CN116904484A - 可提高核苷产量的dna片段、菌株和生产方法 - Google Patents

可提高核苷产量的dna片段、菌株和生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体涉及可提高核苷产量的DNA片段、菌株和生产方法。本发明首次提出了新的purR启动子区域突变和新的tal终止子区域突变，所获得的突变体能够高效生产核苷，并成功创造出能够高效生产核苷的微生物，为核苷的工业化生产奠定了基础。

Description

可提高核苷产量的DNA片段、菌株和生产方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及可提高核苷产量的DNA片段、菌株和生产方法。
背景技术
核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由D-核糖或D-2-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。由D-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与RNA组成，由D-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与DNA组成。D-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)。
鸟嘌呤核苷(鸟苷)和次黄嘌呤核苷(肌苷)在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域，鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷和肌苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体，而肌苷酸可以作为合成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)的前体，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。
目前，微生物发酵是生产核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌等。在生长菌株的选育与改造过程中，通过使用紫外诱变、硫酸二乙酯诱变育种，定向选育核苷高产菌株；或者根据细菌中核苷酸的代谢路径和调节机理，深入了解菌株遗传背景及菌株特性，通过代谢工程手段，有目的性地对菌株进行改造，以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。但目前核苷菌种的发酵性能仍较差、核苷的转化率仍较低，不能满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
本发明通过深入研究后发现，经过修饰枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的嘌呤合成操纵子阻遏蛋白的启动子(由purR基因编码，野生型序列见SEQ ID NO.1)和/或将murAB和tal两基因之间的某些碱基进行突变(野生型序列见SEQ ID NO.5)，分别获得purR基因操纵子的突变体和tal基因操纵子的突变体，使得微生物能够高效率、高速度地生成包括鸟嘌呤核苷和次黄嘌呤核苷在内的核苷，并且成功创造出了能够高效生产核苷的新微生物。
基于上述发现，本发明提供了可提高核苷产量的DNA片段、菌株和生产方法。
具体而言，本发明首先提供一种DNA片段，其包括如下的DNA片段I和/或DNA片段II；
1)DNA片段I，其在核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段的基础上发生以下至少一个突变：
a)purR基因起始密码子前第8bp处的G突变为A；
b)purR基因起始密码子前第15bp处的T突变为A；
c)purR基因起始密码子前第23bp处的A缺失；
d)purR基因起始密码子前第25bp处的A突变为T；
e)purR基因起始密码子前第34bp处的A突变为T；
2)DNA片段II，其在核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的DNA片段的基础上发生以下至少一个突变：
f)tal基因终止密码子后第11bp处的C突变为T；
g)tal基因终止密码子后第115bp处的C突变为T。
其中，purR基因编码嘌呤合成操纵子阻遏蛋白，能够结合到嘌呤操纵子的启动子区域，阻止嘌呤合成操纵子的表达。本发明通过易错PCR等随机突变的方法，对purR基因启动子区域进行随机突变，通过筛选使PurR活性降低的启动子序列，相应启动子序列引入至核苷生产菌中，获得的微生物通过对purR基因启动子的修饰，使得所述菌株产生核苷的能力与未修饰的菌株相比增强。
DNA片段II的突变位于tal基因终止密码子后，tal基因主要参与磷酸戊糖途径。将筛选到的tal基因终止密码子后的2种突变引入核苷生产菌株中，所获微生物较未突变菌株相比，核苷生产能力增强。
虽然CN200410030235.1中公开了失活purR或对其启动子序列进行修饰弱化PurR能提高肌苷产量，但其未对鸟苷产量是否有提升未进行报道。murAB和tal两基因之间的某些碱基突变能提高鸟苷产量目前尚无人报道。本发明首次提出了新的purR启动子区域突变和新的tal终止子区域突变，所获得的突变体能够高效生产核苷，并成功创造出能够高效生产核苷的微生物。
作为优选，所述DNA片段I的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示。
其中，与核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型DNA片段相比，核苷酸序列如SEQID NO.2所示的DNA片段I发生了以下突变：purR基因起始密码子前第8bp处的G突变为A；核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的DNA片段I发生了以下突变：purR基因起始密码子前第23bp处的A缺失，purR基因起始密码子前第25bp处的A突变为T，purR基因起始密码子前第34bp处的A突变为T；核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的DNA片段I发生了以下突变：purR基因起始密码子前第15bp处的T突变为A，purR基因起始密码子前第34bp处的A突变为T。
作为优选，所述DNA片段II的核苷酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
其中，与核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的野生型DNA片段相比，核苷酸序列如SEQID NO.6所示的DNA片段II发生了以下突变：tal基因终止密码子后第115bp处的C突变为T；核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的DNA片段II发生了以下突变：tal基因终止密码子后第11bp处的C突变为T。
将本发明中的所述DNA片段I和DNA片段II组合后，也能提高核苷产量。作为优选，所述DNA片段包括DNA片段I和DNA片段II，其中，所述DNA片段I的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述DNA片段II的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。通过上述组合后的核苷产量更优。
进一步的，本发明还提供含有所述DNA片段的生物材料。
所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
其中，所述表达盒为在所述核酸的上游或下游连接用于驱动其转录、表达的元件得到的重组核酸分子。
所述载体可为表达载体或克隆载体，包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、转座子等。
所述宿主细胞包括但不限于菌株细胞。
第二方面，本发明提供了所述的DNA片段或生物材料在以下任一方面的应用：
(1)构建高产核苷或其衍生物的菌株；
(2)筛选高产核苷或其衍生物的菌株。
优选所述菌株选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌中的一种。
优选所述核苷为鸟苷、肌苷中的一种或两种。
优选所述衍生物为鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸、肌苷酸、腺苷酸中的一种或多种。
进一步的，本发明还提供一种菌株，其含有所述的DNA片段。
作为优选，所述菌株为具备核苷生产能力的菌株；更优选所述菌株选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌中的一种。
第四方面，本发明还提供所述的菌株在生产核苷或其衍生物中的应用。
具体的，本发明进一步提供一种生产核苷或其衍生物的方法，其包括：培养所述的菌株，以产生、积累和收集核苷或其衍生物。
基于上述技术方案，本发明的有益效果如下：
