CN105713885B - 特异识别并修复β地中海贫血症beta-globin基因的嵌合核酸酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了特异识别并修复β地中海贫血症beta‑globin基因的嵌合核酸酶一种融合蛋白，为将TALE蛋白FokI部分替换成改造后I‑SceI蛋白得到的蛋白；所述TALE蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4；所述改造后I‑SceI蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2自N’末端第706‑740位氨基酸。本发明实验显示TALE‑ISceI融合酶在临床应用上的优势，展示应用TALE‑Iscel融合酶根治β‑地中海贫血病的可行性。

Description

特异识别并修复β地中海贫血症beta-globin基因的嵌合核 酸酶

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及特异识别并修复β地中海贫血症beta-globin基因的嵌合核酸酶。

背景技术

地中海贫血症是中国及全球高发、分布广泛的遗传疾病。正常的造血干细胞具备分化为血液细胞能力，地中海贫血患者，其红细胞异常、脆弱且容易死亡，其带氧能力亦不足，因此造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是目前根治重型β-地中海贫血最有效的方法，它包括骨髓造血干细胞移植(BMT)、外周血干细胞移植(PB SCT)和脐血干细胞移植(CBSCT)。但是，供体缺乏和排异反应严重阻滞了此方法的广泛应用。

β-地中海贫血是一类由于β珠蛋白基因突变引起的贫血。正常的血红蛋白由2份β珠蛋白和2份α珠蛋白组成四聚体。如果β珠蛋白的表达量过少，将导致α珠蛋白的聚体并导致溶血等症状。β珠蛋白由位于第11对染色体的β基因表达。β基因含有多个突变热点，不同的地区，突变热点有所不同。

I-SceI是非常特殊的归巢内切酶，是一个特异性非常高并且十分安全的内切酶，一方面可以结合特异序列的DNA片段，另一方面能在识别的DNA序列中进行切割产生DNA双链断裂，其识别和切割的18个位点具有非常强的特异性。在前期许多报道中，已显示I-SceI对人类基因组的低毒性，已发表的研究中，对归巢核酸内切酶的改造多在细菌或酵母中筛选其特导性识別。I-SceI的识别的18个碱基中,﹣7位碱基到+11位碱基都非常重要。结晶结构显示，这18个碱基和I-SceI蛋白的特异性识别通过许多磷酸和碱基的直接接触以及水分子在两者之间的调节作用形成的。

TALEN是目前最容易构建核酸酶，其中可特异结合任意DNA的TALE赋予TALEN较高的同源重组修复率。TALE具有特异性识别较长DNA序列的特点，通过目前的蛋白分析和结晶结果发现，TALEs蛋白的DNA结合域是高度保守的由大约含有33-35个氨基酸的重复片段组成。深入的研究发现，这一段氨基酸只有两个氨基酸是不同的，而这两个氨基酸正好是特异性识别DNA的碱基。这两个可变的氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基(repeatvariable di-residues，RVD)。这种对应关系一共有五种，分别是：HD(分别为氨基酸)特异识别C碱基，NI识别A碱基，NN识别G或A碱基，NG识别T碱基，这种识别还包括某些非特异的配对，如NS可以识别A、T、G、C中的任一种。

目前，常用的核酸酶包括锌指蛋白(ZFN)，TALEN和CRIPAR/Cas9系统等。其中ZFN目前只能识别少数的位点，应用起来会有比较大的限制；TALEN技术具有组装容易，速度快，识别强的特点，但是由于TALEN中含有FokI，具有识别上的非特异性，造成一定的脱靶性；CRISPR/Cas9系统具有操作简单的特点，但是，其和核酸的结合具有非常大的非特异性，这将对其应用的重要障碍。

发明内容

本发明的一个目的是提供了特异识别并修复β地中海贫血症beta-globin基因的嵌合核酸酶。

本发明提供的融合蛋白，为将TALE蛋白FokI部分替换成改造后I-SceI蛋白得到的蛋白；所述TALE蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4；所述改造后I-SceI蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2自N’末端第706-740位氨基酸。

上述融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。

编码上述的融合蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；

3)与1)具有90％以上同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组载体为将上述核酸分子插入表达载体得到的重组载体。

本发明的实施例采用的表达载体为PCS2载体，重组载体PCS2-TALE-I-SceI为将序列表中序列1所示的核苷酸插入PCS2载体的NcoI和XbaI酶切位点得到的载体，该载体表达融合蛋白TALE-I-SceI。

