KR102068107B1 - 게놈 변형 방법 - Google Patents

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Abstract

본원에서, 1종 이상의 외인성 핵산을 숙주 세포 게놈의 1종 이상의 선별된 표적 부위에 삽입하는 방법을 제공한다. 소정의 실시 양태에서, 상기 방법은 숙주 세포 게놈을, 게놈 표적 부위에 삽입될 외인성 핵산을 포함하는 1종 이상의 삽입 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 게놈 표적 부위 근처 또는 내부에서 이중-가닥 절단을 유도할 수 있는 뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

Description

게놈 변형 방법{METHODS FOR GENOMIC MODIFICATION}
본 출원은 2011년 4월 27일에 출원된 미국 가출원 제61/479,821 호; 2011년 6월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/500,741 호; 및 2011년 9월 26일에 출원된 미국 가출원 제61/539,389 호를 우선권으로 주장하며, 이들의 내용은 원용에 의해 참조로서 본원에 포함된다.
본원에서 제공하는 방법 및 조성물은 분자생물학 및 유전자 조작 분야에 관한 것이다.
외인성 핵산을 숙주 세포 게놈으로 도입 및 삽입하기 위한 유전자 조작 기술은 다양한 분야에서 요구되고 있다. 예를 들어, 합성 생물학 분야에서, 유전적으로 변형된 균주의 제조 시, 맞춤형(customized) DNA 서열을 숙주 세포의 염색체로 삽입하여야 하며, 보편적으로 산업적인 규모의 제조에서는 수십 개의 유전자를 숙주 유기체에 도입하여야 한다. 최적화된 산업용 균주 설계는 실험을 통해 완성되며, 다수 DNA 어셈블리들을 단독으로 및/또는 다른 생합성 경로의 구성성분들과 더불어 구축하고 생체내에서 시험하는 과정이 요구된다.
유전자 조작은, 공여체 주형 DNA의 염색체외 절편을 이용하여, 염색체 서열을 외인성 공여체 서열로 치환하기 위해 세포의 상동성 재조합 (HR) 시스템을 적용하는, 유전자 표적화에 크게 의존한다. 예를 들어, Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989)를 참조한다. 유전자 표적화는 그 효능 면에서 한정적이며; 식물 및 포유류 세포에서, 과량의 주형 서열을 제공받은 세포 106개 중에서 단지 약 1개만 원하는 유전자 변형이 이루어진다. 효모는 증가된 상동성 재조합력을 나타낸다. 그러나, 외인성 DNA를 효모 게놈으로 성공적으로 혼입하는 것은 여전히 비교적 드문 현상이므로 (약 1/105), 통상 단일 게놈 변형만을 포함하는 재조합 세포를 스크리닝하기 위한 선별 마커의 사용이 요구된다. 또한, 효모에서는 선별 마커를 한정된 캐시(limited cache)로만 이용가능하므로, 선별 마커(들)는, 동일한 마커들을 사용하여 추가로 게놈 변형을 할 수 있도록 일부 경우에는 제조 환경 또는 자연 환경에 숙주 세포를 방출시키기 전에, 재조합 균주로부터 제거되어야 한다. 따라서, 임의의 단일 위치에서 삽입이 이루어질 수 있는 효율성과는 무관하게, 한번에 하나씩(one-at-a-time) 이루어지는 게놈 조작의 속성으로 인해, 복수의 유전자 좌에 변화를 야기하는 데에는 변형시킬 유전자 좌의 수만큼 조작 사이클이 요구된다.
유전자 표적 효율은, 표적화된 게놈 이중-가닥 절단(DSB)이 원하는 삽입 부위 근처에 도입되는 경우, 개선될 수 있다. 예를 들어, Jasin, M., Trends Genet 12(6):224-228 (1996); and Urnov et al ., Nature 435(7042):646-651 (2005)를 참조한다. 소위 "설계자(designer) 뉴클레아제"는 생체내에서 DNA의 특정 "표적" 서열에 결합하여 그 자리에 이중-가닥 절단을 형성하는 데 적합할 수 있는 효소이다. 이러한 표적화된 이중-가닥 절단은 예를 들어, 숙주 세포를 설계자 뉴클레아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질전환시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 숙주 세포는 상동성-기반의 DNA 복구 또는 비-상동성 말단 접합에 의해 이들 이중-가닥 절단을 복구한다. 복구 시에, 어떤 한 가지 기전을 이용하여, 표적 부위에 외인성 공여체 DNA를 도입할 수 있다. 공여체 DNA의 도입과 동시에, 뉴클레아제를 세포 내로 도입하는 경우, 세포는 표적 유전자 좌에서 공여체 DNA를 삽입할 수 있다.
설계자(designer) 뉴클레아제의 출현으로 작물의 특정 표적 유전자 좌에 이식유전자(transgene)를 도입함으로써 (Wright et al ., Plant J 44:693-705 (2005)), 치료용 항체를 발현하는 포유류 배양 세포주를 개선하고 (Malphettes et al., Biotechnol Bioeng 106(5):774-783 (2010)), 심지어 HIV에 대해 내성을 나타내도록 인간 게놈 DNA를 수정할 수 있게 되었다 (Urnov et al ., Nat Rev Genet 11(9):636-646 (2010)). 효과적이긴 하지만, 다중 DNA 어셈블리를 예를 들어, 산업용 미생물에서 기능성 대사 경로를 구축하는 방향으로 삽입하는 데 필요한 여러 번의 조작 회차를 단축하기 위해서는, DSB-매개 HR이 좀 더 개발되어야 한다.
따라서, 복수의 외인성 핵산을 숙주 게놈 세포의 특정 영역으로 동시에 삽입할 수 있는 방법 및 조성물이 여전히 요구된다.
숙주 세포의 특정한 게놈 유전자 좌에 1종 이상의 외인성 핵산을 삽입하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 복수의 외인성 핵산은 한번의 형질전환 반응으로 동시에 삽입된다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 1종 이상의 뉴클레아제 및 1종 이상의 공여체 DNA 어셈블리를 세포로 도입하여, 게놈의 특정 위치에 공여체 DNA를 용이하게 삽입하는 단계를 포함한다. 상기 방법 및 상기 조성물은 숙주 세포의 고유한 상동성 재조합 시스템을 이용하며, 재조합은 숙주 세포의 게놈 내 원하는 삽입 부위에 표적화된 이중-가닥 절단 유도에 의해 더욱 강화된다.
따라서, 일 측면에서,
(a) 숙주 세포를,
(i) 각각의 외인성 핵산 (ES)x이 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x를 포함하되, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x가 상기 숙주 세포 게놈의 표적 부위 (TS)x에서 (ES)x의 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있는, 복수의 외인성 핵산; 및
(ii) 각각의 상기 표적 부위 (TS)x에 대해, (TS)x에서 절단할 수 있으며, 절단 시, (TS)x에서 (ES)x의 상동성 재조합이 이루어지는 뉴클레아제 (N)x와 접촉시키는 단계,
및
(b) 각각의 선별된 (ES)x가 각각의 선별된 표적 서열 (TS)x에 삽입된, 숙주 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 복수의 외인성 핵산을 숙주 세포 게놈에 삽입하는 방법을 제공하며,
여기서, x는 1 내지 n의 정수이며, n은 2 이상이다.
일부 실시 양태에서, (HR1)x는 (TS)x의 5' 영역과 상동성이며, (HR2)x는 (TS)x의 3' 영역과 상동성이다.
일부 실시 양태에서, (N)x는 (TS)x의 상기 5'과 3' 영역 사이에 위치한 영역에서 절단할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 단일 뉴클레아제는 각각의 (TS)x를 절단할 수 있다.
일부 실시 양태에서, n은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 일부 실시 양태에서, n>10이다.
일부 실시 양태에서, 상기 회수에는 선별 마커의 삽입을 필요로 하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 상기 회수는, 숙주 세포를 상기 표적 부위에서 절단할 수 있는 뉴클레아제와 접촉시키지 않는 경우와 비교해 더 높은 회수율로 달성된다. 일부 실시 양태에서, 상기 회수는, 스크리닝한, 접촉된 숙주 세포 또는 이의 클론 개체군 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2건 당 1건의 비율로 이루어진다. 일부 실시 양태에서, 상기 회수는 PCR, 서던 블롯(Southern blot), 제한효소 맴핑(restriction mapping), 및 DNA 서열분석(DNA sequencing)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 상기 삽입을 동정하는 단계를 포함한다.
일부 실시 양태에서, (N)x는 내인성 숙주 게놈 서열, 예를 들어, (TS)x의 내부 고유 유전자 좌를 절단할 수 있다. 일부 실시 양태에서, (N)x는 외인성 숙주 게놈 서열, 예를 들어, (TS)x에 도입된 유전자 좌를 절단할 수 있다.
일부 실시 양태에서, (ES)x는 (HR1)x의 3' 및 (HR2)x의 5'에 위치한 대상 핵산 (D)x를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, (D)x는 선별 마커, 프로모터, 에피토프 테그(epitope tag)를 코딩하는 핵산 서열, 대상 유전자, 리포터 유전자, 및 종결 코돈을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시 양태에서, (ES)x는 선형이다. 일부 실시 양태에서, (N)x는 (N)x를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서 제공된다. 일부 실시 양태에서, (N)x는 정제된 단백질로서 숙주 세포에 형질전환된다. 일부 실시 양태에서, (N)x는 정제된 RNA로서 숙주 세포에 형질전환된다.
일부 실시 양태에서, 상기 숙주 세포는 생합성 경로의 1종 이상의 효소를 코딩하는 1종 이상의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 생합성 경로의 1종 이상의 효소를 코딩하는 상기 1종 이상의 이종성 뉴클레오타이드 서열이 게놈에 삽입된다. 일부 실시 양태에서, 각각의 상기 외인성 핵산 (ES)x는, 생합성 경로의 효소를 코딩하는 대상 핵산 (D)x를, (HR1)x의 3' 및 (HR2)x의 5'의 위치에 포함한다. 일부 실시 양태에서, (D)x는 생합성 경로 효소의 변이체를 코딩하는 복수의 핵산 분자를 포함하는 라이브러리 (L)x의 구성원(member)이다.
일부 실시 양태에서, 상기 숙주 세포는 아이소펜테닐 파이로포스페이트를 제조하는 메발로네이트 (MEV) 경로의 1종 이상의 효소를 코딩하는 1종 이상의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 메발로네이트 경로의 상기 1종 이상의 효소는 아세틸-CoA 티올라제, HMG-CoA 신타제, HMG-CoA 리덕타제, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제 및 메발로네이트 파이로포스페이트 데카르복실라제로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, 상기 숙주 세포는 MEV 경로의 모든 효소를 각각 코딩하는 복수의 이종성 핵산을 포함한다. 즉, 복수의 이종성 핵산은, 함께, 전술한 MEV 경로의 각 효소 클래스(class)에 속하는 하나 이상의 효소를 코딩한다. 일부 실시 양태에서, 각각의 외인성 핵산 (ES)x는, 테르펜 신타제를 코딩하는 대상 핵산 (D)x를 (HR1)x의 3' 및 (HR2)x의 5'의 위치에 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 테르펜 신타제는 모노테르펜 신타제, 다이테르펜 신타제, 세스퀴테르펜 신타제, 세스터테르펜 신타제, 트리테르펜 신타제, 테트라테르펜 신타제, 및 폴리테르펜 신타제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시 양태에서, (N)x는 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, TAL-작동자(effector) DNA 결합 도메인-뉴클레아제 융합 단백질 (TALEN), 트랜스포자제(transposase), 및 부위-특이적인 재조합효소로 이루어진 군으로부터 선택되며, x는 1, 또는 1 내지 n의 임의의 정수이다. 일부 실시 양태에서, 상기 징크 핑거 뉴클레아제는, 조작된 징크 핑거 결합 도메인이 융합된 IIS형 제한효소 엔도뉴클레아제의 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시 양태에서, 상기 IIS형 제한효소 엔도뉴클레아제는 HO 엔도뉴클레아제 및 Fok I 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, 상기 징크 핑거 결합 도메인은 3, 5 또는 6개의 징크 핑거를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 LAGLIDADG 호밍 엔도뉴클레아제, HNH 호밍 엔도뉴클레아제, His-Cys box 호밍 엔도뉴클레아제, GIY-YIG 호밍 엔도뉴클레아제, 및 시아노박테리아 호밍 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 호밍 엔도뉴클레아제이다. 일부 실시 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 H-DreI, I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, Pi-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-CphI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NclIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp68031, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, i-UarAP, i-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MgaI, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, 또는 PI-TliII로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시 양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Fcph-I이다.
일부 실시 양태에서, 엔도뉴클레아제는 내인성 게놈 서열에 특이적으로 결합하도록 변형되며, 상기 변형된 엔도뉴클레아제는 더이상 이의 야생형 엔도뉴클레아제 인지 서열에 결합하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 상기 변형된 엔도뉴클레아제는 LAGLIDADG 호밍 엔도뉴클레아제, HNH 호밍 엔도뉴클레아제, His-Cys box 호밍 엔도뉴클레아제, GIY-YIG 호밍 엔도뉴클레아제, 및 시아노박테리아 호밍 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 호밍 엔도뉴클레아제로부터 유래된다. 일부 실시 양태에서, 상기 변형된 엔도뉴클레아제는, H-DreI, I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, Pi-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-CphI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NclIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp68031, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, i-UarAP, i-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MgaI, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, 또는 PI-TliII로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔도뉴클레아제로부터 유래한다.
일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 진균 세포, 박테리아 세포, 식물 세포, 동물 세포, 또는 인간 세포이다. 특정 실시 양태에서, 상기 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 실시 양태에서, 상기 효모 세포는 반수체 효모 세포이다. 일부 실시 양태에서, 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세래비지애 ( Saccharomyces cerevisiae ) 세포이다. 일부 실시 양태에서, 상기 사카로마이세스 세래비지애 세포는 빵 효모, Mauri, Santa Fe, IZ-1904, TA, BG-1 , CR-1, SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR-1, BR-1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1 또는 AL-1 균주의 세포이다.
다른 측면에서,
(a) 숙주 세포를,
(i) 제1 상동성 영역 (HR1) 및 제2 상동성 영역 (HR2)를 포함하는 복수의 외인성 핵산 (ES) (여기서, 상기 (HR1) 및 (HR2)는 상기 표적 부위 (TS)에서 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있음); 및
(ii) (TS)에서 절단할 수 있는 뉴클레아제 (N) (이때, 상기 절단으로 (TS)에서 (ES)의 상동성 재조합이 이루어짐)와 접촉시키는 단계,
및
(b) (TS)에 (ES)가 삽입된 효모 세포를 회수하는 단계 (여기서, 상기 회수를 위해 선별 마커의 삽입이 필요하지 않음)를 포함하는, 외인성 핵산을 효모 세포 게놈의 표적 부위에 마커를 사용하지 않고(markerless) 삽입하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본원에서 기술한 하나 이상의 외인성 핵산을 게놈에 삽입하는 임의의 방법에 의해 생성되는 변형된 숙주 세포를 제공하며, 상기 변형된 숙주 세포는,
(a) 복수의 외인성 핵산 (여기서, 상기 각각의 외인성 핵산 (ES)x는 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x를 포함하며, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 상기 숙주 세포 게놈의 표적 부위 (TS)x에서 (ES)x의 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있음); 및
(b) 각각의 상기 표적 부위 (TS)x에 대해, (TS)x에서 절단할 수 있는 뉴클레아제 (N)x (이때, 상기 절단으로 (TS)x에서 (ES)x의 상동성 재조합이 이루어짐)를 포함하며,
x는 1 내지 n의 정수이며, n은 2 이상이다.
일부 실시 양태에서, 상기 변형된 숙주 세포는 효모 세포이며,
(a) 제1 상동성 영역 (HR1) 및 제2 상동성 영역 (HR2)를 포함하는 외인성 핵산 (ES) (여기서, 상기 (HR1) 및 (HR2)는 상기 숙주 세포 게놈의 표적 부위 (TS)에서 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있음); 및
(b) (TS)에서 절단할 수 있는 뉴클레아제 (N) (이때, 상기 절단으로 (TS)에서 (ES)의 상동성 재조합이 이루어짐)를 포함하며,
상기 (ES)는 선별 마커를 포함하지 않는다.
다른 측면에서,
(a) 효모 세포;
(b) 복수의 외인성 핵산으로서, 각각의 외인성 핵산 (ES)x가,
(i) 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x (여기서, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 효모 세포 게놈의 선별된 표적 부위 (TS)x에서 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있음); 및
(ii) (HR1)x의 3' 및 (HR2)x의 5'에 위치한 대상 핵산 (D)x를 포함하는, 복수의 외인성 핵산; 및
(c) 복수의 뉴클레아제 (여기서, 상기 각각의 뉴클레아제 (N)x는 (TS)x에서 절단할 수 있으며, 이때 상기 절단으로 (TS)x에서 (ES)x의 상동성 재조합이 이루어짐)를 포함하는, 조성물을 제공하며,
x는 1 내지 n의 정수이며, n은 2 이상이다.
다른 측면에서, 본원에서 기술한 1종 이상의 외인성 핵산을 게놈에 삽입하기 위한 방법을 수행하는 데 유용한 키트를 제공한다. 일부 실시 양태에서, 상기 키트는,
(a) 복수의 외인성 핵산으로서, 상기 각각의 외인성 핵산 (ES)x이,
(i) 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x (여기서, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 효모 세포 게놈의 선별된 표적 부위 (TS)x에서 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있음); 및
(ii) (HR1)x의 3' 및 (HR2)x의 5'에 위치한 대상 핵산 (D)x를 포함하는, 복수의 외인성 핵산; 및
(b) 복수의 뉴클레아제 (여기서, 상기 각각의 뉴클레아제 (N)x는 (TS)x에서 절단할 수 있으며, 이때 상기 절단으로 (TS)x에서 (ES)x의 상동성 재조합이 이루어짐)를 포함한다.
일부 실시 양태에서, (D)x는 선별 마커, 프로모터, 에피토프 테그를 코딩하는 핵산 서열, 대상 유전자, 리포터 유전자, 및 종결 코돈을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, 상기 키트는 복수의 프라이머 쌍 (P)x을 추가로 포함하며, 상기 프라이머 쌍은 각각 PCR에 의해 (TS)x에서 (ES)x의 삽입을 동정할 수 있다. 일부 실시 양태에서, (ES)x는 선형이다. 일부 실시 양태에서, (ES)x는 원형이다.
특정 실시 양태에서, 상기 키트는 상기 효모 게놈의 대략 6000개의 유전자 좌 중 임의의 유전자 좌 내에 고유 표적 부위에서 외인성 핵산의 부위-특이적인 삽입을 구현할 수 있다. 이들 실시 양태에서, n은 ≥6000이며, 각각의 (TS)x는 효모 세포 게놈의 특정 유전자 좌에 대해 특이적이다.
도 1은 부위-특이적인 뉴클레아제를 이용한, 외인성 핵산의, 마커리스 게놈 삽입에 대한 예시적인 실시 양태를 제공한다.
도 2는 복수의 부위-특이적인 뉴클레아제를 이용한, 복수의 외인성 핵산의 동시적인 게놈 삽입에 대한 예시적인 실시 양태를 제공한다. HR1 - 상류 상동성 영역; HR2 - 하류 상동성 영역; TS - 표적 부위; N - 부위-특이적인 뉴클레아제; D - 대상 핵산.
도 3은 아이소프레노이드를 제조하는 MEV 경로의 도식 대표도를 제공한다.
도 4는 본원에서 제공한 조합적인 삽입 라이브러리의 제조 방법에 대한 예시적인 실시 양태를 제공한다. 해치 마크(hatch mark)는 각각의 라이브러리 (L)x의 개별 외인성 핵산 구성원을 나타낸다.
도 5는 빈(empty) 벡터 DNA, 및 기능성 EmGFP를 코딩하는 선형 "공여체" DNA로 형질전환된 효모 세포 콜로니 96개에 대한 콜로니 PCR 결과를 제공한다. 상기 효모 세포는, HO, YGR250c, 및 NDT80 유전자 좌 각각으로 게놈 삽입한 단축된(truncated), 비-기능성 EmGFP을 코딩하는 "표적" 핵산의 카피(copy)를 포함한다. 개별 PCR 반응을 수행하여, 기능성 EmGFP를 코딩하는 핵산에 특이적인 프라이머로 HO, YGR250c, 및 NDT80 유전자 좌를 탐침하였다. PCR 산물이 관찰되지 않았는데, 이는 비-기능성 EmGFP를 코딩하는 표적 핵산이 기능성 EmGFP를 코딩하는 공여체 핵산으로 대체되지 않았음을 의미한다.
도 6은 pZFN.gfp DNA, 및 기능성 EmGFP를 코딩하는 선형 "공여체" DNA로 형질전환된 효모 세포의 콜로니 96개에 대한 콜로니 PCR 결과를 제공한다. 상기 효모 세포는, HO, YGR250c, 및 NDT80 유전자 좌 각각으로 게놈 삽입한 단축된, 비-기능성 EmGFP을 코딩하는 "표적" 핵산의 카피를 포함하였다. pZFN.gfp는, 비-기능성 EmGFP 코딩 서열에 특이적인 핵산 서열을 인지하여 절단하는 징크 핑거 뉴클레아제를 코딩한다. 개별 PCR 반응을 수행하여, 기능성 EmGFP를 코딩하는 핵산에 특이적인 프라이머로 HO, YGR250c, 및 NDT80 유전자 좌를 탐침하였다. PCR 산물들이 다수 관찰되었는데, 이는 비-기능성 EmGFP 삽입체가 기능성 EmGFP를 코딩하는 DNA로 성공적으로 대체되었음을 의미한다.
도 7은, 메발로네이트 경로의 효소 및 파르네센 신타제 (farnesene synthase, FS)를 코딩하는 플라스미드를 포함하는 파르네센-생성 효모 모 균주인 균주 B; 아모파다이엔 신타제 (amorphadiene synthase, ADS)가 4 카피로 게놈에 삽입된, 균주 B의 유도체 균주인 균주 D; 및 FS를 코딩하는 플라스미드가 소실된, 균주 D의 유도체 균주인 균주 E의 세스퀴테르펜 역가(titer)를 제공한다. 모 균주 B의 세스퀴테르펜 생산력(capacity) 중 거의 100%가 균주 D 및 E에서 유지되었고, 단지 ADS를 다수 카피로 포함하고 있다.
도 8은, SFC1 (GFP 공여체 DNA) 및 YJR030c (ADE2 공여체 DNA) 유전자 좌에 대한 선형 공여체 DNA, YJR030c 엔도뉴클레아제 플라스미드 (pCUT006) 및 SFC1 엔도뉴클레아제 플라스미드 (pCUT058)로 공동-형질전환한 세포에 대한 결과를 제공한다. URA 드롭아웃(dropout) + Kan 한천 플레이트(agar plate)에서 선별한 콜로니 중 80%는 GFP 양성이었다. 이들 콜로니 중에서, 91%는 ADE2 삽입에 대해 양성이었다. 전체적으로, 콜로니 중 72.8%로 모든 유전자 좌에 마커리스 공여체 DNA가 성공적으로 삽입되었다.
6.1 정의
본원에서, 뉴클레아제, 예를 들어, 호밍 엔도뉴클레아제, 징크-핑거 뉴클레아제 또는 TAL-작동자 뉴클레아제에 관해 용어 "절단하다", "절단", 및/또는 "절단하는"은 특정 핵산에서 이중-가닥 절단(DSB)을 만드는 작용을 지칭한다. DSB는 당해 기술분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 블런트 말단(blunt end) 또는 스티키 말단(sticky end) (즉, 5' 또는 3' 오버행(오버행))을 남길 수 있다.
본원에서, 용어 "조작된 숙주 세포"는 유전자 조작 기술 (즉, 재조합 기술)을 이용해 모 세포를 유전적으로 변형함으로써 생성되는 숙주 세포를 지칭한다. 변형된 숙주 세포는 모 세포의 게놈에의 뉴클레오타이드 서열의 첨가, 결실, 및/또는 변형을 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "이종성"은 자연상에서 보통 발견되지 않는 것들을 지칭한다. 용어 "이종성 뉴클레오타이드 서열"은 자연상에서 주어진 세포에서 보통 발견되지 않는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 이와 같이, 이종성 뉴클레오타이드 서열은, (a) 이의 숙주 세포에 대해 외래성 (즉, 세포에 대해 "외인성")이거나; (b) 숙주 세포에서 자연적으로 발견되지만 (즉, "내인성"), 상기 세포에서 비자연적인 양으로 존재하거나 (즉, 숙주 세포에서 자연적으로 발견되는 양보다 더 많거나 더 적음); 또는 (c) 숙주 세포에서 자연적으로 발견되지만 이의 자연적인 유전자 좌의 외부에 위치할 수 있다.
