JP2017042173A - ゲノム修飾のための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】宿主細胞ゲノムの1つ以上の選択される標的部位の中に1つ以上の外因性の核酸を組み込むための方法が、本明細書において提供される。ある実施形態において、方法が、宿主細胞ゲノムを、ゲノムの標的部位の中に組み込まれることとなる外因性の核酸およびゲノム標的部位の近くでまたはゲノム標的部位内で二本鎖切断を引き起こすことができるヌクレアーゼを含む、1つ以上の組み込みポリヌクレオチドと接触させるステップを含む。いくつかの実施形態において、複数の外因性の核酸が、1回の形質転換反応により同時に組み込まれる。いくつかの実施形態において、方法が、ゲノムにおける特定の位置でのドナーDNAの組み込みを促進するための、細胞の中への1つ以上のヌクレアーゼおよび1つ以上のドナーDNAアセンブリの導入を含む。
【選択図】なし
Description
この出願は、2011年4月27日に出願された米国仮出願第61/479,821号;2011年6月24日に出願された米国仮出願第61/500,741号;および2011年9月26日に出願された米国仮出願第61/539,389号(これらの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される)の優先権の利益を主張する。
本明細書において提供される方法および組成物は、一般に、分子生物学および遺伝子工学の分野に関する。
宿主細胞ゲノムの中に外因性の核酸を導入し、かつ組み込むための遺伝子工学技術は、様々な分野において必要とされる。たとえば、合成生物学の分野において、遺伝子修飾株の生成は、宿主細胞の染色体の中への、注文生産のDNA配列の挿入を必要とし、一般に、工業規模の産生は、宿主生物の中への数十の遺伝子の導入を必要とする。工業用株についての設計の最適化は、経験的に到達し、多くのDNAアセンブリの構築ならびに単独でおよび/または他の生合成経路構成成分と共にインビボにおいて試験することを必要とする。
Rev Genet 11(9):636−646(2010))。顕著な効果があるが、DSB媒介性のHRは、たとえば、工業用微生物における機能的な代謝経路の構築に向けて、複数のDNAアセンブリを組み込むのに必要とされる複数回の操作を減らすためにはまだ活用されていない。
宿主細胞の特定のゲノム遺伝子座の中に1つ以上の外因性の核酸を組み込むための方法および組成物が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、複数の外因性の核酸が、1回の形質転換反応により同時に組み込まれる。いくつかの実施形態において、方法が、ゲノムにおける特定の位置でのドナーDNAの組み込みを促進するための、細胞の中への1つ以上のヌクレアーゼおよび1つ以上のドナーDNAアセンブリの導入を含む。方法および組成物は、宿主細胞の本来の相同組換え機構を利用し、この組換えは、組み込みの意図される部位での宿主細胞のゲノムにおける標的二本鎖切断を誘発することによってさらに増強される。
(a)宿主細胞を、
(i)複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xを含み、(HR1)xおよび(HR2)xが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)xで(ES)xの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸;ならびに
(ii)それぞれの前記標的部位(TS)xについて、(TS)xで切断することができるヌクレアーゼ(N)xであって、前記切断が、(TS)xでの(ES)xの相同組換えをもたらすヌクレアーゼ(N)xと接触させるステップならびに
(b)宿主細胞を回収するステップであって、選択された外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、それぞれの選択された標的配列(TS)xで組み込まれるステップを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である、方法が本明細書において提供される。
(a)宿主酵母細胞を、
(i)第1の相同性領域(HR1)および第2の相同性領域(HR2)を含む外因性の核酸(ES)であって、(HR1)および(HR2)が、前記標的部位(TS)で宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸(ES)ならびに
(ii)(TS)で切断することができるヌクレアーゼ(N)であって、前記切断が、(TS)での(ES)の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼ(N)
と接触させるステップ
ならびに
(b)(TS)で組み込まれた(ES)を有する宿主細胞を回収するステップであって、前記回収するステップが、選択マーカーの組み込みを必要としない、ステップ、を含む方法が本明細書において提供される。
(a)複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xを含み、(HR1)xおよび(HR2)xが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)xで(ES)xの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸;ならびに
(b)それぞれの前記標的部位(TS)xについて、(TS)xで切断することができるヌクレアーゼ(N)xであって、前記切断が、(TS)xでの(ES)xの相同組換えをもたらすヌクレアーゼ(N)xを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である。
(a)第1の相同性領域(HR1)および第2の相同性領域(HR2)を含む外因性の核酸(ES)であって、(HR1)および(HR2)が、宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)で宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸(ES)ならびに
(b)(TS)で切断することができるヌクレアーゼ(N)であって、前記切断が、(TS)での(ES)の相同組換えをもたらすヌクレアーゼ(N)を含み、
(ES)が、選択マーカーを含まない。
(a)酵母細胞、
(b)複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、
(i)第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xであって、(HR1)xおよび(HR2)xが、酵母細胞ゲノムの選択される標的部位(TS)xで(ES)xの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xならびに
(ii)(HR1)xの3’および(HR2)xの5’に位置づけられる目的の核酸(D)xを含む、複数の外因性の核酸、
(c)複数のヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ(N)xが、それぞれ、(TS)xで切断することができ、前記切断が、(TS)xでの(ES)xの相同組換えをもたらす複数のヌクレアーゼを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である、組成物が、本明細書において提供される。
(a)複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、
(i)第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xであって、(HR1)xおよび(HR2)xが、酵母細胞ゲノムの選択される標的部位(TS)xで(ES)xの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xならびに
(ii)(HR1)xの3’および(HR2)xの5’に位置づけられる目的の核酸(D)xを含む、複数の外因性の核酸、
(b)複数のヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ(N)xが、それぞれ、(TS)xで切断することができ、前記切断が、(TS)xでの(ES)xの相同組換えをもたらす複数のヌクレアーゼを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
宿主細胞ゲノムの中に複数の外因性の核酸を組み込むための方法であって、
(a)宿主細胞を、
