CN107916275B - 一种利用具有还原tca途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，其中所述解脂耶氏酵母工程菌株外源表达了还原TCA途径中的关键酶：延胡索酸还原酶(FRD)和延胡索酸酶(FUM)，相对于传统氧化TCA途径而言理论产率大幅提高。并且分离纯化琥珀酸的步骤省却了电渗析或者酸化超滤过程，没有副产物硫酸铵的产生，具有可观的应用价值和前景。

Description

一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥 珀酸的方法

技术领域

本发明涉及一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。

背景技术

琥珀酸又称丁二酸，广泛地应用于清洁剂、表面活性剂、食品添加剂、抗菌剂以及制药行业，被美国能源部选为十二种最具商业价值的平台化合物之首(Werpy andPedersen,US Department of Energy.2005)。以可再生资源作为原料利用微生物发酵法生产的琥珀酸摆脱了对石油化工原料的依赖，是一种绿色平台产品。

琥珀酸的微生物合成主要依赖各种细菌，例如产琥珀酸放线杆菌和大肠杆菌等。这些微生物可以高效生产琥珀酸，就目前琥珀酸的产量、产率与生产力而言，细菌似乎更具有优势，但是细菌对酸和渗透压力耐受性低，发酵过程中需要不断调节pH，增加下游工业处理成本。而酵母可以进行低pH的生物发酵，除去菌体后的发酵液可以直接蒸发结晶，这使产物的下游处理成本大大降低。从长远来看，利用酵母作为平台菌株，将大大降低琥珀酸的生物合成成本并促进其商业化生产。酿酒酵母是研究、应用最为广泛的模式微生物之一，近年来许多研究人员尝试以酿酒酵母为宿主生产琥珀酸。Raab等人通过代谢工程改造策略敲除了酿酒酵母 SDH1、SDH2、IDH1和IDP1四个基因，最终实现了琥珀酸的氧化生产。摇瓶培养中，敲除菌株的琥珀酸产量和产率均很低分别为3.62g/L和0.11mol/mol葡萄糖(Raab etal.,2010)。由上所述，酿酒酵母合成琥珀酸的能力与大肠杆菌等细菌宿主差距较大，这严重阻碍了其工业应用前景。

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种重要的非常规酵母，具有安全性高、耐酸能力强、分泌多种代谢产物和能够利用多种碳水化合物等优点，它被视为潜在的生物技术工程菌株受到越来越多的关注。Yuzbashev等人首次报道了利用基因敲除技术构建了缺失琥珀酸脱氢酶活性的解脂酵母工程菌株，然后经过一系列化学诱变和定向筛选，得到的突变株在合成培养基中琥珀酸产量可达50.2g/L(Yuzbashev et al.,2016；Yuzbashevet al.,2010)。除此之外的一系列研究也证明了解脂耶氏酵母具有良好的琥珀酸生产潜能(Jost et al.,2015；Li et al., 2016；Yang et al.,2017)。在本课题组先前工作中，通过敲除解脂耶氏酵母野生型菌株Po1f (ATCC MYA-2613)中的sdh5基因得到一株琥珀酸脱氢酶缺陷型菌株PGC01003，该工程菌以甘油作为碳源经过400h发酵能够生产160g/L琥珀酸(Gao et al.,2016)。尽管PGC01003 菌株琥珀酸产量已经达到较高水平，仍然存在着发酵过程需要调节pH增加下游处理成本和发酵周期长等问题。随后，我们在PGC01003菌株基础上敲除Ylach以消除乙酸溢流，同时过表达酿酒酵母来源的丙酮酸羧激酶ScPCK和解脂耶氏酵母自身琥珀酰-CoA合酶YlSCS2，在低pH条件下最终筛选得到的工程菌株PGC202琥珀酸产量、产率和生产力分别达到110 g/L、0.5g/g甘油和0.8g/L/h(Cui et al.,2017)。

在好氧发酵过程中，微生物主要通过氧化TCA途径合成琥珀酸。这一合成途径涉及CO₂的释放，理论琥珀酸产率较低仅为0.65g/g葡萄糖。实际上，自然界存在另外一条琥珀酸合成途径，即还原TCA途径，由苹果酸脱氢酶(MDH)、延胡索酸酶(FUM)和延胡索酸还原酶(FRD)三个酶组成，其中延胡索酸还原酶是关键限速酶。还原TCA途径不仅没有碳损失而且可以羧化固定CO₂分子用于琥珀酸合成，理论产率较氧化TCA途径更高，因此还原TCA 途径是更加适宜于琥珀酸合成的。然而，还原TCA途径通常存在于特定的严格或者兼性厌氧微生物，真核琥珀酸生产菌株中还原TCA途径的构建和表达尤为困难。解脂耶氏酵母作为一种严格好养微生物，不具有还原TCA路径的关键酶延胡索酸还原酶(FRD)，这大大制约了其理论生产效率的提高和工业生产应用前景。因此，如何突破在严格厌氧菌中表达还原TCA 路径，高转化率的合成琥珀酸，已经成为目前琥珀酸合成研究中的瓶颈。

鉴于此，如果通过基因工程和代谢工程改造的方法精确调控解脂耶氏酵母积累琥珀酸，外源引入和增强还原TCA生物合成途径的通路流量有望增加琥珀酸的理论产量和产率。经检索，利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法未见报道。

参考文献：

Cui,Z.,Gao,C.,Li,J.,Hou,J.,Lin,C.,Qi,Q.,2017.Engineering ofunconventional yeast Yarrowia lipolytica for efficient succinic acidproduction from glycerol at low pH.Metabolic Engineering.42,126.

Fickers,P.,Le,D.M.,Gaillardin,C.,Thonart,P.,Nicaud,J.M.,2003.Newdisruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeastYarrowia lipolytica.Journal of Microbiological Methods.55,727-737.