본원에서, 용어 "상동성"은 2개 이상의 핵산 서열, 또는 2개 이상의 아미노산 서열 간의 동일성을 지칭한다. 서열 동일성은 동일성 (또는 유사성 또는 상동성) %로 측정할 수 있으며; %가 높을수록, 상기 서열은 서로 동일성이 더 높다. 핵산 또는 아미노산 서열의 호모로그 또는 오르소로그(ortholog)는 표준 방법을 이용해 정렬하였을 때, 서열 동일성이 상대적으로 높다. 비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 여러 가지 프로그램 및 정렬 알고리즘이 Smith & Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls . Biosc. 8, 155-65, 1992; 및 Pearson et al., Meth . Mol . Bio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-10, 1990에 기술되어 있으며, 서열 정렬 방법 및 상동성 계산법에 관한 상세 사항이 기술되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-10, 1990)은 서열 분석 프로그램인 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 함께 사용하기 위해 미국 생물학 정보 센터(National Center for Biological Information) (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, Md. 20894) 및 인터넷을 비롯해 다양한 소스에서 이용가능하다. 부가적인 정보는 NCBI 웹 사이트에서 찾을 수 있다.
본원에서, 용어 "마커를 사용하지 않고(마커리스 (markerless))"는 선별 마커의 삽입 없이, 숙주 세포 내 표적 부위로 공여체 DNA를 삽입하는 것을 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 상기 용어는 또한, 선별 마커를 숙주 세포 게놈에 삽입하는 것에 좌우되는 선별 방식을 이용하고, 이러한 숙주 세포를 회수하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 소정의 실시 양태에서, 에피좀(episomal) 또는 염색체외 선별 마커를 이용해, 게놈 표적 부위를 절단할 수 있는 뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드를 포함하는 세포를 선별할 수 있다. 이러한 용도는 선별 마커가 숙주 세포 게놈에 삽입되지 않는 한, "마커를 사용하지 않는 것"으로 간주될 것이다.
본원에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 당해 기술분야의 당업자가 이해하듯이, 뉴클레오타이드 단위로 이루어진 중합체를 지칭한다. 바람직한 뉴클레오타이드 단위로는, 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 티미딘 (T), 및 우라실 (U)을 포함하는 것들을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 유용한 변형된 뉴클레오타이드 단위로는, 4-아세틸시스티딘, 5-(카르복시하이드록실메틸)우리딘, 2-O-메틸시스티딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노-메틸우리딘, 다이하이드로우리딘, 2-O-메틸슈도우리딘, 2-O-메틸구아노신, 이노신, N6-아이소펜틸아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시스티딘, 5-메틸시스티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘, 2-메틸티오-N6-아이소펜틸아데노신, 우리딘-5-옥시아세트산-메틸에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산, 바이부톡소신(wybutoxosine), 바이부토신(wybutosine), 슈도우리딘, 퀴노신(queuosine), 2-티오시스티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, 2-O-메틸-5-메틸우리딘, 2-O-메틸우리딘 등으로 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산 ("DNA") 및 리보핵산 ("RNA")과 같은 천연(naturally occurring) 핵산, 뿐만 아니라 핵산 유사체를 포함한다. 핵산 유사체는 비-천연 염기, 천연 포스포다이에스테르 결합이 아닌 결합으로 다른 뉴클레오타이드와 연계되거나 또는 포스포다이에스테르 결합이 아닌 연결을 통해 결합되는 염기를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함하는 것들을 포함한다. 따라서, 뉴클레오타이드 유사체는, 예를 들어, 한정 없이, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로트리에스테르, 포스포라미데이트, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 펩타이드-핵산 (PNA) 등을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 서열을 기술하는 통상적인 명칭을 본원에서 사용한다: 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 말단은 5'-말단이며; 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 방향은 5'-방향이라고 지칭한다.
본원에서, 다중 삽입과 관련하여, 용어 "동시적인"은, 숙주 세포가 뉴클레아제, 예를 들어, 뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드,및 숙주 세포 게놈에 삽입될 하나 이상의 공여체 DNA로 공동-형질전환되는 시점에서 시작하여, 각각의 표적 유전자 좌에 상기 공여체 DNA가 성공적으로 삽입되었는지에 대해 상기 형질전환된 숙주 세포, 또는 이의 클론 개체군을 스크리닝하는 시점으로 종결되는 기간을 포함한다. 일부 실시 양태에서, "동시적인"에 포함되는 기간은 적어도, 표적 서열 뉴클레아제가 숙주 세포의 염색체(들) 내 이의 표적 서열에 결합하여 절단하는 데 필요한 시간이다. 일부 실시 양태에서, "동시적인"에 포함되는 기간은, 숙주 세포가 뉴클레아제, 예를 들어, 뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드 및 하나 이상의 공여체 DNA를 공동-형질전환하는 시점에서 시작하여, 적어도 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96시간, 또는 96시간 이상이다.
6.2 외인성 핵산을 삽입하는 방법
본원은, 1종 이상의 외인성 핵산을 숙주 세포 게놈의 1종 이상의 선별된 표적 부위로 삽입하는 방법을 제공한다. 소정의 실시 양태에서, 상기 방법은 숙주 세포를, 게놈 표적 부위에 삽입될 외인성 핵산을 포함하는 1종 이상의 삽입 폴리뉴클레오타이드, 즉, 공여체 DNA, 및 게놈 표적 부위 근처 또는 그 내부에서 이중-가닥 절단을 야기할 수 있는 1종 이상의 뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 게놈 표적 부위 근처 또는 그 내부에서의 절단은 상기 절단 자리에 또는 그 근처에서 상동성 재조합의 빈도를 크게 증가시킨다.
특정 측면에서,
(a) 숙주 세포를,
(i) 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x를 포함하는 외인성 핵산 (ES) (여기서, 상기 (HR1) 및 (HR2)는 상기 표적 부위 (TS)에서 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있음); 및
(ii) (TS)에서 절단할 수 있는 뉴클레아제 (N) (이때, 상기 절단으로 (TS)에서 (ES)의 상동성 재조합이 이루어짐)와 접촉시키는 단계,
및
(b) (TS)에 (ES)가 삽입된 숙주 세포를 회수하는 단계 (여기서, 상기 회수를 위해 선별 마커의 삽입이 필요하지 않음)를 포함하는, 외인성 핵산을 숙주 세포 게놈의 표적 부위로 마커를 사용하지 않고 삽입하는 방법을 제공한다.
도 1은, 부위-특이적인 뉴클레아제를 사용해 외인성 핵산을, 마커리스로 게놈에 삽입하는 예시적인 실시 양태를 제공한다. 공여체 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포로 도입되며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 제1 상동성 영역 (HR1) 및 제2 상동성 영역 (HR2)의 측면에 대상 핵산 (D)을 포함한다. HR1 및 HR2는 게놈 표적 부위 (TS)의 5' 및 3' 영역과 각각 상동성을 공유한다. 부위-특이적인 뉴클레아제 (N)가 또한, 숙주 세포에 도입되며, 상기 뉴클레아제는 상기 표적 부위 내 고유 서열을 인지 및 절단할 수 있다. 부위-특이적인 뉴클레아제에 의해 표적 부위 내 이중-가닥 절단을 유도하면, 내인성 상동성 재조합 시스템은, 이중-가닥 절단을 포함하지 않는 표적 부위와 비교해, 상기 절단된 표적 부위에 대상 핵산을 더 높은 빈도로 삽입한다. 이러한 삽입률의 증가는, 재조합이 이루어지는 형질전환체를 선별하기 위한, 선별 마커의 공동-삽입 필요성을 상실시킨다. 선별 마커 필요성을 없앰으로써, 예를 들어, 변형된 미생물의 구축 시, 완전한, 기능성 생합성 경로를 포함하는 균주를 구축하는 데 걸리는 시간이 크게 감소된다. 또한, 조작 전략은 더 이상, 해당 숙주 유기체에 이용가능한 마커의 한정된 캐시로 인한 선별 마커의 재활용 필요성에 제약을 받지 않게 된다.
일부 실시 양태에서, 성공적으로 삽입된 외인성 핵산을 포함하는 형질전환된 세포의 마커리스 회수는, 스크리닝한, 접촉된 숙주 세포 또는 이의 클론 개체군 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 또는 100건 당 약 1건의 비율로 이루어진다. 특정 실시 양태에서, 성공적으로 삽입된 외인성 핵산을 포함하는 형질전환된 세포의 마커리스 회수는, 스크리닝한, 접촉된 숙주 세포 또는 이의 클론 개체군 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10건 당 약 1건의 비율로 이루어진다. 보다 특정한 실시 양태에서, 성공적으로 삽입된 외인성 핵산을 포함하는 형질전환된 세포의 마커리스 회수는, 스크리닝한, 접촉된 숙주 세포 또는 이의 클론 개체군 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2건 당 약 1건의 비율로 이루어진다. 보다 특정한 실시 양태에서, 상기숙주 세포는 효모 세포이며, 삽입률의 증가는 다른 숙주 세포 유형과 비교해, 효모에서의 상동성 재조합의 능력 증가가 이유이다.
선별 마커의 사용 없이, 변형된 게놈을 표적 부위에서 또는 그 근처에 가지는 세포를 동정하기 위해 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이러한 방법은 표적 부위에서의 변화를 검출하고자 하며, 이로는 PCR 방법, 서열분석 방법, 뉴클레아제 분해, 예를 들어, 제한효소 맴핑, 서던 블롯, 및 이의 조합들을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
다른 측면에서,
(a) 숙주 세포를,
(i) 복수의 외인성 핵산 (여기서, 상기 각각의 외인성 핵산 (ES)x는 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x를 포함하며, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 상기 숙주 세포 게놈의 표적 부위 (TS)x에서 (ES)x의 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있음); 및
(ii) 각각의 상기 표적 부위 (TS)x에 대해, (TS)x에서 절단할 수 있는 뉴클레아제 (N)x (이때, 상기 절단으로 (TS)x에서 (ES)x의 상동성 재조합이 이루어짐)와 접촉시키는 단계,
및
(b) 숙주 세포를 회수하는 단계 (여기서, 상기 각각의 선별된 외인성 핵산 (ES)x은 각각의 선별된 표적 서열 (TS)x에서 삽입됨)를 포함하는, 복수의 외인성 핵산을 숙주 세포 게놈에 삽입하는 방법을 제공하며,
여기서, x는 1 내지 n의 정수이며, n은 2 이상이다.
도 2는 복수의 부위-특이적인 뉴클레아제를 사용해 복수의 외인성 핵산을 동시적으로 게놈 삽입하는 것에 관한 예시적인 실시 양태를 제공한다. 이 실시 양태에서, 3가지의 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포에 도입되며, 상기 각각의 폴리뉴클레오타이드는 대상 핵산 (D)x을 포함하는 외인성 핵산 (ES)x (x=1, 2 또는 3임)이다. 각각의 (D)x는 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x의 측면에 존재한다. (HR1)x 및 (HR2)x는 상기 게놈의 총 3가지의 고유 표적 부위 중 선별된 표적 부위 (TS)x의 5' 및 3' 영역과 각각 상동성을 공유한다. 복수의 부위-특이적인 뉴클레아제 (N)x가 또한 상기 숙주 세포에 도입되며, 상기 각각의 (N)x는 이의 상응하는 표적 부위, (TS)x 내 고유 서열을 인지 및 절단할 수 있다. 이의 상응하는 부위-특이적인 뉴클레아제 (N)x에 의해 표적 부위 (TS)x를 절단할 때, 내인성 상동성 재조합 시스템는 (TS)x에서 상응하는 대상 핵산 (D)x의 삽입을 촉진한다.
특정 실시 양태에서, 대상 핵산 (D)x를 선택적으로 포함하는 각각의 외인성 핵산 (ES)x는 이의 각각의 게놈 표적 부위 (TS)x로 동시에 삽입되는데, 즉 복수의 삽입 폴리뉴클레오타이드 및 복수의 뉴클레아제로 숙주 세포가 한번의 형질전환된다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 전술한 방법에 언급한 변형에 따라, 복수의 외인성 핵산 (ES)x (즉, x는 1 내지 n의 정수이며, n은 2 이상임)을 동시에 삽입하는 데 유용하다. 일부 실시 양태에서, 본원에서 제공하는 동시 삽입 방법은 10개 이하의 외인성 핵산 (ES)x를 10개의 선별된 표적 부위 (TS)x (즉, x는 1 내지 n의 정수이며, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10임)로 동시 삽입하는 데 유용하다. 일부 실시 양태에서, 본원에서 제공하는 동시 삽입 방법은 20개 이하의 외인성 핵산 (ES)x를 20개의 선별된 표적 부위 (TS)x (즉, x는 1 내지 n의 정수이며, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20임)로 동시 삽입하는 데 유용하다. 일부 실시 양태에서, n은 2이다. 일부 실시 양태에서, n은 3이다. 일부 실시 양태에서, n은 4이다. 일부 실시 양태에서, n은 5이다. 일부 실시 양태에서, n은 6이다. 일부 실시 양태에서, n은 7이다. 일부 실시 양태에서, n은 8이다. 일부 실시 양태에서, n은 9이다. 일부 실시 양태에서, n은 10이다. 일부 실시 양태에서, n은 11이다. 일부 실시 양태에서, n은 12이다. 일부 실시 양태에서, n은 13이다. 일부 실시 양태에서, n은 14이다. 일부 실시 양태에서, n은 15이다. 일부 실시 양태에서, n은 16이다. 일부 실시 양태에서, n은 17이다. 일부 실시 양태에서, n은 18이다. 일부 실시 양태에서, n은 19이다. 일부 실시 양태에서, n은 20이다. 일부 실시 양태에서, 본원에서 제공하는 동시 삽입 방법은 20개 초과의 외인성 핵산을 동시 삽입하는 데 유용하다.
단일 표적 부위에서의 단일 외인성 핵산의 삽입과 같이, 복수의 외인성 핵산의 동시 다중 삽입은, 표적 부위와 이중-가닥 절단을 유도할 수 있는 뉴클레아제와의 접촉이 없는 경우와 비교해, 상당히 높은 빈도로 발생한다 . 일부 실시 양태에서, 다중 유전자 좌에서의 복수의 외인성 핵산의 동시 삽입, 즉, 다중 뉴클레아제의 존재 하에서의 삽입 동안에, 단일 유전자 좌의 삽입률은 단일 삽입 현상, 즉, 단일 뉴클레아제의 존재 하에서의 삽입 동안 동일한 유전자 좌에서의 삽입률과 비교해 상당히 높다. 이러한 이점은 하기 실시예 6 (섹션 7.5.2)에 나타나 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 복수의 표적 부위에서 이중-가닥 절단 (DSB)을 만드는 다중 뉴클레아제의 존재 및 활성이, 절단 자리에 공여체 DNA(들)를 삽입함으로써 DSB를 성공적으로 복구하는 형질전환체 및/또는 DSB를 복구할 수 없는 형질전환체와 비교해 선별되는, 형질전환체를 농화하는 것으로 여겨진다. DSB가 세포에 유해하기 때문에, 뉴클레아제의 수적 증가는 더 많은 DSB를 생성하게 되며, 따라서 공여체 DNA(들)의 HR-매개의 삽입을 통해 DSB를 복구할 수 있는 세포의 농화가 이루어지는 것으로 여겨진다.
일부 실시 양태에서, 이러한 삽입률의 증가는 복수의 재조합 현상을 동정하기 위해 1종 이상의 선별 마커를 공동-삽입할 필요성을 없앤다. 일부 실시 양태에서, 복수의 성공적으로 삽입된 외인성 핵산을 포함하는 형질전환된 세포의 마커리스 회수는, 스크리닝한, 접촉된 숙주 세포 또는 이의 클론 개체군 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 또는 100건 당 약 1건의 비율로 이루어진다. 특정 실시 양태에서, 성공적으로 삽입된 외인성 핵산을 포함하는 형질전환된 세포의 마커리스 회수는, 스크리닝한, 접촉된 숙주 세포 또는 이의 클론 개체군 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10건 당 약 1건의 비율로 이루어진다. 보다 특정한 실시 양태에서, 성공적으로 삽입된 외인성 핵산을 포함하는 형질전환된 세포의 마커리스 회수는, 스크리닝한, 접촉된 숙주 세포 또는 이의 클론 개체군 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2건 당 약 1건의 비율로 이루어진다. 보다 특정한 실시 양태에서, 상기 숙주 세포는 효모 세포이며, 삽입률 증가는 다른 숙주 세포 유형과 비교해, 효모에서의 상동성 재조합 능력 증가로 인한 것이다.
6.2.1. 대사 경로 조작 방법
본원에서 기술하는 방법 및 조성물은 최적화된 생합성 경로, 예를 들어, 바이오매스를 바이오연료, 약제 또는 생체적합물질로 전환하는 경로를 포함하는 재조합 유기체를 구축하는 특정 이점들을 제공한다. 기능성이면서 비-천연적인 생물학적 경로는 항말라리아 약물인 아르테미시닌(artemisinin)으로의 전구체 (예를 들어, Martin et al., Nat Biotechnol 21:796-802 (2003) 참조); 지방산 유래의 연료 및 화학물질 (예를 들어, 지방산 에스테르, 지방 알코올 및 왁스; 예를 들어, Steen et al., Nature 463:559-562 (2010) 참조); 메틸 할라이드-유래의 연료 및 화학물질 (예를 들어, Bayer et al., J Am Chem Soc 131:6508-6515 (2009) 참조); 콜레스테롤 저하 약물을 제조하는 폴리케타이드 신타제 (예를 들어, Ma et al., Science 326:589-592 (2009) 참조); 및 폴리케타이드 (예를 들어, Kodumal, Proc Natl Acad Sci USA 101:15573-15578 (2004) 참조)를 제조하기 위한 미생물 숙주에서 성공적으로 구축된 바 있다.
전형적으로, 대사 조작, 및 특히 생합성 경로의 구축은, 경로 구성분이 한번에 하나의 단일 유전자 좌로 숙주 세포 게놈에 삽입되는 한번에 한 단계식의 방법으로 진행된다. 본원에서 제공하는 삽입 방법은, 신규 대사 경로, 즉, 숙주 세포에 의해 내인성으로 생성되지 않는 대사물질을 생성하는 대사 경로의 효소를 코딩하는 1종 이상의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 숙주 세포, 예를 들어, 미생물 세포를 조작하는 데 전형적으로 필요한 시간을 줄이는 데 이용할 수 있다. 다른 특정 실시 양태에서, 본원에서 제공하는 삽입 방법은 숙주 세포에 내인성인 대사 경로, 즉, 숙주 세포에 의해 내인성으로 생성되는 대사물질을 생성하는 대사 경로의 효소를 코딩하는 1종 이상의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 숙주 세포를 효율적으로 조작하는 데 사용할 수 있다. 일 실시 양태에서, 설계 전략은 숙주 세포의 3가지의 고유 유전자를 상보적인 외인성 경로로 대체하고자 할 수 있다. 현재의 당해 기술분야를 이용하는 이들 3가지 내인성 유전자 좌는 3가지 분리된 형질전환을 필요로 한다. 이와는 달리, 본원에서 제공하는 동시 다중 삽입 방법은 3가지 삽입 모두가 한번의 형질전환에서 수행될 수 있도록 하여, 필요한 조작 주기를 1/3로 줄일 수 있다. 더욱이, 상기 방법은 숙주 세포 캐시의 다중 자리에서 삽입된 최적화된 경로 구성분을 포함하는 DNA 어셈블리를 제2 숙주 세포 캐시의 유사한 자리로 포팅(porting)될 수 있게 한다. 원하는 유전자형을 조작하는 데 필요한 주기의 횟수를 줄임으로써, 대사 경로의 구축의 속도를 상당히 증가시킨다.
6.2.1.1 아이소프레노이드 경로 조작
일부 실시 양태에서, 본원에서 제공하는 방법은, 변형된 숙주 세포의 산물 프로파일을 변형시키기 위해 생합성 경로 중 1종 이상의 구성분을 동시에 도입 또는 대체하는 데 이용할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 생합성 경로는 아이소프레노이드 경로이다.
테르펜은 많은 유기체에서 생성되는 탄화수소의 큰 클래스이다. 테르펜이 (예를 들어, 산화 또는 탄소 골격의 재배열을 통해) 화학적으로 개질되는 경우, 생성되는 화합물은 일반적으로 테르페노이드로 지칭되며, 이는 아이소프레노이드로도 알려져 있다. 아이소프레노이드는 많은 중요한 생물학적 역할을 하는데, 예를 들어, 전자 수송 연쇄반응에서 퀴논으로서, 막 구성분으로서, 단백질 프레닐화를 통한 조절 및 아세포성 표적화에서, 카로테노이드, 클로로필을 비롯하여 광합성 색소로서, 호르몬 및 보조인자로서, 및 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 및 다이테르펜과 함께 식물 방어 화합물로서 작용한다. 이들은 항생제, 호르몬, 항암 약물, 살충제, 및 화학물질로서 산업적으로 유용하다.
테르펜은 아이소프렌 (C5H8)의 연결 단위에 의해 유래되며, 아이소프렌 단위 존재수에 의해 분류된다. 헤미테르펜은 단일 아이소프렌 단위로 이루어진다. 아이소프렌 자체는 유일한 헤미테르펜으로 간주된다. 모노테르펜은 2개의 아이소프렌 단위로 이루어지며, 분자식 C10H16을 가진다. 모노테르펜의 예는 게라니올(geraniol), 리모넨(limonene), 및 테르피네올(terpineol)이다. 세스퀴테르펜은 3개의 아이소프렌 단위로 이루어지며, 분자식 C15H24을 가진다. 세스퀴테르펜의 예는 파르네센 및 파르네솔(farnesol)이다. 다이테르펜은 4개의 아이소프렌 단위로 이루어지며, 분자식 C20H32을 가진다. 다이테르펜의 예는 카페스톨(cafestol), 카훼올(kahweol), 켐브렌(cembrene), 및 탁사다이엔(taxadiene)이다. 세스터테르펜은 5개의 아이소프렌 단위로 이루어지며, 분자식 C25H40을 가진다. 세스터테르펜의 예는 게라닐파르네솔(geranylfarnesol)이다. 트리테르펜은 6개의 아이소프렌 단위로 이루어지며, 분자식 C30H48을 가진다. 테트라테르펜은 8개의 아이소프렌 단위로 이루어지며, 분자식 C40H64을 가진다. 생물학적으로 중요한 테트라테르펜으로는, 아크릴릭 라이펜(acyclic lycopene), 모노사이클릭 감마-카로텐, 및 바이사이클릭 알파-카로텐 및 베타-카로텐을 포함한다. 폴리테르펜은 많은 아이소프렌 단위의 장쇄로 이루어진다. 천연 고무는, 이중 결합이 cis형인 폴리아이소프렌으로 이루어진다.
테르펜은 아이소펜테닐 파이로포스페이트 (아이소펜테닐 다이포스페이트 또는 IPP) 및 이의 이성질체인 다이메틸알릴 파이로포스페이트 (다이메틸알릴 다이포스페이트 또는 DMAPP)의 축합을 통해 생합성된다. IPP 및 DMAPP를 생성하는 2가지 경로, 즉 진핵생물의 메발로네이트-의존성 (MEV) 경로 (도 3), 및 원핵생물의 메발로네이트-비의존성 또는 데옥시크실룰로스-5-포스페이트 (DXP) 경로가 알려져 있다. 식물은 MEV 경로와 DXP 경로 둘 다를 이용한다. 즉, IPP 및 DMAPP는 프레닐 디스포스페이트 신타제 (예를 들어, 각각 GPP 신타제, FPP 신타제, 및 GGPP 신타제)의 작용을 통해 폴리프레닐 다이포스페이트 (예를 들어, 게라닐 디스포스페이트 또는 GPP, 파네실 다이포스페이트 또는 FPP, 및 게라닐게라닐 다이포스페이트 또는 GGPP)로 축합된다. 폴리프레닐 다이포스페이트 중간산물은 테르펜 신타제에 의해 보다 복잡한 아이소프레노이드 구조로 전환된다.
테르펜 신타제는 다중 산물을 형성하는 큰 유전자 패밀리로 구성된다. 테르펜 신타제의 예로는, GPP를 모노테르펜으로 전환하는 모노테르펜 신타제; GGPP를 다이테르펜으로 전환하는 다이테르펜 신타제; 및 FPP를 세스퀴테르펜으로 전환하는 세스퀴테르펜 신타제를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 세스퀴테르펜 신타제의 예는 파르네센 신타제로, FPP를 파르네센으로 전환한다. 테르펜 신타제는, 이들이 대사 분지점에서 작동하여 세포에 의해 생성되는 아이소프레노이드의 유형을 지시하기 때문에, 아이소프레노이드로의 경로 흐름의 조절에 중요하다. 더욱이, 테르펜 신타제는 이러한 테르펜의 고수율 생성에 중요하다. 이와 같이, 이종성 아이소프레노이드 생성을 위해 변형된 숙주에서 경로 흐름을 개선하기 위한 하나의 전략은 테르펜 신타제를 코딩하는 핵산의 다중 카피를 도입하는 것이다. 예를 들어, 파르네센과 같은 세스퀴테르펜의 생성이 요구되는 MEV 경로를 포함하는 변형된 미생물에서, 세스퀴테르펜 신타제, 예를 들어, 파르네센 신타제를 상기 경로의 말단 효소로서 이용하고, 파르네센 신타제 유전자의 다중 카피를 파르네센 생성에 최적화된 균주의 생성을 위해 숙주 세포로 도입할 수 있다.