(i)複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xを含み、(HR1)xおよび(HR2)xが、上記宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)xで(ES)xの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸;ならびに
(ii)それぞれの上記標的部位(TS)xについて、(TS)xで切断することができるヌクレアーゼ(N)xであって、上記切断が、(TS)xでの(ES)xの相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼと接触させるステップ
ならびに
(b)宿主細胞を回収するステップであって、選択された外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、それぞれの選択された標的配列(TS)xで組み込まれている、ステップを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である、方法。
(項目2)
(HR1)xが、(TS)xの5’領域に対して相同であり、(HR2)xが、(TS)xの3’領域に対して相同である、項目1に記載の方法。
(項目3)
(N)xが、(TS)xの上記5’領域と上記3’領域との間に位置づけられる領域で切断することができる、項目1に記載の方法。
(項目4)
単一のヌクレアーゼが、それぞれの(TS)xを切断することができる、項目1に記載の方法。
(項目5)
n=3、4、5、6、7、8、9、または10である、項目1に記載の方法。
(項目6)
上記回収するステップが、選択マーカーの組み込みを必要としない、項目1に記載の方法。
(項目7)
上記回収するステップが、上記標的部位で切断することができるヌクレアーゼと上記宿主細胞を接触させないことと比較して、より高い頻度で起こる、項目1に記載の方法。
(項目8)
上記回収するステップが、スクリーニングされた10、9、8、7、6、5、4、3、または2つの接触宿主細胞またはそのクローン集団毎に約1の頻度で起こる、項目1に記載の方法。
(項目9)
上記回収するステップが、PCR、サザンブロット、制限マッピング、およびDNA配列決定からなる群から選択される少なくとも1つの方法によって上記組み込みを同定することを含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
(N)xが、(TS)x内の内因性のゲノム配列を切断することができる、項目1に記載の方法。
(項目11)
(N)xが、(TS)x内の外因性の配列を切断することができる、項目1に記載の方法。
(項目12)
上記外因性の配列が、ホーミングエンドヌクレアーゼについての認識配列である、項目11に記載の方法。
(項目13)
上記ホーミングエンドヌクレアーゼが、F−cphIである、項目12に記載の方法。
(項目14)
(ES)xが、(HR1)xの3’および(HR2)xの5’に位置づけられる目的の核酸(D)xをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目15)
(D)xが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される、項目14に記載の方法。
(項目16)
(ES)xが、線状である、項目1に記載の方法。
(項目17)
上記宿主細胞が、生合成経路の1つ以上の酵素をコードする1つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目18)
生合成経路の1つ以上の酵素をコードする上記1つ以上の異種ヌクレオチド配列が、ゲノムで組み込まれる、項目17に記載の方法。
(項目19)
上記外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、生合成経路の酵素をコードする、(HR1)xの3’および(HR2)xの5’に位置づけられる目的の核酸(D)xを含む、項目1に記載の方法。
(項目20)
(D)xが、生合成経路の酵素の変異体をコードする、複数の核酸分子を含むライブラリ(L)xのメンバーである、項目19に記載の方法。
(項目21)
上記宿主細胞が、イソペンテニルピロリン酸を作製するためのメバロン酸(MEV)経路の1つ以上の酵素をコードする1つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目22)
上記メバロン酸経路の上記1つ以上の酵素が、アセチル−CoAチオラーゼ、HMG−CoAシンターゼ、HMG−CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、項目21に記載の方法。
(項目23)
上記宿主細胞が、MEV経路の酵素をそれぞれコードする複数の異種核酸を含む、項目21に記載の方法。
(項目24)
上記外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、テルペンシンターゼをコードする、(HR1)xの3’および(HR2)xの5’に位置づけられる目的の核酸(D)xを含む、項目21に記載の方法。
(項目25)
上記テルペンシンターゼが、モノテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、セスタテルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、テトラテルペンシンターゼ、およびポリテルペンシンターゼからなる群から選択される、項目24に記載の方法。
(項目26)
(N)xが、(N)xをコードする核酸配列を含む発現ベクターとして提供される、項目1に記載の方法。
(項目27)
(N)xが、精製タンパク質として上記宿主細胞の中に形質転換される、項目1に記載の方法。
(項目28)
(N)xが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼ、および部位特異的レコンビナーゼからなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目29)
上記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたTypeIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目28に記載の方法。
(項目30)
上記TypeIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFok
Iエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、項目29に記載の方法。
(項目31)
上記ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5、または6つのジンクフィンガーを含む、項目29に記載の方法。
(項目32)
上記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目30に記載の方法。
(項目33)
上記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliI、またはPI−TliIIからなる群から選択される、項目30に記載の方法。
(項目34)
上記エンドヌクレアーゼが、内因性のゲノム配列に特異的に結合するように修飾され、修飾された上記エンドヌクレアーゼが、もはや、その野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目28に記載の方法。
(項目35)
修飾された上記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼから誘導される、項目34に記載の方法。
(項目36)
修飾された上記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliI、またはPI−TliIIからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼから誘導される、項目34に記載の方法。
(項目37)
上記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目38)
上記宿主細胞が、酵母細胞である、項目1に記載の方法。
(項目39)
上記酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae細胞である、項目38に記載の方法。
(項目40)
上記Saccharomyces cerevisiae細胞が、パン酵母、Mauri、Santa Fe、IZ−1904、TA、BG−1、CR−1、SA−1、M−26、Y−904、PE−2、PE−5、VR−1、BR−1、BR−2、ME−2、VR−2、MA−3、MA−4、CAT−1、CB−1、NR−1、BT−1、またはAL−1株のものである、項目39に記載の方法。
