KR20140109183A - 다중 유전자 삽입 기술을 이용한 유전자 재조합 균주 제작 방법 - Google Patents

다중 유전자 삽입 기술을 이용한 유전자 재조합 균주 제작 방법 Download PDF

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Abstract

일 구체예는 형질전환할 미생물을 OD600이 2.0 내지 10.0이 될때까지 배양한 후 여러 종류의 유전자를 동시에 삽입하는 다중 유전자 삽입 기술에 관한 것이다. 이러한 방법을 이용할 경우 여러 종류의 유전자를 한번의 형질전환으로 미생물에 도입할 수 있다. 이러한 방법을 이용할 경우 형질전환 미생물을 보다 효과적으로 제작할 수 있어 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

다중 유전자 삽입 기술을 이용한 유전자 재조합 균주 제작 방법{Method for construction of recombinant organisms using multiple co-integration}
일 구체예는 여러 종류의 유전자를 한번에 효율적으로 형질전환 시키는 방법에 관한 것이다.
최근 바이오소재에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 특히 미생물을 이용하여 산업적으로 필요한 유용한 물질을 생산하고자 하는 연구가 되고 있다. 그러나, 미생물은 원하는 대사 산물만을 생성하지 않으며, 특정 대사 산물을 과량 생산할 경우 오히려 성장이 억제되거나 더 이상 원하는 대사 산물을 생산하지 않거나, 원하지 않은 부산물을 생산할 수 있다.
이러한 한계를 극복하기 위하여 원하는 대사 산물만을 특이적으로 생산할 수 있는 미생물을 개발하기 위해 많은 연구가 진행되었다. 그러나, 형질전환 미생물의 많은 대사 경로를 모두 변형하여 형질전환 미생물을 제작하는 것은 많은 시간과 노력이 들어가게 된다.
특히, 변형하여야 할 유전자가 많을수록 형질전환시 많은 단계가 필요하고, 그러한 각각의 단계는 많은 시간을 필요로 하며, 유전자 도입 효율도 낮아지게 된다. 따라서, 유전자를 도입하는 방법의 개선이 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
한편, 미생물의 증식은 일정한 기간을 두고 주기적으로 일어나며, 기하급수적으로 증가하게 된다. 하지만 일정 기간의 기하급수적 증식기를 지난 이후에는 성장 속도가 둔화되는 양상을 보이게 되며 개체군의 수를 시간의 함수로 나타내면, 전형적인 S자형 곡선을 얻을 수 있게 된다. 개체군의 수를 시간의 함수로 나타낸 그래프를 미생물의 증식 곡선(growth curve)이라 한다. 이 증식 곡선은 각각 4가지 단계로 나뉜다.
첫번째 단계는 유도기(lag phase)이다. 유도기(잠복기, lag phase)에서는 새 배지에 접종배양시 균이 배지에 적응하는 시기이며, 세포의 내부에서 효소의 활성화 및 세포성분인 RNA 등이 증가하는 화학 변화가 일어나는 시기이기도 하다. 세포내의 RNA 량이 현저하게 증가하며, 세포의 크기도 커지며 호흡활성도가 높은 시기이다.
두번째 단계는 대수기(log phase)이다. 유도기를 지난 세포가 왕성하게 증식하는 시기이다. 세포가 대수적으로 증식(생리 기능이 증가하면서 효소의 분비가 시작되고, 물리, 화학적 처리에 민감한 시기이다)하는 시기이다. 세대 시간, 세포의 크기가 일정한 시기이며, 증식속도는 배지의 영양상태, pH, 온도, 산소분압 등의 환경입자에 의해서 결정되게 된다.
세번째 단계는 정상기(정지기, stationary phase)라 한다. 대수기 이후에 균수가 일정해지며, 배양기간 중에 최대의 세포 수가 유지되게 되며, 효소를 분비하게 된다. 또 이 단계에서는 일부의 세포가 사멸하고 또 다른 일부의 세포는 증식하기 때문에 사멸하는 균주수와 증식하는 균주수가 거의 같은 상태를 유지하게 되는 단계이다. 또한 균의 과밀화 때문에 영양물질의 고갈, 균의 대사 생산물의 축적, 배지 내의 pH 변화, 산소공급의 부족 등 부적당한 환경이 되어 균주의 수가 증가하지 않게 된다.