아이소프레노이드의 생합성은 프레닐 디스포스페이트 신타제 및 테르펜 신타제의 상류 구성분과 동일한 경로에 의존하기 때문에, 일단 숙주 "플랫폼(platform)" 균주로 변형된 이들 경로 구성분을 세스퀴테르펜의 생성에 이용할 수 있으며, 세스퀴테르펜의 동일성은 숙주 세포로 도입되는 특정 세스퀴테르펜 신타제에 의해 지시될 수 있다. 더욱이, 서로 다른 아이소프렌 단위를 가진 테르펜, 예를 들어 세스퀴테르펜 대신에 모노테르펜의 생성이 바람직한 경우, 프레닐 다이포스페이트 신타제 및 테르펜 신타제 둘 다는 상기 경로의 상류 구성분을 여전히 이용하면서 서로 다른 테르펜을 생성하도록 대체될 수 있다.
따라서, 본원에서 제공되는 방법 및 조성물을 이용하여, 아이소프레노이드 생성 경로, 예를 들어, 원하는 아이소프레노이드를 생성하는 MEV 경로를 포함하는 숙주 세포를 효율적으로 변형할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 MEV 경로를 포함하며, 본원에서 제공되는 동시 다중 삽입 방법을 이용해, 프레닐 다이포스페이트 신타제 및/또는 테르펜 신타제의 다중 카피를 동시에 도입하여, 숙주 세포의 테르펜 산물 프로파일을 규명할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 프레닐 다이포스페이트 신타제는 GPP 신타제이며, 상기 테르펜 신타제는 모노테르펜 신타제이다. 일부 실시 양태에서, 상기 프레닐 다이포스페이트 신타제는 FPP 신타제이며, 상기 테르펜 신타제는 세스퀴테르펜 신타제이다. 일부 실시 양태에서, 상기 프레닐 다이포스페이트 신타제는 GGPP 신타제이며, 상기 테르펜 신타제는 다이테르펜 신타제이다. 다른 실시 양태에서, 숙주 세포는 MEV 경로 및 프레닐 다이포스페이트 신타제 및/또는 제1 형 테르펜, 예를 들어, 파르네센의 생성을 위한 테르펜 신타제를 포함하며, 본원에서 제공되는 동시 다중 삽입 방법은 프레닐 다이포스페이트 신타제 및/또는 제2 형 테르펜, 예를 들어, 아모파다이엔을 생성하기 위한 테르펜 신타제의 1종 이상의 카피를 동시에 대체할 수 있다. 이들 실시 양태는 하기 실시예 3 및 4에 예시되어 있다. 본원에서 제공하는 방법은 경로 구성분의 다중 카피를 이용하는 생합성 경로의 구축 및/또는 변형을 위해 유사하게 이용할 수 있으며, 산물 프로파일이 단일 경로 구성분의 다중 카피의 첨가 또는 교환으로 쉽게 변형될 수 있는 숙주 세포를 조작하는 데 특히 유용하다.
6.2.1.2 조합적인 삽입 라이브러리 생성 방법
생합성 경로가 일단 구축되면, 모든 구성분의 발현 수준은 대사 흐름을 최적화하고 산물 역가를 높게 달성하기 위해 조정될 필요가 있다. 흐름을 최적화하는 보편적인 방법으로는, 경로 구성분 유전자의 동일성에 변화를 주는 것, 유전자의 코돈 최적화, 가용성 테그의 사용, 단축 또는 공지된 돌연변이의 사용, 및 유전자의 발현 맥락(expression context)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 전형적인 방법을 이용해 균주를 구축하는 도중에 이러한 다양성을 시도하는 것은, 균주를 비현실적으로 많은 수로 생성 및 보관할 것을 필요로 한다. 예를 들어, 균주 조작자(strain engineer)는 3가지 유전자 좌에서 구축물을 삽입하고, 각각의 유전자 좌에 대해 10개의 변이체를 고안하는 경우, 조합적인 다양성을 전체적으로 시도하기 위해서는 1,000개의 균주가 생성될 필요가 있을 것이다. 경로 유전자가 협력하여 작동하고, 모든 대사 중간산물이 쉽게 스크리닝될 수 있는 것은 아니기 때문에, 종종 각각의 삽입 주기 후에 경로 유전자의 개별적인 기여(contribution)를 평가하는 것이 불가능하다. 따라서, 균주 조작자는 통상적으로, 신규 대사 경로를 구축할 때 시도하는 설계 공간(design space)을 심각하게 한정하는 선택을 한다.
최적의 경로 디자인을 보다 잘 동정하기 위해, 본원에서 제공되는 게놈 변형 방법을, 합리적으로 설계된 삽입 구축물의 조합적인 라이브러리를 포함하는 균주를 생성하는 데 이용할 수 있다. 상기 방법은, 1종 이상의 뉴클레아제 및 1종 이상의 공여체 DNA 어셈블리를 세포로 도입하여, 게놈의 특정 위치에서의 공여체 DNA의 다중 동시 삽입을 촉진하는 데 의존한다. 그러나, 변형된 균주의 다양성을 창출하기 위해, 상기 방법은, 숙주 균주의 조합적인 삽입 라이브러리가 생성될 수 있도록, 공여체 DNA의 라이브러리, 즉, 각각의 표적화된 유전자 좌에 대한 삽입 구축물의 혼합물을 공동-형질전환하는 단계를 포함한다 (도 4). 고 빈도의 다중 삽입이 달성된 것은, 생성되는 균주가 광범위한 게놈 품질 조절 없이 산물에 대해 직접 합리적으로 스크리닝될 수 있으며, 상부 균주의 동일성은 스크리닝 후에 예를 들어 서열분석에 의해 측정될 수 있음을 의미한다. 이러한 방법은 개별 균주 생성, 품질 관리 및 보관의 부담을 덜어주며, 조작자가, 단일 튜브에서 다양한 삽입 조합을 생성하고 예를 들어, 경로의 최종 산물에 대한 스크리닝에 의해 수행력이 최상인 균주를 골라낼 수 있게 한다.
따라서, 일부 실시 양태에서, 복수의 외인성 핵산을 본원에서 제공되는 숙주 세포 게놈에 삽입하는 방법은,
(a) 숙주 세포를,
(i) 복수의 라이브러리 (여기서, 상기 각각의 라이브러리 (L)x는 복수의 외인성 핵산을 포함하며, 선별된 외인성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 제1 상동성 영역 (HR1)x, (D)x 군으로부터 선택되는 임의의 대상 핵산, 및 제2 상동성 영역 (HR2)x를 포함하며, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 상기 숙주 세포 게놈의 표적 부위 (TS)x에서 상기 선별된 외인성 핵산의 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있음); 및
(ii) 각각의 상기 표적 부위 (TS)x에 대해, (TS)x에서 절단할 수 있는 뉴클레아제 (N)x (이때, 상기 절단으로 (TS)x에서 상기 선별된 외인성 핵산의 상동성 재조합이 이루어짐)와 접촉시키는 단계,
및
(b) 숙주 세포를 회수하는 단계 (여기서, 각각의 라이브러리 (L)x 유래의 외인성 핵산은 각각의 선별된 표적 서열 (TS)x에서 삽입됨)를 포함하며,
x는 1 내지 n의 정수이며, n은 2 이상이다.
상기 방법에 관한 도식적인 대표도는 도 4에 나타나 있다.
또한, 본원에서,
(a) 복수의 라이브러리 (여기서, 상기 각각의 라이브러리 (L)x는 복수의 외인성 핵산을 포함하며, 선별된 외인성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 제1 상동성 영역 (HR1)x, (D)x 군으로부터 선택되는 임의의 대상 핵산, 및 제2 상동성 영역 (HR2)x를 포함하며, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 상기 숙주 세포 게놈의 표적 부위 (TS)x에서 상기 선별된 외인성 핵산의 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있음); 및
(b) 각각의 상기 표적 부위 (TS)x에 대해, (TS)x에서 절단할 수 있는 뉴클레아제 (N)x (이때, 상기 절단으로 (TS)x에서 상기 선별된 외인성 핵산의 상동성 재조합이 이루어짐)를 포함하는, 숙주 세포를 제공하며,
x는 1 내지 n의 정수이며, n은 2 이상이다.
일부 실시 양태에서, 각각의 라이브러리 (L)x는 보편적인 생합성 경로의 효소를 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, (D)x 군은 101, 102, 103, 104, 105, 106 이상, 또는 106 개 초과의 고유 대상 핵산을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 각각의 라이브러리 (L)x는 생합성 경로의 효소의 변이체를 코딩하는 복수의 외인성 핵산을 포함한다. 본원에서, 용어 "변이체"는, 선별되는 효소와 비교해 상이한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 가지는 생합성 경로의 효소를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 라이브러리 (L)x는 세스퀴테르펜 신타제 변이체를 포함하며, 선별되는 세스퀴테르펜 신타제의 야생형 버전과 비교해, 상기 세스퀴테르펜 신타제 변이체는 상응하는 아미노산 서열에 변화를 주거나 또는 주지 않을 수 있는 뉴클레오타이드 첨가, 결실, 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 효소 변이체는 대조군 효소, 예를 들어 야생형 버전에 비해 아미노산 첨가, 결실 및/또는 치환을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 숙주 세포는, 상기 접촉 전에, 생합성 경로의 1종 이상의 효소를 코딩하는 1종 이상의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 생합성 경로의 1종 이상의 효소를 코딩하는 상기 1종 이상의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 게놈에 삽입된다.
6.3 삽입 폴리뉴클레오타이드
유리하게는, 삽입 폴리뉴클레오타이드, 즉, 공여체 DNA는 1종 이상의 외인성 핵산 구축물의, 숙주 세포 게놈의 선별된 표적 부위로의 삽입을 촉진한다. 바람직한 실시 양태에서, 삽입 폴리뉴클레오타이드는 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x, 및 선택적으로는 (HR1)x와 (HR2)x 사이에 위치한 대상 핵산을 포함하는, 외인성 핵산 (ES)x이다. 일부 실시 양태에서, 상기 삽입 폴리뉴클레오타이드는 선형 DNA 분자이다. 다른 실시 양태에서, 상기 삽입 폴리뉴클레오타이드는 원형 DNA 분자이다.
삽입 폴리뉴클레오타이드는 당해 기술분야의 당업자가 알고 있는 기술에 의해 생성될 수 있다. 소정의 실시 양태에서, 상기 삽입 폴리뉴클레오타이드는 당해 기술분야에 잘 알려진 중합효소 연쇄반응 (PCR) 및 분자 클로닝 기술을 이용해 생성된다. 예를 들어, PCR Technology : Principles and Applications for DNA Amplification, ed. HA Erlich, Stockton Press, New York, N.Y. (1989); Sambrook et al ., 2001, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; PCR Technology : Principles and Applications for DNA Amplification, ed. HA Erlich, Stockton Press, New York, N.Y. (1989); 미국 특허 제8,110,360 호를 참조한다.
6.3.1. 게놈 삽입 서열
바람직한 실시 양태에서, 삽입 폴리뉴클레오타이드는 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x를 포함하며, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 상기 숙주 세포 게놈의 표적 부위 (TS)x에서 (ES)x의 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있는 외인성 핵산 (ES)x를 포함한다. 외인성 핵산을 상동성 재조합에 의해 게놈에 삽입하기 위해, 상기 삽입 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 한쪽 말단에 (HR1)x, 및 다른쪽 말단에 (HR2)x를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 (HR1)x는 선별된 표적 부위 (TS)x의 5' 영역과 상동성이며, 상기 (HR2)x는 선별된 표적 부위 (TS)x의 3' 영역과 상동성이다. 일부 실시 양태에서, (HR1)x는 선별된 표적 부위 (TS)x의 5' 영역에 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 상동성이다. 일부 실시 양태에서, (HR2)x는 선별된 표적 부위 (TS)x의 3' 영역에 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 상동성이다.
소정의 실시 양태에서, (HR1)x는 대상 핵산 (D)x에 대해 5'에 위치한다. 일부 실시 양태에서, (HR1)x는 (D)x의 5' 말단에 바로 인접하여 위치한다. 일부 실시 양태에서, (HR1)x는 (D)x의 5'의 상류에 위치한다. 소정의 실시 양태에서, (HR2)x는 대상 핵산 (D)x에 대해 3'에 위치한다. 일부 실시 양태에서, (HR2)x의 3' 말단에 바로 인접하여 위치한다. 일부 실시 양태에서, (HR2)x(D)x의 3'의 하류에 위치한다
특정 게놈 유전자 좌에서 삽입 폴리뉴클레오타이드의 삽입에 영향을 줄 수 있는 특성으로는, 게놈 삽입 서열의 길이, 절제가능한 핵산 구축물의 전체 길이, 및 게놈 삽입 유전자 좌의 뉴클레오타이드 서열 또는 위치를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 예를 들어, 숙주 세포 게놈에서 게놈 삽입 서열의 한 가닥과 특정 유전자 좌의 한 가닥 사이의 효과적인 헤테로듀플렉스 형성은 상기 게놈 삽입 서열의 길이에 따라 다르다. 게놈 삽입 서열의 효과적인 길이 범위는 50 내지 5,000개 뉴클레오타이드이다. 게놈 삽입 서열과 게놈 유전자 좌 사이의 상동성의 효과적인 길이에 관해서는, Hasty et al ., Mol Cell Biol 11:5586-91 (1991)을 참조한다.
일부 실시 양태에서, (HR1)x 및 (HR2)x는, 효모 게놈 유전자 좌에서 외인성 핵산 (ES)x의 게놈 삽입을 허용하는, 충분한 길이 및 서열 동일성의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 실시 양태에서, (HR1)x 및 (HR2)x는 각각 독립적으로 약 50 내지 5,000개 뉴클레오타이드로 이루어진다. 소정의 실시 양태에서, (HR1)x 및 (HR2)x는 각각 독립적으로 약 100 내지 2,500개 뉴클레오타이드로 이루어진다. 소정의 실시 양태에서, (HR1)x 및 (HR2)x는 각각 독립적으로 약 100 내지 1,000개 뉴클레오타이드로 이루어진다. 소정의 실시 양태에서, (HR1)x 및 (HR2)x는 각각 독립적으로 약 250 내지 750개 뉴클레오타이드로 이루어진다. 소정의 실시 양태에서, (HR1)x 및 (HR2)x는 각각 독립적으로 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900 또는 5,000개 뉴클레오타이드로 이루어진다. 일부 실시 양태에서, (HR1)x 및 (HR2)x는 각각 독립적으로 약 500개 뉴클레오타이드로 이루어진다.
6.3.2. 대상 핵산
일부 실시 양태에서, 삽입 폴리뉴클레오타이드는 추가로 대상 핵산 (D)x를 포함한다. 상기 대상 핵산은 당해 기술분야의 당업자에 의해 유용하게 여겨지는 DNA 분절일 수 있다. 예를 들어, 상기 DNA 분절은 숙주 게놈으로 "나킹 인(knocked in)"될 수 있는 대상 유전자를 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, DNA 분절은 "낙아웃(knockout)" 구축물로서 기능하는데, 이는 숙주 세포 게놈의 표적 부위로 구축물이 삽입될 때 표적 유전자를 특이적으로 방해하여, 방해된 유전자가 비-기능성이 되게 할 수 있다. 대상 핵산 (D)x의 유용한 예로는, 단백질-코딩 서열, 리포터 유전자, 형광 마커 코딩 서열, 프로모터, 인핸서, 종결자, 전사 활성자, 전사 억제자, 전사 활성자 결합 부위, 인트론, 엑손, 폴리-A 꼬리, 다중 클로닝 자리, 핵 위치화 신호, mRNA 안정화 신호, 삽입 유전자 좌, 에피토프 테그 코딩 서열, 분해 신호, 또는 다른 천연 또는 합성적인 DNA 분자를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 양태에서, (D)x는 그 기원이 자연적일 수 있다. 다른 예로, (D)x는 그 기원이 완전히 합성적이어서 시험관내에서 생성될 수 있다. 아울러, (D)x는 분리된 천연 DNA 분자의 조합, 또는 분리된 천연 DNA 분자와 합성적인 DNA 분자의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, (D)x는 단백질 코딩 서열에 조작적으로 연결된 이종성 프로모터, 폴리-A 꼬리에 연결된 단백질 코딩 서열, 에피토프 테그 코딩 서열과 프레임 내에서 연결된 단백질 코딩 서열 등을 포함할 수 있다. 대상 핵산 (D)x는 게놈 DNA, 또는 이의 절편의 화학적 합성에 의해, cDNA 클로닝에 의해, 또는 클로닝에 의해, 또는 PCR 증폭 및 클로닝에 의해, 당해 기술분야에 공지된 표준 절차에 의해 클로닝된 DNA (예를 들어, DNA "라이브러리")로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, Sambrook et al ., Molecular Cloning, Laboratory Manual, 3d. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); Glover, D.M. (ed.), DNA Cloning : A Practical Approach, 2d. ed., MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1995)를 참조한다.
특정 실시 양태에서, 대상 핵산 (D)x는 선별 마커를 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다. 이들 실시 양태에서, 본원에서 기술한 방법에 의해 제공되는 삽입의 고효율은 선별 배지 상에서 형질전환된 세포를 성장시킬 필요 없이, 삽입 현상의 스크리닝하고 동정할 수 있게 한다. 그러나, 선별 배지 상에서의 성장이 바람직한 다른 실시 양태에서, 대상 핵산 (D)x는 외인성 핵산의 숙주 게놈으로의 삽입을 선별하는 데 사용할 수 있는 선별 마커를 포함한다.
여러 가지 다양한 선별 마커가 당해 기술분야에 알려져 있다 (예를 들어, Kaufinan, Meth . Enzymol., 185:487 (1990); Kaufman, Meth . Enzymol., 185:537 (1990); Srivastava and Schlessinger, Gene, 103:53 (1991); Romanos et al., in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, pages 123-167 (IRL Press 1995); Markie, Methods Mol . Biol., 54:359 (1996); Pfeifer et al., Gene, 188:183 (1997); Tucker and Burke, Gene, 199:25 (1997); Hashida-Okado et al., FEBS Letters, 425:117 (1998) 참조). 일부 실시 양태에서, 상기 선별 마커는 약물 내성 마커이다. 약물 내성 마커는, 해독되지 않으면 세포를 사멸하게 할 외인성 약물을 세포가 해독할 수 있게 한다. 약물 내성 마커의 예시적인 예로는, 암피실린, 테트라사이클린, 케나마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 하이그로마이신, 네오마이신, Zeocin™ 등과 같은 항생제에 대해 내성을 부여하는 것들을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 다른 실시 양태에서, 선별 마커는 영양요구성 마커이다. 영양요구성 마커는 필수 구성분이 결여된 배지에서 성장되지만 필수 구성분 (통상 아미노산)을 세포가 합성할 수 있게 한다. 선별성 영양요구성 유전자 서열로는, 예를 들어, hisD을 포함하는데, 이는 히스티디놀의 존재 하에 히스티딘-무첨가 배지에서 성장할 수 있게 한다. 다른 선별 마커로는, 블레오마이신-내성 유전자, 메탈로티오네인 유전자, 하이그로마이신 B-포스포트랜스퍼라제 유전자, AURI 유전자, 아데노신 디아미나제(deaminase) 유전자, 아미노글라이코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자, 다이하이드로폴레이트 리덕타제 유전자, 티미딘 키나제 유전자, 잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자 등을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 선별 마커는 영양요구성 돌연변이를 구제하는 것이 아닌 마커이다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 영양요구성 돌연변이가 아닌 돌연변이, 예를 들어, 돌연변이가 공지된 선별 방법으로 동정될 수 있는 한, 숙주에 치명적이지 않으며 균주의 원하는 용도, 예를 들어 산업적 발효에 악영향을 야기하지 않는 돌연변이를 포함한다.
염색체적으로 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포 형질전환체는 또한, 개별 DNA 분절 또는 DNA 분절의 조합에 의해 코딩되는 다른 특성, 예를 들어, 발광하는 펩타이드의 발현을 나타내는 숙주 세포 형질전환체를 선별하거나, 또는 개별의 숙주 세포 콜로니의 분자적 분석, 예를 들어, 제한효소 효소 지도화, PCR 증폭, 또는 분리한 조립된 폴리뉴클레오타이드 또는 염색체 삽입 부위의 서열 분석에 의해, 동정할 수 있다.
6.4 뉴클레아제
본원에서 제공되는 방법의 일부 실시 양태에서, 숙주 세포 게놈을, 절단, 즉, 선별된 표적 부위 내 지정 영역에서 이중-가닥 절단을 유도할 수 있는, 1종 이상의 뉴클레아제와 접촉시킨다. 일부 실시 양태에서, 이중-가닥 절단 유도제는 특정 폴리뉴클레오타이드 인지 서열을 인지 및/또는 결합하여, 상기 인지 서열에 또는 그 근처에 절단이 생기게 하는, 임의의 제제이다. 이중-가닥 절단 유도제의 예로는, 엔도뉴클레아제, 부위-특이적인 재조합효소, 트랜스포자제, 토포아이소머라제, 및 징크 핑거 뉴클레아제를 포함하나 이로 한정되지 않으며, 이의 변형된 유도체, 변이체, 및 절편을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 1종 이상의 뉴클레아제의 각각은 선별된 표적 부위 (TS)x 내 지정된 영역에 이중-가닥 절단을 유도할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 뉴클레아제는, (HR1)x 및 (HR2)x가 각각 상동성을 공유하는 (TS)x 의 5' 영역과 3' 영역 사이에 위치한 영역에서 이중-가닥 절단을 유도할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 뉴클레아제는 (TS)x의 5' 영역과 3' 영역의 상류 또는 하류에 위치한 영역에서 이중-가닥 절단을 유도할 수 있다.
인지 서열은 이중-가닥 절단 유도제에 의해 특이적으로 인지 및/또는 결합되는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 인지 부위 서열의 길이는 다양할 수 있으며, 예를 들어, 길이가 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70개 이상의 뉴클레오타이드로 된 서열이다.
일부 실시 양태에서, 인지 서열은 회문식(palindromic)으로, 즉, 한쪽 가닥의 서열은 상보성 가닥의 반대 방향과 동일하게 판독된다. 일부 실시 양태에서, 닉/절단 부위가 상기 인지 서열 내에 존재한다. 다른 실시 양태에서, 상기 닉/절단 부위는 상기 인지 서열의 외부에 존재한다. 일부 실시 양태에서, 절단으로 블런트 말단이 생긴다. 다른 실시 양태에서, 절단으로 단일-가닥 오버행, 즉, "스티키성 말단"이 생기며, 이는 5' 오버행 또는 3' 오버행일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 선별된 표적 부위 내 인지 서열은 상기 숙주 세포 게놈에 대해 내인성 또는 외인성일 수 있다. 인지 부위가 내인성 서열인 경우, 이는 천연, 또는 고유한 이중-가닥 절단 유도제에 의해 인지되는 인지 서열일 수 있다. 다른 예로, 내인성 인지 부위는, 내인성 인지 서열을 특이적으로 인지하도록 설계 또는 선별된 변형된 또는 조작된 이중-가닥 절단 유도제에 의해 인지 및/또는 결합되어, 이중-가닥 절단을 생성할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 변형된 이중-가닥 절단 유도제는 고유의, 천연 이중-가닥 절단 유도제로부터 유래된다. 다른 실시 양태에서, 변형된 이중-가닥 절단 유도제는 인공적으로 만들어지거나 또는 합성된다. 이러한 변형된 또는 조작된 이중-가닥 절단 유도제를 선별하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 단백질(들)의 아미노산 서열 변이체는 DNA에서 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이생성(mutagenesis) 및 뉴클레오타이드 서열 변경 방법으로는, 예를 들어, Kunkel, (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:488-92; Kunkel, et al., (1987) Meth Enzymol 154:367-82; 미국 특허 제4,873,192 호; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) 및 상기 문헌들에서 언급한 참조문헌들을 포함한다. 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않을 아미노산 치환에 관한 지침은 예를 들어, Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequences and Structure (Natl Biomed Res Found, Washington, D.C.)의 모델에 나타나 있다. 보존적인 치환, 예컨대 하나의 아미노산을 유사한 특성을 가진 또 다른 아미노산으로 바꾸는 것이 바람직할 수 있다. 보존적 결실, 삽입, 및 아미노산 치환은 단백질의 특성에 급진적인 변화를 주지 않을 것으로 예상되며, 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 조합의 효과는 일상적인 스크리닝 분석법으로 평가할 수 있다. 이중-가닥 절단 유도 활성에 대한 분석법이 알려져 있으며, 이는 일반적으로 인지 부위를 포함하는 DNA 기질에 대한 상기 제제의 전반적인 활성 및 특이성을 측정한다.
본원에서 제공하는 방법의 일부 실시 양태에서, 1종 이상의 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제이다. 엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오타이드 사슬 내 포스포다이에스테르 결합을 절단하는 효소로서, 염기에 손상을 주지 않으면서 특정 부위에서 DNA를 절단하는 제한효소 엔도뉴클레아제를 포함한다. 제한효소 엔도뉴클레아제로는 I형, II형, III형, 및 IV형 엔도뉴클레아제를 포함하며, 서브타입을 추가로 포함한다. 제한효소 엔도뉴클레아제는 예를 들어 REBASE 데이터베이스 (webpage at rebase.neb.com; Roberts, et al ., (2003) Nucleic Acids Res 31:418-20), Roberts, et al ., (2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12, 및 Belfort, et al ., (2002) in Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie, et al ., ASM Press, Washington, D.C에서 추가로 기술 및 예시되어 있다.