(項目41)
項目1に記載の方法によって生成される宿主細胞。
(項目42)
宿主細胞であって、上記宿主細胞は:
(a)複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xを含み、(HR1)xおよび(HR2)xが、上記宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)xで(ES)xの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸;ならびに
(b)それぞれの上記標的部位(TS)xについて、(TS)xで切断することができるヌクレアーゼ(N)xであって、上記切断が、(TS)xでの(ES)xの相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である、宿主細胞。
(項目43)
(HR1)xが、(TS)xの5’領域に対して相同であり、(HR2)xが、(TS)xの3’領域に対して相同である、項目42に記載の宿主細胞。
(項目44)
(N)xが、(TS)xの上記5’領域と上記3’領域との間に位置づけられる領域で切断することができる、項目33に記載の宿主細胞。
(項目45)
単一のヌクレアーゼが、それぞれの(TS)xを切断することができる、項目42に記載の宿主細胞。
(項目46)
n=3、4、5、6、7、8、9、または10である、項目42に記載の宿主細胞。
(項目47)
(N)xが、(TS)x内の内因性のゲノム配列を切断することができる、項目42に記載の宿主細胞。
(項目48)
(N)xが、(TS)x内の外因性の配列を切断することができ、xが、1または1〜nの任意の整数である、項目42に記載の宿主細胞。
(項目49)
上記外因性の配列が、ホーミングエンドヌクレアーゼについての認識配列である、項目42に記載の宿主細胞。
(項目50)
上記ホーミングエンドヌクレアーゼが、F−cphIである、項目42に記載の宿主細胞。
(項目51)
(ES)xが、(HR1)xの3’および(HR2)xの5’に位置づけられる目的の核酸(D)xをさらに含む、項目42に記載の宿主細胞。
(項目52)
(D)xが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される、項目51に記載の宿主細胞。
(項目53)
(ES)xが、線状である、項目42に記載の宿主細胞。
(項目54)
上記宿主細胞が、生合成経路の1つ以上の酵素をコードする1つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、項目42に記載の宿主細胞。
(項目55)
生合成経路の1つ以上の酵素をコードする上記1つ以上の異種ヌクレオチド配列が、ゲノムで組み込まれる、項目54に記載の宿主細胞。
(項目56)
上記外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、生合成経路の酵素をコードする、(HR1)xの3’および(HR2)xの5’に位置づけられる目的の核酸(D)xを含む、項目42に記載の宿主細胞。
(項目57)
(D)xが、生合成経路の酵素の変異体をコードする、複数の核酸分子を含むライブラリ(L)xのメンバーである、項目56に記載の宿主細胞。
(項目58)
上記宿主細胞が、イソペンテニルピロリン酸を作製するためのメバロン酸(MEV)経路の1つ以上の酵素をコードする1つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、項目42に記載の宿主細胞。
(項目59)
上記メバロン酸経路の上記1つ以上の酵素が、アセチル−CoAチオラーゼ、HMG−CoAシンターゼ、HMG−CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、項目58に記載の宿主細胞。
(項目60)
上記宿主細胞が、MEV経路の酵素のそれぞれをコードする複数の異種核酸を含む、項目58に記載の宿主細胞。
(項目61)
上記外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、テルペンシンターゼをコードする、(HR1)xの3’および(HR2)xの5’に位置づけられる目的の核酸(D)xを含む、項目58に記載の宿主細胞。
(項目62)
上記テルペンシンターゼが、モノテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、セスタテルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、テトラテルペンシンターゼ、およびポリテルペンシンターゼからなる群から選択される、項目61に記載の宿主細胞。
(項目63)
(N)xが、(N)xをコードする核酸配列を含む発現ベクターとして提供される、項目42に記載の宿主細胞。
(項目64)
(N)xが、精製タンパク質として上記宿主細胞の中に形質転換される、項目42に記載の宿主細胞。
(項目65)
(N)xが、精製RNAとして宿主細胞の中に形質転換される、項目42に記載の宿主細胞。
(項目66)
(N)xが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼ、および部位特異的レコンビナーゼからなる群から選択される、項目42に記載の宿主細胞。
(項目67)
上記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたTypeIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目66に記載の宿主細胞。
(項目68)
上記TypeIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFok
Iエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、項目67に記載の宿主細胞。
(項目69)
上記ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5、または6つのジンクフィンガーを含む、項目67に記載の宿主細胞。
(項目70)
上記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目66に記載の宿主細胞。
(項目71)
上記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliI、またはPI−TliIIからなる群から選択される、項目66に記載の宿主細胞。
(項目72)
上記エンドヌクレアーゼが、内因性の宿主細胞ゲノム配列に特異的に結合するように修飾され、修飾された上記エンドヌクレアーゼが、もはや、その野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目66に記載の宿主細胞。
(項目73)
修飾された上記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼから誘導される、項目72に記載の宿主細胞。
(項目74)
修飾された上記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliI、またはPI−TliIIからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼから誘導される、項目72に記載の宿主細胞。
(項目75)
上記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される、項目42に記載の宿主細胞。
(項目76)
上記宿主細胞が、酵母細胞である、項目42に記載の宿主細胞。
(項目77)
上記酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae細胞である、項目76に記載の酵母細胞。
(項目78)
上記Saccharomyces cerevisiae細胞が、パン酵母、Mauri、Santa Fe、IZ−1904、TA、BG−1、CR−1、SA−1、M−26、Y−904、PE−2、PE−5、VR−1、BR−1、BR−2、ME−2、VR−2、MA−3、MA−4、CAT−1、CB−1、NR−1、BT−1、またはAL−1株のものである、項目77に記載の酵母細胞。
(項目79)
キットであって、上記キットは:
(a)複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、