마지막 단계는 사멸기(death phase)이다. 배양의 최종기로 균주의 수가 감소하는 시기이며, 사멸의 주된 원인으로는 핵산 분해효소 또는 단백질 분해효소에 의한 분해 또는 효소 단백질의 변성, 효소들에 의한 사멸된 균의 자기 소화 등으로 세포가 용해되어 사멸하게 되는 단계이다.
미생물을 형질전환 시킬 때에는 세포의 활동이 가장 왕성한 대수기 초기, OD600값이 0.5~1.0 사이일 때의 미생물을 이용하여 형질전환을 시킨다. 이때 형질전환의 대상이 되는 미생물 및 형질전환 조건을 조절할 경우 형질전환 효율이 증가함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
일 구체예의 목적은 여러 유전자를 동시에 균주 내로 도입하는 다중 유전자 도입 기술을 사용하여 보다 효율적인 유전자 재조합 균주 제작 방법을 제공하는데 있다.
일 양상은 형질전환할 미생물을 무작위 삽입(random integration)이 용이하게 일어나는 단계까지 배양하는 단계; 1종류 이상의 유전자가 포함된 미생물에 도입시킬 시료와 상기 배양된 미생물을 혼합하여, 미생물을 형질전환 시키는 단계를 포함하는 다중으로 유전자를 도입하는 방법을 제공한다.
상기 다중으로 유전자를 도입하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 형질전환할 미생물을 무작위 삽입(random integration)이 용이하게 일어나는 단계까지 배양하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 무작위 삽입이 용이하게 일어나는 단계는 배양하는 균주마다 약간씩 상이할 수 있다. 일 구체예로 세포밀도가 대수기에 비해 높은 상태인 것일 수 있다. 이때, 세포밀도가 대수기에 비해 높은 상태는 OD600이 2.0 내지 10.0 일 수 있다. 또한, 상기 OD600는 3.0 내지 8.0일 수 있다. 또한, 상기 OD600이 3.5 내지 6.0이 될 수 있으며, 4.0 내지 5.0일 수 있다. 그러나, 이러한 OD600 값은 대수기 후반 또는 정지기에서 선택되는 값이라면 플라스크에서의 OD600의 값은 3.0 내지 8.0 사이에서 적절히 선택될 수 있다. 또한, 이러한 OD600의 값은 미생물의 종류에 따라 적절히 선택될 수 있다.
상기 형질전환할 미생물은 NHEJ(non-homologous end joining) 시스템이 우세한 균주일 수 있다. 이때, NHEJ 시스템이 우세한 균주는 비전통 효모(non-conventional yeast), 균류(fungi), 동물 세포(mammalian cell) 등일 수 있다. 비전통 효모는 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 한세눌라(Hansenula)일 수 있으며, 클루베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 일 수 있다. K. marxianus는 내산성 효모로서, 낮은 산도에서 유기산을 고효율로 생산할 수 있어 산업화를 위해 형질전환용 미생물로 이용될 수 있다.
이후, 1 종류 이상의 유전자가 포함된 미생물에 도입시킬 시료를 제공하는 단계를 제공할 수 있다.
상기 유전자는 한 종류 이상의 유전자일 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자의 종류는 서로 다른 2종 내지 10종의 유전자일 수 있으며, 3종 내지 6종의 서로 다른 유전자 일 수 있으나, 유전자의 종류는 필요에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 이때 유전자는 DNA 절편일 수 있다. 또한, 1 종의 유전자 또는 유전자 또는 DNA 절편은 여러 카피로 미생물에 삽입될 수 있다.
또한, 상기 유전자는 미생물의 대사 경로에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자일 수 있으며, 상기 유전자는 동종 또는 이종 단백질 발현 효소를 암호화하는 유전자일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 유기산 합성과 관련된 것일 수 있다. 또한, 당화에 관련된 것일 수 있다.
또한, 상기 시료내에 포함될 유전자는 벡터에 삽입 후에 벡터내의 자기복제서열(autonomously replication sequence, ARS)을 제한효소에 의해 절단시켜 얻어지는 것인 선형 유전자일 수 있다. 상기 제한효소는 벡터내에 존재하는 ARS 서열을 제거하고 선형 유전자로서 사용 가능하게 하는 효소로서, 그 종류는 삽입하는 유전자에 따라 달라질 수 있다. 이러한 제한효소는 PfoI, HindIII, XhoI, BglII, KpnI, PacI 또는 AatII 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터 등이 사용될 수 있으며, 플라스미드 벡터가 바람직하다. 또한, 상기 유전자는 작동가능한 프로모터와 연결될 수 있다.