본원에서, 엔도뉴클레아제는 또한, 제한효소 엔도뉴클레아제처럼 특정 인지 서열에 결합하여 절단하는 호밍 엔도뉴클레아제를 포함한다. 그러나, 호밍 엔도뉴클레아제에 대한 인지 부위는 전형적으로 더 길며, 예를 들어, 약 18 bp 이상이다. 메가뉴클레아제로도 알려져 있는 호밍 엔도뉴클레아제는 보존된 서열 모티프(motif)를 토대로 하기 패밀리로 분류된다 : LAGLIDADG (SEQ ID NO: 50) 호밍 엔도뉴클레아제, HNH 호밍 엔도뉴클레아제, His-Cys box 호밍 엔도뉴클레아제, GIY-YIG (SEQ ID NO: 51) 호밍 엔도뉴클레아제, 및 시아노박테리아 호밍 엔도뉴클레아제. 예를 들어, Stoddard, Quarterly Review of Biophysics 38(1): 49-95 (2006)을 참조한다. 이들 패밀리는, 이들의 보존된 뉴클레아제 활성-부위 코어 모티프 및 촉매 메커니즘, 생물학적 및 게놈 구분, 및 비-호밍 뉴클레아제 시스템과의 보다 공범위한 관계에서 크게 상이하다. 예를 들어, Guhan and Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248; Lucas, et al ., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9; Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95; 및 Moure, et al ., (2002) Nat Struct Biol 9:764를 참조한다. 이들 패밀리의 유용한 특정 호밍 엔도뉴클레아제의 예로는, I-CreI (Rochaix et al ., Nucleic Acids Res. 13: 975-984 (1985), I-MsoI (Lucas et al ., Nucleic Acids Res. 29: 960-969 (2001) 참조), I-SceI (Foury et al ., FEBS Lett . 440: 325-331 (1998) 참조), I-SceIV (Moran et al ., Nucleic Acids Res. 20: 4069-4076 (1992) 참조), H-DreI (Chevalier et al ., Mol . Cell 10: 895-905 (2002) 참조), I-HmuI (Goodrich-Blair et al ., Cell 63: 417-424 (1990); Goodrich-Blair et al ., Cell 84: 211-221 (1996) 참조), I-PpoI (Muscarella et al ., Mol . Cell. Biol . 10: 3386-3396 (1990) 참조), I-DirI (Johansen et al ., Cell 76: 725-734 (1994); Johansen, Nucleic Acids Res. 21: 4405 (1993) 참조), I-NjaI (Elde et al ., Eur . J. Biochem . 259: 281-288 (1999); De Jonckheere et al ., J. Eukaryot . Microbiol. 41: 457-463 (1994) 참조), I-NanI (Elde et al ., S. Eur . J. Biochem . 259: 281-288 (1999); De Jonckheere et al ., J. Eukaryot . Microbiol . 41: 457-463 (1994) 참조), I-NitI (De Jonckheere et al ., J. Eukaryot . Microbiol . 41: 457-463 (1994); Elde et al ., Eur . J. Biochem . 259: 281-288 (1999) 참조), I-TevI (Chu et al ., Cell 45: 157-166 (1986) 참조), I-TevII (Tomaschewski et al ., Nucleic Acids Res. 15: 3632-3633 (1987) 참조), I-TevIII (Eddy et al ., Genes Dev. 5: 1032-1041 (1991) 참조), F-TevI (Fujisawa et al ., Nucleic Acids Res. 13: 7473-7481 (1985) 참조), F-TevII (Kadyrov et al ., Dokl . Biochem . 339: 145-147 (1994); Kaliman, Nucleic Acids Res. 18: 4277 (1990) 참조), F-CphI (Zeng et al., Curr . Biol . 19: 218-222 (2009) 참조), PI-MgaI (Saves et al ., Nucleic Acids Res. 29:4310-4318 (2001) 참조), I-CsmI (Colleaux et al ., Mol . Gen . Genet. 223:288-296 (1990) 참조), I-CeuI (Turmel et al ., J . Mol . Biol . 218: 293-311 (1991) 참조), 및 PI-SceI (Hirata et al .,.J. Biol . Chem . 265: 6726-6733 (1990) 참조)를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
본원에서 제공되는 방법의 일부 실시 양태에서, 호밍 엔도뉴클레아제의 천연 변이체, 및/또는 변형된 유도체를 사용한다. 키네틱스, 보조인자 상호작용, 발현, 최적 조건, 및/또는 인지 부위 특이성, 및 활성 스크리닝을 변형하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, Epinat, et al ., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier, et al ., (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble, et al ., (2003) Mol Biol 334:993-1008; Seligman, et al ., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman, et al ., (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen, et al ., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; Chames, et al ., (2005) Nucleic Acids Res 33:e178; Smith, et al ., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen, et al ., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:e154; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; 및 WO2004031346를 참조한다. 유용한 호밍 엔도뉴클레아제는 또한, WO04/067736; WO04/067753; WO06/097784; WO06/097853; WO06/097854; WO07/034262; WO07/049095; WO07/049156; WO07/057781; WO07/060495; WO08/152524; WO09/001159; WO09/095742; WO09/095793; WO10/001189; WO10/015899; 및 WO10/046786에 기술한 것들을 포함한다.
호밍 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 절단 유도제로서 사용될 수 있으며, 이로는 H-DreI, I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, Pi-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-CphI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NclIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp68031, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MgaI, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, 또는 PI-TliII, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 양태에서, 엔도뉴클레아제는 고유한 또는 내인성 인지 서열에 결합한다. 다른 실시 양태에서, 엔도뉴클레아제는, 비-고유한 또는 외인성 인지 서열에 결합하며 고유한 또는 내인성 인지 서열에는 결합하지 않는, 변형된 엔도뉴클레아제이다.
본원에서 제공하는 방법의 일부 실시 양태에서, 1종 이상의 뉴클레아제는 TAL-작동자 DNA 결합 도메인-뉴클레아제 융합 단백질 (TALEN)이다. 잔토모나스( Xanthomonas ) 속(genus)의 식물 병원성 박테리아의 TAL 작동자는 숙주 DNA에 결합하고 작동자-특정 숙주 유전자를 활성화함으로써, 질환에서 중요한 역할을 하거나 또는 방어를 유도한다. 예를 들어, Gu et al . (2005) Nature 435:1122-5; Yang et al ., (2006) Proc . Natl. Acad . Sci. USA 103:10503-8; Kay et al ., (2007) Science 318:648-51; Sugio et al ., (2007) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 104:10720-5; Romer et al ., (2007) Science 318:645-8; Boch et al ., (2009) Science 326(5959):1509-12; 및 Moscou and Bogdanove, (2009) 326(5959):1501을 참조한다. TAL 작동자는, 1종 이상의 탠덤 반복 도메인(tandem repeat domain)을 통해 서열-특이적 방식으로 DNA와 상호작용하는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 상기 반복된 서열은 전형적으로 34개 아미노산을 포함하며, 상기 반복체는 전형적으로 서로 91 내지 100% 상동성이다. 상기 반복체의 다형성은 통상 12번째 및 13번째 위치에 위치하며, 12번째 및 13번째 반복 가변성-2잔기(diresidue)의 동일성과, TAL-작동자의 표적 서열 내 인접(contiguous) 뉴클레오타이드의 동일성 간에 1:1 대응이 존재하는 것으로 보인다.
TAL-작동자 DNA 결합 도메인은 원하는 표적 서열에 결합하도록 변형되며, 예를 들어, II형 제한효소 엔도뉴클레아제의 뉴클레아제 도메인, 전형적으로 II형 제한효소 엔도뉴클레아제 예컨대 FokI의 비특정 절단 도메인에 융합될 수 있다 (예를 들어, Kim et al . (1996) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:1156-1160 참조). 다른 유용한 엔도뉴클레아제로는, 예를 들어, HhaI, HindIII, Nod, BbvCI, EcoRI, BglI, 및AlwI을 포함할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시 양태에서, TALEN은, TALEN이 특정 뉴클레오타이드 서열 내 또는 이에 인접한 표적 DNA를 절단하도록, 복수의 TAL 작동자 반복 서열을 포함하는, 즉, 표적 DNA 서열에 특정 뉴클레오타이드 서열을 결합시키는 TAL 작동자 도메인을 포함한다. 본원에서 제공하는 방법에 유용한 TALENS으로는 WO10/079430 및 미국 출원 공개 제2011/0145940 호에 기술된 것들을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 표적 DNA 내 특정 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 TAL 작동자 도메인은 10개 이상의 DNA 결합 반복체, 바람직하게는 15개 이상의 DNA 결합 반복체를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 각각의 DNA 결합 반복체는 반복 가변성-2잔기(RVD)를 포함하며, 이는 표적 DNA 서열의 염기쌍의 인지을 결정하며, 상기 각각의 DNA 결합 반복체는 표적 DNA 서열의 하나의 염기쌍을 인지하는 데 관여하며, 상기 RVD는, C를 인지하는 HD; T를 인지하는 NG; A를 인지하는 NI; G 또는 A를 인지하는 NN; A 또는 C 또는 G 또는 T를 인지하는 NS; C 또는 T를 인지하는 N* (여기서, *는 RVD의 제2 위치에서의 갭을 나타냄); T를 인지하는 HG; T를 인지하는 H* (여기서, *는 RVD의 제2 위치에서의 갭을 나타냄); T를 인지하는 IG; G를 인지하는 NK; C를 인지하는 HA; C를 인지하는 ND; C를 인지하는 HI; G를 인지하는 HN; G를 인지하는 NA; G 또는 A를 인지하는 SN; 및 T를 인지하는 YG 중 1종 이상을 포함한다.
본원에서 제공하는 방법의 일부 실시 양태에서, 1종 이상의 뉴클레아제는 부위-특이적인 재조합효소이다. 재조합효소로도 지칭되는 부위-특이적인 재조합효소는, 융화성 재조합 부위 사이의 보존적 부위-특이적인 재조합을 촉매하며, 고유한 폴리펩타이드 뿐만 아니라, 활성을 유지하는 이의 유도체, 변이체 및/또는 절편, 및 재조합 효소를 코딩하는 고유한 폴리뉴클레오타이드, 활성을 유지하는 유도체, 변이체, 및/또는 절편을 포함하는 폴리펩타이드이다. 부위-특이적인 재조합효소 및 이들의 인지 부위에 관해서는, Sauer (1994) Curr Op Biotechnol 5:521-7; 및 Sadowski, (1993) FASEB 7:760-7을 참조한다. 일부 실시 양태에서, 재조합효소는 세린 재조합효소 또는 티로신 재조합효소이다. 일부 실시 양태에서, 재조합효소는 인테그라제(Integrase) 또는 레솔바제(Resolvase) 패밀리 유래이다. 일부 실시 양태에서, 재조합효소는 FLP, Cre, 람다 인테그라제, 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되는 인테그라제이다. 인터그라제 패밀리의 다른 구성원들에 관해서는, 예를 들어, Esposito, et al ., (1997) Nucleic Acids Res 25:3605-14 및 Abremski, et al ., (1992) Protein Eng 5:87-91를 참조한다. 키네틱스, 보조인자 상호작용 및 요건, 발현, 최적 상태, 및/또는 인지 부위 특이성을 변형시키고, 재조합효소 및 변이체의 활성을 스크리닝하는 방법이 알려져 있으며, 예를 들어 Miller, et al ., (1980) Cell 20:721-9; Lange-Gustafson and Nash, (1984) J Biol Chem 259:12724-32; Christ, et al ., (1998) J Mol Biol 288:825-36; Lorbach, et al., (2000) J Mol Biol 296:1175-81; Vergunst, et al ., (2000) Science 290:979-82; Dorgai, et al ., (1995) J Mol Biol 252:178-88; Dorgai, et al ., (1998) J Mol Biol 277:1059-70; Yagu, et al ., (1995) J Mol Biol 252:163-7; Sclimente, et al ., (2001) Nucleic Acids Res 29:5044-51; Santoro and Schultze, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:4185-90; Buchholz and Stewart, (2001) Nat Biotechnol 19:1047-52; Voziyanov, et al ., (2002) Nucleic Acids Res 30:1656-63; Voziyanov, et al., (2003) J Mol Biol 326:65-76; Klippel, et al ., (1988) EMBO J 7:3983-9; Arnold, et al ., (1999) EMBO J 18:1407-14; WO03/08045; WO99/25840; 및 WO99/25841을 참조한다. 인지 부위의 범위는 약 30개 뉴클레오타이드의 최소 부위부터 수백개 뉴클레오타이드에 이른다. 자연적인 부위 및 변이체를 비롯하여, 재조합효소에 대한 인지 부위를 사용할 수 있다. 변이체 인지 부위가 알려져 있으며, 예를 들어 Hoess, et al ., (1986) Nucleic Acids Res 14:2287-300; Albert, et al ., (1995) Plant J 7:649-59; Thomson, et al ., (2003) Genesis 36:162-7; Huang, et al ., (1991) Nucleic Acids Res 19:443-8; Siebler and Bode, (1997) Biochemistry 36:1740-7; Schlake and Bode, (1994) Biochemistry 33:12746-51; Thygarajan, et al ., (2001) Mol Cell Biol 21:3926-34; Umlauf and Cox, (1988) EMBO J 7:1845-52; Lee and Saito, (1998) Gene 216:55-65; WO01/23545; WO99/25821; WO99/25851; WO01/11058; WO01/07572 및 미국 특허 제5,888,732를 참조한다.
본원에서 제공하는 방법의 일부 실시 양태에서, 1종 이상의 뉴클레아제는 트랜스포자제이다. 트랜스포자제는, 게놈의 한 위치에서 또 다른 위치로 트랜스포존(transposon)이 전위되는 것을 매개하는 폴리펩타이드이다. 트랜스포자제는 전형적으로, 트랜스포존을 절제하기 위해 이중 가닥 절단을 유도하며, 서브말단 반복체를 인지하고, 절제된 트랜스포존의 말단들을 함께 연결하며, 일부 시스템에서는 전위 동안에 상기 말단들을 함께 연결하기 위한 다른 단백질들이 필요하다. 트랜스포존 및 트랜스포자제의 예로는, 옥수수 유래의 Ac/Ds, Dt/rdt, Mu-M1/Mn, 및 Spm(En)/dSpm 구성원, 금어초(snapdragon) 유래의 Tam 구성원, 박테리오파지 유래의 Mu 트랜스포존, 박테리아 트랜스포존(Tn) 및 삽입 서열(IS), 효모의 Ty 구성원 (레트로트랜스포존), 아라비돕시스(Arabidopsis) 유래의 Ta1 구성원 (레트로트랜스포존), 드로소필라(Drosophila) 유래의 P 구성원 트랜스포존 (Gloor, et al ., (1991) Science 253:1110-1117), 드로소필라 유래의 Copia, Mariner 및 Minos 구성원, 집파리 유래의 Hermes 구성원, 트리크플루시아 니( Trichplusia ni ) 유래의 PiggyBack 구성원, 씨. 엘레강스 (C. elegans ) 유래의 Tc1 구성원, 및 마우스 유래의 IAP 구성원 (레트로트랜스포존)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
본원에서 제공하는 방법의 일부 실시 양태에서, 1종 이상의 뉴클레아제는 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN)이다. ZFN은 징크 핑거 DNA 결합 도메인 및 이중 가닥 절단 유도제 도메인으로 이루어진 변형된 이중-가닥 절단 유도제이다. 변형된 ZFN은 2개의 징크 핑거 어레이 (ZFA)로 이루어지며, 이들의 각각은 비-특정 엔도뉴클레아제의 단일 서브유닛, 예컨대 FokI 효소 유래의 뉴클레아제 도메인에 융합되며, 이량체화 시 활성화된다. 전형적으로, 단일 ZFA는 3 또는 4개의 징크 핑거 도메인으로 이루어지며, 이의 각각은 특정 뉴클레오타이드 3중체 (GGC, GAT, 등)를 인지하도록 설계된다. 따라서, "3-핑거" ZFA 2개로 이루어진 ZFN은 18개 염기쌍 표적 부위를 인지할 수 있으며; 18개 염기쌍 인지 서열은 일반적으로, 인간 및 식물과 같은 거대 게놈 내에서도 독특하다. 2개의 FokI 뉴클레아제 단량체의 공동-위치화 및 이량체화를 지시함으로써, ZFN은, 표적화된 유전자 좌에서 DNA에 이중-가닥 절단 (DSB)을 형성하는 기능성 부위-특이적인 엔도뉴클레아제를 생성한다.
유용한 징크-핑거 뉴클레아제로는, 공지된 것들과, 본원에서 기술한 1종 이상의 표적 부위 (TS)에 대한 특이성을 가지도록 변형되는 것들을 포함한다. 징크 핑거 도메인은, 예를 들어, 숙주 세포 게놈의 표적 부위 내 선별된 폴리뉴클레오타이드 인지 서열에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 설계하는 데 순응성이다(amenable). ZFN은, 비-특정 엔도뉴클레아제 도메인, 예를 들어 HO 또는 FokI와 같은 II형 엔도뉴클레아제 유래의 뉴클레아제 도메인에 연결된 변형된 DNA-결합 징크 핑거 도메인으로 이루어진다. 다른 예로, 변형된 징크 핑거 DNA 결합 도메인은 DNA 니킹(nicking)/절단 활성을 유지하는, 다른 이중-가닥 절단 유도제 또는 이들의 유도체이다. 예를 들어, 이러한 유형의 융합을 이용해, 서로 다른 표적 부위로 이중-가닥 절단 유도제를 위치시키거나, 닉 또는 절단 부위의 위치를 변경하거나, 더 짧은 표적 부위로 유도제를 위치시키거나, 또는 더 긴 표적 부위로 유도제를 위치시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 징크 핑거 DNA 결합 도메인은 부위-특이적인 재조합효소, 트랜스포자제, 또는 니킹/절단 활성을 유지하는 이들의 유도체에 융합된다. 부가적인 기능기가 전사 활성자 도메인, 전사 억제자 도메인, 및 메틸라제를 비롯한 징크-핑거 결합 도메인에 융합될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 뉴클레아제 도메인의 이량체화가 절단 활성에 필요하다.
각각의 징크 핑거는 표적 DNA 내 3개의 구성적인 염기쌍을 인지한다. 예를 들어, 3개 핑거 도메인은 9개의 인접 뉴클레오타이드의 서열을 인지하였으며, 뉴클레아제의 이량체화 요건과 함께, 징크 핑거 3중체의 2개 세트를 사용해 18개의 뉴클레오타이드 인지 서열에 결합한다. 유용한 설계자 징크 핑거 모듈로는, 다양한 GNN 및 ANN 3중체를 인지하는 것들 (Dreier, et al ., (2001) J Biol Chem 276:29466-78; Dreier, et al ., (2000) J Mol Biol 303:489-502; Liu, et al., (2002) J Biol Chem 277:3850-6), 뿐만 아니라 다양한 CNN 또는 TNN 3중체를 인지하는 것들 (Dreier, et al ., (2005) J Biol Chem 280:35588-97; Jamieson, et al., (2003) Nature Rev Drug Discov 2:361-8)을 포함한다. 또한, Durai, et al ., (2005) Nucleic Acids Res 33:5978-90; Segal, (2002) Methods 26:76-83; Porteus and Carroll, (2005) Nat Biotechnol 23:967-73; Pabo, et al ., (2001) Ann Rev Biochem 70:313-40; Wolfe, et al ., (2000) Ann Rev Biophys Biomol Struct 29:183-212; Segal and Barbas, (2001) Curr Opin Biotechnol 12:632-7; Segal, et al ., (2003) Biochemistry 42:2137-48; Beerli and Barbas, (2002) Nat Biotechnol 20:135-41; Carroll, et al ., (2006) Nature Protocols 1:1329; Ordiz, et al ., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:13290-5; Guan, et al ., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:13296-301; WO2002099084; WO00/42219; WO02/42459; WO2003062455; US20030059767; 미국 특허 출원 공개 제2003/0108880 호; 미국 특허 제6,140,466 호, 제6,511,808 호 및 제6,453,242 호를 참조한다. 유용한 징크-핑거 뉴클레아제는 또한, WO03/080809; WO05/014791; WO05/084190; WO08/021207; WO09/042186; WO09/054985; 및 WO10/065123에 기술된 것들을 포함한다.
6.5 게놈 표적 부위
본원에서 제공하는 방법에서, 뉴클레아제는, 게놈 표적 부위 근처 또는 그 내에 이중-가닥 절단을 유도할 수 있는 숙주 세포로 도입되며, 상기 절단 부위에서 또는 그 근처에서 상동성 재조합의 빈도를 크게 증가시킨다. 바람직한 실시 양태에서, 뉴클레아제에 대한 인지 서열은 숙주 세포 게놈 내 표적 부위에만 존재하여, 상기 뉴클레아제에 의한 표적-외 게놈 결합 및 절단을 최소화한다.
일부 실시 양태에서, 게놈 표적 부위는 숙주 세포에 대해 내인성으로,예컨대 고유한 유전자 좌이다. 일부 실시 양태에서, 고유한 게놈 표적 부위는 본원에서 제공하는 삽입 방법에 이용되는 뉴클레아제의 유형에 따라 선택된다. 이용되는 뉴클레아제가 징크 핑거 뉴클레아제인 경우, 최적의 표적 부위는 공개적으로 이용가능한 온라인 리소스를 이용해 선택될 수 있다. 예를 들어, 원용에 의해 본원에 포함된 Reyon et al ., BMC Genomes 12:83 (2011)을 참조한다. 예를 들어, 올리고머화된 풀 조작 (Oligomerized Pool Engineering, OPEN)은 징크 핑거 어레이를 고 특이성 및 생체내 기능성으로 조작하기 위한 매우 확실(robust)하며 공개적으로 이용가능한 프로토콜로서, 식물, 제브라피쉬, 및 인간의 체세포 및 만능줄기세포에서 효율적으로 기능하는 ZFN을 생성하는 데 성공적으로 이용되어 왔다. OPEN은, 후보 ZFA의 예비-구축된 랜덤화된 풀을 스크리닝하여 원하는 표적 서열에 대해 고 친화성 및 특이성을 가진 것들을 동정하는, 선별-기재 방법이다. ZFNGenome은 OPEN-생성된 ZFN에 대한 잠재적인 표적 부위를 동정 및 시각화하기 위한, GBrowse-기재의 툴이다. ZFNGenome은 모델 유기체의 서열화되고 아노테이트화(annotation)된 게놈에서 잠재적인 ZFN 표적 부위의 개요(compendium)를 제공한다. ZFNGenome은 현재 총 1억 1600만개 초과의 잠재적인 ZFN 표적 부위를 포함하며, 7가지의 모델 유기체인 S. 세레비지애(S. cerevisiae ), 씨. 레인하르드티이 (C. reinhardtii ), 에이. 탈리아나 (A. thaliana ), 디. 멜라노가스터 (D. melanogaster ), 디. 레리오 (D. rerio ), 씨. 엘레 강스(C. elegans ), 및 에이치. 사피엔스(H. sapiens )의 완전히 서열화된 게놈 내에서 지도화된다. 부가적인 모델 유기체로는 3가지 식물 종인 글리시네 막스( Glycine max ) (대두), 오리자 사티바 ( Oryza sativa ) (쌀), 제아 마이스( Zea mays) (옥수수)를 포함하며, 3가지 동물 종인 트리볼리움 카스타네움( Tribolium castaneum) (붉은밀가루갑충(red flour beetle)), 무스 무스쿨루스 ( Mus musculus ) (마우스), 라투스 노르베기쿠스 ( Rattus norvegicus ) (갈색 래트)가 머지않아 추가될 것이다. ZFNGenome은 전사 개시 부위(들)에 관한 이의 염색체의 자리 및 위치를 비롯하여 각각의 잠재적인 ZFN 표적 부위에 대한 정보를 제공한다. 사용자들은 몇몇 서로 다른 범주를 이용해 ZFNGenome에 조회할 수 있다 (예를 들어, 유전자 ID, 전사체 ID, 표적 부위 서열).
이용되는 뉴클레아제가 TAL-작동자 뉴클레아제인 경우, 일부 실시 양태에서, 최적의 표적 부위는 Sanjana et al ., Nature Protocols , 7:171-192 (2012) (원용에 의해 본원에 포함됨)에 기술된 방법에 따라 선별할 수 있다. 간략하게는, TALEN은 이량체로서 기능하며, 좌측 및 우측 TALEN이라고도 지칭하는 한 쌍의 TALEN은 DNA의 반대 가닥들의 서열을 표적으로 한다. TALEN은 TALE DNA-결합 도메인 및 단량체성 FokI 촉매성 도메인의 융합으로서 변형된다. FokI 이량체화를 촉진하기 위해, 좌측 및 우측 TALEN 표적 부위는 대략 14-20 염기로 간격을 두어 선택된다. 따라서, 각각이 20-bp 서열을 표적화하는 한 쌍의 TALEN의 경우, 최적의 표적 부위는 5'-TN19N14-20N19A-3'를 형성하며, 여기서, 좌측 TALEN은 5'-TN19-3'를 표적화하며, 우측 TALEN은 5'-N19A-3' (N = A, G, T 또는 C)의 안티센스 가닥을 표적화한다.