(i)第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xであって、(HR1)xおよび(HR2)xが、酵母細胞ゲノムの選択される標的部位(TS)xで(ES)xの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xならびに
(ii)(HR1)xの3’および(HR2)xの5’に位置づけられる目的の核酸(D)xを含む、複数の外因性の核酸、
(b)複数のヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ(N)xが、それぞれ、(TS)xで切断することができ、上記切断が、(TS)xでの(ES)xの相同組換えをもたらす、複数のヌクレアーゼを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である、キット。
(項目80)
複数のプライマー対(P)xをさらに含み、プライマー対が、それぞれ、PCRによって、(TS)xでの(ES)xの組み込みを同定することができる、項目79に記載のキット。
(項目81)
(HR1)xが、(TS)xの5’領域に対して相同であり、(HR2)xが、(TS)xの3’領域に対して相同である、項目79に記載のキット。
(項目82)
(N)xが、(TS)xの上記5’領域と上記3’領域との間に位置づけられる領域で切断することができる、項目79に記載のキット。
(項目83)
n=≧6000であり、(TS)xが、それぞれ、上記酵母細胞ゲノムの特有の領域である、項目79に記載のキット。
(項目84)
(N)xが、(TS)x内の内因性の酵母ゲノム配列を切断することができる、項目79に記載のキット。
(項目85)
(N)xが、(TS)x内の外因性の配列を切断することができる、項目79に記載のキット。
(項目86)
(ES)xが、(HR1)xの3’および(HR2)xの5’に位置づけられる目的の核酸(D)xをさらに含む、項目79に記載のキット。
(項目87)
(D)xが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される、項目86に記載のキット。
(項目88)
(ES)xが、線状である、項目79に記載のキット。
(項目89)
(ES)xが、環状である、項目79に記載のキット。
(項目90)
(N)xが、(N)xをコードする核酸配列を含む発現ベクターとして提供される、項目79に記載のキット。
(項目91)
(N)xが、精製タンパク質として提供される、項目79に記載のキット。
(項目92)
(N)xが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼ、および部位特異的レコンビナーゼからなる群から選択される、項目79に記載のキット。
(項目93)
上記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたTypeIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目92に記載のキット。
(項目94)
上記TypeIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFok
Iエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、項目93に記載のキット。
(項目95)
上記ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5、または6つのジンクフィンガーを含む、項目93に記載のキット。
(項目96)
上記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目92に記載のキット。
(項目97)
上記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliI、またはPI−TliIIからなる群から選択される、項目92に記載のキット。
(項目98)
上記エンドヌクレアーゼが、内因性の酵母ゲノム配列に特異的に結合するように修飾され、修飾された上記エンドヌクレアーゼが、もはや、その野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目92に記載のキット。
(項目99)
修飾された上記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼから誘導される、項目98に記載のキット。
(項目100)
修飾された上記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliI、またはPI−TliIIからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼから誘導される、項目99に記載のキット。
(項目101)
酵母細胞ゲノムの標的部位の中への外因性の核酸のマーカーレス組み込みのための方法であって、上記方法は:
(a)酵母細胞を、
(i)第1の相同性領域(HR1)1および第2の相同性領域(HR2)1を含む外因性の核酸(ES)1であって、(HR1)1および(HR2)1が、標的部位(TS)1で宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸(ES)1ならびに
(ii)(TS)1で切断することができるヌクレアーゼ(N)1であって、上記切断が、(TS)1での(ES)1の相同組換えをもたらす、(TS)1で切断することができるヌクレアーゼ(N)1と接触させるステップ
ならびに
(b)(TS)1で組み込まれた(ES1)を有する酵母細胞を回収するステップであって、上記回収するステップが、選択マーカーの組み込みを必要としない、ステップ、を含む、方法。
(項目102)
酵母細胞であって、
(a)第1の相同性領域(HR1)1および第2の相同性領域(HR2)1を含む外因性の核酸(ES)1であって、(HR1)1および(HR2)1が、上記酵母細胞のゲノムの標的部位(TS)1で宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸(ES)1ならびに
(b)(TS)1で切断することができるヌクレアーゼ(N)1であって、上記切断が、(TS)1での(ES)1の相同組換えをもたらす、(TS)1で切断することができるヌクレアーゼ(N)1を含み、
(ES)1が、選択マーカーを含まない、酵母細胞。
(項目103)
宿主細胞ゲノムの中に複数の外因性の核酸を組み込むための方法であって、
(a)宿主細胞を、
(i)複数のライブラリであって、ライブラリ(L)xが、それぞれ、複数の外因性の核酸を含み、選択された外因性の核酸が、5’から3’方向に、第1の相同性領域(HR1)x、群(D)xから選択される目的の任意の核酸、および第2の相同性領域(HR2)xを含み、(HR1)xおよび(HR2)xが、上記宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)xで上記選択された外因性の核酸の宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数のライブラリならびに
(ii)それぞれの上記標的部位(TS)xについて、(TS)xで切断することができるヌクレアーゼ(N)xであって、上記切断が、(TS)xでの上記選択された外因性の核酸の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼと接触させるステップ
ならびに
(b)宿主細胞を回収するステップであって、それぞれのライブラリ(L)x由来の外因性の核酸が、それぞれの選択された標的配列(TS)xで組み込まれているステップを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である、方法。
(項目104)
宿主細胞であって、上記宿主細胞は:
(a)複数のライブラリであって、ライブラリ(L)xが、それぞれ、複数の外因性の核酸を含み、選択された外因性の核酸が、5’から3’方向に、第1の相同性領域(HR1)x、群(D)xから選択される目的の任意の核酸、および第2の相同性領域(HR2)xを含み、(HR1)xおよび(HR2)xが、上記宿主細胞のゲノムの標的部位(TS)xで上記選択された外因性の核酸の宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数のライブラリ;ならびに
(b)それぞれの上記標的部位(TS)xについて、(TS)xで切断することができるヌクレアーゼ(N)xであって、上記切断が、(TS)xでの上記選択された外因性の核酸の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼ(N)xを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である、宿主細胞。
(項目105)