Gao,C.,Yang,X.,Wang,H.,Rivero,C.P.,Li,C.,Cui,Z.,Qi,Q.,Lin,C.S.K.,2016.Robust succinic acid production from crude glycerol using engineeredYarrowia lipolytica.Biotechnology for Biofuels.9,179.

Jost,B.,Holz,M.,Aurich,A.,Barth,G.,Bley,T.,Müller,R.A.,2015.Theinfluence of oxygen limitation for the production of succinic acid withrecombinant strains of Yarrowia lipolytica.Applied Microbiology andBiotechnology. 99,1675.

Li,C.,Yang,X.,Gao,S.,Wang,H.,Lin,C.S.K.,2016.High efficiency succinicacid production from glycerol via in situ fibrous bed bioreactor with anengineered Yarrowia lipolytica.Bioresource Technology.225,9.

Raab,A.M.,Gebhardt,G.,Bolotina,N.,Weuster-Botz,D.,Lang,C.,2010.Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for thebiotechnological production of succinic acid.Metabolic Engineering.12,518-525.

Yan,D.,Wang,C.,Zhou,J.,Liu,Y.,Yang,M.,Xing,J.,2014.Construction ofreductive pathway in Saccharomyces cerevisiae for effective succinic acidfermentation at low pH value.Bioresource Technology.156,232.

Yang,L.,Lübeck,M.,Ahring,B.K.,Lübeck,P.S.,2016.Enhanced succinic acidproduction in Aspergillus saccharolyticus by heterologous expression offumarate reductase from Trypanosoma brucei.Applied Microbiology andBiotechnology.100,1799-1809.

Yang,X.,Wang,H.,Chong,L.,Lin,C.S.K.,2017.Restoring of glucosemetabolism of engineered Yarrowia lipolytica for succinic acid production viaa simple and efficient adaptive evolution strategy.Journal of Agriculturaland Food Chemistry.

Yuzbashev,T.V.,Bondarenko,P.Y.,Sobolevskaya,T.I.,Yuzbasheva,E.Y.,Laptev,I.A.,Kachala,V.V.,Fedorov,A.S., Vybornaya,T.V.,Larina,A.S.,Sineoky,S.P.,2016.Metabolic evolution and ¹³C flux analysis of a succinatedehydrogenase deficient strain of Yarrowia lipolytica.Biotechnology andBioengineering.113,2425-2432.

Yuzbashev,T.V.,Yuzbasheva,E.Y.,Sobolevskaya,T.I.,Laptev,I.A.,Vybornaya,T.V.,Larina,A.S.,Matsui,K., Fukui,K.,Sineoky,S.P.,2010.Productionof succinic acid at low pH by a recombinant strain of the aerobic yeastYarrowia lipolytica.Biotechnology and Bioengineering.107,673-682.

发明内容

针对解脂耶氏酵母好氧发酵生产琥珀酸过程中存在的理论产率低的缺陷，本发明提供了一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法。

本发明所述利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，步骤是：

a)构建工程菌株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)PGC91 TbFRD-EcFUM；

b)以改良YPD或者YPG培养基在好氧条件下培养构建的工程菌株生产琥珀酸；

其特征在于：

构建工程菌株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)PGC91 TbFRD-EcFUM的方法是：

(1)以表达载体pKi-1构建pKi1-TbFRD质粒，以解脂耶氏酵母PGC91(Po1f Δsdh5Δach1 Ylpyc)菌株为出发菌，构建过表达Tbfrd基因的解脂耶氏酵母PGC91 TbFRD(Po1fΔsdh5 Δach1 Ylpyc Tbfrd)；(2)以表达载体pKi-1构建pKi1-FUM质粒，以解脂耶氏酵母PGC91 TbFRD(Po1f Δsdh5 Δach1 Ylpyc Tbfrd)菌株为出发菌，构建得到过表达Ecfum基因的工程菌株，命名为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)PGC91 TbFRD-EcFUM(Po1f Δsdh5 Δach1 Ylpyc Tbfrd Ecfum)；该工程菌株引入了还原TCA途径，能表达延胡索酸还原酶TbFRD和延胡索酸酶EcFUM；其中所述延胡索酸还原酶来源于布氏锥虫(Trypanosomabrucei)，所述延胡索酸酶来源于大肠杆菌(Escherichia Coli)；

其中：上述构建过程中筛选培养基为YNBG，配方以重量百分比计为：酵母含氮碱基YNB (with ammonium sulfate,Solarbo and without amino acids)，0.67％；甘油，2％；Casamino acids， 0.2％；尿嘧啶，0.05％；潮霉素，0.05％。

以改良YPD或者YPG培养基在好氧条件下培养构建的工程菌株生产琥珀酸的方法是：好氧条件为30±1℃，摇瓶培养转速120-220rpm，培养96±4h；改良YPD培养基的配方以重量百分比计为：2％蛋白胨，1％酵母粉，2％-6％葡萄糖，余量为水；改良YPG培养基的配方以重量百分比计为：2％蛋白胨，1％酵母粉，2％-6％甘油，余量为水；整个培养过程不外源添加酸碱剂维持发酵液中性pH值，后期发酵液pH为4.0-5.0；培养过程中，每间隔 12-24h取样，在600nm波长下检测菌液的光吸收值，监测琥珀酸的含量。

其中：上述好氧条件优选为30℃，摇瓶培养转速180rpm，培养96h。

本发明公开了一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，其中所述解脂耶氏酵母工程菌株外源表达了还原TCA途径中的关键酶：延胡索酸还原酶 (FRD)和延胡索酸酶(FUM)，相对于传统氧化TCA途径而言理论产率大幅提高。并且分离纯化琥珀酸的步骤省却了电渗析或者酸化超滤过程，没有副产物硫酸铵的产生。