본원에서 제공하는 방법의 다른 실시 양태에서, 게놈 표적 부위는 숙주 세포에 대해 외인성이다. 예를 들어, 1종 이상의 게놈 표적 부위는, 본원에서 기술한 삽입 방법을 수행하기 전에, 전형적인 방법, 예를 들어 유전자 표적화를 이용해 숙주 세포 게놈으로 변형될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 동일 표적 서열의 다중 카피를 서로 다른 유전자 좌에서 숙주 세포 게놈으로 변형시켜, 표적 서열을 특이적으로 인지하는 단일 뉴클레아제만을 이용하는 동시 다중 삽입 현상을 촉진한다. 다른 실시 양태에서, 복수의 서로 다른 표적 서열은 서로 다른 유전자 좌에서 숙주 세포 게놈으로 변형된다. 일부 실시 양태에서, 변형된 표적 부위는, 숙주 세포의 고유한 게놈에서는 나타나지 않는 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 호밍 엔도뉴클레아제는 통상 인트론 또는 인테인(intein)에 파묻혀 있는 거대 인지 부위 (12-40 bp)를 표적으로 하며, 이와 같이, 이들의 인지 부위는 극히 드물며, 이들 부위 중 어느 것도 또는 소수만이 포유류-크기의 게놈에 존재한다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 외인성 게놈 표적 부위는 호밍 엔도뉴클레아제에 대한 인지 서열이다. 일부 실시 양태에서, 호밍 뉴클레아제는, H-DreI, I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, Pi-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-CphI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NclIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp68031, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MgaI, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, 또는 PI-TliII, 또는 이들의 임의의 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시 양태에서, 상기 외인성 게놈 표적 부위는 I-SceI, VDE (PI-SceI), F-CphI, PI-MgaI 또는 PI-MtuII에 대한 인지 서열이며, 이들은 각각 하기에 제공된다.
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전달
일부 실시 양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 유용한 1종 이상의 뉴클레아제는, 정제된 단백질로서 숙주 세포로 제공, 예를 들어 전달될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 1종 이상의 뉴클레아제는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 통해 제공된다. 다른 실시 양태에서, 상기 1종 이상의 뉴클레아제는, 숙주 세포의 핵에서 직접 번역될 수 있는 정제된 RNA로서 숙주 세포로 도입된다.
소정의 실시 양태에서, 삽입 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 전술한 바와 같은 정제된 뉴클레아제 단백질, 또는 이들의 조합을 통상의 기법을 이용해 숙주 세포 내로 도입하여, 당해 기술분야에 공지된 세포 내로 외인성 단백질 및/또는 핵산을 도입할 수 있다. 이러한 방법으로는, 용액으로부터 세포에 의해 분자를 직접 취하는 것, 또는 예를 들어, 리포좀 또는 면역리포좀을 사용하는 리포펙틴(lipofection); 입자-매개성 형질감염 등을 통한 촉진화된 취득(facilitated uptake)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 제5,272,065 호; Goeddel et al ., eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression -- A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al ., 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; and Ausubel et al ., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY를 참조한다. 세포를 형질전환시키는 특정 방법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. Hinnen et al ., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 75:1292-3 (1978); Cregg et al., Mol . Cell . Biol. 5:3376-3385 (1985)를 참조한다. 예시적인 기법으로는, 스페로플라스팅(spheroplasting), 전기천공, PEG 1000 매개성 형질전환, 및 리튬 아세테이트 또는 리튬 클로라이드 매개성 형질전환을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 양태에서, 바이오리스틱스(biolistics)를 이용해, 삽입 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 정제된 뉴클레아제 단백질, 또는 이들의 조합을 숙주 세포, 특히 식물과 같이 통상적인 기술을 이용해 형질전환/형질감염되기 어려운 숙주 세포로 도입한다. 바이오리스틱스는, 형질전환 반응물을 현미경적 금 입자(microscopic gold particle)에 결합시킨 다음, 상기 입자들을 표적 세포에서 압축 가스를 이용해 추진함으로써, 작동한다.
일부 실시 양태에서, 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 뉴클레아제가 발현될 수 있게 하는 발현 벡터이다. 적절한 발현 벡터로는, 에스케리키아 콜라이( Escherichia coli ), 효모, 또는 포유류 세포에서 유전자를 발현하는 데 사용되는 것으로 알려진 것들을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 에스케리키아 콜라이 발현 벡터의 예로는, pSCM525, pDIC73, pSCM351, 및 pSCM353을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 효모 발현 벡터의 예로는, pPEX7 및 pPEX408을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 적절한 발현 벡터의 다른 예로는, CEN.ARS 서열 및 효모 선별 마커를 포함하는 효모-에스케리키아 콜라이 pRS 시리즈의 셔틀 벡터; 및 2μ 플라스미드를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, 자연적인 폴리뉴클레오타이드 서열에 비해 숙주 세포에서의 사용 빈도가 더 높은 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, 자연적인 폴리뉴클레오타이드 서열에 비해, 에스 . 세레비지애에서 사용 빈도가 더 높은 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다 .
뉴클레아제가 각각의 단량체의 개별 발현을 필요로 하는 헤테로이량체로서 기능하는 일부 실시 양태에서, 징크 핑거 뉴클레아제 및 TAL-작동자 뉴클레아제의 경우에서와 같이, 상기 헤테로이량체의 각각의 단량체는 동일한 발현 플라스미드, 또는 상이한 플라스미드로부터 발현될 수 있다. 다중 뉴클레아제가 서로 다른 표적 부위에서 이중-가닥 절단을 할 수 있도록 세포에 도입되는 실시 양태에서, 상기 뉴클레아제는 단일 플라스미드 또는 개별 플라스미드에서 코딩될 수 있다.
소정의 실시 양태에서, 뉴클레아제 발현 벡터는, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선별할 수 있게 하는 선별 마커를 추가로 포함한다. 이러한 선별은, 뉴클레아제가 충분한 양으로 발현하는 데 필요한 기간 동안, 예를 들어, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96시간, 또는 96시간 이상 동안, 숙주 세포에서 벡터가 유지되는 것을 도울 수 있으며, 이후 상기 숙주 세포는 발현 벡터가 더 이상 유지되지 않는 조건 하에 배양될 수 있다. 소정의 실시 양태에서, 상기 선별 마커는, URA3, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아미노글라이코시드 포스포트랜스퍼라제, 제오신 내성, 및 포스피노트리신 N-아세틸트랜스퍼라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, 뉴클레아제 발현 벡터는, 1종 이상의 공여체 핵산 분자의 삽입에 이어, 발현 벡터를 함유하지 않는 숙주 세포를 선별할 수 있게 하는 카운터-선별 마커를 포함할 수 있다. 사용되는 뉴클레아제 발현 벡터는 또한, 선별 마커를 가지지 않는 일시적인 벡터일 수 있으며, 또는 선별되지 않는 벡터이다. 특정 실시 양태에서, 일시적인 뉴클레아제 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포의 자손은 시간이 지나면서 상기 벡터를 상실한다.
소정의 실시 양태에서, 발현 벡터는 전사 종결 서열, 및 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 조작적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 실시 양태에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터이다. 효모 세포에서 사용하기에 적절한 프로모터의 예시적인 예로는, 케이 . 락티스(K. lactis)의 TEF1 유전자의 프로모터, 사카로마이세스 세레비지애의 PGK1 유전자의 프로모터, 사카로마이세스 세레비지애의 TDH3 유전자의 프로모터, 억제성 프로모터, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애의 CTR3 유전자의 프로모터, 및 유도성 프로모터, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애의 갈락토스 유도성 프로모터 (예를 들어, GAL1, GAL7, 및 GAL10 유전자의 프로모터)를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 양태에서, 핵 위치화 서열 (NLS)을 포함하는 부가적인 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 5'에 연결된다. NLS는 보다 큰 뉴클레아제 (>25 kD)의 핵 위치화를 촉진할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 핵 위치화 서열는 SV40 핵 위치화 서열이다. 일부 실시 양태에서, 핵 위치화 서열은 효모 핵 위치화 서열이다.
뉴클레아제 발현 벡터는 당해 기술분야의 당업자가 알고 있는 기술을 이용해 제조할 수 있다. 소정의 실시 양태에서, 상기 벡터는 당해 기술분야에 잘 알려진 중합효소 연쇄반응 (PCR) 및 분자 클로닝 기술을 이용해 제조된다. 예를 들어, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, ed. HA Erlich, Stockton Press, New York, N.Y. (1989); Sambrook et al ., 2001, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY를 참조한다.
6.7 숙주 세포
다른 측면에서, 본원은, 본원에서 기술한 1종 이상의 외인성 핵산을 게놈에 삽입하는 방법에 의해 생성되는 변형된 숙주 세포를 제공한다. 적절한 숙주 세포는, 대상 핵산 또는 "공여체의 DNA"를 염색체 또는 에피좀 유전자 좌로 삽입하는 것이 바람직한 임의의 세포를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 세포는 상동성 재조합을 수행하는 능력을 가진 유기체의 세포이다. 예시적인 실시 양태의 몇몇이 효모 (에스 . 세레비지애)에서 언급되어 있지만, 본원에서 제공되는 게놈 변형 방법은, 재조합 시스템이 효모에서만큼 효율적이지 않은 경우라도, 기능성 재조합 시스템을 가진 모든 생물학적 유기체에서 수행될 수 있다. 기능성 상동성 재조합 시스템을 가진 다른 세포 또는 세포 유형은, 바실러스 서브틸리스 ( Bacillus subtilis ) 및 이.콜라이(E. coli )와 같은 박테리아 (RecE RecT 재조합 효율성임; Muyrers et al., EMBO rep. 1: 239-243, 2000); 원생동물 (예를 들어, 플라스모디 움( Plasmodium ), 톡소플라즈마 ( Toxoplasma )); 기타 효모 (예를 들어, 스키조사카로마이세스 폼베 ( Schizosaccharomyces pombe)); 사상균 (예를 들어, 아시브야 고씨피 이(Ashbya gossypii )); 필로스코미트렐라 파텐스( Physcomitrella patens ) 이끼와 같은 식물 (Schaefer and Zryd, Plant J. 11: 1195-1206, 1997); 및 포유류 세포 및 치킨 DT40 세포와 같은 동물 세포 (Dieken et al., Nat . Genet. 12:174-182, 1996)를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시 양태에서, 상기 세포는 진균 세포 (예를 들어, 효모 세포), 박테리아 세포, 식물 세포, 또는 동물 세포 (예를 들어, 치킨 세포)이다. 일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, COS-7 세포, 마우스 섬유아세포, 마우스 배아 암세포, 또는 마우스 배아 줄기세포이다. 일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다. 일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 S2 세포, Schneider 세포, S12 세포, 5B1-4 세포, Tn5 세포, 또는 Sf9 세포이다. 일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 단세포성 진핵 유기체 세포이다.
특정 실시 양태에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 유용한 효모 숙주 세포는 미생물 수탁기관 (예를 들어, IFO, ATCC, etc.)에 기탁된 효모 세포를 포함하며, 특히, 아키쿨로코니디움( Aciculoconidium ), 암브로시오지마 ( Ambrosiozyma ), 아르트로아스쿠스( Arthroascus ), 아륵시오지마 ( Arxiozyma ), 아시브야 ( Ashbya ), 바베비아( Babjevia ), 벤싱토니아 ( Bensingtonia ), 보트리오아스쿠스 ( Botryoascus ), 보트리오지마( Botryozyma ), 브레타노마이세스 ( Brettanomyces ), 불레라 ( Bullera ), 불레라마이세스( Bulleromyces ), 칸디다( Candida ), 시테로마이세스 ( Citeromyces ), 클라비 스포라( Clavispora ), 크립토코커스 ( Cryptococcus ), 키스토필로바시디움( Cystofilobasidium ), 데바리오마이세스 ( Debaryomyces ), 데카라 ( Dekkara ), 디포다스콥시스( Dipodascopsis ), 디포다스쿠스 ( Dipodascus ), 에에니엘라 ( Eeniella ), 엔도마이콥셀라( Endomycopsella ), 에레마스쿠스 ( Eremascus ), 에레모테시움( Eremothecium ), 에리트로바시디움 ( Erythrobasidium ), 펠로마이세스( Fellomyces ), 필로바시디움 ( Filobasidium ), 갈락토마이세스 ( Galactomyces ), 게오트리쿰( Geotrichum ), 구일리에르몬델라 ( Guilliermondella ), 한세니이스포라( Hanseniaspora ), 한세눌라 ( Hansenula ), 하세가와에아 ( Hasegawaea ), 홀테르만니아( Holtermannia ), 호르모아스쿠스 ( Hormoascus ), 하이포피키아 ( Hyphopichia ), 이싸트켄키아( Issatchenkia ), 클로에케라 ( Kloeckera ), 클로에케라스포라( Kloeckeraspora ), 클루이베로마이세스 ( Kluyveromyces ), 콘도아 ( Kondoa ), 쿠라이시아( Kuraishia ), 쿠르츠마노마이세스 ( Kurtzmanomyces ), 레우코스포리디움( Leucosporidium ), 리포마이세스 ( Lipomyces ), 로데로마이세스 ( Lodderomyces ), 말라세지아( Malassezia ), 메트쉬니코위아 ( Metschnikowia ), 므라키아 ( Mrakia ), 마이속지아( Myxozyma ), 나드소니아 ( Nadsonia ), 나카자와에아 ( Nakazawaea ), 네마토스포라( Nematospora ), 오가테아 ( Ogataea ), 오오스포리디움 ( Oosporidium ), 파키솔렌( Pachysolen ), 파키티코스포라 ( Phachytichospora ), 파피아 ( Phaffia ), 피키아( Pichia ), 로도스포리디움 ( Rhodosporidium ), 로도토룰라 ( Rhodotorula ), 사카로마이세스( Saccharomyces ), 사카로마이코데스 ( Saccharomycodes ), 사카로마이콥시스( Saccharomycopsis ), 사이토엘라 ( Saitoella ), 사카구키아 ( Sakaguchia ), 사투르노스포라( Saturnospora ), 스키조블라스토스포리온 ( Schizoblastosporion ), 쉬조사카로마이세스( Schizosaccharomyces ), 쉬반니오마이세스 ( Schwanniomyces ), 스포리디오볼루스( Sporidiobolus ), 스포로볼로마이세스 ( Sporobolomyces ), 스포로파키데르미아( Sporopachydermia ), 스테파노아스쿠스 ( Stephanoascus ), 스테리그마토마이세스( Sterigmatomyces ), 스테리그마토스포리디움 ( Sterigmatosporidium ), 심보비오타프리나( Symbiotaphrina ), 심포디오마이세스 ( Sympodiomyces ), 심포디오마이콥시스( Sympodiomycopsis ), 토룰라스포라 ( Torulaspora ), 트리코스포리엘라( Trichosporiella ), 트리코스포론 ( Trichosporon ), 트리고놉시스 ( Trigonopsis ), 츠키야에아( Tsuchiyaea ), 우데니오마이세스 ( Udeniomyces ), 왈토마이세스( Waltomyces ), 위케르하미아 ( Wickerhamia ), 위케르하미엘라 ( Wickerhamiella ), 윌리옵시스( Williopsis ), 야마다지마 ( Yamadazyma ), 야로위아 ( Yarrowia ), 자이고아스쿠스( Zygoascus ), 자이고사카로마이세스 ( Zygosaccharomyces ), 자이고윌리옵시스(Zygowilliopsis ), 및 자이고자이마 ( Zygozyma ) 속에 속한다.
일부 실시 양태에서, 효모 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애 세포, 피키아 파스토리스 ( Pichia pastoris ) 세포, 스키조사카로마이세스 폼베( Schizosaccharomyces pombe ) 세포, 데케라 브룩셀렌시스 ( Dekkera bruxellensis ) 세포, 클루이베로마이세스 락티스 ( Kluyveromyces lactis ) 세포, 아륵술라 아데니니 보란스( Arxula adeninivorans ) 세포, 또는 한세눌라 폴리모파( Hansenula polymorpha (현재 피키아 안구스타(Pichia angusta)로 알려져 있음) 세포이다. 특정 실시 양태에서, 효모 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애 세포이다. 일부 실시 양태에서, 효모 숙주 세포는 사카로마이세스 프라길리스( Saccharomyces fragilis) 세포 또는 클루이베로마이세스 락티스 (과거 사카로마이세스 락티스( Saccharomyces lactis)로 불렸음) 세포이다. 일부 실시 양태에서, 효모 숙주 세포는 칸디다 속에 속하는 세포, 예컨대 칸디다 리폴리티카( Candida lipolytica ), 칸디다 구일리에르몬디이 ( Candida guilliermondii ), 칸디다 크루세이( Candida krusei), 칸디다 슈도트로피칼리스 ( andida pseudotropicalis ), 또는 칸디다 유틸리 스( Candida utilis)이다. 다른 특정 실시 양태에서, 효모 숙주 세포는 클루이베로마이세스 마륵시아누스 ( Kluveromyces marxianus ) 세포이다.
특정 실시 양태에서, 효모 숙주 세포는, 빵 효모 세포, CBS 7959 세포, CBS 7960 세포, CBS 7961 세포, CBS 7962 세포, CBS 7963 세포, CBS 7964 세포, IZ-1904 세포, TA 세포, BG-1 세포, CR-1 세포, SA-1 세포, M-26 세포, Y-904 세포, PE-2 세포, PE-5 세포, VR-1 세포, BR-1 세포, BR-2 세포, ME-2 세포, VR-2 세포, MA-3 세포, MA-4 세포, CAT-1 세포, CB-1 세포, NR-1 세포, BT-1 세포, 및 AL-1 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 사카로마이세스 세레비지애 세포이다. 일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 PE-2 세포, CAT-1 세포, VR-1 세포, BG-1 세포, CR-1 세포, 및 SA-1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 사카로마이세스 세레비지애 세포이다. 특정 실시 양태에서, 상기 사카로마이세스 세레비지애 숙주 세포는 PE-2 세포이다. 다른 특정 실시 양태에서, 상기 사카로마이세스 세레비지애 숙주 세포는 CAT-1 세포이다. 다른 특정 실시 양태에서, 상기 사카로마이세스 세레비지애 숙주 세포는 BG-1 세포이다.
일부 실시 양태에서, 효모 숙주 세포는 바이오에탄올 발효와 같은 산업적 발효에 적절한 세포이다. 특정 실시 양태에서, 상기 세포는 고 용매 농도, 고온, 확장된 기질 용도, 영양 제한, 삼투성 스트레스 요인(osmotic stress due), 산성, 설파이트 및 박테리아 오염, 또는 이들의 조합 (이들은 산업적 발효 환경의 스트레스 조건인 것으로 인지됨) 하에 생존하도록 조건화된다.
6.8 키트
다른 측면에서, 본원에서 기술한 1종 이상의 외인성 핵산을 게놈에 삽입하는 방법을 수행하는 데 유용한 키트를 제공한다. 일부 실시 양태에서, 상기 키트는,
(a) 복수의 외인성 핵산으로서, 상기 각각의 외인성 핵산 (ES)x이,
(i) 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x (여기서, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 숙주 세포 게놈의 선별된 표적 부위 (TS)x에서 (ES)x의 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있음); 및
(ii) (HR1)x의 3' 및 (HR2)x의 5'에 위치한 대상 핵산 (D)x을 포함하는, 복수의 외인성 핵산; 및
(b) 복수의 뉴클레아제 (여기서, 상기 각각의 뉴클레아제 (N)x는 (TS)x에서 절단할 수 있으며, 이때 상기 절단으로 (TS)x에서 (ES)x의 상동성 재조합이 이루어짐)를 포함하며,
x는 1 내지 n의 정수이며, n은 2 이상이다.
일부 실시 양태에서, (D)x는 선별 마커, 프로모터, 에피토프 테그(epitope tag)를 코딩하는 핵산 서열, 대상 유전자, 리포터 유전자, 및 종결 코돈을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서,상기 키트는 복수의 프라이머 쌍 (P)x을 추가로 포함하며, 상기 프라이머 쌍은 각각 PCR에 의해 (TS)x에서 (ES)x의 삽입을 동정할 수 있다. 일부 실시 양태에서, (ES)x는 선형이다. 일부 실시 양태에서, (ES)x는 원형이다.
특정 실시 양태에서, 상기 키트는 효모 게놈의 대략 6,000개의 유전자 좌 중 임의의 유전자 좌 내 고유 표적 부위에서 외인성 핵산을 부위-특이적인 삽입할 수 있게 한다. 이들 실시 양태에서, n은 ≥6000이며, 각각의 (TS)x는 효모 세포 게놈의 고유 영역이다.
일부 실시 양태에서, 상기 키트는 1종 이상의 외인성 핵산을 숙주 효모 세포의 유전자 좌 중 임의의 유전자 좌로 삽입하는 방법을 기술하는 용도에 대한 지시사항을 추가로 포함한다.
7. 실시예
7.1 실시예 1:
복수의 외인성 핵산의 동시 다중 삽입
본원에서 기술한 방법 및 조성물은 한번의 형질전환 공정으로 효모 세포 게놈의 2개의 유전자 좌에 2개의 외인성 핵산이 삽입된 변형된 효모 세포를 제조하기 위해 수행하며, 상기 변형된 효모 세포의 회수에는 선별 마커(들)가 사용되지 않는다.
(a) NDT80 유전자 좌에 위치한 F-CphI 엔도뉴클레아제에 대한 기존에 도입된 인지 부위; 및 (b): HO 유전자 좌 내 위치한 I-SceI 엔도뉴클레아제에 대한 기존에 도입된 인지 부위를 포함하는 숙주 균주를 제공한다. 숙주 세포는, (1) F-CphI를 코딩하는 발현 플라스미드; (2) I-SceI를 코딩하는 발현 플라스미드; (3) NDT80 유전자 좌의 5' 및 3' 영역에 상응하는 >500 bp 서열로 이루어진 2개의 연장부(stretch)의 측면에 위치한, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 선형 DNA; 및 (4) HO 유전자 좌의 5' 및 3' 영역에 상응하는 >500 bp 서열로 이루어진 2개의 연장부의 측면에 위치한, lacZ를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 선형 DNA로 동시에 형질전환시킨다. 각각 F-CphI 및 I-SceI를 코딩하는 발현 플라스미드의 삽입(inclusion)에 대한 대안으로서, 정제된 F-CphI 및 I-SceI 단백질을 형질전환 반응에 포함한다. 비-이중 가닥 절단 대조군은, F-CphI 및 I-SceI 발현 플라스미드 또는 정제된 단백질의 부재 하에, (3) 및 (4)만으로 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 수행한다.
실험 및 대조군 형질전환체를 선별제-무첨가 배지에 평판배양하고, 각각의 플레이트로부터의 콜로니를 각각 GFP 및 lacZ의 발현에 대해 시각화한다. 콜로니 PCR은 독립적으로, 각각 삽입된 삽입 구축물 (3) 또는 (4)과 이들 각각의 표적 서열 사이의 접합점의 상류 및 하류에 어닐링되는 프라이머 쌍으로 수행하여, 삽입의 피델리티(fidelity) 및 빈도를 확인한다.
7.2 실시예 2:
복수의 외인성 핵산의 동시 다중 삽입
본 실시예는, 숙주 세포 게놈에 표적화된 이중-가닥 절단을 도입한 후, 에스. 세레비지애 숙주의 3개의 서로 다른 유전자 좌에서의 3개의 외인성 핵산의 동시 삽입을 나타내는 결과를 제공한다. 간략하게는, 에메랄드 녹색 형광 단백질의 단축된, 비-기능성 카피 (emgfp△)를 코딩하는 외인성 "표적" 핵산 서열을 숙주 효모 세포의 HO, YGR250c 및 NDT80 유전자 좌에 각각 삽입한다. 재조합 세포를, 에메랄드 녹색 형광 단백질 (EmGFP)의 본래의 기능성 카피를 코딩하는 선형 "공여체" DNA, 및 (1) 빈(empty) 벡터; 또는 (2) emgfp△ 코딩 서열 내 서열을 특이적으로 인지 및 절단하는 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN.gfp)를 코딩하는 발현 벡터, pZFN.gfp로 형질전환한다. 형질전환된 콜로니는, 표적 emgfp△ 코딩 서열의 1, 2, 또는 3개의 게놈 삽입된 카피가 공여체 EmGFP 코딩 서열로 대체되었는지에 대해, 콜로니 PCR (cPCR)로 스크리닝하였다.
7.2.1. 표적 DNA의 구축 및 삽입
뉴클레아제-매개성 이중-가닥 절단에 대한 외인성 게놈 표적 부위를 만들기 위해, emgfp△를 코딩하는 표적 DNA를 미국 특허 제 8,110,360 호 (원용에 의해 본원에 포함됨)에 기술한 바와 같이, RYSE-매개성 어셈블리를 이용해 구축하였다. 야생형 EmGFP 코딩 서열 (SEQ ID NO:1)의 450 내지 462개 뉴클레오타이드를 하기 서열: 5'-CGTCTAAATCATG-3' (SEQ ID NO:2)로 대체하여, (1) EmGFP (emgfp△)의 152번째 위치에 조기성숙 정지 코돈; 및 (2) ZFN.gfp에 대한 인지/절단 서열을 도입하였다.
emgfp△ 코딩 서열의, HO, YGR250c 및 NDT80 유전자 좌의 각각으로의 표적화된 삽입을 위해, 상기 emgfp△ 코딩 서열을, 각각의 유전자 좌 (SEQ ID NOS:3-8)에 대해 ~200-500 bp의 상류 및 하류 상동 서열 측면에 두었다. 성공적인 삽입 현상을 가진 콜로니를 선별하기 위해, 고유 선별 마커를 또한, 각각의 구축물로 삽입하여 emgfp△ 코딩 서열의 5'에 위치시켰다. HO 삽입 구축물은 KanR을 포함하였으며, YGR250c 삽입 구축물은 URA3을 포함하였으며, NDT80 삽입 구축물은 NatR을 포함하였다. 각각의 삽입 구축물을 고유한 CEN.PK2 반수체 효모 균주 (A 균주)에 차례대로 형질전환시키고, emgfp△ 코딩 서열의 3개의 삽입된 카피를 가지는지 상기 균주를 확인하였다.