本发明首次提出了新的purR启动子区域突变和新的tal终止子区域突变，所获得的突变体能够高效生产核苷(尤其包括鸟苷、肌苷及其衍生物)，并成功创造出能够高效生产核苷的微生物，为核苷的工业化生产奠定了基础。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明所用到的菌株B.a 837已在CN2021108586529中公开，其构建过程如下：以菌株DSM7(参见文献Genome sequence of B.amyloliquefaciens type strain DSM7Treveals differences to plant-associated B.amyloliquefaciens FZB42)基因组为模板，引物guaB-1f/1r(SEQ ID NO.20-21)和guaB-2f/3r(SEQ ID NO.22-23)，使用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)扩增出2个片段。用引物guaB-1f/3r将2个片段融合，获得重组片段(ORF区核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示)。将guaBL454F片段与pKSU质粒(pKSU质粒由南开大学王淑芳教授惠赠，参见A markerless genereplacement method forB.amyloliquefaciensLL3and its usein genome reductionand improvement of poly-γ-glutamic acid production[J]，Applied Microbiologyand Biotechnology,2014,98(21):8963-8973.Zhang W,Gao W,Feng J,et al DOI:10.1007/s00253-014-5824-2)经SalI/PstI双酶切、组装、转化等操作后得到重组质粒pKSU-guaBL454F。转化至B.a 836菌株(已公开于CN112574934A)中，用含2.5μg/mL氯霉素的LB平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml LB液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布至含5μg/mL氯霉素的LB平板获得一次重组子；将一次重组子接到5mlLB液体培养基中，42℃200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μM 5-FU的LB平板筛选二次重组子，筛选获得guaBL454F点突变菌株，命名为B.a 837。
pBE43质粒的序列如SEQ ID NO.26所示，通过全基因合成(参考文献Effects ofoverexpression of key enzyme genes on guanosine accumulation in Bacillusamyloliquefaciens)。
实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示(由上至下依次为SEQ ID NO.8-19)。
表1
引物名称 引物序列
PpurR-1f TACAAGCTTGCATGCCTGCAGtcatttttctgtctccccattctt
PpurR-1r TGTACGTTCCTTAAGGAATTCatccgtatgttaagttatattatttttaaattatt
purR-2f ctgccgctgcgacgaaacttcat
purR-2r CCCTGATCTCGACTTCGTTC
purR-3r atgaagtttcgtcgcagcggcag
purR-4r atgtccttgtattctttctcttcgaaatccgtatgttaagttatattatttt
Ttal-1f CTTGCATGCCTGCAGGTCGACttcgaagagaaagaatacaaggacat
Ttal-1r ATATAAAGTGATAGCGGTACCatgttatttttcattgatacagcaaaca
Ttal-2f CTTGCATGCCTGCAGGTCGAC
Ttal-2r cttggcagactggaataaataa
tal-3f ttatttattccagtctgccaagaattgctcg
tal-4f taatataacttaacatacggatttcgaagagaaagaatacaaggacatta
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1：易错PCR获得含多种不同突变启动子的purR基因片段
以DSM7基因组为模板，PpurR-1f/PpurR-1r进行易错PCR扩增。扩增体系为：每50μL体系添加5μL 10×易错PCR缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH 8.3，500mmol/L KCl，1％Triton，20mmol/LMgCl2，5μL 10×dNTP混合物(1mmol/L dGTP，1mmol/L dATP，5mmol/LdCTP，5mmol/L dTTP)；引物PpurR-1f/PpurR-1r各50pmol，质粒DNA模板10ng，5μL的5mmol/LMn2+，15U/μL的Taq DNA聚合酶2.5μL，5μL的25mmol/L的Mg2+，添加灭菌后的超纯水至总体积为50μL。易错PCR程序为:95℃5min；94℃1mi，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。以首次获得的PCR胶回收产物为模板进行下一轮易错PCR，如此反复共5轮易错PCR，最终获得含多种不同突变的基因序列。因上述获得的DNA片段中purR也可能带有突变，为避免purR引入其他突变，使用purR-2f/2r引物将含多种突变的启动子进行扩增，并使用PpurR-1f和purR-3r引物，以DSM7基因组为模板扩增野生型purR片段，将上述含多种突变的Ppur片段与野生型purR基因进行融合，获得含多种不同突变启动子的purR基因片段。
实施例2：purR启动子突变文库的构建
提取pBE43质粒，使用PstI/EcoRI限制性内切酶将质粒线性化，按照组装试剂盒说明书将线性化载体及含多种不同突变启动子的purR基因片段进行组装，组装产物转化至大肠杆菌中。
待菌株长出后，从中挑选单菌，使用抗性及菌落PCR验证，将质粒进行送测，确定其序列，进一步从中挑选出序列不同的质粒。
以下列举通过上述方法获得的8个质粒，其分别命名为pBE43-PpurR1-8。原始启动子对应的质粒为pBE43-PpurR。
实施例3：含不同突变PpurR生产菌株的获得
将8个质粒分别转化至核苷生产菌株B.a 837中，筛选获得的菌株分别命名为Ba.8317-8324。
实施例4：含不同Ppur启动子的菌株产苷性能验证
1、将甘油中保存的菌种37℃过夜培养划出单克隆。
2、挑单菌落接种至30mL种子培养基(g/L：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH7.0～7.2。中，110rpm 37℃培养7～8h)。
3、按10％v/v接种量转接至30ml发酵培养基(g/L：葡萄糖120，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，谷氨酸钠10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH7.0～7.2)中，摇床转速130rpm，35℃培养70h。
4、使用液相色谱仪对发酵液中产苷进行检测，结果见表2，表中结果为三次重复均值。
表2 PurR突变菌株摇瓶发酵产鸟苷及肌苷评估结果
菌株 总苷产量(g/L) 鸟苷产量(g/L) 肌苷产量(g/L) 糖苷转化率提升％
B.a 837 5.4 4.9 0.5 0
B.a 8317 4.3 3.9 0.3 -1.1
B.a 8318 5.7 5.2 0.5 0.5
B.a 8319 2.1 1.9 0.2 -3.4
B.a 8320 5.3 4.7 0.6 0
B.a 8321 9.1 8.2 0.6 3.7
B.a 8322 6.9 6.1 0.6 0.8
B.a 8323 3.2 3.0 0.1 -2.2
B.a 8324 4.5 4.1 0.2 -0.9
由结果可知，突变菌株B.a8318、突变菌株B.a8321和突变菌株B.a8322的效果更优。其中，突变菌株B.a8318(purR起始密码子前第8bp的G突变为A，具体序列信息见SEQ IDNO.2)菌株与出发菌株B.a837相比，鸟苷产量由4.9g/L提高到5.2g/L，糖苷转化率提高0.5％。突变菌株B.a8321(purR起始密码子ATG前23bp处A缺失，ATG前25位及34位A突变为T，具体序列信息见SEQ ID NO.3)菌株与出发菌株B.a837相比，鸟苷产量由4.9g/L提高至8.2g/L，糖苷转化率提高3.7％。突变菌株B.a8322(purR起始密码子ATG前15bp处T突变为A，前第34位A突变为T，具体序列信息见SEQ ID NO.4)菌株与出发菌株B.a837相比，鸟苷产量由4.9g/L提高至6.1g/L，糖苷转化率提高0.8％。