上述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌。

上述的蛋白、上述核酸分子、含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在切割目的基因和/或修复目的基因中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的蛋白、上述核酸分子、含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在提高切割目的基因效率、提高修复目的基因效率或降低细胞毒性中的应用也是本发明保护的范围。

切割目的基因是使切割后目的基因在细胞内进行自行修复，最后产生基因突变。

上述应用中，所述目的基因为β地中海贫血症beta-globin基因。

上述的蛋白、上述核酸分子、含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在制备治疗或辅助治疗β-地中海贫血病产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明利用归巢内切酶I-SceI的低基因毒性和TALEN核酸酶的高效打靶优势，构建融合型内切酶TALE-IsceI，以β-地中海贫血疾病患者造血干细胞为模型，对其突变基因进行修复。该酶在体外β-地中海贫血疾病患者造血干细胞中发挥作用，有望在临床中得到广泛应用。同时，可以通过筛选从而使该酶识别并修复更多的核酸片段，将其推广应用到其他遗传型疾病治疗中。

利用此新型基因打靶技术，目的是在体外修复β-地中海贫血患者的造血干细胞所携带基因的突变，并将修复过的造血干细胞分化为能正常表达β珠蛋白的红细胞。在造血干细胞上直接进行基因修复具有如下优势：避免了iPS转基因的不稳定性及iPS细胞的可能致癌性，同时避免移殖细胞的免疫排斥性等。因此，此工程酶的获得为β地中海贫血患者的彻底根治提供实践依据。

附图说明

图1为在人体细胞中表达的绿色荧光蛋白修复报告系统。

图2为改造I-SceI为特异性识别beta-珠蛋白DNA序列的流程。

图3为I-SceI蛋白改造对应的位置和筛选结果。

图4为谦和蛋白示意图。

图5为I-SceI工程蛋白和TALE-ISceI分别造成的DNA缺失或突变。

图6为I-SceI工程蛋白和TALE-ISceI的基因修复效率。

图7为改造后的谦和核酸酶的细胞毒性比较。

图8为利用western blot检测Tale-ISVBII的表达。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、特异性识别并修复β地中海贫血症beta-globin基因的嵌合核酸酶的制备

一、归巢内切酶I-SceI改造

归巢内切酶I-SceI将在人类细胞中，利用特殊的荧光报告系统，来筛选特异识别β地中海贫血突变位点邻近的DNA序列(图1)。由目前的I-SceI的结构可以发现，I-SceI中的某些氨基酸和DNA序列是直接接触，可以通过逐渐改变碱基的序列，然后筛选这些直接接触的氨基酸，并找到结合最特异的新的氨基酸的结合位点(见图2)。

I-SceI和DNA序列的识别过程中，DNA序列中的ATAAC是蛋白切割的重要部分，改变这些碱基时，其切割效率将会发生显著的下降，可以通过改变I-SceI氨基酸的方法来筛选到能够识别新的序列的I-SceI工程酶。

在地中海贫血患者的β珠蛋白基因中，发现存在三段ATAAC序列，其中有一段ATAAC序列两边的序列和I-SceI识别的序列比较接近，同时也距离中国常见的β-地中海贫血症的突变位点之一，IVS-Ⅱ654(C→T)非常近，该突变位点在中国β-地中海贫血患者中约占24％，是第二大热点区域。因此，这段序列非常适合用来作为切割位点产生DNA双链断裂。通过对比发现，这段序列和I-SceI识别的序列有7个碱基的变化，其中4个碱基和I-SceI的氨基酸有直接的接触。如-7位的T直接和N152氨基酸接触。策略是依次改变与DNA的4个碱基直接接触的I-SceI的氨基酸，希望能找到能够特异性识别β珠蛋白基因的新的I-SceI氨基酸。I-SceI第一个识别位点TAG，把其改成β珠蛋白基因的AAA，然后对I-SceI的N152位氨基酸进行点突变，改变为其它19种氨基酸，再利用eGFP报告系统筛选出最高效HDR氨基酸。依次类推，获得特异靶向β珠蛋白基因改造的I-SceI(图3，a，I-SceI识别的原始序列和改造后识别的序列；b,三维结构图展示的需要改变的核酸位点和蛋白的相互作用位置；c-f,分别是四轮筛选得到的结果)，改造的I-SceI编码基因的改变的核苷酸位置为序列表中的序列1自5’末端第45,144,456,579位，改造的I-SceI的氨基酸序列改变的氨基酸位置为序列表中的序列2自N’末端第15,48,152,193位。