7.2.2. ZFN 효모 발현 플라스미드의 구축
징크 핑거 뉴클레아제는 2가지 기능성 도메인인, 징크 핑거 단백질의 사슬로 이루어진 DNA-결합 도메인, 및 FokI의 뉴클레아제 도메인으로 이루어진 DNA-절단 도메인으로 이루어진다. FokI의 엔도뉴클레아제 도메인은 오빌리게이트(obligate) 헤테로이량체로서 작용하여 DNA를 절단해서, ZFN 한 쌍은 이의 표적 서열을 결합하고 절단할 것이 요구된다. ZFN.gfp (CompoZr®징크 핑거 뉴클레아제, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 표적 서열은, 5'-ACAACTACAACAGCCACAACgtctatATCATGGCCGACAAGCA-3' (SEQ ID NO: 9)로서, 인지 서열은 대문자로 표시하고, 절단 서열은 소문자에 표시한다.
고-복사(high-copy) ZFN.gfp 효모 발현 플라스미드인 pZFN.gfp를 하기와 같이 구축하였다. 각각이 ZFN.gfp 오빌리게이트 헤테로이량체의 일 구성원을 코딩하는 ZFN.gfp.1 및 ZFN.gfp.2 유전자를 포유류 발현 플라스미드로부터 PCR-증폭시키고, 분기성 PGAL1 ,10 프로모터 및 ADH1 및 CYC1 종결자에 각각 융합하였다. PGAL10>ZFN.gfp.1-TADH1 및 PGAL1>ZFN.gfp.2-TCYC1의 개별 PCR 산물을, LEU2 선별 마커를 포함하는 선형화된 벡터 백본과 함께, 중복 말단들의 상동성 재조합을 통해 생체내 어셈블리용의 고유한 효모 균주에 공동-형질전환시켰다. PCR 산물은 pGAL1,10 프로모터 서열에서 재조합하였고, 말단 프라이머에 의해 첨가된 상동 서열을 통해 벡터 백본으로 조립되었다. 형질전환체를 루신 결핍 최소 배지에서 선별하고, 분리하여, 액체 배지에서 배양하였다. 다중 클론 유래의 플라스미드를 Zymoprep 효모 플라스미드 Miniprep I kit (Zymo Research)를 사용해 효모로부터 추출하였다. 그런 다음, 추출 프로토콜로부터의 용출액을 이. 콜라이 XL-1 블루 화학적 컴피턴트(competent) 세포로 형질전환시켰다. 플라스미드를 이. 콜라이에서 밤새 확산시키고, 미니프렙하였다 (Qiagen, Valencia, CA). 올바른 클론을 제한효소 맴핑로 동정하였다.
7.2.3. 공여체 DNA로의 형질전환, 및 이중-가닥 절단의 유도
표준 리튬 아세테이트/SSDNA/PEG 프로토콜 (Gietz and Woods, Methods Enzymol. 350:87-96 (2002))을 이용해, A 균주를, EmGFP를 코딩하는 선형 "공여체" DNA, 및 : (1) 빈 벡터; 또는 (2) pZFN.gfp 발현 벡터로 공동-형질전환시켰다. EmGFP 코딩 서열은 ZFN.gfp에 대한 인지/절단 부위 내 위치들, 즉 450 (C→G), 456 (A→T), 461 (T→C) 및 462 (G→C)번째 위치들에서 emgfp△ 코딩 서열과 상이하였다. 따라서, ZFN.gfp는 emgfp△ 서열 내에서 인지 및 절단하며, EmGFP 서열 내에서는 그러지 않을 것으로 예상된다.
적절한 플라스미드 DNA 1 ㎍을 70 ul의 선형 EmGFP DNA (~300 ng/ul)로 공동-형질전환시켰다. 형질전환체 모두를 YP + 2% 갈락토스에서 밤새 회수하여, ZFN 발현을 유도하였다. 여러 가지 희석물을 루신 결핍 최소 배지 한천 플레이트 상으로 도말하여, 플라스미드 DNA로 형질전환된 콜로니를 선별하였다. 플레이트를 30℃에서 3-4일간 인큐베이션하였다.
7.2.4. 다중 동시 삽입의 확인
각각의 표적 유전자 좌에서 emgfp△ 코딩 서열을 EmGFP 코딩 서열로 치환하는 빈도를 측정하기 위해, 콜로니 PCR을 수행하였다. DNA는, 각각의 형질전환체 유래의 96개 콜로니로부터 프렙하고, 각각의 유전자 좌에서의 EmGFP 코딩 서열의 성공적인 삽입이 예상한 크기의 앰플리콘을 생성하는 것으로 예상되지만 비-삽입은 앰플리콘을 생성하지 않는 것으로 예상되도록, EmGFP 및 HO, EmGFP 및 NDT80, 및 EmGFP 및 YGR250c 각각에 대해 특이적인 프라이머 쌍으로 탐침하였다.
Figure 112013108556036-pct00002
도 5에서 나타낸 바와 같이, 선형 EmGFP 공여체 DNA (SEQ ID NO:1) 및 빈 벡터 대조군으로 형질전환시킨 96개 콜로니 중, 앰플리콘은 PCR 동안 생성되지 않았으며, 이는 성공적인 삽입 현상, 즉, 이중-가닥 절단의 부재 하에 표적 emgfp△ 코딩 서열을 포함하는 3개의 유전자 좌 중 임의의 유전자 좌에서의 치환이 존재하지 않았음을 나타낸다. 대조적으로, 선형 EmGFP DNA 및 pZFN.gfp로 형질전환시킨 96개 콜로니 중, 2개 콜로니는 하나의 유전자 좌가 치환되었으며, 4개 콜로니는 2개의 유전자 좌가 치환되었으며, 23개 콜로니는 3개 유전자 좌 모두가 EmGFP 코딩 서열로 치환되었다 (도 6). 콜로니 PCR 결과는, 플레이트 상에서의 형질전환된 콜로니의 형광을 시각화함으로써 뒷받침되었다 (데이터는 나타내지 않음). EmGFP DNA 및 빈 벡터로 형질전환된 콜로니 중 어느 것도 녹색을 띄지 않았으며, 이는 표적 emgfp△ 코딩 서열 중 어느 것도 기능성 EmGFP 코딩 서열로 치환되지 않았음을 나타낸다. 대조적으로, EmGFP DNA 및 pZFN.gfp로 형질전환된 콜로니 중 약 20%는 녹색을 띄었으며, 이는 cPCR에 의해 관찰되는 삽입 현상의 빈도와 대략 상관이 있다.
이들 결과는, 숙주 세포의 게놈에서 다중 표적화된 이중-가닥 절단의 유도는 외인성 공여체 핵산의 동시 다중 표적화된 삽입을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
7.3 실시예 3:
파르네센 생성 균주를 아모파다이엔 생성 균주로의 전환을 촉진하기 위한, 테르펜 신타제 유전자의 동시 다중 삽입
본 실시예는, 고(high) 메발로네이트 경로 흐름을 위해 변형된 에스 . 세레비지애 숙주의 3개의 서로 다른 변형된 유전자 좌에서 3개의 세스퀴테르펜 신타제의 동시 삽입을 나타내는 결과를 제공한다. 그 결과, 파르네센을 생성하며 파르네센 신타제 유전자의 플라스미드-기재 카피를 포함하는 모 균주를, 아모파다이엔 신타제의 다중 게놈 삽입된 카피를 포함하는 아모파다이엔 생성 균주로 전환시켰다. 간략하게는, F-CphI 부위 측면에 있는 URA3, NatR 및 KanR 마커 카세트를 각각 숙주 균주의 Gal80, HXT3 및 Mata 유전자 좌로 삽입하였다. 그런 다음, 상기 숙주를, F-CphI 엔도뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드, 뿐만 아니라 Gal1 프로모터로부터 발현되며 CYC1 종결자 (ADS 카세트)에 의해 종결되는 아모파다이엔 신타제 (ADS)의 구별되는 코돈 최적화를 포함하는 3개의 선형 "공여체' DNA 구축물 (각각은 이들 각각의 표적 유전자 좌에 대한 상동성 영역의 측면에 존재함)으로 공동-형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니는, 1, 2, 또는 3개의 게놈 삽입된 표적 마커 유전자 좌가 ADS 카세트로 치환되었는지에 대해, 콜로니 PCR (cPCR)로 스크리닝하였다. 3중-삽입된 균주를 동정하고, 제4 ADS 카세트를 삽입시킴으로써 추가로 변형시켰으며, 이의 산물 프로파일을 파르네센에서 아모파다이엔으로 완전히 전환시키도록, 생성되는 균주를 파르네센 신타제를 코딩하는 플라스미드의 소실을 허용하는 조건 하에 배양하였다.
7.3.1. 모 파르네센 생성 균주의 구축
아모파다이엔 신타제를 코딩하는 외인성 공여체 DNA의 다중 동시 삽입에 유용한, 파르네센-생성 효모 균주인 Y3639를 하기와 같이 제조하였다.
균주 Y93 (MAT A) 및 Y94 (MAT 알파)는, 효모 균주 Y002 및 Y003 (각각 CEN.PK2 백그라운드 MAT A 또는 MAT 알파; ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3D1; MAL2-8C; SUC2; van Dijken et al. (2000) Enzyme Microb. Technol. 26:706-714)의 ERG9 유전자의 프로모터를 각각 사카로마이세스 세레비지애의 MET3 유전자의 프로모터로 치환함으로써, 제조하였다. 이를 위해, 기하급수적으로 성장하는 Y002 및 Y003 세포를 삽입 구축물 i8 (SEQ ID NO: 14)로 형질전환시켰으며, 상기 구축물은, 클루이베로마이세스 락티스의 Tef1 유전자의 프로모터 및 종결자의 측면에 위치하는 카나마이신 내성 마커 (KanMX), ERG9 코딩 서열, ERG9 프로모터의 단축된 분절 (trunc. PERG9), 및 MET3 프로모터 (PMET3) (ERG9 상류 및 하류 서열의 측면에 존재함)를 포함하였다. 숙주 세포 형질전환체는, 0.5 ㎍/㎖ 제네티신 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)을 포함하는 배지에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하였으며, 균주 Y93 및 Y94를 수득하였다.
균주 Y176 (MAT A) 및 Y177 (MAT 알파)는, 균주 Y93 및 Y94 내 ADE1 유전자의 코딩 서열을 칸디다 글라브라타의 LEU2 유전자 (CgLEU2)의 코딩 서열로 치환함으로써 제조하였다. 이를 위해, 3.5 kb CgLEU2 게놈 유전자 좌는, 프라이머 61-67-CPK066-G (SEQ ID NO: 15) 및 61-67-CPK067-G (SEQ ID NO: 16)를 사용하여 칸디 다 글라브라타 게놈 DNA (ATCC, Manassas, VA)으로부터 PCR 증폭시키고, 상기 PCR 산물을 기하급수적으로 성장하는 Y93 및 Y94 세포로 형질전환시켰다. 숙주 세포 형질전환체를 CSM-L에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하였으며, 균주 Y176 및 Y177을 수득하였다.
균주 Y188는, 사카로마이세스 세레비지애의 ERG13, ERG10, 및 ERG12 유전자의 코딩 서열, 및 사카로마이세스 세레비지애의 HMG1 유전자의 단축된 코딩 서열의 부가적인 카피를 균주 Y176으로 도입함으로써 제조하였으며, 각각은 사카로마이세스 세레비지애의 GAL1 또는 GAL10 유전자의 갈락토스 유도성 프로모터의 제어 조절 하에서였다. 이를 위해, 기하급수적으로 성장하는 Y176 세포는, PmeI 제한효소 엔도뉴클레아제 (New England Biolabs, Beverly, MA)로 분해한 발현 플라스미드 pAM491 및 pAM495 2 ㎍으로 형질전환시켰다. 숙주 세포 형질전환체는, 우라실 및 히스티딘 결핍 CSM (CSM-U-H)에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하였으며, 균주 Y188을 수득하였다.
균주 Y189는, 사카로마이세스 세레비지애의 ERG20, ERG8, 및 ERG19 유전자의 코딩 서열, 및 사카로마이세스 세레비지애의 HMG1 유전자의 단축된 코딩 서열의 부가적인 카피를 균주 Y177로 도입함으로써 제조하였으며, 각각은 사카로마이세스 세레비지애의 GAL1 또는 GAL10 유전자의 갈락토스 유도성 프로모터의 제어 조절 하에서였다. 이를 위해, 기하급수적으로 성장하는 Y188 세포는, PmeI 제한효소 엔도뉴클레아제로 분해한 발현 플라스미드 pAM489 및 pAM497 2 ㎍으로 형질전환시켰다. 숙주 세포 형질전환체는, 트립토판 및 히스티딘 결핍 CSM (CSM-T-H)에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하였으며, 균주 Y189를 수득하였다.
균주 Y238은, 균주 Y188 및 Y189를 메이팅(mating)시키고, 사카로마이세스 세레비지애의 IDI1 유전자의 코딩 서열, 및 사카로마이세스 세레비지애의 HMG1 유전자의 단축된 코딩 서열의 부가적인 카피를 도입함으로써 제조하였으며, 각각은 사카로마이세스 세레비지애의 GAL1 또는 GAL10 유전자의 갈락토스 유도성 프로모터의 제어 조절 하에서였다. 이를 위해, 균주 Y188 및 Y189의 대략 1 x 107 세포를 실온에서 6시간 동안 YPD 배지 플레이트에서 혼합하였으며, 2배체 세포를 CSM-H-U-T에서 선별하였고, 기하급수적으로 성장하는 2배체를, PmeI 제한효소 엔도뉴클레아제로 분해된 발현 플라스미드 pAM493 2 ㎍으로 형질전환시켰다. 숙주 세포 형질전환체는, 아데닌 결핍 CSM (CSM-A)에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하였으며, 균주 Y238을 수득하였다.
균주 Y210 (MAT A) 및 Y211 (MAT 알파)는 균주 Y238를 포자형성시킴으로써 제조하였다. 2배체 세포는 2% 포타슘 아세테이트 및 0.02% 라피노스(raffinose) 액체 배지에서 포자형성시켰고, 대략 200 유전적 4배체를 Singer Instruments MSM300 시리즈 마이크로매니퓰레이터(series micromanipulator) (Singer Instrument Co, LTD. Somerset, UK)로 분리하였다. 포자는 CSM-A-H-U-T에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하였으며, 균주 Y210 (MAT A) 및 Y211 (MAT 알파)을 수득하였다.
균주 Y221는 기하급수적으로 성장하는 Y211 세포를 벡터 pAM178로 형질전환시킴으로써 제조하였다. 숙주 세포 형질전환체는 CSM-L에서 선별하였다.
균주 Y290는 균주 Y221의 GAL80 유전자의 코딩 서열을 결실시킴으로써 제조하였다. 이를 위해, 기하급수적으로 성장하는 Y221 세포를 삽입 구축물 i32 (SEQ ID NO: 17)로 형질전환시켰으며, 이 구축물은, GAL80 상류 및 하류 서열의 측면에 위치하는 클루이베로마이세스 락티스의 Tef1 유전자의 프로모터 및 종결자의 측면에 위치하는 하이그로마이신 B 내성 마커 (hph)를 포함하였다. 숙주 세포 형질전환체는 하이그로마이신 B를 포함하는 배지에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하였으며, 균주 Y290을 수득하였다.
균주 Y318는, 루신-농후 배지에서의 단계식 확산(propagation)에 의해 균주 Y290으로부터 pAM178 벡터를 제거함으로써 제조하였으며, CSM-L에서의 성장불능에 대해 개별 콜로니를 시험하고, 균주 Y318을 수득하였다.
균주 Y409는, β-파르네센 신타제를 코딩하는 이종성 뉴클레오타이드 서열을 균주 Y318로 도입함으로써 제조하였다. 이를 위해, 기하급수적으로 성장하는 Y318 세포를 발현 플라스미드 pAM404로 형질전환시켰다. 숙주 세포 형질전환체는 CSM-L에서 선별하였으며, 균주 Y409를 수득하였다.
균주 Y419는, 균주 Y409의 GAL 프로모터를 구성적으로 활성이 되게 함으로써 제조하였다. 이를 위해, 기하급수적으로 성장하는 Y409 세포를 삽입 구축물 i33 (SEQ ID NO: 18)로 형질전환시켰으며, 이 구축물은, 클루이베로마이세스 락티스의 Tef1 유전자의 프로모터 및 종결자의 측면에 위치하는 스트렙토마이세스 노우세이( Streptomyces noursei )의 노우세오트리신(nourseothricin) 내성 마커 (NatR) 및 사카 로마이세스 세레비지애의 GAL4 유전자의 코딩 서열을 포함하였으며, "조작적인 구성적인(operative constitutive)" 버전의 이의 고유한 프로모터 (PGAL4oc; Griggs & Johnston (1991) PNAS 88(19):8597-8601) 및 GAL4 종결자 (TGAL4) (변형된 ERG9 프로모터 및 코딩 서열의 상류 및 하류 서열의 측면에 존재함)의 제어 조절 하에서였다. 숙주 세포 형질전환체는 노우세오트리신을 포함하는 배지에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하였고, 균주 Y419를 수득하였다.
균주 Y677은, 사카로마이세스 세레비지애의 GAL1 유전자의 프로모터의 제어 조절 하에 사카로마이세스 세레비지애의 ERG12 유전자의 코딩 영역의 부가적인 카피를 균주 Y419의 변형된 GAL80 유전자 좌에 도입함으로써 제조하였다. 이를 위해, 기하급수적으로 성장하는 Y677 세포를 삽입 구축물 i37 (SEQ ID NO: 19)로 형질전환시켰으며, 이 구축물은, 클루이베로마이세스 락티스의 Tef1 유전자의 프로모터 및 종결자의 측면에 위치하는 스트렙토마이세스 노우세이의 카나마이신 내성 마커 (KanR), 및 GAL1 프로모터 (PGAL1) 및 ERG12 종결자 (TERG12)의 측면에 위치하는 사카로마이세스 세레비지애의 ERG12 유전자의 코딩 및 종결자 서열을 포함하였다. 숙주 세포 형질전환체는 카나마이신을 포함하는 배지에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하였으며, 균주 Y677을 수득하였다.
균주 Y1551는 균주 Y677로부터 화학적 돌연변이생성에 의해 제조하였다. 돌연변이화된 균주를 β-파르네센의 생성 증가에 대해 스크리닝하고, 균주 Y1551을 수득하였다.
균주 Y1778은 균주 Y1551로부터 화학적 돌연변이생성에 의해 제조하였다. 돌연변이화된 균주를 β-파르네센의 생성 증가에 대해 스크리닝하고, 균주 Y1778을 수득하였다.
균주 Y1816는, 균주 Y1778의 HXT3 코딩 서열을 아세토아세틸-CoA 티올라제 코딩 서열의 2개의 카피 (하나의 카피는 사카로마이세스 세레비지애 유래이며, 다른 하나는 씨. 부틸리쿰 유래임), 및 비. 윤세아(B. juncea)의 HMGS 유전자의 코딩 서열의 하나의 카피로 치환함으로서 제조하였다. 이를 위해, 기하급수적으로 성장하는 Y1778 세포를, 삽입 구축물 i301 (SEQ ID NO: 20)로 형질전환시켰으며, 이 구축물은, 클루이베로마이세스 락티스의 Tef1 유전자의 프로모터 및 종결자의 측면에 위치하는 하이그로마이신 B 내성 마커 (hyg), 단축된 TDH3 프로모터 (tPTDH3) 및 AHP1 종결자 (TAHP1)의 측면에 위치하는 사카로마이세스 세레비지애의 ERG10 유전자의 코딩 서열, YPD1 프로모터 (PYPD1) 및 CCW12 종결자 (TCCW12)의 측면에 위치하는 씨. 부틸리쿰 (티올라제)의 아세토아세틸-CoA 티올라제 유전자의 코딩 서열, 및 사카로마이세스 세레비지애의 HXT3 유전자의 상류 및 하류 서열의 측면에 위치하는, TUB2 프로모터 (PTUB2)보다 선행하는 비. 윤세아 의 HMGS 유전자(HMGS)의 코딩 서열을 포함하였다. 숙주 세포 형질전환체는 하이그로마이신 B를 포함하는 배지에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하였고, 균주 Y1816을 수득하였다.
균주 Y2055는 균주 Y1778로부터 화학적 돌연변이생성에 의해 제조하였다. 돌연변이화된 균주를 β-파르네센의 생성 증가에 대해 스크리닝하고, 균주 Y2055를 수득하였다.
균주 Y2295는 균주 Y2055로부터 화학적 돌연변이생성에 의해 제조하였다. 돌연변이화된 균주를 β-파르네센의 생성 증가에 대해 스크리닝하고, 균주 Y2295를 수득하였다.
균주 Y3111는 MAT A 내지 MAT 알파의 균주 Y2295의 메이팅 형을 스위칭함으로서 제조하였다. 이를 위해, 기하급수적으로 성장하는 Y2295 세포를 삽입 구축물 i476 (SEQ ID NO: 21)로 형질전환시켰으며, 이 구축물은 MAT 알파 메이팅 유전자 좌 및 하이그로마이신 B 내성 마커 (hygA)를 포함하였다. 숙주 세포 형질전환체는 하이그로마이신 B를 포함하는 배지에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하고, 균주 Y3111을 수득하였다.
균주 Y2168은 균주 Y1816으로부터 화학적 돌연변이생성에 의해 제조하였다. 돌연변이화된 균주를 β-파르네센의 생성 증가에 대해 스크리닝하고, 균주 Y2168을 수득하였다.
균주 Y2446은 균주 Y2168로부터 화학적 돌연변이생성에 의해 제조하였다. 돌연변이화된 균주를 β-파르네센의 생성 증가에 대해 스크리닝하고, 균주 Y2446을 수득하였다.
균주 Y3118은, 사카로마이세스 세레비지애의 GAL80 유전자의 코딩 서열, 프로모터, 및 종결자를 균주 Y2446의 고유한 URA3 유전자 좌로 삽입함으로써 제조하였다. 이를 위해, 기하급수적으로 성장하는 Y2446 세포를 삽입 구축물 i477 (SEQ ID NO: 22)로 형질전환시켰으며, 이 구축물은 중복 URA3 서열의 측면에 위치하는 사카로마이 세스 세레비지애의 GAL80 유전자의 프로모터, 종결자, 및 코딩 서열을 포함하였다 (본래의 URA3 서열의 복구 및 상동성 재조합에 의해 GAL80 유전자의 루프-아웃(loop-out) 절제를 가능하게 함). 숙주 세포 형질전환체는 5-FOA를 포함하는 배지에서 선별하였으며, 균주 Y3118을 수득하였다.
균주 Y3215는 균주 Y3111 및 Y3118을 메이팅함으로써 제조하였다. 균주 Y3111 및 Y3118의 대략 1 x 107 세포를 실온에서 6시간 동안 YPD 배지 플레이트에서 혼합하여, 메이팅이 가능하게 한 다음, YPD 한천 플레이트에 도말하여, 단일 콜로니를 분리하였다. 2배체는, hphA-marked MAT 알파 유전자 좌 및 야생형 MAT A 유전자 좌 둘 다의 존재에 대해 콜로니 PCR로 스크리닝하여 동정하였다.
균주 Y3000는, 균주 Y3215을 포자형성시키고, GAL80 코딩 서열을 루핑-아웃함으로써 제조하였다. 2배체 세포는 2% 포타슘 아세테이트 및 0.02% 라피노스 액체 배지에서 포자형성시켰다. 랜덤 포자를 분리하고, YPD 한천에 도말하고, 3일 동안 배양한 다음, CSM-U에 레플리카-도말하여, GAL80이 결핍된 (즉, 기능성 URA3 유전자를 가진) 세포만 성장할 수 있게 하였다. 그런 다음, 포자를 β-파르네센 생성에 대해 시험하고, 최상의 생산자를 동정하고, 삽입 구축물 i301의 존재를 진단 PCR로 확인하였으며, 균주 Y3000을 수득하였다.
균주 Y3284는 균주 Y3000으로부터 URA3 마커를 제거으로써 제조하였다. 이를 위해, 기하급수적으로 성장하는 Y3000 세포를 삽입 구축물 i94 (SEQ ID NO: 23)로 형질전환시켰으며, 이 구축물은, 살모넬라의 hisG 코딩 서열, 및 ERG13 유전자의 코딩 서열 및 사카로마이세스 세레비지애의 HMG1 유전자의 단축된 코딩 서열을 포함하였다 (사카로마이세스 세레비지애의 GAL1 또는 GAL10 유전자의 갈락토스 유도성 프로모터의 조절 하에서, 그리고 사카로마이세스 세레비지애의 URA3 유전자의 상류 및 하류 서열의 측면에 존재함). 숙주 세포 형질전환체는 5-FOA를 포함하는 배지에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하고, 균주 Y3284를 수득하였다.