이후, 준비된 시료와 상기 배양된 미생물을 혼합하여, 미생물을 형질전환 시키는 단계를 제공한다.
이때, 상기 형질전환 시키는 단계는 다중 유전자 삽입(Multiple genes co-integration) 기술을 활용하는 것일 수 있다.
종래에는 다중 형질전환(Multiple co-transformation) 방법을 사용하여 여러 유전자를 균주의 게놈(genome)내로 도입하기 위해서는 서로 다른 선택 마커(selectable marker)를 가지고 있는 플라스미드를 사용해야 하며 또한 사용 균주 또한 이러한 선택 마커를 사용할 수 있게 균주 조작이 되어 있는 균주여야 한다. 이러한 방법은 사용할 수 있는 선택 마커 수에 제한 될 수 밖에 없다.
그러나, 일 구체예에 개시된 방법을 이용한 다중 유전자 삽입(Multiple genes co-integration)은 선택 마커의 수에 상관 없으며, 유전자 수에 상관없이 균주의 게놈(genome) 내로 co-integration 하는데 동일한 시간이 걸린다. 그 시간은 대략 6일 정도로 다중 형질전환(Multiple co-transformation) 방법에 비하여 유전자 삽입 시간이 현저히 단축되었다. 또한, 마커 제거(marker pop-out)가 가능한 반복 서열(repeat sequence)이 포함된 카세트(cassette)를 활용하여 반복적 삽입이 가능하다.
상기 다중 유전자 삽입 기술은 다수의 선택 마커를 이용할 수 있으나, 1 내지 3개의 선택 마커, 또는 1개의 선택 마커를 이용할 수 있다. 이때, 마커가 제거될 수 있는 반복 서열이 포함될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 방법으로 제작된 서로 다른 여러 종류의 유전자를 포함하는 것인 형질전환 미생물을 제공하는 것이다.
상기 형질전환할 미생물은 NHEJ(non-homologous end joining) 시스템이 우세한 균주일 수 있다. 이때, NHEJ 시스템이 우세한 균주는 비전통 효모(non-conventional yeast), 균류(fungi), 동물 세포(mammalian cell) 등일 수 있다. 비전통 효모는 Kluyveromyces, Hansenula일 수 있으며, Kluyveromyces marxianus인 것이 바람직하다. K. marxianus는 내산성 효모로서, 낮은 산도에서 유기산을 고효율로 생산할 수 있어 산업화를 위해 형질전환용 미생물로 이용될 수 있다.
또한, 상기 유전자는 한 종류 이상의 유전자일 수 있다. 또한 상기 유전자는 서로 다른 2종 내지 10종의 유전자일 수 있으며, 3종 내지 6종의 서로 다른 유전자 일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 미생물의 대사 경로에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자일 수 있으며, 상기 유전자는 동종 또는 이종 단백질 발현 효소를 암호화하는 유전자일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 유기산 합성과 관련된 것일 수 있다. 또한, 당화에 관련된 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 형질전환 미생물을 이용한 대사산물의 제조방법에 관한 것이다. 이는 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 대사산물을 회수하는 단계를 포함 할 수 있다.
상기 대사산물 제조 방법은 다음과 같다.
먼저, 다중 유전자 삽입 기술로 제조된 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 제공한다.
용어, "대사산물"은 미생물의 대사반응에 의해 생성되는 모든 물질들을 의미한다. 상기 대사산물은 미생물의 대사반응의 중간 생성물일 수도 있고, 미생물의 대사반응의 최종 생성물일 수도 있다. 이러한 대사 산물의 예로는 숙신산, 젖산, 1,4-BDO (3-hydroxypropionate) 등이 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 미생물이 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류 등에서 배양될 수 있다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 갈락토오즈 등이 이용될 수 있다. 또한, 미생물이 이용할 수 있는 질소원은 유기질소화합물, 무기질소화합물 등 일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 암모늄염 등 일 수 있다. 미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1 ~ 10 %의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건일 수 있다.
이후, 상기 배양액으로부터 대사산물을 회수하는 단계를 제공한다.