综上，本发明首次在严格好氧微生物解脂耶氏酵母中引入异源还原TCA途径，所述酵母工程菌株可以高效利用葡萄糖或者甘油进行琥珀酸合成代谢。在同时过表达布氏锥虫(Trypanosoma brucei)来源TbFRD以及大肠杆菌(Escherichia Coli)来源的EcFUM以增强还原TCA途径代谢通量时，最高琥珀酸产率可达0.85g/g葡萄糖，约为氧化TCA途径理论产率的132％。这是目前已报道真核微生物中琥珀酸最高产率。与此同时，该工程菌株对酸性条件耐受性好，发酵过程中不需要添加酸碱中和剂调节pH。这将有效减少甚至消除琥珀酸分离纯化过程中副产物硫酸铵的产生，省却了电渗析或者酸化超滤步骤，降低生产成本。因此本发明所述工程菌具有可观的应用价值和前景。

附图说明

图1还原TCA途径的过表达有利于琥珀酸的高效合成。

其中PGC91为对照菌株，PGC91 TbFRD以PGC91为宿主表达了布氏锥虫来源的TbFRD， PGC91 TbFRD-EcFUM同时过表达了布氏锥虫来源的TbFRD和大肠杆菌来源的EcFUM。

图2以甘油为唯一碳源生产琥珀酸。

其中PGC91为对照菌株，PGC91 TbFRD以PGC91为宿主表达了布氏锥虫来源的TbFRD， PGC91 TbFRD-EcFUM同时过表达了布氏锥虫来源的TbFRD和大肠杆菌来源的EcFUM。

图3不同转速条件对PGC91 TbFRD-EcFUM工程菌株琥珀酸合成的影响。

其中共设置三个实验组，摇瓶培养转速分别为120rpm、180rpm和220rpm。

具体实施方式

本发明所涉及解脂耶氏酵母菌株PGC91(Po1f Δsdh5 Δach1 Ylpyc)，其由原始菌株Po1f (ATCC编号MYA-2613；基因型MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2，购自ATCC)构建完成(见Cui et al.,2017)。还涉及携带可回收筛选标记的过表达载体pKi-1(主要包含有一个强启动子UAS8B-TEF和终止子CYC1、两侧连接lox位点的LEU2 营养缺陷型基因)，其构建步骤为PCR扩增并将启动子UAS8B-TEF和终止子CYC1融合，随后插入到含有LEU2营养缺陷型基因的载体JMP114中。JMP114和pUB4-CRE质粒的构建见文献(Fickers et al.,2003)。

YPG固体培养基配方：

酵母粉，1％；蛋白胨，2％；甘油，2％；琼脂粉，2％；余量为水。

YNBG固体培养基配方：

YNB，0.67％；甘油，2％；余量为水。

实施例1工程菌株的构建

(1)Tbfrd基因的过表达

菌种：解脂耶氏酵母PGC91(Po1f Δsdh5 Δach1 Ylpyc)

a.表达载体的构建

根据Genbank公布的Tbfrd基因序列(KT026107.1)，经密码子优化以后由通用生物系统(安徽)有限公司安排合成。以及同时根据表达质粒pKi-1序列设计引物：

Tbfrd-F：

ATAAGAATCATTCAAAGGTTATGGTGGACGGTCGATCTTC

Tbfrd-R：

ACATAACTAATTACATGATTTTAGGAGCCAGAGGGCTCGG

以密码子优化合成的Tbfrd基因序列为模板，使用Tbfrd-F/Tbfrd-R引物PCR(聚合酶链式反应)扩增得到携带相应末端同源序列的组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

pKi-1通过Bsp119I内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒(NewEngland Biolabs(NEB),England)将上述酶切片段和PCR产物连接，构建完成pKi1-TbFRD质粒。通过NotI内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。

b.LiAc转化感受态的制备

I.从甘油管取50μl PGC91(Po1f Δsdh5 Δach1 Ylpyc)菌液，涂布YPG平板，30℃过夜培养

II.刮取适量Po1f细胞，重悬悬于1ml TE Buffer中

III.10，000rpm离心1min，倒掉上清液

IV.细胞悬于600μl Lithium Acetate(0.1M pH 6.0)，30℃水浴、静止培养1h

V.3000rpm离心2min，倒掉上清液

VI.用80-120μl的Lithium Acetate轻悬细胞。

c.片段转化，筛选重组子

I.取40μl感受态细胞，加5μl过表达整合片断和2μl鲑鱼精DNA，30℃水浴培养15min

II.加350μl PEG 4000-Lithium Acetate(0.1M pH 6.0)及16μl 1M DTT(40mM)，30℃水浴静止培养1h

III.加40μl DMSO(nearly 10％final)，39℃热击10min

IV.加600微升Lithium Acetate(0.1M pH 6.0)，室温放置15min

V.取200μl混合液涂布YNBG筛选平板，30℃培养2-3d。

VI.随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证

Chrom-Tbfrd-F：CAGCCACAGATTTTCACT

Chrom-Tbfrd-R：GCGGAGTAACACTTGACA

测序进一步验证过表达片段整合到基因组上。

VII.Lox位点专一重组

将pUB4-CRE转入上述Tbfrd基因组整合工程菌，YPG-hyg培养基中30℃培养1-2d，CRE 重组酶组成型表达。利用接种环蘸取菌液在YPG-hyg筛选平板上划线，将长出的单克隆同时转入YNBG-ura平板和YPG-hyg筛选平板上培养，在YPG-hyg平板上生长而在YNBG-ura平板上不生长的筛选标记基因已被CRE重组酶删除。利用检测引物Chrom-ura-F/Chrom-ura-R 和Chrom-leu-F/Chrom-leu-R进一步鉴定。