균주 Y3385는, 균주 Y3284의 NDT80 코딩 서열을, 사카로마이세스 세레비지 애의 아세틸-CoA 신타제 유전자의 코딩 서열의 부가적인 카피, 및 제트. 모빌리스(Z. mobilis )의 PDC 유전자의 코딩 서열로 치환함으로써 제조하였다. 이를 위해, 기하급수적으로 성장하는 Y3385 세포를, 삽입 구축물 i467 (SEQ ID NO: 24)로 형질전환시켰으며, 이 구축물은 URA3 마커, HXT3 프로모터 (PHXT3) 및 PGK1 종결자 (TPGK1)의 측면에 위치하는 사카로마이세스 세레비지애의 ACS2 유전자의 코딩 서열 (ACS2), 및 GAL7 프로모터 (PGAL7) 및 TDH3 종결자 (TTDH3)의 측면에 위치하는 제트. 모빌리스의 PDC 유전자의 코딩 서열 (zmPDC) (상류 및 하류 NDT80 서열의 측면에 존재함)을 포함하였다. 숙주 세포 형질전환체는 CSM-U에서 선별하였으며, 선별된 클론은 진단 PCR로 확인하고, 균주 Y3385를 수득하였다.
균주 Y3547은 균주 Y3385로부터 화학적 돌연변이생성에 의해 제조하였다. 돌연변이화된 균주를 β-파르네센의 생성 증가에 대해 스크리닝하고, 균주 Y3547을 수득하였다.
균주 Y3639는 균주 Y3547로부터 화학적 돌연변이생성에 의해 제조하였다. 돌연변이화된 균주를 β-파르네센의 생성 증가에 대해 스크리닝하고, 균주 Y3639를 수득하였다.
7.3.2. 표적 DNA의 구축 및 삽입
FcphI 엔도뉴클레아제-매개성 이중-가닥 절단에 대한 외인성 게놈 표적 부위를 균주 Y3639의 3개의 서로 다른 유전자 좌로 삽입시켰다. 3개의 표적 부위 카세트는 중복 절편의 PCR 어셈블리를 사용해 구축하였으며, 각각은 FcphI 엔도뉴클레아제에 대한 인지 서열, 및 각각 (1) URA3 (변형된 Gal80 유전자 좌에 대한 상동성 영역의 측면에 존재함) (SEQ ID NO: 25); (2) NatR (변형된 HXT3 유전자 좌에 대한 상동성 영역의 측면에 존재함) (SEQ ID NO: 26); 및 (3) KanR (변형된 Mata 유전자 좌에 대한 상동성 영역의 측면에 존재함) (SEQ ID NO: 27)에 대한 코딩 서열을 포함하였다. 각각의 표적 부위 카세트를 Y3639로 단계적으로 형질전환시켰으며, 상기 균주는, 올바른 유전자 좌에서 F-CphI-플랭킹된 카세트의 3개의 삽입된 카피를 가지는지 콜로니 PCR로 확인하였다 ("B 균주").
7.3.3. F-CphI 효모 발현 플라스미드의 구축
HygR 선별 마커를 포함하는 F-CphI 효모 발현 플라스미드 pAM1799는 미국 특허 제 7,919,605 호 (원용에 의해 본원에 포함됨)에서 전술하였다.
7.3.4. 공여체 DNA으로의 형질전환, 및 이중-가닥 절단의 유도
표준 리튬 아세테이트/SSDNA/PEG 프로토콜 (Gietz and Woods, Methods Enzymol. 2002;350:87-96)은, 42도 열쇼크 전에 세포를 30도에서 30분 인큐베이션하는 것으로 포함하도록 변경하였다. 이 방법을 이용해, FcphI 엔도뉴클레아제를 코딩하는 pAM1799, 및 3개의 선형 "공여체" DNA로 균주 B를 형질전환시켰으며, 각각은, 각각 균주 B의 변형된 Gal80 (SEQ ID NO: 28), HXT3 (SEQ ID NO: 29) 및 Mata 유전자 좌 (SEQ ID NO: 30)에 대한 상동성 영역의 측면에 위치하는, 아르테미시아 안누아( Artemisia annua)의 아모파다이엔 신타제 (ADS)에 대한 코돈 최적화된 코딩 서열을 포함하였다.
1 ㎍의 pAM1799을 ADS 공여체 DNA 각각의 ~100 ng으로 공동-형질전환시켰다. 형질전환체 모두를 YP + 2% 갈락토스에서 밤새 회수하여, F-CphI 발현을 유도하였다. 여러 가지 희석물을 하이그로마이신 함유 YPD 한천 플레이트 상으로 도말하여, 플라스미드 DNA로 형질전환된 콜로니를 선별하였다. 플레이트를 30℃에서 3-4일간 인큐베이션하였다.
7.3.5. 다중 동시 삽입의 확인
콜로니 PCR (cPCR)을 수행하여, F-CphI-flanked 마커 카세트 코딩 서열이 ADS 카세트 코딩 서열로 치환되는 빈도를 측정하였다. DNA는, 각각의 유전자 좌에서의 ADS 카세트 코딩 서열의 성공적인 삽입이 예상한 크기의 앰플리콘을 생성하는 것으로 예상되지만 비-삽입은 앰플리콘을 생성하지 않는 것으로 예상되도록, ADS 및 Gal80 유전자 좌, ADS 및 HXT3 유전자 좌, 및 ADS 및 Mata 유전자 좌 각각에 대해 특이적인 프라이머 쌍으로 탐침한 20개의 콜로니로부터 프렙하였다. 각각의 유전자 좌의 5' 및 3' 말단으로부터 앰플리콘을 생성하기 위한 PCR 반응을 여러 번 수행하였다. 일부 경우, 5' 또는 3' 앰플리콘만이 성공적으로 검출되었지만, ADS 카세트의 적절한 삽입은 더 큰 PCR 절편을 서열분석함으로써 이들 유전자 좌에서 확인하였다.
Figure 112013108556036-pct00003
cPCR로 스크리닝한 20개 콜로니 중에서, 14개는 Gal80 유전자 좌에서 ADS 삽입되었으며, 17개는 HXT3 유전자 좌에서 ADS 삽입되었으며, 4개는 Matα 유전자 좌에서 ADS 삽입되었다. Matα 유전자 좌에서의 삽입률이 낮은 것은, F-CphI 부위의 측면에 위치하는 직접 반복 서열에 의해 매개되는, 이 유전자 좌에서 자가-밀폐(self-closure)때문일 수 있다. 전체적으로, 6개 클론은 단일 부위에서 ADS 삽입되었으며, 10개 클론은 2개 부위에서 ADS 삽입되었으며, 3개 클론은 3개 유전자 좌 모두에서 ADS 삽입되었다 ("C 균주"). 3중 삽입된 균주는 플랭크를 둘 다 포함하는 더 긴 PCR 산물을 서열분석함으로써 추가로 확인하였다.
1.1.5 삽입된 ADS 균주의 완성 및 세스퀴테르펜 분석법
3중 삽입된 ADS 균주는 표준 프로토콜을 이용해 His3 유전자 좌에서 URA 카세트 (SEQ ID NO: 40)로 마킹한 ADS의 최종 카피를 삽입시켜서 추가로 변형하였으며, 생성되는 균주는 이 4번째 카피에 대해 확인하였다 ("D 균주"). 마지막으로, 균주 D 세포를 비-선별성 배지에서 계대배양하여, Leu+ 마킹된 고 복사 파르네센 신타제 플라스미드 (pAM404)를 상실시켰다 ("E 균주").
E 균주의 여러 가지 분리물을 균주 D 및 본래 모 균주 B와 함께 세스퀴테르펜 생성에 대해 분석하였다. 간략하게는, 균주 B, D 및 E의 분리물을, 각 웰 당 360 ㎕ Bird Seed Medium (BSM) + 2% 수크로스가 든 96-웰의 개별 웰에서 인큐베이션하였다 (예비배양). 33.5℃에서 999 rpm 진탕과 함께 3일간 인큐베이션한 후, 각각의 웰의 14.4 ㎕를 360 ㎕의 신선한 BSM + 4% 수크로스가 든 새로운 96-웰 플레이트의 웰에 접종하였다 (생성 배양). 33.5℃에서 999 rpm 진탕과 함께 2일간 인큐베이션한 후, 샘플을 취하고, 기체 크로마토그래피 (CG) 분석에 의해 세스퀴테르펜 생성에 대해 분석하였다. 샘플을 메탄올-헵탄 (1:1)으로 추출하고, 혼합물을 원심분리하여 세포성 물질을 제거하였다. 메탄올-헵탄 추출물의 분취물을 헵탄 중에 희석시킨 다음, 펄스 스플리트 주입을 이용해 메틸 실리콘 고정상(stationary phase)으로 주입하였다. 파르네센 및 아모파다이엔을 불꽃 이온화 검출기 (FID)를 이용해 비점에 의해 분리하였다. 트랜스-β-카르요필렌을 체류 시간 마커로서 사용하여, 특정한 GC 오븐 프로파일 동안의 성공적인 주입 및 용출을 모니터링하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 전체 세스퀴테르펜 생성은 모든 균주에 대해 거의 동일한 채로 있었지만 (3-3.5 g/L), 산물 프로파일은 파르네센 (균주 B) → 혼합 산물 (균주 D) → 아모파다이엔 (E 균주)로 성공적으로 전환되었다.
이들 결과는, 숙주 세포의 게놈에서 다중 표적화된 이중-가닥 절단을 유도하면, 기능성 유전자 카세트의 동시 다중 삽입을 촉진할 수 있으며, 이 경우 한번의 형질전환에서 파르네센-생성 균주에서 아모파다이엔-생성 균주로의 전환을 촉진함을 나타낸다.
7.4 실시예 4:
파르네센 신타제의 다중 삽입된 카피의 아모파다이엔 신타제로의 동시 치환
본 실시예는, 신타제 코딩 영역 내 설계자 뉴클레아제-유도성 이중-가닥 절단에 의해 촉진되는, 4개의 게놈 삽입된 테르펜 신타제 유전자의 동시 치환을 나타내는 결과를 제공한다. 간략하게는, 균주 Y3639 (실시예 3에서 기술) 유래이지만 파르네센 신타제 (FS) 유전자의 염색체외성 카피보다는 4개의 삽입체를 포함하는 기존의 파르네센 생성 균주를, 설계자 TAL-작동자 뉴클레아제 (TALEN)를 코딩하는 플라스미드, 및 새로운 테르펜 신타제 유전자를 코딩하는 4개의 선형 공여체 DNA로 공동-형질전환시켰다. 상기 설계자 TALEN은 삽입된 파르네센 신타제 유전자에 고유 서열을 결합 및 절단할 수 있다. 형질전환된 콜로니를 콜로니 PCR (cPCR)로 스크리닝하고, 1, 2, 3, 또는 4개의 게놈 삽입된 표적 마커 유전자 좌를 가진 균주를 동정하였다.
7.4.1. 표적 DNA의 구축 및 삽입
4개의 공여체 카세트 (각각은 표적 유전자 좌 각각에 대한 상동성 영역 (~500 bp)의 측면에 위치하는 테르펜 신타제 코딩 서열을 포함함)를 중복 PCR로 조립하였다. 공여체 DNA 중 3개는 ADS 코딩 서열을 포함하고 선별 마커는 포함하지 않았지만 (SEQ ID NOs: 41-43), 마지막의 공여체 DNA는 URA3 마커 카세트에 융합된 파르네센 신타제 (FS)의 새로운 코돈 최적화를 포함하는 카세트였다 (SEQ ID NO: 44). 공여체 DNA 중 어느 것도 FS-특정 TALEN (5'- TAGTGGAGGAATTAAAAGAGGAAGTTAAGAAGGAATTGATAACTATCAA-3' (SEQ ID NO:45))에 의해 인지되는 표적 부위를 포함하지 않았다.
균주에서 4개의 삽입된 FS 카세트의 치환의 경우 (균주 F), hyg+ marked TALEN 플라스미드를, 실시예 3에서 기술한 프로토콜에 따라, ~500 ng의 각각의 선형 공여체 DNA와 함께 숙주 균주로 공동-형질전환시켰다. 여러 가지 희석물을 CSM-URA + Hyg 플레이트로 도말하고, 30도에서 3일간 인큐베이션하였다.
7.4.2. 다중 동시 삽입의 확인
TALEN 플라스미드의 선별, 및 CSM-URA + Hyg 플레이트상에서의 URA3 마킹된 코돈-FS 카세트의 삽입 후, 콜로니 PCR를 수행하여, 3개의 유전자 좌에서 삽입된 FS 카세트를 비마킹된 ADS 카세트로 치환하는 빈도를 측정하였다. DNA는, 각각의 유전자 좌에서의 ADS 카세트 코딩 서열의 성공적인 삽입이 예상한 크기의 앰플리콘을 생성하는 것으로 예상되지만 비-삽입은 앰플리콘을 생성하지 않는 것으로 예상되도록, 20개의 콜로니로부터 프렙하고, NDT80, DIT1 및 ERG10 유전자 좌에서 ADS 카세트의 삽입에 특이적인 프라이머 쌍으로 탐침하였다.
Figure 112013108556036-pct00004
시험한 48개 클론 중 3개는 URA3-마킹된 FS 외에도 단일 ADS 카세트를 삽입하였으며, 1개의 클론은 2개의 ADS 카세트를 삽입하였으며, 1개의 클론은 3개의 ADS 카세트를 모두 삽입하였다. 다중 삽입 결과는, 플랭크 둘 다를 포함하는 더 긴 PCR 산물을 서열분석함으로써 추가로 확인하였다.
이들 결과는, 생합성 경로를 포함하는 숙주 세포에서 부위-특이적인 설계자 뉴클레아제의 발현이, 경로 유전자의 다중 삽입된 카피를 한번의 형질전환 공정에서 새로운 경로 유전자로 동시 치환되는 것을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
7.5 실시예 5:
구별되는 설계자 뉴클레아제로 절단한 2개의 유전자 좌로의, 마커 리스 DNA 구축물의 동시 다중 삽입
본 실시예는 2개의 고유 표적 부위에서 2개의 마커리스 DNA 구축물의 동시 삽입을 나타내는 결과를 제공하며, 각각의 부위는 구별되는 설계자 뉴클레아제로 절단한다. 간략하게는, ADE- 숙주 균주를, (1) GFP 카세트 (SFC1 유전자 좌에 상동성인 상류 및 하류 영역에 의해 플랭킹됨)를 포함하는 선형 DNA 절편; (2) ADE2 카세트 (YJR030c 유전자 좌에 상동성인 상류 및 하류 영역에 의해 플랭킹됨)를 포함하는 선형 DNA 절편; 및 (3) 고유한 SFC1 및 YJR030c 개방형 판독 프레임(open reading frame) 각각에서 서열을 표적화하는 설계자 뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드(들)로 공동-형질전환시켰다. 플라스미드(들)의 선별 후, 형질전환된 콜로니를, ADE- 표현형의 보완을 나타내는 GFP 형광 및 백색에 대해 시각적으로 스크리닝하였다. 콜로니 PCR (cPCR)을 또한 수행하여, 두 유전자 좌 모두의 치환을 확인하였다. 흥미롭게도, 단일 설계자 뉴클레아제만 사용한 경우의 삽입 속도에 비해 설계자 엔도뉴클레아제를 함께 사용하였을 때, 두 표적 유전자 좌 모두에서의 삽입 속도가 크게 개선되어 나타났다.
7.5.1. 공여체 DNA 카세트의 구축
2개의 공여체 DNA는 중복(overlapping) 절편의 PCR 어셈블리를 이용해 생성하였다: (1) SFC1 유전자 좌 (SEQ ID NO: 58)에 상동성인 상류 및 하류 영역의 ~500 bp에 의해 플랭킹된(flanked) GFP 카세트를 포함하는 선형 DNA 절편; 및 (2) YJR030c 유전자 좌 (SEQ ID NO: 59)에 상동성인 상류 및 하류 영역의 ~500 bp에 의해 플랭킹된 ADE2 카세트를 포함하는 선형 DNA 절편.
7.5.2. 헤테로이량체성 ZFN 발현 플라스미드의 구축
YJR030c-특정 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 코딩하는 플라스미드를 2가지 방식으로 구축하였다. 제1 버전에서, 분기성(divergent) Gal1-10 프로모터의 발현 하에 Adh1 및 CYC1 종결자에 의해 종결되는 헤테로이량체성 ZFN의 2개의 ORF를 효모에서 3개 파트 갭 복구에 의해 Kan marked CEN-ARS 벡터로 클로닝하였다 (pCUT006). 제2 버전은 또한, 헤테로이량체성 ZFN의 ORF 둘 다, 절단형 펩타이드 링커를 코딩하는 DNA 서열에 의해 분리되는 단량체를 이용해 Gal10 프로모터로부터 단일 ORF로서 발현되도록 구축하였다. 이 제2 플라스미드는, PCR 절편의 IIS형 제한효소 효소 분해에 의해 생성된 링커를 이용해 Kan 마킹된 CEN-ARS 벡터 백본 (pCUT016)으로 3-파트 연결함으로써 구축하였다. SFC1-특정 ZFN을 코딩하는 플라스미드를 또한, 동일한 링커 방법, 마커 및 백본을 이용해 단일 ORF로서 구축하였다 (pCUT015). 그런 다음, 마커를 효모 (pCUT058)에서 갭 복구 반응에 의해 URA로 바꾸었다. YJR030c 및 SFC1-특정 뉴클레아제 둘 다의 발현을 위한 단일 플라스미드를 구축하기 위해, pCUT16 및 pCUT15 유래의 단일 ORF를 새로운 CEN-ARS Kan+ 벡터 백본으로 서브클로닝하고, Cyc1 및 Adh1 종결자 (pCUT032)를 이용해 Gal1-10 분기성 프로모터로부터 발현시켰다.
7.5.1. 공여체 DNA으로의 형질전환 및 이중-가닥 절단의 도입
1 ㎍의 각각의 설계자 뉴클레아제 플라스미드 DNA, 또는 단일 플라스미드에 설계자 엔도뉴클레아제를 둘 다 포함하는 플라스미드를 ~1 ㎍의 공여체 DNA 각각으로 공동-형질전환시켰다. 모든 형질전환체를 YP + 2% 갈락토스에서 밤새 회수하여, 뉴클레아제 발현을 유도하였다. 여러 가지 희석물을 URA 드롭아웃 + Kan 한천 플레이트 (이중 플라스미드의 경우) 또는 YPD + Kan 상으로 도말하여, 플라스미드 DNA로 형질전환된 콜로니를 선별하였다. 플레이트를 30℃에서 3-4일간 인큐베이션하였다.
7.5.2. 다중 동시 삽입의 확인
SFC1 유전자 좌에서의 마커리스 삽입은, 적절한 필터를 사용하여 UV 광 하에 GFP 형광을 관찰함으로써 스코어링하였다. ADE2의 마커리스 삽입은 백색 콜로니 색상을 관찰하여 스코어링하였으며, 이는 숙주 균주에서 ADE2 결실 표현형 (분홍색 콜로니)의 보완(complementation)을 나타낸다. 전형적인 실험에서, 50-150개 콜로니를 분석하였다. 시각적인 스코어링 방법은, 삽입 구축물의 5' 프라이머 및 내부 역방향 프라이머를 사용해 콜로니 PCR에 의해 콜로니의 서브셋에서 확인하였다. 각각의 유전자 좌에서의 삽입은 예상한 크기의 앰플리콘(amplicon)을 생성하는 것으로 예상하였지만, 비-삽입은 앰플리콘을 생성하지 않는 것으로 예상하였다. cPCR 결과는 시각적인 스코어링 방법의 정확도를 확인시켜 주었다.
Figure 112013108556036-pct00005
도 8에서 나타낸 바와 같이, SFC1 및 YJR030c 유전자 좌에 대한 선형 공여체 DNA와, YJR030c 엔도뉴클레아제 플라스미드 (pCUT006) 및 SFC1 엔도뉴클레아제 플라스미드 (pCUT058)로 공동-형질전환시킨 세포에서, URA 드롭아웃 + Kan 한천 플레이트 상에서 선별한 콜로니 중 80%는 GFP 양성이었다. 이들 콜로니 중, 91%는 ADE2 삽입에 대해 양성이었다. 전체적으로, 콜로니 중 72.8%는 두 유전자 좌 모두에서 공여체 DNA를 삽입하였다.
SFC1 유전자 좌에 대한 선형 공여체 DNA 및 SFC1를 표적으로 하는 설계자 뉴클레아제 플라스미드 (pCUT015)로 공동-형질전환된 세포에서, 상기 세포 중 50%는 GFP 양성이었다. 세포를 YJR030c 유전자 좌에 대한 선형 공여체 DNA, 및 YJR030c 유전자 좌를 표적으로 하는 설계자 뉴클레아제 플라스미드 (pCUT016)로 공동-형질전환시키는 경우, 상기 세포 중 단 5%만이 ADE2 삽입에 대해 양성이었다. 숙주 세포를 SFC1 및 YJR030c 유전자 좌에 대한 선형 DNA, 및 SFC1/YJR030c 설계자 뉴클레아제 플라스미드 (pCUT032)로 공동-형질전환시키는 경우, 상기 세포 중 76%는 GFP 양성이었으며, 63%는 ADE2 양성이었다. 이 결과는, 다중 부위가 설계자 엔도뉴클레아제에 의해 표적화되는 경우, 삽입 효율이 놀랍게도 크게 개선됨을 나타낸다.