实施例5：易错PCR获得含多种不同突变终止子的tal片段
获得含多种不同终止子的tal片段的方法同实施例1，过程中先使用Ttal-1f/Ttal-1r进行易错PCR，使用Ttal-2f/Ttal-2r扩增突变的终止子序列，再使用tal-3f/1r扩增未突变的tal基因，用Ttal-1f/Ttal-1r，以获得的突变的终止子的PCR产物及野生型的tal基因为模板进行融合PCR，获得突变的基因片段。
实施例6：tal终止子突变文库的构建
提取pBE43质粒，使用KpnI/SalI对质粒进行线性化，将上述获得的片段与线性化质粒进行连接。连接产物转化至大肠杆菌中。
待菌株长出后，从中挑选单菌，使用抗性及菌落PCR验证，将质粒进行送测，确定其序列，进一步从中挑选出序列不同的质粒。
以下列举通过上述方法获得的6个质粒，其分别命名为pBE43-Ttal1-6。原始启动子对应的质粒为pBE43-Ttal。
实施例7：含不同突变Ttal生产菌株的获得
将6个质粒分别转化至核苷生产菌株B.a 837中，筛选获得的菌株分别命名为Ba.8325-8330。
实施例8：tal突变菌株产核苷性能验证
将上述获得的菌株进行摇瓶发酵验证，培养基配方及发酵条件同实施例4，结果见表3，表中结果为三次重复均值。
表3 tal突变菌株摇瓶发酵产鸟苷及肌苷评估结果
菌株 总苷产量(g/L) 鸟苷产量(g/L) 肌苷产量(g/L) 糖苷转化率提升％
B.a 837 5.4 4.9 0.5 0
B.a 8325 5.5 4.9 0.5 0
B.a 8326 6.0 5.6 0.3 0.6
B.a 8327 4.1 4.0 0.1 -1.3
B.a 8328 3.2 2.9 0.1 -2.2
B.a 8329 6.9 6.3 0.5 1.4
B.a 8330 3.8 2.5 1.0 -1.6
由结果可知，突变菌株B.a8326和突变菌株B.a8329的效果更优。其中，突变菌株B.a8326(tal的终止密码子后第115位C突变为T，SEQ ID NO.6)与出发菌株B.a837相比，鸟苷产量由4.9g/L提高到5.6g/L，糖苷转化率提高0.6％。突变菌株B.a8329(tal终止密码子后的第11位C突变为T，SEQ ID NO.7)，鸟苷产量由4.9g/L提高至6.3g/L，糖苷转化率提高1.4％。
实施例9：双突变菌株的构建
分别以pBE43-PpurR-2、pBE43-PpurR-5、pBE43-PpurR-6为模板，PpurR-1f/4r引物扩增出较优的purR突变片段，同时以pBE43-Ttal-2、pBE43-Ttal-5质粒为模板，Ttal-4f/1r扩增出较优的tal突变片段，分别将上述purR及tal片段进行两两融合，共获得6种不同组合的突变片段，再将PBE43质粒使用PstI/KpnI进行线性化，获得的片段及质粒进行组装连接，连接产物转化至大肠杆菌中，获得的质粒进行测序验证。验证正确后，将质粒分别转化至B.a 837菌株中，获得的菌株分别命名为B.a 8331-B.a 8336。
实施例10：双突变菌株产苷性能验证
培养基配方同实施例4，验证结果见下表4，令人感到惊讶的是，将效果最佳的purR突变及tal突变同时转化至核苷生产菌株中，并未表现出最佳的产苷情况。反而有轻微下降，最佳组合为pBE43-PpurR-5+pBE43-Ttal-2(简写为R5+L2，表中简写同理)，具体产苷等情况见下表4，表中结果为三次重复均值。
表4双突变菌株摇瓶发酵产鸟苷及肌苷评估结果
上述突变位点可应用于解淀粉芽孢杆菌，但不限于解淀粉芽孢杆菌，还可应用于如枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌、大肠杆菌等宿主菌，同时，其可用于产肌苷、鸟苷等核苷或对应的核苷衍生物，如次黄嘌呤、肌苷酸、鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸等，但不限于上述核苷及其衍生物的生产。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 冯波
<120> 可提高核苷产量的DNA片段、菌株和生产方法
<130> KHP211121299.8
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 932
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acagaatgct cttgattaaa tccgtatgtt aagttatatt atttttaaat tattcggatt 60
ttgggggtaa gttcatgaag tttcgtcgca gcggcagatt ggtggactta acaaattatt 120
tgttaaccca tccgcatgaa ttaataccgt taacgttttt ctcagaacgg tatcaatcag 180
caaagtcatc aatcagtgaa gatttaacaa ttattaaaca gaccttcgaa cagcaaggca 240
ttgggacgct gcttacagtg ccgggagctg ccggaggcgt caaatatatt ccgaaagtaa 300
aacaggctga agcagaagcg tttatacagg agctgggaca gtctttagta aatcctgagc 360
gtatccttcc gggcggttat gtatatttaa cggatatctt aggcaaacct tctgtcctct 420
ctaatgcagg caggcttttt gcttccgttt ttgcggagcg ggagattgat gtggtgatga 480
ccgttgcgac aaaaggaatc cctcttgctt acgcagcggc cagttatctg aacgttccgg 540
ttgtcatcgt acgaaaagac aataaagtga cggaaggctc tacagtgagc atcaattatg 600
tatcagggtc gtctaaccgc attcaaacaa tgtcgcttgc gaaaagaagt ttggccacgg 660
ggtcgaacgt tttgattatt gacgacttta tgaaagccgg cggcacaatt aacggcatga 720
tcagcctgct tgatgagttt aatgcgaacg tcgcgggtat aggcgtcttg gttgaagctg 780
agggagtgaa tgaacggctt gtcgatgaat acatgtcgct gcttaccctt tcaaccatca 840
acatgaaaga caaaacgatt gagattcaaa acggcaattt tctgcgattt tttaaagaac 900
agcatttaaa gaatggggag acagaaaaat ga 932
<210> 2
<211> 932
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acagaatgct cttgattaaa tccgtatgtt aagttatatt atttttaaat tattcggatt 60
ttggggataa gttcatgaag tttcgtcgca gcggcagatt ggtggactta acaaattatt 120
tgttaaccca tccgcatgaa ttaataccgt taacgttttt ctcagaacgg tatcaatcag 180
caaagtcatc aatcagtgaa gatttaacaa ttattaaaca gaccttcgaa cagcaaggca 240
ttgggacgct gcttacagtg ccgggagctg ccggaggcgt caaatatatt ccgaaagtaa 300
aacaggctga agcagaagcg tttatacagg agctgggaca gtctttagta aatcctgagc 360
gtatccttcc gggcggttat gtatatttaa cggatatctt aggcaaacct tctgtcctct 420
ctaatgcagg caggcttttt gcttccgttt ttgcggagcg ggagattgat gtggtgatga 480
ccgttgcgac aaaaggaatc cctcttgctt acgcagcggc cagttatctg aacgttccgg 540
ttgtcatcgt acgaaaagac aataaagtga cggaaggctc tacagtgagc atcaattatg 600
tatcagggtc gtctaaccgc attcaaacaa tgtcgcttgc gaaaagaagt ttggccacgg 660
ggtcgaacgt tttgattatt gacgacttta tgaaagccgg cggcacaatt aacggcatga 720
tcagcctgct tgatgagttt aatgcgaacg tcgcgggtat aggcgtcttg gttgaagctg 780
agggagtgaa tgaacggctt gtcgatgaat acatgtcgct gcttaccctt tcaaccatca 840