대사산물은 숙신산, 3HP(3-hydropropionate), 젖산일 수 있다. 대사산물은 여과 등을 통하여 회수될 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일 구체예의 방법을 이용할 시, 유전자 재조합 효모 균주의 제작을 위해 기존의 방법 보다 더 효율적으로 유전자를 도입할 수 있다. 이러한 기술을 이용할 경우 기존에 순차적인 유전자 도입 기술(27일 소요)과 대비하여, 소요 시간을 4배 단축하였다(일 구체예에 따른 기술은 6일 소요). 따라서, 이러한 효율적인 기술을 이용하여 보다 효과적으로 여러 종류의 유전자를 미생물에 도입시킬 수있다.
도 1은 유전자 재조합 균주 제작 시스템을 나타낸다. 도 1a는 순차적유전자 결합(sequential gene integration)을 이용한 형질전환 방법을 나타낸다. 도 1b는 다중 유전자 발현 벡터(Multiple gene expression vector)를 이용한 형질전환 방법을 나타낸다. 도 1c는 다중 동시 형질전환(multiple co-transformation)에 의한 형질전환 방법을 나타낸 것이다.
도 2는 NHEJ 시스템을 이용한 유전자 도입기술의 개요를 나타낸 것이다.
도 3은 K. 마르시아누스(K. marxianus)　유전자 발현용 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 4는 종래의 기술인 순차적인 형질전환 방법 및 일 구체예에 따른 다중 유전자 삽입 기술(multiple genes co-integration)을 비교한 것을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 하기 실시예에서는 K. 마르시아누스를 모델 시스템으로 이용한 방법에 대하여만 예시되어 있으나, K. 마르시아누스 이외의 다른 미생물의 경우에도 적용된다는 것은 본 명세서에 개시된 내용으로부터 당업자에게 자명하다.
실시예 1. 유전자 발현 벡터 제작
우라실(uracil) 영양 요구성 K. 마르시아누스　균주에 도입이 가능한 유전자 발현용 벡터(vector)를 만들기 위해 　K. 마르시아누스의 복제개시점(replication origin), ARS(autonomously replicating sequence) 및 동원체(centromere)를 PCR로 증폭한 후 ATCC 로부터 구입한 pRS306 벡터에 도입하여 K. marxianus　-　E. coli 셔틀 벡터(shuttle vector)를 제작하였다. 제작된 셔틀 벡터에 GPD 프로모터 및 CYC 터미네이터 유전자를 삽입한 후(pJSKM316-GPD, 서열번호 1), 사카로마이세스 세레비지애(Sacharomyces cerevisiae) ALD6(서열번호 2), S. 세레비지애(S. cerevisiae) ACS2(서열번호 3), 그리고 K. 마르시아누스 ACC(서열번호 4) 유전자를 GPD 프로모터 및 CYC 터미네이터에 의해 K. marxianus에서 발현 가능하도록 하였다.
실시예 2. K. marxianus 균주에 유전자 도입
2-1. K. marxianus 균주를 이용한 컴피턴트 세포(competent cell)의 제작
우라실(Ura) 영양요구성 KM 균주를 Glycerol stock 에서 YPD plate에 도말(streaking) 한 후 37℃에서 2일 동안 배양하였다. 하나의 콜로니를 100 ml YPD 배지에 접종한 후 37℃에서 250 rpm으로 하룻밤동안 배양하였다. OD600가 3.0 ~ 5.0 될 때까지 배양한 후 5,000 rpm에서 5분 원심분리하여 세포를 분리하였다. 60 ml 멸균수로 세포를 세척 후 10 ml 리튬 아세테이트 버퍼(lithium acetate buffer) (100mM Lithium acetate, 10mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM DTT, 0.6M Sorbitol)를 첨가한 후 실온에서 30 분 두었다. 그 후, 10 ml 1M 솔비톨로 3번 세척 후 1 ml 1M 솔비톨로 재현탁 후 100 ul 씩 분주 후 -80℃에서 보관하고 이용하였다.
2-2. 형질전환 시킬 DNA 시료 준비
pJSKM316-GPD_inBGL1(intracellular beta-glucosidase), pJSKM316-GPD_exBGL1(extracellular beta-glucosidase), pJSKM316-GPD_EG1(endo-glucanase), pJSKM316-GPD_CBH1(cellobiohydrolase), pJSKM316-GPD_CBH2(cellobiohydrolase II) 플라스미드를 PacI 제한 효소로 처리 후, 아가로즈 겔에 전기영동하였다. 800 bp의 ARS 서열(autonomously replicating sequence)을 제외한 나머지 선형 DNA 단편을 겔에서 각각 추출하였다.