이들 결과는, 숙주 세포의 게놈 내 고유한 유전자 좌에서 다중 표적화된 이중-가닥 절단의 도입은 기능성 유전자 카세트의 동시, 다중, 마커리스 삽입을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
본 출원에서 언급한 모든 공개, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공개 또는 특허 출원이 참조로서 구체적이면서 개별적으로 나타나 있는 것처럼, 본원에 참조로서 포함된다. 전술한 발명이 이해의 명확성을 위해 예시 및 실시예로써 좀더 상세히 기술되었지만, 당해 기술분야의 당업자는, 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구항의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음을 본 발명의 교시를 통해 쉽게 알 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> AMYRIS, INC. SERBER, Zach HORWITZ, Andrew <120> METHODS FOR GENOMIC MODIFICATION <130> AM-4800-US <150> US 61/479,821 <151> 2011-04-27 <150> US 61/500,741 <151> 2011-06-24 <150> US 61/539,389 <151> 2011-09-26 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Wild-type Em.GFP coding sequence <400> 1 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccttgaccta cggcgtgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaag gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gacccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac 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tctaaatcca tatcctcata agcagcaatc 480 aattctatct atactttaaa 500 <210> 4 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: HO downstream integration sequence <400> 4 aatgtgtata ttagtttaaa aagttgtatg taataaaagt aaaatttaat attttggatg 60 aaaaaaacca tttttagact ttttcttaac tagaatgctg gagtagaaat acgccatctc 120 aagatacaaa aagcgttacc ggcactgatt tgtttcaacc agtatataga ttattattgg 180 gtcttgatca actttcctca 200 <210> 5 <211> 490 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: YGR250c upstream integration sequence <400> 5 gtacgatgtt tctcccgctg atccgattac tagccgaaga cgtaaaattg gcgcttgatt 60 caatttatgc ccttcccggg aatagttgac caaagggcaa aaaaattcag tcggagattc 120 cctattgggc ggaatttagt agatctcttt ccgtgcataa cgcctgcccg ttagtcgtta 180 tttcacgtta acattttctt ggccactgcg ctatataaat aaatacatat atatatgtca 240 agcacaataa agaaacttcc cttaaatatt gaataagtaa ataatagttg aaaagtgcct 300 tttgttcgaa ggattagagt gttcttaatt ttagttcgtt caacggtctc aaaaaaagtg 360 tgaacaagta aagcatagca cacatcccaa 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tacaaaccgt aatgtcacat tttgcatata tcttatgtat aaatatatag 780 ttcacttact acttgttctc gttttgttaa ctttcttgtt gtagttcttc ttgttcttgg 840 cgtttccccc tttgttttct atctgcttca taagtaaagt gcaaagcatt ttggaagata 900 ttatcaattg agtcattgaa agaaacttgg catcttccct attactaaaa ctaagaatac 960 ttgattcaag aaagaagttt atattagttt tagccgtaag ataacataac aaagaagaag 1020 aaagaaaatt cttgaataat acataacttt tcttaaaaga atcaaagaca gataaaattt 1080 aagagatatt aaatattagt gagaagccga gaattttgta acaccaacat aacactgaca 1140 tctttaacaa cttttaatta tgatacattt cttacgtcat gattgattat tacagctatg 1200 ctgacaaatg actcttgttg catggctacg aaccgggtaa tactaagtga ttgactcttg 1260 ctgacctttt attaagaact aaatggacaa tattatggag catttcatgt ataaattggt 1320 gcgtaaaatc gttggatctc tcttctaagt acatcctact ataacaatca agaaaaacaa 1380 gaaaatcgga caaaacaatc aagtatggat tctagaacag ttggtatatt aggaggggga 1440 caattgggac gtatgattgt tgaggcagca aacaggctca acattaagac ggtaatacta 1500 gatgctgaaa attctcctgc caaacaaata agcaactcca atgaccacgt taatggctcc 1560 ttttccaatc ctcttgatat 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tctctcttgt ttaatatata ttcatttata tcacgctctc 1440 tttttatctt cctttttttc ctctctcttg tattcttcct tcccctttct actcaaacca 1500 agaagaaaaa gaaaaggtca atctttgtta aagaatagga tcttctacta catcagcttt 1560 tagatttttc acgcttactg cttttttctt cccaagatcg aaaatttact gaattaacaa 1620 tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg 1680 gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg 1740 gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc 1800 tcgtgaccac cttgacctac ggcgtgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc 1860 agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct 1920 tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg 1980 tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca 2040 agctggagta caactacaac agccacaagg tctatatcac cgccgacaag cagaagaacg 2100 gcatcaaggt gaacttcaag acccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg 2160 accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact 2220 acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc 2280 tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaac 2340 tcgagaagct tgatccggct gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag 2400 ttataaaaaa aataagtgta tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat 2460 tcttattctt gagtaactct ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg 2520 tcgctcttat tgaccacacc tctaccggca tgccgagcat gatgaacaat gggactacaa 2580 aatgaaataa agaaaaaata gaaatagaat agaagatcaa ttattaatcg ccctattctt 2640 ccttattacc tacacaaaat aaagcagcaa cataagaaac aaaaacaaaa tgaaaacaaa 2700 ccaaataaat ctatgtaagc atactcattt caatttgata ttcattactt gacttttttg 2760 tccttatttg aggctccata agcgcgccat tttcccctac tccctttttt cgtaaatagt 2820 aataatgtgc tgaaaagaac aatgaagtag ttatcataca tattccgtcg tgtcgatatg 2880 aggggaggtg tctctttctt tcatcccttg tcgcaacctc caatatataa gagcataagc 2940 aactgatctt actttagtaa ttaacttagc atacctggcc cgaaggaaga aaaaaaattc 3000 acctcaacaa catggttcct aagttttaca aactttcaaa cggcttcaaa atcccaagca 3060 ttgctttggg aacctaccgg tgtttaaacc ccagcgcctg gcggggatat tccaagatcg 3120 caaacagccg aaattgtgta tgaaggtgtc aagtgcggct accgtcattt cgatactgct 3180 gttctttatg gtaatgagaa ggaagttggc gatggtatca ttaaatggtt gaacgaagat 3240 ccagggaacc ataaacgtga ggaaatcttc tacactacta aattatggaa ttcgcaaaac 3300 ggatataaaa gagctaaagc tgccattcag caatgtttga atgaagtctc gggcttgcaa 3360 tacatcgatc ttcttttgat tcattcgcca ctggaaggtt ctaaattaag gttggaaact 3420 tggcgcgcca tgcaagaagc ggttgatgaa ggattggtta agtctatagg ggtttccaac 3480 tatgggaaaa agcacattga tgaacttttg aactggccag aactgaagca caagccagtg 3540 gtcaaccaaa tcgagatatc accttggatt atgagacaag aattag 3586 <210> 59 <211> 4300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADE2_YJR030C donor cassette <400> 59 ggaactttat gaacatatta agtctgcttg atgaaatgtc atgtgcaggt gccgttggca 60 caaaatggga acaaaattat gaaaattcag tcgaggatgg gtgtgaagca cctgaatcca 120 atccataccg ttctattatt gatctttcta gtcgttccat taatataact gcagacctac 180 tttcgactgt tgggaggagt aattcagcac tcaacaagaa tgagattata gctgctattc 240 aaggtctcgc ccatcaatgc ctcaatccct gtgacgaact aggtatgcaa gcattgcaag 300 cattagagaa cattctgtta tctcgagcaa gtcaactacg tacggaaaaa gttgcggtgg 360 ataacctact agagacagga ttattaccga tttttgagtt ggatgaaatc caagatgtca 420 agatgaaacg aattactagc attttatccg ttctttctaa aatgacggca cggccacgcg 480 tttaaaccgc ccttcttggg tcaacttgtg gaaggcgtaa caagtaacga aacttttttg 540 agagtgctta acgtatttaa caagtatgta gatgatccta cggtggaaag gcagttgcaa 600 gagttgatta tttctaagag ggaaatcgag aaggagtaga ccaacgataa tgtaactata 660 ccaagaaact tagtatgatg gaattttttc aaggagtcgt aaattagatt ttcgcaggta 720 ataatgcgat atataagcaa tctcatttaa atatcgacgg tggcatttat accatcattt 780 actgttatat ttatctaacg cgtcgcgacg cgttagataa aatacaacaa gatttttttt 840 tcgtgtcacc aatggcatga aagcttcgag aataatttga aggaaatttc acttaatggg 900 aaaaataaaa atgtaccctt atcgagatta ctcttttacc ctcagttcaa ttaaaattca 960 tcatgaacca agtaaaagtt cctctaatta cgaacgagca agcaaattag tattgtgtgg 1020 gagacgggtt cttgaataat acataacttt tcttaaaaga atcaaagaca gataaaattt 1080 aagagatatt aaatattagt gagaagccga gaattttgta acaccaacat aacactgaca 1140 tctttaacaa cttttaatta tgatacattt cttacgtcat gattgattat tacagctatg 1200 ctgacaaatg actcttgttg catggctacg aaccgggtaa tactaagtga ttgactcttg 1260 ctgacctttt attaagaact aaatggacaa tattatggag catttcatgt ataaattggt 1320 gcgtaaaatc gttggatctc tcttctaagt acatcctact ataacaatca agaaaaacaa 1380 gaaaatcgga caaaacaatc aagtatggat tctagaacag ttggtatatt aggaggggga 1440 caattgggac gtatgattgt tgaggcagca aacaggctca acattaagac ggtaatacta 1500 gatgctgaaa attctcctgc caaacaaata agcaactcca atgaccacgt taatggctcc 1560 ttttccaatc ctcttgatat cgaaaaacta gctgaaaaat gtgatgtgct aacgattgag 1620 attgagcatg ttgatgttcc tacactaaag aatcttcaag taaaacatcc caaattaaaa 1680 atttaccctt ctccagaaac aatcagattg atacaagaca aatatattca aaaagagcat 1740 ttaatcaaaa atggtatagc agttacccaa agtgttcctg tggaacaagc cagtgagacg 1800 tccctattga atgttggaag agatttgggt tttccattcg tcttgaagtc gaggactttg 1860 gcatacgatg gaagaggtaa cttcgttgta aagaataagg aaatgattcc ggaagctttg 1920 gaagtactga aggatcgtcc tttgtacgcc gaaaaatggg caccatttac taaagaatta 1980 gcagtcatga ttgtgaggtc tgttaacggt ttagtgtttt cttacccaat tgtagagact 2040 atccacaagg acaatatttg tgacttatgt tatgcgcctg ctagagttcc ggactccgtt 2100 caacttaagg cgaagttgtt ggcagaaaat gcaatcaaat cttttcccgg ttgtggtata 2160 tttggtgtgg aaatgttcta tttagaaaca ggggaattgc ttattaacga aattgcccca 2220 aggcctcaca actctggaca ttataccatt gatgcttgcg tcacttctca atttgaagct 2280 catttgagat caatattgga tttgccaatg ccaaagaatt tcacatcttt ctccaccatt 2340 acaacgaacg ccattatgct aaatgttctt ggagacaaac atacaaaaga taaagagcta 2400 gaaacttgcg aaagagcatt ggcgactcca ggttcctcag tgtacttata tggaaaagag 2460 tctagaccta acagaaaagt aggtcacata aatattattg cctccagtat ggcggaatgt 2520 gaacaaaggc tgaactacat tacaggtaga actgatattc caatcaaaat ctctgtcgct 2580 caaaagttgg acttggaagc aatggtcaaa ccattggttg gaatcatcat gggatcagac 2640 tctgacttgc cggtaatgtc tgccgcatgt gcggttttaa aagattttgg cgttccattt 2700 gaagtgacaa tagtctctgc tcatagaact ccacatagga tgtcagcata tgctatttcc 2760 gcaagcaagc gtggaattaa aacaattatc gctggagctg gtggggctgc tcacttgcca 2820 ggtatggtgg ctgcaatgac accacttcct gtcatcggtg tgcccgtaaa aggttcttgt 2880 ctagatggag tagattcttt acattcaatt gtgcaaatgc ctagaggtgt tccagtagct 2940 accgtcgcta ttaataatag tacgaacgct gcgctgttgg ctgtcagact gcttggcgct 3000 tatgattcaa gttatacaac gaaaatggaa cagtttttat taaagcaaga agaagaagtt 3060 cttgtcaaag cacaaaagtt agaaactgtc ggttacgaag cttatctaga aaacaagtaa 3120 tatataagtt tattgatata cttgtacagc aaataattat aaaatgatat acctattttt 3180 taggctttgt tatgattaca tcaaatgtgg acttcataca tagaaatcaa cgcttacagg 3240 tgtccttttt taagaatttc atacataaga tcatgttgag ataattgttg ggattccatt 3300 gttgataaag gctataatat taggtataca gaatatacta gaagttctcc tcgaggatat 3360 aggaatcctc aaaatggaat ctatatttct acatactaat attacgatta ttcctcattc 3420 cgttttatat gtttatattc attgatccta ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc 3480 ctctaacttc gatgacagct tctcataact tatgtcatca tcttaacacc gtatatgata 3540 atatattgat aatataacta ttagttgata gacgatagtg gatttttatt ccaacatacc 3600 acccataatg taatagatct aatgaatcca tttgtttgtt aatagtttga atgtttttat 3660 cggaagaggt ttggtcatta cgtctgcaat attctttttg gtttcgatat agcatacgtg 3720 cagatgattt cctgatactt catctctcaa tctcattgct ttagtaccaa aaaatctgtt 3780 cctaaatttc cggtgtttaa accccagcgc ctggcgggtc ttcattattg gatataatta 3840 tactgattgt agatttactg tcggttagta atcctttggt aattggtttc ttgtcaagtt 3900 cttgtatcag gtaacttaga ttatttaata atgggacaga ttcacttatc gcgtgtattt 3960 ctgcttccgt agttgaagta catgttaatg aagccttggt ggactttcct ccaattacct 4020 ttccattaag taaatatatg ttgccaattt gtgatttata atacggttgg ttgccatacg 4080 aggcatcgct tataacaact aatttatttg ttggcttaac aggtttgctt ttgtgccata 4140 ttaattgctt atctctcgta ttccatatga actgtatcaa ttcatatgtc atatctaaca 4200 cttgcttgga cggaaatagt atatgttgtg caagtgtgtt gatgtagtat aataggtcaa 4260 atctaaattt atatccaaca tatgatgcta gacctatcag 4300 <210> 60 <211> 3586 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: GFP_YJR030C donor cassette <400> 60 ggaactttat gaacatatta agtctgcttg atgaaatgtc atgtgcaggt gccgttggca 60 caaaatggga acaaaattat gaaaattcag tcgaggatgg gtgtgaagca cctgaatcca 120 atccataccg ttctattatt gatctttcta gtcgttccat taatataact gcagacctac 180 tttcgactgt tgggaggagt aattcagcac tcaacaagaa tgagattata gctgctattc 240 aaggtctcgc ccatcaatgc ctcaatccct gtgacgaact aggtatgcaa gcattgcaag 300 cattagagaa cattctgtta tctcgagcaa gtcaactacg tacggaaaaa gttgcggtgg 360 ataacctact agagacagga ttattaccga tttttgagtt ggatgaaatc caagatgtca 420 agatgaaacg aattactagc attttatccg ttctttctaa aatgacggca cggccacgcg 480 tttaaaccgc ccttcttggg tcaacttgtg gaaggcgtaa caagtaacga aacttttttg 540 agagtgctta acgtatttaa caagtatgta gatgatccta cggtggaaag gcagttgcaa 600 gagttgatta tttctaagag ggaaatcgag aaggagtaga ccaacgataa tgtaactata 660 ccaagaaact tagtatgatg gaattttttc aaggagtcgt aaattagatt ttcgcaggta 720 ataatgcgat atataagcaa tctcatttaa atatcgacgg tggcatttat accatcattt 780 actgttatat ttatctaacg cgtcgcgacg cgttagataa aatacaacaa gatttttttt 840 tcgtgtcacc aatggcatga aagcttcgag aataatttga aggaaatttc acttaatggg 900 aaaaataaaa atgtaccctt atcgagatta ctcttttacc ctcagttcaa ttaaaattca 960 tcatgaacca agtaaaagtt cctctaatta cgaacgagca agcaaattag tattgtgtgg 1020 gagacgggac acaattacag taacaataac aagaggacag atactaccaa aatgtgtggg 1080 gaagcgggta agctgccaca gcaattaatg cacaacattt aacctacatt cttccttatc 1140 ggatcctcaa aacccttaaa aacatatgcc tcaccctaac atattttcca attaaccctc 1200 aatatttctc tgtcacccgg cctctatttt ccattttctt ctttacccgc cacgcgtttt 1260 tttctttcaa atttttttct tctttcttct ttttcttcca cgtcctcttg cataaataaa 1320 taaaccgttt tgaaaccaaa ctcgcctctc tctctccttt ttgaaatatt tttgggtttg 1380 tttgatcctt tccttcccaa tctctcttgt ttaatatata ttcatttata tcacgctctc 1440 tttttatctt cctttttttc ctctctcttg tattcttcct tcccctttct actcaaacca 1500 agaagaaaaa gaaaaggtca atctttgtta aagaatagga tcttctacta catcagcttt 1560 tagatttttc acgcttactg cttttttctt cccaagatcg aaaatttact gaattaacaa 1620 tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg 1680 gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg 1740 gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc 1800 tcgtgaccac cttgacctac ggcgtgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc 1860 agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct 1920 tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg 1980 tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca 2040 agctggagta caactacaac agccacaagg tctatatcac cgccgacaag cagaagaacg 2100 gcatcaaggt gaacttcaag acccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg 2160 accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact 2220 acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc 2280 tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaac 2340 tcgagaagct tgatccggct gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag 2400 ttataaaaaa aataagtgta tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat 2460 tcttattctt gagtaactct ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg 2520 tcgctcttat tgaccacacc tctaccggca tgccgagcat gttgagataa ttgttgggat 2580 tccattgttg ataaaggcta taatattagg tatacagaat atactagaag ttctcctcga 2640 ggatatagga atcctcaaaa tggaatctat atttctacat actaatatta cgattattcc 2700 tcattccgtt ttatatgttt atattcattg atcctattac attatcaatc cttgcgtttc 2760 agcttcctct aacttcgatg acagcttctc ataacttatg tcatcatctt aacaccgtat 2820 atgataatat attgataata taactattag ttgatagacg atagtggatt tttattccaa 2880 cataccaccc ataatgtaat agatctaatg aatccatttg tttgttaata gtttgaatgt 2940 ttttatcgga agaggtttgg tcattacgtc tgcaatattc tttttggttt cgatatagca 3000 tacgtgcaga tgatttcctg atacttcatc tctcaatctc attgctttag taccaaaaaa 3060 tctgttccta aatttccggt gtttaaaccc cagcgcctgg cgggtcttca ttattggata 3120 taattatact gattgtagat ttactgtcgg ttagtaatcc tttggtaatt ggtttcttgt 3180 caagttcttg tatcaggtaa cttagattat ttaataatgg gacagattca cttatcgcgt 3240 gtatttctgc ttccgtagtt gaagtacatg ttaatgaagc cttggtggac tttcctccaa 3300 ttacctttcc attaagtaaa tatatgttgc caatttgtga tttataatac ggttggttgc 3360 catacgaggc atcgcttata acaactaatt tatttgttgg cttaacaggt ttgcttttgt 3420 gccatattaa ttgcttatct ctcgtattcc atatgaactg tatcaattca tatgtcatat 3480 ctaacacttg cttggacgga aatagtatat gttgtgcaag tgtgttgatg tagtataata 3540 ggtcaaatct aaatttatat ccaacatatg atgctagacc tatcag 3586 <210> 61 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Recognition sequence for ZFN.YJR030C <400> 61 cccggtatca gcaacccccc atgacgataa cgttgatgaa acg 43 <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Recognition sequence for ZFN.SFC1 <400> 62 cacctttacc gtttatgaat atgtaaggga gcatttagaa 40 <210> 63 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Primer CUT351 <400> 63 gcgaatgagc catgaattat taaccgc 27 <210> 64 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Primer CUT350 <400> 64 agatgaaacg aattactagc attttatccg ttc 33 <210> 65 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Primer CUT371 <400> 65 taactaccat tactcagtgt acttgattgt tttgtccgat tttcttg 47 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Primer HJ788 <400> 66 gccgggtgac agagaaatat tg 22

Claims (105)

  1. 복수 (n)개의 외인성 핵산을 숙주 세포 게놈의 복수 (n)개의 표적 부위에 동시에 삽입하는 시험관 내 (in vitro) 방법으로서, 상기 n은 2 이상이며, 상기 숙주 세포가 효모 세포이고, 상기 방법은,
    (a) 숙주 세포를 하기 (i) 및 (ii)와 동시에 접촉시키는 단계:
    (i) 상기 복수의 외인성 핵산으로서,
    x는 1 내지 n의 정수이며, 각각의 정수 x에 대해, 상기 각각의 외인성 핵산 (ES)x는 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x를 포함하며, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 상기 숙주 세포 게놈의 상기 복수 (n)개의 표적 부위로부터 선택되는 표적 부위 (TS)x에서 (ES)x의 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있는 것인, 복수의 외인성 핵산; 및
    (ii) 각각의 상기 표적 부위 (TS)x에 대해, (TS)x에서 절단할 수 있는 뉴클레아제 (N)x 로서, 상기 절단으로 (TS)x에서 (ES)x의 상동성 재조합이 이루어지는 것인, 뉴클레아제 (N)x,
    및
    (b) 각각의 외인성 핵산 (ES)x가 이의 선택된 표적 서열 (TS)x에 삽입된 숙주 세포를 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 회수에는 선별 마커의 삽입이 필요 없고,
    상기 회수는, 스크리닝한, 접촉된 숙주 세포 또는 이의 클론 개체군 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2건 당 1건의 회수율로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 숙주 세포로서,
    (a) 복수 (n)개의 게놈 표적 부위로서, 상기 n이 2 이상인, 게놈 표적 부위;
    (b) 복수 (n)개의 외인성 핵산으로서, x가 1 내지 n의 정수이며, 각각의 정수 x에 대해, 상기 각각의 외인성 핵산 (ES)x는 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x를 포함하며, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 상기 복수 (n)개의 게놈 표적 부위로부터 선택되는 표적 부위 (TS)x에서 (ES)x의 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있는, 복수의 외인성 핵산; 및
    (c) 각각의 상기 표적 부위 (TS)x에 대해, (TS)x에서 절단할 수 있는 뉴클레아제 (N)x로서, 상기 절단으로 (TS)x에서 (ES)x의 상동성 재조합이 이루어지는, 뉴클레아제 (N)x를 포함하며,
    상기 외인성 핵산 (ES)x는 선별 마커를 코딩하는 핵산을 포함하지 않고, 상기 숙주 세포가 효모 세포인, 숙주 세포.
  3. 숙주 세포로서,
    (a) 복수 (n)개의 게놈 표적 부위로서, 상기 n이 2 이상인, 게놈 표적 부위; 및
    (b) 복수 (n)개의 외인성 핵산으로서, x가 1 내지 n의 정수이며, 각각의 정수 x에 대해, 상기 각각의 외인성 핵산 (ES)x는 제1 상동성 영역 (HR1)x 및 제2 상동성 영역 (HR2)x를 포함하며, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 상기 복수 (n)개의 게놈 표적 부위로부터 선택되는 표적 부위 (TS)x에서 (ES)x의 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있는, 복수의 외인성 핵산을 포함하고,
    상기 각각의 게놈 표적 부위 (TS)x는 이중-가닥 절단(double-strand break)을 포함하며,
    상기 외인성 핵산 (ES)x는 선별 마커를 코딩하는 핵산을 포함하지 않고, 상기 숙주 세포가 효모 세포인, 숙주 세포.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (HR1)x가 (TS)x의 5' 영역과 상동성이며,
    상기 (HR2)x는 (TS)x의 3' 영역과 상동성인, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (N)x가 (TS)x의 상기 5'과 상기 3' 영역 사이에 위치한 영역에서 절단할 수 있는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    단일 뉴클레아제가 각각의 (TS)x를 절단할 수 있는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    n이 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인, 방법.
  8. 제1항 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 회수는, 숙주 세포를 상기 표적 부위에서 절단할 수 있는 뉴클레아제와 접촉시키지 않는 경우와 비교해, 더 높은 회수율(frequency)로 이루어지는, 방법.
  9. 제1항 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (N)x가 (TS)x 내 내인성 게놈 서열을 절단할 수 있는, 방법.
  10. 제1항 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (N)x가 (TS)x 내 외인성 서열을 절단할 수 있는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 외인성 서열이 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease)에 대한 인지 서열인, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 호밍 엔도뉴클레아제가 F-cphI인, 방법.
  13. 제1항 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (ES)x가, (HR1)x의 3' 및 (HR2)x의 5'에 위치한 대상 핵산 (D)x를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 (D)x가 선별 마커, 프로모터, 에피토프 테그(epitope tag)를 코딩하는 핵산 서열, 대상 유전자, 리포터 유전자 및 종결 코돈을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제1항 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (ES)x가 선형인, 방법.
  16. 제1항 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (N)x가 (N)x를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서 제공되는, 방법.
  17. 제1항 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (N)x가 엔도뉴클레아제, 징크 핑거(zinc finger) 뉴클레아제, TAL-작동자(effector) DNA 결합 도메인-뉴클레아제 융합 단백질 (TALEN), 트랜스포자제(transposase) 및 부위-특이적인 재조합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 엔도뉴클레아제가 내인성 게놈 서열에 특이적으로 결합하도록 변형되며,
    상기 변형된 엔도뉴클레아제는 더이상 이의 야생형 엔도뉴클레아제 인지 서열에 결합하지 않는, 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 엔도뉴클레아제가 LAGLIDADG 호밍 엔도뉴클레아제, HNH 호밍 엔도뉴클레아제, His-Cys box 호밍 엔도뉴클레아제, GIY-YIG 호밍 엔도뉴클레아제 및 시아노박테리아 호밍 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 호밍 엔도뉴클레아제인, 방법.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 엔도뉴클레아제가 H-DreI, I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, Pi-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-CphI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NclIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp68031, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, i-UarAP, i-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MgaI, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI 또는 PI-TliII로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔도뉴클레아제로부터 유래되는, 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 효모 세포가 사카로마이세스 세래비지애(Saccharomyces cerevisiae) 세포인, 방법.
  22. 복수 (n)개의 외인성 핵산을 숙주 세포 게놈의 복수 (n)개의 표적 부위에 동시에 삽입하는 시험관 내(in vitro) 방법으로서, 상기 n은 2 이상이며, 상기 숙주 세포가 효모 세포이고, 상기 방법은,
    (a) 숙주 세포를 하기 (i) 및 (ii)와 동시에 접촉시키는 단계:
    (i) 복수의 라이브러리로서, x가 1 내지 n의 정수이며, 각각의 정수 x에 대해, 상기 각각의 라이브러리 (L)x는 복수의 외인성 핵산을 포함하며, 상기 각각의 외인성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 제1 상동성 영역 (HR1)x, (D)x 군으로부터 선택되는 대상 핵산 및 제2 상동성 영역 (HR2)x를 포함하며, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 상기 숙주 세포 게놈의 표적 부위 (TS)x에서 선택된 외인성 핵산의 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있는 것인, 복수의 라이브러리; 및
    (ii) 각각의 상기 표적 부위 (TS)x에 대해, (TS)x에서 절단할 수 있는 뉴클레아제 (N)x로서, 상기 절단으로 (TS)x에서 (L)x 유래의 외인성 핵산의 상동성 재조합이 이루어지는 것인, 뉴클레아제 (N)x,
    및
    (b) 각각의 라이브러리 (L)x 유래의 외인성 핵산이 각각의 선택된 표적 서열 (TS)x에 삽입된 숙주 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 숙주 세포로서,
    (a) 복수 (n)개의 게놈 표적 부위로서, 상기 n이 2 이상인, 게놈 표적 부위;
    (b) 복수의 라이브러리로서, x가 1 내지 n의 정수이며, 각각의 정수 x에 대해, 상기 각각의 라이브러리 (L)x는 복수의 외인성 핵산을 포함하며, 상기 각각의 외인성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 제1 상동성 영역 (HR1)x, (D)x 군으로부터 선택되는 대상 핵산, 및 제2 상동성 영역 (HR2)x를 포함하며, 상기 (HR1)x 및 (HR2)x는 상기 숙주 세포 게놈의 표적 부위 (TS)x에서 선택된 외인성 핵산의 숙주 세포 매개의 상동성 재조합을 개시할 수 있는 것인, 복수의 라이브러리; 및
    (c) 각각의 상기 표적 부위 (TS)x에 대해, (TS)x에서 절단할 수 있는 뉴클레아제 (N)x로서, 상기 절단으로 (TS)x에서 (L)x 유래의 외인성 핵산의 상동성 재조합이 이루어지는, 뉴클레아제 (N)x를 포함하고, 상기 숙주 세포가 효모 세포인, 숙주 세포.
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