acatgaaaga caaaacgatt gagattcaaa acggcaattt tctgcgattt tttaaagaac 900
agcatttaaa gaatggggag acagaaaaat ga 932
<210> 3
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acagaatgct cttgattaaa tccgtatgtt aagttatatt ttttttaatt tttcggattt 60
tgggggtaag ttcatgaagt ttcgtcgcag cggcagattg gtggacttaa caaattattt 120
gttaacccat ccgcatgaat taataccgtt aacgtttttc tcagaacggt atcaatcagc 180
aaagtcatca atcagtgaag atttaacaat tattaaacag accttcgaac agcaaggcat 240
tgggacgctg cttacagtgc cgggagctgc cggaggcgtc aaatatattc cgaaagtaaa 300
acaggctgaa gcagaagcgt ttatacagga gctgggacag tctttagtaa atcctgagcg 360
tatccttccg ggcggttatg tatatttaac ggatatctta ggcaaacctt ctgtcctctc 420
taatgcaggc aggctttttg cttccgtttt tgcggagcgg gagattgatg tggtgatgac 480
cgttgcgaca aaaggaatcc ctcttgctta cgcagcggcc agttatctga acgttccggt 540
tgtcatcgta cgaaaagaca ataaagtgac ggaaggctct acagtgagca tcaattatgt 600
atcagggtcg tctaaccgca ttcaaacaat gtcgcttgcg aaaagaagtt tggccacggg 660
gtcgaacgtt ttgattattg acgactttat gaaagccggc ggcacaatta acggcatgat 720
cagcctgctt gatgagttta atgcgaacgt cgcgggtata ggcgtcttgg ttgaagctga 780
gggagtgaat gaacggcttg tcgatgaata catgtcgctg cttacccttt caaccatcaa 840
catgaaagac aaaacgattg agattcaaaa cggcaatttt ctgcgatttt ttaaagaaca 900
gcatttaaag aatggggaga cagaaaaatg a 931
<210> 4
<211> 932
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acagaatgct cttgattaaa tccgtatgtt aagttatatt ttttttaaat tattcggata 60
ttgggggtaa gttcatgaag tttcgtcgca gcggcagatt ggtggactta acaaattatt 120
tgttaaccca tccgcatgaa ttaataccgt taacgttttt ctcagaacgg tatcaatcag 180
caaagtcatc aatcagtgaa gatttaacaa ttattaaaca gaccttcgaa cagcaaggca 240
ttgggacgct gcttacagtg ccgggagctg ccggaggcgt caaatatatt ccgaaagtaa 300
aacaggctga agcagaagcg tttatacagg agctgggaca gtctttagta aatcctgagc 360
gtatccttcc gggcggttat gtatatttaa cggatatctt aggcaaacct tctgtcctct 420
ctaatgcagg caggcttttt gcttccgttt ttgcggagcg ggagattgat gtggtgatga 480
ccgttgcgac aaaaggaatc cctcttgctt acgcagcggc cagttatctg aacgttccgg 540
ttgtcatcgt acgaaaagac aataaagtga cggaaggctc tacagtgagc atcaattatg 600
tatcagggtc gtctaaccgc attcaaacaa tgtcgcttgc gaaaagaagt ttggccacgg 660
ggtcgaacgt tttgattatt gacgacttta tgaaagccgg cggcacaatt aacggcatga 720
tcagcctgct tgatgagttt aatgcgaacg tcgcgggtat aggcgtcttg gttgaagctg 780
agggagtgaa tgaacggctt gtcgatgaat acatgtcgct gcttaccctt tcaaccatca 840
acatgaaaga caaaacgatt gagattcaaa acggcaattt tctgcgattt tttaaagaac 900
agcatttaaa gaatggggag acagaaaaat ga 932
<210> 5
<211> 839
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgttatttt tcattgatac agcaaacatt gacgagatta aagaagctta tgaacttggc 60
gttcttgccg gagttacgac aaaccctagt ttagtggcaa aagaagctga cgtgtctttc 120
catgacagac tgcgtgagat tacggaagtc gtgaaaggat ctgtaagcgc ggaagtcatt 180
tccctgaacg ctgaagaaat gattgaagaa ggtaaagaac ttgcgaaaat cgcgccgaat 240
atcacggtaa aaattccgat gacgtctgaa ggattaaaag ccgtaaaagc gctgagcgac 300
ctgaacatta aaacaaacgt gacgctcatc ttcagcgcca accaggcgct tttggccgcc 360
agagccggag cgacttatgt ttctccgttc ttaggccgtc tggatgatat cggtcataac 420
ggtcttgaac tgatttcaga aataagacag atttttgacc ttcatgacat tgatacacaa 480
atcatcgcag cttccatccg tcatgcgcag cacgtgactg aagccgcttt acgcggtgcc 540
catatcggta cgatgccgct gaaagttatt caccagctga caaagcaccc gttaacggat 600
aaaggcatcg agcaattctt ggcagactgg aataaataag ggcgaaaagg gcggcaaacc 660
ggttgcatcc gtttgccgca cccttatgtt ttcctgtttg acggcgggcc ttcaatatca 720
aagttccccg gaatgtaaac ccggcgggtc tctgtgcatc ctatgttaaa aatgccccgc 780
aaagcttcgc tattttcttc ctgttatttt ataatgtcct tgtattcttt ctcttcgaa 839
<210> 6
<211> 839
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgttatttt tcattgatac agcaaacatt gacgagatta aagaagctta tgaacttggc 60
gttcttgccg gagttacgac aaaccctagt ttagtggcaa aagaagctga cgtgtctttc 120
catgacagac tgcgtgagat tacggaagtc gtgaaaggat ctgtaagcgc ggaagtcatt 180
tccctgaacg ctgaagaaat gattgaagaa ggtaaagaac ttgcgaaaat cgcgccgaat 240
atcacggtaa aaattccgat gacgtctgaa ggattaaaag ccgtaaaagc gctgagcgac 300
ctgaacatta aaacaaacgt gacgctcatc ttcagcgcca accaggcgct tttggccgcc 360
agagccggag cgacttatgt ttctccgttc ttaggccgtc tggatgatat cggtcataac 420
ggtcttgaac tgatttcaga aataagacag atttttgacc ttcatgacat tgatacacaa 480