2-3. K. 마르시아누스 균주에 여러 종류의 유전자 다중형질 전환(multiple co-integration)
상기에서 제작한 K. 마르시아누스의 컴피턴트 세포에 선형 DNA 단편을 각 300 ng 씩 (total DNA volume <10 ul) 넣어 준 후 얼음에 20분 동안 반응 후 일렉트로포레이션(electroporation) (MicroPulser Electorporator, Bio-Rad)하였다. 그 후, 1 ml YPDS (YPD +1M sorbitol)로 재현탁한 후 37℃에서 2시간 동안 250 rpm으로 배양한 후 합성 배지(synthetic media) (6.7g/L Yeast nitrogen base w/o amino acid, 1.92 g/L Synthetic drop-out mix w/o uracil, 20 g/L glucose, 20 g/L agar)에 스프레딩(spreading) 후 37℃에서 36 시간 동안 배양하였다.
2-4. K. 마르시아누스 균주에 도입된 유전자 확인
　유전자 도입 후 유리딘(Uridine)이 없는 최소 배지(minimal media)에 스프레딩한 후 37℃에서 2일 동안 배양 한다. 단일 콜로니로부터 게놈 DNA를 추출한 후 PCR을 통해서 유전자의 도입 여부를 확인 한 후 ALD6, ACS1 그리고 ACC 유전자가 모두 도입된 K. 마르시아누스 균주를 확보하였다. 각각의 유전자를 증폭하기 위하여 하기 표 1의 프라이머를 이용하였다. 또한, PCR은 95℃에서 2분간 처리후, 95℃에서 30초동안 열변성, 55℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 3분간의 신장단계를 30회 반복하고, 72℃에서 54분간 반응시켰다.
증폭대상 서열 서열번호
ALD6
정방향 프라이머 5'-cattatcaatactcgccatttcaaag-3' 서열번호 5
역방향 프라이머 5'-ttacaacttaattctgacagcttttac-3' 서열번호 6
ACS2
 정방향 프라이머 5'-cattatcaatactcgccatttcaaag-3' 서열번호 7
역방향 프라이머 5'-ttatttcttttgttggttaagaattggg-3' 서열번호 8
ACC
 정방향 프라이머 5'-cattatcaatactcgccatttcaaag-3' 서열번호 9
역방향 프라이머 5'-tcattccaaagccttttgaagcttttctttg-3' 서열번호 10
실시예 3. 균주의 OD 값에 따른 유전자 도입 효율
상기 <실시예 2>에서와 같이 dhaB1(서열번호 11), dhaB2(서열번호 12), dhaB3(서열번호 13), gdrA(서열번호 14), gdrB(서열번호 15), aldH(서열번호 16) 및 KGSadh(서열번호 17)을 벡터에 삽입하고 제한 효소로 절단하여 형질전환을 위한 시료를 제작하였다. 그 후 상기 유전자를 K. marxianus competent cell에 도입하였다. 또한, 상기 유전자의 도입을 확인하기 위하여 <표 2>의 프라이머를 이용하였다.
증폭대상 서열 서열번호
dhaB1
정방향 프라이머 5'-ATT GTG GAG TTG GAT GGT AAG CGT-3' 서열번호 18
역방향 프라이머 5'-CCA AGT CAA GCA TGG AGG CAA TCA A-3' 서열번호 19
dhaB2
 정방향 프라이머 5'-GGA GCT AAT CGC TGG TGT TGA AGA-3' 서열번호 20
역방향 프라이머 5'-CCA AGT CGA TAT GTA AGG TGA CAG GT-3' 서열번호 21
dhaB3
 정방향 프라이머 5'-CTA TGA GAG TTC AGG ATT ACC CAC T-3' 서열번호 22
역방향 프라이머 5'-CCC TTT CTT AGC TTA TGT CTT TGT TGG T-3' 서열번호 23
gdrA
정방향 프라이머 5'-GAG GGT TGG ATT GTT TTG ATC GAT GA-3' 서열번호 24
역방향 프라이머 5'-CCT CTA ATA TCT CTG ACA GGA GCA-3' 서열번호 25
gdrB
 정방향 프라이머 5'-TCT TTC CCC TCC AGG TGT CAG GT-3' 서열번호 26
역방향 프라이머 5'-CGG ACA ATG GCA AAA CCT TCA CCA-3' 서열번호 27
aldH
정방향 프라이머 5'-CTG ACT TGA TGG AAG CCC ACG CT-3' 서열번호 28
역방향 프라이머 5'-GGA ACC TGT GAA GGC AAT AGC GTC A-3' 서열번호 29
KGSadh
 정방향 프라이머 5'-CGA TGC CAT TGC TCA ACT TAT GAC TCA-3' 서열번호 30
역방향 프라이머 5'-CCA AAC CAA TCA CGC CAG CTG GA-3' 서열번호 31
Exp. 1 Exp. 2
Host KM36907 KM36907
Expression vector pJSKM-316 pJSKM-316
Promoter GPD promoter GPD promoter
Terminator CYC1 terminator CYC1 terminator
유전자 수 6종
(dhaB1, B2, B3, gdrA, gdrB, aldH)		 6종
(dhaB1, B2, B3, gdrA, gdrB, KGSadh)
유전자 도입 효율 28.8% 100%
균주 제작 시간 6일 5일
* Exp.1은 OD600이 1 일 때의 K. marxianus의 도입 효율 및 균주 제작시간을 나타낸 것이다.