Chrom-ura-F：CGAAGCTCGAGCTAACGTC

Chrom-ura-R：CAGTTAATCTTCTGGTAAG

Chrom-leu-F：AGCATCATGGCGGCAGACAG

Chrom-leu-R：AGGCCGTCAAGGTGCTCAAG

将得到的阳性重组子在YPG培养基中连续传代2-3d，筛选出去除pUB4-CRE质粒的工程菌株，命名为工程菌株PGC91 TbFRD(Po1f Δsdh5 Δach1 Ylpyc Tbfrd)。

其中：

上述YPG-hyg培养基为：酵母粉，1％；蛋白胨，2％；甘油，2％；潮霉素，0.05％，余量为水。

上述YNBG-ura培养基为：YNB，0.67％；甘油，2％；尿嘧啶，0.05％，余量为水。

上述YPG平板为：含有2％琼脂的YPG固体培养基。

上述YNBG平板为：含有2％琼脂的YNBG固体培养基。

上述YNBG-ura筛选平板为：含有2％琼脂的YNBG-ura固体培养基。

上述YPG-hyg筛选平板为：含有2％琼脂的YNBG-hyg固体培养基。

(2)Ecfum基因的过表达

菌种：解脂耶氏酵母PGC91 TbFRD(Po1f Δsdh5 Δach1 Ylpyc Tbfrd)

a.表达载体的构建

根据Genbank公布的Ecfum基因序列(NC_000913.3)以及过表达质粒pKi-1序列设计引物：

Ecfum-F：

ATAAGAATCATTCAAAGGTTATGAATACAGTACGCAGCGA

Ecfum-R：

ACATAACTAATTACATGATTTTAACGCCCGGCTTTCATAC

以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用Ecfum-F/Ecfum-R引物PCR(聚合酶链式反应) 扩增得到携带相应末端同源序列的组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

pKi-1通过Bsp119I内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒(NewEngland Biolabs(NEB),England)将上述酶切片段和PCR产物连接，构建完成pKi1-FUM质粒。通过 NotI内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。

b.LiAc转化感受态的制备

I.从甘油管取50μl PGC91 TbFRD(Po1f Δsdh5 Δach1 Ylpyc Tbfrd)菌液，涂布YPG平板，30℃过夜培养

II.刮取适量Po1f细胞，重悬悬于1ml TE Buffer中

III.10，000rpm离心1min，倒掉上清液

IV.细胞悬于600μl Lithium Acetate(0.1M pH 6.0)，30℃水浴、静止培养1h

V.3000rpm离心2min，倒掉上清液

VI.用80-120μl的Lithium Acetate轻悬细胞。

c.片段转化，筛选重组子

I.取40μl感受态细胞，加5μl过表达整合片断和2μl鲑鱼精DNA，30℃水浴培养15min

II.加350μl PEG 4000-Lithium Acetate(0.1M pH 6.0)及16μl 1M DTT(40mM)，30℃水浴静止培养1h

III.加40μl DMSO(nearly 10％final)，39℃热击10min

IV.加600微升Lithium Acetate(0.1M pH 6.0)，室温放置15min

V.取200μl混合液涂布YNBG筛选平板，30℃培养2-3d。

VI.随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证

Chrom-fum-F：GCGTAGCAGATGAACTG

Chrom-fum-R：AACGCCCGGCTTTCATAC

测序进一步验证过表达片段整合到基因组上，并最终得到工程菌株，命名为工程菌株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)PGC91 TbFRD-EcFUM(Po1f Δsdh5 Δach1Ylpyc Tbfrd Ecfum)。

其中：

上述YPG平板为：含有2％琼脂的YPG固体培养基。

上述YNBG筛选平板为：含有2％琼脂的YNBG固体培养基。

实施例2不同菌株生产琥珀酸效率的比较

工程菌株：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)PGC91、PGC91 TbFRD和PGC91TbFRD-EcFUM。

冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母PGC91、PGC91 TbFRD和PGC91 TbFRD-EcFUM划线接种于YPG平板(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％甘油，2％琼脂粉)，30℃培养30h。

将上述平板上长出的单菌落接入装有50ml的YPD液体培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉， 2％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。

种子培养：分别取1ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，4％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h。

发酵培养：分别取2ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，6％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，180rpm好氧培养96h，发酵过程中不外源添加酸碱剂维持发酵液中性pH值。

发酵过程中，每间隔12-24h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1ml 菌液10，000-12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H₂O重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。

发酵液中的碳源和有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪(HPLC)分析。具体方法为取1ml 发酵液室温下12,000rpm离心2min，取上清，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测有机酸和葡萄糖浓度。

检测条件为：色谱柱为HPX-87H(BioRad Labs,300mm×7.8mm)，检测器为示差折光检测器RID-10A，柱温为65℃，流动相为5mM H₂SO₄溶液，流速为0.6ml/min。

解脂耶氏酵母PGC91菌株自身不含有延胡索酸还原酶，负责琥珀酸合成的主要是氧化 TCA和乙醛酸循环途径。我们在此基础上引入了还原TCA途径的关键基因frd(布氏锥虫来源的Tbfrd)和fum(大肠杆菌来源的Ecfum)，以重构酵母代谢通量减少氧化TCA代谢压力，提高琥珀酸合成理论产率。其中，Tbfrd编码的NADH依赖的延胡索酸还原酶(TbFRD)催化延胡索酸生成琥珀酸，Ecfum编码的延胡索酸酶(EcFUM)催化苹果酸生成延胡索酸。由图1可知，单独过表达了Tbfrd(编码布氏锥虫来源NADH依赖的延胡索酸还原酶)时，尽管工程菌PGC91 TbFRD的琥珀酸较对照菌株PGC91有所下降，但是其对葡萄糖的产率可以达到0.7g/g(图1)，约为PGC91的145％。随后TbFRD和EcFUM的协同表达有助于解脂酵母琥珀酸合成。在转速为180rpm条件下，PGC91 TbFRD-EcFUM琥珀酸产量、生产力和产率分别可以达到16.75g/L、0.17g/L/h和0.85g/g葡萄糖。证实还原TCA途径过表达可以提高琥珀酸生产效率。