組成物であって、上記組成物は:
(a)酵母細胞、
(b)複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、
(i)第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xであって、(HR1)xおよび(HR2)xが、酵母細胞ゲノムの選択される標的部位(TS)xで(ES)xの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xならびに
(ii)(HR1)xの3’および(HR2)xの5’に位置づけられる目的の核酸(D)xを含む、複数の外因性の核酸、
(c)複数のヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ(N)xが、それぞれ、(TS)xで切断することができ、上記切断が、(TS)xでの(ES)xの相同組換えをもたらす複数のヌクレアーゼを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である、組成物。
6.1 定義
本明細書において使用されるように、ヌクレアーゼ、たとえばホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはTAL−エフェクターヌクレアーゼに関しての用語「切断する」、「切断」、および/または「切断すること」は、特定の核酸において二本鎖切断(DSB)を作り出す作用を指す。DSBは、当業者らによって理解されるように、平滑末端または付着末端(すなわち5’または3’オーバーハング)を残すことができる。
宿主細胞ゲノムの1つ以上の選択される標的部位の中に1つ以上の外因性の核酸を組み込むための方法が、本明細書において提供される。ある実施形態において、方法が、ゲノム標的部位の中に組み込まれることとなる外因性の核酸を含む、1つ以上の組み込みポリヌクレオチド、すなわちドナーDNAおよびゲノム標的部位の近くでまたは標的部位内で二本鎖切断を引き起こすことができる1つ以上のヌクレアーゼと宿主細胞を接触させるステップを含む。ゲノム標的部位の近くでのまたは標的部位内での切断は、切断部位でのまたは切断部位の近くでの相同組換えの頻度を大幅に増加させる。
(a)宿主細胞を、
(i)第1の相同性領域(HR1)および第2の相同性領域(HR2)を含む外因性の核酸(ES)であって、(HR1)および(HR2)が、前記標的部位(TS)で宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸(ES)ならびに
(ii)(TS)で切断することができるヌクレアーゼ(N)であって、前記切断が、(TS)での(ES)の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼ(N)と接触させるステップならびに
(b)(TS)で組み込まれた(ES)を有する宿主細胞を回収するステップであって、前記回収するステップが、選択マーカーの組み込みを必要としない、ステップ、を含む方法が本明細書において提供される。
(a)宿主細胞を、
(i)複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xを含み、(HR1)xおよび(HR2)xが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)xで(ES)xの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸;ならびに
(ii)それぞれの前記標的部位(TS)xについて、(TS)xで切断することができるヌクレアーゼ(N)xであって、前記切断が、(TS)xでの(ES)xの相同組換えをもたらす複数のヌクレアーゼと接触させるステップ
ならびに
(b)宿主細胞を回収するステップであって、選択された外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、それぞれの選択された標的配列(TS)xで組み込まれる、ステップを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である、方法が、本明細書において提供される。
本明細書において記載される方法および組成物は、たとえば、バイオ燃料、医薬品、またはバイオマテリアルへのバイオマスの変換に向けて、最適化された生合成経路を含む組換え生物を構築するための特定の利点を提供する。機能的な、本来のものではない生物学的経路は、抗マラリア薬アルテミシニンに対する前駆体(たとえばMartinら、Nat Biotechnol 21:796−802(2003);脂肪酸誘導体燃料および化学物質(たとえば脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、およびワックス;たとえばSteenら、Nature 463:559−562(2010)を参照されたい;ハロゲン化メチル誘導燃料および化学物質(たとえばBayerら、J Am Chem Soc 131:6508−6515(2009)を参照されたい;コレステロール降下薬を生成するポリケチドシンターゼ(たとえばMaら、Science 326:589−592(2009)を参照されたい;ならびにポリケチド(たとえばKodumal、Proc Natl Acad Sci USA 101:15573−15578(2004)を参照されたい、の産生のための微生物宿主における構築に成功した。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、遺伝子操作された宿主細胞の産物プロファイルを修飾するために、生合成経路の1つ以上の構成成分を同時に導入するまたは交換するために利用することができる。いくつかの実施形態において、生合成経路が、イソプレノイド経路である。
一度生合成経路が構築されたら、代謝フラックスを最適化し、かつ高産物力価を達成するために、すべての構成成分の発現レベルを調整する必要がある。フラックスを最適化するための共通のアプローチは、経路構成成分遺伝子の特徴、遺伝子のコドン最適化、溶解性タグの使用、切断または既知の突然変異の使用、ならびに遺伝子の発現状況(すなわちプロモーターおよびターミネーターの選択)を多様化することを含む。株を構築する過程においてこの多様性をサンプリングするために、従来の方法の使用は、非実用的に多くの株を生成し、かつアーカイブすることを必要とする。たとえば、株のエンジニアが3つの遺伝子座の構築物を組み込むことを計画し、それぞれの遺伝子座について10の変異体を考案した場合、コンビナトリアルな多様性を完全にサンプリングするために1,000株が生成される必要があるであろう。経路遺伝子が協力して作用し、すべての代謝物質中間体を容易にスクリーニングすることができるとは限らないので、それぞれの組み込みサイクルの後に経路遺伝子の個々の寄与を評価することができないことが多い。したがって、株のエンジニアらは、新規な代謝経路を構築する場合に彼らがサンプリングするデザインスペース(design space)を厳重に制限する選択をルーチン的になす。
(d)宿主細胞を、
(i)複数のライブラリであって、ライブラリ(L)xが、それぞれ、複数の外因性の核酸を含み、選択された外因性の核酸が、5’から3’方向に、第1の相同性領域(HR1)x、群(D)xから選択される目的の任意の核酸、および第2の相同性領域(HR2)xを含み、(HR1)xおよび(HR2)xが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)xで前記選択された外因性の核酸の宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数のライブラリならびに
(ii)それぞれの前記標的部位(TS)xについて、(TS)xで切断することができるヌクレアーゼ(N)xであって、前記切断が、(TS)xでの前記選択された外因性の核酸の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼと接触させるステップ
ならびに
(e)宿主細胞を回収するステップであって、それぞれのライブラリ(L)x由来の外因性の核酸が、それぞれの選択された標的配列(TS)xで組み込まれているステップを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である。
(b)それぞれの前記標的部位(TS)xについて、(TS)xで切断することができるヌクレアーゼ(N)xであって、前記切断が、(TS)xでの前記選択された外因性の核酸の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼ(N)xを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である、宿主細胞もまた、本明細書において提供される。