atcatcgcag cttccatccg tcatgcgcag cacgtgactg aagccgcttt acgcggtgcc 540
catatcggta cgatgccgct gaaagttatt caccagctga caaagcaccc gttaacggat 600
aaaggcatcg agcaattctt ggcagactgg aataaataag ggcgaaaagg gcggcaaacc 660
ggttgcatcc gtttgccgca cccttatgtt ttcctgtttg acggcgggcc ttcaatatca 720
aagttccccg gaatgtaaac ccggcgggtc tctatgcatc ctatgttaaa aatgccccgc 780
aaagcttcgc tattttcttc ctgttatttt ataatgtcct tgtattcttt ctcttcgaa 839
<210> 7
<211> 839
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgttatttt tcattgatac agcaaacatt gacgagatta aagaagctta tgaacttggc 60
gttcttgccg gagttacgac aaaccctagt ttagtggcaa aagaagctga cgtgtctttc 120
catgacagac tgcgtgagat tacggaagtc gtgaaaggat ctgtaagcgc ggaagtcatt 180
tccctgaacg ctgaagaaat gattgaagaa ggtaaagaac ttgcgaaaat cgcgccgaat 240
atcacggtaa aaattccgat gacgtctgaa ggattaaaag ccgtaaaagc gctgagcgac 300
ctgaacatta aaacaaacgt gacgctcatc ttcagcgcca accaggcgct tttggccgcc 360
agagccggag cgacttatgt ttctccgttc ttaggccgtc tggatgatat cggtcataac 420
ggtcttgaac tgatttcaga aataagacag atttttgacc ttcatgacat tgatacacaa 480
atcatcgcag cttccatccg tcatgcgcag cacgtgactg aagccgcttt acgcggtgcc 540
catatcggta cgatgccgct gaaagttatt caccagctga caaagcaccc gttaacggat 600
aaaggcatcg agcaattctt ggcagactgg aataaataag ggcgaaaaga gcggcaaacc 660
ggttgcatcc gtttgccgca cccttatgtt ttcctgtttg acggcgggcc ttcaatatca 720
aagttccccg gaatgtaaac ccggcgggtc tctgtgcatc ctatgttaaa aatgccccgc 780
aaagcttcgc tattttcttc ctgttatttt ataatgtcct tgtattcttt ctcttcgaa 839
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tacaagcttg catgcctgca gtcatttttc tgtctcccca ttctt 45
<210> 9
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtacgttcc ttaaggaatt catccgtatg ttaagttata ttatttttaa attatt 56
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgccgctgc gacgaaactt cat 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccctgatctc gacttcgttc 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgaagtttc gtcgcagcgg cag 23
<210> 13
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgtccttgt attctttctc ttcgaaatcc gtatgttaag ttatattatt tt 52
<210> 14
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttgcatgcc tgcaggtcga cttcgaagag aaagaataca aggacat 47
<210> 15
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atataaagtg atagcggtac catgttattt ttcattgata cagcaaaca 49
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cttgcatgcc tgcaggtcga c 21
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cttggcagac tggaataaat aa 22
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttatttattc cagtctgcca agaattgctc g 31
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
taatataact taacatacgg atttcgaaga gaaagaatac aaggacatta 50
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
taaggatcct ctagagtcga cacgcgtcgt tgcaggcgta 40
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
attgagcttc ttctctaaaa gcgcgcaagt ctttt 35
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gacttgcgcg cttttagaga agaagctcaa ttta 34
<210> 23
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gccaagcttg catgcctgca gcataatcat caggagtata cgtttggt 48
<210> 24
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atgtgggaaa gtaaattttc aaaagaaggc ttaacgttcg atgatgtact gctcgtacca 60
gctcaatcag acgtacttcc gcgtgatgtg gatttgtctg ttgaactgac aaaaacgtta 120
aagcttaata ttcctgtcat cagtgcagga atggatacag taacagaatc agcaatggcg 180
attgcgatgg cccgacaagg cggcttgggc attattcata aaaacatgtc catcgaacag 240
caggctgaac atgttgacaa agtcaaacgt tctgaacggg gcgttattac aaatcccttc 300
tttttaacac ctgatcatca agtattcgat gcggagcatt tgatggggaa atacagaatt 360
tccggtgttc cgatcgtaga taataaagac gatcaaaagc tggtcggtat cattacaaac 420
cgcgatcttc gctttatctc tgattattca atgaaaatca gtgatgttat gacaaaagaa 480
gagctggtta cggctcctgt gggaaccaca ttagacgaag cggaaaaaat cttgcagaag 540
cataaaattg aaaaacttcc attagtggat gaccaaaaca aattaaaagg tcttatcacg 600
atcaaagata ttgaaaaggt tatcgaattc ccgaattcat ctaaagatga acacggacgc 660
ctgatcgtcg gcgctgcggt aggcgtgaca ggtgatacaa tgactcgtgt cagcaagctt 720
gttgaagcga atgtcgacgt tatcgtggtt gatacggctc acggacattc cagaggcgta 780