实施例3甘油作为唯一碳源时PGC91 TbFRD-EcFUM菌株的琥珀酸合成情况

工程菌株：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)PGC91、PGC91 TbFRD和PGC91TbFRD-EcFUM。

冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母PGC91、PGC91 TbFRD和PGC91 TbFRD-EcFUM划线接种于YPG平板(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖，2％琼脂粉)，30℃培养30h。

将上述平板上长出的单菌落接入装有50ml的YPG液体培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉， 2％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。种子培养：取1ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，4％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h

发酵培养：取2ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉， 6％甘油)的250ml三角瓶中，30℃，180rpm条件下好氧培养96h，发酵过程中不外源添加酸碱剂维持发酵液中性pH值。

发酵过程中，每间隔12-24h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1ml 菌液10，000-12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H₂O重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。

发酵液中的碳源和有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪(HPLC)分析。具体方法为取1ml 发酵液室温下12,000rpm离心2min，取上清，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测有机酸和葡萄糖浓度。

检测条件为：色谱柱为HPX-87H(BioRad Labs,300mm×7.8mm)，检测器为示差折光检测器RID-10A，柱温为65℃，流动相为5mM H₂SO₄溶液，流速为0.6ml/min。

甘油，作为一种生物柴油制备过程中的副产物，来源广泛且价格低廉。由图2结果可知，尽管甘油和葡萄糖吸收转运机制以及氧化还原性能有所差异，表达了还原TCA途径的工程菌株PGC91 TbFRD-EcFUM同样可以高效代谢甘油合成琥珀酸。在甘油作为唯一碳源时，PGC91 TbFRD-EcFUM好氧发酵生产琥珀酸的产量和产率分别可达36.3g/L和0.62g/g甘油。甘油的还原性较葡萄糖更强，代谢过程中每消耗一分子甘油产生一分子NADH，因此解脂耶氏酵母工程菌株以甘油为底物时有利于菌体生长和代谢产物快速积累。虽然还原性强的甘油可以提供更多ATP促进细胞生长，但是同时也会造成过量还原性副产物如甘露醇和赤藓糖醇等的溢流，造成琥珀酸产率较葡萄糖更低。

实施例4不同转速条件对PGC91 TbFRD-EcFUM菌株琥珀酸生产的影响

工程菌株：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)PGC91 TbFRD-EcFUM。

冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母PGC91 TbFRD-EcFUM划线接种于YPG平板(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖，2％琼脂粉)，30℃培养30h。

将上述平板上长出的单菌落接入装有50ml的YPG液体培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉， 2％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。种子培养：取1ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，4％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h

发酵培养：取2ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉， 6％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，分别在120rpm、180rpm和220rpm条件下好氧培养96h，发酵过程中不外源添加酸碱剂。

发酵过程中，每间隔12-24h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1ml 菌液10，000-12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H₂O重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。

发酵液中的碳源和有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪(HPLC)分析。具体方法为取1ml 发酵液室温下12,000rpm离心2min，取上清，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测有机酸和葡萄糖浓度。

检测条件为：色谱柱为HPX-87H(BioRad Labs,300mm×7.8mm)，检测器为示差折光检测器RID-10A，柱温为65℃，流动相为5mM H₂SO₄溶液，流速为0.6ml/min。

通过研究不同转速或者溶氧水平下琥珀酸发酵性能，发现220rpm时解脂耶氏酵母工程菌株PGC91 TbFRD-EcFUM琥珀酸产量最高为24.6g/L，然而产率仅有0.57g/g葡萄糖(图3)。随着转速的降低琥珀酸产量呈现递减趋势，转速为120rpm条件下琥珀酸产量最低为10.3 g/L。转速为180rpm情况下琥珀酸产量和产率均达到最佳。高转速有利于菌株生长和琥珀酸生产力的提高，但是低转速条件下琥珀酸产率更高。说明在摇瓶发酵过程中PGC91TbFRD-EcFUM菌株会同时利用氧化TCA途径和还原TCA途径进行琥珀酸合成代谢。氧化 TCA途径在负责产生琥珀酸的同时还起到氧化功能的作用，其代谢通量直接影响菌株生长状况。还原TCA途径作为一种高效琥珀酸合成途径，其琥珀酸理论产率是氧化TCA途径的近两倍。适宜的转速或者溶氧水平有利于细胞生长和琥珀酸合成以及氧化TCA途径和还原TCA途径的平衡，在满足细胞生长的同时高效生产琥珀酸。