好都合にも、組み込みポリヌクレオチド、すなわちドナーDNAは、宿主細胞ゲノムの選択された標的部位の中への1つ以上の外因性の核酸構築物の組み込みを促進する。好ましい実施形態において、組み込みポリヌクレオチドが、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xを含む外因性の核酸(ES)xならびに任意選択で、(HR1)xおよび(HR2)xの間に位置づけられる目的の核酸を含む。いくつかの実施形態において、組み込みポリヌクレオチドが、線状DNA分子である。他の実施形態において、組み込みポリヌクレオチドが、環状DNA分子である。
好ましい実施形態において、組み込みポリヌクレオチドが、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xを含む外因性の核酸(ES)xを含み、(HR1)xおよび(HR2)xが、宿主細胞ゲノム内の選択された標的部位(TS)xで宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる。相同組換えによってゲノムの中に外因性の核酸を組み込むために、組み込みポリヌクレオチドは、好ましくは、一方の末端に(HR1)xおよび他方の末端に(HR2)xを含む。いくつかの実施形態において、(HR1)xが、選択されたゲノムの標的部位(TS)xの5’領域に対して相同であり、(HR2)xが、選択された標的部位(TS)xの3’領域に対して相同である。いくつかの実施形態において、(HR1)xが、選択されたゲノムの標的部位(TS)xの5’領域に対して約70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%相同である。いくつかの実施形態において、(HR2)xが、選択された標的部位(TS)xの3’領域に対して約70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%相同である。
いくつかの実施形態において、組み込みポリヌクレオチドが、目的の核酸(D)xをさらに含む。目的の核酸は、当業者によって有用であると見なされる任意のDNAセグメントとすることができる。たとえば、DNAセグメントは、宿主ゲノムに対して「ノックイン」することができる目的の遺伝子を含んでいてもよい。他の実施形態において、DNAセグメントが、宿主細胞ゲノムの標的部位の中への構築物の組み込みに際して標的遺伝子を特異的に破壊し、それによって、破壊された遺伝子を非機能的にすることができる「ノックアウト」構築物として機能する。目的の核酸(D)xの有用な例は、タンパク質コード配列、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、転写活性化因子、転写リプレッサー、転写活性化因子結合部位、転写リプレッサー結合部位、イントロン、エクソン、ポリAテイル、マルチクローニングサイト、核移行シグナル、mRNA安定化シグナル、組み込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、分解シグナル、または任意の他の天然に存在する分子もしくは合成DNA分子を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、(D)xが、天然起源のものとすることができる。その代わりに、(D)xは、インビトロにおいて産生された、完全に合成起源のものとすることができる。さらに、(D)xは、単離された天然に存在するDNA分子の任意の組み合わせまたは単離された天然に存在するDNA分子および合成DNA分子の任意の組み合わせを含むことができる。たとえば、(D)xは、タンパク質コード配列に作動可能に連結された異種プロモーター、ポリAテイルに連結されたタンパク質コード配列、エピトープタグコード配列とインフレームで連結されたタンパク質コード配列、およびその他同種のものを含んでいてもよい。目的の核酸(D)xは、クローニングされたDNA(たとえばDNA「ライブラリ」)から当技術分野において知られている標準的な手順によって、化学合成によって、cDNAクローニングによって、または所望の細胞から精製されたゲノムDNAもしくはその断片のクローニングによって、またはPCR増幅およびクローニングによって得られてもよい。たとえばSambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3d. ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(2001);Glover, D.M.(ed.)、DNA Cloning:A Practical Approach, 2d. ed.、MRL Press, Ltd.、Oxford、U.K.(1995)を参照されたい。
本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態において、宿主細胞ゲノムが、切断する、すなわち、選択された標的部位内の指定された領域で二本鎖切断を引き起こすことができる1つ以上のヌクレアーゼと接触させられる。いくつかの実施形態において、二本鎖切断誘発剤が、認識配列でまたはその近くでブレークをもたらすように、特異的なポリヌクレオチド認識配列を認識するおよび/またはそれに結合する任意の作用物質である。二本鎖切断誘発剤の例は、エンドヌクレアーゼ、部位特異的レコンビナーゼ、トランスポザーゼ、トポイソメラーゼ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼを含むが、これらに限定されず、修飾誘導体、変異体、およびその断片を含む。
本明細書において提供される方法において、ヌクレアーゼは、ゲノム標的部位の近くでまたは標的部位内で二本鎖切断を引き起こすことができる宿主細胞に導入され、これは、切断部位でのまたは切断部位の近くでの相同組換えの頻度を大幅に増加させる。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼについての認識配列が、宿主細胞ゲノムにおいて標的部位にのみ存在し、それによって、ヌクレアーゼによるあらゆるオフターゲットゲノム結合および切断を最小限にする。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に有用な1つ以上のヌクレアーゼが、精製タンパク質として宿主細胞に提供される、たとえば送達される。他の実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼがヌクレアーゼをコードする核酸を含むポリヌクレオチド(複数可)を介して提供される。他の実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼが宿主細胞核において直接翻訳することができる、精製RNAとして宿主細胞の中に導入される。
他の態様において、本明細書において記載される1つ以上の外因性の核酸をゲノムで組み込むための方法のいずれかによって生成される修飾宿主細胞が、本明細書において提供される。適した宿主細胞は、染色体またはエピソーム遺伝子座の中への目的の核酸または「ドナーDNA」の組み込みが所望される任意の細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞が、相同組換えを実行する能力を有する生物の細胞である。いくつかの例証となる実施形態が、酵母(S.cerevisiae)において実証されるが、本明細書において提供されるゲノム修飾の方法は、組換え系が酵母ほど熟達していない場合でさえ、機能的な組換え系を有するすべての生物有機体で実施することができると考えられる。機能的な相同組換え系を有する他の細胞または細胞型は、Bacillus subtilisおよび大腸菌などのような細菌(これはRecE RecT組換えに熟達している;Muyrersら、EMBO rep. 1:239−243、2000);原生動物(たとえばプラスモジウム、トキソプラズマ);他の酵母(たとえばSchizosaccharomyces pombe);糸状菌(たとえばAshbya gossypii);植物、たとえばコケであるニセツリガネゴケ(Schaefer and Zryd、Plant J. 11:1195−1206、1997);ならびに哺乳動物細胞およびニワトリDT40細胞などのような動物細胞(Diekenら、Nat. Genet. 12:174−182、1996)を含む。
他の態様において、本明細書において記載される1つ以上の外因性の核酸をゲノムで組み込むための方法を実行するのに有用なキットが、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、キットが、