对归巢蛋白酶改造结果的验证，利用“绿色荧光蛋白基因打靶系统(GFP GeneTargeting Systems)”系统进行(见图4)。这个系统包括3个部分：第一部分，细胞系中通过病毒转染稳定整合一个单位的GFP基因，此基因编码区插入了18bp逐步被改造为β-珠蛋的靶序列，因而不能正常表达GFP。第二部分，细胞中通过病毒转染表达改造过的归巢内切酶I-SceI。第三部分，细胞中转染供体序列(donor sequence)，这一片断含有truncated GFP(tGFP)序列。在归巢内切酶产生切割形成DNA双链断裂时，能够诱导供体片段与内切酶识别片段进行同源重组，并对基因进行修复，eGFP基因被修复成正确的序列，从而表达eGFP蛋白。通过流式细胞技术等方法检测eGFP蛋白阳性细胞的相对含量，因此可以判断I-SceI蛋白的相对修复效率，从而找到最适合的I-SceI工程酶。在没有I-SceI的情况下，同源修复效率非常低，通常认为-1000万个细胞中会有一个细胞被修复。在有表达I-SceI的时候，这个效率能够显著的提高，达到1000倍以上，这也是为什么特异性高的打靶蛋白显得非常重要的原因。

二、表达嵌合核酸酶TALE-I-SceI编码基因重组载体的制备

将TALEN(氨基酸序列4及其编码基因的核苷酸序列5，购自addgene)，其由TALE和FokI组成)的FokI部分替换成I-SceI，构建同源重组修复率高、安全性高、脱靶效应低的融合型嵌合核酸酶TALE-ISceI(图4上图左边卫TALE的片段示意图，右边为I-SceI的示意图，下图表示融合酶的示意)。由于TALE的重复片段具有上述特性，可以对其进行特异性的改造使得其能识别β珠蛋白基因特定的DNA序列。目前TALE的改造方法都是利用同尾酶的方法，依据所需识别的DNA序列，将相对应的氨基酸片段连接起来。在TALE的重复片段上目前共发现三对同尾酶：BsaI(可识别多个位点)，SpeI和NheI以及发现的BspEI和XmalI。利用同尾酶的性质，可以按照想要的顺序，利用双酶切的方法，产生一个具有相同粘性末端的载体片段和DNA片段，再用T4连接酶将这个片段连接起来，此片段就可以识别两个碱基。利用这种方法，依据靶向β珠蛋白基因的序列，构建出可以识别15bp珠蛋白基因序列，对应TALE氨基酸的TALE质粒序列。利用“绿色荧光蛋白基因打靶系统”，将所需要识别的53bp珠蛋白序列插入到eGFP基因编码区，验证构建的TALE质粒其生物学活性。

表达嵌合核酸酶TALE-I-SceI编码基因重组载体PCS2-TALE-I-SceI的制备方法具体如下：

1、以TALE片段为模板，用正向引物“CACCATGGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGGTA”和反向引物“GGATCCGGCAACGCGA TGGGATGTGC”扩增，得到2119bp的TALE扩增产物；

2、用NcoI和BamHI酶切上述TALE扩增产物，得到的酶切产物与经过同样酶切的PCS2载体(addgene,plasmid#17095)连接，得到中间载体PCS2-TALE(为将序列1自5’末端第1-2115位核苷酸插入PCS2载体的NcoI和BamHI酶切位点间得到)，PCS2载体含有CMV启动子，该启动子能够启动目的基因在多种人类细胞系内的表达；

3、以改造后的I-SceI为模板，用正向引物“GGATCCATGAAAAACATCAAAAAAAACC”和反向引物“TCTAGATTACTTAAGAAAAGTTTCGGAG”扩增，得到720bp的I-SceI扩增产物；

用BamHI和XbaI酶切上述I-SceI扩增产物，得到酶切产物与经过同样酶切的中间载体PCS2-TALE连接，得到重组载体；

经过测序，该重组载体为将序列表中序列1所示的核苷酸插入PCS2载体的NcoI和XbaI酶切位点得到的载体，命名为PCS2-TALE-I-SceI，该载体表达融合蛋白TALE-I-SceI，即为嵌合核酸酶，该融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。