ctgaacacag ttgcgaaaat ccgtgagaca tatcctgaat tgaacattat cgcaggaaat 840
gttgctacgg ctgaagcgac aaaggctttg attgaagccg gagcaaacat tgtaaaagtg 900
ggaatcggac ctggatctat ctgtacgaca cgcgtcgttg caggcgtagg tgtaccgcaa 960
atcactgcga tttatgattg tgccactgaa gcgagaaaac acggcgcaac aattatcgcg 1020
gacggcggta ttaaattctc cggagatatt acgaaagcat tggcatccgg cggacatgct 1080
gtcatgcttg gaagcctgct tgccggtact tcagaaagcc cgggcgaaac tgaaatctat 1140
caaggcagaa gatttaaagt gtatcgcggt atgggttctg tcgctgccat ggaaaaaggc 1200
agtaaagacc gatatttcca agaagaaaat aagaaattcg tccctgaagg tatcgaagga 1260
cggactccgt acaaaggtcc tgtagaagaa acagtgtatc agcttgtcgg cggtcttcgt 1320
tcaggtatgg gatattgcgg ttcaaaagac ttgcgcgctt ttagagaaga agctcaattt 1380
atccgtatga caggagcagg tcttcgcgaa agccatccgc atgatgtcca aatcacgaag 1440
gaatcaccaa actacacaat ctcataa 1467
<210> 25
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Met Trp Glu Ser Lys Phe Ser Lys Glu Gly Leu Thr Phe Asp Asp Val
1 5 10 15
Leu Leu Val Pro Ala Gln Ser Asp Val Leu Pro Arg Asp Val Asp Leu
20 25 30
Ser Val Glu Leu Thr Lys Thr Leu Lys Leu Asn Ile Pro Val Ile Ser
35 40 45
Ala Gly Met Asp Thr Val Thr Glu Ser Ala Met Ala Ile Ala Met Ala
50 55 60
Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ile Ile His Lys Asn Met Ser Ile Glu Gln
65 70 75 80
Gln Ala Glu His Val Asp Lys Val Lys Arg Ser Glu Arg Gly Val Ile
85 90 95
Thr Asn Pro Phe Phe Leu Thr Pro Asp His Gln Val Phe Asp Ala Glu
100 105 110
His Leu Met Gly Lys Tyr Arg Ile Ser Gly Val Pro Ile Val Asp Asn
115 120 125
Lys Asp Asp Gln Lys Leu Val Gly Ile Ile Thr Asn Arg Asp Leu Arg
130 135 140
Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Met Lys Ile Ser Asp Val Met Thr Lys Glu
145 150 155 160
Glu Leu Val Thr Ala Pro Val Gly Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys
165 170 175
Ile Leu Gln Lys His Lys Ile Glu Lys Leu Pro Leu Val Asp Asp Gln
180 185 190
Asn Lys Leu Lys Gly Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ile Glu Lys Val Ile
195 200 205
Glu Phe Pro Asn Ser Ser Lys Asp Glu His Gly Arg Leu Ile Val Gly
210 215 220
Ala Ala Val Gly Val Thr Gly Asp Thr Met Thr Arg Val Ser Lys Leu
225 230 235 240
Val Glu Ala Asn Val Asp Val Ile Val Val Asp Thr Ala His Gly His
245 250 255
Ser Arg Gly Val Leu Asn Thr Val Ala Lys Ile Arg Glu Thr Tyr Pro
260 265 270
Glu Leu Asn Ile Ile Ala Gly Asn Val Ala Thr Ala Glu Ala Thr Lys
275 280 285
Ala Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Gly Ile Gly Pro
290 295 300
Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg Val Val Ala Gly Val Gly Val Pro Gln
305 310 315 320
Ile Thr Ala Ile Tyr Asp Cys Ala Thr Glu Ala Arg Lys His Gly Ala
325 330 335
Thr Ile Ile Ala Asp Gly Gly Ile Lys Phe Ser Gly Asp Ile Thr Lys
340 345 350
Ala Leu Ala Ser Gly Gly His Ala Val Met Leu Gly Ser Leu Leu Ala
355 360 365
Gly Thr Ser Glu Ser Pro Gly Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Gly Arg Arg
370 375 380
Phe Lys Val Tyr Arg Gly Met Gly Ser Val Ala Ala Met Glu Lys Gly
385 390 395 400
Ser Lys Asp Arg Tyr Phe Gln Glu Glu Asn Lys Lys Phe Val Pro Glu
405 410 415
Gly Ile Glu Gly Arg Thr Pro Tyr Lys Gly Pro Val Glu Glu Thr Val
420 425 430
Tyr Gln Leu Val Gly Gly Leu Arg Ser Gly Met Gly Tyr Cys Gly Ser
435 440 445
Lys Asp Leu Arg Ala Phe Arg Glu Glu Ala Gln Phe Ile Arg Met Thr
450 455 460
Gly Ala Gly Leu Arg Glu Ser His Pro His Asp Val Gln Ile Thr Lys
465 470 475 480
Glu Ser Pro Asn Tyr Thr Ile Ser
485
<210> 26
<211> 6638
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaatacaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat ccccgggtac cgctatcact 60
ttatatttta cataatcgcg cgcttttttt cacgcccatt tctaaaaatg taaaataaat 120
gtaagaattt tcagccatta cagctttggc aaaaaaataa gtaaaccaat gatacacgaa 180
atcacggcaa aaacgcaaac agccccggcg gcagcgtcct tggccgcttt agcaagaggg 240
tgatgtttgt cagttattaa atcaaccgta tgttcaatgg ctgtatttaa aagttcaagc 300
gaaaacatac cacctatcaa aaggaatata atcatccact caataatgct gagctcgaat 360
tccttaagga acgtacagac ggcttaaaag cctttaaaaa cgtttttaag gggtttgtag 420
acaaggtaaa ggataaaaca gcacaattcc aagaaaaaca cgatttagaa cctaaaaaga 480
acgaatttga actaactcat aaccgagagg taaaaaaaga acgaagtcga gatcagggaa 540