(a)複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸(ES)xが、それぞれ、
(i)第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xであって、(HR1)xおよび(HR2)xが、宿主細胞ゲノムの選択される標的部位(TS)xで(ES)xの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xならびに
(ii)(HR1)xの3’および(HR2)xの5’に位置づけられる目的の核酸(D)xを含む、複数の外因性の核酸、
(b)複数のヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ(N)xが、それぞれ、(TS)xで切断することができ、前記切断が、(TS)xでの(ES)xの相同組換えをもたらす複数のヌクレアーゼを含み、
xが、1〜nの任意の整数であり、nが、少なくとも2である。
7.1 実施例1:複数の外因性の核酸の同時の複数の組み込み
本明細書において記載される方法および組成物は、1回の形質転換ステップにおいて酵母細胞ゲノムの2つの遺伝子座で組み込まれた2つの外因性の核酸を含む修飾酵母細胞を作り出すために実行され、修飾酵母細胞の回収は、選択マーカー(複数可)の使用を必要としない。
本実施例は、宿主細胞ゲノムにおける標的二本鎖切断の誘発の後に、S.cerevisiae宿主の3つの異なる遺伝子座での3つの外因性の核酸の同時の組み込みを実証する結果を提供する。手短に言えば、エメラルドグリーン蛍光タンパク質の切断型非機能的コピー(emgfp△)をコードする外因性の「標的」核酸配列を、宿主酵母細胞の、それぞれ、HO、YGR250c、およびNDT80遺伝子座の中に組み込んだ。組換え細胞は、エメラルドグリーン蛍光タンパク質(EmGFP)のインタクトで機能的なコピーをコードする線状「ドナー」DNAおよび(1)空ベクターまたは(2)emgfp△コード配列内の配列を特異的に認識し、かつ切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN.gfp)をコードする発現ベクター、pZFN.gfpのどちらかにより形質転換した。形質転換されたコロニーは、ドナーEmGFPコード配列との、標的emgfp△コード配列の1つ、2つ、または3つのゲノム組み込みコピーの交換について、コロニーPCR(cPCR)によってスクリーニングした。
ヌクレアーゼ媒介性の二本鎖切断のための外因性のゲノム標的部位を生成するために、内容についてそれらの全体が参照によってこれによって組み込まれる米国特許第8,110,360号明細書において記載されるように、emgfp△をコードする標的DNAを、RYSE媒介性のアセンブリを使用して構築した。野生型EmGFPコード配列(配列番号:1)のヌクレオチド450〜462を、以下の配列:5’CGTCTAAATCATG3’(配列番号:2)と交換し、(1)EmGFPの152位での成熟前終止コドン(emgfp△)および(2)ZFN.gfpについての認識/切断配列の導入がもたらされた。
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、2つの機能的ドメイン:ジンクフィンガータンパク質の鎖から構成されるDNA結合ドメインおよびFokIのヌクレアーゼドメインから構成されるDNA切断ドメインからなる。FokIのエンドヌクレアーゼドメインは、DNAを切断するために、必須のヘテロ二量体として機能し、したがって、1対のZFNが、その標的配列に結合し、切断するために必要とされる。ZFN.gfp(CompoZr(登録商標)ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Sigma−Aldrich、St. Louis、MO)の標的配列は、5’−ACAACTACAACAGCCACAACgtctatATCATGGCCGACAAGCA−3’(配列番号:9)であり、認識配列は、大文字で示し、切断配列は、小文字で示す。
標準的な酢酸リチウム/SSDNA/PEGプロトコール(Gietz and Woods、Methods Enzymol. 350:87−96(2002))は、EmGFPおよび(1)空ベクターまたは(2)pZFN.gfp発現ベクターのどちらかをコードする線状「ドナー」DNAにより株Aを同時形質転換するために使用した。EmGFPコード配列は、ZFN.gfpについての認識/切断部位内の位置、すなわち、450位(C→G)、456位(A→T)、461位(T→C)、および462位(G→C)でemgfp△コード配列と異なる。したがって、ZFN.gfpは、EmGFP配列内ではなく、emgfp△配列内で認識し、切断することが予想される。
コロニーPCRは、それぞれの標的遺伝子座での、EmGFPコード配列との、emgfp△コード配列の交換の頻度を決定するために実行した。DNAは、それぞれの形質転換由来の96コロニーから準備し、それぞれ、EmGFPおよびHO、EmGFPおよびNDT80、ならびにEmGFPおよびYGR250cに対して特異的なプライマー対によりプローブし、その結果、それぞれの遺伝子座でのEmGFPコード配列の組み込みの成功により、予測されるサイズの増幅産物が産生されることが予想され、非組み込みによっては、増幅産物を産生しないことが予想された。
本実施例は、高メバロン酸経路フラックスのために遺伝子操作されたS.cerevisiae宿主の3つの異なる遺伝子操作された遺伝子座での3つのセスキテルペンシンターゼ遺伝子の同時の組み込みを実証する結果を提供する。その結果として、ファルネセンを産生し、ファルネセンシンターゼ遺伝子のプラスミドベースのコピーを含む親株は、アモルファジエンシンターゼの複数のゲノム組み込みコピーを含むアモルファジエン産生株に変換された。手短に言えば、F−CphI部位が側面に位置するURA3、NatR、およびKanRマーカーカセットを、宿主株の、それぞれ、Gal80、HXT3、およびMatα遺伝子座で組み込ませた。その後、宿主は、F−CphIエンドヌクレアーゼをコードするプラスミドならびにそれぞれ、それらのそれぞれの標的遺伝子座に対する相同性領域が側面に位置する、Gal1プロモーターから発現され、CYC1ターミネーターによって終結するアモルファジエンシンターゼ(ADS)遺伝子(ADSカセット)の別個のコドン最適化を含有する3つの線状「ドナー」DNA構築物により同時形質転換した。形質転換されたコロニーは、ADSカセットとの、1つ、2つ、または3つのゲノム組み込み標的マーカー遺伝子座の交換について、コロニーPCR(cPCR)によってスクリーニングした。三重に組み込まれた株を同定し、第4のADSカセットを組み込むことによってさらに遺伝子操作し、結果として生じる株は、ファルネセンシンターゼをコードするプラスミドの損失を可能にする条件下で培養し、その結果、その産物プロファイルは、ファルネセンからアモルファジエンに完全に変換された。
アモルファジエンシンターゼをコードする外因性のドナーDNAの複数の同時の組み込みに有用なファルネセン産生酵母株、Y3639を、以下のように調製した。
FcphIエンドヌクレアーゼ媒介性の二本鎖切断のための外因性のゲノム標的部位を、株Y3639の3つの異なる遺伝子座の中に組み込んだ。3つの標的部位カセットは、それぞれ、FcphIエンドヌクレアーゼについての認識配列ならびにそれぞれ、(1)URA3(修飾Gal80遺伝子座に対する相同性領域が側面に位置する)(配列番号:25);(2)NatR(修飾HXT3遺伝子座に対する相同性領域が側面に位置する)(配列番号:26);および(3)KanR(修飾Matα遺伝子座に対する相同性領域が側面に位置する)(配列番号:27)についてのコード配列を含んだオーバーラップ断片のPCRアセンブリを使用して構築した。標的部位カセットは、それぞれ、Y3639の中に連続的に形質転換し、株は、正確な遺伝子座に、F−CphIが側面に位置するマーカーカセットの3つの組み込みコピーを有することを、コロニーPCRによって確認した(「株B」)。
HygR選択マーカーを含むF−CphI酵母発現プラスミドpAM1799は、その全体が参照によってこれによって組み込まれる米国特許第7,919,605号明細書において以前に記載される。
標準的な酢酸リチウム/SSDNA/PEGプロトコール(Gietz and Woods、Methods Enzymol. 2002;350:87−96)は、42度での熱ショックの前に、細胞の30分間の30度でのインキュベーションを含むように修飾した。この方法は、FcphIエンドヌクレアーゼをコードするpAM1799ならびにそれぞれ、株Bの、それぞれ、修飾Gal80(配列番号:28)、HXT3(配列番号:29)、およびMatα遺伝子座(配列番号:30)に対する相同性領域が側面に位置するクソニンジンのアモルファジエンシンターゼ(ADS)についてのコドン最適化コード配列を含む3つの線状「ドナー」DNAにより株Bを同時形質転換するために使用した。