* Exp.2는 OD600이 3.5 일 때의 K. marxianus의 도입 효율 및 균주 제작시간을 나타낸 것이다.
* dhaB1(서열번호 11), dhaB2(서열번호 12), dhaB3(서열번호 13), gdrA(서열번호 14), gdrB(서열번호 15), aldH(서열번호 16), KGSadh(서열번호 17).
<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Method for construction of recombinant organisms using multiple co-integration <130> PN096618 <160> 31 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6544 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pJSKM316-GPD sequence <400> 1 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accacgcttt tcaattcaat tcatcatttt ttttttattc ttttttttga tttcggtttc 240 tttgaaattt ttttgattcg gtaatctccg aacagaagga agaacgaagg aaggagcaca 300 gacttagatt ggtatatata cgcatatgta gtgttgaaga aacatgaaat tgcccagtat 360 tcttaaccca actgcacaga acaaaaacct gcaggaaacg aagataaatc atgtcgaaag 420 ctacatataa ggaacgtgct gctactcatc ctagtcctgt tgctgccaag ctatttaata 480 tcatgcacga aaagcaaaca aacttgtgtg cttcattgga tgttcgtacc accaaggaat 540 tactggagtt agttgaagca ttaggtccca aaatttgttt actaaaaaca catgtggata 600 tcttgactga tttttccatg gagggcacag ttaagccgct aaaggcatta tccgccaagt 660 acaatttttt actcttcgaa gacagaaaat ttgctgacat tggtaataca gtcaaattgc 720 agtactctgc gggtgtatac agaatagcag aatgggcaga cattacgaat gcacacggtg 780 tggtgggccc aggtattgtt agcggtttga agcaggcggc agaagaagta acaaaggaac 840 ctagaggcct tttgatgtta gcagaattgt catgcaaggg ctccctatct actggagaat 900 atactaaggg tactgttgac attgcgaaga gcgacaaaga ttttgttatc ggctttattg 960 ctcaaagaga catgggtgga agagatgaag gttacgattg gttgattatg acacccggtg 1020 tgggtttaga tgacaaggga gacgcattgg gtcaacagta tagaaccgtg gatgatgtgg 1080 tctctacagg atctgacatt attattgttg gaagaggact atttgcaaag ggaagggatg 1140 ctaaggtaga gggtgaacgt tacagaaaag caggctggga agcatatttg agaagatgcg 1200 gccagcaaaa ctaaaaaact gtattataag taaatgcatg tatactaaac tcacaaatta 1260 gagcttcaat ttaattatat cagttattac cctgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 1320 aaggagaaaa taccgcatca ggaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta 1380 aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat 1440 aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca 1500 ctattaaaga 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ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 3240 cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 3300 gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 3360 ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 3420 ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctcggcccc cctgacgagc 3480 atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 3540 aggcgttccc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 3600 gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta 3660 ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 3720 ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 3780 acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 3840 gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 3900 ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 3960 ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 4020 gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 4080 ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 4140 agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 4200 ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 4260 gttcatccat agttgcctga ctgcccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 4320 catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 4380 cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 