tgagtttata aaataaaaaa agcacctgaa aaggtgtctt tttttgatgg ttttgaactt 600
gttctttctt atcttgatac atatagaaat aacgtcattt ttattttagt tgctgaaagg 660
tgcgttgaag tgttggtatg tatgtgtttt aaagtattga aaacccttaa aattggttgc 720
acagaaaaac cccatctgtt aaagttataa gtgactaaac aaataactaa atagatgggg 780
gtttctttta atattatgtg tcctaatagt agcatttatt cagatgaaaa atcaagggtt 840
ttagtggaca agacaaaaag tggaaaagtg agaccatgga gagaaaagaa aatcgctaat 900
gttgattact ttgaacttct gcatattctt gaatttaaaa aggctgaaag agtaaaagat 960
tgtgctgaaa tattagagta taaacaaaat cgtgaaacag gcgaaagaaa gttgtatcga 1020
gtgtggtttt gtaaatccag gctttgtcca atgtgcaact ggaggagagc aatgaaacat 1080
ggcattcagt cacaaaaggt tgttgctgaa gttattaaac aaaagccaac agttcgttgg 1140
ttgtttctca cattaacagt taaaaatgtt tatgatggcg aagaattaaa taagagtttg 1200
tcagatatgg ctcaaggatt tcgccgaatg atgcaatata aaaaaattaa taaaaatctt 1260
gttggtttta tgcgtgcaac ggaagtgaca ataaataata aagataattc ttataatcag 1320
cacatgcatg tattggtatg tgtggaacca acttatttta agaatacaga aaactacgtg 1380
aatcaaaaac aatggattca attttggaaa aaggcaatga aattagacta tgatccaaat 1440
gtaaaagttc aaatgattcg accgaaaaat aaatataaat cggatataca atcggcaatt 1500
gacgaaactg caaaatatcc tgtaaaggat acggatttta tgaccgatga tgaagaaaag 1560
aatttgaaac gtttgtctga tttggaggaa ggtttacacc gtaaaaggtt aatctcctat 1620
ggtggtttgt taaaagaaat acataaaaaa ttaaaccttg atgacacaga agaaggcgat 1680
ttgattcata cagatgatga cgaaaaagcc gatgaagatg gattttctat tattgcaatg 1740
tggaattggg aacggaaaaa ttattttatt aaagagtagt tcaacaaacg ggccagtttg 1800
ttgaagatta gatgctataa ttgttattaa aaggattgaa ggatgcttag gaagacgagt 1860
tattaatagc tgaataagaa cggtgctctc caaatattct tatttagaaa agcaaatcta 1920
aaattatctg aaaagggaat gagaatagtg aatggaccaa taataatgac tagagaagaa 1980
agaatgaaga ttgttcatga aattaaggaa cgaatattgg ataaatatgg ggatgatgtt 2040
aaggctattg gtgtttatgg ctctcttggt cgtcagactg atgggcccta ttcggatatt 2100
gagatgatgt gtgtcatgtc aacagaggaa gcagagttca gccatgaatg gacaaccggt 2160
gagtggaagg tggaagtgaa ttttgatagc gaagagattc tactagatta tgcatctcag 2220
gtggaatcag attggccgct tacacatggt caatttttct ctattttgcc gatttatgat 2280
tcaggtggat acttagagaa agtgtatcaa actgctaaat cggtagaagc ccaaacgttc 2340
cacgatgcga tttgtgccct tatcgtagaa gagctgtttg aatatgcagg caaatggcgt 2400
aatattcgtg tgcaaggacc gacaacattt ctaccatcct tgactgtaca ggtagcaatg 2460
gcaggtgcca tgttgattgg tctgcatcat cgcatctgtt atacgacgag cgcttcggtc 2520
ttaactgaag cagttaagca atcagatctt ccttcaggtt atgaccatct gtgccagttc 2580
gtaatgtctg gtcaactttc cgactctgag aaacttctgg aatcgctaga gaatttctgg 2640
aatgggattc aggagtggac agaacgacac ggatatatag tggatgtgtc aaaacgcata 2700
ccattttgaa cgatgacctc taataattgt taatcatgtt ggttacgtat ttattaactt 2760
ctcctagtat tagtaattat catggctgtc atggcgcatt aacggaataa agggtgtgct 2820
taaatcgggc cattttgcgt aataagaaaa aggattaatt atgagcgaat tgaattaata 2880
ataaggtaat agatttacat tagaaaatga aaggggattt tatgcgtgag aatgttacag 2940
tctatcccgg cattgccagt cggggatatt aaaaagagta taggttttta ttgcgataaa 3000
ctaggtttca ctttggttca ccatgaagat ggattcgcag ttctaatgtg taatgaggtt 3060
cggattcatc tatgggaggc aagtgatgaa gctggcgctc tcgtagtaat gattcaccgg 3120
tttgtacagg tgcggagtcg tttattgctg gtactgctag ttgccgcatt gaagtagagg 3180
gaattgatga attatatcaa catattaagc ctttgggcat tttgcacccc aatacatcat 3240
taaaagatca gtggtgggat gaacgagact ttgcagtaat tgatcccgac aacaatttga 3300
ttagcttttt tcaacaaata aaaagctaaa atctattatt aatctgttca gcaatcgggc 3360
gcgattgctg aataaaagat acgagagacc tctcttgtat cttttttatt ttgagtggtt 3420
ttgtccgtta cactagaaaa ccgaaagaca ataaaaattt tattcttgct gagtctggct 3480
ttcggtaagc tagacaaaac ggacaaaata aaaattggca agggtttaaa ggtggagatt 3540
ttttgagtga tcttctcaaa aaatactacc tgtcccttgc tgatttttaa acgagcacga 3600
gagcaaaacc cccctttgct gaggtggcag agggcaggtt tttttgtttc ttttttctcg 3660
taaaaaaaag aaaggtctta aaggttttat ggttttggtc ggcactgccg acagcctcgc 3720
agagcacaca ctttatgaat ataaagtata gtgtgttata ctttacttgg aagtggttgc 3780
cggaaagagc gaaaatgcct cacatttgtg ccacctaaaa aggagcgatt tacatatgag 3840
ttatgcagtt tgtagaatgc aaaaagtgaa atcagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 3900
cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 3960