コロニーPCR(cPCR)は、ADSカセットコード配列とのF−CphIが側面に位置するマーカーカセットコード配列の交換の頻度を決定するために実行した。DNAは、それぞれADSおよびGal80遺伝子座、ADSおよびHXT3遺伝子座、ならびにADSおよびMatα遺伝子座に対して特異的なプライマー対によりプローブした20コロニーから準備し、その結果、それぞれの遺伝子座でのADSカセットコード配列の組み込みの成功により、予測されるサイズの増幅産物が産生されることが予想され、非組み込みによっては、増幅産物を産生しないことが予想された。それぞれの遺伝子座の5’および3’末端から増幅産物を産生するためのPCR反応は、マルチプレックスで試みた。いくつかの場合において、5’または3’増幅産物のみが検出に成功したが、ADSカセットの適切な組み込みは、より大きなPCR断片を配列決定することによってこれらの遺伝子座で確認された。
三重に組み込まれたADS株は、標準的なプロトコールを使用して、His3遺伝子座で、URAカセット(配列番号:40)によりマークされたADSの最終のコピーを組み込むことによってさらに遺伝子操作し、結果として生じる株を、この第4のコピーについて確認した(「株D」)。最終的に、Leu+によりマークされた高コピーファルネセンシンターゼプラスミド(pAM404)を失わせるために、株D細胞を、非選択的培地中で継代培養した(「株E」)。
本実施例は、4つのゲノムで組み込まれたテルペンシンターゼ遺伝子の同時の交換が、シンターゼコード領域内のデザイナーヌクレアーゼ誘発性の二本鎖切断によって促進されたことを実証する結果を提供する。手短に言えば、株Y3639(実施例3において記載される)から誘導したが、ファルネセンシンターゼ(FS)遺伝子の4つの、染色体外コピーではなく組み込みコピーを含む、既存のファルネセン産生株を、デザイナーTAL−エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)をコードするプラスミドおよび新しいテルペンシンターゼ遺伝子をコードする4つの線状ドナーDNAにより同時形質転換した。デザイナーTALENは、組み込まれたファルネセンシンターゼ遺伝子に対して特有の配列に結合し、切断することができる。形質転換されたコロニーは、コロニーPCR(cPCR)によってスクリーニングし、1、2、3、または4つのゲノムで組み込まれた標的マーカー遺伝子座を有する株を同定した。
そのそれぞれの標的遺伝子座に対する相同性領域(約500bp)が側面に位置するテルペンシンターゼコード配列をそれぞれが含む4つのドナーカセットを、オーバーラップPCRによってアセンブルした。ドナーDNAのうちの3つは、ADSコード配列を含み、また選択マーカーを含まなかった(配列番号41〜43)が、最終のドナーDNAは、URA3マーカーカセット(配列番号:44)に融合された、ファルネセンシンターゼ(FS)の新規なコドン最適化を含むカセットとした。ドナーDNAのどれも、FS特異的TALENによって認識される標的部位を含有しなかった(5’−TAGTGGAGGAATTAAAAGAGGAAGTTAAGAAGGAATTGATAACTATCAA−3’(配列番号:45))。
TALENプラスミドの選択およびCSM−URA+Hygプレート上でのURA3によりマークされたコドン−FSカセットの組み込みの後に、コロニーPCRは、3つの遺伝子座でのマークなしのADSカセットとの組み込みFSカセットの交換の頻度を決定するために実行した。DNAは、20コロニーから準備し、NDT80、DIT1、およびERG10遺伝子座でのADSカセットの組み込みについて特異的なプライマー対によりプローブし、その結果、それぞれの遺伝子座でのADSカセットコード配列の組み込みの成功により、予測されるサイズの増幅産物が産生されることが予想され、非組み込みによっては、増幅産物を産生しないことが予想された。
本実施例は、それぞれの部位が別個のデザイナーヌクレアーゼにより切断される、2つの天然の標的部位での2つのマーカーレスDNA構築物の同時の組み込みを実証する結果を提供する。手短に言えば、ADE−宿主株は、(1)GFPカセットを含む線状DNA断片(SFC1遺伝子座に対して相同な上流および下流領域が側面に位置する);(2)ADE2カセットを含む線状DNA断片(YJR030c遺伝子座に対して相同な上流および下流領域が側面に位置する);ならびに(3)それぞれ天然のSFC1およびYJR030cオープンリーディングフレームにおける配列を標的にするデザイナーヌクレアーゼをコードするプラスミド(複数可)により同時形質転換した。プラスミド(複数可)についての選択の後に、形質転換されたコロニーは、GFP蛍光および白色について視覚的にスクリーニングし、ADE−表現型が補完されたことを示した。コロニーPCR(cPCR)もまた、両方の遺伝子座の交換を確認するために実行した。興味深いことには、デザイナーエンドヌクレアーゼを一緒に使用した場合に、単一のデザイナーヌクレアーゼのみを使用した場合の組み込みの率と比較して、両方の標的遺伝子座での組み込みの率における有意な改善が観察された。
2つのドナーDNAは、オーバーラップ断片:(1)SFC1遺伝子座に対して相同な上流および下流領域の約500bpが側面に位置する、GFPカセットを含む線状DNA断片(配列番号:58)ならびに(2)YJR030c遺伝子座に対して相同な上流および下流領域の約500bpが側面に位置する、ADE2カセットを含む線状DNA断片(配列番号:59)のPCRアセンブリを使用して生成した。
YJR030c特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)をコードするプラスミドを、2つの方法で構築した。第1のバージョンにおいて、異なるGal1−10プロモーターの発現下の、Adh1およびCYC1ターミネーターによって終結するヘテロ二量体ZFNの2つのORFを、酵母における3つの部分的なギャップ修復によって、KanによりマークされたCEN−ARSベクターの中にクローニングした(pCUT006)。第2のバージョンもまた、構築し、ヘテロ二量体ZFNの両方のORFを、単一のORFとしてGal10プロモーターから発現させ、単量体は、切断可能なペプチドリンカーをコードするDNA配列によって分離される。この第2のプラスミドは、KanによりマークされたCEN−ARSベクター骨格への、PCR断片のIIS型制限酵素消化物によって産生されるリンカーを使用する、3つの部分のライゲーションによって構築した(pCUT016)。SFC1特異的ZFNをコードするプラスミドもまた、同じリンカー戦略、マーカー、および骨格を使用して、単一のORFとして構築した(pCUT015)。その後、マーカーは、酵母におけるギャップ修復反応の手段によってURAに変更した(pCUT058)。YJR030cおよびSFC1特異的ヌクレアーゼの両方の発現のための単一のプラスミドを構築するために、pCUT16およびpCUT15由来の単一のORFを、新しいCEN−ARS Kan+ベクター骨格の中にサブクローニングし、Cyc1およびAdh1ターミネーターと共に、Gal1−10の異なるプロモーターから発現させた(pCUT032)。
1マイクログラムのそれぞれのデザイナーヌクレアーゼプラスミドDNAまたは単一のプラスミド上に両方のデザイナーエンドヌクレアーゼを含有するプラスミドを、約1マイクログラムのそれぞれのドナーDNAと共に同時形質転換した。形質転換はすべて、ヌクレアーゼ発現を誘発するためにYP+2%ガラクトース中で一晩回復させた。様々な希釈液は、URA dropout+Kan寒天プレート(2重のプラスミドについて)またはYPD+Kan上で平板培養し、プラスミドDNAにより形質転換されたコロニーを選択した。プレートは、30℃で3〜4日間インキュベートした。
SFC1遺伝子座でのマーカーレス組み込みは、適切なフィルターを使用して、UV光下のGFP蛍光の観察によってスコア化した。ADE2のマーカーレス組み込みは、白いコロニー色の観察によってスコア化し、宿主株におけるADE2欠失表現型(淡紅色のコロニー)が補完されたことを示した。典型的な実験において、50〜150のコロニーをアッセイした。視覚的スコア化戦略は、プライマー、組み込み構築物の5’および内部リバースプライマーを使用して、コロニーPCRによってコロニーのサブセットにおいて確認した。それぞれの遺伝子座での組み込みは、予測されるサイズの増幅産物を産生するが、非組み込みによっては、増幅産物を産生しないことが予想された。cPCR結果により、視覚的スコア化方法の正確性を確認した。
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- 本願明細書に記載の発明。
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