其中序列表中序列1所示的核苷酸包括改造后I-SceI编码基因和连接在其上游的TALE编码基因，改造后I-SceI编码基因的核苷酸序列为序列1自5’末端第2116-2823位核苷酸，TALE编码基因的核苷酸序列为序列1自5’末端第1-2115位核苷酸。

序列表中序列2自N末端第1-705位氨基酸残基为TALE，自N末端第706-940位氨基酸残基为I-SceI。

构建表达I-SceI的重组载体，将改造后I-SceI编码基因(序列1自5’末端第2116-2823位核苷酸)插入PCS2载体的NcoI和XbaI酶切位点得到的载体，命名为PCS2-I-SceI；

构建表达TALE的重组载体，将TALE编码基因(序列1自5’末端第1-2115位核苷酸)插入PCS2载体的NcoI和XbaI酶切位点得到的载体，命名为PCS2-TALE。

实施例2、嵌合核酸酶TALE-I-SceI的功能验证

一、提高人类基因组中基因打靶效率

经改造后的融合蛋白具有切割基因组DNA的作用，在不提供供体的情况下，DSB会通过体内的NEHJ的修复方式进行修复，在切割位点产生indel或者mutations。

实验方法：

1、将1X10⁶个293ft细胞(life technology)铺在6孔板中，培养24h后，在细胞中分别转染1ug的由实施例1制备的PCS2-I-SceI、PCS2-TALEN和PCS2-TALE-I-SceI质粒，得到转PCS2-I-SceI细胞、转PCS2-TALEN细胞和转PCS2-TALE-I-SceI细胞3种转基因细胞。

转染24h后，利用免疫荧光技术，用anti-flag抗体鉴定蛋白的表达，在PCS2载体上带有flag标签，因此可以用来检测目的蛋白的表达，结果3种转基因细胞目的蛋白均表达。(见图8，western blot图。)

2、转染后培养36h，利用QIAGEN的基因组提取试剂盒提取基因组，步骤参见试剂盒说明书。

以基因组DNA为模板，用正向引物“GCCTAGTACATTACTATTTG”和反向引物“ATTAGGCAGAATCCAGATGC”进行PCR扩增，得到768bp目的片段，该目的片段为β地中海贫血症beta-globin基因部分片段(beta-globin基因全长为序列6，此部分片段核苷酸序列为序列6自5’末端第892-1565位核苷酸)。

3、将PCR的产物连接到T3(全式金公司产品)载体上，挑选单克隆，进行桑格测序。

切割目的片段的效率＝(含有突变或缺失目的片段的单克隆数/测序总克隆数)*100％

结果如图5所示，可以看出，转染PCS2-TALE-I-SceI后的细胞中切割目的片段的效率比转染PCS2-I-SceI显著提高，转染PCS2-I-SceI的细胞中切割目的片段的效率为10％，转染PCS2-TALE-I-SceI的细胞中切割目的片段的效率为13％；转染TALEN的细胞中切割目的片段的效率为15％。

从上述可以看出，融合蛋白TALE-I-SceI对目的片段的切割效率远远高于单独的I-SceI。

二、提高人类基因组中基因同源重组修复效率

1、绿色荧光蛋白报告系统的构建

1)、绿色荧光蛋白eGFP基因的获得

以PCS2-eGFP载体(Addgene购买)为模板，用正向引物“CACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC”和反向引物“CTACTTGTACAGCTCGTCCATGC”进行PCR扩增，得到720bp的绿色荧光蛋白eGFP基因(序列7)。

2)、Overlap PCR的制备插入I-SceI蛋白识别序列的eGFP片段eGFP-1

以上述绿色荧光蛋白eGFP基因为模板，用正向引物“CACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC”和反向引物“TGCCGTCGTCCTTGAAGAATTACCCTGTTATCCTTTAGATGGTGCGCTCCTGGACGT”为引物，得到334p的PCR产物1；

以eGFP为模板，用正向引物“ACGTCCAGGAGCGCACCATCTAAAGGATAACAGGGTAATTCTTCAAGGACGACGGCA”和反向引物“CTACTTGTACAGCTCGTCCATGC”，得到461bp的PCR产物2；

以PCR产物1和PCR产物2为模板，用CACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC和CTACTTGTACAGCTCGTCCATGC为引物，得到742bp的DNA片段eGFP-1。