　　序列表

　　<110>山东大学

　　<120>一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法

　　<141>2017-10-25

　　<160>14

　　<210>1

　　<211>40

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223> Tbfrd-F

　　<400>1

　　ataagaatca ttcaaaggtt atggtggacg gtcgatcttc 40

　　<210>2

　　<211>40

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>Tbfrd-R

　　<400>2

　　acataactaa ttacatgatt ttaggagcca gagggctcgg 40

　　<210>3

　　<211>18

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>Chrom-Tbfrd-F

　　<400>3

　　cagccacaga ttttcact 18

　　<210>4

　　<211>18

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>Chrom-Tbfrd-R

　　<400>4

　　gcggagtaac acttgaca 18

　　<210>5

　　<211>19

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>Chrom-ura-F

　　<400>5

　　cgaagctcga gctaacgtc 19

　　<210>6

　　<211>19

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>Chrom-ura-R

　　<400>6

　　cagttaatct tctggtaag 19

　　<210>7

　　<211>20

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>Chrom-leu-F

　　<400>7

　　agcatcatgg cggcagacag 20

　　<210>8

　　<211>20

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>Chrom-leu-R

　　<400>8

　　Aggccgtcaa ggtgctcaag 20

　　<210>9

　　<211>40

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>Ecfum-F

　　<400>9

　　ataagaatca ttcaaaggtt atgaatacag tacgcagcga 40

　　<210>10

　　<211>40

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>Ecfum-R

　　<400>10

　　acataactaa ttacatgatt ttaacgcccg gctttcatac 40

　　<210>11

　　<211>17

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>Chrom-fum-F

　　<400>11

　　gcgtagcaga tgaactg 17

　　<210>12

　　<211>18

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>Chrom-fum-R

　　<400>12

aacgcccggc tttcatac 18

　　<210>13

　　<211>6435

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>pKi-1

　　<400>13

cggccgagtc gatcagctgg tggttgagct ccagctgggg gaactcgtcc ttgaggactc 60

gggtgacagt ctttcgccaa agtcgagagg aggccagcac gttggccttg tcaagagacc 120

acacgggaag aggggggttg tgctgaaggg ccaggaaggc ggccattcgg gcaattcgct 180

caacctcagg aacggagtag gtctcggtgt cggaagcgac gccagatccg tcatcctcct 240

ttcgctctcc aaagtagata cctccgacga gctctcggac aatgatgaag tcggtgccct 300

caacgtttcg gatgggggag agatcggcga gcttgggcga cagcagctgg cagggtcgca 360

ggttggcgta caggttcagg tcctttcgca gcttgaggag accctgctcg ggtcgcacgt 420

cggttcgtcc gtcgggagtg gtccatacgg tgttggcagc gcctccgaca gcaccgagca 480

taatagagtc agcctttcgg cagatgtcga gagtagcgtc ggtgatgggc tcgccctcct 540

tctcaatggc agctcctcca atgagtcggt cctcgaacac aaactcggtg ccggaggcct 600

cagcaacaga cttgagcacc ttgacggcct cggcaatcac ctcggggcca cagaagtcgc 660

cgccgagaag aacaatcttc ttggagtcag tcttggtctt cttagtttcg ggttccattg 720

tggatgtgtg tggttgtatg tgtgatgtgg tgtgtggagt gaaaatctgt ggctggcaaa 780

cgctcttgta tatatacgca cttttgcccg tgctatgtgg aagactaaac ctccgaagat 840

tgtgactcag gtagtgcggt atcggctagg gacccaaacc ttgtcgatgc cgatagcgct 900

atcgaacgta cccagccggc cgggagtatg tcggagggga catacgagat cgtcaagggt 960

ttgtggccaa ctggtaaata aatgatgact caggcggaat tcagaataac ttcgtatgat 1020

gtatgctata cgaagttatg tagggataac agggtaatct cgaggggggg cccggtacca 1080

gcttttgttc cctttagtga gggttaattc cgagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 1140

ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 1200

agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 1260

tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 1320

cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 1380

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 1440

ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 1500

ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 1560

atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 1620

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 1680

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 1740

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 1800

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 1860

acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 1920

gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 1980

ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 2040

ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 2100

gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 2160

ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 2220

agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 2280

ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 2340

gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 2400

catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 2460

cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 2520

cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 2580

gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 2640

tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 2700

gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 2760

tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 2820

gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 2880

gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 2940

taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 3000

tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 3060

ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 3120

taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 3180

tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 3240

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgggaaattg taaacgttaa 3300

tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc 3360

cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt 3420

tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa 3480

aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg 3540

gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg 3600

acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc 3660

tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa 3720

tgcgccgcta cagggcgcgt cgcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg 3780

gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag 3840

gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 3900

tgaattgtaa tacgactcac tatagggcga attggagctc caccgcggtg gcggccgctc 3960

tagaactagt ggatcctagt catatgaagg taccaaggaa gcatgcggta cccgaattcc 4020

tgaggtgtct cacaagtgcc gtgcagtccc gcccccactt gcttctcttt gtgtgtagtg 4080

tacgtacatt atcgagaccg ttgttcccgc ccacctcgat ccggtctaga ctgaggtgtc 4140

tcacaagtgc cgtgcagtcc cgcccccact tgcttctctt tgtgtgtagt gtacgtacat 4200

tatcgagacc gttgttcccg cccacctcga tccggggatc cctgaggtgt ctcacaagtg 4260

ccgtgcagtc ccgcccccac ttgcttctct ttgtgtgtag tgtacgtaca ttatcgagac 4320

cgttgttccc gcccacctcg atccgggtcg acctgaggtg tctcacaagt gccgtgcagt 4380

cccgccccca cttgcttctc tttgtgtgta gtgtacgtac attatcgaga ccgttgttcc 4440

cgcccacctc gatccgggag ctcctgaggt gtctcacaag tgccgtgcag tcccgccccc 4500

acttgcttct ctttgtgtgt agtgtacgta cattatcgag accgttgttc ccgcccacct 4560

cgatccggtc tagactgagg tgtctcacaa gtgccgtgca gtcccgcccc cacttgcttc 4620

tctttgtgtg tagtgtacgt acattatcga gaccgttgtt cccgcccacc tcgatccggg 4680

gatccctgag gtgtctcaca agtgccgtgc agtcccgccc ccacttgctt ctctttgtgt 4740

gtagtgtacg tacattatcg agaccgttgt tcccgcccac ctcgatccgg gtctacctga 4800

ggtgtctcac aagtgccgtg cagtcccgcc cccacttgct tctctttgtg tgtagtgtac 4860

gtacattatc gaagaccgtt gttcccgccc acctcgatcc gggcatgcct gcagaagctt 4920

agagaccggg ttggcggcgt atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 4980

cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttcacc ccacatatca 5040

aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 5100

cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 5160

gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 5220

aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 5280

cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaaggtt cgaatcatgt 5340

aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctccctccac atccgctcta accgaaaagg 5400

aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt tttttaatag ttatgttagt 5460

attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacaaac gcgtgtacgc 5520

atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat 5580

ttgcggataa cagggtaatt atcgcttcgg ataactcctg ctatacgaag ttatacgaat 5640

tcaatataca gtaacaagct accaccacac tcgttgggtg cagtcgccag ctttaaagat 5700

atctatccac atcagccaca actcccttcc tttaataaac cgactacacc cttggctatt 5760

gaggttatga gtgaatatac tgtagacaag acactttcaa gaagactgtt tccaaaacgt 5820

accactgtcc tccactacaa acacacccaa tctgcttctt ctagtcaagg ttgctacacc 5880

ggtaaattat aaatcatcat ttcattagca gggctgggcc ctttttatag agtcttatac 5940

actagcggat cctgccggta gaccaacccg caggcgcgtc agtttgctcc ttccatcaat 6000

gcgtcgtaga aacgacttac tccttcttga gcagctcctt gaccttgttg gcaacaaagt 6060

ctccgacctc ggaggtggag gaagagcctc cgatatcggc ggtagtgata ccagcctcga 6120

cggactcctt gacggcagcc tcaacagcgt caccggcggg cttcatgtta agagagaact 6180

tgagcatcat ggcggcagac agaatggtgg caatggggtt gaccttctgc ttgccgagat 6240

cgggggcaga tccgtgacag ggctcgtaca gaccgaacgc ctcgttggtg tcgggcagag 6300

aagccagaga ggcggagggc agcagaccca gagaaccggg gatgacggag gcctcgtcgg 6360

agatgatatc gccaaacatg ttggtggtga tgatgatacc attcatcttg gaaggctgct 6420

tgatgaggat catgg 6435

　　<210>14

　　<211>3420

　　<212>DNA

　　<213> 人工序列

　　<220>

　　<223>Tbfrd

　　<400>14

atggtggacg gtcgatcttc cgcctccatc gtcgccgtcg accccgagcg agccgctcga 60

gagcgagacg ctgccgctcg agccctgctg caggactccc ctctgcacac caccatgcag 120

tacgccacct ccggcctgga gctgaccgtc ccttacgccc tgaaggtcgt cgcctccgcc 180

gacaccttcg accgagccaa ggaggtcgcc gacgaggtgc tgcgatgcgc ctggcagctg 240

gccgacaccg tgctgaactc tttcaacccc aactctgagg tctctctggt cggtcgactg 300

cccgtcggcc agaagcacca gatgtccgcc cccctgaagc gagtcatggc ctgttgccag 360

cgagtctaca actcctccgc cggttgtttc gacccctcta ccgcccccgt ggccaaggct 420

ctgcgagaga ttgccctggg taaagagcga aacaacgcct gcctggaggc cctgacccag 480

gcctgtaccc tgcccaactc cttcgtgatt gacttcgagg ccggcaccat ctctcgaaag 540

cacgagcacg cctctctgga cctgggcggt gtctccaagg gttacattgt ggactacgtg 600

atcgacaaca tcaacgccgc cggcttccag aacgtcttct tcgactgggg cggcgactgc 660

cgagcctctg gtatgaacgc ccgaaacacc ccctgggtcg tgggcattac ccgacccccc 720

tccctggaca tgctgcccaa cccccccaag gaggcctcct acatctccgt gatctccctg 780

gacaacgagg ccctggccac ctctggtgac tacgagaacc tgatctacac cgccgacgac 840

aagcccctga cctgtaccta cgactggaag ggcaaggagc tgatgaagcc ctctcagtct 900

aacatcgccc aggtctctgt caagtgttac tccgccatgt acgccgacgc cctggccact 960

gcctgtttca ttaagcgaga ccccgccaag gtccgacagc tgctggacgg ttggcgatac 1020

gtccgagaca ccgtccgaga ctaccgagtc tacgtccgag agaacgagcg agtcgccaag 1080

atgttcgaga ttgccaccga ggacgccgag atgcgaaagc gacgaatctc taacaccctg 1140

cccgcccgag tcatcgtggt cggtggtggc ctggccggtc tgtccgctgc tattgaggcc 1200

gccggttgtg gcgcccaggt ggttctgatg gagaaggagg ccaagctggg tggtaactct 1260

gccaaggcca cctccggaat taacggttgg ggcacccgag cccaggccaa ggcttccatt 1320

gtggacggtg gcaagtactt cgagcgagac acctacaagt ccggtatcgg tggtaacacc 1380

gaccccgccc tggtcaagac cctgtccatg aagtctgccg acgccattgg ctggctgacc 1440

tccctgggtg tccccctgac cgtgctgtcc cagctgggcg gacactcccg aaagcgaacc 1500

caccgagccc ccgacaagaa ggacggcacc cccctgccca ttggcttcac cattatgaag 1560

