である、請求項8、9または10記載の方法。
- 前記人工多能性細胞が、線維芽細胞から形成される、請求項8、9または10記載の方法。
- 請求項8〜13のいずれか一項記載の方法によって作製される非ヒト動物。
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