经过测序，序列表中序列3为I-SceI蛋白识别序列。

3)、报告载体的制备

将上述2)制备的DNA片段eGFP-1插入D-TOPO载体(拓扑酶重组,Life Technology购买)中，得到重组载体D-TOPO-eGFP-1；

将上述重组载体D-TOPO-eGFP-1经过LR重组，eGFP-1序列重组到p2k病毒载体(购自Life Technology)连接，得到报告载体；

利用报告载体转染293细胞，得到含有eGFP-1的转基因细胞，为报告系统。

2、将由实施例1制备的PCS2-TALE-I-SceI质粒和含有供体片段的质粒共同转染(质粒的质量比1:1)含有eGFP-1的转基因细胞；转染36h后，收集细胞，利用流式细胞仪分析。

含有供体片段的质粒为将供体片段(核苷酸序列为序列8)插入T3(全式金公司产品)载体上得到的载体。

以PCS2-I-SceI载体与含有供体片段的质粒共转染为对照1；

以含有供体片段的质粒单独转染为对照2；

以PCS2-TALEN载体与含有供体片段的质粒共转染为对照3；

PCS2-TALEN载体为将序列表中序列5所示的TALEN编码基因插入PCS2载体的NcoI和XbaI酶切位点得到的载体。

结果如图6所示，与转染PCS2-I-SceI载体的转基因细胞相比，转染PCS2-TALE-I-SceI载体的转基因细胞(TALE-ISVBII)中GFP阳性细胞率为0.21％；转染PCS2-I-SceI载体的转基因细胞(ISVBII)中GFP阳性细胞率为0.10％；转染PCS2-TALEN载体的转基因细胞(TALEN)中GFP阳性细胞率为0.22％；NA中GFP阳性细胞率为0，可以看出，TALE-ISVBII表达TALE-ISceI蛋白能够显著提高修复效率为0.21％，ISVBII表达的I-SceI蛋白修复效率为0.1％。

三、融合蛋白TALE-I-SceI对细胞毒性低

γ-H2AX和53BP1蛋白都是用来检测细胞产生DSB的生物标记，为细胞毒性的表征蛋白，通过对这两个生物标记实验的检测。γ-H2AX和53BP1免疫荧光染色多显示TALEN的基因毒性高。

实验方法如下：

1将1X10⁶个293细胞铺在6孔板中。过24h时候，在细胞中分别转染1ug的由实施例1制备的PCS2-I-SceI、PCS2-TALEN和PCS2-TALE-I-SceI。

2、转染后培养36h，将6孔板的细胞做免疫荧光染色实验，实验的步骤可以简要如下：4％甲醛固定15min,0.1％TritonX-100透膜10min,10％FBS封闭1h,抗γ-H2AX和53BP1蛋白的抗体孵育1h,PBS洗3遍5min,二抗孵育1h,PBS洗5min,DAPI染色15min,PBS洗3遍5min,将所得的细胞用于显微镜观察或者流式分析。

结果如图7所示，a为γ-H2AX结果，b为53BP1结果，可以看出，与转染PCS2-I-SceI的转基因细胞相比，转染PCS2-TALE-I-SceI的转基因细胞能够显著降低细胞毒性，体现在γ-H2AX和53BP1的蛋白水平表达显著降低。

与转染PCS2-I-SceI的转基因细胞(ISVB2)和转染PCS2-TALEN的转基因细胞(TALEN)相比，转染PCS2-TALE-I-SceI的转基因细胞(TALE-ISVB2)中γ-H2AX和53BP1的蛋白水平表达显著降低，可以看出，融合蛋白TALE-I-SceI对细胞毒性低。

上述结果显示了新型基因打靶技术TALE-ISceI融合酶在临床应用上的优势，展示应用TALE-Iscel融合酶根治β-地中海贫血病的可行性。

Claims (9)

1.一种融合蛋白，为将TALE蛋白FokI部分替换成改造后I-SceI蛋白得到的蛋白；

所述TALE蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4；

所述改造后I-SceI蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2自N’末端第706-940位氨基酸。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。

3.编码权利要求1或2所述的融合蛋白的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为序列表中序列1所示的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求3或4所述核酸分子插入表达载体得到的重组载体。

7.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌。

8.权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求2或3所述核酸分子、含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌在切割目的基因和/或修复目的基因中的应用；

或权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求2或3所述核酸分子、含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌在降低细胞毒性中的应用；

所述应用为非诊断治疗。

9.权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求2或3所述核酸分子、含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌在制备治疗或辅助治疗β-地中海贫血病产品中的应用。