accctggagg accacgtccg aggcaacctg tctggccgaa tcaccatcat ggagaactgc 1620

tccgtcacct ccctgctgtc cgagaccaag gagcgacccg acggcaccaa gcagatccga 1680

gtcaccggtg tggagttcac ccaggccggc tccggtaaaa ccaccatcct ggccgacgcc 1740

gtgatcctgg ccaccggagg tttctccaac gacaagaccg ccgactccct gctgcgagag 1800

cacgcccctc acctggtcaa cttccccacc accaacggtc cctgggccac cggagacggt 1860

gtcaagctgg cccagcgact gggtgcccag ctggtcgaca tggacaaggt ccagctgcac 1920

cccaccggtc tgattaaccc caaggacccc gccaacccca ccaagttcct gggccccgag 1980

gccctgcgag gctctggtgg tgtgctgctg aacaagcagg gcaagcgatt cgtgaacgag 2040

ctggacctgc gatctgtcgt ctccaaggcc atcatggagc agggtgccga gtaccccggt 2100

tccggtggtt ccatgttcgc ctactgtgtc ctgaacgccg ccgcccagaa gctgttcggc 2160

gtctcttccc acgagttcta ctggaagaag atgggcctgt tcgtcaaggc cgacaccatg 2220

cgagacctgg ccgccctgat tggttgcccc gtggagtccg tgcagcagac cctggaggag 2280

tacgagcgac tgtccatttc ccagcgatct tgccccatta cccgaaagtc cgtgtacccc 2340

tgcgtcctgg gcaccaaggg cccctactac gtcgccttcg tcaccccctc cattcactac 2400

accatgggtg gttgcctgat ttccccctcc gccgagatcc agatgaagaa cacctcctct 2460

cgagcccccc tgtcccactc caaccccatc ctgggtctgt tcggtgccgg cgaggtgacc 2520

ggcggtgtcc atggtggcaa ccgactgggc ggcaactccc tgctggagtg tgtcgtcttc 2580

ggccgaatcg ccggcgaccg agcctctacc atcctgcagc gaaagtcctc cgccctgtct 2640

ttcaaggtgt ggaccaccgt ggtcctgcga gaggtccgag agggcggtgt gtacggcgcc 2700

ggttcccgag tgctgcgatt caacctgccc ggcgccctgc agcgatctgg cctttctctg 2760

ggccagttca ttgccatccg aggcgactgg gacggtcagc agctgatcgg ttactactct 2820

cccatcaccc tgcccgacga cctgggtatg atcgacattc tggcccgatc tgacaagggc 2880

accctgcgag agtggatttc tgccctggag cccggcgacg ccgtcgagat gaaggcctgt 2940

ggcggtctgg tcatcgagcg acgactgtct gacaagcact tcgtgttcat gggccacatc 3000

atcaacaagc tgtgtctgat cgccggcggt accggcgtcg cccctatgct tcagatcatt 3060

aaggccgcct tcatgaagcc cttcattgac accctggagt ctgtgcacct gatctacgcc 3120

gccgaggacg tcaccgagct gacctaccga gaggtgctgg aggagcgacg acgagagtcc 3180

cgaggcaagt tcaagaagac cttcgtgctg aaccgacccc cccccctgtg gaccgacgga 3240

gttggattca ttgaccgagg tattctgacc aaccacgtcc agcccccctc tgacaacctg 3300

ctggtggcca tttgcggccc ccccgtcatg cagcgaatcg tgaaggccac cctgaagacc 3360

ctgggctaca acatgaacct ggtgcgaacc gtggacgaga ccgagccctc tggctcctaa 3420

Claims (3)

1.一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，步骤是：

a)构建工程菌株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)PGC91 TbFRD-EcFUM；

(1)以表达载体pKi-1构建pKi1-TbFRD质粒，以解脂耶氏酵母PGC91(Po1fΔsdh5Δach1Ylpyc)菌株为出发菌，构建过表达Tbfrd基因的解脂耶氏酵母PGC91 TbFRD(Po1fΔsdh5Δach1 Ylpyc Tbfrd)；(2)以表达载体pKi-1构建pKi1-FUM质粒，以解脂耶氏酵母PGC91TbFRD(Po1fΔsdh5Δach1 Ylpyc Tbfrd)菌株为出发菌，构建得到过表达Ecfum基因的工程菌株，命名为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)PGC91 TbFRD-EcFUM(Po1fΔsdh5Δach1 Ylpyc Tbfrd Ecfum)；该工程菌株引入了还原TCA途径，能表达延胡索酸还原酶TbFRD和延胡索酸酶EcFUM；其中所述延胡索酸还原酶来源于布氏锥虫(Trypanosoma brucei)，所述延胡索酸酶来源于大肠杆菌(Escherichia Coli)；

其中，所述表达载体pKi-1的核苷酸序列如SEQ ID No:13所示；所述Tbfrd基因的核苷酸序列如SEQ ID No:14所示；所述Ecfum基因的核苷酸序列为Genbank数据库中公开的已知序列，能以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用Ecfum-F/Ecfum-R引物PCR扩增获得，其中引物Ecfum-F的核苷酸序列如SEQ ID No:9所示，引物Ecfum-R的核苷酸序列如SEQ ID No:10所示；

b)以改良YPD或者YPG培养基在好氧条件下培养构建的工程菌株生产琥珀酸；

好氧条件为30±1℃，摇瓶培养转速120-220rpm，培养96±4h；改良YPD培养基的配方以重量百分比计为：2％蛋白胨，1％酵母粉，2％-6％葡萄糖，余量为水；改良YPG培养基的配方以重量百分比计为：2％蛋白胨，1％酵母粉，2％-6％甘油，余量为水；整个培养过程不外源添加酸碱剂维持发酵液中性pH值，后期发酵液pH为4.0-5.0；培养过程中，每间隔12-24h取样，在600nm波长下检测菌液的光吸收值，监测琥珀酸的含量。

2.根据权利要求1所述利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，其特征在于：好氧条件为30℃，摇瓶培养转速180rpm，培养96h。

3.根据权利要求1所述利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，其特征在于：改良YPD培养基的配方以重量百分比计为：2％蛋白胨，1％酵母粉，6％葡萄糖，余量为水；改良YPG培养基的配方以重量百分比计为：2％蛋白胨，1％酵母粉，6％甘油，余量为水。

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