4440 cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 4500 gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 4560 tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 4620 gaaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 4680 tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 4740 gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 4800 gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 4860 taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 4920 tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 4980 ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 5040 taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 5100 tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 5160 aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtcgag ctcctttcat 5220 ttctgataaa agtaagatta ctccatttat cttttcacca acatattcat agttgaaagt 5280 tatccttcta agtacgtata caatattaat taaacgtaaa aacaaaactg actgtaaaaa 5340 tgtgtaaaaa aaaaatatca aattcatagc agtttcaagg aatgaaaact attatgatct 5400 ggtcacgtgt atataaatta ttaattttaa acccatataa tttattattt ttttattcta 5460 aagtttaaag taattttagt agtattttat attttgaata aatatacttt aaatttttat 5520 ttttatattt tattactttt aaaaataatg tttttattta aaacaaaatt ataagttaaa 5580 aagttgttcc gaaagtaaaa tatattttat agtttttaca aaaataaatt atttttaacg 5640 tatttttttt aattatattt ttgtatgtga ttatatccac aggtattatg ctgaatttag 5700 ctgtttcagt ttaccagtgt gatagtatga ttttttttgc ctctcaaaag ctattttttt 5760 agaagcttcg tcttagaaat aggtggtgta taaattgcgg ttgactttta actatatatc 5820 attttcgatt tatttattac atagagaggt gcttttaatt ttttaatttt tattttcaat 5880 aattttaaaa gtgggtactt ttaaattgga acaaagtgaa aaatatctgt tatacgtgca 5940 actgaatttt actgacctta aaggactatc tcaatcctgg ttcagaaatc cttgaaatga 6000 ttgatatgtt ggtggatttt ctctgatttt caaacaagag gtattttatt tcatatttat 6060 tatatttttt acatttattt tatatttttt tattgtttgg aagggaaagc gacaatcaaa 6120 ttcaaaatat attaattaaa ctgtaatact taataagaga caaataacag ccaagaatca 6180 aatactgggt ttttaatcaa aagatctctc tacatgcacc caaattcatt atttaaattt 6240 actatactac agacagaata tacgaaccca gattaagtag tcagacgctt ttccgcttta 6300 ttgagtatat agccttacat attttctgcc cataatttct ggatttaaaa taaacaaaaa 6360 tggttacttt gtagttatga aaaaaggctt ttccaaaatg cgaaatacgt gttatttaag 6420 gttaatcaac aaaacgcata tccatatggg tagttggaca aaacttcaat cgatgacgtc 6480 taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 6540 cgtc 6544 <210> 2 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALD6 seuquence <400> 2 atgactaagc tacactttga cactgctgaa ccagtcaaga tcacacttcc aaatggtttg 60 acatacgagc aaccaaccgg tctattcatt aacaacaagt ttatgaaagc tcaagacggt 120 aagacctatc ccgtcgaaga tccttccact gaaaacaccg tttgtgaggt ctcttctgcc 180 accactgaag atgttgaata tgctatcgaa tgtgccgacc gtgctttcca cgacactgaa 240 tgggctaccc aagacccaag agaaagaggc cgtctactaa gtaagttggc tgacgaattg 300 gaaagccaaa ttgacttggt ttcttccatt gaagctttgg acaatggtaa aactttggcc 360 ttagcccgtg gggatgttac cattgcaatc aactgtctaa gagatgctgc tgcctatgcc 420 gacaaagtca acggtagaac aatcaacacc ggtgacggct acatgaactt caccacctta 480 gagccaatcg gtgtctgtgg tcaaattatt ccatggaact ttccaataat gatgttggct 540 tggaagatcg ccccagcatt ggccatgggt aacgtctgta tcttgaaacc cgctgctgtc 600 acacctttaa atgccctata ctttgcttct ttatgtaaga aggttggtat tccagctggt 660 gtcgtcaaca tcgttccagg tcctggtaga actgttggtg ctgctttgac caacgaccca 720 agaatcagaa agctggcttt taccggttct acagaagtcg gtaagagtgt tgctgtcgac 780 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acgaagtttt ggcccgccat 