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 4020
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 4080
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 4140
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 4200
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 4260
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 4320
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 4380
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 4440
acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 4500
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 4560
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 4620
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 4680
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 4740
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 4800
agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 4860
ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 4920
gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 4980
catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 5040
cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 5100
cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 5160
gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 5220
tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 5280
gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 5340
tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 5400
gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 5460
gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 5520
taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 5580
tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 5640
ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 5700
taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 5760
tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 5820
aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 5880
ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt 5940
tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc 6000
tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt 6060
gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatcg 6120
acgctctccc ttatgcgact cctgcattag gaagcagccc agtagtaggt tgaggccgtt 6180
gagcaccgcc gccgcaagga atggtgcaag gagatggcgc ccaacagtcc cccggccacg 6240
gggcctgcca ccatacccac gccgaaacaa gcgctcatga gcccgaagtg gcgagcccga 6300
tcttccccat cggtgatgtc ggcgatatag gcgccagcaa ccgcacctgt ggcgccggtg 6360
atgccggcca cgatgcgtcc ggcgtagagg atctggctag cgatgaccct gctgattggt 6420
tcgctgacca tttccggggt gcggaacggc gttaccagaa actcagaagg ttcgtccaac 6480
caaaccgact ctgacggcag tttacgagag agatgatagg gtctgcttca gtaagccaga 6540
tgctacacaa ttaggcttgt acatattgtc gttagaacgc ggctacaatt aatacataac 6600
cttatgtatc atacacatac gatttaggtg acactata 6638

Claims (10)

1.DNA片段，其特征在于，其包括如下的DNA片段I和/或DNA片段II；
1)DNA片段I，其在核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段的基础上发生以下至少一个突变：
a)purR基因起始密码子前第8bp处的G突变为A；
b)purR基因起始密码子前第15bp处的T突变为A；
c)purR基因起始密码子前第23bp处的A缺失；
d)purR基因起始密码子前第25bp处的A突变为T；
e)purR基因起始密码子前第34bp处的A突变为T；
2)DNA片段II，其在核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的DNA片段的基础上发生以下至少一个突变：
f)tal基因终止密码子后第11bp处的C突变为T；
g)tal基因终止密码子后第115bp处的C突变为T。
2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段I的核苷酸序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段II的核苷酸序列如SEQID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段包括DNA片段I和DNA片段II，其中，所述DNA片段I的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述DNA片段II的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.含有权利要求1-4中任一项所述的DNA片段的生物材料。
6.权利要求1-4中任一项所述的DNA片段或权利要求5所述的生物材料在以下任一方面的应用：
(1)构建高产核苷或其衍生物的菌株；
(2)筛选高产核苷或其衍生物的菌株；
优选所述菌株选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌中的一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述核苷为鸟苷、肌苷中的一种或两种；和/或
所述衍生物为鸟嘌呤、鸟苷酸、核黄素、二乙酰鸟苷酸、肌苷酸、腺苷酸中的一种或多种。
8.一种菌株，其特征在于，其含有权利要求1-4中任一项所述的DNA片段。
9.根据权利要求8所述的菌株，其特征在于，所述菌株为具备核苷生产能力的菌株；优选所述菌株选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌中的一种。
10.一种生产核苷或其衍生物的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求8或9所述的菌株，以产生、积累和收集核苷或其衍生物。
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