60 gcgccagaac atttctacaa gtcgcaacca ggcaagtcgt actgtgcgga tgaagaacag 120 taccgccaaa tgtacagcca atcgatcaac gacccaagcg gcttttttgg acccttggct 180 aaggagtact tgcactggga ccgcccattc acgcaagtgc aaagcggttc gttggaacac 240 ggcgatgttg cgtggttttt gaacggtgag ttgaacgcct cgtataactg tgttgataga 300 cacgcgtttg ccaacccaga caagccagct ttgatctacg aagccgacga cgaatctgaa 360 aacaaggtca tcacctttgg cgaattgttg agacaggtct ctgaagtcgc tggtgtcttg 420 aagtcatggg gtgtcaagaa gggtgacacc gttgctgtgt atttgccaat gattccagcc 480 gctgttgttg ccatgttggc tgttgccaga ttgggtgcca tccactctgt catctttgct 540 ggtttctcag ccggttcctt gaaggaaaga gtcgtcgatg ctggctgtaa agttgtcatc 600 acctgcgatg agggtaagag aggtggtaaa acggtccaca ccaagaagat tgttgacgaa 660 ggtttggctg gtgtcgactc cgttgccaag atcttggtct tccaaagaac tggtaccgtt 720 ggcatcccaa tgaagccagg tagagatttc tggtggcacg aggaatgtgt caagcaaaag 780 ggttacctac cacctgtccc agttaactct gaggacccat tgttcttgct atacacttcc 840 ggttccaccg gttctccaaa gggtgttgtt cactccaccg caggttactt gttgggttcc 900 gcattgacca ccagatatgt cttcgatatc cacccagaag atgtcttgtt taccgctggt 960 gacgtcggtt ggattaccgg tcacacttat gctttgtatg gtccattgac tcttggtacc 1020 gccaccatca tctttgaatc cacccctgcc tacccagatt acggtagata ctggagaatc 1080 atcgaacgtc acagagctac ccacttctac gttgccccaa ccgcgctaag attgatcaag 1140 cgtgttggtg aacaggaaat cgccaagtac gacacctctt ccttgagagt gttgggttct 1200 gttggtgagc caatctcccc agatctatgg gaatggtatc acgaaaaggt cggtaacaag 1260 aattgtgtca tctgtgacac catgtggcaa accgaatctg gttcccactt gatcgctcca 1320 ttggcaggtg ctgtgccaac caagccaggt tccgctaccg ttccattctt tggtatcaac 1380 gcatgcatca tcgacccagt ctccggtgaa gagttgacag gtaacgatgt cgaaggtgtc 1440 ttggccgtca agtccccatg gccttcaatg gccagatctg tctggaacaa tcactcccgt 1500 tacttcgaaa cctacttgaa gccataccct ggttactact tcaccggtga cggtgctggt 1560 agagaccacg acggttacta ctggatcaga ggtagagttg acgatgtcgt gaacgtctcc 1620 ggtcacagac tatctaccgc tgaaatcgaa gccgccttgg tcgaacacga aggtgtctca 1680 gaatctgccg tcgttggtat caccgacgaa cttacaggtc aagctgttat cgcctttgtc 1740 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Claims (15)

  1. 형질전환할 미생물을 무작위 삽입(random integration)이 용이하게 일어나는 단계까지 배양하는 단계;
    1종류 이상의 유전자가 포함된 미생물에 도입시킬 시료와 상기 배양된 미생물을 혼합하여, 미생물을 형질전환 시키는 단계를 포함하는 다중으로 유전자를 도입하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 무작위 삽입이 용이하게 일어나는 단계는 세포밀도가 대수기에 비해 높은 상태인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 무작위 삽입이 용이하게 일어나는 단계는 OD600이 2.0 내지 810.0인 것인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 OD600은 3.5 내지 6.0인 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 형질전환할 미생물은 NHEJ(non-homologous end joining) 시스템이 우세한 균주인 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 형질전환 미생물은 비전통 효모(non-conventional yeast), 균류, 동물 세포인 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 형질전환 미생물은 K. marxianus인 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 형질전환 시키는 단계는 다중 유전자 삽입(Multiple genes co-integration) 기술을 이용하는 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 시료내에 포함될 유전자는 벡터에 삽입 후에 벡터내의 자기복제서열을 제한효소에 의해 절단시켜 얻어지는 것인 방법.
  10. 청구항 9항에 있어서, 상기 유전자는 미생물의 대사 경로에 관여하는 효소를 암호화하는 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 대사 경로는 유기산 합성과 관련된 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자는 2종 내지 10종의 서로 유전자인 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 유전자는 3종 내지 6종의 서로 다른 유전자인 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 1종의 유전자 절편을 여러 카피로 삽입하는 것인 방법.
  15. 청구항 1 내지 14의 방법으로 제작된 형질전환 미생물.
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